2025-92132 培養器具、培養キット及び組織の培養方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2025092132

(43)【公開日】2025-06-19

(54)【発明の名称】培養器具、培養キット及び組織の培養方法

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/00 20060101AFI20250612BHJP

   C12N 1/00 20060101ALI20250612BHJP

【ＦＩ】

C12M1/00 C

C12N1/00 Z

【審査請求】未請求

【請求項の数】10

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023207815

(22)【出願日】2023-12-08

(71)【出願人】

【識別番号】514277260

【氏名又は名称】シンクランド株式会社

(71)【出願人】

【識別番号】593106918

【氏名又は名称】株式会社ファンケル

(74)【代理人】

【識別番号】100141139

【弁理士】

【氏名又は名称】及川 周

(74)【代理人】

【識別番号】100147267

【弁理士】

【氏名又は名称】大槻 真紀子

(74)【代理人】

【識別番号】100178847

【弁理士】

【氏名又は名称】服部 映美

(74)【代理人】

【識別番号】100175824

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 淳一

(72)【発明者】

【氏名】辛島 亨

(72)【発明者】

【氏名】木村 泰治

(72)【発明者】

【氏名】山口 俊二

(72)【発明者】

【氏名】東ヶ崎 健

【テーマコード（参考）】

4B029

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B029AA01

4B029AA27

4B029BB11

4B029CC02

4B029DA10

4B029DG06

4B029GA02

4B029GA03

4B029GB02

4B029GB10

4B065AA90X

4B065AC17

4B065BC50

4B065CA44

(57)【要約】

【課題】組織培養を長期に継続可能とする培養器具を提供する。また、このような培養器具を備え、組織培養を長期に渡って継続しやすい培養キットを提供する。さらに、組織培養を長期に渡って継続しやすい組織の培養方法を提供する。
【解決手段】底部を有する筒状のセルカルチャーインサートと、セルカルチャーインサートに挿入され、底部の上面で培養される組織に培地を供給する供給部材と、を有し、供給部材は、培地が流動する流路を有する本体部と、セルカルチャーインサート内の供給部材の高さ位置を保持する保持部と、本体部の他端側において流路の開口部を覆って設けられたマイクロニードル部と、を有し、マイクロニードル部は、流路に連通するマイクロニードルを有し、マイクロニードルは、供給部材をセルカルチャーインサート内に挿入した姿勢において底部から離間し、組織に穿刺される培養器具。
【選択図】図６

【特許請求の範囲】

【請求項1】

底部を有する筒状のセルカルチャーインサートと、
前記セルカルチャーインサートに挿入され、前記底部の上面で培養される組織に培地を供給する供給部材と、を有し、
前記供給部材は、前記培地が流動する流路を有する本体部と、
前記セルカルチャーインサート内の前記供給部材の高さ位置を保持する保持部と、
前記本体部の他端側において前記流路の開口部を覆って設けられたマイクロニードル部と、を有し、
前記マイクロニードル部は、前記流路に連通するマイクロニードルを有し、
前記マイクロニードルは、前記供給部材を前記セルカルチャーインサート内に挿入した姿勢において前記底部から離間し、前記組織に穿刺される培養器具。

【請求項2】

前記本体部の外側面に設けられ、前記本体部と前記セルカルチャーインサートの内面とを離間させる離間部を有する請求項１に記載の培養器具。

【請求項3】

前記本体部の一端側に接続され、前記流路と連通する供給管を有する請求項１又は２に記載の培養器具。

【請求項4】

前記本体部と前記供給管とを接続する接続部材を有する請求項３に記載の培養器具。

【請求項5】

前記接続部材は、前記本体部に設けられた第１接続部と、
前記供給管の端部に設けられた第２接続部と、を有し、
前記第１接続部と前記第２接続部とが合わさって前記本体部と前記供給管とを接続する請求項４に記載の培養器具。

【請求項6】

前記供給管を支持する支持部材を有する請求項３に記載の培養器具。

【請求項7】

前記マイクロニードル部は、前記本体部に対して交換可能に設けられている請求項１又は２に記載の培養器具。

【請求項8】

前記マイクロニードル部と交換可能な第２マイクロニードル部を有し、
前記第２マイクロニードル部が有するマイクロニードルは、前記マイクロニードル部が有するマイクロニードルと構成が異なる請求項７に記載の培養器具。

【請求項9】

請求項１又は２に記載の培養器具と、
複数のウェルを備え、前記ウェルに培地を貯留するウェルプレートと、を有する培養キット。

【請求項10】

組織を培地に浸漬するとともに、前記組織の内部に配置した供給部材から前記組織の内部に培地を供給する組織の培養方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、培養器具、培養キット及び組織の培養方法に関する。

【背景技術】

【0002】

従来、生命科学の分野では、組織を培養し、得られた組織を用いて種々の研究が行われている。これらの組織は、通常、ウェルプレート等の培養容器に貯留された培地に浸漬された状態で培養されている。その際、培養される組織を、セルカルチャーインサートのメンブレン上に配置された状態で培養する方法が広く採用されている（例えば、特許文献１参照）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】特開２０２１－１４１８７７号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

上述のような従来の培養方法においては、培養する組織の周囲に配置された培地から組織に栄養素が供給される。そのため、成長した組織では、成長前の組織と比べ、培地から組織内部にまで培地（に含まれる栄養素）が届きにくいということが生じる。その結果、成長した組織では、組織の内部から壊死や炎症が生じ易く、実験の長期継続が困難となっていた。

【0005】

本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであって、組織培養を長期に継続可能とする培養器具を提供することを目的とする。また、このような培養器具を備え、組織培養を長期に渡って継続しやすい培養キットを提供することを合わせて目的とする。さらに、組織培養を長期に渡って継続しやすい組織の培養方法を提供することを併せて目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

上記の課題を解決するため、本発明の一態様は、以下の態様を包含する。

【0007】

［１］底部を有する筒状のセルカルチャーインサートと、前記セルカルチャーインサートに挿入され、前記底部の上面で培養される組織に培地を供給する供給部材と、を有し、前記供給部材は、前記培地が流動する流路を有する本体部と、前記セルカルチャーインサート内の前記供給部材の高さ位置を保持する保持部と、前記本体部の他端側において前記流路の開口部を覆って設けられたマイクロニードル部と、を有し、前記マイクロニードル部は、前記流路に連通するマイクロニードルを有し、前記マイクロニードルは、前記供給部材を前記セルカルチャーインサート内に挿入した姿勢において前記底部から離間し、前記組織に穿刺される培養器具。

【0008】

［２］前記本体部の外側面に設けられ、前記本体部と前記セルカルチャーインサートの内面とを離間させる離間部を有する［１］に記載の培養器具。

【0009】

［３］前記本体部の一端側に接続され、前記流路と連通する供給管を有する［１］又は［２］に記載の培養器具。

【0010】

［４］前記本体部と前記供給管とを接続する接続部材を有する［３］に記載の培養器具。

【0011】

［５］前記接続部材は、前記本体部に設けられた第１接続部と、前記供給管の端部に設けられた第２接続部と、を有し、前記第１接続部と前記第２接続部とが合わさって前記本体部と前記供給管とを接続する［４］に記載の培養器具。

【0012】

［６］前記供給管を支持する支持部材を有する［３］から［５］のいずれか1項に記載の培養器具。

【0013】

［７］前記マイクロニードル部は、前記本体部に対して交換可能に設けられている［１］から［６］のいずれか１項に記載の培養器具。

【0014】

［８］前記マイクロニードル部と交換可能な第２マイクロニードル部を有し、前記第２マイクロニードル部が有するマイクロニードルは、前記マイクロニードル部が有するマイクロニードルと構成が異なる［７］に記載の培養器具。

【0015】

［９］［１］から［８］のいずれか１項に記載の培養器具と、複数のウェルを備え、前記ウェルに培地を貯留するウェルプレートと、を有する培養キット。

【0016】

［１０］組織を培地に浸漬するとともに、前記組織の内部に配置した供給部材から前記組織の内部に培地を供給する組織の培養方法。

【発明の効果】

【0017】

本発明によれば、組織培養を長期に継続可能とする培養器具を提供することができる。また、このような培養器具を備え、組織培養を長期に渡って継続しやすい培養キットを提供することができる。さらに、組織培養を長期に渡って継続しやすい組織の培養方法を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】図１は、培養キット１０００の概略斜視図である。

【図2】図２は、培養器具１００の分解斜視図である。

【図3】図３は、培養器具１００の分解断面図である。

【図4】図４は、マイクロニードル部２５の断面図である。

【図5】図５は、マイクロニードル部２５の底面図である。

【図6】図６は、培養キット１０００及び培養器具１００の使用方法を示す模式図である。

【図7】図７は、支持部材６０の説明図である。

【図8】図８は、供給部材の変形例を示す分解斜視図である。

【図9】図９は、供給部材の変形例を示す分解斜視図である。

【図10】図１０は、供給部材の変形例を示す分解斜視図である。

【図11】図１１は、変形例にかかる組織の培養方法の説明図である。

【図12】図１２は、実施例の皮膚組織を示す拡大写真である。

【図13】図１３は比較例の皮膚組織を示す拡大写真である。

【図14】図１４は、皮膚細胞が産生した物質の量を示すグラフである。

【図15】図１５は、皮膚細胞が産生した物質の量を示すグラフである。

【図16】図１６は、皮膚細胞が産生した物質の量を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0019】

以下、図１～図１１を参照しながら、本実施形態に係る培養器具、培養キット及び組織の培養方法について説明する。なお、以下の全ての図面においては、図面を見やすくするため、各構成要素の寸法や比率などは適宜異ならせてある。

【0020】

以下の説明においては、ｘｙｚ直交座標系を設定し、このｘｙｚ直交座標系を参照しつつ各部材の位置関係について説明する。ここでは、水平面内の所定方向をｘ軸方向、水平面内においてｘ軸方向と直交する方向をｙ軸方向、ｘ軸方向及びｙ軸方向のそれぞれと直交する方向（すなわち鉛直方向）をｚ軸方向とする。「平面視」とは、＋ｚ方向からの視野において対象物を観察する視野を意味する。

【0021】

また、＋ｚ方向を「上」、－ｚ方向を「下」と称することがある。また、各構成を説明する際、部材の上方の端部を「一端」、部材の下方の端部を「他端」と称することがある。

【0022】

《培養キット、培養器具》
図１は、培養キット１０００の概略斜視図である。培養キット１０００は、本実施形態の培養器具１００と、ウェルプレート５０と、を有する。

【0023】

[ウェルプレート]
ウェルプレート５０は、天板５１と、天板５１を支持する枠体５２と、天板５１に設けられた複数（図では１２つ）のウェル５３と、を有する。培養キット１０００の使用時には、培養器具１００はウェル５３に挿入される。

【0024】

天板５１は、平面視で矩形であり、同じく平面視矩形を呈する筒状の枠体５２の内周面に接続され支持されている。

【0025】

ウェル５３は、細胞培養に用いる培地を貯留する。ウェル５３は、天板５１において３行４列のマトリクス状に配列している。ウェル５３の底部は、公知の種々の形状を採用し得る。ウェル５３の底部は、平底であってもよく、丸底であってもよく、Ｖ底であってもよい。

【0026】

ウェルプレート５０は、ウェルプレートの材料として公知の材料で形成されている。例えば、ウェルプレート５０の材料は、ポリスチレンを採用することができる。

【0027】

図２は、培養器具１００の分解斜視図である。図３は、培養器具１００の分解断面図である。図２，３に示すように、培養器具１００は、セルカルチャーインサート１０と、供給部材２０Ａと、を有する。以下の説明においては、セルカルチャーインサートを「インサート」と略称することがある。

【0028】

［セルカルチャーインサート］
インサート１０は、一端が開口し、他端に底部１２０を有する筒状の部材である。詳細には、インサート１０は、一端１１０ｘが開口する筒状の側壁１１０と、側壁１１０の他端１１０ｙに設けられた底部１２０とを有する。

【0029】

側壁１１０は、一端側に設けられた筒状の第１側壁部１１１と、第１側壁部１１１の他端側において第１側壁部１１１に接続された筒状の第２側壁部１１２と、を有する。第１側壁部１１１は、第２側壁部１１２よりも開口径が大きい。

【0030】

側壁１１０は、セルカルチャーインサートの材料として公知の材料で形成されている。例えば、側壁１１０の材料は、ポリスチレンを採用することができる。

【0031】

底部１２０は、樹脂製の膜（メンブレン）が用いられている。底部１２０の上面１２０ａには細胞が播種されて培養され、組織Ｘを形成している。培養中の組織Ｘには、底部１２０を介してウェル５３内の培地が供給される。

【0032】

培養キット１０００及び培養器具１００を用いた操作では、組織Ｘとして種々の組織を培養することができる。組織Ｘとしては、培養皮膚、培養軟骨、培養心筋シート等のヒトの組織、マウス等のヒト以外の動物の組織、及び動物の組織を模した人工臓器等の人工組織が挙げられる。

【0033】

［供給部材］
供給部材２０Ａは、供給部２１と、マイクロニードル部２５と、を有し、培地が流動する流路２０ｘを有する。また、供給部材２０Ａには、流路２０ｘと連通し、培地を供給する供給管３０が接続されている。供給部材２０Ａは、インサート１０に挿入され、底部１２０の上面１２０ａで培養される組織Ｘに培地を供給する機能を有する。

【0034】

（供給部）
供給部２１は、本体部２１１と、保持部２１２と、結合部２１３と、離間部２１４と、第１接続部２１５と、第２接続部２１６とを有する。本体部２１１、保持部２１２、結合部２１３、離間部２１４及び第１接続部２１５は一体的に構成され、第２接続部２１６は別部材として構成されている。

【0035】

本体部２１１は、両端が開口した筒状部材であり、培地が流動する流路２１１ｘを有する。流路２１１ｘの一端側は、流路２１１ｘよりも拡径された孔２１１ｙに連通している。流路２１１ｘの他端側は、下方に向かうに従って徐々に拡径している拡径孔２１１ｚに連通している。流路２１１ｘ及び拡径孔２１１ｚは、供給部材２０Ａの流路２０ｘの一部を構成する。

【0036】

本実施形態の本体部２１１は円筒状の部材であるが、発明の効果を損なわない範囲において、これに限らず種々の形状を採用可能である。

【0037】

保持部２１２は、本体部２１１の一端側において、本体部２１１の外側面２１１ａから本体部２１１の径方向外側に広がる平面視円盤状（フランジ状）の部分である。供給部材２０Ａをインサート１０に挿入した姿勢において、保持部２１２の下面２１２ａ（インサート１０側の面）は、インサート１０の一端側の端面１０ａに接し、インサート１０内の供給部材２０Ａの高さ位置を保持する。

【0038】

保持部２１２の周縁部には、切り欠き２１２ｘが形成されている。図２では、切り欠き２１２ｘが１つ図示しているが、これに限らず、２以上であってもよい。切り欠き２１２ｘは、供給部材２０Ａをインサート１０に挿入した姿勢において、インサート１０内と外部とをつなぐ空気穴として機能する。

【0039】

結合部２１３は、本体部２１１の他端側において、本体部２１１の外側面２１１ａから本体部２１１の径方向外側に広がる平面視円盤状（フランジ状）の部分である。結合部２１３は、フランジ状の基部２１３ａと、基部２１３ａの下面の周縁部において平面視円環状に設けられた凸状部２１３ｂとを有する。また、基部２１３ａの下面には、凸状部２１３ｂの内側に円環状の溝部２１３ｃが設けられている。結合部２１３には、マイクロニードル部２５が結合している。

【0040】

離間部２１４は、本体部２１１の外側面２１１ａに設けられている。離間部２１４は、本体部２１１の軸方向と同方向に延びる平板状の構造であり、本体部２１１の外側面２１１ａにおいて本体部２１１の周方向の複数個所に互いに等間隔に配置されている。複数の離間部２１４は、同形状、且つ同じ大きさである。本実施形態においては、離間部２１４は、本体部２１１の周方向に等間隔に４か所配置されている。

【0041】

離間部２１４は、供給部材２０Ａがインサート１０に挿入された姿勢において、インサート１０の内面１１０ａと干渉することにより、本体部２１１とインサート１０の内面１１０ａとを離間させる。そのため、供給部材２０Ａは、インサート１０に挿入した姿勢において、本体部２１１をインサート１０の中心に配置させやすい。インサート１０において培養される組織Ｘは、通常、インサート１０の底部１２０の中央に配置されるため、供給部２１が離間部２１４を有することにより、供給部材２０Ａが組織Ｘに正対しやすい。

【0042】

第１接続部２１５及び第２接続部２１６は、供給部２１（本体部２１１）と供給管３０とを接続する本発明の「接続部材」に該当する。

【0043】

第１接続部２１５は、供給部２１（本体部２１１）に設けられ、供給部２１と供給管３０とを接続する。第１接続部２１５は、保持部２１２の上面２１２ｂにおいて、平面視中央に設けられている。第１接続部２１５は、筒状に設けられ本体部２１１の孔２１１ｙと連通する貫通孔を有する。

【0044】

第２接続部２１６は、供給管３０の端部に設けられている。第２接続部２１６は、一端が閉じ他端が開口する筒状の第１部材２１６ａと、第１部材２１６ａの内部に挿入された筒状の第２部材２１６ｂと、第１部材２１６ａの上面において平面地中央に設けられた筒状の第３部材２１６ｃとを有する。第３部材２１６ｃは、上端の外周面が円錐台状に形成され、円錐台状の端部の下部には反し２１６ｄを有する。

【0045】

第２接続部２１６は、第３部材２１６ｃの上端から第２部材２１６ｂの下端まで連通する貫通孔２１６ｘを有する。貫通孔２１６ｘは、供給部材２０Ａの流路２０ｘの一部を構成する。

【0046】

第２接続部２１６は、第１接続部２１５の孔２１１ｙに封止部材（Ｏリング）ＯＲを挿入した状態で第２部材２１６ｂを挿入することで、第１接続部２１５と液密に接続可能である。第１接続部２１５と第２接続部２１６とは、公知のルアーロック方式の接続方式を採用している。第１接続部２１５と第２接続部２１６との接続方法は、これに限らず、ねじ止め方式やルアースリップ方式など、他の公知の接続方法であってもよい。

【0047】

（マイクロニードル部）
図４は、マイクロニードル部２５の断面図である。図５は、マイクロニードル部２５の底面図である。

【0048】

図４，５に示すように、マイクロニードル部２５は、平面視円形の部材である。マイクロニードル部２５は、平面視円盤状の基部２５１と、基部２５１の上面の周縁部において平面視円環状に設けられた凸状部２５２と、基部２５１の下面に設けられた複数のマイクロニードルと、を有する。マイクロニードルは、直径や長さが１ｍｍ未満（μｍオーダー）の針である。

【0049】

基部２５１の平面視中央には、上方に盛り上がる凸部２５１ａが設けられている。

【0050】

マイクロニードル部２５は、凸状部２５２を結合部２１３の溝部２１３ｃに挿入し、供給部２１に液密に接続する。

【0051】

マイクロニードル部２５が供給部２１に接続された姿勢において、マイクロニードル部２５と供給部２１との間には、空間２５ｘが形成されている。また、凸部２５１ａは、流路２１１ｘ（拡径孔２１１ｚ）に面する位置に配置される。空間２５ｘは、供給部材２０Ａの流路２０ｘの一部を構成する。

【0052】

マイクロニードル部２５は、マイクロニードルとして、第１マイクロニードル２５５と第２マイクロニードル２５６とを有する。第１マイクロニードル２５５と第２マイクロニードル２５６とは、それぞれ４本ずつ設けられ、基部２５１の下面において平面視で周方向に交互且つ等角度間隔に配置している。図４，５においては、マイクロニードル部２５は第１マイクロニードル２５５と第２マイクロニードル２５６とをそれぞれ４本ずつ有することとしたが、これに限らない。

【0053】

第１マイクロニードル２５５及び第２マイクロニードル２５６の先端は、平面視でマイクロニードル部２５の内側に面する傾斜面となっている。

【0054】

第１マイクロニードル２５５は、基部２５１の上面に達する貫通孔２５５ｘを有する。貫通孔２５５ｘの基部２５１側は、基部２５１側に向かって徐々に拡径している。

【0055】

一方で、第２マイクロニードル２５６は、貫通孔を有さない。

【0056】

第１マイクロニードル２５５の高さ（基部２５１の底面からニードル先端までのＺ方向の距離）と第２マイクロニードル２５６の高さとは、異なっていてもよいが、同じであると好ましい。なお、第１マイクロニードルの高さと第２マイクロニードルの高さとが「同じ」とする場合、成形誤差を許容する。

【0057】

第１マイクロニードル２５５、第２マイクロニードル２５６の高さは、例えば１０μｍ以上１００μｍ以下である。

【0058】

このようなマイクロニードル部２５においては、流路２１１ｘを流動する培地Ｌは、マイクロニードル部２５の凸部２５１ａに衝突して空間２５ｘ内に拡散し、貫通孔２５５ｘを介して第１マイクロニードル２５５の先端から供給される。

【0059】

マイクロニードル部２５は、本体部２１１に対して交換可能に設けられていてもよく、取り外しができないよう結合部２１３に固定されていてもよい。

【0060】

マイクロニードル部２５が交換可能である場合、培養器具１００は、マイクロニードル部２５と交換可能な、又は予備の第２マイクロニードル部を有するキットであってもよい。その場合、培養器具１００は、第２マイクロニードル部を複数有し、実験ごとに交換可能であってもよい。

【0061】

第２マイクロニードル部が有するマイクロニードルは、マイクロニードル部２５が有するマイクロニードルと同じ構成であってもよく、構成が異なっていてもよい。マイクロニードルの「構成」としては、個々のマイクロニードルの構成と、マイクロニードル全体の構成と、の両方が挙げられる。

【0062】

個々のマイクロニードルの構成としては、マイクロニードルの長さ、直径、先端の傾斜面の傾斜角、第１マイクロニードル２５５の貫通孔２５５ｘの直径等、が挙げられる。

【0063】

マイクロニードル全体の構成としては、複数のマイクロニードルの配置、マイクロニードルの総数、第１マイクロニードル２５５の総数、第２マイクロニードル２５６の総数等、が挙げられる。

【0064】

マイクロニードル部と第２マイクロニードル部とでマイクロニードルの「構成」が異なることにより、実験内容に応じて適切なマイクロニードル部を用いて培養を行うことができる。

【0065】

例えば、図４，５においては、マイクロニードル部２５が第１マイクロニードル２５５を４本有することとして示したが、第１マイクロニードル２５５の数が増えると、培地Ｌの供給の際の吐出抵抗が低下する。そのため、培地Ｌの種類や供給速度に応じ、安定した培地Ｌの注入を実現するために、第１マイクロニードル２５５の数を異ならせた第２マイクロニードル部を用意し、適宜交換するとよい。

【0066】

第１マイクロニードル部２５５の貫通孔２５５ｘの直径についても、上記第１マイクロニードル２５５の数と同様の考え方で理解することができる。

【0067】

［組織の培養方法］
図６は、培養キット１０００及び培養器具１００の使用方法を示す模式図であり、本実施形態の組織の培養方法の説明図である。

【0068】

本実施形態の組織の培養方法では、組織Ｘを培地Ｌに浸漬するとともに、組織Ｘの内部に配置した供給部材２０Ａから組織Ｘの内部に培地Ｌを供給する。このような方法を実施するため、上述した培養キット１０００及び培養器具１００は、次のように用いられる。

【0069】

インサート１０の底部１２０には、組織Ｘとして皮膚細胞を培養していることとして説明する。組織Ｘは、例えば１ｍｍ厚に成長した組織であることとする。

【0070】

まず、インサート１０に供給部材２０Ａを挿入して培養器具１００を組み立てる。供給部材２０Ａは、保持部２１２がインサート１０の上端の縁に接することにより、インサート１０内の高さ位置が保持される。供給部材２０Ａが有するマイクロニードル（第１マイクロニードル２５５、第２マイクロニードル２５６）は、供給部材２０Ａをインサート１０内に挿入した姿勢（保持部２１２により保持された高さ位置）において、底部１２０から離間し、組織Ｘに穿刺されている。

【0071】

マイクロニードル部２５が組織Ｘに穿刺される際、マイクロニードル部２５の下方の第１マイクロニードル２５５と第２マイクロニードル２５６とが組織Ｘに押し当てられる。このとき、第２マイクロニードル２５５は、組織Ｘに食い込み、マイクロニードル部２５の組織Ｘの表面方向へのずれを抑制する「滑り止め」として機能する。

【0072】

また、マイクロニードル部２５が第２マイクロニードル２５６を有することで、穿刺時に周方向に隣り合う第２マイクロニードル２５６間で組織Ｘを伸ばし広げ、組織Ｘに適度な張りを与える。そのため、マイクロニードル部２５が４本の第１マイクロニードル２５５を有し第２マイクロニードル２５６を有さない場合と比べると、柔らかい組織Ｘや弾性に富む組織Ｘに第１マイクロニードル２５５を穿刺しやすい。

【0073】

培養器具１００は、培地Ｌが貯留されたウェルプレート５０のウェル５３に挿入される。培養器具１００は、インサート１０の外側面の上端部においてウェル５３の縁に接し、ウェル５３内で高さ位置が保持される。ウェル５３内の培地Ｌは、メンブレン製の底部１２０を介して組織Ｘの外表面に供給される。組織Ｘは、外表面から培地Ｌを吸収する。

【0074】

一方、供給部材２０Ａには、不図示の貯留部から供給管３０を介して培地Ｌが供給される。不図示の貯留部には、適宜シリンジポンプ等の微量ポンプが接続されていてもよい。培地Ｌは、断続的に供給されてもよく、微量ずつ連続的に供給されてもよい。

【0075】

このとき、ウェルプレート５０に対して複数の培養器具１００を取り付ける場合、各培養器具１００が有する供給管３０の弾性や重みにより培養キット１０００が動きやすく、静置が困難となるおそれがある。そのため、培養器具１００は、複数の供給管３０を支持する支持部材を有することとしてもよい。

【0076】

図７は、支持部材６０の説明図である。支持部材６０は、一対の柱部６１と、柱部６１の間に渡された支持部６２とを有する。支持部６２は、複数の凹部６２ａを有している。複数の供給管３０は、支持部材６０の凹部６２ａに引っ掛かり、支持されるとともに動きが規制されている。

【0077】

なお、ここに示す支持部材６０は一例であり、供給管３０を支持することが可能であれば種々の構成を採用することができる。支持部材６０は、複数の供給管３０を同時に支持することとしたが、これに限らず、１つの支持部材で１つの供給管３０を支持する構成であってもよい。

【0078】

培地Ｌは、供給部材２０Ａが有する流路２０ｘ（貫通孔２１６ｘ、流路２１１ｘ、拡径孔２１１ｚ、空間２５ｘ及び貫通孔２５５ｘが連通した流路２０ｘ）を介して、組織Ｘに穿刺された第１マイクロニードル２５５の先端から組織Ｘの内部に供給される。組織Ｘは、内部において培地Ｌを吸収する。

【0079】

このとき、第１マイクロニードル２５５が平面視において等角度間隔に配置されているため、組織Ｘに接する供給部材２０Ａの接触箇所においては、偏り無く培地Ｌを供給することができる。

【0080】

すなわち、培養キット１０００（培養器具１００）は、培養される組織Ｘに対して、組織Ｘの外表面及び内部に培地Ｌを供給することができる。これにより、培養キット１０００（培養器具１００）を用いた組織の培養方法では、成長した後の組織Ｘであっても、組織内部にまで効果的に培地を供給することができ、実験を長期に継続可能となる。

【0081】

なお、本実施形態においては、本体部２１１と供給管３０とを接続する接続部材として、第１接続部２１５と第２接続部２１６とがルアーロック方式で接続する構成を示したが、これに限らない。

【0082】

図８，９は、供給部材の変形例を示す分解斜視図である。図８に示す供給部材２０Ｂは、上述の供給部材２０Ａと異なり、保持部２１２の平面視中央には第１接続部が設けられておらず、代わりに孔２１２ｙが形成されている。孔２１２ｙは、不図示の流路２１１ｘと連通している。

【0083】

また、供給管３０の端部には、接続部材２１７が設けられている。接続部材２１７は、外周面がテーパ面である円錐台状の部材であり、供給管３０の内部空間と連通する不図示の貫通孔を有する。

【0084】

供給部材２０Ｂでは、このような接続部材２１７を孔２１２ｙに差し込むことにより、本体部２１１と供給管３０とを接続する。

【0085】

図９に示す供給部材２０Ｃは、上述の供給部材２０Ａと異なり、供給管３０の端部に第２接続部が設けられていない。また、保持部２１２の平面視中央には第１接続部が設けられておらず、代わりに接続部材２１８が形成されている。接続部材２１８は、貫通孔２１８ｘを有する筒状部材であり、上端の外周面が円錐台状に形成されている。貫通孔２１８ｘは、不図示の流路２１１ｘと連通している。

【0086】

供給部材２０Ｃでは、このような接続部材２１８に供給管３０を差し込むことにより、本体部２１１と供給管３０とを接続する。

【0087】

また、本実施形態においては、本体部２１１が平板状の離間部２１４を４つ有することとしたが、これに限らない。図１０は、供給部材の変形例を示す断面図である。

【0088】

図１０に示す供給部材２０Ｄは、上述の供給部材２０Ａと異なり、平板状の離間部２１４を有していない。また、供給部材２０Ｄは、供給部材２０Ａの保持部２１２の代わりに、椀状の保持部２１９を有する。

【0089】

保持部２１９は、フランジ部２１９ａと、テーパ部２１９ｂ、円環部２１９ｃととを有する。フランジ部２１９ａは、本体部２１１の外側面２１１ａから本体部２１１の径方向外側に広がる平面視円盤状の構造である。

【0090】

テーパ部２１９ｂは、フランジ部２１９ａの外縁に接続し、上方に向かって拡径する円錐台状の管状部である。

【0091】

円環部２１９ｃは、テーパ部２１９ｂの外縁に接続する環状の構造である。

【0092】

このような供給部材２０Ｄにおいては、インサート１０に供給部材２０Ｄを挿入した姿勢において、円環部２１９ｃがインサートの一端側の端面１０ａに接し、インサート１０内の供給部材２０Ｄの高さ位置を保持する。また、保持部２１９の外周面２１９ｘがインサート１０の内面１１０ａと干渉することにより、本体部２１１とインサート１０の内面１１０ａとを離間させる。そのため、供給部材２０Ｄは、インサート１０に挿入した姿勢において、本体部２１１をインサート１０の中心に配置させやすい。すなわち、供給部材２０Ｄの保持部２１９は、離間部としても機能する。

【0093】

また、本実施形態においては、組織の培養方法を実施する際に上述の培養キット１０００及び培養器具１００を用いることとして説明したが、組織の培養方法を実施する上で培養キット１０００及び培養器具１００は必須ではない。

【0094】

図１１は、変形例にかかる組織の培養方法の説明図である。図１１に示す組織の培養方法では、不図示の貯留部と、配管２００とを有する培養キットを用いる。

【0095】

図１１に示す構成では、培地Ｌが流動する配管２００の外側面２００ａに細胞を播種し、組織Ｘを培養している。配管２００の管壁には微細な複数の貫通孔２００ｘが設けられており、組織Ｘは貫通孔２００ｘを覆っている。さらに、配管２００は、不図示の貯留部に貯留された培地Ｌに浸漬されている。

【0096】

このような組織の培養方法においても、組織Ｘは、外表面から培地Ｌを吸収するとともに、組織Ｘの内部からも培地Ｌを吸収される。そのため、成長した後の組織Ｘであっても、組織内部にまで効果的に培地を供給することができ、実験を長期に継続可能となる。

【0097】

以上、添付図面を参照しながら本発明に係る好適な実施の形態例について説明したが、本発明は係る例に限定されない。上述した例において示した各構成部材の諸形状や組み合わせ等は一例であって、本発明の主旨から逸脱しない範囲において設計、仕様等に基づき種々変更可能である。

【実施例0098】

以下に本発明を実施例により説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

【0099】

本実施例においては、上述した供給部材２０Ａを有する培養器具１００（培養キット１０００）を用いて皮膚組織を培養した。すなわち、実施例においては、皮膚組織の表面に培地を供給するとともに、上記供給部材２０Ａにより皮膚組織の内部にも培地を供給した。

【0100】

比較例として、上述の供給部材を用いず、セルカルチャーインサートとウェルプレートとを用いた公知の培養キットを用いて皮膚細胞を培養した。すなわち、比較例においては、皮膚組織の表面にのみ培地を供給した。

【0101】

直径約１２ｍｍ、厚さ約９００μｍの市販のヒト腹部皮膚片（Biopredic International社）を実験に用いた。各皮膚片を、セルカルチャーインサート（Thermo Fisher Scientific社製）内に設置し、培養用培地（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium（Thermo Fisher Scientific社製））をインサート下部のメンブレンより浸透させて、３７℃、５％ＣＯ_２下で最長１１日間培養した。培養期間中、培地は毎日交換した。

【0102】

実施例では、皮膚上部（表皮側）に供給部材２０Ａのマイクロニードルを刺し、シリンジポンプ（アズワン社製）を用いて２ｍｌ／ｄａｙの速度で皮膚真皮内部へ培地を供給した。

【0103】

（培養組織の様子）
実施例及び比較例の皮膚細胞について、公知の方法で染色し様子を観察した。

【0104】

培養開始時、培養開始５日後及び１１日後の皮膚組織を、それぞれ４％パラホルムアルデヒドで固定して、約１ｍｍの厚さに薄切し、ブロッキングバッファー（Starting Block（ThermoFisher Scientific社製））によりブロッキング処理した。

【0105】

１次抗体として、真皮弾性繊維の可視化のため抗エラスチン抗体（Ｓanta Cruz Biotechnology社）、基底膜の可視化のため抗ＣＯＬ ＶＩＩ抗体（Ａｂｃａｍ社）を用いた。

【0106】

２次抗体として、抗マウスＩｇＧ Ｈ＆Ｌ抗体（Alexa Fluor 488（ThermoFisher Scientific社製））、抗ウサギＩｇＧ抗体（Alexa Fluor 647（ThermoFisher Scientific社製））を用いた。

【0107】

さらに、細胞核染色としてＤＡＰＩ（同仁化学社）を用いた。

【0108】

撮像前には、Rapiclear1.49（サンジンラボ社）により組織透明化処理を行った。撮像は、走査型共焦点レーザー顕微鏡ＡＸ Ｒ（株式会社ニコン製）により、４０倍のｄｒｙレンズを用いて３次元的に撮像した。

【0109】

図１２は、実施例の皮膚組織を示す拡大写真であり、図１３は比較例の皮膚組織を示す拡大写真である。図１２，１３において、符号Ａは表皮、符号Ｂは基底膜、符号Ｃは真皮を示す。また、図１２、１３において、それぞれ（ａ）は培養開始時（０日目）、（ｂ）は培養開始から５日目、（ｃ）は培養開始から１１日目の皮膚組織を示す。図１２（ａ）と図１３（ａ）とは、培養開始時の様子を示す同じ写真である。

【0110】

出願人の知見として、従来の方法で皮膚組織を培養すると、通常は３～４日、長くても１週間ほどで皮膚組織が一部死滅し、真皮と表皮との間が剥離して培養の継続ができないことが分かっている。

【0111】

上記知見を踏まえ図１２を確認すると、実施例の皮膚組織は、培養開始から１１日目であっても真皮と表皮とが剥離することなく、適切に培養されていることが確認できた。

【0112】

対して図１３を確認すると、比較例の皮膚組織は、培養開始から１１日目には真皮と表皮とが剥離している箇所（符号αで示す）が確認でき、従来の知見通り、以後の培養の継続ができないことが確認できた。また、図１３（ｂ）（培養開始から５日目）を詳細に観察すると、細胞核の形状が楕円から真円に近い形状となっており、皮膚細胞が衰弱していることが確認できた。

【0113】

（細胞産生物質の確認）
実施例及び比較例の皮膚細胞について、公知の方法により細胞の産生物質を確認した。確認方法は以下の通りであった。
培養開始から５、１１日後の培地を回収し、細胞毒性の指標として培地中の血清乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の量を、市販の測定キット（富士フイルム和光純薬株式会社）を用い、付属の使用書に基づいて測定した。

【0114】

また、培養１１日後の培地中の炎症性サイトカインの量を、市販の測定キット（BD Cytometric Bead Array (CBA) Human Inflammatory Cytokine Kit（Becton, Dickinson and Company社）を用い、付属の使用書に基づいて測定した。

【0115】

図１４～１６は、皮膚細胞が産生した物質の量を示すグラフである。図１４は、炎症性サイトカインであるインターロイキン６（ＩＬ－６）の量を示すグラフである。図１５は、炎症性サイトカインであるインターロイキン８（ＩＬ－８）の量を示すグラフである。ＩＬ－６及びＩＬ－８は、組織に生じる炎症の程度を示すマーカーとして用いられる。

【0116】

実施例の皮膚組織においては、培養１日目から培養１１日目にかけてＩＬ－６の値が低下し（図１４）、ＩＬ－８の値の上昇が抑制されている（図１５）。そのため、実施例においては、皮膚組織の炎症が抑制されていることが分かる。

【0117】

一方で、比較例の皮膚組織においては、培養１日目から培養１１日目にかけてＩＬ－６及びＩＬ－８の値がいずれも増加しており、皮膚組織に炎症が生じていることが分かる。

【0118】

図１６は、細胞毒性マーカーである血清乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の量を示すグラフである。ＬＤＨは、細胞死が増えると検出量が多くなるため、細胞毒性のマーカーとして用いられる。

【0119】

実施例の皮膚組織においては、培養１１日目までＬＤＨの量の上昇が抑制されており、皮膚細胞の細胞死が抑制されていることが分かる。

【0120】

対して、比較例の皮膚組織においては、培養５日目ですでに培養１１日目に匹敵するほど多量のＬＤＨが検出されている。上述したように、比較例の皮膚組織は、培養５日目では表皮と真皮との剥離は確認できなかったが、上述した図１３（ｂ）における細胞核の形状変化と、図１６に示すＬＤＨ量の急上昇とを合わせて考えると、培養５日目にはすでに多くの細胞が細胞死していることが分かる。

【0121】

以上の結果より、本発明により細胞培養を長期に継続することが可能であることが確認でき、本発明が有用であることが分かった。

【符号の説明】

【0122】

１０…セルカルチャーインサート、１０ａ…端面、２０ｘ，２１１ｘ…流路、２０Ａ，２０Ｂ，２０Ｃ，２０Ｄ…供給部材、２１…供給部、２５…マイクロニードル部、２５ｘ…空間、３０…供給管、５０…ウェルプレート、５１…天板、５２…枠体、５３…ウェル、６０…支持部材、６１…柱部、６２…支持部、６２ａ…凹部、１００…培養器具、１１０…側壁、１１０ａ…内面、１１０ｘ…一端、１１０ｙ…他端、１１１…第１側壁部、１１２…第２側壁部、１２０…底部、１２０ａ，２１２ｂ…上面、２００…配管、２００ａ，２１１ａ…外側面、２００ｘ，２１６ｘ，２１８ｘ，２５５ｘ…貫通孔、２１１…本体部、２１１ｙ，２１２ｙ…孔、２１１ｚ…拡径孔、２１２，２１９…保持部、２１２ａ…下面、２１２ｘ…切り欠き、２１３…結合部、２１３ａ，２５１…基部、２１３ｂ，２５２…凸状部、２１３ｃ…溝部、２１４…離間部、２１５…第１接続部、２１６…第２接続部、２１６ａ…第１部材、２１６ｂ…第２部材、２１６ｃ…第３部材、２１６ｄ…反し、２１７，２１８…接続部材、２１９ａ…フランジ部、２１９ｂ…テーパ部、２１９ｃ…円環部、２１９ｘ…外周面、２５１ａ…凸部、２５５…第１マイクロニードル、２５６…第２マイクロニードル、１０００…培養キット、Ｌ…培地、ＯＲ…封止部材（Ｏリング）、Ｘ…組織

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】