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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2025009555
(43)【公開日】2025-01-20
(54)【発明の名称】脱顆粒抑制用（－）－ネオエキヌリンＡ
(51)【国際特許分類】
A23L 33/10 20160101AFI20250110BHJP
A61K 31/495 20060101ALI20250110BHJP
C07D 403/06 20060101ALI20250110BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20250110BHJP
A61K 36/062 20060101ALI20250110BHJP
【ＦＩ】
A23L33/10
A61K31/495
C07D403/06 CSP
A61P37/08
A61K36/062
【審査請求】未請求
【請求項の数】2
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023112636
(22)【出願日】2023-07-07
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り 令和５年４月１２日、第７７回日本栄養・食糧学会大会のウェブサイト（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ２．ａｅｐｌａｎ．ｃｏ．ｊｐ／ｊｓｎｆｓ２０２３／ｃｏｎｔｅｎｔｓ／ｐｒｏｇｒａｍ．ｈｔｍｌ）、において公開
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り 令和５年５月１４日、第７７回日本栄養・食糧学会大会、において公開
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り 令和５年４月２８日、第７７回日本栄養・食糧学会大会のウェブサイト（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ２．ａｅｐｌａｎ．ｃｏ．ｊｐ／ｊｓｎｆｓ２０２３／ｃｏｎｔｅｎｔｓ／ｐｒｏｇｒａｍ．ｈｔｍｌ）、において公開
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】504147254
【氏名又は名称】国立大学法人愛媛大学
(71)【出願人】
【識別番号】590006398
【氏名又は名称】マルトモ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100127579
【弁理士】
【氏名又は名称】平野 泰弘
(74)【代理人】
【識別番号】100203301
【弁理士】
【氏名又は名称】都築 健太郎
(72)【発明者】
【氏名】石田 萌子
(72)【発明者】
【氏名】山内 聡
(72)【発明者】
【氏名】菅原 卓也
(72)【発明者】
【氏名】西 甲介
(72)【発明者】
【氏名】土居 幹治
(72)【発明者】
【氏名】木下 義浩
(72)【発明者】
【氏名】大福 美帆
【テーマコード（参考）】
4B018
4C063
4C086
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B018MD18
4B018MD80
4B018ME07
4C063AA01
4C063BB03
4C063CC34
4C063DD06
4C063EE01
4C063EE10
4C086AA01
4C086AA02
4C086BC47
4C086GA07
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZB13
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC05
4C087BC06
4C087CA10
4C087CA38
4C087NA14
4C087ZB13
(57)【要約】
【課題】海洋性真菌の二次代謝産物であるインドールアルカロイドであり、鰹節のカビ付けに用いられるAspergillus属やEurotium属によっても生産される（－）－ネオエキヌリンＡの用途を広げること。
【解決手段】
脱顆粒抑制用（－）－ネオエキヌリンＡ。食品添加用の用途にも供することができる。（－）－ネオエキヌリンＡは脱顆粒シグナルの上流に位置する非受容体型チロシンキナーゼであるＬｙｎの活性化には影響せず、その下流にある非受容体型チロシンキナーゼであるＳｙｋのリン酸化を抑制することが確認された。また、セリン／スレオニンキナーゼであるＡｋｔのリン酸化レベルの低下も確認された。
これらのことから、（－）－ネオエキヌリンＡはＳｙｋおよびＡｋｔシグナル伝達経路を下方制御することで細胞外からのＣａ２＋流入を阻害し、脱顆粒を抑制することが示唆された。
【選択図】図４
【解決手段】
脱顆粒抑制用（－）－ネオエキヌリンＡ。食品添加用の用途にも供することができる。（－）－ネオエキヌリンＡは脱顆粒シグナルの上流に位置する非受容体型チロシンキナーゼであるＬｙｎの活性化には影響せず、その下流にある非受容体型チロシンキナーゼであるＳｙｋのリン酸化を抑制することが確認された。また、セリン／スレオニンキナーゼであるＡｋｔのリン酸化レベルの低下も確認された。
これらのことから、（－）－ネオエキヌリンＡはＳｙｋおよびＡｋｔシグナル伝達経路を下方制御することで細胞外からのＣａ２＋流入を阻害し、脱顆粒を抑制することが示唆された。
【選択図】図４
【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記化学式で表される脱顆粒抑制用（－）－ネオエキヌリンＡ。
【化1】
【請求項2】
用途が食品添加用である、請求項１に記載の脱顆粒抑制用（－）－ネオエキヌリンＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、脱顆粒抑制用（－）－ネオエキヌリンＡに関し、詳しくは、食品添加用の脱顆粒抑制用（－）－ネオエキヌリンＡに関する。
【背景技術】
【0002】
（－）－ネオエキヌリンＡは、海洋性真菌の二次代謝産物であるインドールアルカロイドであり、鰹節のカビ付けに用いられるAspergillus属やEurotium属によっても生産されることが確認されている。
また、ネオエキヌリンＢが抗ウイルス薬として使用できることも知られている（特許文献１および２）。
また、ネオエキヌリンＢが抗ウイルス薬として使用できることも知られている（特許文献１および２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【特許文献1】特表２０２２－５４５５５３号公報
【特許文献2】特表２０２２－５３１５５６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
しかし、（－）－ネオエキヌリンＡがこれまで知られている事例以外に、具体的にどのような生理活性を有しているかは予測できないため、未判明の生理活性を有している可能性がある。
一方、新たに開発される医薬品は生体に対する副作用が懸念されるため、新たに開発された医薬品に具体的に生体に対する効能・効用が発見されても、安全性確認のためには長い年月と確認作業が必要になる。
本発明の目的は、従来食用に供されている安全な原料から得られる（－）－ネオエキヌリンＡの用途を広げることにある。
一方、新たに開発される医薬品は生体に対する副作用が懸念されるため、新たに開発された医薬品に具体的に生体に対する効能・効用が発見されても、安全性確認のためには長い年月と確認作業が必要になる。
本発明の目的は、従来食用に供されている安全な原料から得られる（－）－ネオエキヌリンＡの用途を広げることにある。
【課題を解決するための手段】
【0005】
上記の課題を解決すべく、本発明者らが鋭意検討した結果、（－）－ネオエキヌリンＡが、脱顆粒抑制用の用途に使用できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【0006】
すなわち本発明は、
［１］脱顆粒抑制用（－）－ネオエキヌリンＡを提供するものである。
［１］脱顆粒抑制用（－）－ネオエキヌリンＡを提供するものである。
【化1】
【0007】
また本発明の一つは、
［２］用途が食品添加用である、上記［１］に記載の脱顆粒抑制用（－）－ネオエキヌリンＡを提供するものである。
［２］用途が食品添加用である、上記［１］に記載の脱顆粒抑制用（－）－ネオエキヌリンＡを提供するものである。
【発明の効果】
【0008】
本発明の脱顆粒抑制用（－）－ネオエキヌリンＡは、脱顆粒抑制による抗アレルギー効果を有する。本発明の脱顆粒抑制用（－）－ネオエキヌリンＡは、鰹節のカビ付けに用いられるAspergillus属やEurotium属によっても生産されるから、従来食用として日常的に摂取されてきたものであり、安全性にも優れる。
さらに本発明の脱顆粒抑制用（－）－ネオエキヌリンＡは、ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞に対して、０．２５～１．０ ｍＭの濃度で、脱顆粒抑制を示す一方、細胞毒性を示さないことから、安全性に優れる。
本発明の脱顆粒抑制用（－）－ネオエキヌリンＡは、例えば、出汁、豆腐、野菜等の料理用途等、従来鰹節の用途に用いられてきた食品添加用の用途に広く活用できる。
さらに本発明の脱顆粒抑制用（－）－ネオエキヌリンＡは、ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞に対して、０．２５～１．０ ｍＭの濃度で、脱顆粒抑制を示す一方、細胞毒性を示さないことから、安全性に優れる。
本発明の脱顆粒抑制用（－）－ネオエキヌリンＡは、例えば、出汁、豆腐、野菜等の料理用途等、従来鰹節の用途に用いられてきた食品添加用の用途に広く活用できる。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【発明を実施するための形態】
【0010】
ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞を、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）特異的ＩｇＥで感作した後、培地に（－）－ネオエキヌリンＡを添加し、その後ＤＮＰ－ＨＳＡによる抗原刺激で脱顆粒を誘導した。
顆粒中に含まれるβ－ヘキソサミニダーゼの放出率を指標として抗原誘導性脱顆粒に対する効果を評価した。また、細胞毒性の評価にはＷＳＴ－８法、シグナル伝達因子への影響にはウェスタンブロッティング法を用いて検討した。
顆粒中に含まれるβ－ヘキソサミニダーゼの放出率を指標として抗原誘導性脱顆粒に対する効果を評価した。また、細胞毒性の評価にはＷＳＴ－８法、シグナル伝達因子への影響にはウェスタンブロッティング法を用いて検討した。
【0011】
ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞の抗原誘導性脱顆粒に及ぼす影響を検討した結果、（－）－ネオエキヌリンＡは細胞毒性を示すことなく脱顆粒を有意に抑制した。
脱顆粒を抑制する作用機構を明らかにするため、細胞内カルシウムイオン（Ｃａ２＋）濃度に及ぼす影響を検討したところ、抗原誘導性の細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇が（－）－ネオエキヌリンＡにより抑制された。
またシグナル伝達因子に与える影響を検討したところ、（－）－ネオエキヌリンＡは脱顆粒シグナルの上流に位置するＬｙｎ（非受容体型チロシンキナーゼ）の活性化には影響せず、その下流にあるＳｙｋ（非受容体型チロシンキナーゼ）のリン酸化を抑制することが確認された。
また、Ａｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）のリン酸化レベルの低下も確認された。
脱顆粒を抑制する作用機構を明らかにするため、細胞内カルシウムイオン（Ｃａ２＋）濃度に及ぼす影響を検討したところ、抗原誘導性の細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇が（－）－ネオエキヌリンＡにより抑制された。
またシグナル伝達因子に与える影響を検討したところ、（－）－ネオエキヌリンＡは脱顆粒シグナルの上流に位置するＬｙｎ（非受容体型チロシンキナーゼ）の活性化には影響せず、その下流にあるＳｙｋ（非受容体型チロシンキナーゼ）のリン酸化を抑制することが確認された。
また、Ａｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）のリン酸化レベルの低下も確認された。
【0012】
なお、本発明の説明に使用する語句の意義は次の通りである。
【表1】
【0013】
次に実施例に基づき、本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例0014】
［ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞に対する脱顆粒の抑制実験の概要］
ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞を、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）特異的ＩｇＥで感作した後、培地にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ: Dimethylsulfoxide）で溶解した（－）－ネオエキヌリンＡを０．１２５ ｍＭ、０．２５ ｍＭ、０．５ ｍＭおよび１ ｍＭの濃度で添加し、その後ＤＮＰ－ＨＳＡによる抗原刺激で脱顆粒を誘導した。
顆粒中に含まれるβ－ヘキソサミニダーゼの放出率を指標として抗原誘導性脱顆粒に対する効果を評価した。
また、細胞毒性の評価にはＷＳＴ－８法で行った。ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞の抗原誘導性脱顆粒に及ぼす影響を検討した結果、（－）－ネオエキヌリンＡは細胞毒性を示すことなく０．２５～１．０ ｍＭの濃度で脱顆粒を有意に抑制した。
ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞を、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）特異的ＩｇＥで感作した後、培地にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ: Dimethylsulfoxide）で溶解した（－）－ネオエキヌリンＡを０．１２５ ｍＭ、０．２５ ｍＭ、０．５ ｍＭおよび１ ｍＭの濃度で添加し、その後ＤＮＰ－ＨＳＡによる抗原刺激で脱顆粒を誘導した。
顆粒中に含まれるβ－ヘキソサミニダーゼの放出率を指標として抗原誘導性脱顆粒に対する効果を評価した。
また、細胞毒性の評価にはＷＳＴ－８法で行った。ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞の抗原誘導性脱顆粒に及ぼす影響を検討した結果、（－）－ネオエキヌリンＡは細胞毒性を示すことなく０．２５～１．０ ｍＭの濃度で脱顆粒を有意に抑制した。
【0015】
［滅菌タイロード緩衝液（ｐＨ ７．４）の調製］
ＨＥＰＥＳ（ 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid）４．７７ ｇ、ＮａＣｌ ７．８９ ｇ、ＫＣｌ ０．３７ ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．２６ ｇ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．２０ ｇ、グルコース １．０１ ｇおよびＢＳＡ ０．５０ ｇを蒸留水に溶解させた後、水酸化ナトリウムを用いてｐＨ ７．４に調整し、蒸留水で１Ｌの体積に合わせ、タイロード緩衝液（２０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineet hanesulfonic acid）、１３５ ｍＭ ＮａＣｌ、５ ｍＭ ＫＣｌ、１．８ ｍＭ ＣａＣｌ２、１ ｍＭ ＭｇＣｌ２、５．６ ｍＭ グルコースおよび０．０５％ＢＳＡ）を調製した。
次に孔径０．２２ ｍのメンブレンフィルターでろ過滅菌し、冷蔵保存したものを使用した。
ＨＥＰＥＳ（ 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid）４．７７ ｇ、ＮａＣｌ ７．８９ ｇ、ＫＣｌ ０．３７ ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．２６ ｇ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．２０ ｇ、グルコース １．０１ ｇおよびＢＳＡ ０．５０ ｇを蒸留水に溶解させた後、水酸化ナトリウムを用いてｐＨ ７．４に調整し、蒸留水で１Ｌの体積に合わせ、タイロード緩衝液（２０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineet hanesulfonic acid）、１３５ ｍＭ ＮａＣｌ、５ ｍＭ ＫＣｌ、１．８ ｍＭ ＣａＣｌ２、１ ｍＭ ＭｇＣｌ２、５．６ ｍＭ グルコースおよび０．０５％ＢＳＡ）を調製した。
次に孔径０．２２ ｍのメンブレンフィルターでろ過滅菌し、冷蔵保存したものを使用した。
【0016】
［ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞］
実施例１に使用したラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞は、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）から販売されている製品番号「ＣＲＬ－２２５６」を使用した。ＲＢＬ－２Ｈ３細胞（Rat basophilic leukemia cell line）は脱顆粒抑制効果を評価するために使用しているラット好塩基球様細胞株である。ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞は１０％ＦＢＳ－ＤＭＥＭ培地にて３７℃、５％ＣＯ２条件で培養した。ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum）はウシ胎児血清のことで、細胞培養培地の増殖用添加剤として用いる。ＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle Medium）はダルベッコ改変イーグル培地のことであり、ＲＢＬ－２Ｈ３細胞の培養に用いる。
実施例１に使用したラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞は、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）から販売されている製品番号「ＣＲＬ－２２５６」を使用した。ＲＢＬ－２Ｈ３細胞（Rat basophilic leukemia cell line）は脱顆粒抑制効果を評価するために使用しているラット好塩基球様細胞株である。ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞は１０％ＦＢＳ－ＤＭＥＭ培地にて３７℃、５％ＣＯ２条件で培養した。ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum）はウシ胎児血清のことで、細胞培養培地の増殖用添加剤として用いる。ＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle Medium）はダルベッコ改変イーグル培地のことであり、ＲＢＬ－２Ｈ３細胞の培養に用いる。
【0017】
［播き込みとＩｇＥ感作］
ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞を１０％ＦＢＳ－ＤＥＭＥ培地中に４．０×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度になるように調整した細胞懸濁液を１００ｍｍディッシュに１０ｍｌ入れ、４．０×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで３７℃、５％ＣＯ２条件で培養した。４８時間後にラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞が最初の状態（４．０×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈ）から１００ｍｍディッシュ中に７０から８０％増殖したことを目視で確認することができた。
滅菌した１５ ｍＬ遠心管に、ウシ胎児血清（ＦＢＳ、シグマアルドリッチ社製、製品名non-USA origin, sterile-filtered, suitable for cell culture）を１ ｍＬおよびダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を７ ｍＬ加え、混合液Ａを調製した。
ＤＭＥＭ培地はＤＭＥＭ(シグマアルドリッチ社製、製品番号Ｄ５６４８) １３．４ ｇ、ＮａＨＣＯ３(富士フィルム和光純薬社製、製品番号１９１－０１３０５) ３．７ g
、ストレプトマイシン(シグマアルドリッチ社製、製品番号Ｓ９１３７) ０．１ ｇ、ペニシリン(シグマアルドリッチ社製、製品番号Ｐ７７９４) ０．０６２５ ｇを1 Ｌの蒸留水に溶解した後、加圧蒸気滅菌済ハウジングでろ過滅菌して調製した。
ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞を１０％ＦＢＳ－ＤＥＭＥ培地中に４．０×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度になるように調整した細胞懸濁液を１００ｍｍディッシュに１０ｍｌ入れ、４．０×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで３７℃、５％ＣＯ２条件で培養した。４８時間後にラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞が最初の状態（４．０×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈ）から１００ｍｍディッシュ中に７０から８０％増殖したことを目視で確認することができた。
滅菌した１５ ｍＬ遠心管に、ウシ胎児血清（ＦＢＳ、シグマアルドリッチ社製、製品名non-USA origin, sterile-filtered, suitable for cell culture）を１ ｍＬおよびダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を７ ｍＬ加え、混合液Ａを調製した。
ＤＭＥＭ培地はＤＭＥＭ(シグマアルドリッチ社製、製品番号Ｄ５６４８) １３．４ ｇ、ＮａＨＣＯ３(富士フィルム和光純薬社製、製品番号１９１－０１３０５) ３．７ g
、ストレプトマイシン(シグマアルドリッチ社製、製品番号Ｓ９１３７) ０．１ ｇ、ペニシリン(シグマアルドリッチ社製、製品番号Ｐ７７９４) ０．０６２５ ｇを1 Ｌの蒸留水に溶解した後、加圧蒸気滅菌済ハウジングでろ過滅菌して調製した。
【0018】
１００ｍｍディッシュに７０～８０％増殖したラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞の細胞上清を吸引除去した後、滅菌処理後のリン酸緩衝液（滅菌ＰＢＳ）を１０ ｍＬ添加して、軽くディッシュを揺らしてラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞を洗浄した。ＰＢＳ（Phosphate-buffered saline）はリン酸緩衝生理食塩水を示し、本試験でＲＢＬ－２Ｈ３細胞の洗浄などに使用している緩衝液である。
【0019】
滅菌ＰＢＳを吸引除去し、混合水溶液（０．２５％トリプシン、０．０２％エチレンジアミン四酢酸）１ ｍＬと、滅菌ＰＢＳ １ ｍＬとを、ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞に加えて、２分間、３７℃、５％ＣＯ２条件で保温した。
【0020】
混合液Ａを上記の２分間保温後のラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞に加えて、ピペットで吸い上げ操作と注入操作を繰り返して、１００ｍｍディッシュに密着したラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞を剥がして、ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞懸濁溶液を得た。
【0021】
上記のラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞濁溶液を１５ ｍＬ遠心管に回収し、１０００ ｒｐｍ、５分間の条件で遠心分離した。ｒｐｍ（rotations per minute）は遠心機の1分間での回転数である。
【0022】
遠心分離後、１５ ｍＬ遠心管内の上清を吸引除去し、血球計算盤またはセルカウンターを用いて４．０×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、１０％ ＦＢＳ－ＤＭＥＭ溶液を加えて、ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞懸濁液を調製した。
【0023】
ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞懸濁液を９６ウェル培養プレートに、それぞれ１００ μＬ／ｗｅｌｌで播種した。
【0024】
５００ μｇ／ｍＬのモノクローナル抗ジニトロフェニル（ＤＮＰ）－ＩｇＥ溶液（シグマアルドリッチ社製、製品番号Ｄ８４０６）を１０％ ＦＢＳ－ＤＭＥＭ溶液により５０００倍希釈して、１００ ｎｇ／ｍＬとし、播種済みの上記９６ウェル培養プレートに、それぞれ１００ μＬ／ｗｅｌｌで添加した。
ＤＮＰ（Dinitrophenyl）は脱顆粒誘導に用いている不完全抗原であり、部分抗原抗体であるモノクローナル抗ジニトロフェニル（ＤＮＰ）－ＩｇＥと結合するが、分子量が小さいため単独で抗体産生を誘起する活性を示さない物質である。
ＤＮＰ（Dinitrophenyl）は脱顆粒誘導に用いている不完全抗原であり、部分抗原抗体であるモノクローナル抗ジニトロフェニル（ＤＮＰ）－ＩｇＥと結合するが、分子量が小さいため単独で抗体産生を誘起する活性を示さない物質である。
【0025】
ＩｇＥ（Immunoglobulin E）は、免疫グロブリンの主要なクラスの一つであり、主にマスト細胞や好塩基球の細胞表面に存在し、アレルゲンと結合することで アレルギー応答反応を引き起こす。本試験では、ＲＢＬ－２Ｈ３細胞をモノクローナル抗ジニトロフェニル（ＤＮＰ）－ＩｇＥで感作してＤＮＰ－ＨＳＡ（Dinitrophenyl－Human Serum Albumin）に対して敏感な状態にし、脱顆粒を誘導するために使用している。
【0026】
ＤＮＰ－ＨＳＡはＲＢＬ－２Ｈ３細胞を抗原刺激して脱顆粒を誘導するために使用しているジニトロフェニルとヒト血清アルブミンが結合した完全抗原である。
【0027】
培地中のモノクローナル抗ジニトロフェニル（ＤＮＰ）－ＩｇＥ溶液の終濃度は５０ｎｇ／ｍＬであり、ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞は４．０×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌである。
【0028】
続いて、温度３７℃、５％ＣＯ２条件で、１８～２４時間、培養器で前培養を実施した。
【0029】
図１は、培養器で前培養を実施した際の、９６ウェル培養プレートのラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞懸濁液の設置状況を説明するための模式図である。
図１に例示されるように、参照符号１００で示される９６ウェル培養プレートのうち、縦ＡからＨまでの８行と、横１から６までの６列に実際にラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞懸濁液を配置した。それ以外の操作は上記の説明の通りである。
図１に例示されるように、参照符号１００で示される９６ウェル培養プレートのうち、縦ＡからＨまでの８行と、横１から６までの６列に実際にラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞懸濁液を配置した。それ以外の操作は上記の説明の通りである。
【0030】
［抗原刺激から脱顆粒評価まで］
前培養の実施後、上記９６ウェル培養プレート内の各ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞上清を吸引除去した。
先に調製した滅菌タイロード緩衝液を、上記９６ウェル培養プレート内の各ウェルに２００ μＬ／ｗｅｌｌでゆっくり添加し、各ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞を洗浄した。
この洗浄を２回繰り返した。
前培養の実施後、上記９６ウェル培養プレート内の各ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞上清を吸引除去した。
先に調製した滅菌タイロード緩衝液を、上記９６ウェル培養プレート内の各ウェルに２００ μＬ／ｗｅｌｌでゆっくり添加し、各ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞を洗浄した。
この洗浄を２回繰り返した。
【0031】
（－）－ネオエキヌリンＡをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ: Dimethylsulfoxide）で２００ ｍＭになるように溶解した。（－）－ネオエキヌリンＡの２００ ｍＭ溶液を２０としてＤＭＳＯで２１、２２、および２３倍にそれぞれ希釈した。ネオエキヌリンＡ２００ ｍＭ溶液の２０、２１、２２、および２３倍希釈液を滅菌タイロード緩衝液に０．５％添加して０．１２５ ｍＭ、０．２５ ｍＭ、０．５ ｍＭ、および１ ｍＭの濃度に調製した。
上記９６ウェル培養プレート内の滅菌タイロード緩衝液を吸引除去した後、滅菌タイロード緩衝液で０．１２５ ｍＭ、０．２５ ｍＭ、０．５ ｍＭ、および１ ｍＭの濃度に調製した各濃度の溶液を３ウェルずつ１２０ μＬ／ｗｅｌｌになるように添加した。ブランク（ＤＮＰ－ＨＳＡによる抗原刺激なし条件）、コントロール（ＤＮＰ－ＨＳＡによる抗原刺激あり条件）はＤＭＳＯを滅菌タイロード緩衝液に０．５％添加した溶液をそれぞれ３ウェルずつ１２０ μＬ／ｗｅｌｌになるように添加した。
上記９６ウェル培養プレート内の滅菌タイロード緩衝液を吸引除去した後、滅菌タイロード緩衝液で０．１２５ ｍＭ、０．２５ ｍＭ、０．５ ｍＭ、および１ ｍＭの濃度に調製した各濃度の溶液を３ウェルずつ１２０ μＬ／ｗｅｌｌになるように添加した。ブランク（ＤＮＰ－ＨＳＡによる抗原刺激なし条件）、コントロール（ＤＮＰ－ＨＳＡによる抗原刺激あり条件）はＤＭＳＯを滅菌タイロード緩衝液に０．５％添加した溶液をそれぞれ３ウェルずつ１２０ μＬ／ｗｅｌｌになるように添加した。
【0032】
続いて、それぞれの９６ウェル培養プレートを用いて、温度３７℃、５％ＣＯ２条件で、培養器内で１０分間培養した。
【0033】
この培養の間に、１０ ｍｇ／ｍＬのジニトロフェニル（ＤＮＰ）－ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）溶液（以下、「ＤＮＰ－ＨＳＡ溶液」と呼ぶ。）を滅菌タイロード緩衝液で１６，０００倍希釈（０．６２５ μｇ／ｍＬ）した。
【0034】
１０分後、上記の１６，０００倍希釈（０．６２５ μｇ／ｍＬ）したＤＮＰ－ＨＳＡ溶液を、上記の１０分間培養後の９６ウェル培養プレートに対して、培地中の最終のＤＮＰ－ＨＳＡ溶液濃度が４８．１ ｎｇ／ｍＬとなる様に、それぞれ１０ μＬ／ｗｅｌｌずつ添加した。
この９６ウェル培養プレートを用いて、温度３７℃、５％ＣＯ２条件で、３０分間、培養器内で培養した。
なお、ウェル内の溶液全量は１３０ μＬであった。
この９６ウェル培養プレートを用いて、温度３７℃、５％ＣＯ２条件で、３０分間、培養器内で培養した。
なお、ウェル内の溶液全量は１３０ μＬであった。
【0035】
また、以降の操作は、全てクリーンベンチ外で実施した。
【0036】
上記の培養中に、次の試薬の調製を実施した。
（１）０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００ －タイロード緩衝液の調製
ＨＥＰＥＳ（ 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid）４．７７ ｇ、ＮａＣｌ ７．８９ ｇ、ＫＣｌ ０．３７ ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．２６ ｇ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．２０ ｇ、グルコース １．０１ ｇ、およびＢＳＡ ０．５０ ｇを蒸留水に溶解させた後、水酸化ナトリウムを用いてｐＨ ７．４に調整し、蒸留水で１Ｌの体積に合わせ、タイロード緩衝液（２０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid）、１３５ ｍＭ ＮａＣｌ、５ ｍＭ ＫＣｌ、１．８ ｍＭ ＣａＣｌ２、１ ｍＭ ＭｇＣｌ２、５．６ ｍＭ グルコース、および０．０５％ＢＳＡ）を調製した。タイロード緩衝液１０ ｍＬで１０ ｍｇのＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（シグマアルドリッチ製、製品番号Ｔ９２８４）を希釈し、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００ －タイロード緩衝液を調製した。
（１）０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００ －タイロード緩衝液の調製
ＨＥＰＥＳ（ 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid）４．７７ ｇ、ＮａＣｌ ７．８９ ｇ、ＫＣｌ ０．３７ ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．２６ ｇ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．２０ ｇ、グルコース １．０１ ｇ、およびＢＳＡ ０．５０ ｇを蒸留水に溶解させた後、水酸化ナトリウムを用いてｐＨ ７．４に調整し、蒸留水で１Ｌの体積に合わせ、タイロード緩衝液（２０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid）、１３５ ｍＭ ＮａＣｌ、５ ｍＭ ＫＣｌ、１．８ ｍＭ ＣａＣｌ２、１ ｍＭ ＭｇＣｌ２、５．６ ｍＭ グルコース、および０．０５％ＢＳＡ）を調製した。タイロード緩衝液１０ ｍＬで１０ ｍｇのＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（シグマアルドリッチ製、製品番号Ｔ９２８４）を希釈し、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００ －タイロード緩衝液を調製した。
【0037】
（２）基質溶液
基質としてp-nitrophenyl-2-acetoamid-2deoxy-β-D-glucopyranoside（ナカライテスク株式会社製、製品番号24937-81）を１００ ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ ４．５）に溶解して、３．３ ｍＭ基質溶液を得た（１０ ｍＬの１００ ｍＭクエン酸緩衝液に、１１．３ ｍｇの基質を溶解した）。
基質としてp-nitrophenyl-2-acetoamid-2deoxy-β-D-glucopyranoside（ナカライテスク株式会社製、製品番号24937-81）を１００ ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ ４．５）に溶解して、３．３ ｍＭ基質溶液を得た（１０ ｍＬの１００ ｍＭクエン酸緩衝液に、１１．３ ｍｇの基質を溶解した）。
【0038】
培養器から温度３７℃、５％ＣＯ２条件で、３０分間、培養器内で培養した、ウェル内の溶液全量が１３０ μＬの９６ウェル培養プレートを取り出し、１０分間氷上に静置して、脱顆粒反応を停止させた。
【0039】
１０分間氷上に静置後の各１３０ μＬの培養上清を、別の空のウェルまたは別の９６ウェル培養プレートに移した。
【0040】
図２は、細胞破砕液と、培養上清を別の空のウェルに移した状態の９６ウェル培養プレートを説明するための模式図である。
ここで図２に例示されるように、参照符号１２０で示される９６ウェル培養プレートのうち、縦ＡからＨまでの８行と、横１から６までの６列に細胞破砕液が配置され、参照符号１４０で示される縦ＡからＨまでの８行と、横７から１２までの６列に移された培養上清が配置されている。それ以外の操作は上記の説明の通りである。
ここで図２に例示されるように、参照符号１２０で示される９６ウェル培養プレートのうち、縦ＡからＨまでの８行と、横１から６までの６列に細胞破砕液が配置され、参照符号１４０で示される縦ＡからＨまでの８行と、横７から１２までの６列に移された培養上清が配置されている。それ以外の操作は上記の説明の通りである。
【0041】
培養上清除去後のラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞に対して、先に調製した０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００ －タイロード緩衝液を１３０ μＬ／ｗｅｌｌの割合で入れた。
次に氷冷しながら０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００ －タイロード緩衝液を１３０ μＬ／ｗｅｌｌ入れたラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞に対して超音波破砕を実施し、ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞を破壊した。これを細胞破砕液とする。
１ウェル当たりの超音波破砕時間は５秒である。
次に氷冷しながら０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００ －タイロード緩衝液を１３０ μＬ／ｗｅｌｌ入れたラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞に対して超音波破砕を実施し、ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞を破壊した。これを細胞破砕液とする。
１ウェル当たりの超音波破砕時間は５秒である。
【0042】
新しく準備した、清浄な９６ウェル培養プレートに、４行６列の２４ウェルを一つの単位として、培養上清を２単位および細胞破砕液を２単位に、それぞれ５０μＬずつ入れ、恒温室で、温度３７℃で５分間保温した。
【0043】
次に、反応停止液として、２Ｍグリシン緩衝液を準備した。また基質溶液は上記の（２）で準備したものを使用した。
図３は、細胞破砕液と細胞上清に対する（ａ）から（ｄ）の４通りの操作に使用した９６ウェル培養プレートを説明するための模式図である。
図３で、それぞれ、左上が参照符号（ａ）、右上が参照符号（ｂ）、左下が参照符号（ｃ）および右下が参照符号（ｄ）の関係になっている。
上記の４列６行の２４ウェルを一つの単位とした４単位分の各ウェルに対して、下記の（ａ）から（ｄ）の４通りの操作を実施した。
図３は、細胞破砕液と細胞上清に対する（ａ）から（ｄ）の４通りの操作に使用した９６ウェル培養プレートを説明するための模式図である。
図３で、それぞれ、左上が参照符号（ａ）、右上が参照符号（ｂ）、左下が参照符号（ｃ）および右下が参照符号（ｄ）の関係になっている。
上記の４列６行の２４ウェルを一つの単位とした４単位分の各ウェルに対して、下記の（ａ）から（ｄ）の４通りの操作を実施した。
【0044】
（ａ）細胞破砕液（５０ μＬ）に対して基質溶液１００ μＬ／ｗｅｌｌを追加
（ｂ）細胞破砕液（５０ μＬ）に対して反応停止液１００ μＬ／ｗｅｌｌを追加
（ｃ）細胞上清（５０ μＬ）に対して基質溶液１００ μＬ／ｗｅｌｌを追加
（ｄ）細胞上清（５０ μＬ）に対して反応停止液１００ μＬ／ｗｅｌｌを追加
これらの（ａ）から（ｄ）に対して、恒温室で、温度３７℃で２５分間保温した。
（ｂ）細胞破砕液（５０ μＬ）に対して反応停止液１００ μＬ／ｗｅｌｌを追加
（ｃ）細胞上清（５０ μＬ）に対して基質溶液１００ μＬ／ｗｅｌｌを追加
（ｄ）細胞上清（５０ μＬ）に対して反応停止液１００ μＬ／ｗｅｌｌを追加
これらの（ａ）から（ｄ）に対して、恒温室で、温度３７℃で２５分間保温した。
【0045】
次に、上記の（ａ）から（ｄ）に対して、下記の通り基質溶液または反応停止液を下記の通り１００ μＬ／ｗｅｌｌ添加して、酵素反応を停止させた。
（ａ）反応停止液１００ μＬ／ｗｅｌｌを添加
（ｂ）基質溶液１００ μＬ／ｗｅｌｌを添加
（ｃ）反応停止液１００ μＬ／ｗｅｌｌを添加
（ｄ）基質溶液１００ μＬ／ｗｅｌｌを添加
（ａ）反応停止液１００ μＬ／ｗｅｌｌを添加
（ｂ）基質溶液１００ μＬ／ｗｅｌｌを添加
（ｃ）反応停止液１００ μＬ／ｗｅｌｌを添加
（ｄ）基質溶液１００ μＬ／ｗｅｌｌを添加
【0046】
（－）－ネオエキヌリンＡが吸光分析の際に、４１５ ｎｍに吸収領域を持つ可能性があるため、反応停止液を入れた後に基質溶液を加えた条件である（ｂ）（ｄ）の吸光度を測定し、酵素反応におけるブランク（β-ヘキソサミニダーゼの放出率を算出するために、ネオエキヌリンＡなど他の試薬の影響を除いて補正するための吸光度値）とした。
【0047】
次にマイクロプレートリーダー（バイオラッド社製、製品名：iMarkマイクロプレートリーダー、型番：1681135JA）を用いて、それぞれの上記（ａ）から（ｄ）のウェルの４１５ ｎｍの吸光度を測定した。
【0048】
ウェル条件とβ‐ヘキソサミニダーゼ放出率の計算式中の吸光度の表記対応表は次の通りである。
【表2】
【0049】
β-ヘキソサミニダーゼの放出率を以下の式により算出した。
ここで、Ａは各ウェルにおける吸光度の値を示す。
【数1】
【0050】
結果を図４に示す。
図４は、コントロールを基準とした、相対的な顆粒中に含まれるβ-ヘキソサミニダーゼの放出率を示すグラフである。
参照符号１０は、（－）－ネオエキヌリンＡを使用した場合である。参照符号２０は、コントロールであり、参照符号３０はブランクである。
図４に示される通り、（－）－ネオエキヌリンＡは、ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞に対して、０．２５～１．０ ｍＭの濃度で、脱顆粒抑制を示すことが示された。
図４は、コントロールを基準とした、相対的な顆粒中に含まれるβ-ヘキソサミニダーゼの放出率を示すグラフである。
参照符号１０は、（－）－ネオエキヌリンＡを使用した場合である。参照符号２０は、コントロールであり、参照符号３０はブランクである。
図４に示される通り、（－）－ネオエキヌリンＡは、ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞に対して、０．２５～１．０ ｍＭの濃度で、脱顆粒抑制を示すことが示された。
【0051】
［細胞毒性試験］
細胞毒性試験に使用した器具は次の通りである。
遠心分離には、滅菌した１５ ｍＬ遠心管、接着用に１００ ｍｍディッシュおよび９６ウェル培養プレートを使用した。
細胞毒性試験に使用した器具は次の通りである。
遠心分離には、滅菌した１５ ｍＬ遠心管、接着用に１００ ｍｍディッシュおよび９６ウェル培養プレートを使用した。
【0052】
また試薬として使用したＤＭＥＭ、ＦＢＳ、滅菌ＰＢＳ、トリプシンとエチレンジアミン四酢酸の混合水溶液（トリプシン０．２５％、エチレンジアミン四酢酸０．０２％）、モノクローナル抗ジニトロフェニル（ＤＮＰ）－ＩｇＥ溶液、ＤＮＰ－ＨＳＡ溶液および滅菌タイロード緩衝液はそれぞれ先に例示した場合と同様である。
細胞計数試薬として、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔ Ｒｅａｇｅｎｔ ＳＦ（ナカライテスク株式会社製）を使用した。
細胞計数試薬として、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔ Ｒｅａｇｅｎｔ ＳＦ（ナカライテスク株式会社製）を使用した。
【0053】
［滅菌タイロード緩衝液（ｐＨ ７．４）の調製］
細胞毒性試験に使用した滅菌タイロード緩衝液（ｐＨ ７．４）の調製は、先に説明した場合と同様である。
細胞毒性試験に使用した滅菌タイロード緩衝液（ｐＨ ７．４）の調製は、先に説明した場合と同様である。
【0054】
［播き込みとＩｇＥ感作］
ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞を１０％ＦＢＳ－ＤＥＭＥ培地中に４．０×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度になるように調整した細胞懸濁液を１００ｍｍディッシュに１０ｍｌ入れ、４．０×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで３７℃、５％ＣＯ２条件で培養した。４８時間後にラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞が最初の状態（４．０×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈ）から１００ｍｍディッシュ中に７０から８０％増殖したことを目視で確認することができた。
滅菌した１５ ｍＬ遠心管に、ウシ胎児血清（ＦＢＳ、シグマアルドリッチ社製、製品名non-USA origin, sterile-filtered, suitable for cell culture）を１ ｍＬおよびダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を７ ｍＬ加え、混合液Ａを調製した。
ＤＭＥＭ培地はＤＭＥＭ(シグマアルドリッチ社製、製品番号Ｄ５６４８) １３．４ ｇ、ＮａＨＣＯ３(富士フィルム和光純薬社製、製品番号１９１－０１３０５) ３．７ ｇ、ストレプトマイシン(シグマアルドリッチ社製、製品番号Ｓ９１３７) ０．１ ｇ、ペニシリン(シグマアルドリッチ社製、製品番号Ｐ７７９４) ０．０６２５ ｇを１ Ｌの蒸留水に溶解した後、加圧蒸気滅菌済ハウジングでろ過滅菌して調製した。
ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞を１０％ＦＢＳ－ＤＥＭＥ培地中に４．０×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度になるように調整した細胞懸濁液を１００ｍｍディッシュに１０ｍｌ入れ、４．０×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで３７℃、５％ＣＯ２条件で培養した。４８時間後にラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞が最初の状態（４．０×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈ）から１００ｍｍディッシュ中に７０から８０％増殖したことを目視で確認することができた。
滅菌した１５ ｍＬ遠心管に、ウシ胎児血清（ＦＢＳ、シグマアルドリッチ社製、製品名non-USA origin, sterile-filtered, suitable for cell culture）を１ ｍＬおよびダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を７ ｍＬ加え、混合液Ａを調製した。
ＤＭＥＭ培地はＤＭＥＭ(シグマアルドリッチ社製、製品番号Ｄ５６４８) １３．４ ｇ、ＮａＨＣＯ３(富士フィルム和光純薬社製、製品番号１９１－０１３０５) ３．７ ｇ、ストレプトマイシン(シグマアルドリッチ社製、製品番号Ｓ９１３７) ０．１ ｇ、ペニシリン(シグマアルドリッチ社製、製品番号Ｐ７７９４) ０．０６２５ ｇを１ Ｌの蒸留水に溶解した後、加圧蒸気滅菌済ハウジングでろ過滅菌して調製した。
【0055】
１００ｍｍディッシュに７０～８０％増殖したラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞の細胞上清を吸引除去した後、滅菌処理後のリン酸緩衝液（滅菌ＰＢＳ）を１０ ｍＬ添加して、軽くディッシュを揺らしてラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞を洗浄した。
【0056】
滅菌ＰＢＳを吸引除去し、混合水溶液（０．２５％トリプシン、０．０２％エチレンジアミン四酢酸）１ ｍＬと、滅菌ＰＢＳ １ ｍＬとを、ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞に加えて、２分間、３７℃、５％ＣＯ２条件で保温した。
【0057】
混合液Ａを上記の２分間保温後のラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞に加えて、ピペットで吸い上げ操作と注入操作を繰り返して、１００ｍｍディッシュに密着したラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞を剥がして、ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞懸濁溶液を得た。
【0058】
上記のラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞濁溶液を１５ ｍＬ遠心管に回収し、１０００ ｒｐｍ、５分間の条件で遠心分離した。
【0059】
遠心分離後、１５ ｍＬ遠心管内の上清を吸引除去し、血球計算盤またはセルカウンターを用いて４．０×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、１０％ ＦＢＳ－ＤＭＥＭ溶液を加えて、ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞懸濁液を調製した。
【0060】
ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞懸濁液を９６ウェル培養プレートに、それぞれ１００ μＬ／ｗｅｌｌで播種した。
【0061】
５００ μｇ／ｍＬのモノクローナル抗ジニトロフェニル（ＤＮＰ）－ＩｇＥ溶液（シグマアルドリッチ社製、製品番号Ｄ８４０６）を１０％ ＦＢＳ－ＤＭＥＭ溶液により５０００倍希釈して、１００ ｎｇ／ｍＬとし、播種済みの上記９６ウェル培養プレートに、それぞれ１００ μＬ／ｗｅｌｌで添加した。
培地中のモノクローナル抗ジニトロフェニル（ＤＮＰ）－ＩｇＥ溶液の終濃度は５０ｎｇ／ｍＬであり、ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞は４．０×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌである。
培地中のモノクローナル抗ジニトロフェニル（ＤＮＰ）－ＩｇＥ溶液の終濃度は５０ｎｇ／ｍＬであり、ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞は４．０×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌである。
【0062】
続いて、温度３７℃、５％ＣＯ２条件で、１８～２４時間、培養器で前培養を実施した。
【0063】
［抗原刺激から脱顆粒評価まで］
前培養の実施後、上記９６ウェル培養プレート内の各ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞上清を吸引除去した。
先に調製した滅菌タイロード緩衝液を、上記９６ウェル培養プレート内の各ウェルに２００ μＬ／ｗｅｌｌでゆっくり添加し、各ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞を洗浄した。
この洗浄を２回繰り返した。
前培養の実施後、上記９６ウェル培養プレート内の各ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞上清を吸引除去した。
先に調製した滅菌タイロード緩衝液を、上記９６ウェル培養プレート内の各ウェルに２００ μＬ／ｗｅｌｌでゆっくり添加し、各ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞を洗浄した。
この洗浄を２回繰り返した。
【0064】
（－）－ネオエキヌリンＡをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で２００ ｍＭになるように溶解した。（－）－ネオエキヌリンＡの２００ ｍＭ溶液を２０としてＤＭＳＯで２１、２２、および２３倍にそれぞれ希釈した。ネオエキヌリンＡ２００ ｍＭ溶液の２０、２１、２２、および２３倍希釈液を滅菌タイロード緩衝液に０．５％添加して０．１２５ ｍＭ、０．２５ ｍＭ、０．５ ｍＭ、および１ ｍＭの濃度に調製した。
上記９６ウェル培養プレート内の滅菌タイロード緩衝液を吸引除去した後、滅菌タイロード緩衝液で０．１２５ ｍＭ、０．２５ ｍＭ、０．５ ｍＭ、および１ ｍＭの濃度に調製した各濃度の溶液を３ウェルずつ１２０ μＬ／ｗｅｌｌになるように添加した。ブランク（ＤＮＰ－ＨＳＡによる抗原刺激なし条件）、コントロール（ＤＮＰ－ＨＳＡによる抗原刺激あり条件）はＤＭＳＯを滅菌タイロード緩衝液に０．５％添加した溶液をそれぞれ３ウェルずつ１２０ μＬ／ｗｅｌｌになるように添加した。
上記９６ウェル培養プレート内の滅菌タイロード緩衝液を吸引除去した後、滅菌タイロード緩衝液で０．１２５ ｍＭ、０．２５ ｍＭ、０．５ ｍＭ、および１ ｍＭの濃度に調製した各濃度の溶液を３ウェルずつ１２０ μＬ／ｗｅｌｌになるように添加した。ブランク（ＤＮＰ－ＨＳＡによる抗原刺激なし条件）、コントロール（ＤＮＰ－ＨＳＡによる抗原刺激あり条件）はＤＭＳＯを滅菌タイロード緩衝液に０．５％添加した溶液をそれぞれ３ウェルずつ１２０ μＬ／ｗｅｌｌになるように添加した。
【0065】
続いて、それぞれの９６ウェル培養プレートを用いて、温度３７℃、５％ＣＯ２条件で、培養器内で１０分間培養した。
【0066】
この培養の間に、１０ ｍｇ／ｍＬのジニトロフェニル（ＤＮＰ）－ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）溶液（以下、「ＤＮＰ－ＨＳＡ溶液」と呼ぶ。）を滅菌タイロード緩衝液で１６，０００倍希釈（０．６２５ μｇ／ｍＬ）した。
【0067】
１０分後、上記の１６，０００倍希釈（０．６２５ μｇ／ｍＬ）したＤＮＰ－ＨＳＡ溶液を、上記の１０分間培養後の９６ウェル培養プレートに対して、培地中の最終のＤＮＰ－ＨＳＡ溶液濃度が４８．１ ｎｇ／ｍＬとなる様に、それぞれ１０ μＬ／ｗｅｌｌずつ添加した。
この９６ウェル培養プレートを用いて、温度３７℃、５％ＣＯ２条件で、３０分間、培養器内で培養した。
なお、ウェル内の溶液全量は１３０ μＬであった。
この９６ウェル培養プレートを用いて、温度３７℃、５％ＣＯ２条件で、３０分間、培養器内で培養した。
なお、ウェル内の溶液全量は１３０ μＬであった。
【0068】
上記の培養中に、細胞計数試薬として、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔ Ｒｅａｇｅｎｔ ＳＦ（ナカライテスク株式会社製、製品名：ＷＳＴ－８）を１０％含むＤＭＥＭ溶液を調製した（１０％ ＷＳＴ－８－ＤＭＥＭとする）。ＷＳＴ（water-soluble tetrazolium）は水溶性テトラゾリウムのことで、細胞の生存率を測定するために使用している。本試験ではＷＳＴ－８を用いてＲＢＬ－２Ｈ３細胞の細胞生存率を測定して細胞毒性を評価している。
【0069】
９６ウェル培養プレートを用いた温度３７℃、５％ＣＯ２条件下の３０分間の培養後、細胞上清を吸引除去し、ＤＭＥＭを上記９６ウェル培養プレート内の各ウェルに２００ μＬ／ｗｅｌｌでゆっくり添加し、各ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞を洗浄した。
【0070】
上記９６ウェル培養プレート内の各ウェルからＤＭＥＭを吸引除去後、先に調製した１０％ ＷＳＴ－８－ＤＭＥＭを記９６ウェル培養プレート内の各ウェルに１００ μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、温度３７℃、５％ＣＯ２条件で、２０分間、培養器内で培養した。
【0071】
先の場合と同様、マイクロプレートリーダーを用いて４５０ ｎｍ（リファレンス：６５５ ｎｍ）の吸光度を測定した。
【0072】
結果を図５に示す。
図５は、ＷＳＴ－８法により評価した細胞毒性の評価結果を示すグラフである。
参照符号１２は、（－）－ネオエキヌリンＡを使用した場合である。参照符号２２は、コントロールであり、参照符号３２はブランクである。
ここでブランクは、ＤＮＰ－ＨＳＡによる抗原刺激なしで、ＲＢＬ－２Ｈ３細胞の脱顆粒を誘導しない条件を意味する。またコントロールは、ＤＮＰ－ＨＳＡによる抗原刺激ありで、ＲＢＬ－２Ｈ３細胞の脱顆粒を誘導した条件を意味する。また、（－）－ネオエキヌリンＡを使用した場合とは、ＤＮＰ－ＨＳＡによる抗原刺激ありの場合を示す。ＲＢＬ－２Ｈ３細胞の脱顆粒を誘導した条件で（－）－ネオエキヌリンＡを添加し、ブランク、コントロールのβ‐ヘキソサミニダーゼ放出率を比較対照にして脱顆粒が抑制されるかどうかを評価した。
図５に示される通り、（－）－ネオエキヌリンＡは、ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞に対して、０．２５～１．０ ｍＭの濃度で、毒性を示さないことが示された。
図５は、ＷＳＴ－８法により評価した細胞毒性の評価結果を示すグラフである。
参照符号１２は、（－）－ネオエキヌリンＡを使用した場合である。参照符号２２は、コントロールであり、参照符号３２はブランクである。
ここでブランクは、ＤＮＰ－ＨＳＡによる抗原刺激なしで、ＲＢＬ－２Ｈ３細胞の脱顆粒を誘導しない条件を意味する。またコントロールは、ＤＮＰ－ＨＳＡによる抗原刺激ありで、ＲＢＬ－２Ｈ３細胞の脱顆粒を誘導した条件を意味する。また、（－）－ネオエキヌリンＡを使用した場合とは、ＤＮＰ－ＨＳＡによる抗原刺激ありの場合を示す。ＲＢＬ－２Ｈ３細胞の脱顆粒を誘導した条件で（－）－ネオエキヌリンＡを添加し、ブランク、コントロールのβ‐ヘキソサミニダーゼ放出率を比較対照にして脱顆粒が抑制されるかどうかを評価した。
図５に示される通り、（－）－ネオエキヌリンＡは、ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞に対して、０．２５～１．０ ｍＭの濃度で、毒性を示さないことが示された。
【0073】
［細胞内カルシウムイオン濃度測定結果概要］
次に、（－）－ネオエキヌリンＡが脱顆粒を抑制する作用機構を明らかにするため、細胞内カルシウムイオン（Ｃａ２＋）濃度に及ぼす影響を検討した。
（－）－ネオエキヌリンＡを１ ｍＭの濃度で添加したところ、抗原誘導性の細胞内Ｃａ２＋の濃度の上昇が、（－）－ネオエキヌリンＡにより抑制される結果となった。
次に、（－）－ネオエキヌリンＡが脱顆粒を抑制する作用機構を明らかにするため、細胞内カルシウムイオン（Ｃａ２＋）濃度に及ぼす影響を検討した。
（－）－ネオエキヌリンＡを１ ｍＭの濃度で添加したところ、抗原誘導性の細胞内Ｃａ２＋の濃度の上昇が、（－）－ネオエキヌリンＡにより抑制される結果となった。
【0074】
［細胞内カルシウムイオン濃度測定］
細胞内カルシウムイオン濃度測定に使用した器具は次の通りである。
遠心分離には、滅菌した１５ ｍＬ遠心管、接着用に１００ ｍｍディッシュおよび９６ウェル培養プレートを使用した。９６ウェル培養プレートは黒色のものを使用した。
細胞内カルシウムイオン濃度測定に使用した器具は次の通りである。
遠心分離には、滅菌した１５ ｍＬ遠心管、接着用に１００ ｍｍディッシュおよび９６ウェル培養プレートを使用した。９６ウェル培養プレートは黒色のものを使用した。
【0075】
また試薬として使用したＤＭＥＭ、ＦＢＳ、滅菌ＰＢＳ、トリプシンとエチレンジアミン四酢酸の混合水溶液（トリプシン０．２５％、エチレンジアミン四酢酸０．０２％）、モノクローナル抗ジニトロフェニル（ＤＮＰ）－ＩｇＥ溶液（シグマアルドリッチ社製）およびＤＮＰ－ＨＳＡ溶液（シグマアルドリッチ社製）はそれぞれ先に例示した場合と同様である。
【0076】
加えて細胞内カルシウムイオン測定試薬として、Ｆｌｕｏ ３－ＡＭ（1-[2-Amino-5-(2,7-dichloro-6-acetoxymethoxy-3-oxo-9-xanthenyl)phenoxy]-2-(2-amino-5methylphenoxy)ethane-N,N,N',N'-tetraacetic acid,tetra(acetoxymethyl)ester））（株式会社同仁化学研究所製）、２倍レコーディングミディアム（下記［２倍レコーディングミディアムの調製］参照）、プロベネシド（富士フィルム和光純薬株式会社製、製品番号１６５－１５４７２）およびクレモフォール ＥＬ（ナカライテスク株式会社製）を使用した。
【0077】
［２倍レコーディングミディアムの調製］
ＨＥＰＥＳ（ 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid） ９．５３ ｇ、ＮａＣｌ １３．４４ ｇ、ＫＣｌ ０．８１ ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．５３ ｇ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．３３ ｇ、グルコース ４．９７２ ｇを蒸留水に溶解後、蒸留水で１Ｌの体積に合わせ、２倍レコーディングミディアム（４０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２３０ ｍＭ ＮａＣｌ、１．６ ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０．８ ｍＭ ＫＣｌ、３．６ ｍＭ ＣａＣｌ２、および２７．６ ｍＭ グルコース）を調製した。
２倍レコーディングミディアムの調製には、同人化学研究所社のウェブサイト（Ｄｏｊｉｎｄｏ、https://www.dojindo.co.jp/）を参照した。
ＨＥＰＥＳ（ 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid） ９．５３ ｇ、ＮａＣｌ １３．４４ ｇ、ＫＣｌ ０．８１ ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．５３ ｇ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．３３ ｇ、グルコース ４．９７２ ｇを蒸留水に溶解後、蒸留水で１Ｌの体積に合わせ、２倍レコーディングミディアム（４０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２３０ ｍＭ ＮａＣｌ、１．６ ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０．８ ｍＭ ＫＣｌ、３．６ ｍＭ ＣａＣｌ２、および２７．６ ｍＭ グルコース）を調製した。
２倍レコーディングミディアムの調製には、同人化学研究所社のウェブサイト（Ｄｏｊｉｎｄｏ、https://www.dojindo.co.jp/）を参照した。
【0078】
［播き込みとＩｇＥ感作］
ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞を１０％ＦＢＳ－ＤＥＭＥ培地中に４．０×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度になるように調整した細胞懸濁液を１００ｍｍディッシュに１０ｍｌ入れ、４．０×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで３７℃、５％ＣＯ２条件で培養した。
４８時間後にラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞が最初の状態（４．０×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈ）から１００ｍｍディッシュ中に７０から８０％増殖したことを目視で確認することができた。
滅菌した１５ ｍＬ遠心管に、ウシ胎児血清（ＦＢＳ、シグマアルドリッチ社製、製品名non-USA origin, sterile-filtered, suitable for cell culture）を１ ｍＬおよびダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を７ ｍＬ加え、混合液Ａを調製した。
ＤＭＥＭ培地はＤＭＥＭ(シグマアルドリッチ社製、製品番号Ｄ５６４８) １３．４ g
、ＮａＨＣＯ３(富士フィルム和光純薬社製、製品番号１９１－０１３０５) ３．７ ｇ、ストレプトマイシン(シグマアルドリッチ社製、製品番号S9137) ０．１ ｇ、ペニシリン(シグマアルドリッチ社製、製品番号P7794) ０．０６２５ ｇ gを1 Lの蒸留水に溶解した後、加圧蒸気滅菌済ハウジングでろ過滅菌して調製した。
ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞を１０％ＦＢＳ－ＤＥＭＥ培地中に４．０×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度になるように調整した細胞懸濁液を１００ｍｍディッシュに１０ｍｌ入れ、４．０×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで３７℃、５％ＣＯ２条件で培養した。
４８時間後にラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞が最初の状態（４．０×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈ）から１００ｍｍディッシュ中に７０から８０％増殖したことを目視で確認することができた。
滅菌した１５ ｍＬ遠心管に、ウシ胎児血清（ＦＢＳ、シグマアルドリッチ社製、製品名non-USA origin, sterile-filtered, suitable for cell culture）を１ ｍＬおよびダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を７ ｍＬ加え、混合液Ａを調製した。
ＤＭＥＭ培地はＤＭＥＭ(シグマアルドリッチ社製、製品番号Ｄ５６４８) １３．４ g
、ＮａＨＣＯ３(富士フィルム和光純薬社製、製品番号１９１－０１３０５) ３．７ ｇ、ストレプトマイシン(シグマアルドリッチ社製、製品番号S9137) ０．１ ｇ、ペニシリン(シグマアルドリッチ社製、製品番号P7794) ０．０６２５ ｇ gを1 Lの蒸留水に溶解した後、加圧蒸気滅菌済ハウジングでろ過滅菌して調製した。
【0079】
１００ｍｍディッシュに７０～８０％増殖したラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞の細胞上清を吸引除去した後、滅菌処理後のリン酸緩衝液（滅菌ＰＢＳ）を１０ ｍＬ添加して、軽くディッシュを揺らしてラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞を洗浄した。
【0080】
滅菌ＰＢＳを吸引除去し、混合水溶液（０．２５％トリプシン、０．０２％エチレンジアミン四酢酸）１ ｍＬと、滅菌ＰＢＳ １ ｍＬとを、ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞に加えて、２分間、３７℃、５％ＣＯ２条件で保温した。
【0081】
混合液Ａを上記の２分間保温後のラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞に加えて、ピペットで吸い上げ操作と注入操作を繰り返して、１００ｍｍディッシュに密着したラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞を剥がして、ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞懸濁溶液を得た。
【0082】
上記のラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞濁溶液を１５ ｍＬ遠心管に回収し、１０００ ｒｐｍ、５分間の条件で遠心分離した。
【0083】
遠心分離後、１５ ｍＬ遠心管内の上清を吸引除去し、血球計算盤またはセルカウンターを用いて４．０×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、１０％ ＦＢＳ－ＤＭＥＭ溶液を加えて、ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞懸濁液を調製した。
【0084】
ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞懸濁液を９６ウェル培養プレートに、それぞれ１００ μＬ／ｗｅｌｌで播種した。
【0085】
５００ μｇ／ｍＬのモノクローナル抗ジニトロフェニル（ＤＮＰ）－ＩｇＥ溶液（シグマアルドリッチ社製、製品番号Ｄ８４０６）を１０％ ＦＢＳ－ＤＭＥＭ溶液により５０００倍希釈して、１００ ｎｇ／ｍＬとし、播種済みの上記９６ウェル培養プレートに、それぞれ１００ μＬ／ｗｅｌｌで添加した。
培地中のモノクローナル抗ジニトロフェニル（ＤＮＰ）－ＩｇＥ溶液の終濃度は５０ｎｇ／ｍＬであり、ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞は４．０×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌである。
培地中のモノクローナル抗ジニトロフェニル（ＤＮＰ）－ＩｇＥ溶液の終濃度は５０ｎｇ／ｍＬであり、ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞は４．０×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌである。
【0086】
続いて、温度３７℃、５％ＣＯ２条件で、１８～２４時間、培養器で前培養を実施した。
【0087】
［抗原刺激から細胞内カルシウムイオン濃度測定まで］
下記の表の配合通り、ローディング緩衝液とレコーディングミディアムを調製した。
（１）ローディング緩衝液
下記の表の配合通り、ローディング緩衝液とレコーディングミディアムを調製した。
（１）ローディング緩衝液
【表3】
【0088】
（２）レコーディングミディアム
【表4】
【0089】
［抗原刺激から脱顆粒評価まで］
前培養の実施後、上記９６ウェル培養プレート内の各ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞上清を吸引除去した。
先に調製した２倍レコーディングミディアムを滅菌した蒸留水で２倍希釈して１倍レコーディングミディアムとした。１倍レコーディングミディアムを、上記９６ウェル培養プレート内の各ウェルに２００ μＬ／ｗｅｌｌでゆっくり添加し、各ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞を洗浄した。
この洗浄を２回繰り返した。
前培養の実施後、上記９６ウェル培養プレート内の各ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞上清を吸引除去した。
先に調製した２倍レコーディングミディアムを滅菌した蒸留水で２倍希釈して１倍レコーディングミディアムとした。１倍レコーディングミディアムを、上記９６ウェル培養プレート内の各ウェルに２００ μＬ／ｗｅｌｌでゆっくり添加し、各ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞を洗浄した。
この洗浄を２回繰り返した。
【0090】
１倍レコーディングミディアムを吸引除去した後、ローディング緩衝液を上記９６ウェル培養プレート内の各ウェルに１００ μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、温度３７℃、５％ＣＯ２条件で、培養器内で１時間培養した。
【0091】
この培養の間に、１０ ｍｇ／ｍＬのモノクローナル抗ジニトロフェニル（ＤＮＰ）－ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）溶液（以下、「ＤＮＰ－ＨＳＡ溶液」と呼ぶ。）を１倍レコーディングミディアムで１６，０００倍希釈（０．６２５ μｇ／ｍＬ）した。
【0092】
１時間後、培養器内で１時間培養した９６ウェル培養プレート内の各ウェルのローディング緩衝液の上清を吸引除去した。
次に、先に調製した１倍レコーディングミディアムを、上記９６ウェル培養プレート内の各ウェルに２００ μＬ／ｗｅｌｌでゆっくり添加し、各ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞を洗浄した。
この洗浄を２回繰り返した。
次に、先に調製した１倍レコーディングミディアムを、上記９６ウェル培養プレート内の各ウェルに２００ μＬ／ｗｅｌｌでゆっくり添加し、各ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞を洗浄した。
この洗浄を２回繰り返した。
【0093】
（－）－ネオエキヌリンＡをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で２００ ｍＭになるように溶解して（－）－ネオエキヌリンＡの２００ ｍＭ溶液を調製した。（－）－ネオエキヌリンＡの２００ ｍＭ溶液を表４の処方により調製したレコーディングミディアムに０．５％添加し、１ ｍＭの（－）－ネオエキヌリンＡ溶液を調製した。
上記９６ウェル培養プレート内の各ウェルの１倍レコーディングミディアムを吸引除去後、１ ｍＭの濃度に調製した（－）－ネオエキヌリンＡを上記９６ウェル培養プレート内の各ウェルに１００ μＬ／ｗｅｌｌずつ添加した。ブランク（ＤＮＰ－ＨＳＡによる抗原刺激なし条件）、コントロール（ＤＮＰ－ＨＳＡによる抗原刺激あり条件）はＤＭＳＯを表４で調製したレコーディングミディアムに０．５％添加した溶液を１００ μＬ／ｗｅｌｌになるように添加した。蛍光プレートリーダー（Tecan社製、製品名：蛍光マイクロプレートリーダー Infinite F200 Pro）で温度３７℃、１０分間保温した。
上記９６ウェル培養プレート内の各ウェルの１倍レコーディングミディアムを吸引除去後、１ ｍＭの濃度に調製した（－）－ネオエキヌリンＡを上記９６ウェル培養プレート内の各ウェルに１００ μＬ／ｗｅｌｌずつ添加した。ブランク（ＤＮＰ－ＨＳＡによる抗原刺激なし条件）、コントロール（ＤＮＰ－ＨＳＡによる抗原刺激あり条件）はＤＭＳＯを表４で調製したレコーディングミディアムに０．５％添加した溶液を１００ μＬ／ｗｅｌｌになるように添加した。蛍光プレートリーダー（Tecan社製、製品名：蛍光マイクロプレートリーダー Infinite F200 Pro）で温度３７℃、１０分間保温した。
【0094】
次に、蛍光プレートリーダー（Tecan社製、製品名：蛍光マイクロプレートリーダー Infinite F200 Pro）で、抗原刺激前（０秒）の蛍光強度を測定した（λex ＝ ４８５ｎｍ、 λem ＝ ５３５ｎｍ）。
【0095】
先に調製したＤＮＰ－ＨＳＡ溶液を上記９６ウェル培養プレート内の各ウェルに１０ μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、蛍光プレートリーダーで１０秒ずつ、６０秒まで測定した。ブランク（ＤＮＰ－ＨＳＡによる抗原刺激なし条件）のウェルにはＤＮＰ－ＨＳＡ溶液のかわりに１倍レコーディングミディアムを１０ μＬ／ｗｅｌｌずつ添加した。
【0096】
結果を図６に示す。
図６は、（－）－ネオエキヌリンＡの細胞内カルシウムイオン濃度に及ぼす影響を示すグラフである。
参照符号１４は、（－）－ネオエキヌリンＡを使用した場合である。参照符号２４はコントロールであり、参照符号３４はブランクである。
ここでブランクは、ＤＮＰ－ＨＳＡによる抗原刺激なしで、ＲＢＬ－２Ｈ３細胞の細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を誘導しない条件を意味する。またコントロールは、ＤＮＰ－ＨＳＡによる抗原刺激ありで、ＲＢＬ－２Ｈ３細胞の細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を誘導する条件を意味する。また、（－）－ネオエキヌリンＡを使用した場合とは、ＤＮＰ－ＨＳＡによる抗原刺激ありの場合を示す。ＲＢＬ－２Ｈ３細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる条件で（－）－ネオエキヌリンＡを添加し、ブランク、コントロールのカルシウムイオン濃度（相対蛍光強度で評価）を比較対照にしてカルシウムイオン濃度の上昇が抑制されるかどうかを評価した。
図６の縦軸は、相対蛍光強度であり、横軸は反応時間（秒）である。図６に示される通り、（－）－ネオエキヌリンＡは、ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞に対して、細胞内カルシウムイオン濃度の上昇が抑えられることが確認された。
図６は、（－）－ネオエキヌリンＡの細胞内カルシウムイオン濃度に及ぼす影響を示すグラフである。
参照符号１４は、（－）－ネオエキヌリンＡを使用した場合である。参照符号２４はコントロールであり、参照符号３４はブランクである。
ここでブランクは、ＤＮＰ－ＨＳＡによる抗原刺激なしで、ＲＢＬ－２Ｈ３細胞の細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を誘導しない条件を意味する。またコントロールは、ＤＮＰ－ＨＳＡによる抗原刺激ありで、ＲＢＬ－２Ｈ３細胞の細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を誘導する条件を意味する。また、（－）－ネオエキヌリンＡを使用した場合とは、ＤＮＰ－ＨＳＡによる抗原刺激ありの場合を示す。ＲＢＬ－２Ｈ３細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる条件で（－）－ネオエキヌリンＡを添加し、ブランク、コントロールのカルシウムイオン濃度（相対蛍光強度で評価）を比較対照にしてカルシウムイオン濃度の上昇が抑制されるかどうかを評価した。
図６の縦軸は、相対蛍光強度であり、横軸は反応時間（秒）である。図６に示される通り、（－）－ネオエキヌリンＡは、ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞に対して、細胞内カルシウムイオン濃度の上昇が抑えられることが確認された。
【0097】
［ウェスタンブロッティング法の概要］
シグナル伝達因子に与える（－）－ネオエキヌリンＡの影響についてウェスタンブロッティング法を用いて検討した。（－）－ネオエキヌリンＡは１ ｍＭの濃度で添加した。
シグナル伝達因子に与える（－）－ネオエキヌリンＡの影響についてウェスタンブロッティング法を用いて検討した。（－）－ネオエキヌリンＡは１ ｍＭの濃度で添加した。
【0098】
［ウェスタンブロッティング法］
ウェスタンブロッティング法に使用した器具は次の通りである。
遠心分離には、滅菌した１５ ｍＬ遠心管、接着用に１００ ｍｍディッシュおよび
６ウェル培養プレートを使用した。
ウェスタンブロッティング法に使用した器具は次の通りである。
遠心分離には、滅菌した１５ ｍＬ遠心管、接着用に１００ ｍｍディッシュおよび
６ウェル培養プレートを使用した。
【0099】
また試薬として使用したＤＭＥＭ、ＦＢＳ、滅菌ＰＢＳ、トリプシンとエチレンジアミン四酢酸の混合水溶液（トリプシン０．２５％、エチレンジアミン四酢酸０．０２％）、モノクローナル抗ジニトロフェニル（ＤＮＰ）－ＩｇＥ溶液、ＤＮＰ－ＨＳＡ溶液および滅菌タイロード緩衝液はそれぞれ先に例示した場合と同様である。
【0100】
核内タンパク質抽出キットとして、ＣｅｌＬｕｔｉｃ ＮｕＣＬＥＡＲ抽出キット（シグマアルドリッチ社製）、細胞内タンパク質分離用ゲルとして、ミニプロティアンTGXゲル（バイオラッド社製）、タンパク質の膜への転写キットとして、トランスブロットTurbo転写パック PVDF（バイオラッド社製）、電気泳動分子量確認マーカーとして、プレシジョン プラス プロテイン プレステイン スタンダード（バイオラッド社製）、ブロッキング剤として、ブロッキングワン（ナカライテスク株式会社製）、抗体として、各一次抗体（セルシグナリングテクノロジー社製）、二次抗体として、抗ウサギＩｇＧ－ＨＲＰ結合抗体（セルシグナリングテクノロジー社製）を使用した。
【0101】
［滅菌タイロード緩衝液（ｐＨ ７．４）の調製］
細胞毒性試験に使用した滅菌タイロード緩衝液（ｐＨ ７．４）の調製は、先に説明した場合と同様である。
細胞毒性試験に使用した滅菌タイロード緩衝液（ｐＨ ７．４）の調製は、先に説明した場合と同様である。
【0102】
［播き込みとＩｇＥ感作］
ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞を１０％ＦＢＳ－ＤＥＭＥ培地中に４．０×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度になるように調整した細胞懸濁液を１００ｍｍディッシュに１０ｍｌ入れ、４．０×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで３７℃、５％ＣＯ２条件で培養した。４８時間後にラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞が最初の状態（４．０×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈ）から１００ｍｍディッシュ中に７０から８０％増殖したことを目視で確認することができた。
滅菌した１５ ｍＬ遠心管に、ウシ胎児血清（ＦＢＳ、シグマアルドリッチ社製、製品名non-USA origin, sterile-filtered, suitable for cell culture）を１ ｍＬおよびダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を７ ｍＬ加え、混合液Ａを調製した。
ＤＭＥＭ培地はＤＭＥＭ(シグマアルドリッチ社製、製品番号Ｄ５６４８) １３．４ ｇ、ＮａＨＣＯ３(富士フィルム和光純薬社製、製品番号１９１－０１３０５) ３．７ ｇ、ストレプトマイシン(シグマアルドリッチ社製、製品番号Ｓ９１３７) ０．１ ｇ、ペニシリン(シグマアルドリッチ社製、製品番号Ｐ７７９４) ０．０６２５ ｇを１ Ｌの蒸留水に溶解した後、加圧蒸気滅菌済ハウジングでろ過滅菌して調製した。
ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞を１０％ＦＢＳ－ＤＥＭＥ培地中に４．０×１０４ ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度になるように調整した細胞懸濁液を１００ｍｍディッシュに１０ｍｌ入れ、４．０×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで３７℃、５％ＣＯ２条件で培養した。４８時間後にラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞が最初の状態（４．０×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈ）から１００ｍｍディッシュ中に７０から８０％増殖したことを目視で確認することができた。
滅菌した１５ ｍＬ遠心管に、ウシ胎児血清（ＦＢＳ、シグマアルドリッチ社製、製品名non-USA origin, sterile-filtered, suitable for cell culture）を１ ｍＬおよびダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を７ ｍＬ加え、混合液Ａを調製した。
ＤＭＥＭ培地はＤＭＥＭ(シグマアルドリッチ社製、製品番号Ｄ５６４８) １３．４ ｇ、ＮａＨＣＯ３(富士フィルム和光純薬社製、製品番号１９１－０１３０５) ３．７ ｇ、ストレプトマイシン(シグマアルドリッチ社製、製品番号Ｓ９１３７) ０．１ ｇ、ペニシリン(シグマアルドリッチ社製、製品番号Ｐ７７９４) ０．０６２５ ｇを１ Ｌの蒸留水に溶解した後、加圧蒸気滅菌済ハウジングでろ過滅菌して調製した。
【0103】
１００ｍｍディッシュに７０～８０％増殖したラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞の細胞上清を吸引除去した後、滅菌処理後のリン酸緩衝液（滅菌ＰＢＳ）を１０ ｍＬ添加して、軽くディッシュを揺らしてラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞を洗浄した。
【0104】
滅菌ＰＢＳを吸引除去し、混合水溶液（０．２５％トリプシン、０．０２％エチレンジアミン四酢酸）１ ｍＬと、滅菌ＰＢＳ １ ｍＬとを、ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞に加えて、２分間、３７℃、５％ＣＯ２条件で保温した。
【0105】
混合液Ａを上記の２分間保温後のラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞に加えて、ピペットで吸い上げ操作と注入操作を繰り返して、１００ｍｍディッシュに密着したラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞を剥がして、ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞懸濁溶液を得た。
【0106】
上記のラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞濁溶液を１５ ｍＬ遠心管に回収し、１０００ ｒｐｍ、５分間の条件で遠心分離した。
【0107】
遠心分離後、１５ ｍＬ遠心管内の上清を吸引除去し、血球計算盤またはセルカウンターを用いて４．０×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、１０％ ＦＢＳ－ＤＭＥＭ溶液を加えて、ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞懸濁液を調製した。
【0108】
ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞懸濁液を６ウェル培養プレートに、それぞれ１ｍＬ／ｗｅｌｌで播種した。
【0109】
５００ μｇ／ｍＬのモノクローナル抗ジニトロフェニル（ＤＮＰ）－ＩｇＥ溶液（シグマアルドリッチ社製、製品番号Ｄ８４０６）を１０％ ＦＢＳ－ＤＭＥＭ溶液により５０００倍希釈して、１００ ｎｇ／ｍＬとし、播種済みの上記６ウェル培養プレートに、それぞれ１ｍＬ／ｗｅｌｌで添加した。
培地中のモノクローナル抗ジニトロフェニル（ＤＮＰ）－ＩｇＥ溶液の終濃度は５０ｎｇ／ｍＬであり、ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞は４．０×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌである。
培地中のモノクローナル抗ジニトロフェニル（ＤＮＰ）－ＩｇＥ溶液の終濃度は５０ｎｇ／ｍＬであり、ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞は４．０×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌである。
【0110】
続いて、温度３７℃、５％ＣＯ２条件で、１８～２４時間、培養器で前培養を実施した。
【0111】
［抗原刺激からタンパク質抽出まで］
前培養の実施後、上記６ウェル培養プレート内の各ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞上清を吸引除去した。
先に調製した滅菌タイロード緩衝液を、上記６ウェル培養プレート内の各ウェルに２ ｍＬ／ｗｅｌｌでゆっくり添加し、各ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞を洗浄した。
この洗浄を２回繰り返した。
前培養の実施後、上記６ウェル培養プレート内の各ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞上清を吸引除去した。
先に調製した滅菌タイロード緩衝液を、上記６ウェル培養プレート内の各ウェルに２ ｍＬ／ｗｅｌｌでゆっくり添加し、各ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞を洗浄した。
この洗浄を２回繰り返した。
【0112】
（－）－ネオエキヌリンＡをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で２００ ｍＭになるように溶解して（－）－ネオエキヌリンＡの２００ ｍＭ溶液を調製した。（－）－ネオエキヌリンＡの２００ ｍＭ溶液を滅菌タイロード緩衝液に０．５％添加し、１ ｍＭの（－）－ネオエキヌリンＡ溶液を調製した。滅菌タイロード緩衝液を吸引除去した後、滅菌タイロード緩衝液に溶解させた１ ｍＭの（－）－ネオエキヌリンＡ溶液を、上記６ウェル培養プレート内の各ウェルに１．９ ｍＬ／ｗｅｌｌずつ添加した。ブランク（ＤＮＰ－ＨＳＡによる抗原刺激なし条件）、コントロール（ＤＮＰ－ＨＳＡによる抗原刺激あり条件）はＤＭＳＯを滅菌タイロード緩衝液に０．５％添加した溶液を６ウェル培養プレート内の各ウェルに１．９ ｍＬ／ｗｅｌｌずつ添加した。
【0113】
続いて、それぞれの６ウェル培養プレートを用いて、温度３７℃、５％ＣＯ２条件で、培養器内で１０分間培養した。
【0114】
この培養の間に、１０ ｍｇ／ｍＬのジニトロフェニル（ＤＮＰ）－ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）溶液（以下、「ＤＮＰ－ＨＳＡ溶液」と呼ぶ。）を滅菌タイロード緩衝液で１０，０００倍希釈（１ μｇ／ｍＬ）した。
【0115】
１０分後、上記の１０，０００倍希釈（１ μｇ／ｍＬ）したＤＮＰ－ＨＳＡ溶液を、上記の１０分間培養後の６ウェル培養プレートに対して、培地中の最終のＤＮＰ－ＨＳＡ溶液濃度が５０ ｎｇ／ｍＬとなる様に、それぞれ０．１ ｍＬ／ｗｅｌｌずつ添加した。
この６ウェル培養プレートを用いて、温度３７℃、５％ＣＯ２条件で、５分間、培養器内で培養した。
なお、ウェル内の溶液全量は２ ｍＬであった。
この６ウェル培養プレートを用いて、温度３７℃、５％ＣＯ２条件で、５分間、培養器内で培養した。
なお、ウェル内の溶液全量は２ ｍＬであった。
【0116】
５分後、培養後の６ウェル培養プレートの各ウェルの上清を吸引除去し、滅菌ＰＢＳを２ ｍＬ／ｗｅｌｌずつゆっくり添加し、各ラット好塩基球様細胞株ＲＢＬ－２Ｈ３細胞を洗浄した。
【0117】
ＣｅｌＬｕｔｉｃ ＮｕＣＬＥＡＲ抽出キット（シグマアルドリッチ社製）に指定された操作手順に従い、細胞内タンパク質を抽出した。
【0118】
４～１５%ミニプロティアンＴＧＸゲル（１５ウェル）に、電気泳動分子量確認マーカーを３ μＬずつ、各細胞タンパク質を１０ μＬずつ添加し、１５０ Ｖ定電圧で１時間ほど電気泳動を行った。
【0119】
電気泳動後、トランスブロットＴｕｒｂｏ転写システム（バイオラッド社、製品番号１７０４１５０Ｊ１）を用いてＰＶＤＦ膜に細胞内タンパク質を転写した。
転写膜としての各ＰＶＤＦ膜１枚につき、１０ ｍＬのブロッキング剤（ブロッキングワン、ナカライテスク株式会社製）を用い、室温で３０分間ブロッキングした。
転写膜としての各ＰＶＤＦ膜１枚につき、１０ ｍＬのブロッキング剤（ブロッキングワン、ナカライテスク株式会社製）を用い、室温で３０分間ブロッキングした。
【0120】
［０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０－ＴＢＳの調製方法］
Ｔｒｉｓ Ｂａｓｅ ２４．２ ｇ、ＮａＣｌ ８０ ｇを蒸留水に溶解し、ＨＣｌでｐＨ７．６に調整後、蒸留水で１Ｌの体積に合わせて、１０倍ＴＢＳ（Tris-buffered saline）を調製した。１０倍ＴＢＳを蒸留水で１０倍希釈し、Ｔｗｅｅｎ－２０を０．１％の濃度で添加して０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０－ＴＢＳを調製した。０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０－ＴＢＳ（ｔ－ＴＢＳ）は本試験でウェスタンブロッティングに用いている緩衝液である。
０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０－ＴＢＳを１０ ｍＬ／膜でゆっくり添加し、３分間洗浄した。
この操作を三回繰り返した。
Ｔｒｉｓ Ｂａｓｅ ２４．２ ｇ、ＮａＣｌ ８０ ｇを蒸留水に溶解し、ＨＣｌでｐＨ７．６に調整後、蒸留水で１Ｌの体積に合わせて、１０倍ＴＢＳ（Tris-buffered saline）を調製した。１０倍ＴＢＳを蒸留水で１０倍希釈し、Ｔｗｅｅｎ－２０を０．１％の濃度で添加して０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０－ＴＢＳを調製した。０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０－ＴＢＳ（ｔ－ＴＢＳ）は本試験でウェスタンブロッティングに用いている緩衝液である。
０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０－ＴＢＳを１０ ｍＬ／膜でゆっくり添加し、３分間洗浄した。
この操作を三回繰り返した。
【0121】
５％ＢＳＡ－ｔ－ＴＢＳを用いて１０００倍に希釈した各１次抗体に転写膜を浸け、４℃で終夜振とうしながら反応させた。
【0122】
【表5】
【0123】
一次抗体の反応後、０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０－ＴＢＳを１０ ｍＬ／膜でゆっくり添加し、３分間洗浄した。
この操作を三回繰り返した。
この操作を三回繰り返した。
【0124】
５％スキムミルク－ｔ－ＴＢＳを用いて１０００倍に希釈した二次抗体としての抗ウサギＩｇG－ＨＲＰ結合抗体（セルシグナリングテクノロジー社製）に転写膜を浸け、室温で１時間振とうしながら反応させた。
【0125】
【表6】
【0126】
二次抗体の反応後、０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０－ＴＢＳを１０ ｍＬ／膜でゆっくり添加し、３分間洗浄した。
この操作を三回繰り返した。
この操作を三回繰り返した。
【0127】
イムノスタ－ＬＤ（富士フイルム和光純薬株式会社製）の発光液にＰＶＤＦ膜のタンパク質結合面を下にして接触させ、３０秒間反応させた。
【0128】
ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳシステム（バイオラッド社製）により、目的タンパク質の発光を確認した。
【0129】
結果を図７に示す。
図７は、シグナル伝達因子に与える（－）－ネオエキヌリンＡの影響を調べるためのウエスタンブロッティングの結果を示す図面代用写真である。
参照符号Ｂｌａｎｋはブランク、参照符号Ｃｏｎｔｒｏｌはコントロールおよび参照符号ＮｅｏＡは（－）－ネオエキヌリンＡを含む場合を示す。以下、同様である。
ここでブランクは、ＤＮＰ－ＨＳＡによる抗原刺激なしで、脱顆粒誘導に関わるキナーゼ（Ｌｙｎ、Ｓｋｙ、ＰＩ３Ｋｐ３８およびＡｋｔ）のリン酸化を誘導しない条件を意味する。またコントロールは、ＤＮＰ－ＨＳＡによる抗原刺激ありで、脱顆粒誘導に関わるキナーゼ（Ｌｙｎ、Ｓｋｙ、ＰＩ３Ｋｐ３８、Ａｋｔ）のリン酸化を誘導する条件を意味する。また、（－）－ネオエキヌリンＡを使用した場合とは、ＤＮＰ－ＨＳＡによる抗原刺激ありの場合を示す。脱顆粒誘導に関わるキナーゼ（Ｌｙｎ、Ｓｋｙ、ＰＩ３Ｋｐ３８、Ａｋｔ）のリン酸化を誘導する条件で（－）－ネオエキヌリンＡを添加し、ブランク、コントロールのＬｙｎ、Ｓｋｙ、ＰＩ３Ｋｐ３８、Ａｋｔのリン酸化割合を比較対照にして、（－）－ネオエキヌリンＡがキナーゼのリン酸化を抑制するかどうかを評価した。この関係は、以下の図８から図１１の場合もそれぞれ同様である。
また図７中のＬｙｎは非受容体型チロシンキナーゼを、ｐ－Ｌｙｎはリン酸化非受容体型チロシンキナーゼを、Ｓｙｋは非受容体型チロシンキナーゼを、ｐ－Ｓｙｋはリン酸化非受容体型チロシンキナーゼをそれぞれ示す。
ＰＩ３Ｋ ｐ８５は、脂質キナーゼサブユニットを示し、ｐ－ＰＩ３Ｋ ｐ８５はリン酸化脂質キナーゼサブユニットを示す。
Ａｋｔはセリン／スレオニンキナーゼを示し、ｐ－Ａｋｔはリン酸化セリン／スレオニンキナーゼを示す。また、Ａｃｔｉｎは、タンパク質のアクチンを示す。
以下の場合も同様である。
図７は、シグナル伝達因子に与える（－）－ネオエキヌリンＡの影響を調べるためのウエスタンブロッティングの結果を示す図面代用写真である。
参照符号Ｂｌａｎｋはブランク、参照符号Ｃｏｎｔｒｏｌはコントロールおよび参照符号ＮｅｏＡは（－）－ネオエキヌリンＡを含む場合を示す。以下、同様である。
ここでブランクは、ＤＮＰ－ＨＳＡによる抗原刺激なしで、脱顆粒誘導に関わるキナーゼ（Ｌｙｎ、Ｓｋｙ、ＰＩ３Ｋｐ３８およびＡｋｔ）のリン酸化を誘導しない条件を意味する。またコントロールは、ＤＮＰ－ＨＳＡによる抗原刺激ありで、脱顆粒誘導に関わるキナーゼ（Ｌｙｎ、Ｓｋｙ、ＰＩ３Ｋｐ３８、Ａｋｔ）のリン酸化を誘導する条件を意味する。また、（－）－ネオエキヌリンＡを使用した場合とは、ＤＮＰ－ＨＳＡによる抗原刺激ありの場合を示す。脱顆粒誘導に関わるキナーゼ（Ｌｙｎ、Ｓｋｙ、ＰＩ３Ｋｐ３８、Ａｋｔ）のリン酸化を誘導する条件で（－）－ネオエキヌリンＡを添加し、ブランク、コントロールのＬｙｎ、Ｓｋｙ、ＰＩ３Ｋｐ３８、Ａｋｔのリン酸化割合を比較対照にして、（－）－ネオエキヌリンＡがキナーゼのリン酸化を抑制するかどうかを評価した。この関係は、以下の図８から図１１の場合もそれぞれ同様である。
また図７中のＬｙｎは非受容体型チロシンキナーゼを、ｐ－Ｌｙｎはリン酸化非受容体型チロシンキナーゼを、Ｓｙｋは非受容体型チロシンキナーゼを、ｐ－Ｓｙｋはリン酸化非受容体型チロシンキナーゼをそれぞれ示す。
ＰＩ３Ｋ ｐ８５は、脂質キナーゼサブユニットを示し、ｐ－ＰＩ３Ｋ ｐ８５はリン酸化脂質キナーゼサブユニットを示す。
Ａｋｔはセリン／スレオニンキナーゼを示し、ｐ－Ａｋｔはリン酸化セリン／スレオニンキナーゼを示す。また、Ａｃｔｉｎは、タンパク質のアクチンを示す。
以下の場合も同様である。
【0130】
図８は、Ｌｙｎ（非受容体型チロシンキナーゼの一種）のリン酸化において、Ｌｙｎに対するＰ－Ｌｙｎ（Ｓｙｋをリン酸化するリン酸化非受容体型チロシンキナーゼ）の割合を示すグラフである。
図９は、Ｓｙｋ（Ｐ－Ｌｙｎによりリン酸化を受ける非受容体型チロシンキナーゼ）のリン酸化において、Ｓｙｋに対するＰ－Ｓｙｋ（Ｐ－Ｌｙｎによってリン酸化されたリン酸化非受容体型チロシンキナーゼ）の割合を示すグラフである。
図１０は、ＰＩ３Ｋ（Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ３－ｋｉｎａｓｅ、脂質キナーゼ）のリン酸化において、ＰＩ３Ｋに対するＰ－ＰＩ３Ｋ（リン酸化脂質キナーゼ）の割合を示すグラフである。
図１１は、Ａｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）のリン酸化において、Ａｋｔに対するＰ－Ａｋｔ（リン酸化セリン／スレオニンキナーゼ）の割合を示すグラフである。
図９は、Ｓｙｋ（Ｐ－Ｌｙｎによりリン酸化を受ける非受容体型チロシンキナーゼ）のリン酸化において、Ｓｙｋに対するＰ－Ｓｙｋ（Ｐ－Ｌｙｎによってリン酸化されたリン酸化非受容体型チロシンキナーゼ）の割合を示すグラフである。
図１０は、ＰＩ３Ｋ（Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ３－ｋｉｎａｓｅ、脂質キナーゼ）のリン酸化において、ＰＩ３Ｋに対するＰ－ＰＩ３Ｋ（リン酸化脂質キナーゼ）の割合を示すグラフである。
図１１は、Ａｋｔ（セリン／スレオニンキナーゼ）のリン酸化において、Ａｋｔに対するＰ－Ａｋｔ（リン酸化セリン／スレオニンキナーゼ）の割合を示すグラフである。
【0131】
その結果、（－）－ネオエキヌリンＡは脱顆粒シグナルの上流に位置する非受容体型チロシンキナーゼであるＬｙｎの活性化には影響せず、その下流にある非受容体型チロシンキナーゼであるＳｙｋのリン酸化を抑制することが確認された。また、セリン／スレオニンキナーゼであるＡｋｔのリン酸化レベルの低下も確認された。
これらのことから、（－）－ネオエキヌリンＡはＳｙｋおよびＡｋｔシグナル伝達経路を下方制御することで細胞外からのＣａ２＋流入を阻害し、脱顆粒を抑制することが示唆された。
これらのことから、（－）－ネオエキヌリンＡはＳｙｋおよびＡｋｔシグナル伝達経路を下方制御することで細胞外からのＣａ２＋流入を阻害し、脱顆粒を抑制することが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【0132】
本発明の脱顆粒抑制用（－）－ネオエキヌリンＡは鰹節のカビ付けに用いられるAspergillus属やEurotium属によっても生産され安全性に優れることからアレルギーを抑える脱顆粒抑制用の用途に広く応用できる。
加えて、従来鰹節の用途に使用されてきた日本食等の食品添加用の用途にも供することができる。
加えて、従来鰹節の用途に使用されてきた日本食等の食品添加用の用途にも供することができる。
【符号の説明】
【0133】
１０，１２，１４，ＮｅｏＡ （－）－ネオエキヌリンＡ
２０，２２，２４，Ｃｏｎｔｒｏｌ コントロール
３０，３２，３４，Ｂｌａｎｋ ブランク
２０，２２，２４，Ｃｏｎｔｒｏｌ コントロール
３０，３２，３４，Ｂｌａｎｋ ブランク
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】