特開 2025-9426 糖尿病の治療薬

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2025009426

(43)【公開日】2025-01-20

(54)【発明の名称】糖尿病の治療薬

(51)【国際特許分類】

   A61K 48/00 20060101AFI20250110BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20250110BHJP

   A61P 5/50 20060101ALI20250110BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20250110BHJP

   A61K 38/17 20060101ALI20250110BHJP

【ＦＩ】

A61K48/00

A61P3/10

A61P5/50

A61P43/00 105

A61K38/17

A61P43/00 111

【審査請求】未請求

【請求項の数】3

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023112427

(22)【出願日】2023-07-07

(71)【出願人】

【識別番号】504145342

【氏名又は名称】国立大学法人九州大学

(71)【出願人】

【識別番号】300061835

【氏名又は名称】公益財団法人神戸医療産業都市推進機構

(74)【代理人】

【識別番号】100079108

【弁理士】

【氏名又は名称】稲葉 良幸

(74)【代理人】

【識別番号】100109346

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 敏史

(74)【代理人】

【識別番号】100117189

【弁理士】

【氏名又は名称】江口 昭彦

(74)【代理人】

【識別番号】100134120

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 和彦

(72)【発明者】

【氏名】稲田 明理

(72)【発明者】

【氏名】稲田 扇

【テーマコード（参考）】

4C084

【Ｆターム（参考）】

4C084AA13

4C084BA44

4C084MA52

4C084MA55

4C084NA14

4C084ZB211

4C084ZB212

4C084ZC031

4C084ZC032

4C084ZC351

4C084ZC352

(57)【要約】

【課題】有効性の高い糖尿病の治療薬を提供する。
【解決手段】ＧＲＥＢ１（Ｇｒｏｗｔｈ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ Ｂｙ Ｅｓｔｒｏｇｅｎ Ｉｎ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ １）又はＧＲＥＢ１をコードする核酸を含む、糖尿病の治療薬。ＧＲＥＢ１又はＧＲＥＢ１をコードする核酸を含む、β細胞増殖剤。ＧＲＥＢ１又はＧＲＥＢ１をコードする核酸を含む、インスリン産生促進剤。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＧＲＥＢ１（Ｇｒｏｗｔｈ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ Ｂｙ Ｅｓｔｒｏｇｅｎ Ｉｎ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ １）又はＧＲＥＢ１をコードする核酸を含む、糖尿病の治療薬。

【請求項2】

ＧＲＥＢ１（Ｇｒｏｗｔｈ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ Ｂｙ Ｅｓｔｒｏｇｅｎ Ｉｎ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ １）又はＧＲＥＢ１をコードする核酸を含む、β細胞増殖剤。

【請求項3】

ＧＲＥＢ１（Ｇｒｏｗｔｈ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ Ｂｙ Ｅｓｔｒｏｇｅｎ Ｉｎ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ １）又はＧＲＥＢ１をコードする核酸を含む、インスリン産生促進剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、糖尿病の治療薬に関する。

【背景技術】

【0002】

血中のグルコース濃度である血糖値は、インスリン、グルカゴン、及びコルチゾール等の様々なホルモンの働きによって、常に一定範囲内に調節されている。これらのホルモンの中でも、インスリンは唯一血糖値を下げることが可能であり、膵臓のβ細胞で産生されている。β細胞が減少すると、体内でインスリンが不足し、血中のグルコースが正常範囲を逸脱し、糖尿病を発症する。近年、糖尿病患者が世界中で急増している。なお、糖尿病患者の約９０％は２型糖尿病である。

【0003】

これまで多くの２型糖尿病の治療薬が開発されてきている。例えば、体内のインスリンを補充するインスリン注射、体内に残存するβ細胞を刺激してインスリン分泌させる治療薬、筋肉や脂肪細胞内におけるインスリン感受性を改善する治療薬、腎臓において糖を尿中に排出させる治療薬、腸における糖の吸収を遅延又は抑制させる治療薬、及び肝臓における糖の産生を抑制する治療薬などがある。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】国際公開第２００４／０７２２８２号

【特許文献2】国際公開第２０１１／００７８８２号

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】The Journal of Biological Chemistry 1999, 274 (30): 21095-21103

【非特許文献2】Molecular and Cellular Biology 2004, 24(7): 2831-28412831-2841

【非特許文献3】The American Journal of Pathology 2005, 167 (2): 327-336

【非特許文献4】The American Journal of Pathology 2022, 192 (7): 1028-1052

【非特許文献5】Endocrinology 2014, 155(10): 3829-3842

【非特許文献6】Journal of American Society Nephrology 2016, 27(10): 3035-3050

【非特許文献7】Endocrinology 2016, 157(12): 4691-4705

【非特許文献8】JAMA 1935,105: 257-263; J Clin Invest 1939, 18: 715-722

【非特許文献9】J Clin Endocrinol Metab 1997, 82: 638-643

【非特許文献10】Diabetologia 1997, 40: 843-849

【非特許文献11】Br J Obstet Gynaecol 2000, 107; 1017-1021

【非特許文献12】J Clin Endocrinol Metab 2001, 86: 48-52

【非特許文献13】Diabet Med 2007, 24: 906-910

【非特許文献14】Proc Natul Acad Sci USA 2006, 103: 9232-9237

【非特許文献15】Nature Metabolism 2022, 2: 192-209

【非特許文献16】Scientific Reports 2015, 5: 10211

【非特許文献17】Cell Reports Medicine 2022, 3,100598

【非特許文献18】Diabetologia 2015, 58: 604-614

【非特許文献19】Diabetes Care 2007, 30 (4): 989-992

【非特許文献20】日本糖尿病学会誌「糖尿病」2005, 48 (9): 677-684

【非特許文献21】日本糖尿病学会誌「糖尿病」2006, 49 (8): 679-684

【非特許文献22】日本糖尿病学会誌「糖尿病」2007, 50 (1): 1-8

【非特許文献23】日本糖尿病学会誌「糖尿病」2001, 44 (1): 17-22

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

従来の糖尿病の治療薬は、いずれも、インスリン分泌を完全に制御したり、減少したβ細胞を回復したり、血糖値を正常に戻すことはできない。そのため、より有効性が高い糖尿病の治療薬が求められている。そこで、本発明は、有効性の高い糖尿病の治療薬を提供することを目的の一つとする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明者らは、糖尿病の主な原因であるインスリン不足を解消するため、膵臓β細胞のインスリン遺伝子の転写調節機構について研究し、インスリン遺伝子の転写を抑制する因子である誘導性ｃＡＭＰ早期抑制因子（ＩＣＥＲ）を同定した（非特許文献１参照。）。また、本発明者らは、β細胞に特異的にＩＣＥＲを過剰発現するトランスジエニックマウス（ＩＣＥＲ－Ｔｇマウス）を作製し、ＩＣＥＲ－Ｔｇマウスではβ細胞が枯渇し、インスリンの産生が低下して、ＩＣＥＲ－Ｔｇマウスは早期から重度の糖尿病を発症することを示した（非特許文献２参照。）。これらの結果をもとに、本発明者らは、ＩＣＥＲ－Ｔｇマウスを、高血糖を維持する重症２型糖尿病・糖尿病性腎症モデルとして確立した（非特許文献３、４及び特許文献１参照。）。

【0008】

さらに、本発明者らは、オスのＩＣＥＲ－Ｔｇマウスに、エストロゲンの一種である１７βエストラジオール（Ｅ２）を投与して、オスのＩＣＥＲ－Ｔｇマウスにおいて男性ホルモンであるアンドロゲンと女性ホルモンである１７βエストラジオールの比率を、メスのＩＣＥＲ－Ｔｇマウスにおける比率に近づけたところ、膵島や膵管でβ細胞が急速に増殖誘導され、病態が著しく回復することを見出した（非特許文献５及び特許文献２参照。）。

【0009】

また、本発明者らは、ＩＣＥＲ－Ｔｇマウスが糖尿病性腎症を発症した後でも、マウスに１７βエストラジオールを投与すると、硬化した腎臓組織（糸球体や尿細管）が回復することを見出した（非特許文献６参照。）。さらに、本発明者らは、１７βエストラジオールを投与することによって、ＡＫＴやＧｌｕｔ４等の骨格筋において糖取り込みに関わる分子の発現が充進し、糖取り込みが促進されることを見出した（非特許文献７参照。）。

【0010】

本発明者らは、糖尿病の治療に有効な戦略は、生体内で十分な量の内因性β細胞を再生させ、維持することであると考えた。しかし、従来、１７βエストラジオールによってβ細胞が増殖する原因は明らかでなかった。そこで、本発明者らは、鋭意研究の末、１７βエストラジオールによって膵島においてＧＲＥＢ１（Ｇｒｏｗｔｈ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ Ｂｙ Ｅｓｔｒｏｇｅｎ Ｉｎ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ １）の発現が誘導され、β細胞が増殖し、血中グルコース濃度が低下することを見出し、ＧＲＥＢ１が糖尿病の治療薬として有効であることを見出した。

【0011】

ＧＲＥＢ１は、ＧＲＥＢ１遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＧＲＥＢ１は、乳がん細胞株において、エストロゲンシグナルの標的遺伝子として発現し、核内でエストロゲン受容体と結合して転写を促進する転写共役因子として同定されたタンパク質である。ＧＲＥＢ１は、エストロゲンやアンドロゲン等の性ホルモンに感受性のある乳がんや前立腺がんの細胞増殖を促進することが報告されている。しかし、従来、ＧＲＥＢ１と血中グルコース濃度の関係は全く不明であった。

【0012】

本発明の態様によれば、ＧＲＥＢ１又はＧＲＥＢ１をコードする核酸を含む糖尿病の治療薬が提供される。

【0013】

本発明の態様によれば、有効成分としてＧＲＥＢ１又はＧＲＥＢ１をコードする核酸を含む糖尿病の治療薬が提供される。

【0014】

本発明の態様によれば、有効成分がＧＲＥＢ１又はＧＲＥＢ１をコードする核酸から本質的になる糖尿病の治療薬が提供される。

【0015】

本発明の態様によれば、有効成分がＧＲＥＢ１又はＧＲＥＢ１をコードする核酸からなる糖尿病の治療薬が提供される。

【0016】

本発明の態様によれば、糖尿病の治療薬の製造における、ＧＲＥＢ１又はＧＲＥＢ１をコードする核酸の使用が提供される。

【0017】

本発明の態様によれば、糖尿病の治療薬の製造における、ＧＲＥＢ１又はＧＲＥＢ１をコードする核酸を含む有効成分の使用が提供される。

【0018】

本発明の態様によれば、糖尿病の治療薬の製造における、ＧＲＥＢ１又はＧＲＥＢ１をコードする核酸から本質的になる有効成分の使用が提供される。

【0019】

本発明の態様によれば、糖尿病の治療薬の製造における、ＧＲＥＢ１又はＧＲＥＢ１をコードする核酸からなる有効成分の使用が提供される。

【0020】

本発明の態様によれば、糖尿病の患者に、ＧＲＥＢ１又はＧＲＥＢ１をコードする核酸を含む糖尿病の治療薬を投与することを含む、糖尿病の治療方法が提供される。

【0021】

本発明の態様によれば、糖尿病の患者に、有効成分としてＧＲＥＢ１又はＧＲＥＢ１をコードする核酸を含む糖尿病の治療薬を投与することを含む、糖尿病の治療方法が提供される。

【0022】

本発明の態様によれば、糖尿病の患者に、有効成分がＧＲＥＢ１又はＧＲＥＢ１をコードする核酸から本質的になる糖尿病の治療薬を投与することを含む、糖尿病の治療方法が提供される。

【0023】

本発明の態様によれば、糖尿病の患者に、有効成分がＧＲＥＢ１又はＧＲＥＢ１をコードする核酸からなる糖尿病の治療薬を投与することを含む、糖尿病の治療方法が提供される。

【0024】

本発明の態様によれば、ＧＲＥＢ１又はＧＲＥＢ１をコードする核酸を含むβ細胞増殖剤が提供される。

【0025】

本発明の態様によれば、有効成分としてＧＲＥＢ１又はＧＲＥＢ１をコードする核酸を含むβ細胞増殖剤が提供される。

【0026】

本発明の態様によれば、有効成分がＧＲＥＢ１又はＧＲＥＢ１をコードする核酸から本質的になるβ細胞増殖剤が提供される。

【0027】

本発明の態様によれば、有効成分がＧＲＥＢ１又はＧＲＥＢ１をコードする核酸からなるβ細胞増殖剤が提供される。

【0028】

本発明の態様によれば、β細胞増殖剤の製造における、ＧＲＥＢ１又はＧＲＥＢ１をコードする核酸の使用が提供される。

【0029】

本発明の態様によれば、β細胞増殖剤の製造における、ＧＲＥＢ１又はＧＲＥＢ１をコードする核酸を含む有効成分の使用が提供される。

【0030】

本発明の態様によれば、β細胞増殖剤の製造における、ＧＲＥＢ１又はＧＲＥＢ１をコードする核酸から本質的になる有効成分の使用が提供される。

【0031】

本発明の態様によれば、β細胞増殖剤の製造における、ＧＲＥＢ１又はＧＲＥＢ１をコードする核酸からなる有効成分の使用が提供される。

【0032】

本発明の態様によれば、対象に、ＧＲＥＢ１又はＧＲＥＢ１をコードする核酸を含むβ細胞増殖剤を投与することを含む、対象におけるβ細胞を増殖させる方法が提供される。

【0033】

本発明の態様によれば、対象に、有効成分としてＧＲＥＢ１又はＧＲＥＢ１をコードする核酸を含むβ細胞増殖剤を投与することを含む、対象におけるβ細胞を増殖させる方法が提供される。

【0034】

本発明の態様によれば、対象に、有効成分がＧＲＥＢ１又はＧＲＥＢ１をコードする核酸から本質的になるβ細胞増殖剤を投与することを含む、対象におけるβ細胞を増殖させる方法が提供される。

【0035】

本発明の態様によれば、対象に、有効成分がＧＲＥＢ１又はＧＲＥＢ１をコードする核酸からなるβ細胞増殖剤を投与することを含む、対象におけるβ細胞を増殖させる方法が提供される。

【0036】

本発明の態様によれば、ＧＲＥＢ１又はＧＲＥＢ１をコードする核酸を含むインスリン産生促進剤が提供される。

【0037】

本発明の態様によれば、有効成分としてＧＲＥＢ１又はＧＲＥＢ１をコードする核酸を含むインスリン産生促進剤が提供される。

【0038】

本発明の態様によれば、有効成分がＧＲＥＢ１又はＧＲＥＢ１をコードする核酸から本質的になるインスリン産生促進剤が提供される。

【0039】

本発明の態様によれば、有効成分がＧＲＥＢ１又はＧＲＥＢ１をコードする核酸からなるインスリン産生促進剤が提供される。

【0040】

本発明の態様によれば、インスリン産生促進剤の製造における、ＧＲＥＢ１又はＧＲＥＢ１をコードする核酸の使用が提供される。

【0041】

本発明の態様によれば、インスリン産生促進剤の製造における、ＧＲＥＢ１又はＧＲＥＢ１をコードする核酸を含む有効成分の使用が提供される。

【0042】

本発明の態様によれば、インスリン産生促進剤の製造における、ＧＲＥＢ１又はＧＲＥＢ１をコードする核酸から本質的になる有効成分の使用が提供される。

【0043】

本発明の態様によれば、インスリン産生促進剤の製造における、ＧＲＥＢ１又はＧＲＥＢ１をコードする核酸からなる有効成分の使用が提供される。

【0044】

本発明の態様によれば、対象に、ＧＲＥＢ１又はＧＲＥＢ１をコードする核酸を含むインスリン産生促進剤を投与することを含む、対象におけるインスリン産生を促進する方法が提供される。

【0045】

本発明の態様によれば、対象に、有効成分としてＧＲＥＢ１又はＧＲＥＢ１をコードする核酸を含むインスリン産生促進剤を投与することを含む、対象におけるインスリン産生を促進する方法が提供される。

【0046】

本発明の態様によれば、対象に、有効成分がＧＲＥＢ１又はＧＲＥＢ１をコードする核酸から本質的になるインスリン産生促進剤を投与することを含む、対象におけるインスリン産生を促進する方法が提供される。

【0047】

本発明の態様によれば、対象に、有効成分がＧＲＥＢ１又はＧＲＥＢ１をコードする核酸からなるインスリン産生促進剤を投与することを含む、対象におけるインスリン産生を促進する方法が提供される。

【発明の効果】

【0048】

本発明によれば、有効性の高い糖尿病の治療薬を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0049】

【図1】図１は、マウスの血中グルコース濃度の時間変化を示すグラフである。グラフのプロットは、平均値±標準誤差を示す。

【図2】図２は、マイクロアレイ解析に使用した４群のマウスを示す模式図である。

【図3】図３は、マイクロアレイ解析により得られた４群のマウスの膵島における遺伝子発現パターンを示すヒートマップである。

【図4】図４は、マイクロアレイ解析により得られた遺伝子の抽出方法を示す模式図である。１７β－エストラジオール（Ｅ２）をインプラントされたトランスジェニックマウスで有意に発現が増加した遺伝子、発現が減少した遺伝子、及びエストロゲン応答領域（ＥＲＥ）サイトを有する遺伝子の関係を示す。Ｔｇ－Ｅ２群で有意に変動した遺伝子は合計６７個、そのうち５２個が発現上昇、１５個が発現低下。合計２６０個の遺伝子にエストロゲン応答エレメント（ＥＲＥ）部位があり、２個の遺伝子が両群に共通していた。

【図5】図５は、１７β－エストラジオールをインプラントされたトランスジェニックマウスで発現が増加した遺伝子であり、かつエストロゲン応答領域（ＥＲＥ）サイトを有する遺伝子である２つの遺伝子の統計値を示す表である。

【図6】図６は、β細胞特異的にＧｒｅｂ１をノックアウトしたマウスを作製する際におけるアレルの変化を示す模式図である。

【図7】図７は、ゲノムＤＮＡをＰＣＲにて増幅し、電気泳動により遺伝子型を解析した結果を示す写真である。

【図8】図８は、β細胞特異的にＧｒｅｂ１をノックアウトしたマウスの膵島におけるｍＲＮＡの相対発現量を示すグラフである。グラフのプロットは、平均値±標準誤差を示す。

【図9】図９は、実施例３の実験デザインを示す模式図である。

【図10】図１０は、β細胞特異的にＧｒｅｂ１をノックアウトし、１７β－エストラジオールをインプラントされたマウスの血中グルコース濃度の経時変化を示すグラフである。グラフのプロットは、平均値±標準誤差を示す。

【図11】図１１は、β細胞特異的にＧｒｅｂ１をノックアウトし、１７β－エストラジオールをインプラントされたマウスの累積生存率の経時変化を示すグラフである。

【図12】図１２は、抗インスリン抗体及び抗グルカゴン抗体を用いて免疫染色した膵島の蛍光顕微鏡写真である。

【図13】図１３は、膵島におけるβ細胞の比率を示すグラフである。

【図14】図１４は、膵島におけるβ細胞の面積を示すグラフである。

【図15】図１５は、実施例４の実験デザインを示す模式図である。中央写真は１７β－エストラジオールペレット、右写真は腎皮膜下に移植された極少量の単離膵島と隣接してインプラントされた１７β－エストラジオールペレットの写真を示す。

【図16】図１６は、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）を投与されたマウスの血中グルコース濃度の経時変化を示すグラフである。グラフのプロットは、平均値±標準誤差を示す。

【図17】図１７は、単離膵島と１７β－エストラジオールをインプラントされた腎臓の写真である。

【図18】図１８は、単離膵島と１７β－エストラジオールをインプラントされた腎臓の断面の写真である。

【図19】図１９は、単離膵島と１７β－エストラジオールをインプラントされた腎臓の蛍光顕微鏡写真である。

【図20】図２０は、腎臓に移植された膵島におけるＧｒｅｂ１のｍＲＮＡの相対発現量を示すグラフである。

【図21】図２１は、オスの野生型マウス、誘導性ｃＡＭＰ早期抑制因子（ＩＣＥＲ Ｉγ）が膵β細胞特異的に高発現するオスのトランスジェニックマウス（ＩＣＥＲ－Ｔｇマウス）、及び１７β－エストラジオールをインプラントされたオスのＩＣＥＲ－Ｔｇマウスの血中グルコース濃度を示すグラフである。

【図22】図２２は、オスの野生型マウス、オスのＩＣＥＲ－Ｔｇマウス、及び１７β－エストラジオールをインプラントされたオスのＩＣＥＲ－Ｔｇマウスの膵島におけるＧｒｅｂ１とＧｒｅｂ１に関連する因子の遺伝子のｍＲＮＡの相対発現量を示すグラフである。

【図23】図２３は、オスの野生型マウス、オスのＩＣＥＲ－Ｔｇマウス、及び１７β－エストラジオールをインプラントされたオスのＩＣＥＲ－Ｔｇマウスの膵島における細胞周期に関連する因子の遺伝子のｍＲＮＡの相対発現量を示すグラフである。

【図24】図２４は、メスのＩＣＥＲ－Ｔｇマウスの血中グルコース濃度の経時変化を示すグラフである。

【図25】図２５は、メスのＩＣＥＲ－Ｔｇマウスの膵島におけるインスリンｍＲＮＡの相対発現量を示すグラフである。

【図26】図２６は、メスのＩＣＥＲ－Ｔｇマウスの膵島におけるＧｒｅｂ１とＧｒｅｂ１に関連する因子の遺伝子のｍＲＮＡの相対発現量を示すグラフである。

【図27】図２７は、メスのＩＣＥＲ－Ｔｇマウスの膵島における細胞周期に関連する因子の遺伝子のｍＲＮＡの相対発現量を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0050】

以下に本発明の実施形態を説明する。ただし、以下の実施形態が本発明を限定するものであると理解するべきではない。本開示から当業者には様々な代替実施形態、実施例及び運用技術が明らかになるはずである。本発明はここでは記載していない様々な実施形態等を包含するということを理解すべきである。

【0051】

実施形態に係る糖尿病の治療薬は、ＧＲＥＢ１（Ｇｒｏｗｔｈ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ Ｂｙ Ｅｓｔｒｏｇｅｎ Ｉｎ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ １）又はＧＲＥＢ１をコードする核酸を含む。実施形態に係るβ細胞増殖剤は、ＧＲＥＢ１又はＧＲＥＢ１をコードする核酸を含む。実施形態に係るインスリン産生促進剤は、ＧＲＥＢ１又はＧＲＥＢ１をコードする核酸を含む。

【0052】

実施形態に係る糖尿病の治療薬、β細胞増殖剤、又はインスリン産生促進剤は、ヒト又は非ヒト動物である対象に投与される。ＧＲＥＢ１は、対象の膵島に送達されると、膵島のβ細胞を増殖し、これによりインスリンの産生が促進され、グルカゴンの濃度が正常になり、対象の血糖値が下がる。そのため、ＧＲＥＢ１は、対象の糖尿病の治療に有効である。なお、糖尿病には、１型糖尿病、２型糖尿病、その他の特定の機序、疾患による糖尿病、及び妊娠糖尿病があるが、いずれにも限定されない。

【0053】

ＧＲＥＢ１をコードする核酸は、対象の膵島に送達されると、膵島の細胞内に導入され、膵島の細胞内でＧＲＥＢ１を産生する。ＧＲＥＢ１をコードする核酸は、ＤＮＡであってもよいし、ＲＮＡであってもよい。ＲＮＡはｍＲＮＡであってもよい。ＧＲＥＢ１をコードする核酸は、ベクターに搭載されていてもよい。ベクターはウイルスベクターであってもよいし、非ウイルスベクターであってもよい。

【0054】

ウイルスベクターの例としては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、及びセンダイウイルスベクターが挙げられるが、特に限定されない。非ウイルスベクターの例としては、プラスミドベクターが挙げられるが、特に限定されない。ＧＲＥＢ１をコードする核酸は、リポソームに含まれていてもよい。

【0055】

ＧＲＥＢ１又はＧＲＥＢ１をコードする核酸は、膵臓細胞の受容体に結合するタンパク質又はペプチドと結合又は融合していてもよい。臓細胞の受容体に結合するタンパク質又はペプチドと結合又は融合することにより、ＧＲＥＢ１又はＧＲＥＢ１をコードする核酸が膵臓細胞に効率的に送達され得る。膵臓細胞は、例えば、β細胞である。

【0056】

膵臓細胞の受容体は、例えば、グルカゴンスーパーファミリーの受容体である。グルカゴンスーパーファミリーの受容体は、例えば、グルカゴン様ペプチド-1（ＧＬＰ－１）受容体である。膵臓細胞の受容体に結合するタンパク質は、例えば、グルカゴンスーパーファミリーのタンパク質である。グルカゴンスーパーファミリーのタンパク質は、例えば、ＧＬＰ－１である。グルカゴンスーパーファミリーのペプチドは、例えば、グルカゴンスーパーファミリーの受容体に対するアゴニスト活性を有するペプチドである。

【0057】

例えば、ＧＲＥＢ１の求核反応性部分と、膵臓細胞の受容体に結合するタンパク質又はペプチドの求電子反応性部分と、を反応させて、ＧＲＥＢ１と、膵臓細胞の受容体に結合するタンパク質又はペプチドと、を結合させてもよい。あるいは、ＧＲＥＢ１の求電子反応性部分と、膵臓細胞の受容体に結合するタンパク質又はペプチドの求核反応性部分と、を反応させて、ＧＲＥＢ１と、膵臓細胞の受容体に結合するタンパク質又はペプチドと、を結合させてもよい。

【0058】

求核反応性基の例としては、アミノ、チオール、及びヒドロキシルが挙げられるが、特に限定されない。求電子反応性基の例としては、カルボキシル、塩化アシル、無水物、エステル、スクシンイミドエステル、ハロゲン化アルキル、スルホン酸エステル、マレイミド、ハロアセチル、及びイソシアン酸が挙げられるが、特に限定されない。

【0059】

あるいは、リンカーを介して、ＧＲＥＢ１と、膵臓細胞の受容体に結合するタンパク質又はペプチドの求電子反応性部分と、を架橋させて、ＧＲＥＢ１と、膵臓細胞の受容体に結合するタンパク質又はペプチドと、を結合させてもよい。

【0060】

実施形態に係る糖尿病の治療薬は、有効量のＧＲＥＢ１又はＧＲＥＢ１をコードする核酸を含む。有効量とは、例えば、糖尿病を治療できる量である。糖尿病を治療できるか否かは、例えば、対象の血中グルコース濃度が正常値に近づくよう変化しているか否かで判断することができる。有効量は、対象の体重、年齢、症状、病態、及び投与方法によって変わり得る。

【0061】

実施形態に係るβ細胞増殖剤、及びインスリン産生促進剤は、それぞれ、有効量のＧＲＥＢ１又はＧＲＥＢ１をコードする核酸を含む。有効量とは、例えば、β細胞を増殖できる量、あるいはインスリン産生を促進できる量である。

【0062】

実施形態に係る糖尿病の治療薬、β細胞増殖剤、又はインスリン産生促進剤は、薬学的に許容可能な賦形剤、担体、緩衝剤、及び安定剤から選択される少なくともいずれかとともに、医薬組成物を構成していてもよい。

【0063】

担体は、液体であってもよい。液体担体は、例えば、水、石油、動物油、植物油、鉱油、及び合成油から選択される少なくともいずれかを含んでいてもよい。実施形態に係る糖尿病の治療薬、β細胞増殖剤、又はインスリン産生促進剤は、注射液に含まれていてもよい。注射液の例としては、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、及び乳酸化リンゲル注射液が挙げられるが、特に限定されない。

【0064】

実施形態に係る糖尿病の治療薬、β細胞増殖剤、又はインスリン産生促進剤の投与方法は、経口投与であってもよいし、非経口投与であってもよい。実施形態に係る糖尿病の治療薬、β細胞増殖剤、又はインスリン産生促進剤は、対象の膵臓、好ましくは膵島に局所的に投与されてもよい。

【0065】

（実施例１）
Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドの野生型オスマウス（オスのＷＴマウス）、誘導性ｃＡＭＰ早期抑制因子（ＩＣＥＲ Ｉγ）が膵β細胞特異的に高発現するオスのトランスジェニックマウス（オスのＩＣＥＲ－Ｔｇマウス）、及びＩＣＥＲ Ｉγが膵β細胞特異的に高発現するメスのトランスジェニックマウス（メスのＩＣＥＲ－Ｔｇマウス）を用意した。ＩＣＥＲ Ｉγは、β細胞におけるインスリンとサイクリンＡの発現を強く抑制し、β細胞の増殖を低下させる。そのため、ＩＣＥＲ－Ｔｇマウスは、誕生後、早期に重症の糖尿病を発症する。

【0066】

マウスを動物実験施設で１２時間の明暗サイクルで飼育した。マウスには水と標準的な飼料（ＣＥ－２、ＣＬＥＡ Ｊａｐａｎ）を自由に与えた。飼料は、８．９％の水、２４．９％の粗タンパク質、４．６％の粗脂質、４．１％の粗繊維、６．６％の粗灰分、及び５１％の可溶無窒素物を含み、１００ｇあたり３４４．９ｋｃａｌを含む。当該飼料は、長期にわたって標準的な血中グルコース濃度を維持するのに適している。

【0067】

本実施例及び以下の実施例において、マウスの体重及び朝食後グルコース濃度を、隔週で測定した。マウスの尻尾から採取した血液におけるグルコース濃度は、血糖値測定装置（ＯＮＥ－ＴＯＵＣＨ ＵｌｔｒａＶｕｅ、Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ又はＧＬＵＣＯＣＡＲＤ ＤＩＡｍｅｔｅｒ、登録商標、ＡＲＫＲＡＹ）で測定した。マウスの尻尾から採取した血液におけるグリコシル化ヘモグロビン濃度（ＨｂＡ１ｃ）は、血液分析装置（ＤＣＡ２０００、Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｉｎｅｅｒｓ）で測定した。

【0068】

図１に示すように、オスのＷＴマウス（ｎ＝６）の血中グルコース濃度は、生後３週から２４週にわたって、一定の低い値を示した。オスのＩＣＥＲ－Ｔｇマウス（ｎ＝２６）は重度の糖尿病であり、血中グルコース濃度は、生後上昇を続け、その後、高濃度を維持した。オスのＩＣＥＲ－Ｔｇマウスとは対照的に、メスのＩＣＥＲ－Ｔｇマウス（ｎ＝７）の血中グルコース濃度は、生後上昇したものの、その後、低下に転じ、オスのＷＴマウスと同等となった。

【0069】

膵島中のβ細胞の増殖を誘導するために、１９週齢のオスのＩＣＥＲ－Ｔｇマウス（同腹仔、ｎ＝６）の首筋に０．７２ｍｇの１７β－エストラジオール（Ｅ２）の９０日持続放出ペレット（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）をインプラントしたところ、インプラントしてから１週間後には血中グルコース濃度が半減し、その後も血中グルコース濃度は低下し続け、６週間後（６ヵ月齢）には、オスのＷＴマウス及びメスのＩＣＥＲ－Ｔｇマウスと同じ程度まで血中グルコース濃度が低下した。

【0070】

次に、図２に模式的に示すように、それぞれ６ヵ月齢のオスのＷＴマウス（ｎ＝６）、１７β－エストラジオールをインプラントしなかったオスのＩＣＥＲ－Ｔｇマウス（ｎ＝１５）、１７β－エストラジオールをインプラントして６週間経過したオスのＩＣＥＲ－Ｔｇマウス（ｎ＝６）、及びメスのＩＣＥＲ－Ｔｇマウス（ｎ＝７）から膵島を単離し、試薬（ＴＲＩｚｏｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ又はＲＮｅａｓｙ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、単離した膵島からトータルＲＮＡを抽出した。

【0071】

ｃＲＮＡ調製キット（Ｌｏｗ Ｉｎｐｕｔ Ｑｕｉｃｋ Ａｍｐ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、トータルＲＮＡから増幅されたラベル化ｃＲＮＡを調製した。ｃＲＮＡを、マウスのｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡを網羅的に搭載した遺伝子発現マイクロアレイ（ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ Ｇ３ Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ８ｘ６０Ｋ， Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とハイブリダイズさせ、マイクロアレイをスキャナー（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でスキャンし、相対的なハイブリダイゼーション強度を遺伝子ごとに算出した。さらに、マイクロアレイの解析結果に基づき、統計解析ソフト（Ｒ）を用いて、図３に示す遺伝子発現パターンを示すヒートマップを生成し、膵島における遺伝子発現をプロファイリングした。図３のヒートマップのカラーキーにおいて、プラス側はアップレギュレーション、マイナス側はダウンレギュレーションを示す。ヒートマップは、１７β－エストラジオールをインプラントして６週間経過したオスのＩＣＥＲ－Ｔｇマウスにおいて、多数の遺伝子の発現がアップレギュレートされていたことを示していた。

【0072】

１７β－エストラジオールをインプラントして６週間経過したオスのＩＣＥＲ－Ｔｇマウスにおいて、発現が有意に変動した遺伝子は６７個であった。そのうち、５２個の遺伝子の発現が増加し、１５個の遺伝子の発現が減少していた。また、１７β－エストラジオールに応答するエストロゲン応答領域（ＥＲＥ）サイトを有する遺伝子は２６０個あり、図４に示すように、１７β－エストラジオールをインプラントしたオスのＩＣＥＲ－Ｔｇマウスにおいて発現が上昇した遺伝子群と、ＥＲＥサイトを有する遺伝子群と、に共通する遺伝子は、Ｇｒｅｂ１とＮｕｄｔ４の２個であった。

【0073】

マイクロアレイの解析で得られた１７β－エストラジオールをインプラントしたオスのＩＣＥＲ－ＴｇマウスにおけるＧｒｅｂ１のシグナル強度を、オスのＷＴマウス、１７β－エストラジオールをインプラントしなかったオスのＩＣＥＲ－Ｔｇマウス、及びメスのＩＣＥＲ－ＴｇマウスにおけるＧｒｅｂ１のシグナル強度と比較したところ、図５に示すように、１７β－エストラジオールをインプラントしたオスのＩＣＥＲ－ＴｇマウスにおけるＧｒｅｂ１のシグナル強度は、Ｚスコア及び強度比において高かった。１７β－エストラジオールをインプラントしたオスのＩＣＥＲ－ＴｇマウスにおけるＧｒｅｂ１の発現は、１７β－エストラジオールをインプラントしなかったオスのＩＣＥＲ－Ｔｇマウスの４．６倍、野生型マウスの６．７から１０倍であった。この結果は、体内における１７β－エストラジオールの濃度の上昇によってＧｒｅｂ１の発現が誘導され、β細胞が増殖し、血中グルコース濃度が低下したことを示している。

【0074】

（実施例２）
Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ－Ｇｒｅｂ１^{tm1a(KOMP)Wtsi}／ＢａｙＭｍｕｃｄマウス（Ｇｒｅｂ１^tm1a/tm1aマウス）をカリフォルニア大学デービス校のノックアウトマウスプロジェクト（ＫＯＭＰ）リポジトリから入手した。また、Ｉｎｓ１遺伝子のストップコドン直前にＰ２Ａ－ｎｌｓ ＣｒｅをノックインしたバイシストロニックＣｒｅドライバーマウスであるＣ５７ＢＬ／６Ｊ－Ｉｎｓ１^em1(cre)Utrマウスを理化学研究所バイオリソース研究センターから入手した。Ｇｒｅｂ１^tm1a/tm1aマウスとＩｎｓ１^em1(cre)Utrマウスを交配させ、β細胞特異的にＧｒｅｂ１をノックアウトしたマウス（Ｉｎｓ１－Ｇｒｅ^+/-；Ｇｒｅｂ１^tm1a/tm1aマウス）を作製した。Ｇｒｅｂ１ノックアウトマウスにおいては、図６に模式的に示すように、膵臓のβ細胞にＴｍ１ｂアレルが生成している。

【0075】

野生型マウス、Ｇｒｅｂ１^tm1a/tm1aマウス、及びＧｒｅｂ１ノックアウトマウスのゲノムＤＮＡをＰＣＲにて増幅し、電気泳動により遺伝子型を解析したところ、図７に示すように、野生型のマウスからは２０１８ｂｐの野生型アレルが検出され、Ｇｒｅｂ１^tm1a/tm1aマウスからは野生型アレルと４２１２ｂｐのＴｍ１ａアレルが検出され、Ｇｒｅｂ１ノックアウトマウスからは野生型アレルと６２５ｂｐのＴｍ１ｂアレルが検出された。

【0076】

１７週齢のメスのＧｒｅｂ１^tm1a/tm1aマウス（ｎ＝１０）及び１７週齢のメスのＧｒｅｂ１ノックアウトマウス（ｎ＝５）のそれぞれから膵島を単離し、膵島からトータルＲＮＡを抽出した。Ｇｒｅｂ１^tm1a/tm1aマウスにおけるｍＲＮＡの発現量を１として、Ｇｒｅｂ１ノックアウトマウスにおけるｍＲＮＡの相対的発現量を測定した。その結果、図８に示すように、Ｇｒｅｂ１ノックアウトマウスの膵島においては、Ｇｒｅｂ１の発現がないことが確認された。

【0077】

（実施例３）
図９に模式的に示すように、１１４週齢のＧｒｅｂ１^tm1a/tm1aマウス（コントロールマウス）と１１４週齢のＧｒｅｂ１ノックアウト（ＫＯ）マウスのそれぞれに、１５０ｍｇ／ｋｇのストレプトゾトシン（ＳＴＺ、シグマアルドリッチ）を腹腔内投与し、β細胞を著しく破壊して高血糖を誘発した。ストレプトゾトシンを投与してから１週間後に、Ｇｒｅｂ１^tm1a/tm1aマウスとＧｒｅｂ１ノックアウトマウスのそれぞれに、１７β－エストラジオール（Ｅ２）をインプラントした。図１０及び図１１に示すように、オスのＧｒｅｂ１^tm1a/tm1aマウス（ｎ＝７）は、１７β－エストラジオールをインプラントした後、血中グルコース濃度が徐々に低下し、ほとんどが死亡しなかった。これに対し、Ｇｒｅｂ１ノックアウトマウス（ｎ＝７、うち、メス３、オス４）は、１７β－エストラジオールをインプラントした後でも、血中グルコース濃度が低下せず、次第に衰弱し、ほとんどが死亡した。Ｇｒｅｂ１^tm1a/tm1aマウス（ｎ＝１４）の生存率と、Ｇｒｅｂ１ノックアウトマウス（ｎ＝１９）の生存率との差は、統計的に有意であった。

【0078】

ストレプトゾトシンを投与してから４から５週目（１９週齢）にＧｒｅｂ１^tm1a/tm1aマウスとＧｒｅｂ１ノックアウトマウスのそれぞれから、１０週目（２４週齢）にＧｒｅｂ１^tm1aマウスから膵島を単離し、図１２に示すように、抗インスリン抗体及び抗グルカゴン抗体を用いて膵島を免疫染色した。図１３に示すように、Ｇｒｅｂ１^tm1a/tm1aマウス（４、５週で解析：ｎ＝３、１０週で解析：ｎ＝４）においては、膵島におけるα細胞とβ細胞の合計に対するβ細胞の比率が時間経過とともに増加した。また、図１４に示すように、Ｇｒｅｂ１^tm1a/tm1aマウスにおいては、膵島におけるβ細胞の面積が時間経過とともに有意に増加し、多くの膵島の形態が正常化していた。これに対し、Ｇｒｅｂ１ノックアウトマウス（ｎ＝７、うち、メス４、オス３）においては、β細胞の比率が低く、膵島の形態も崩壊しており、改善は見られなかった。これらの結果は、Ｇｒｅｂ１が欠損していると、１７β－エストラジオールをインプラントしても、β細胞は増殖できなことを示しており、Ｇｒｅｂ１がβ細胞増殖因子であることを示している。

【0079】

（実施例４）
８週齢の野生型（ＷＴ）マウスを用意し、２日後、１８０ｍｇ／ｋｇのストレプトゾトシン（ＳＴＺ、シグマアルドリッチ）をマウスの尾静脈に投与し、β細胞を著しく破壊して重度の糖尿病を誘発した。マウスを用意してから５日後、図１５に示すように、ストレプトゾトシンを投与された野生型マウスの腎被膜下の一か所に、５０個の単離膵島を移植した。５０個の単離膵島の移植のみでは、糖尿病マウスの高血糖を改善することはできないと従来報告されている。しかし、腎被膜下の５０個の単離膵島の近傍に１７β－エストラジオール（Ｅ２）のペレット（１．５ｍｍ径、０．７２ｍｇ、９０日徐放性、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）をインプラントすると、マウスは死亡しなかった。

【0080】

独立して２回実験を繰り返したところ、図１６に示すように、野生型マウス（１回目：ｎ＝７、２回目：ｎ＝３）の血中グルコース濃度は、ストレプトゾトシンを投与された後、急上昇した。単離膵島と１７β－エストラジオールを腎皮下にインプラントした後は、変動はあるものの、３０日にわたって血中グルコース濃度は減少し、その後は正常の範囲内に安定的に保たれた。マウスを用意してから４６日目に、マウス（ｎ＝２）から膵島を移植した腎臓（片腎）を摘出すると、マウスの血糖値は直ちに上昇した。これらの結果は、移植された膵島が、１７β－エストラジオールに曝されることにより、血糖値を正常に維持したこと、すなわち正常血糖の維持は移植膵島に完全に依存していたことを示している。

【0081】

マウスを用意してから１０９日目に腎臓を摘出した。図１７に示すように、多くの新生血管が、膵島移植片とペレットに伸展し、広がっているのが観察された。また、マウスを用意してから１０９日目又は１４５日目に摘出した腎臓の切片を４％のパラホルムアルデヒドで固定した。さらに、固定した腎臓の切片をヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色した。図１８に示すように、膵島は、腎被膜下で拡大していた。また、腎被膜下に移植された膵島に対してインスリンとＢｒｄＵ、あるいはインスリンとグルカゴン抗体を用いて免疫染色をしたところ、図１９―１、及び図１９―２に示すように、膵島のβ細胞が増殖していることが観察された。

【0082】

マウスを用意してから１０９日目にマウス（ｎ＝３）から腎臓を摘出し、腎皮膜を剥離して膵島の移植片を摘出し、膵島の移植片における遺伝子発現を調べた。その結果、図２０に示すように、１７β－エストラジオールをインプラントしなかったマウスの膵島の移植片におけるＧｒｅｂ１の発現量を１として、１７β－エストラジオールをインプラントしたマウスの膵島の移植片におけるＧｒｅｂ１の相対発現量は、著しく増加していた。

【0083】

（実施例５）
６ヵ月齢のオスのＷＴマウス（ｎ＝６）、６ヵ月齢のオスのＩＣＥＲ－Ｔｇマウス（ｎ＝１５）、１９週齢の時に０．７２ｍｇの１７β－エストラジオール（Ｅ２）をインプラントされた６ヵ月齢のオスのＩＣＥＲ－Ｔｇマウス（オスのＩＣＥＲ－Ｔｇ－Ｅ２マウス、ｎ＝６）を用意した。それぞれのマウスの血中グルコース濃度を測定した結果を図２１に示す。

【0084】

また、それぞれのオスのマウスから単離した膵島におけるＧｒｅｂ１とＧｒｅｂ１に関連する因子の遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した結果を図２２に示す。Ｎｉｋ特異的キナーゼ（Ｎｒｋ）は、Ｇｒｅｂ１の活性と逆相関する因子である。エストロゲン受容体α（ＥＲα）と肝受容体相同体１（ＬＲＨ１）は、１７β－エストラジオールの上昇に迅速に反応してβ細胞で誘導されることが知られている。また、乳がん細胞株では、ＥＲαとＬＲＨ１が、ＧＲＥＢ１の発現を活性化することが知られている。

【0085】

図２２のグラフは、オスのＷＴマウスにおけるｍＲＮＡの発現量を１として、オスのＩＣＥＲ－Ｔｇマウス及びオスのＩＣＥＲ－Ｔｇ－Ｅ２マウスにおけるｍＲＮＡの相対発現量を示している。オスのＩＣＥＲ－Ｔｇ－Ｅ２マウスでは、Ｇｒｅｂ１の発現が顕著に増加していた。Ｇｒｅｂ１より低いものの、ＬＲＨ－１の発現も増加していた。ＥＲαとＮｒｋの発現は非常に低かった。ＬＲＨ－１は、オスのＩＣＥＲ－Ｔｇ－Ｅ２マウスのみならず、オスのＩＣＥＲ－Ｔｇマウスでも高発現していた。

【0086】

また、それぞれのオスのマウスから単離した膵島における細胞周期に関連する因子の遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した結果を図２３に示す。図２３のグラフは、オスのＷＴマウスにおけるｍＲＮＡの発現量を１として、オスのＩＣＥＲ－Ｔｇマウス及びオスのＩＣＥＲ－Ｔｇ－Ｅ２マウスにおけるｍＲＮＡの相対発現量を示している。オスのＷＴマウス及びオスのＩＣＥＲ－Ｔｇマウスと比較して、オスのＩＣＥＲ－Ｔｇ－Ｅ２マウスにおいては、サイクリンＡ２、サイクリンＢ１、サイクリンＢ２、及びオーロラキナーゼＢをコードする遺伝子の発現が有意に増加していた。

【0087】

これらの結果は、外因性の１７β－エストラジオールにより、Ｇｒｅｂ１、ＬＲＨ１、サイクリンＡ２、サイクリンＢ１、サイクリンＢ２、及びオーロラキナーゼＢの発現が増加したことを示している。また、細胞周期に関連する因子の発現の上昇により、β細胞が増殖したことが示唆される。

【0088】

（実施例６）
５週齢のメスのＩＣＥＲ－Ｔｇマウス、８から１２週齢のメスのＩＣＥＲ－Ｔｇマウス、１３から１８週齢のメスのＩＣＥＲ－Ｔｇマウス、及び２４週齢のメスのＩＣＥＲ－Ｔｇマウスを用意した。それぞれのメスのマウスの血中グルコース濃度を測定した結果を図２４に示す。５週齢のメスのＩＣＥＲ－Ｔｇマウスの血中グルコース濃度は高かったものの、週齢とともに血中グルコース濃度は低下し、１３週齢以降は正常な濃度となっていた。

【0089】

メスの野生型ラットでは、血漿中の内因性の１７β－エストラジオール（Ｅ２）の濃度は、生後３から４週目に徐々に増加し、６週目にさらに増加した後、６ヶ月目までに徐々に減少すると報告されている。したがって、メスのＩＣＥＲ－Ｔｇマウスにおける血中グルコース濃度の低下は、血漿中の内因性の１７β－エストラジオールの濃度上昇に応じていることが示唆された。

【0090】

メスのＩＣＥＲ－Ｔｇマウスのそれぞれから膵島を単離し、インスリンｍＲＮＡの発現量を測定した。１３から１５週齢のオスのマウスにおけるインスリンｍＲＮＡの発現量を１として、メスのＩＣＥＲ－ＴｇマウスにおけるインスリンｍＲＮＡの相対的な発現量を図２５のグラフに示す。メスのＩＣＥＲ－Ｔｇマウスにおいて、インスリンｍＲＮＡの発現量は週齢とともに有意に増加していた。インスリンｍＲＮＡの発現量の増加は、β細胞の増加を反映している。

【0091】

また、メスのＩＣＥＲ－Ｔｇマウスのそれぞれから単離した膵島におけるＧｒｅｂ１とＧｒｅｂ１に関連する因子の遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した。１３から１５週齢のオスのマウスにおけるｍＲＮＡの発現量を１として、メスのＩＣＥＲ－ＴｇマウスにおけるｍＲＮＡの相対的な発現量を図２６のグラフに示す。

【0092】

５週齢のメスのＩＣＥＲ－Ｔｇマウスでは、ＥＲαとＬＲＨ－１の発現は高かったが、Ｇｒｅｂ１とＮｒｋの発現は低かった。８から１２週齢のメスのＩＣＥＲ－Ｔｇマウスでは、ＥＲαの発現は著しく低下したが、Ｇｒｅｂ１の発現は約８倍まで急増した。血中グルコース濃度が十分に低下し、インスリンの発現が増えた１３から１８週齢のメスのＩＣＥＲ－Ｔｇマウスでは、ＥＲαとＬＲＨ－１の発現はさらに減少し、Ｇｒｅｂ１の発現も低下したが、Ｎｒｋの発現は増加していた。２４週齢のメスのＩＣＥＲ－Ｔｇマウスでは、ＥＲα、ＬＲＨ－１、Ｇｒｅｂ１、及びＮｒｋの発現が低下していた。よって、Ｇｒｅｂ1の発現は一過性であることが示された。

【0093】

また、メスのＩＣＥＲ－Ｔｇマウスのそれぞれから単離した膵島における細胞周期に関連する因子の遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した。１３から１５週齢のオスのマウスにおけるｍＲＮＡの発現量を１として、メスのＩＣＥＲ－ＴｇマウスにおけるｍＲＮＡの相対的な発現量を図２７のグラフに示す。

【0094】

サイクリンＤ１とサイクリンＥ２を除く測定された全ての細胞周期関連因子であるサイクリンＡ２、サイクリンＢ１、サイクリンＢ２、サイクリンＤ２、サイクリンＥ１、オーロラキナーゼＡ、及びオーロラキナーゼＢは、血中グルコース濃度が低下する８から１２週齢において増加し、その後、インスリンが十分に増加する１３から１８週齢で低下していた。

【0095】

これらの結果は、メスのＩＣＥＲ－Ｔｇマウスでは、内因性の１７β－エストラジオールの増加により、Ｇｒｅｂ１、サイクリンＡ２、サイクリンＢ１、サイクリンＢ２、サイクリンＤ２、サイクリンＥ１、オーロラキナーゼＡ、及びオーロラキナーゼＢの発現が増加したことを示している。また、これらの結果から、細胞周期に関連する因子の発現の上昇により、β細胞が増殖したことが示唆される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19-1】

【図19-2】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】