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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2025009766
(43)【公開日】2025-01-20
(54)【発明の名称】目的タンパク質の生産方法
(51)【国際特許分類】
C12P 21/08 20060101AFI20250109BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20250109BHJP
C12N 9/90 20060101ALN20250109BHJP
C12N 15/61 20060101ALN20250109BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20250109BHJP
【ＦＩ】
C12P21/08
C12N1/21
C12N9/90 ZNA
C12N15/61
C12N15/13
【審査請求】未請求
【請求項の数】10
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024025618
(22)【出願日】2024-02-22
(31)【優先権主張番号】P 2023105948
(32)【優先日】2023-06-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】000000918
【氏名又は名称】花王株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】西口 大貴
(72)【発明者】
【氏名】川原 彰人
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AG01
4B064AG27
4B064CA19
4B064CC24
4B064CE10
4B064DA01
4B065AA15X
4B065AA15Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA01
4B065CA25
4B065CA27
4B065CA44
(57)【要約】
【課題】生産性が向上した、グラム陽性細菌を用いる目的タンパク質の生産方法の提供。
【解決手段】異種ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）をコードする遺伝子及び目的タンパク質をコードする遺伝子を含むグラム陽性細菌を培養すること、又は異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子を含むグラム陽性細菌及び目的タンパク質をコードする遺伝子を含むグラム陽性細菌を混合培養することを含む、目的タンパク質の生産方法。
【選択図】なし
【解決手段】異種ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）をコードする遺伝子及び目的タンパク質をコードする遺伝子を含むグラム陽性細菌を培養すること、又は異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子を含むグラム陽性細菌及び目的タンパク質をコードする遺伝子を含むグラム陽性細菌を混合培養することを含む、目的タンパク質の生産方法。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
異種ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）をコードする遺伝子及び目的タンパク質をコードする遺伝子を含むグラム陽性細菌を培養すること、又は異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子を含むグラム陽性細菌及び目的タンパク質をコードする遺伝子を含むグラム陽性細菌を混合培養することを含む、目的タンパク質の生産方法。
【請求項2】
前記異種ＦＫＢＰがＢＣＦＫクレードに属しかつプロリル結合の異性化活性を有するポリペプチド、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号６で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつプロリル結合の異性化活性を有するポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記異種ＦＫＢＰが配列番号１～６のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号１～６のいずれかで示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつプロリル結合の異性化活性を有するポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子が分泌シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結されている、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記グラム陽性細菌が枯草菌又はその変異株である、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記グラム陽性細菌が少なくとも１種類の細胞外プロテアーゼ遺伝子が欠失又は不活性化されている枯草菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記目的タンパク質が少なくとも１箇所のプロリル結合異性化部位を有する、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
前記目的タンパク質が抗体関連分子である、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
前記目的タンパク質がＦａｂである、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子、又は異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子及び目的タンパク質をコードする遺伝子を含むグラム陽性細菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は生産性が向上した目的タンパク質の生産方法に関する。
【背景技術】
【0002】
微生物による有用物質の工業的生産は、食品類、アミノ酸、有機酸、核酸関連物質、抗生物質、糖質、脂質、タンパク質等、その種類は多岐に渡っており、またその用途についても食品、医薬、洗剤、化粧品等の日用品、或いは各種化成品原料に至るまで幅広い分野に広がっている。産業的に有用な宿主微生物としては、大腸菌、枯草菌、酵母、糸状菌等が挙げられる。こうした微生物による有用物質の工業生産においては、その生産性の向上が重要な課題の一つである。
【0003】
プロリン異性化酵素（peptidylprolyl isomerase、ＰＰＩａｓｅ）はプロリル結合の異性化を触媒し、タンパク質の折り畳みを補助しうる酵素である（非特許文献１）。ＰＰＩａｓｅは、阻害剤に対する感受性が異なるシクロフィリン、ＦＫ５０６結合タンパク質（FK506-binding protein、ＦＫＢＰ）、パービュリンという３つのファミリーからなる。ＰＰＩａｓｅの３つのファミリー間のアミノ酸配列の配列同一性は低いことが知られている。大腸菌のペリプラズムには３つのファミリー全てのＰＰＩａｓｅが存在する。中でもＦＫＢＰに属するＦｋｐＡは良く研究されており、その発現量の増大により目的タンパク質の生産性が向上しうることが報告されている（非特許文献２）。大腸菌において目的タンパク質の生産性向上に寄与するＦｋｐＡの領域はＮ末端側のシャペロン領域であることも報告されている（非特許文献３）。無細胞系においても３つのファミリーいずれのＰＰＩａｓｅ添加においても目的タンパク質の生産性を向上しうることが報告されている（特許文献１）。グラム陽性細菌における目的タンパク質の分泌生産においてはＰｒｓＡを含むパービュリンの発現増強が多く検討されている（非特許文献４）。
【0004】
グラム陽性細菌である枯草菌は内在性のシャペロン兼ＰＰＩａｓｅとしてＰｒｓＡを有し（非特許文献５）、ＰｒｓＡの発現量を増強することで目的のタンパク質生産性が向上することが報告されている（特許文献２、非特許文献６、７）。ＰｒｓＡは細胞膜の外表面に固定されており、トランスロカーゼを介して輸送されたタンパク質の折り畳みを促進する。正しく折りたたまれなかったタンパク質は細胞壁や細胞膜－細胞膜界面に存在するプロテアーゼによる分解を受けるため、シグナルペプチドが切断された直後に正しく折りたたまれる必要がある（非特許文献４）。
【0005】
一方、グラム陽性細菌における目的タンパク質の生産にＦＫＢＰが如何なる影響を及ぼすのかはこれまで報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】特開２００５－２５３４３２号公報
【特許文献2】特許第４２０２９８５号公報
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Journal of Molecular Biology, 2015, 427(7): 1609-1631
【非特許文献2】Biotechnol Prog. 2017, 33(1): 212-220
【非特許文献3】Microbial Cell Factories, 2010, volume 9, Article number: 22
【非特許文献4】Microbial Cell Factories, 2019, volume 18, Article number: 158
【非特許文献5】J Biol Chem. 2004, 279(18):19302-14
【非特許文献6】Journal of Bacteriology, 1998, 180(11): 2830-2835
【非特許文献7】Journal of Bacteriology, 2001, 183(6): 1881-1890
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明は、生産性が向上した、枯草菌を代表とするグラム陽性細菌を用いる目的タンパク質の生産方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、グラム陽性細菌を用いる目的タンパク質の生産において、グラム陽性細菌に異種生物由来の特定のＰＰＩａｓｅを発現させることにより、目的タンパク質の生産性を向上できることを見出した。
【0010】
すなわち、本発明は、以下の１）及び２）に係るものである。
１）異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子及び目的タンパク質をコードする遺伝子を含むグラム陽性細菌を培養すること、又は異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子を含むグラム陽性細菌及び目的タンパク質をコードする遺伝子を含むグラム陽性細菌を混合培養することを含む、目的タンパク質の生産方法。
２）異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子、又は異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子及び目的タンパク質をコードする遺伝子を含むグラム陽性細菌。
１）異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子及び目的タンパク質をコードする遺伝子を含むグラム陽性細菌を培養すること、又は異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子を含むグラム陽性細菌及び目的タンパク質をコードする遺伝子を含むグラム陽性細菌を混合培養することを含む、目的タンパク質の生産方法。
２）異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子、又は異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子及び目的タンパク質をコードする遺伝子を含むグラム陽性細菌。
【発明の効果】
【0011】
本発明によれば、枯草菌を代表とするグラム陽性細菌を用いて目的タンパク質を効率よく生産することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】Ｆａｂ生産枯草菌株に各ＰＰＩａｓｅを発現させた場合のＦａｂ生産量。
【図2】Ｆａｂ生産枯草菌株にＰｒｓＡ又はＦｋｐＡを発現させた場合のＦａｂ生産量。
【図3】Ｆａｂ生産枯草菌株にＦｋｐＡの全領域（ＦｋｐＡ）、Ｎ末端領域（ＦｋｐＡ＿Ｎ）又はＣ末端領域（ＦｋｐＡ＿Ｃ）を発現させた場合のＦａｂ生産量。
【図4】Ｆａｂ生産枯草菌株にＦｋｐＡを分泌発現させた場合（ＦｋｐＡ＿ｐ）又は細胞膜にアンカーして発現させた場合（ＦｋｐＡ＿ｍ）のＦａｂ生産量。
【図5】ＦＫＢＰの系統樹。
【図6】ＢＣＦＫクレードのＨＭＭプロファイル。
【発明を実施するための形態】
【0013】
本明細書において、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の同一性は、Ｌｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法（Science, 1985, 227:1435-1441）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ－Ｗｉｎのホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
【0014】
本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列に関する「少なくとも８０％の同一性」とは、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性をいう。
【0015】
本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列上の「相当する位置」又は「相当する領域」は、目的配列と参照配列（例えば、配列番号１のアミノ酸配列）とを、最大の相同性を与えるように整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アミノ酸配列又はヌクレオチド配列のアラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Nucleic Acids Res, 1994, 22:4673-4680）をデフォルト設定で用いることにより、行うことができる。あるいは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗの改訂版であるＣｌｕｓｔａｌ Ｗ２やＣｌｕｓｔａｌ ｏｍｅｇａを使用することもできる。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ２及びＣｌｕｓｔａｌ ｏｍｅｇａは、例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｄｕｂｌｉｎが運営するＣｌｕｓｔａｌのウェブサイト（[www.clustal.org]）、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＥＢＩ [www.ebi.ac.uk/index.html]）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ [www.ddbj.nig.ac.jp/searches-j.html]）のウェブサイト上で利用することができる。上述のアラインメントにより参照配列の任意の位置にアラインされた目的配列の位置は、当該任意の位置に「相当する位置」とみなされる。また、相当する位置により挟まれた領域、又は相当するモチーフからなる領域は、相当する領域とみなされる。
【0016】
当業者であれば、上記で得られたアミノ酸配列のアラインメントを、最適化するようにさらに微調整することができる。そのような最適アラインメントは、アミノ酸配列の同一性又は類似性や挿入されるギャップの頻度等を考慮して決定するのが好ましい。ここでアミノ酸配列の同一性又は類似性とは、２つのアミノ酸配列をアラインメントしたときにその両方の配列に同一又は類似のアミノ酸残基が存在する位置の数の全長アミノ酸残基数に対する割合（％）をいう。類似のアミノ酸残基とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸のうち、極性や電荷の点で互いに類似した性質を有しており、いわゆる保存的置換を生じるようなアミノ酸残基を意味する。そのような類似のアミノ酸残基からなるグループは当業者にはよく知られており、例えば、アルギニンとリシン；グルタミン酸とアスパラギン酸；セリンとトレオニン；グルタミンとアスパラギン；ロイシンとイソロイシン等がそれぞれ挙げられるが、これらに限定されない。
【0017】
本明細書において、「アミノ酸残基」とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸残基、アラニン（Ａｌａ又はＡ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、リシン（Ｌｙｓ又はＫ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、スレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）及びバリン（Ｖａｌ又はＶ）を意味する。
【0018】
本明細書において、制御領域と遺伝子との「作動可能な連結」とは、遺伝子と制御領域とが、該遺伝子が該制御領域の制御の下で発現し得るように連結されていることをいう。遺伝子と制御領域との「作動可能な連結」の手順は当業者に周知である。
【0019】
本明細書において、遺伝子に関する「上流」及び「下流」とは、該遺伝子の転写方向の上流及び下流をいう。例えば、「プロモーターの下流に配置された遺伝子」とは、ＤＮＡセンス鎖においてプロモーターの３’側に該遺伝子が存在することを意味し、遺伝子の上流とは、ＤＮＡセンス鎖における該遺伝子の５’側の領域を意味する。
【0020】
本明細書に記載の枯草菌の遺伝子の名称は、ＪＡＦＡＮ：Ｊａｐａｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｎｅｔｗｏｒｋ ｆｏｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＢＳＯＲＦ ＤＢ）でインターネット公開（[bacillus.genome.ad.jp/]、２００６年１月１８日更新）された枯草菌ゲノムデータに基づいて記載されている。本明細書に記載される枯草菌の遺伝子番号は、ＢＳＯＲＦ ＤＢに登録されている遺伝子番号を表す。
【0021】
本明細書において、ＦＫ５０６結合タンパク質（FK506-binding protein、ＦＫＢＰ）は、プロリル結合の異性化を触媒し、タンパク質の折り畳みを補助しうるプロリン異性化酵素（peptidylprolyl isomerase、ＰＰＩａｓｅ、ＥＣ５．１．２．８）の１ファミリーを構成する酵素をいう。ＦＫＢＰは、ＰＰＩａｓｅのうち、免疫阻害剤であるＦＫ５０６と結合することで活性が阻害される一群の酵素である。
【0022】
本明細書において、「クレード」とは、共通の祖先と共通の祖先から派生したすべての子孫における配列から構成される集団である（evolution.berkeley.edu/evolibrary/article/0_0_0/evo_06）。クレードは系統樹として視覚化することができ、共通の特性を共有している。系統樹のクレード内で一群を形成するサブクレードもまた共通の特性を共有することができ、あるサブクレードにおける配列同志は、そのクレードにおける他のサブクレードの配列よりも近縁の関係にある。
【0023】
本明細書において、「ＢＣＦＫクレード」とは、ＦＫＢＰファミリーに属する一群の配列群である。ＢＣＦＫクレードに属する配列は、図６に記載の隠れマルコフモデル（Ｈｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ Ｍｏｄｅｌ；ＨＭＭ）プロファイルに対してアミノ酸配列の全長で１１５以上のＨＭＭスコアを有する配列として定義される。ＢＣＦＫクレードに属する好ましい配列は、図６に記載のＨＭＭプロファイルに対してアミノ酸配列の全長で１５０以上のＨＭＭスコアを有する配列である。
図６のＨＭＭプロファイルは、ＢＣＦＫクレードに属するＦＫＢＰ配列群を用いてＭＡＦＦＴ ｖ７．４７１によりマルチプルアラインメントを構築し、次いで、ＨＭＭＥＲ バージョン３．３．２（http://hmmer.org/）を用い、パラメーターとして――ｐｎｏｎｅ ――ｗｎｏｎｅを指定して作成した。ＢＣＦＫクレードを定義するＨＭＭプロファイルの作成に用いたＦＫＢＰ配列群のＵｎｉｐｒｏｔ番号は、後述の表３に示す。ｈｍｍｐｒｅｓｓを用いてＨＭＭプロファイルをバイナリ化し、ｈｍｍｓｃａｎを用いて相同性検索を行うことで、作成したＢＣＦＫクレードのＨＭＭプロファイルに対する任意の配列のＨＭＭスコアを計算することができる。
図６のＨＭＭプロファイルは、ＢＣＦＫクレードに属するＦＫＢＰ配列群を用いてＭＡＦＦＴ ｖ７．４７１によりマルチプルアラインメントを構築し、次いで、ＨＭＭＥＲ バージョン３．３．２（http://hmmer.org/）を用い、パラメーターとして――ｐｎｏｎｅ ――ｗｎｏｎｅを指定して作成した。ＢＣＦＫクレードを定義するＨＭＭプロファイルの作成に用いたＦＫＢＰ配列群のＵｎｉｐｒｏｔ番号は、後述の表３に示す。ｈｍｍｐｒｅｓｓを用いてＨＭＭプロファイルをバイナリ化し、ｈｍｍｓｃａｎを用いて相同性検索を行うことで、作成したＢＣＦＫクレードのＨＭＭプロファイルに対する任意の配列のＨＭＭスコアを計算することができる。
【0024】
本明細書において、「抗体関連分子」とは、イムノグロブリン、又はイムノグロブリンを構成するドメインから選択される単一のドメインもしくは２以上のドメインの組合せからなる分子種を含むタンパク質をいう。イムノグロブリンを構成するドメインとしては、イムノグロブリン重鎖のドメインであるＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３、ならびにイムノグロブリン軽鎖のドメインであるＶＬ及びＣＬが挙げられる。抗体関連分子は、単量体タンパク質であってもよく、又は多量体タンパク質であってもよい。抗体関連分子が多量体タンパク質である場合には、単一の種類のサブユニットからなるホモ多量体であってもよく、又は２種類以上のサブユニットからなるヘテロ多量体であってもよい。好ましくは、抗体関連分子は、イムノグロブリンの抗原認識ドメインを含みタンパク質等の標的に特異的に結合可能な分子である。抗体関連分子の例としては、ＩｇＧなどのイムノグロブリン、ならびにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（single chain antibody、ｓｃＦｖ）、ｄｉａｂｏｄｙ、重鎖抗体の重鎖可変ドメイン（variable domain of heavy chain of heavy chain antibody、ＶＨＨ）、などの低分子抗体が挙げられる。
【0025】
本明細書において、「Ｆａｂ」とは、イムノグロブリン重鎖のＶＨ－ＣＨ１ドメインとイムノグロブリン軽鎖のＶＬ－ＣＬドメインからなる抗体をいう。
【0026】
本明細書において、「ＶＨＨ」とは、重鎖抗体の重鎖可変ドメイン（variable domain of heavy chain of heavy chain antibody）をいう。重鎖抗体はラクダ科動物、サメ等の軟骨魚類などから見出されている。なお、サメ等の軟骨魚類由来のものは、ＶＮＡＲ（single variable new antigen receptor domain antibody）とも呼ばれる。本明細書におけるＶＨＨは、例えばラクダ科動物又はサメ由来であり、好ましくはラクダ科動物由来である。ＶＨＨは、単ドメインで抗原を認識できる分子であり、現在までに見つかっている抗体分子の中では最小の単位である。本発明で製造されるＶＨＨは、重鎖抗体由来の重鎖可変ドメインを１つ以上含むことができ、該ＶＨＨに含まれる重鎖可変ドメインの数は限定されない。本発明で製造されるＶＨＨに含まれる該重鎖可変ドメインは、天然の重鎖抗体由来の重鎖可変ドメインであっても、その改変体であってもよい。また本発明で製造されるＶＨＨは、該イムノグロブリン重鎖由来の重鎖可変ドメイン以外のフラグメント（例えば重鎖抗体の定常領域のフラグメント、又はヒト由来フラグメント、リンカー配列など）や、安定化のためのアミノ酸変異などを含んでいてもよい。
【0027】
本明細書において、ラクダ科動物としては、フタコブラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、アルパカ、ビクーニャ、グアナコなどが挙げられ、好ましくはアルパカが挙げられる。
【0028】
本発明の目的タンパク質の生産方法は、異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子及び目的タンパク質をコードする遺伝子を含むグラム陽性細菌を培養すること、又は異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子を含むグラム陽性細菌及び目的タンパク質をコードする遺伝子を含むグラム陽性細菌を混合培養することを含む。
【0029】
本発明の方法において、ＦＫＢＰは、異種のＦＫＢＰである限り、特に限定されない。ここで、異種とは、目的タンパク質を生産するためのグラム陽性細菌が属する種以外に分類される微生物又は生物を意味する。斯かる異種ＦＫＢＰとしては、目的タンパク質の生産性向上の観点から、ＢＣＦＫクレードに属しかつプロリル結合の異性化活性を有するポリペプチド、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号６で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつプロリル結合の異性化活性を有するポリペプチドが好ましく、配列番号１～６のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号１～６のいずれかで示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつプロリル結合の異性化活性を有するポリペプチドがより好ましい。
【0030】
配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、Methanococcus jannaschii由来のＭＪＦＫＳである。配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、大腸菌由来のＦｋｐＡである。配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、Lelliottia amnigena由来のＦＫＢＰ＿ｌである。配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、Klebsiella quasipneumoniae由来のＦＫＢＰ＿Ｋである。配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、Erwinia sp. B116由来のＦＫＢＰ＿Ｅである。配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、Pantoea sp. Nvir由来のＦＫＢＰ＿Ｐである。配列番号１～６のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ＦＫＢＰファミリーに属するポリペプチドであり、プロリル結合の異性化活性を有する。このうち、配列番号１～５のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ＢＣＦＫクレードに属するポリペプチドである。
【0031】
「プロリル結合の異性化活性」とは、タンパク質中のシス－トランス型プロリル結合を異性化する活性を意味する。プロリル結合の異性化活性は、当該技術分野において周知の方法を用いて評価され得る。例えば、該活性は、対象となるポリペプチドによるribonuclease T1（ＲＮａｓｅ）のリフォールディング速度を測定することによって決定することができる（Marika Vitikainen et al. Journal of Biological Chemistry, 2004, 279(18): 19302-19314）。
【0032】
異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子は、上述した異種ＦＫＢＰをコードするポリヌクレオチドである。異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子としては、ＦｋｐＡをコードする配列番号３５で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、ＦＫＢＰ＿ｌをコードする配列番号４０で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、ＦＫＢＰ＿Ｋをコードする配列番号４１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、ＦＫＢＰ＿Ｅをコードする配列番号４２で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、ＦＫＢＰ＿Ｐをコードする配列番号４３で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、ＭＪＦＫＳをコードする配列番号４６で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号３５、４０～４３及び４６のいずれかで示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなりかつプロリル結合の異性化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが好ましく、配列番号３５、４０～４３及び４６のいずれかで示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドがより好ましい。
【0033】
異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子は、常法に従って調製することができる。例えば、異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子は、該異種ＦＫＢＰを本来生産する微生物又は生物から常法によりゲノムＤＮＡを抽出するか、又はＲＮＡを抽出し逆転写によりｃＤＮＡを合成することによって、調製することができる。例えば、ＦｋｐＡをコードする遺伝子（配列番号３５）は、Escherichia coli（NBRC 3301）等から調製することができる。上記微生物は、公的微生物保存機関より購入することができる。上記の手順で得られた異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子に対して、さらに部位特異的変異導入を行うことにより、変異が導入された異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子を調製してもよい。あるいは、異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子は、該異種ＦＫＢＰのアミノ酸配列に基づいて化学合成してもよい。また、異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子は、宿主細胞としてのグラム陽性細菌の種にあわせてコドン至適化されていてもよい。各種生物が使用するコドンの情報は、Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（[www.kazusa.or.jp/codon/]）から入手可能である。
【0034】
異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子は、制御領域と作動可能に連結されていてもよい。「制御領域」とは、その下流に配置された遺伝子の細胞内における発現を制御する機能を有し、好ましくは、該下流に配置された遺伝子を構成的に発現又は高発現させる機能を有する領域である。より具体的には、遺伝子のコーディング領域の上流に存在し、ＲＮＡポリメラーゼが相互作用して該コーディング領域の転写を制御する機能を有する領域と定義され得る。好ましくは、本明細書における制御領域とは、遺伝子のコーディング領域の上流２００～６００ヌクレオチド程度の領域をいう。制御領域は、転写開始制御領域及び／又は翻訳開始制御領域、あるいは転写開始制御領域から翻訳開始制御領域に至るまでの領域を含む。転写開始制御領域はプロモーター及び転写開始点を含む領域であり、翻訳開始制御領域は開始コドンと共にリボソーム結合部位を形成するＳｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列に相当する部位である（Ｓｈｉｎｅ，Ｊ．，Ｄａｌｇａｒｎｏ，Ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，１９７４，７１：１３４２－１３４６）。
【0035】
制御領域の好ましい例としては、グラム陽性細菌、好ましくはバチルス属菌で機能する制御領域、例えば、バチルス属細菌由来のα－アミラーゼ遺伝子、プロテアーゼ遺伝子、ａｐｒＥ遺伝子又はｓｐｏＶＧ遺伝子の制御領域、バチルス・エスピーＫＳＭ－Ｓ２３７株のセルラーゼ遺伝子（特開２０００－２１００８１号公報）の制御領域、バチルス・エスピーＫＳＭ－６４株のセルラーゼ遺伝子（特開２０１１－１０３８７号公報）の制御領域、ならびに、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）由来のカナマイシン耐性遺伝子又はクロラムフェニコール耐性遺伝子の制御領域（いずれも、特開２００９－０８９７０８号公報を参照）、などが挙げられるが、特に限定されない。制御領域のより好ましい例として、バチルス属菌由来のプロモーター、例えば、バチルス・エスピーＫＳＭ－Ｓ２３７株のセルラーゼ遺伝子のプロモーター（配列番号９４）、バチルス・エスピーＫＳＭ－６４株のセルラーゼ遺伝子のプロモーター（配列番号９５）、枯草菌ｓｐｏＶＧ遺伝子のプロモーター（配列番号９６）、が挙げられる。また、好ましい制御領域としては、配列番号９４～９６のいずれかと少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるプロモーターが挙げられる。
【0036】
また異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子は、目的タンパク質の生産性向上の観点から、発現されたＦＫＢＰを細胞外へ分泌させる機能を有する分泌シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド（分泌シグナル配列と呼ぶ）と作動可能に連結されているのが好ましい。分泌シグナル配列の好ましい例としては、グラム陽性細菌、好ましくはバチルス属菌で機能する分泌シグナル配列、例えばバチルス属菌由来の分泌シグナル配列が挙げられる。バチルス属菌由来の分泌シグナル配列の好ましい例としては、バチルス・エスピーＫＳＭ－Ｓ２３７株のセルラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列（配列番号９７）、バチルス・エスピーＫＳＭ－６４株のセルラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列（配列番号９８）、枯草菌アミラーゼ遺伝子ａｍｙＥの分泌シグナル配列（配列番号９９）などが挙げられる。バチルス属菌由来の分泌シグナル配列のさらなる例としては、配列番号９７～９９のいずれかと少なくとも８０％の同一性を有し、かつ発現されたタンパク質を細胞外へ分泌させる機能を有するヌクレオチド配列が挙げられる。これらのバチルス属菌由来の分泌シグナル配列に連結される異種ＦＫＢＰをコードする配列は、天然型異種ＦＫＢＰの分泌シグナル配列を含んでいてもいなくてもよい。
【0037】
したがって、異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子は、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に加えて、非翻訳領域（ＵＴＲ）のヌクレオチド配列を含んでいてもよい。例えば、該遺伝子は、上述したプロモーター、分泌シグナル配列、及びターミネーターを含んでいてもよい。
【0038】
本発明の方法において、目的タンパク質をコードする遺伝子は、異種タンパク質をコードする外来遺伝子（異種遺伝子）であっても、外部から導入された同種由来のタンパク質をコードする遺伝子であっても、宿主細胞が本来発現することができるタンパク質をコードする内在遺伝子であってもよい。目的タンパク質としては、少なくとも１箇所のプロリル結合異性化部位を有するタンパク質が好ましい。ここで、目的タンパク質中のプロリル結合異性化部位とは、目的タンパク質の生産過程で異性化し得る部位、すなわちシス－プロリル結合部位であり、目的タンパク質中のシス－プロリル結合部位の有無及び／又は個数は、Ｘ線結晶構造解析によって得られる目的タンパク質の立体構造を参照することで確認することができる。目的タンパク質の種類は、特に限定されない。目的タンパク質の例としては、所望のタンパク質又は所望の目的物質の合成に関わる酵素が挙げられ、例えば、抗体関連分子、サイトカイン、ホルモン、その他生理活性ペプチド、トランスポーター、プロテアーゼなどの産業用酵素、代謝関連酵素などが挙げられる。
【0039】
好ましくは、目的タンパク質は抗体関連分子であり、より好ましくはＦａｂ、ＳｃＦｖ、ＶＨＨなどの低分子抗体である。さらに好ましくは、目的タンパク質はＦａｂ、ＳｃＦｖ及びＶＨＨからなる群より選択され、さらに好ましくはＦａｂである。
【0040】
目的タンパク質をコードする遺伝子は、常法に従って調製することができる。例えば、目的タンパク質をコードする遺伝子は、該目的タンパク質を本来生産する微生物又は生物から常法によりゲノムＤＮＡを抽出するか、又はＲＮＡを抽出し逆転写によりｃＤＮＡを合成することによって、調製することができる。あるいは、目的タンパク質をコードする遺伝子は、該目的タンパク質のアミノ酸配列に基づいて化学合成することができる。また、目的タンパク質をコードする遺伝子は、宿主細胞としてのグラム陽性細菌の種にあわせてコドン至適化されていてもよい。
【0041】
目的タンパク質をコードする遺伝子は、制御領域と作動可能に連結されていてもよい。また目的タンパク質をコードする遺伝子は、発現された目的タンパク質を細胞外へ分泌させる分泌シグナル配列と作動可能に連結されているのが好ましい。制御領域及び分泌シグナルの詳細は、異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子について述べたものと同様である。
【0042】
異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子及び目的タンパク質をコードする遺伝子は、同一のグラム陽性細菌に導入されていてもよいし、それぞれ異なるグラム陽性細菌に導入されていてもよい。異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子及び目的タンパク質をコードする遺伝子がそれぞれ異なるグラム陽性細菌に導入されている場合、各グラム陽性細菌は同種であっても異種であってもよいが、培養効率の観点から、同種であることが好ましい。また、異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子及び目的タンパク質をコードする遺伝子がそれぞれ異なるグラム陽性細菌に導入されている場合、各遺伝子はそれぞれ分泌シグナル配列と作動可能に連結されているのが好ましい。より好ましくは、異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子及び目的タンパク質をコードする遺伝子は、同一のグラム陽性細菌に導入されている。
【0043】
宿主細胞としてのグラム陽性細菌は、タンパク質の生産に使用できる限り特に限定されず、枯草菌（Bacillus subtilis）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、バチルス・チューリンジェンシス（Bacillus thuringiensis）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）等のバチルス属菌、クロストリジウム・ブチリカム（Clostridium butyricum）等のクロストリジウム属菌等が挙げられる。なかでも、バチルス属菌が好ましく、枯草菌がより好ましい。
【0044】
上記グラム陽性細菌は、野生株であってもよいが、変異を施した変異株であってもよい。例えば、枯草菌の変異株としては、細胞外に分泌されるタンパク質の細胞外における分解を効果的に防止してタンパク質の生産性を向上させるため、少なくとも１種の細胞外プロテアーゼ遺伝子が欠損した枯草菌株を用いるのが好ましい。ここで、細胞外プロテアーゼの「欠損」とは、細胞外プロテアーゼの活性が細胞外プロテアーゼ非欠損細胞（例えば野生株）の活性と比べて低下していることを意味する。細胞外プロテアーゼが欠損した細胞（細胞外プロテアーゼ欠損株）は、細胞における該細胞外プロテアーゼの遺伝子の部分的又は完全な欠失又は不活性化（いわゆるノックダウン又はノックアウトなど）によって作製することができる。好ましくは、細胞外プロテアーゼ欠損株は、該細胞外プロテアーゼの活性が、野生株に対して５０％以下、より好ましくは２５％以下に低下している。細胞外プロテアーゼ欠損枯草菌株で欠損している細胞外プロテアーゼ遺伝子は、好ましくは、ａｐｒＥ（ＢＳＯＲＦ ＤＢ遺伝子番号：ＢＧ１０１９０）、ｅｐｒ（ＢＧ１０５６１）、ｗｐｒＡ（ＢＧ１１８４６）、ｍｐｒ（ＢＧ１０６９０）、ｎｐｒＢ（ＢＧ１０６９１）、ｂｐｒ（ＢＧ１０２３３）、ｎｐｒＥ（ＢＧ１０４４８）、ｖｐｒ（ＢＧ１０５９１）及びａｐｒＸ（ＢＧ１２５６７）からなる群より選択される好ましくは少なくとも１種の遺伝子、より好ましくは３種の遺伝子、さらに好ましくは全遺伝子である。斯かる枯草菌変異株の好ましい例としては、細胞外プロテアーゼ欠損枯草菌株Ｄｐｒ９（特許第４４８５３４１号参照）が挙げられる。また、枯草菌変異株は、ｓｉｇＦ等のシグマ因子の欠失（特許第４３３６０８２号参照）、相同組み換え活性に関与するｒｅｃＡの欠失（特許第６０８８２８２号参照）などを施されていてもよい。Ｄｐｒ９株に、ｓｉｇＦ及びｒｅｃＡの一方又は両方の欠失を加えた枯草菌変異株も使用できる。
【0045】
宿主細胞としてのグラム陽性細菌への異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子、目的タンパク質をコードする遺伝子、又は異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子及び目的タンパク質をコードする遺伝子の導入は、定法に従って行うことができる。例えば、異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子は、異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子又はそれを含むベクターを宿主グラム陽性細菌細胞に導入することで、該宿主細胞のゲノムに組み込むことができる。目的タンパク質をコードする遺伝子は、目的タンパク質をコードする遺伝子又はそれを含むベクターを宿主グラム陽性細菌細胞に導入することで、該宿主細胞のゲノムに組み込むことができる。異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子及び目的タンパク質をコードする遺伝子は、異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子若しくはそれを含むベクター及び目的タンパク質をコードする遺伝子若しくはそれを含むベクター、又は異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子及び目的タンパク質をコードする遺伝子の両方を含むベクターを宿主グラム陽性細菌細胞に導入することで、該宿主細胞のゲノムに組み込むことができる。あるいは、異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子を含む発現ベクター、目的タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター、異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子を含む発現ベクター及び目的タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター、又は異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子及び目的のタンパク質をコードする遺伝子の両方を含む発現ベクターを宿主グラム陽性細菌細胞に導入してもよい。同一宿主細胞に２種の遺伝子又はベクターを導入する場合、その導入順は限定されず、いずれを先に導入してもよいし、同時に導入してもよい。
【0046】
グラム陽性細菌細胞への遺伝子やベクターの導入には、例えば、コンピテントセル法、エレクトロポレーション法、プロトプラスト法、パーテイクルガン法、ＰＥＧ法等の公知の形質転換技術を適用することができる。
【0047】
異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子を含むベクター、目的タンパク質をコードする遺伝子を含むベクター、又は異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子及び目的タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターは、該異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子及び／又は該目的タンパク質をコードする遺伝子、並びに必要に応じて制御領域もしくは分泌シグナル配列を、常法により任意のベクター中に挿入し連結することにより構築することができる。該ベクターの種類は特に限定されず、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、ウイルス、ＹＡＣベクター、シャトルベクター等の任意のベクターであってよい。また該ベクターは、好ましくは、宿主細胞内で増幅可能なベクターであり、より好ましくは発現ベクターである。好ましいベクターの例としては、限定するものではないが、ｐＨＡ３０４０ＳＰ６４、ｐＨＳＰ６４Ｒ又はｐＡＳＰ６４（特許第３４９２９３５号公報）、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（大腸菌と枯草菌の両方を形質転換可能な発現ベクター；Ｊｐｎ Ｊ Ｇｅｎｅｔ，１９８５，６０：２３５－２４３）、ｐＨＹ－Ｓ２３７（特開２０１４－１５８４３０号公報）、ｐＡＣ３（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１９８８，１６：８７３２）等のシャトルベクター；ｐＵＢ１１０（Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９７８，１３４：３１８－３２９）、ｐＴＡ１０６０７（Ｐｌａｓｍｉｄ，１９８７，１８：８－１５）等のバチルス属細菌の形質転換に利用可能なプラスミド、等が挙げられる。また大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＥＴ２２ｂ（＋）、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ５７、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等）を用いることもできる。
【0048】
本発明の方法においては、上記のような手順で得られた、異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子及び目的タンパク質をコードする遺伝子を含むグラム陽性細菌を培養する、又は異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子を含むグラム陽性細菌及び目的タンパク質をコードする遺伝子を含むグラム陽性細菌を混合培養する。該グラム陽性細菌は、一般的なグラム陽性細菌の培養方法に従って培養すればよい。例えば、グラム陽性細菌の培養のための培地は、菌の生育に必要な炭素源及び窒素源を含む。炭素源としては、例えばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖、メタノールなどが挙げられる。窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが挙げられる。必要に応じて、該培地は、他の栄養素、例えば無機塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類、抗生物質（例えばテトラサイクリン、ネオマイシン、カナマイシン、スペクチノマイシン、エリスロマイシン等）などを含んでいてもよい。培養条件、例えば温度、通気撹拌条件、培地のｐＨ及び培養時間等は、菌種や形質、培養スケール等に応じて適宜選択され得る。
【0049】
当該グラム陽性細菌の培養により、グラム陽性細菌の細胞内に目的タンパク質が発現する。さらに目的タンパク質をコードする遺伝子が分泌シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドと連結されている場合、発現した目的タンパク質は細胞外に分泌される。本発明の方法により生産された目的タンパク質は、タンパク質精製に用いられる一般的な方法、例えば、細胞の破砕、遠心分離、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、培養液から回収することができる。
【0050】
本発明の方法によれば、後述する実施例に示すように、グラム陽性細菌における目的タンパク質の発現の際に異種ＦＫＢＰを発現させることで、目的タンパク質の単独発現の場合と比較して、目的タンパク質の生産性が大きく向上する。また、グラム陽性細菌における目的タンパク質の発現の際に枯草菌で目的タンパク質の生産性向上に寄与することが報告されているＰｒｓＡ（前記特許文献２、非特許文献５、６）を共存させる場合と比較しても、目的タンパク質の生産性が大きく向上する。斯様に、本発明の方法は、グラム陽性細菌を用いて目的タンパク質を高い生産性で効率よく生産することができ、当該目的タンパク質の生産に必要な時間やコストの低減化を実現する。
【0051】
さらに、グラム陽性細菌における目的タンパク質の発現の際に異種ＦＫＢＰを分泌発現させることで、目的タンパク質の発現の際に異種ＦＫＢＰを細胞膜に係留された状態で発現させる場合と比較して、目的タンパク質の生産性が大きく向上する。枯草菌では生産されたタンパク質が細胞膜近傍で折りたたまれることが知られていたところ（前記非特許文献４）、タンパク質の折りたたみを補助しうるＦＫＢＰを細胞膜近傍ではなく分泌発現させた場合に目的タンパク質の生産性が向上することは全く予想外のことである。
【0052】
本発明はまた、例示的実施形態として以下の物質、製造方法、用途、方法等を包含する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
【0053】
〔１〕異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子及び目的タンパク質をコードする遺伝子を含むグラム陽性細菌を培養すること、又は異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子を含むグラム陽性細菌及び目的タンパク質をコードする遺伝子を含むグラム陽性細菌を混合培養することを含む、好ましくは異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子及び目的タンパク質をコードする遺伝子を含むグラム陽性細菌を培養することを含む、目的タンパク質の生産方法。
〔２〕異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子及び目的タンパク質をコードする遺伝子を含むグラム陽性細菌を培養すること、又は異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子を含むグラム陽性細菌及び目的タンパク質をコードする遺伝子を含むグラム陽性細菌を混合培養することを含む、好ましくは異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子及び目的タンパク質をコードする遺伝子を含むグラム陽性細菌を培養することを含む、目的タンパク質の生産性向上方法。
〔３〕前記異種ＦＫＢＰがＢＣＦＫクレードに属しかつプロリル結合の異性化活性を有するポリペプチド、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号６で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつプロリル結合の異性化活性を有するポリペプチドであり、好ましくはＢＣＦＫクレードに属しかつプロリル結合の異性化活性を有するポリペプチド又は配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔４〕前記異種ＦＫＢＰが配列番号１～６のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号１～６のいずれかで示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつプロリル結合の異性化活性を有するポリペプチドであり、好ましくは配列番号１～６のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔５〕前記異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子が配列番号３５、４０～４３及び４６のいずれかで示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号３５、４０～４３及び４６のいずれかで示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなりかつプロリル結合の異性化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり、好ましくは配列番号３５、４０～４３及び４６のいずれかで示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドである、〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔６〕前記異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子が分泌シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結されている、〔１〕～〔５〕のいずれか１項に記載の方法。
〔７〕前記グラム陽性細菌がバチルス属菌であり、好ましくは枯草菌又はその変異株である、〔１〕～〔６〕のいずれか１項に記載の方法。
〔８〕前記グラム陽性細菌が少なくとも１種類の細胞外プロテアーゼ遺伝子が欠失又は不活性化されている枯草菌であり、好ましくはａｐｒＥ、ｅｐｒ、ｗｐｒＡ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｂｐｒ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ及びａｐｒＸからなる群より選択される少なくとも１種の細胞外プロテアーゼ遺伝子が欠失又は不活化されている枯草菌であり、より好ましくはａｐｒＥ、ｅｐｒ、ｗｐｒＡ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｂｐｒ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ及びａｐｒＸが欠失又は不活化されている枯草菌である、〔１〕～〔６〕のいずれか１項に記載の方法。
〔９〕前記目的タンパク質が少なくとも１箇所のプロリル結合異性化部位を有する、〔１〕～〔８〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１０〕前記目的タンパク質が抗体関連分子であり、好ましくはＦａｂ、ＳｃＦｖ及びＶＨＨからなる群より選択されるものであり、より好ましくはＦａｂである、〔１〕～〔９〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１１〕培養物から目的タンパク質を回収することをさらに含む、〔１〕～〔１０〕のいずれか１項に記載の方法。
〔２〕異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子及び目的タンパク質をコードする遺伝子を含むグラム陽性細菌を培養すること、又は異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子を含むグラム陽性細菌及び目的タンパク質をコードする遺伝子を含むグラム陽性細菌を混合培養することを含む、好ましくは異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子及び目的タンパク質をコードする遺伝子を含むグラム陽性細菌を培養することを含む、目的タンパク質の生産性向上方法。
〔３〕前記異種ＦＫＢＰがＢＣＦＫクレードに属しかつプロリル結合の異性化活性を有するポリペプチド、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号６で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつプロリル結合の異性化活性を有するポリペプチドであり、好ましくはＢＣＦＫクレードに属しかつプロリル結合の異性化活性を有するポリペプチド又は配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔４〕前記異種ＦＫＢＰが配列番号１～６のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号１～６のいずれかで示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつプロリル結合の異性化活性を有するポリペプチドであり、好ましくは配列番号１～６のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔５〕前記異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子が配列番号３５、４０～４３及び４６のいずれかで示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号３５、４０～４３及び４６のいずれかで示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなりかつプロリル結合の異性化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり、好ましくは配列番号３５、４０～４３及び４６のいずれかで示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドである、〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔６〕前記異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子が分泌シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結されている、〔１〕～〔５〕のいずれか１項に記載の方法。
〔７〕前記グラム陽性細菌がバチルス属菌であり、好ましくは枯草菌又はその変異株である、〔１〕～〔６〕のいずれか１項に記載の方法。
〔８〕前記グラム陽性細菌が少なくとも１種類の細胞外プロテアーゼ遺伝子が欠失又は不活性化されている枯草菌であり、好ましくはａｐｒＥ、ｅｐｒ、ｗｐｒＡ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｂｐｒ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ及びａｐｒＸからなる群より選択される少なくとも１種の細胞外プロテアーゼ遺伝子が欠失又は不活化されている枯草菌であり、より好ましくはａｐｒＥ、ｅｐｒ、ｗｐｒＡ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｂｐｒ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ及びａｐｒＸが欠失又は不活化されている枯草菌である、〔１〕～〔６〕のいずれか１項に記載の方法。
〔９〕前記目的タンパク質が少なくとも１箇所のプロリル結合異性化部位を有する、〔１〕～〔８〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１０〕前記目的タンパク質が抗体関連分子であり、好ましくはＦａｂ、ＳｃＦｖ及びＶＨＨからなる群より選択されるものであり、より好ましくはＦａｂである、〔１〕～〔９〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１１〕培養物から目的タンパク質を回収することをさらに含む、〔１〕～〔１０〕のいずれか１項に記載の方法。
【0054】
〔１２〕異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子、又は異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子及び目的タンパク質をコードする遺伝子を含むグラム陽性細菌。
〔１３〕前記異種ＦＫＢＰがＢＣＦＫクレードに属しかつプロリル結合の異性化活性を有するポリペプチド、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号６で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつプロリル結合の異性化活性を有するポリペプチドであり、好ましくはＢＣＦＫクレードに属しかつプロリル結合の異性化活性を有するポリペプチド又は配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、〔１２〕に記載のグラム陽性細菌。
〔１４〕前記異種ＦＫＢＰが配列番号１～６のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号１～６のいずれかで示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつプロリル結合の異性化活性を有するポリペプチドであり、好ましくは配列番号１～６のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、〔１２〕に記載のグラム陽性細菌。
〔１５〕前記異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子が配列番号３５、４０～４３及び４６のいずれかで示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号３５、４０～４３及び４６のいずれかで示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなりかつプロリル結合の異性化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり、好ましくは配列番号３５、４０～４３及び４６のいずれかで示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドである、〔１２〕に記載のグラム陽性細菌。
〔１６〕前記異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子が分泌シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結されている、〔１２〕～〔１５〕のいずれか１項に記載のグラム陽性細菌。
〔１７〕バチルス属菌、好ましくは枯草菌又はその変異株である、〔１２〕～〔１６〕のいずれか１項に記載のグラム陽性細菌。
〔１８〕少なくとも１種類の細胞外プロテアーゼ遺伝子が欠失又は不活性化されている枯草菌であり、好ましくはａｐｒＥ、ｅｐｒ、ｗｐｒＡ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｂｐｒ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ及びａｐｒＸからなる群より選択される少なくとも１種の細胞外プロテアーゼ遺伝子が欠失又は不活化されている枯草菌であり、より好ましくはａｐｒＥ、ｅｐｒ、ｗｐｒＡ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｂｐｒ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ及びａｐｒＸが欠失又は不活化されている枯草菌である、〔１２〕～〔１６〕のいずれか１項に記載のグラム陽性細菌。
〔１９〕前記目的タンパク質が少なくとも１箇所のプロリル結合異性化部位を有する、〔１２〕～〔１８〕のいずれか１項に記載のグラム陽性細菌。
〔２０〕前記目的タンパク質が抗体関連分子であり、好ましくはＦａｂ、ＳｃＦｖ及びＶＨＨからなる群より選択されるものであり、より好ましくはＦａｂである、〔１２〕～〔１９〕のいずれか１項に記載のグラム陽性細菌。
〔１３〕前記異種ＦＫＢＰがＢＣＦＫクレードに属しかつプロリル結合の異性化活性を有するポリペプチド、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号６で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつプロリル結合の異性化活性を有するポリペプチドであり、好ましくはＢＣＦＫクレードに属しかつプロリル結合の異性化活性を有するポリペプチド又は配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、〔１２〕に記載のグラム陽性細菌。
〔１４〕前記異種ＦＫＢＰが配列番号１～６のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号１～６のいずれかで示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつプロリル結合の異性化活性を有するポリペプチドであり、好ましくは配列番号１～６のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、〔１２〕に記載のグラム陽性細菌。
〔１５〕前記異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子が配列番号３５、４０～４３及び４６のいずれかで示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号３５、４０～４３及び４６のいずれかで示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなりかつプロリル結合の異性化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり、好ましくは配列番号３５、４０～４３及び４６のいずれかで示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドである、〔１２〕に記載のグラム陽性細菌。
〔１６〕前記異種ＦＫＢＰをコードする遺伝子が分泌シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結されている、〔１２〕～〔１５〕のいずれか１項に記載のグラム陽性細菌。
〔１７〕バチルス属菌、好ましくは枯草菌又はその変異株である、〔１２〕～〔１６〕のいずれか１項に記載のグラム陽性細菌。
〔１８〕少なくとも１種類の細胞外プロテアーゼ遺伝子が欠失又は不活性化されている枯草菌であり、好ましくはａｐｒＥ、ｅｐｒ、ｗｐｒＡ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｂｐｒ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ及びａｐｒＸからなる群より選択される少なくとも１種の細胞外プロテアーゼ遺伝子が欠失又は不活化されている枯草菌であり、より好ましくはａｐｒＥ、ｅｐｒ、ｗｐｒＡ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｂｐｒ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ及びａｐｒＸが欠失又は不活化されている枯草菌である、〔１２〕～〔１６〕のいずれか１項に記載のグラム陽性細菌。
〔１９〕前記目的タンパク質が少なくとも１箇所のプロリル結合異性化部位を有する、〔１２〕～〔１８〕のいずれか１項に記載のグラム陽性細菌。
〔２０〕前記目的タンパク質が抗体関連分子であり、好ましくはＦａｂ、ＳｃＦｖ及びＶＨＨからなる群より選択されるものであり、より好ましくはＦａｂである、〔１２〕～〔１９〕のいずれか１項に記載のグラム陽性細菌。
【実施例0055】
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【0056】
材料及び方法
（１）宿主菌株
宿主枯草菌には、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８株の派生株を用いた。細胞外プロテアーゼ欠損枯草菌株Ｄｐｒ９（特許第４４８５３４１号参照、細胞外プロテアーゼｅｐｒ、ｗｐｒＡ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｂｐｒ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ、ａｐｒＥ及びａｐｒＸが欠損）から、特許第４３３６０８２号に記載されている方法に従ってｓｉｇＦ遺伝子欠損株（Ｄｐｒ９ΔｓｉｇＦ）を作製した。
（１）宿主菌株
宿主枯草菌には、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８株の派生株を用いた。細胞外プロテアーゼ欠損枯草菌株Ｄｐｒ９（特許第４４８５３４１号参照、細胞外プロテアーゼｅｐｒ、ｗｐｒＡ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｂｐｒ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ、ａｐｒＥ及びａｐｒＸが欠損）から、特許第４３３６０８２号に記載されている方法に従ってｓｉｇＦ遺伝子欠損株（Ｄｐｒ９ΔｓｉｇＦ）を作製した。
【0057】
（２）培地
・ＬＢ培地：１％ＢａｃｔｏＴＭ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．５％ＢａｃｔｏＴＭ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、１％塩化ナトリウム。平板培地には１．５％の寒天を加えた。必要に応じてテトラサイクリン（５０ｐｐｍ）を加えた。
・ＤＭ３培地：１％ＣＭＣ（関東化学）、０．５％ＢａｃｔｏＴＭ Ｃａｓａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ、０．５％ＢａｃｔｏＴＭ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、８．１％コハク酸二ナトリウム・６Ｈ２Ｏ、０．３５％リン酸水素二カリウム、０．１５％リン酸二水素カリウム、０．５％グルコース、２０ｍＭ塩化マグネシウム、０．０１％ＢＳＡ、５０ｐｐｍテトラサイクリン。平板培地には１％の寒天を加えた。
・２×Ｌ－ｍａｌ培地：２％ＢａｃｔｏＴＭ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、１％ＢａｃｔｏＴＭ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、１％塩化ナトリウム、７．５％マルトース一水和物、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン、１５ｐｐｍテトラサイクリン。
・ＬＢ培地：１％ＢａｃｔｏＴＭ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．５％ＢａｃｔｏＴＭ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、１％塩化ナトリウム。平板培地には１．５％の寒天を加えた。必要に応じてテトラサイクリン（５０ｐｐｍ）を加えた。
・ＤＭ３培地：１％ＣＭＣ（関東化学）、０．５％ＢａｃｔｏＴＭ Ｃａｓａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ、０．５％ＢａｃｔｏＴＭ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、８．１％コハク酸二ナトリウム・６Ｈ２Ｏ、０．３５％リン酸水素二カリウム、０．１５％リン酸二水素カリウム、０．５％グルコース、２０ｍＭ塩化マグネシウム、０．０１％ＢＳＡ、５０ｐｐｍテトラサイクリン。平板培地には１％の寒天を加えた。
・２×Ｌ－ｍａｌ培地：２％ＢａｃｔｏＴＭ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、１％ＢａｃｔｏＴＭ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、１％塩化ナトリウム、７．５％マルトース一水和物、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン、１５ｐｐｍテトラサイクリン。
【0058】
実施例１ ＰＰＩａｓｅ発現によるタンパク質高生産化
１－１．ＰＰＩａｓｅ発現用プラスミドの構築
ｐＨＹ３００ＰＬＫをベースとして作製された組換えプラスミドｐＨＹ－Ｓ２３７（特開２０１４－１５８４３０号公報）をテンプレートとし、配列番号７と配列番号８のプライマーセットとＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）を用いたＰＣＲによりプラスミド配列を増幅した。１６８株のゲノムをテンプレートとし、配列番号９と配列番号１０のプライマーセットを用いたＰＣＲによりｓｐｏＶＧ遺伝子由来のプロモーターＤＮＡを増幅した。得られたプロモーターＤＮＡを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いてプラスミド配列に組み込んだ。得られたプラスミド配列から配列番号１１と配列番号１２のプライマーセットを用いたＰＣＲによりセルラーゼ配列を除去した。得られたプラスミドをテンプレートとし、配列番号１１と配列番号１３のプライマーセットを用いたＰＣＲによりプラスミド配列を増幅した。１６８株のゲノムをテンプレートとし、配列番号１４と配列番号１５のプライマーセットを用いたＰＣＲにより分泌シグナルＤＮＡを増幅した。得られた分泌シグナルＤＮＡを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いてプラスミド配列に組み込むことでＰＰＩａｓｅ発現用プラスミドを構築した。
１－１．ＰＰＩａｓｅ発現用プラスミドの構築
ｐＨＹ３００ＰＬＫをベースとして作製された組換えプラスミドｐＨＹ－Ｓ２３７（特開２０１４－１５８４３０号公報）をテンプレートとし、配列番号７と配列番号８のプライマーセットとＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）を用いたＰＣＲによりプラスミド配列を増幅した。１６８株のゲノムをテンプレートとし、配列番号９と配列番号１０のプライマーセットを用いたＰＣＲによりｓｐｏＶＧ遺伝子由来のプロモーターＤＮＡを増幅した。得られたプロモーターＤＮＡを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いてプラスミド配列に組み込んだ。得られたプラスミド配列から配列番号１１と配列番号１２のプライマーセットを用いたＰＣＲによりセルラーゼ配列を除去した。得られたプラスミドをテンプレートとし、配列番号１１と配列番号１３のプライマーセットを用いたＰＣＲによりプラスミド配列を増幅した。１６８株のゲノムをテンプレートとし、配列番号１４と配列番号１５のプライマーセットを用いたＰＣＲにより分泌シグナルＤＮＡを増幅した。得られた分泌シグナルＤＮＡを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いてプラスミド配列に組み込むことでＰＰＩａｓｅ発現用プラスミドを構築した。
【0059】
１－２．ＰＰＩａｓｅ発現用プラスミドの設計
１－１で構築したＰＰＩａｓｅ発現用プラスミドをテンプレートとし、配列番号１１と配列番号１３のプライマーセットとＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）を用いたＰＣＲによりプラスミド配列を増幅した。１６８株のゲノムをテンプレートとし、配列番号１６と配列番号１７のプライマーセットを用いたＰＣＲにより配列番号１８に示すＰｒｓＡをコードするＤＮＡを増幅した（配列番号１９）。得られたＰｒｓＡをコードするＤＮＡを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いてプラスミド配列に組み込むことでＰｒｓＡ発現用プラスミドを得た。１－１で構築したＰＰＩａｓｅ発現用プラスミドをテンプレートとし、配列番号１３と配列番号２０のプライマーセットとＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）を用いたＰＣＲによりプラスミド配列を増幅した。大腸菌ＤＨ５αのゲノムをテンプレートとし、配列番号２１と配列番号２２、配列番号２３と配列番号２４、配列番号２５と配列番号２６、配列番号２７と配列番号２８のプライマーセットを用いたＰＣＲによりＳｕｒＡ（配列番号２９）、ＰｐｉＡ（配列番号３０）、Ｔｉｇ（配列番号３１）、ＦｋｐＡ（配列番号１）をそれぞれコードするＤＮＡを増幅した（配列番号３２～３５）。得られたＰＰＩａｓｅをコードするＤＮＡを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いてプラスミド配列に組み込むことでＳｕｒＡ、ＰｐｉＡ、Ｔｉｇ、ＦｋｐＡ発現用プラスミドをそれぞれ得た。ＦＫＢＰ＿ｌ（配列番号２）、ＦＫＢＰ＿Ｋ（配列番号３）、ＦＫＢＰ＿Ｅ（配列番号４）、ＦＫＢＰ＿Ｐ（配列番号５）、ＦＫＢＰ２（配列番号３６）、ＦＫ１５３（配列番号３７）、ＭＪＦＫＳ（配列番号６）、ＦＫＢＰ５２（配列番号３８）、ＣｙＰ４０（配列番号３９）のアミノ酸配列をコードする配列番号４０～４８に示す塩基配列をＧｅｎｅｓｃｒｉｐｔ社のＧｅｎＰｌｕｓクローニングによって１－１で構築したＰＰＩａｓｅ発現用プラスミドの配列番号４９と配列番号５０に示す領域の間に組み込む形で合成し、ＦＫＢＰ＿ｌ、ＦＫＢＰ＿Ｋ、ＦＫＢＰ＿Ｅ、ＦＫＢＰ＿Ｐ、ＦＫＢＰ２、ＦＫ１５３、ＭＪＦＫＳ、ＦＫＢＰ５２、ＣｙＰ４０発現用プラスミドをそれぞれ得た。
１－１で構築したＰＰＩａｓｅ発現用プラスミドをテンプレートとし、配列番号１１と配列番号１３のプライマーセットとＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）を用いたＰＣＲによりプラスミド配列を増幅した。１６８株のゲノムをテンプレートとし、配列番号１６と配列番号１７のプライマーセットを用いたＰＣＲにより配列番号１８に示すＰｒｓＡをコードするＤＮＡを増幅した（配列番号１９）。得られたＰｒｓＡをコードするＤＮＡを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いてプラスミド配列に組み込むことでＰｒｓＡ発現用プラスミドを得た。１－１で構築したＰＰＩａｓｅ発現用プラスミドをテンプレートとし、配列番号１３と配列番号２０のプライマーセットとＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）を用いたＰＣＲによりプラスミド配列を増幅した。大腸菌ＤＨ５αのゲノムをテンプレートとし、配列番号２１と配列番号２２、配列番号２３と配列番号２４、配列番号２５と配列番号２６、配列番号２７と配列番号２８のプライマーセットを用いたＰＣＲによりＳｕｒＡ（配列番号２９）、ＰｐｉＡ（配列番号３０）、Ｔｉｇ（配列番号３１）、ＦｋｐＡ（配列番号１）をそれぞれコードするＤＮＡを増幅した（配列番号３２～３５）。得られたＰＰＩａｓｅをコードするＤＮＡを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いてプラスミド配列に組み込むことでＳｕｒＡ、ＰｐｉＡ、Ｔｉｇ、ＦｋｐＡ発現用プラスミドをそれぞれ得た。ＦＫＢＰ＿ｌ（配列番号２）、ＦＫＢＰ＿Ｋ（配列番号３）、ＦＫＢＰ＿Ｅ（配列番号４）、ＦＫＢＰ＿Ｐ（配列番号５）、ＦＫＢＰ２（配列番号３６）、ＦＫ１５３（配列番号３７）、ＭＪＦＫＳ（配列番号６）、ＦＫＢＰ５２（配列番号３８）、ＣｙＰ４０（配列番号３９）のアミノ酸配列をコードする配列番号４０～４８に示す塩基配列をＧｅｎｅｓｃｒｉｐｔ社のＧｅｎＰｌｕｓクローニングによって１－１で構築したＰＰＩａｓｅ発現用プラスミドの配列番号４９と配列番号５０に示す領域の間に組み込む形で合成し、ＦＫＢＰ＿ｌ、ＦＫＢＰ＿Ｋ、ＦＫＢＰ＿Ｅ、ＦＫＢＰ＿Ｐ、ＦＫＢＰ２、ＦＫ１５３、ＭＪＦＫＳ、ＦＫＢＰ５２、ＣｙＰ４０発現用プラスミドをそれぞれ得た。
【0060】
１－３．Ｆａｂ発現株の構築
１６８株のゲノムをテンプレートとし、配列番号５１と配列番号５２、配列番号５３と配列番号５４のプライマーセットを用いたＰＣＲによりｙｂｄＯ遺伝子領域を含むＤＮＡ断片（Ａ）、ｙｂｘＧ遺伝子領域を含むＤＮＡ断片（Ｂ）を増幅した。プラスミドｐＣ１９４ ＤＮＡを鋳型とし、配列番号５５と配列番号５６のプライマーセットを用いたＰＣＲによりクロラムフェニコール耐性遺伝子領域（Ｃ）を増幅した。配列番号５７と配列番号５８に示す重鎖及び軽鎖からなるＦａｂ＿ｃ（ＣｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂのＦａｂ）をオペロンで発現可能な配列番号５９に示す塩基配列をＧｅｎｅｓｃｒｉｐｔ社のＧｅｎＰｌｕｓクローニングによって１－１で構築したＰＰＩａｓｅ発現用プラスミドの配列番号６０と配列番号５０に示す領域の間に組み込む形で合成し、Ｆａｂ＿ｃ発現用プラスミドを得た。Ｆａｂ＿ｃ発現用プラスミドを鋳型に配列番号６１と配列番号６２のプライマーセットを用いたＰＣＲによりＦａｂ＿ｃ発現領域を含むＤＮＡ断片（Ｄ）を増幅した。上記（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）（Ｄ）の４断片を混合して鋳型とし、配列番号５１と配列番号５４のプライマーセットを用いたＳＯＥ－ＰＣＲを行うことによって、４断片を連結しＦａｂ＿ｃ発現領域のゲノム組み込み用のＤＮＡ断片を得た。得られたＦａｂ＿ｃ発現領域のゲノム組み込み用のＤＮＡ断片を用いてコンピテントセル法により枯草菌Ｄｐｒ９ΔｓｉｇＦ株を形質転換した。形質転換後、クロラムフェニコール（１０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。このようにして得られた菌株をＦａｂ＿ｃ生産株と命名した。
１６８株のゲノムをテンプレートとし、配列番号５１と配列番号５２、配列番号５３と配列番号５４のプライマーセットを用いたＰＣＲによりｙｂｄＯ遺伝子領域を含むＤＮＡ断片（Ａ）、ｙｂｘＧ遺伝子領域を含むＤＮＡ断片（Ｂ）を増幅した。プラスミドｐＣ１９４ ＤＮＡを鋳型とし、配列番号５５と配列番号５６のプライマーセットを用いたＰＣＲによりクロラムフェニコール耐性遺伝子領域（Ｃ）を増幅した。配列番号５７と配列番号５８に示す重鎖及び軽鎖からなるＦａｂ＿ｃ（ＣｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂのＦａｂ）をオペロンで発現可能な配列番号５９に示す塩基配列をＧｅｎｅｓｃｒｉｐｔ社のＧｅｎＰｌｕｓクローニングによって１－１で構築したＰＰＩａｓｅ発現用プラスミドの配列番号６０と配列番号５０に示す領域の間に組み込む形で合成し、Ｆａｂ＿ｃ発現用プラスミドを得た。Ｆａｂ＿ｃ発現用プラスミドを鋳型に配列番号６１と配列番号６２のプライマーセットを用いたＰＣＲによりＦａｂ＿ｃ発現領域を含むＤＮＡ断片（Ｄ）を増幅した。上記（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）（Ｄ）の４断片を混合して鋳型とし、配列番号５１と配列番号５４のプライマーセットを用いたＳＯＥ－ＰＣＲを行うことによって、４断片を連結しＦａｂ＿ｃ発現領域のゲノム組み込み用のＤＮＡ断片を得た。得られたＦａｂ＿ｃ発現領域のゲノム組み込み用のＤＮＡ断片を用いてコンピテントセル法により枯草菌Ｄｐｒ９ΔｓｉｇＦ株を形質転換した。形質転換後、クロラムフェニコール（１０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。このようにして得られた菌株をＦａｂ＿ｃ生産株と命名した。
【0061】
１－４．枯草菌へのＰＰＩａｓｅ発現用プラスミドの導入
Ｆａｂ＿ｃ生産株への１－２で構築したＰＰｌａｓｅ発現用プラスミドの導入は以下に示すプロトプラスト法によって行った。１ｍＬのＬＢ液体培地にグリセロールストックした枯草菌を植菌し、３０℃、２１０ｒｐｍで一晩振とう培養した。翌日、新たな１ｍＬのＬＢ液体培地にこの培養液を１０μＬ植菌し、３７℃、２１０ｒｐｍで約２時間振とう培養した。この培養液を１．５ｍＬチューブに回収し、１，２０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除去したペレットをＬｙｓｏｚｙｍｅ（ＳＩＧＭＡ社製）４ｍｇ／ｍＬを含むＳＭＭＰ５００μＬに懸濁し、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、３，５００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を除去したペレットをＳＭＭＰ４００μＬに懸濁した。この懸濁液３３μＬを各種プラスミドと混合し、さらに４０％ＰＥＧを１００μＬ添加してボルテックスした。この液にＳＭＭＰを３５０μＬ加えて転倒混和し、３０℃、２１０ｒｐｍで１時間振とうした後、ＤＭ３寒天培地プレートに全量塗布し、３０℃で２～３日間インキュベートした。
Ｆａｂ＿ｃ生産株への１－２で構築したＰＰｌａｓｅ発現用プラスミドの導入は以下に示すプロトプラスト法によって行った。１ｍＬのＬＢ液体培地にグリセロールストックした枯草菌を植菌し、３０℃、２１０ｒｐｍで一晩振とう培養した。翌日、新たな１ｍＬのＬＢ液体培地にこの培養液を１０μＬ植菌し、３７℃、２１０ｒｐｍで約２時間振とう培養した。この培養液を１．５ｍＬチューブに回収し、１，２０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除去したペレットをＬｙｓｏｚｙｍｅ（ＳＩＧＭＡ社製）４ｍｇ／ｍＬを含むＳＭＭＰ５００μＬに懸濁し、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、３，５００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を除去したペレットをＳＭＭＰ４００μＬに懸濁した。この懸濁液３３μＬを各種プラスミドと混合し、さらに４０％ＰＥＧを１００μＬ添加してボルテックスした。この液にＳＭＭＰを３５０μＬ加えて転倒混和し、３０℃、２１０ｒｐｍで１時間振とうした後、ＤＭ３寒天培地プレートに全量塗布し、３０℃で２～３日間インキュベートした。
【0062】
１－５．Ｆａｂ産生
１－４で作製した組換え枯草菌を５００μＬの５０ｐｐｍテトラサイクリンを含むＬＢ培地に植菌し、９６穴プレート内で３０℃で一晩培養し、前培養液とした。前培養液を８００μＬの１５ｐｐｍテトラサイクリンを含む２×Ｌ－ｍａｌ培地に１％接種し、９６穴内で３０℃で７２時間培養した。培養終了時に４℃、３０００ｒｐｍ、２０分間遠心し、上清を回収した。
１－４で作製した組換え枯草菌を５００μＬの５０ｐｐｍテトラサイクリンを含むＬＢ培地に植菌し、９６穴プレート内で３０℃で一晩培養し、前培養液とした。前培養液を８００μＬの１５ｐｐｍテトラサイクリンを含む２×Ｌ－ｍａｌ培地に１％接種し、９６穴内で３０℃で７２時間培養した。培養終了時に４℃、３０００ｒｐｍ、２０分間遠心し、上清を回収した。
【0063】
１－６．ＥＬＩＳＡ法によるＦａｂ生産量の定量
Ｆ９６ Ｃｅｒｔ．Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ（商標）Ｐｌａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の各ウェルに１００μＬの１μｇ／ｍＬ ＴＮＦ－α（Ｗａｋｏ）を添加し、シーリング後、４℃で一晩静置した。ウェルに吸着しなかったＴＮＦ－αを取り除いた後２００μＬのＰＢＳＴ（０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。２％のスキムミルクを含むＰＢＳＴを添加し、室温で１時間インキュベートした。スキムミルクを含むＰＢＳＴを取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴを添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。１－５で回収した培養上清をＰＢＳＴで５０倍に希釈し、さらに２％のスキムミルクを含むＰＢＳＴで１０倍に希釈した。Ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の希釈系列についても同様の希釈操作を実施した。希釈後の溶液をＴＮＦ－αを固相化した各ウェルに対して１００μＬずつ添加し、室温で１時間インキュベートした。希釈した溶液を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴを添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。検出抗体にはＧｏａｔ ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ （Ｈ＋Ｌ） Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＨＲＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。ＰＢＳＴにより検出抗体を１／５，０００に希釈した。各ウェルに１００μＬの検出抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした。検出抗体を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴを添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。発色基質はＯＰＤタブレット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＳｔａｂｌｅ Ｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で溶解し調製した。各ウェルに１００μＬの発色基質を添加し、遮光下で１０分間インキュベートした。１００μＬの０．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸を添加したのち、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒを用いて吸光度４９０ｎｍを測定した。Ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の希釈系列濃度を元にＦａｂ＿ｃ生産量を算出し、ｐＨＹ３００ＰＬＫを導入したＦａｂ＿ｃ生産株に対する相対値を示した（図１）。その結果、ＦｋｐＡ、ＦＫＢＰ＿ｌ、ＦＫＢＰ＿Ｋ、ＦＫＢＰ＿Ｅ、ＦＫＢＰ＿Ｐ、ＭＪＦＫＳ発現用プラスミドを保持したＦａｂ＿ｃ生産株においてＦａｂ＿ｃの生産量が大きく向上することが確認された。枯草菌の内在性因子であるＰｒｓＡ発現用プラスミドを保持したＦａｂ＿ｃ生産株ではＦａｂ＿ｃの生産量が低下した。尚、Ｆａｂ＿ｃは、プロリル結合異性化部位、具体的にはシス型のプロリル結合を有する。
Ｆ９６ Ｃｅｒｔ．Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ（商標）Ｐｌａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の各ウェルに１００μＬの１μｇ／ｍＬ ＴＮＦ－α（Ｗａｋｏ）を添加し、シーリング後、４℃で一晩静置した。ウェルに吸着しなかったＴＮＦ－αを取り除いた後２００μＬのＰＢＳＴ（０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。２％のスキムミルクを含むＰＢＳＴを添加し、室温で１時間インキュベートした。スキムミルクを含むＰＢＳＴを取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴを添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。１－５で回収した培養上清をＰＢＳＴで５０倍に希釈し、さらに２％のスキムミルクを含むＰＢＳＴで１０倍に希釈した。Ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の希釈系列についても同様の希釈操作を実施した。希釈後の溶液をＴＮＦ－αを固相化した各ウェルに対して１００μＬずつ添加し、室温で１時間インキュベートした。希釈した溶液を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴを添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。検出抗体にはＧｏａｔ ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ （Ｈ＋Ｌ） Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＨＲＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。ＰＢＳＴにより検出抗体を１／５，０００に希釈した。各ウェルに１００μＬの検出抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした。検出抗体を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴを添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。発色基質はＯＰＤタブレット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＳｔａｂｌｅ Ｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で溶解し調製した。各ウェルに１００μＬの発色基質を添加し、遮光下で１０分間インキュベートした。１００μＬの０．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸を添加したのち、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒを用いて吸光度４９０ｎｍを測定した。Ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の希釈系列濃度を元にＦａｂ＿ｃ生産量を算出し、ｐＨＹ３００ＰＬＫを導入したＦａｂ＿ｃ生産株に対する相対値を示した（図１）。その結果、ＦｋｐＡ、ＦＫＢＰ＿ｌ、ＦＫＢＰ＿Ｋ、ＦＫＢＰ＿Ｅ、ＦＫＢＰ＿Ｐ、ＭＪＦＫＳ発現用プラスミドを保持したＦａｂ＿ｃ生産株においてＦａｂ＿ｃの生産量が大きく向上することが確認された。枯草菌の内在性因子であるＰｒｓＡ発現用プラスミドを保持したＦａｂ＿ｃ生産株ではＦａｂ＿ｃの生産量が低下した。尚、Ｆａｂ＿ｃは、プロリル結合異性化部位、具体的にはシス型のプロリル結合を有する。
【0064】
１－７．ウエスタンブロッティングによるＦａｂ生産の確認
１－５で得られた培養上清をＬａｅｍｍｌｉ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を等量混和後、９９℃で５分間熱処理してサンプルを調製した。ゲルはＡｎｙ ｋＤＴＭ Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ ＴＧＸＴＭ Ｐｒｅｃａｓｔ Ｇｅｌ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を用いた。各ウェルに５μＬのサンプルをアプライした後に２１０Ｖで５分間泳動した。分子量マーカーにはＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｂｌｕｅ ｓｔａｎｄａｒｄ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を用い、Ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）も標品として同時に泳動した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルから、Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ Ｍｉｎｉ ＰＶＤＦ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｐａｃｋｓ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）、及びＴｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を用いてタンパク質をＰＶＤＦ膜へ転写した。抗体はＧｏａｔ ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ （Ｈ＋Ｌ） Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＨＲＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、抗体反応にはｉＢｉｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて目的タンパク質を検出した（図２）。１－６に示したＥＬＩＳＡ法での定量と同様にＦｋｐＡ発現用プラスミドを保持したＦａｂ＿ｃ生産株においてｐＨＹ３００ＰＬＫを導入したＦａｂ＿ｃ生産株よりも生産性が向上していることが確認された。ＰｒｓＡ発現用プラスミドを保持したＦａｂ＿ｃ生産株においてｐＨＹ３００ＰＬＫを導入したＦａｂ＿ｃ生産株よりも生産性が低下していることも確認された。
１－５で得られた培養上清をＬａｅｍｍｌｉ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を等量混和後、９９℃で５分間熱処理してサンプルを調製した。ゲルはＡｎｙ ｋＤＴＭ Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ ＴＧＸＴＭ Ｐｒｅｃａｓｔ Ｇｅｌ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を用いた。各ウェルに５μＬのサンプルをアプライした後に２１０Ｖで５分間泳動した。分子量マーカーにはＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｂｌｕｅ ｓｔａｎｄａｒｄ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を用い、Ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）も標品として同時に泳動した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルから、Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ Ｍｉｎｉ ＰＶＤＦ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｐａｃｋｓ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）、及びＴｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を用いてタンパク質をＰＶＤＦ膜へ転写した。抗体はＧｏａｔ ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ （Ｈ＋Ｌ） Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＨＲＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、抗体反応にはｉＢｉｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて目的タンパク質を検出した（図２）。１－６に示したＥＬＩＳＡ法での定量と同様にＦｋｐＡ発現用プラスミドを保持したＦａｂ＿ｃ生産株においてｐＨＹ３００ＰＬＫを導入したＦａｂ＿ｃ生産株よりも生産性が向上していることが確認された。ＰｒｓＡ発現用プラスミドを保持したＦａｂ＿ｃ生産株においてｐＨＹ３００ＰＬＫを導入したＦａｂ＿ｃ生産株よりも生産性が低下していることも確認された。
【0065】
実施例２ 高生産化に必要なドメインの検証
２－１．各ドメイン発現用プラスミドの設計
１－２で構築したＦｋｐＡ発現用プラスミドをテンプレートとし配列番号６３と配列番号６４、配列番号６５と配列番号６６のプライマーセットとＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）を用いたＰＣＲによりＦｋｐＡのＣ末端領域またはＮ末端領域を除去し、ＦｋｐＡのＮ末端領域（配列番号６７）を発現するＦｋｐＡ＿Ｎ発現用プラスミドとＣ末端領域（配列番号６８）を発現するＦｋｐＡ＿Ｃ発現用プラスミドをそれぞれ得た。
２－１．各ドメイン発現用プラスミドの設計
１－２で構築したＦｋｐＡ発現用プラスミドをテンプレートとし配列番号６３と配列番号６４、配列番号６５と配列番号６６のプライマーセットとＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）を用いたＰＣＲによりＦｋｐＡのＣ末端領域またはＮ末端領域を除去し、ＦｋｐＡのＮ末端領域（配列番号６７）を発現するＦｋｐＡ＿Ｎ発現用プラスミドとＣ末端領域（配列番号６８）を発現するＦｋｐＡ＿Ｃ発現用プラスミドをそれぞれ得た。
【0066】
２－２．枯草菌へのＰＰＩａｓｅ発現用プラスミドの導入
Ｆａｂ＿ｃ生産株への２－１で構築した各ドメイン発現用プラスミドの導入は１－４に示すプロトプラスト法によって行った。
Ｆａｂ＿ｃ生産株への２－１で構築した各ドメイン発現用プラスミドの導入は１－４に示すプロトプラスト法によって行った。
【0067】
２－３．Ｆａｂ産生
２－２で作製した組換え枯草菌を５００μＬの５０ｐｐｍテトラサイクリンを含むＬＢ培地に植菌し、９６穴プレート内で３０℃で一晩培養し、前培養液とした。前培養液を８００μＬの１５ｐｐｍテトラサイクリンを含む２×Ｌ－ｍａｌ培地に１％接種し、９６穴内で３０℃で７２時間培養した。培養終了時に４℃、３０００ｒｐｍ、２０分間遠心し、上清を回収した。
２－２で作製した組換え枯草菌を５００μＬの５０ｐｐｍテトラサイクリンを含むＬＢ培地に植菌し、９６穴プレート内で３０℃で一晩培養し、前培養液とした。前培養液を８００μＬの１５ｐｐｍテトラサイクリンを含む２×Ｌ－ｍａｌ培地に１％接種し、９６穴内で３０℃で７２時間培養した。培養終了時に４℃、３０００ｒｐｍ、２０分間遠心し、上清を回収した。
【0068】
２－４．ＥＬＩＳＡ法によるＦａｂ生産量の定量
Ｆａｂ＿ｃの生産量を１－６に示すＥＬＩＳＡ法によって定量した。Ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の希釈系列濃度を元にＦａｂ＿ｃ生産量を算出し、ｐＨＹ３００ＰＬＫを導入したＦａｂ＿ｃ生産株に対する相対値を示した（図３）。その結果、枯草菌生産系において大きな生産性向上効果を得るためには、ＦｋｐＡのＮ末端領域とＣ末端領域を共に発現する必要があることが確認された。
Ｆａｂ＿ｃの生産量を１－６に示すＥＬＩＳＡ法によって定量した。Ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の希釈系列濃度を元にＦａｂ＿ｃ生産量を算出し、ｐＨＹ３００ＰＬＫを導入したＦａｂ＿ｃ生産株に対する相対値を示した（図３）。その結果、枯草菌生産系において大きな生産性向上効果を得るためには、ＦｋｐＡのＮ末端領域とＣ末端領域を共に発現する必要があることが確認された。
【0069】
実施例３ ＰＰＩａｓｅの局在箇所によるタンパク質高生産化効果の検証
３－１．Ｆａｂ発現用プラスミドの構築
ｐＨＹ３００ＰＬＫをベースとして作製された組換えプラスミドｐＨＹ－Ｓ２３７（特開２０１４－１５８４３０号公報）をテンプレートとし、配列番号７と配列番号８のプライマーセットとＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）を用いたＰＣＲによりプラスミド配列を増幅した。１６８株のゲノムをテンプレートとし、配列番号９と配列番号１０のプライマーセットを用いたＰＣＲによりｓｐｏＶＧ遺伝子由来のプロモーターＤＮＡを増幅した。得られたプロモーターＤＮＡを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いてプラスミド配列に組み込んだ。得られたプラスミドをテンプレートとし、配列番号１１と配列番号１３のプライマーセットを用いたＰＣＲによりプラスミド配列を増幅した。配列番号６９と配列番号７０に示す重鎖及び軽鎖からなるＦａｂ＿ｌ（リゾチームに対するＦａｂ）をオペロンで発現可能な配列番号７１に示す塩基配列をサーモフィッシャー社で人工合成し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いてプラスミド配列に組み込むことでＦａｂ＿ｌ発現用プラスミドを構築した。
３－１．Ｆａｂ発現用プラスミドの構築
ｐＨＹ３００ＰＬＫをベースとして作製された組換えプラスミドｐＨＹ－Ｓ２３７（特開２０１４－１５８４３０号公報）をテンプレートとし、配列番号７と配列番号８のプライマーセットとＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）を用いたＰＣＲによりプラスミド配列を増幅した。１６８株のゲノムをテンプレートとし、配列番号９と配列番号１０のプライマーセットを用いたＰＣＲによりｓｐｏＶＧ遺伝子由来のプロモーターＤＮＡを増幅した。得られたプロモーターＤＮＡを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いてプラスミド配列に組み込んだ。得られたプラスミドをテンプレートとし、配列番号１１と配列番号１３のプライマーセットを用いたＰＣＲによりプラスミド配列を増幅した。配列番号６９と配列番号７０に示す重鎖及び軽鎖からなるＦａｂ＿ｌ（リゾチームに対するＦａｂ）をオペロンで発現可能な配列番号７１に示す塩基配列をサーモフィッシャー社で人工合成し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いてプラスミド配列に組み込むことでＦａｂ＿ｌ発現用プラスミドを構築した。
【0070】
３－２．ＰＰＩａｓｅ発現株の構築
１６８株のゲノムをテンプレートとし、配列番号７２と配列番号７３、配列番号７４と配列番号７５、配列番号７６と配列番号７７のプライマーセットを用いたＰＣＲによりｂｇｌＰ遺伝子領域を含むＤＮＡ断片（Ａ）、ｙｘｘＥ遺伝子領域を含むＤＮＡ断片（Ｂ）、ｓｐｏＶＧ遺伝子由来のプロモーターＤＮＡ（Ｃ）を増幅した。プラスミドｐＣ１９４ ＤＮＡを鋳型とし、配列番号５５と配列番号５６のプライマーセットを用いたＰＣＲによりクロラムフェニコール耐性遺伝子領域（Ｄ）を増幅した。大腸菌ＤＨ５αのゲノムを鋳型とし配列番号７８と配列番号７９、配列番号７９と配列番号８０のプライマーセットを用いたＰＣＲにより分泌シグナル又は膜上にタンパク質をアンカーするためのシグナルを連結したＦｋｐＡをコードするＤＮＡを増幅した（Ｅ）（Ｅ’）。上記（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）（Ｄ）（Ｅ）または（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）（Ｄ）（Ｅ’）の５断片を混合して鋳型とし、配列番号７２と配列番号７５のプライマーセットを用いたＳＯＥ－ＰＣＲを行うことによって、５断片を連結しＦｋｐＡを分泌又は膜にアンカーして発現するゲノム組み込み用のＤＮＡ断片を得た。得られたゲノム組み込み用のＤＮＡ断片を用いてコンピテントセル法により枯草菌Ｄｐｒ９ΔｓｉｇＦ株を形質転換した。形質転換後、クロラムフェニコール（１０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。このようにして得られたＦｋｐＡを分泌発現可能な菌株をＦｋｐＡ＿ｐ株、ＦｋｐＡを膜にアンカーして発現可能な菌株をＦｋｐＡ＿ｍ株と命名した。
１６８株のゲノムをテンプレートとし、配列番号７２と配列番号７３、配列番号７４と配列番号７５、配列番号７６と配列番号７７のプライマーセットを用いたＰＣＲによりｂｇｌＰ遺伝子領域を含むＤＮＡ断片（Ａ）、ｙｘｘＥ遺伝子領域を含むＤＮＡ断片（Ｂ）、ｓｐｏＶＧ遺伝子由来のプロモーターＤＮＡ（Ｃ）を増幅した。プラスミドｐＣ１９４ ＤＮＡを鋳型とし、配列番号５５と配列番号５６のプライマーセットを用いたＰＣＲによりクロラムフェニコール耐性遺伝子領域（Ｄ）を増幅した。大腸菌ＤＨ５αのゲノムを鋳型とし配列番号７８と配列番号７９、配列番号７９と配列番号８０のプライマーセットを用いたＰＣＲにより分泌シグナル又は膜上にタンパク質をアンカーするためのシグナルを連結したＦｋｐＡをコードするＤＮＡを増幅した（Ｅ）（Ｅ’）。上記（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）（Ｄ）（Ｅ）または（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）（Ｄ）（Ｅ’）の５断片を混合して鋳型とし、配列番号７２と配列番号７５のプライマーセットを用いたＳＯＥ－ＰＣＲを行うことによって、５断片を連結しＦｋｐＡを分泌又は膜にアンカーして発現するゲノム組み込み用のＤＮＡ断片を得た。得られたゲノム組み込み用のＤＮＡ断片を用いてコンピテントセル法により枯草菌Ｄｐｒ９ΔｓｉｇＦ株を形質転換した。形質転換後、クロラムフェニコール（１０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。このようにして得られたＦｋｐＡを分泌発現可能な菌株をＦｋｐＡ＿ｐ株、ＦｋｐＡを膜にアンカーして発現可能な菌株をＦｋｐＡ＿ｍ株と命名した。
【0071】
３－３．枯草菌へのＦａｂ発現用プラスミドの導入
ＦｋｐＡ＿ｐ株及びＦｋｐＡ＿ｍ株への３－１で構築したＦａｂ＿ｌ発現用プラスミドの導入は１－４に示すプロトプラスト法によって行った。
ＦｋｐＡ＿ｐ株及びＦｋｐＡ＿ｍ株への３－１で構築したＦａｂ＿ｌ発現用プラスミドの導入は１－４に示すプロトプラスト法によって行った。
【0072】
３－４．Ｆａｂ産生
３－３で作製した組換え枯草菌を５００μＬの５０ｐｐｍテトラサイクリンを含むＬＢ培地に植菌し、９６穴プレート内で３０℃で一晩培養し、前培養液とした。前培養液を８００μＬの１５ｐｐｍテトラサイクリンを含む２×Ｌ－ｍａｌ培地に１％接種し、９６穴内で３０℃で７２時間培養した。培養終了時に４℃、３０００ｒｐｍ、２０分間遠心し、上清を回収した。
３－３で作製した組換え枯草菌を５００μＬの５０ｐｐｍテトラサイクリンを含むＬＢ培地に植菌し、９６穴プレート内で３０℃で一晩培養し、前培養液とした。前培養液を８００μＬの１５ｐｐｍテトラサイクリンを含む２×Ｌ－ｍａｌ培地に１％接種し、９６穴内で３０℃で７２時間培養した。培養終了時に４℃、３０００ｒｐｍ、２０分間遠心し、上清を回収した。
【0073】
３－５．ＥＬＩＳＡ法によるＦａｂ生産量の定量
Ｆ９６ Ｃｅｒｔ．Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ（商標）Ｐｌａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の各ウェルに１００μＬの１００μｇ／ｍＬ Ｌｙｓｏｚｙｍｅ，ｆｒｏｍ Ｅｇｇ Ｗｈｉｔｅ（Ｗａｋｏ）を添加し、シーリング後、４℃で一晩静置した。ウェルに吸着しなかったＬｙｓｏｚｙｍｅを取り除いた後２００μＬのＰＢＳＴ（０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。２％のスキムミルクを含むＰＢＳＴを添加し、室温で１時間インキュベートした。スキムミルクを含むＰＢＳＴを取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴを添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。３－４で回収した培養上清を２％のスキムミルクを含むＰＢＳＴで１０倍に希釈した。希釈後の溶液をＬｙｓｏｚｙｍｅを固相化した各ウェルに対して１００μＬずつ添加し、室温で１時間インキュベートした。希釈した溶液を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴを添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。検出抗体にはＭｏｕｓｅ ＩｇＧ Ｆａｂ Ａｎｔｉｂｏｄｙ：ＨＲＰ（ｂｉｏｖａｌｌｅｙ）を用いた。ＰＢＳＴにより検出抗体を１／５，０００に希釈した。各ウェルに１００μＬの検出抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした。検出抗体を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴを添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。発色基質はＯＰＤタブレット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＳｔａｂｌｅ Ｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で溶解し調製した。各ウェルに１００μＬの発色基質を添加し、遮光下で２０分間インキュベートした。１００μＬの０．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸を添加したのち、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒを用いて吸光度４９０ｎｍを測定した。得られた吸光度のＦａｂ＿ｌ発現用プラスミドをＤｐｒ９ΔｓｉｇＦに導入した株に対する相対値を示した（図４）。その結果、枯草菌は細胞膜付近でタンパク質を折りたたむことが知られているにも関わらず、ＦｋｐＡを膜にアンカーして発現するよりも分泌発現させる方が目的タンパク質の高生産化に寄与することが明らかとなった。尚、Ｆａｂ＿ｌは、プロリル結合異性化部位、具体的にはシス型のプロリル結合を有する。
Ｆ９６ Ｃｅｒｔ．Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ（商標）Ｐｌａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の各ウェルに１００μＬの１００μｇ／ｍＬ Ｌｙｓｏｚｙｍｅ，ｆｒｏｍ Ｅｇｇ Ｗｈｉｔｅ（Ｗａｋｏ）を添加し、シーリング後、４℃で一晩静置した。ウェルに吸着しなかったＬｙｓｏｚｙｍｅを取り除いた後２００μＬのＰＢＳＴ（０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。２％のスキムミルクを含むＰＢＳＴを添加し、室温で１時間インキュベートした。スキムミルクを含むＰＢＳＴを取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴを添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。３－４で回収した培養上清を２％のスキムミルクを含むＰＢＳＴで１０倍に希釈した。希釈後の溶液をＬｙｓｏｚｙｍｅを固相化した各ウェルに対して１００μＬずつ添加し、室温で１時間インキュベートした。希釈した溶液を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴを添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。検出抗体にはＭｏｕｓｅ ＩｇＧ Ｆａｂ Ａｎｔｉｂｏｄｙ：ＨＲＰ（ｂｉｏｖａｌｌｅｙ）を用いた。ＰＢＳＴにより検出抗体を１／５，０００に希釈した。各ウェルに１００μＬの検出抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした。検出抗体を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴを添加し、すぐに取り除いた。この洗浄操作は３回行った。発色基質はＯＰＤタブレット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＳｔａｂｌｅ Ｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で溶解し調製した。各ウェルに１００μＬの発色基質を添加し、遮光下で２０分間インキュベートした。１００μＬの０．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸を添加したのち、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒを用いて吸光度４９０ｎｍを測定した。得られた吸光度のＦａｂ＿ｌ発現用プラスミドをＤｐｒ９ΔｓｉｇＦに導入した株に対する相対値を示した（図４）。その結果、枯草菌は細胞膜付近でタンパク質を折りたたむことが知られているにも関わらず、ＦｋｐＡを膜にアンカーして発現するよりも分泌発現させる方が目的タンパク質の高生産化に寄与することが明らかとなった。尚、Ｆａｂ＿ｌは、プロリル結合異性化部位、具体的にはシス型のプロリル結合を有する。
【0074】
実施例４ ＰＰＩａｓｅ発現によるタンパク質高生産化
４－１．ＲＮａｓｅＴ１発現用プラスミドの構築
ＲＮａｓｅＴ１（配列番号１００）のアミノ酸配列をコードする配列番号１０１に示す塩基配列をＧｅｎｅｓｃｒｉｐｔ社のＧｅｎＰｌｕｓクローニングによって１－１で構築したＰＰＩａｓｅ発現用プラスミドの配列番号４９と配列番号５０に示す領域の間に組み込む形で合成し、ＲＮａｓｅＴ１発現用プラスミドを得た。
４－１．ＲＮａｓｅＴ１発現用プラスミドの構築
ＲＮａｓｅＴ１（配列番号１００）のアミノ酸配列をコードする配列番号１０１に示す塩基配列をＧｅｎｅｓｃｒｉｐｔ社のＧｅｎＰｌｕｓクローニングによって１－１で構築したＰＰＩａｓｅ発現用プラスミドの配列番号４９と配列番号５０に示す領域の間に組み込む形で合成し、ＲＮａｓｅＴ１発現用プラスミドを得た。
【0075】
４－２．ＰＰｌａｓｅ発現株へのＲＮａｓｅＴ１発現用プラスミドの導入
枯草菌Ｄｐｒ９ΔｓｉｇＦ株及び３－２で構築したＦｋｐＡ＿ｐ株へのＲＮａｓｅＴ１発現用プラスミドの導入は１－４に示すプロトプラスト法によって行った。
枯草菌Ｄｐｒ９ΔｓｉｇＦ株及び３－２で構築したＦｋｐＡ＿ｐ株へのＲＮａｓｅＴ１発現用プラスミドの導入は１－４に示すプロトプラスト法によって行った。
【0076】
４－３．ＲＮａｓｅＴ１産生
４－２で作製した組換え枯草菌を５００μＬの５０ｐｐｍテトラサイクリンを含むＬＢ培地に植菌し、９６穴プレート内で３０℃で一晩培養し、前培養液とした。前培養液を８００μＬの１５ｐｐｍテトラサイクリンを含む２×Ｌ－ｍａｌ培地に１％接種し、９６穴内で３０℃で７２時間培養した。培養終了時に４℃、３０００ｒｐｍ、２０分間遠心し、上清を回収した。
４－２で作製した組換え枯草菌を５００μＬの５０ｐｐｍテトラサイクリンを含むＬＢ培地に植菌し、９６穴プレート内で３０℃で一晩培養し、前培養液とした。前培養液を８００μＬの１５ｐｐｍテトラサイクリンを含む２×Ｌ－ｍａｌ培地に１％接種し、９６穴内で３０℃で７２時間培養した。培養終了時に４℃、３０００ｒｐｍ、２０分間遠心し、上清を回収した。
【0077】
４－４．ＳＤＳ－ＰＡＧＥによるＲＮａｓｅＴ１生産量の定量
４－３で回収した培養上清とＬａｅｍｍｌｉ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を等量混和後、９９℃で５分間熱処理してサンプルを調製した。ゲルはＭｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＩＮ ＴＧＸ Ｓｔａｉｎ－Ｆｒｅｅ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を用いた。各ウェルに５μＬのサンプルをアプライし、２１０Ｖで２５分間泳動した。分子量マーカーにはＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ ｓｔａｎｄａｒｄ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を用いた。ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＭＰ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍでタンパク質のバンドを検出した。リゾチーム標品（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）をもとに作成した検量線によって検出したタンパク質を定量した（表１）。その結果、ＰＰＩａｓｅの発現によりＲＮａｓｅＴ１の生産量が大きく向上することが確認された。尚、ＲＮａｓｅＴ１は、プロリル結合異性化部位、具体的にはシス型のプロリル結合を有する。
４－３で回収した培養上清とＬａｅｍｍｌｉ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を等量混和後、９９℃で５分間熱処理してサンプルを調製した。ゲルはＭｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＩＮ ＴＧＸ Ｓｔａｉｎ－Ｆｒｅｅ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を用いた。各ウェルに５μＬのサンプルをアプライし、２１０Ｖで２５分間泳動した。分子量マーカーにはＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ ｓｔａｎｄａｒｄ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を用いた。ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＭＰ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍでタンパク質のバンドを検出した。リゾチーム標品（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）をもとに作成した検量線によって検出したタンパク質を定量した（表１）。その結果、ＰＰＩａｓｅの発現によりＲＮａｓｅＴ１の生産量が大きく向上することが確認された。尚、ＲＮａｓｅＴ１は、プロリル結合異性化部位、具体的にはシス型のプロリル結合を有する。
【0078】
【表1】
【0079】
参考例１ ＨＭＭプロファイルを用いたＢＣＦＫクレードに属するＰＰＩａｓｅ配列群の特定
・ＦＫＢＰの系統解析
表２に示すＰｆａｍにＰＦ００２５４ファミリーのＳｅｅｄ配列として登録されているＦＫＢＰ配列群に配列番号８１に示すＦｋｐＡ配列を追加した配列群を用いて系統解析を行った。ＭＡＦＦＴ ｖ７．４７１のデフォルトパラメーターを用いてマルチプルアラインメントを構築したのち、ｔｒｉｍＡｌ ｖ１．４．ｒｅｖ１５によって保存領域を抽出し、ＭｏｄｅｌＴｅｓｔ－ＮＧ ｖ０．１．７を用いて進化モデルを選択した。系統解析にはＩＱ－ＴＲＥＥ ｍｕｌｔｉｃｏｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０．３を用い、進化モデルにはＬＧ＋Ｇ４＋Ｆを指定した。Ｆｉｇｔｒｅｅ（http://tree.bio.ed.ac.uk/software/FigTree/）を用いて可視化した系統樹を図５に示す。図５のＢＣＦＫクレードに属するＦＫＢＰ配列群のＵｎｉｐｒｏｔ番号を表３に示す。
・ＦＫＢＰの系統解析
表２に示すＰｆａｍにＰＦ００２５４ファミリーのＳｅｅｄ配列として登録されているＦＫＢＰ配列群に配列番号８１に示すＦｋｐＡ配列を追加した配列群を用いて系統解析を行った。ＭＡＦＦＴ ｖ７．４７１のデフォルトパラメーターを用いてマルチプルアラインメントを構築したのち、ｔｒｉｍＡｌ ｖ１．４．ｒｅｖ１５によって保存領域を抽出し、ＭｏｄｅｌＴｅｓｔ－ＮＧ ｖ０．１．７を用いて進化モデルを選択した。系統解析にはＩＱ－ＴＲＥＥ ｍｕｌｔｉｃｏｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０．３を用い、進化モデルにはＬＧ＋Ｇ４＋Ｆを指定した。Ｆｉｇｔｒｅｅ（http://tree.bio.ed.ac.uk/software/FigTree/）を用いて可視化した系統樹を図５に示す。図５のＢＣＦＫクレードに属するＦＫＢＰ配列群のＵｎｉｐｒｏｔ番号を表３に示す。
【0080】
【表2】
【0081】
【表3】
【0082】
（２）ＢＣＦＫクレードに属するＦＫＢＰ配列群の特定
表３に示すＢＣＦＫクレードに属するＦＫＢＰ配列群をＦａｓｔａ形式でまとめたファイルＢＣＦＫ．ｆａｓｔａを用意した。ＭＡＦＦＴ ｖ７．４７１でｍａｆｆｔ ――ａｕｔｏ ＢＣＦＫ＿ｍａｆｆｔ．ｆａｓｔａ＞ＢＣＦＫ．ｆａｓｔａのコマンドを実行し、マルチプルアラインメントを構築した。次に、ＨＭＭＥＲ バージョン３．３．２を用いて、ｈｍｍｂｕｉｌｄ ――ｐｎｏｎｅ ――ｗｎｏｎｅ ＢＣＦＫ＿ｍａｆｆｔ．ｈｍｍ ＢＣＦＫ＿ｍａｆｆｔ．ｆａｓｔａのコマンドを実行し、図６に示すＨＭＭプロファイルを作成し、さらにｈｍｍｐｒｅｓｓ ＢＣＦＫ＿ｍａｆｆｔ．ｈｍｍのコマンドを実行してバイナリ化した。表２に含まれるＦＫＢＰ配列群のうち、ＢＣＦＫクレードに属さないＦＫＢＰ配列群をＦａｓｔａ形式でまとめたファイルＮｏ＿ＢＣＦＫ．Ｆａｓｔａを用意した。ｈｍｍｓｃａｎ ――ｔｂｌｏｕｔ ＢＣＦＫ．ｔｂｌｏｕｔ ＢＣＦＫ＿ｍａｆｆｔ．ｈｍｍ Ｎｏ＿ＢＣＦＫ．Ｆａｓｔａのコマンドを実行することで、ＢＣＦＫクレードを定義するＨＭＭプロファイルに対してＦＫＢＰ配列のうち、ＢＣＦＫクレードに含まれない配列の相同性検索を行った。その結果、ＢＣＦＫクレードに含まれない配列は全て１１２．３以下のＨＭＭスコアとなることが確認された。次に、配列番号１８、８１～９３で表されるＰＰＩａｓｅ（ＰｒｓＡ、ＦｋｐＡ、ＦＫＢＰ＿ｌ、ＦＫＢＰ＿Ｋ、ＦＫＢＰ＿Ｅ、ＦＫＢＰ＿Ｐ、ＭＪＦＫＳ、ＳｕｒＡ、ＰｐｉＡ、Ｔｉｇ、ＦＫＢＰ２、ＦＫ１５３、ＦＫＢＰ５２、ＣｙＰ４０）配列をＦａｓｔａ形式でまとめたファイルＥｘｐｒｅｓｓ＿ＰＰＩａｓｅ．Ｆａｓｔａを用意した。ｈｍｍｓｃａｎ ――ｔｂｌｏｕｔ ＢＣＦＫ．ｔｂｌｏｕｔ ＢＣＦＫ＿ｍａｆｆｔ．ｈｍｍ Ｅｘｐｒｅｓｓ＿ＰＰＩａｓｅ．Ｆａｓｔａのコマンドを実行することで、ＢＣＦＫクレードを定義するＨＭＭプロファイルに対して実施例１に記載のＰＰＩａｓｅ配列の相同性検索を行った。相同性が見られない配列のＨＭＭスコアは０として示した。結果を表４に示す。実施例１の１－６で高い生産性向上効果を示したＦｋｐＡ、ＦＫＢＰ＿ｌ、ＦＫＢＰ＿Ｋ、ＦＫＢＰ＿Ｅ、ＦＫＢＰ＿Ｐは１５０以上のＨＭＭスコアを持っており、ＢＣＦＫクレードに属するＦＫＢＰ配列であると言える。このように任意のＰＰＩａｓｅ配列がＢＣＦＫクレードに属するＰＰＩａｓｅ配列かどうかを確認することができる。
表３に示すＢＣＦＫクレードに属するＦＫＢＰ配列群をＦａｓｔａ形式でまとめたファイルＢＣＦＫ．ｆａｓｔａを用意した。ＭＡＦＦＴ ｖ７．４７１でｍａｆｆｔ ――ａｕｔｏ ＢＣＦＫ＿ｍａｆｆｔ．ｆａｓｔａ＞ＢＣＦＫ．ｆａｓｔａのコマンドを実行し、マルチプルアラインメントを構築した。次に、ＨＭＭＥＲ バージョン３．３．２を用いて、ｈｍｍｂｕｉｌｄ ――ｐｎｏｎｅ ――ｗｎｏｎｅ ＢＣＦＫ＿ｍａｆｆｔ．ｈｍｍ ＢＣＦＫ＿ｍａｆｆｔ．ｆａｓｔａのコマンドを実行し、図６に示すＨＭＭプロファイルを作成し、さらにｈｍｍｐｒｅｓｓ ＢＣＦＫ＿ｍａｆｆｔ．ｈｍｍのコマンドを実行してバイナリ化した。表２に含まれるＦＫＢＰ配列群のうち、ＢＣＦＫクレードに属さないＦＫＢＰ配列群をＦａｓｔａ形式でまとめたファイルＮｏ＿ＢＣＦＫ．Ｆａｓｔａを用意した。ｈｍｍｓｃａｎ ――ｔｂｌｏｕｔ ＢＣＦＫ．ｔｂｌｏｕｔ ＢＣＦＫ＿ｍａｆｆｔ．ｈｍｍ Ｎｏ＿ＢＣＦＫ．Ｆａｓｔａのコマンドを実行することで、ＢＣＦＫクレードを定義するＨＭＭプロファイルに対してＦＫＢＰ配列のうち、ＢＣＦＫクレードに含まれない配列の相同性検索を行った。その結果、ＢＣＦＫクレードに含まれない配列は全て１１２．３以下のＨＭＭスコアとなることが確認された。次に、配列番号１８、８１～９３で表されるＰＰＩａｓｅ（ＰｒｓＡ、ＦｋｐＡ、ＦＫＢＰ＿ｌ、ＦＫＢＰ＿Ｋ、ＦＫＢＰ＿Ｅ、ＦＫＢＰ＿Ｐ、ＭＪＦＫＳ、ＳｕｒＡ、ＰｐｉＡ、Ｔｉｇ、ＦＫＢＰ２、ＦＫ１５３、ＦＫＢＰ５２、ＣｙＰ４０）配列をＦａｓｔａ形式でまとめたファイルＥｘｐｒｅｓｓ＿ＰＰＩａｓｅ．Ｆａｓｔａを用意した。ｈｍｍｓｃａｎ ――ｔｂｌｏｕｔ ＢＣＦＫ．ｔｂｌｏｕｔ ＢＣＦＫ＿ｍａｆｆｔ．ｈｍｍ Ｅｘｐｒｅｓｓ＿ＰＰＩａｓｅ．Ｆａｓｔａのコマンドを実行することで、ＢＣＦＫクレードを定義するＨＭＭプロファイルに対して実施例１に記載のＰＰＩａｓｅ配列の相同性検索を行った。相同性が見られない配列のＨＭＭスコアは０として示した。結果を表４に示す。実施例１の１－６で高い生産性向上効果を示したＦｋｐＡ、ＦＫＢＰ＿ｌ、ＦＫＢＰ＿Ｋ、ＦＫＢＰ＿Ｅ、ＦＫＢＰ＿Ｐは１５０以上のＨＭＭスコアを持っており、ＢＣＦＫクレードに属するＦＫＢＰ配列であると言える。このように任意のＰＰＩａｓｅ配列がＢＣＦＫクレードに属するＰＰＩａｓｅ配列かどうかを確認することができる。
【0083】
【表4】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6-1】
【図6-2】
【図6-3】
【図6-4】
【図6-5】
【図6-6】
【図6-7】
【図6-8】
【図6-9】
【図6-10】
【配列表】