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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2021-12-07
(45)【発行日】2022-01-12
(54)【発明の名称】細胞塊を集合させる方法及び細胞塊を集合させる装置
(51)【国際特許分類】
C12N 5/077 20100101AFI20220104BHJP
C12M 3/00 20060101ALI20220104BHJP
【ＦＩ】
C12N5/077
C12M3/00 A
【請求項の数】
9
(21)【出願番号】P 2019557352
(86)(22)【出願日】2018-11-30
(86)【国際出願番号】 JP2018044196
(87)【国際公開番号】W WO2019107546
(87)【国際公開日】2019-06-06
【審査請求日】2020-03-19
(31)【優先権主張番号】P 2017230609
(32)【優先日】2017-11-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】505155528
【氏名又は名称】公立大学法人横浜市立大学
(73)【特許権者】
【識別番号】503361400
【氏名又は名称】国立研究開発法人宇宙航空研究開発機構
(74)【代理人】
【識別番号】100106909
【弁理士】
【氏名又は名称】棚井 澄雄
(74)【代理人】
【識別番号】100161702
【弁理士】
【氏名又は名称】橋本 宏之
(74)【代理人】
【識別番号】100188592
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 洋
(74)【代理人】
【識別番号】100181124
【弁理士】
【氏名又は名称】沖田 壮男
(74)【代理人】
【識別番号】100163496
【弁理士】
【氏名又は名称】荒 則彦
(72)【発明者】
【氏名】谷口 英樹
(72)【発明者】
【氏名】田所 友美
(72)【発明者】
【氏名】坂下 哲也
(72)【発明者】
【氏名】松本 聡
(72)【発明者】
【氏名】足立 聡
(72)【発明者】
【氏名】東端 晃
【審査官】野村 英雄
(56)【参考文献】
【文献】特開２００６－３０４７９１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００３－０７０４５８（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許第０４２０８４８３（ＵＳ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１４／１４８５９２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２００９－０７７７０８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００８－２３７２０３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００２－０４５１７３（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１０／１４３６５１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１３／０７７４２３（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／００－ ７／０８
Ｃ１２Ｍ １／００－ ３／１０
Ｃ１２Ｑ １／００－ ３／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
液体培地を含み生体適合性を有する比重調整液と、前記比重調整液よりも比重が小さい細胞塊と、が収容された回転体を回転させて前記細胞塊を集合させる細胞塊集合工程を行う細胞塊を集合させる方法。
【請求項2】
前記細胞塊集合工程では、前記回転体を前記回転体の中心軸周りに回転させて、前記中心軸の周辺に前記細胞塊を集合させる請求項１に記載の細胞塊を集合させる方法。
【請求項3】
前記回転体の前記中心軸上に母材を配置した状態で、前記細胞塊集合工程を行う請求項２に記載の細胞塊を集合させる方法。
【請求項4】
前記母材内に液体培地を供給させながら、前記細胞塊集合工程を行う請求項３に記載の細胞塊を集合させる方法。
【請求項5】
前記回転体を回転させて、前記回転体内の空気を前記母材上に集約して前記母材を通して前記回転体内から前記空気を除去する脱気工程を行う請求項３又は４に記載の細胞塊を集合させる方法。
【請求項6】
前記脱気工程は、前記細胞塊集合工程よりも前に行う請求項５に記載の細胞塊を集合させる方法。
【請求項7】
前記母材は人工血管又は再生血管である請求項３から６のいずれか１項に記載の細胞塊を集合させる方法。
【請求項8】
液体培地を含み生体適合性を有する比重調整液と、前記比重調整液よりも比重が小さい細胞塊と、が収容される回転体と、
前記回転体の中心軸上に互いの間に隙間を形成して配置され、母材の各端部を取付けるための第１取付け部及び第２取付け部と、
を備える細胞塊を集合させる装置。
【請求項9】
前記母材内に液体培地を供給させる供給部を備え、
前記供給部は、
本体と、
前記本体により第２液体媒体が供給される供給配管と、
前記第２液体媒体を前記本体内に戻す排出配管と、
を有し、
前記供給配管及び前記排出配管は、前記取付け部に連通する請求項８に記載の細胞塊を集合させる装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細胞塊を集合させる方法及び細胞塊を集合させる装置に関する。
本願は、２０１７年１１月３０日に、日本に出願された特願２０１７－２３０６０９号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
本願は、２０１７年１１月３０日に、日本に出願された特願２０１７－２３０６０９号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【0002】
従来、液体培地（比重調整液）内で細胞塊（スフェロイド、オルガノイド）に対して様々な処理を行うことが検討されている。
例えば、特許文献１に記載された細胞の培養装置（以下、培養装置とも略して言う）は、ガス交換機能を備えた１軸式の回転式バイオリアクターである。培養装置では、横向きの円筒形バイオリアクター内に液体培地が満たされている。液体培地に細胞（細胞塊）を播種した後で、バイオリアクターの水平軸方向に沿ってバイオリアクターを回転させながら培養を行う。バイオリアクターの回転によってバイオリアクター内の細胞（塊）に掛かる重力の方向が周期的に変化することで、細胞がバイオリアクターに対して相対的に微小な範囲に保持される。つまり、細胞の沈降が抑制される。細胞は液体培地内で均一に懸濁され、必要時間培養増殖され、融合して組織塊を形成する。
例えば、特許文献１に記載された細胞の培養装置（以下、培養装置とも略して言う）は、ガス交換機能を備えた１軸式の回転式バイオリアクターである。培養装置では、横向きの円筒形バイオリアクター内に液体培地が満たされている。液体培地に細胞（細胞塊）を播種した後で、バイオリアクターの水平軸方向に沿ってバイオリアクターを回転させながら培養を行う。バイオリアクターの回転によってバイオリアクター内の細胞（塊）に掛かる重力の方向が周期的に変化することで、細胞がバイオリアクターに対して相対的に微小な範囲に保持される。つまり、細胞の沈降が抑制される。細胞は液体培地内で均一に懸濁され、必要時間培養増殖され、融合して組織塊を形成する。
【0003】
また、特許文献２に記載された培養装置は、液体培地循環システムを搭載したクリノスタットを用いている。クリノスタットは、本体に設けられた支柱と、外側フレームと、内側フレームと、を備えている。外側フレームは、支柱に対して回転可能に支持されている。内側フレームは、外側フレームに対して回転可能に支持されている。内側フレームと同体に、培養容器が回転する。培養容器の内部には、液体培地と、培養される細胞塊とが封入される。各フレームが支持される軸周りに回転すると、培養容器に働く重力方向が分散され、細胞塊があらゆる方向に向けて増殖・伸展することができる。従って、細胞塊の３次元的な培養が可能になる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【文献】国際公開第２００５／０５６０７２号公報
【文献】特開２００６－３０４７９１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
特許文献１及び特許文献２に記載された培養装置は、培養容器内に微小重力環境を実現し、その環境内で細胞塊を培養する。しかしながら、これらの培養装置では、比重調整液内に分散した細胞塊を所定の位置に集合させることができないという問題がある。
【0006】
本発明は、このような問題点に鑑みてなされたものであって、比重調整液内の所定の位置に細胞塊を集合させることができる細胞塊を集合させる方法及びその装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
上記課題を解決するために、この発明は以下の手段を提案している。
本発明の細胞塊を集合させる方法は、液体培地を含み生体適合性を有する比重調整液と、前記比重調整液よりも比重が小さい細胞塊と、が収容された回転体を回転させて前記細胞塊を集合させる細胞塊集合工程を行うことを特徴としている。
また、本発明の細胞塊を集合させる装置は、液体培地を含み生体適合性を有する比重調整液と、前記比重調整液よりも比重が小さい細胞塊と、が収容される回転体と、前記回転体の中心軸上に互いの間に隙間を形成して配置され、母材の各端部を取付けるための第１取付け部及び第２取付け部と、を備えることを特徴としている。
本発明の細胞塊を集合させる方法は、液体培地を含み生体適合性を有する比重調整液と、前記比重調整液よりも比重が小さい細胞塊と、が収容された回転体を回転させて前記細胞塊を集合させる細胞塊集合工程を行うことを特徴としている。
また、本発明の細胞塊を集合させる装置は、液体培地を含み生体適合性を有する比重調整液と、前記比重調整液よりも比重が小さい細胞塊と、が収容される回転体と、前記回転体の中心軸上に互いの間に隙間を形成して配置され、母材の各端部を取付けるための第１取付け部及び第２取付け部と、を備えることを特徴としている。
【0008】
これらの発明によれば、回転体を回転させると、比重調整液の比重と細胞塊の比重との差で生じる向心力により、比重調整液に対して細胞塊が比重調整液内の所定の位置に向かって移動する。比重調整液は生体適合性を有するため、所定の位置に集まった細胞塊は比重調整液内で生存を続ける。従って、比重調整液内の所定の位置に細胞塊を集合させることができる。
【0009】
また、上記の細胞塊を集合させる方法において、前記細胞塊集合工程では、前記回転体を前記回転体の中心軸周りに回転させて、前記中心軸の周辺に前記細胞塊を集合させてもよい。
この発明によれば、中心軸の周辺に細胞塊を集合させることができる。
この発明によれば、中心軸の周辺に細胞塊を集合させることができる。
【0010】
また、上記の細胞塊を集合させる方法において、前記回転体の前記中心軸上に母材を配置した状態で、前記細胞塊集合工程を行ってもよい。
この発明によれば、細胞塊を母材周囲に集合させることができる。
この発明によれば、細胞塊を母材周囲に集合させることができる。
【0011】
また、上記の細胞塊を集合させる方法において、前記母材内に液体培地を供給させながら、前記細胞塊集合工程を行ってもよい。
また、上記の細胞塊を集合させる装置において、前記母材内に液体培地を供給させる供給部を備え、前記供給部は、本体と、前記本体により第２液体媒体が供給される供給配管と、前記第２液体媒体を前記本体内に戻す排出配管と、を有し、前記供給配管及び前記排出配管は、前記取付け部に連通してもよい。
これらの発明によれば、母材を通して液体培地中の栄養や酸素等を供給し、細胞塊が壊死するのを抑制することができる。
また、上記の細胞塊を集合させる装置において、前記母材内に液体培地を供給させる供給部を備え、前記供給部は、本体と、前記本体により第２液体媒体が供給される供給配管と、前記第２液体媒体を前記本体内に戻す排出配管と、を有し、前記供給配管及び前記排出配管は、前記取付け部に連通してもよい。
これらの発明によれば、母材を通して液体培地中の栄養や酸素等を供給し、細胞塊が壊死するのを抑制することができる。
【0012】
また、上記の細胞塊を集合させる方法において、前記回転体を回転させて、前記回転体内の空気を前記母材上に集約して前記母材を通して前記回転体内から前記空気を除去する脱気工程を行ってもよい。
この発明によれば、回転体内に空気が入っていても、その空気により比重調整液内の流れが乱れることを抑制して、細胞を確実に集合させることができる。
この発明によれば、回転体内に空気が入っていても、その空気により比重調整液内の流れが乱れることを抑制して、細胞を確実に集合させることができる。
【0013】
また、上記の細胞塊を集合させる方法において、前記脱気工程は、前記細胞塊集合工程よりも前に行ってもよい。
この発明によれば、回転体内に空気が無い状態から、細胞塊をさらに確実に集合させることができる。
また、上記の細胞塊を集合させる方法において、前記母材は人工血管又は再生血管であってもよい。
この発明によれば、回転体内に空気が無い状態から、細胞塊をさらに確実に集合させることができる。
また、上記の細胞塊を集合させる方法において、前記母材は人工血管又は再生血管であってもよい。
【発明の効果】
【0014】
本発明の細胞塊を集合させる方法及び細胞塊を集合させる装置によれば、比重調整液内の所定の位置に細胞塊を集合させることができる。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】本発明の一実施形態の細胞塊を集合させる装置の一部を破断した斜視図である。
【図2】人工多能性幹細胞由来細胞、血管内皮細胞、及び間葉系細胞を混合させて細胞塊を生成する工程を説明する斜視図である。
【図3】本発明の一実施形態の細胞塊を集合させる方法を示すフローチャートである。
【図4】同細胞塊を集合させる方法における細胞塊集合工程で人工血管に複数の細胞塊が集合した状態を説明する斜視図である。
【図5】同細胞塊を集合させる方法のシミュレーション結果を示す、回転体が回転する前の状態を示す斜視図である。
【図6】同細胞塊を集合させる方法のシミュレーション結果を示す、回転体が回転してから４分後の状態を示す斜視図である。
【図7】同細胞塊を集合させる方法のシミュレーション結果を示す、回転体が回転してから８分後の状態を示す斜視図である。
【図8】同細胞塊を集合させる方法のシミュレーション結果を示す、回転体が回転してから１２分後の状態を示す斜視図である。
【図9】回転体内に比重調整液を充填し、複数の細胞塊を注入した状態で回転体を回転させた状態を斜視して示す写真である。
【図10】細胞塊が人工血管上に集合した状態を斜視して示す写真である。
【図11】細胞塊が人工血管上に集合した状態を正面視して示す写真である。
【図12】細胞塊が蛍光発現を保持している状態を側面視して示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【0016】
以下、本発明に係る細胞塊を集合させる装置（以下、集合装置とも略して言う）の一実施形態を、図面を参照しながら説明する。
図１に示すように、本実施形態の集合装置１は、回転体１１と、一対の取付け部２１，２２と、供給部２６と、を備えている。
回転体１１は、後述する比重調整液及び細胞（細胞塊）を収容する収容空間が形成されていれば、特に形状は限定されない。本実施形態では、回転体１１は、第１側部１２と、第２側部１３と、外周板１４と、を有している。側部１２，１３は、円板状に形成され、互いに対向するように配置されている。外周板１４は、筒状に形成されている。外周板１４の軸線方向の各端部は、第１側部１２の外周縁部、及び第２側部１３の外周縁部にそれぞれ連なっている。回転体１１は、樹脂等により中空の円柱状に形成されている。
例えば、外周板１４には、ゴム等により注入口１５が形成されている。注入口１５は、外周板１４を貫通し、回転体１１の内部空間に達している。回転体１１には、開閉可能な蓋部が設けられていることが好ましい。蓋部を閉じたときに、回転体１１における蓋部以外の部分に対して、蓋部が液密に接続される。
図１に示すように、本実施形態の集合装置１は、回転体１１と、一対の取付け部２１，２２と、供給部２６と、を備えている。
回転体１１は、後述する比重調整液及び細胞（細胞塊）を収容する収容空間が形成されていれば、特に形状は限定されない。本実施形態では、回転体１１は、第１側部１２と、第２側部１３と、外周板１４と、を有している。側部１２，１３は、円板状に形成され、互いに対向するように配置されている。外周板１４は、筒状に形成されている。外周板１４の軸線方向の各端部は、第１側部１２の外周縁部、及び第２側部１３の外周縁部にそれぞれ連なっている。回転体１１は、樹脂等により中空の円柱状に形成されている。
例えば、外周板１４には、ゴム等により注入口１５が形成されている。注入口１５は、外周板１４を貫通し、回転体１１の内部空間に達している。回転体１１には、開閉可能な蓋部が設けられていることが好ましい。蓋部を閉じたときに、回転体１１における蓋部以外の部分に対して、蓋部が液密に接続される。
【0017】
回転体１１の側部１２，１３及び外周板１４を形成する材料は、金属や、アクリル樹脂等、特に制限されない。しかし、生体適合性・内部の視認性の観点からは、回転体１１を、射出成形により樹脂で形成することが好ましい。
また、本明細書で言う細胞とは、スフェロイドを形成できるものであれば、特に限定はないが、例えば、動物由来細胞であり、ヒト、サル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス、ハムスター等の哺乳動物由来細胞のことを意味する。細胞は、培養細胞として株化されたものであっても、生物組織から得られた初代細胞であってもよい。胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（以下、ｉＰＳ細胞と言う）、間葉系幹細胞、細胞として、神経幹細胞等を用いることができ、また、分化細胞としては、肝細胞、膵島細胞、腎細胞、神経細胞、角膜内皮細胞、軟骨細胞、心筋細胞等を用いることができる。さらに、臍帯血、骨髄、脂肪、血液由来組織性幹細胞から分化誘導される細胞を用いることもできる。あるいは腫瘍化した細胞、遺伝子工学的手法により形質転換された細胞やウイルスベクターにより感染された細胞を用いることもできる。
また、本明細書で言う細胞とは、スフェロイドを形成できるものであれば、特に限定はないが、例えば、動物由来細胞であり、ヒト、サル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス、ハムスター等の哺乳動物由来細胞のことを意味する。細胞は、培養細胞として株化されたものであっても、生物組織から得られた初代細胞であってもよい。胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（以下、ｉＰＳ細胞と言う）、間葉系幹細胞、細胞として、神経幹細胞等を用いることができ、また、分化細胞としては、肝細胞、膵島細胞、腎細胞、神経細胞、角膜内皮細胞、軟骨細胞、心筋細胞等を用いることができる。さらに、臍帯血、骨髄、脂肪、血液由来組織性幹細胞から分化誘導される細胞を用いることもできる。あるいは腫瘍化した細胞、遺伝子工学的手法により形質転換された細胞やウイルスベクターにより感染された細胞を用いることもできる。
【0018】
回転体１１は、図示しない支持台により中心軸Ｃ周りに回転可能に支持されている。
回転体１１は、モータ等の駆動部により中心軸Ｃ周りに回転する。駆動部は、回転体１１の外周板１４の外面に接触してこの外面を回転させたり、回転体１１と同軸に固定されたプーリ等に巻かれたベルトを回転させることにより、駆動力を伝達させる。
回転体１１は、モータ等の駆動部により中心軸Ｃ周りに回転する。駆動部は、回転体１１の外周板１４の外面に接触してこの外面を回転させたり、回転体１１と同軸に固定されたプーリ等に巻かれたベルトを回転させることにより、駆動力を伝達させる。
【0019】
取付け部２１，２２は、筒状に形成され、回転体１１の中心軸Ｃ上にそれぞれ配置されている。第１取付け部２１は、第１側部１２のうち第２側部１３に対向する面に固定されている。第２取付け部２２は、第２側部１３のうち第１側部１２に対向する面に固定されている。第１取付け部２１と第２取付け部２２との間には、隙間が形成されている。
取付け部２１，２２は、回転体１１と同一の材料で形成されている。
取付け部２１，２２は、回転体１１と同一の材料で形成されている。
【0020】
取付け部２１，２２には、人工血管（母材）Ｄが取付けられる。ここで言う人工血管とは、合成繊維や生体材料等により形成された血管のことを意味する。人工血管Ｄは、ガス透過性を有する材料により管状に形成されている。人工血管Ｄは、人工血管Ｄの各端部を取付け部２１，２２に径方向外側から嵌め込むこと等により、取付け部２１，２２に取付けられる。
なお、母材は人工血管Ｄであるとしたが、母材はこれに限定されず再生血管等でもよい。ここで言う再生血管とは、再生医療により形成された血管のことを意味する。
なお、母材は人工血管Ｄであるとしたが、母材はこれに限定されず再生血管等でもよい。ここで言う再生血管とは、再生医療により形成された血管のことを意味する。
【0021】
回転体１１内には、原液Ｗが収容される。原液Ｗは、比重調整液Ｗ１と、細胞塊Ｗ２と、を含む。
図２に示すように、細胞塊Ｗ２は、ｉＰＳ細胞由来細胞Ｗ４と、血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）Ｗ５と、間葉系細胞（ＭＳＣ）Ｗ６と、を所定の比率で混ぜた混合物Ｗ２ａを、ウェル内等に集合させて共培養したものである。
ここで言う血管内皮細胞とは、血管内皮を構成する細胞、又はそのような細胞に分化することのできる細胞のことを意味する。ここで言う間葉系細胞とは、主として中胚葉に由来する結合織に存在し、組織で機能する細胞の支持構造を形成する結合織細胞のことを意味するが、間葉系細胞への分化運命が決定しているが、まだ間葉系細胞へ分化していない細胞も含む概念である。
細胞塊Ｗ２の比重は、比重調整液Ｗ１の比重よりも小さい。例えば、細胞塊Ｗ２の比重は１．０５である。
図２に示すように、細胞塊Ｗ２は、ｉＰＳ細胞由来細胞Ｗ４と、血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）Ｗ５と、間葉系細胞（ＭＳＣ）Ｗ６と、を所定の比率で混ぜた混合物Ｗ２ａを、ウェル内等に集合させて共培養したものである。
ここで言う血管内皮細胞とは、血管内皮を構成する細胞、又はそのような細胞に分化することのできる細胞のことを意味する。ここで言う間葉系細胞とは、主として中胚葉に由来する結合織に存在し、組織で機能する細胞の支持構造を形成する結合織細胞のことを意味するが、間葉系細胞への分化運命が決定しているが、まだ間葉系細胞へ分化していない細胞も含む概念である。
細胞塊Ｗ２の比重は、比重調整液Ｗ１の比重よりも小さい。例えば、細胞塊Ｗ２の比重は１．０５である。
【0022】
比重調整液Ｗ１は、第１液体培地、及び生体適合性を有する比重調整剤を含む。比重調整液Ｗ１は、第１液体培地及び比重調整剤以外に、ｐＨ調整剤や懸濁剤等を含んでもよい。比重調整剤Ｗ１は、イオディキサノール（Ｉｏｄｉｘａｎｏｌ）やフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）等でもよい。
ここで言う第１液体培地、及び後述する第２液体培地は特に限定はなく、培養する細胞（塊）に合わせて適宜選択することができる。例えば、ＭＥＭ、α－ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭ１、ｃＲＤＦ、ＥＲＤＦ、Ｆ１２、ＭＣＤＢ１３１、Ｆ１２／ＤＭＥＭ、及びＷＥ等の公知の培地を挙げることができる。また、細胞がヒト幹細胞である場合、ヒト全能性幹細胞用培地として市販されている、mTeSR1（Stem Cell Tech.社製）、Essential 8（登録商標、Life Technologies社製）、Ripro FF/FF2/XF（リプロセル社製）、StemSure（登録商標、和光純薬社製）、CELRENA（細胞科学研究所製）、S-Medium（DSファーマ社製）、StemFit（味の素社製）等を用いることができる。
また、ここで言う生体適合性とは、生体に強い悪影響や強い刺激を与えないことから、生体成分、細胞（塊）等の生体組織、及び生体由来の物質のいずれか１つ以上と共存することが可能である属性を意味する。
ここで言う第１液体培地、及び後述する第２液体培地は特に限定はなく、培養する細胞（塊）に合わせて適宜選択することができる。例えば、ＭＥＭ、α－ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭ１、ｃＲＤＦ、ＥＲＤＦ、Ｆ１２、ＭＣＤＢ１３１、Ｆ１２／ＤＭＥＭ、及びＷＥ等の公知の培地を挙げることができる。また、細胞がヒト幹細胞である場合、ヒト全能性幹細胞用培地として市販されている、mTeSR1（Stem Cell Tech.社製）、Essential 8（登録商標、Life Technologies社製）、Ripro FF/FF2/XF（リプロセル社製）、StemSure（登録商標、和光純薬社製）、CELRENA（細胞科学研究所製）、S-Medium（DSファーマ社製）、StemFit（味の素社製）等を用いることができる。
また、ここで言う生体適合性とは、生体に強い悪影響や強い刺激を与えないことから、生体成分、細胞（塊）等の生体組織、及び生体由来の物質のいずれか１つ以上と共存することが可能である属性を意味する。
【0023】
例えば、第１液体培地は、細胞塊Ｗ２を肝臓に分化させるものが用いられている。第１液体培地の比重は、約１．０である。
比重調整剤は、細胞分離用の密度勾配媒体であることが好ましい。密度勾配媒体として、ＯｐｔｉＰｒｅｐ（登録商標、コスモ・バイオ株式会社製）が用いられる。例えば比重調整液Ｗ１の比重は、１．０６以上１．０８以下である。ただし、細胞塊Ｗ２の比重が比重調整液Ｗ１の比重よりも小さければ、比重調整液Ｗ１の比重は、例えば１．０３以上１．１５以下、１．０１以上１．２０以下とすることができる。
比重調整液Ｗ１中の比重調整剤の濃度は、比重調整液Ｗ１が細胞塊Ｗ２に害を与えない程度の濃度であることが好ましい。
比重調整剤は、細胞分離用の密度勾配媒体であることが好ましい。密度勾配媒体として、ＯｐｔｉＰｒｅｐ（登録商標、コスモ・バイオ株式会社製）が用いられる。例えば比重調整液Ｗ１の比重は、１．０６以上１．０８以下である。ただし、細胞塊Ｗ２の比重が比重調整液Ｗ１の比重よりも小さければ、比重調整液Ｗ１の比重は、例えば１．０３以上１．１５以下、１．０１以上１．２０以下とすることができる。
比重調整液Ｗ１中の比重調整剤の濃度は、比重調整液Ｗ１が細胞塊Ｗ２に害を与えない程度の濃度であることが好ましい。
【0024】
図１に示すように、例えば、供給部２６は、本体２７と、供給配管２８と、排出配管２９と、を有している。供給配管２８と第１取付け部２１とは、互いに連通している。排出配管２９と第２取付け部２２とは、互いに連通している。
例えば、本体２７は、図示はしないが、供給タンク、ポンプ、廃棄タンクを有している。供給タンク内には、第２液体培地（液体培地）が収容されている。第２液体培地は特に限定されないが、第１液体培地と同一であってもよい。
ポンプは、供給タンク内の第２液体培地を一定の流速で供給配管２８に供給する。供給部２６は、回転体１１内に第２液体培地を供給する。排出配管２９を通して本体２７に戻された使用済みの第２液体培地は、廃棄タンク内に収容される。
なお、供給部２６は、第２液体培地に代えて血液や人工血液等を供給してもよい。
例えば、本体２７は、図示はしないが、供給タンク、ポンプ、廃棄タンクを有している。供給タンク内には、第２液体培地（液体培地）が収容されている。第２液体培地は特に限定されないが、第１液体培地と同一であってもよい。
ポンプは、供給タンク内の第２液体培地を一定の流速で供給配管２８に供給する。供給部２６は、回転体１１内に第２液体培地を供給する。排出配管２９を通して本体２７に戻された使用済みの第２液体培地は、廃棄タンク内に収容される。
なお、供給部２６は、第２液体培地に代えて血液や人工血液等を供給してもよい。
【0025】
次に、本実施形態の細胞塊を集合させる方法（以下、集合方法とも略して言う）について説明する。図３は、本発明の一実施形態における集合方法Ｓを示すフローチャートである。
まず、取付け工程（図３に示すステップＳ１）において、回転体１１の蓋部を開け、人工血管Ｄの各端部を取付け部２１，２２に嵌め込む。これにより、回転体１１の中心軸Ｃ上に人工血管Ｄを配置する。人工血管Ｄの各端部と取付け部２１，２２との間は、液密に封止される。人工血管Ｄの配置後、回転体１１の蓋部を閉じる。取付け工程Ｓ１が終了すると、ステップＳ３に移行する。
まず、取付け工程（図３に示すステップＳ１）において、回転体１１の蓋部を開け、人工血管Ｄの各端部を取付け部２１，２２に嵌め込む。これにより、回転体１１の中心軸Ｃ上に人工血管Ｄを配置する。人工血管Ｄの各端部と取付け部２１，２２との間は、液密に封止される。人工血管Ｄの配置後、回転体１１の蓋部を閉じる。取付け工程Ｓ１が終了すると、ステップＳ３に移行する。
【0026】
次に、充填工程（ステップＳ３）において、注射器等により注入口１５を通して回転体１１内に比重調整液Ｗ１を充填する。このとき、回転体１１内に気泡が残らないように比重調整液Ｗ１を充填することが好ましい。
次に、脱気工程（ステップＳ５）において、比重調整液Ｗ１が収容された回転体１１を、駆動部により中心軸Ｃ周りに回転させる。空気の比重は比重調整液Ｗ１の比重よりも小さいため、空気に作用する向心力により、比重調整液Ｗ１に対して空気が中心軸Ｃの径方向外側から中心軸Ｃに向かって移動する。回転体１１内の空気は、人工血管Ｄ上に集約する。人工血管Ｄはガス透過性を有するため、空気が回転体１１内から人工血管Ｄの血管壁を通して人工血管Ｄ内に除去される。
この脱気工程Ｓ５は、後述する細胞塊集合工程Ｓ９よりも前に行う。
次に、脱気工程（ステップＳ５）において、比重調整液Ｗ１が収容された回転体１１を、駆動部により中心軸Ｃ周りに回転させる。空気の比重は比重調整液Ｗ１の比重よりも小さいため、空気に作用する向心力により、比重調整液Ｗ１に対して空気が中心軸Ｃの径方向外側から中心軸Ｃに向かって移動する。回転体１１内の空気は、人工血管Ｄ上に集約する。人工血管Ｄはガス透過性を有するため、空気が回転体１１内から人工血管Ｄの血管壁を通して人工血管Ｄ内に除去される。
この脱気工程Ｓ５は、後述する細胞塊集合工程Ｓ９よりも前に行う。
【0027】
次に、細胞注入工程（ステップＳ７）において、注射器等により注入口１５を通して回転体１１内に複数の細胞塊Ｗ２を注入する。回転体１１内の比重調整液Ｗ１は生体適合性を有するため、複数の細胞塊Ｗ２は比重調整液Ｗ１内で生存を続けることができる。
次に、細胞塊集合工程（ステップＳ９）において、比重調整液Ｗ１と複数の細胞塊Ｗ２とが収容された回転体１１を、駆動部により中心軸Ｃ周りに回転させる。細胞塊Ｗ２の比重は比重調整液Ｗ１の比重よりも小さいため、細胞塊Ｗ２に作用する向心力により、比重調整液Ｗ１に対して複数の細胞塊Ｗ２が中心軸Ｃに向かって移動する。図４に示すように複数の細胞塊Ｗ２は、中心軸Ｃ上に配置された人工血管Ｄの外周面に集合する。
次に、細胞塊集合工程（ステップＳ９）において、比重調整液Ｗ１と複数の細胞塊Ｗ２とが収容された回転体１１を、駆動部により中心軸Ｃ周りに回転させる。細胞塊Ｗ２の比重は比重調整液Ｗ１の比重よりも小さいため、細胞塊Ｗ２に作用する向心力により、比重調整液Ｗ１に対して複数の細胞塊Ｗ２が中心軸Ｃに向かって移動する。図４に示すように複数の細胞塊Ｗ２は、中心軸Ｃ上に配置された人工血管Ｄの外周面に集合する。
【0028】
この細胞塊集合工程Ｓ９は、供給部２６により人工血管Ｄ内に第２液体培地を供給させながら行ってもよい。このようにすることで、第２液体培地中の栄養や酸素等が細胞塊Ｗ２に供給される。
以上により、集合方法Ｓの全工程が終了する。
以上により、集合方法Ｓの全工程が終了する。
【0029】
本実施形態の集合方法Ｓを宇宙空間等の重力が作用しない場所、又は地球の重力に比べて小さい重力しか作用しない場所で行うと、回転体１１が中心軸Ｃ周りに回転しなくても、比重調整液Ｗ１中で細胞塊Ｗ２が沈降しにくい。回転体１１を中心軸Ｃ周りに回転させることにより、細胞塊Ｗ２を安定化して集合させることができる。
【0030】
〔シミュレーション結果〕
以下では、重力が作用する地上において、回転する回転体１１中で複数の細胞塊Ｗ２が移動する様子をシミュレーションした結果について説明する。
回転体１１の直径を２０ｍｍ、厚さを１０ｍｍとし、側部１２，１３及び外周板１４の厚さは無視した。回転体１１は、中心軸Ｃが水平面に沿って配置されているとした。
細胞塊Ｗ２の径を１００μｍ（マイクロメートル）、比重を１．０５とした。回転体１１内に供給される細胞塊Ｗ２の数は、６００とした。比重調整液Ｗ１の比重を１．０８とした。人工血管Ｄの径を１ｍｍとした。重力が図５に示す下方Ａに向かって１Ｇ（９．８ｍ／ｓ２）で作用するとした。回転体１１の中心軸Ｃ周りの回転速度を、１５０ｒｐｍ（回転／分）とした。
以下では、重力が作用する地上において、回転する回転体１１中で複数の細胞塊Ｗ２が移動する様子をシミュレーションした結果について説明する。
回転体１１の直径を２０ｍｍ、厚さを１０ｍｍとし、側部１２，１３及び外周板１４の厚さは無視した。回転体１１は、中心軸Ｃが水平面に沿って配置されているとした。
細胞塊Ｗ２の径を１００μｍ（マイクロメートル）、比重を１．０５とした。回転体１１内に供給される細胞塊Ｗ２の数は、６００とした。比重調整液Ｗ１の比重を１．０８とした。人工血管Ｄの径を１ｍｍとした。重力が図５に示す下方Ａに向かって１Ｇ（９．８ｍ／ｓ２）で作用するとした。回転体１１の中心軸Ｃ周りの回転速度を、１５０ｒｐｍ（回転／分）とした。
【0031】
回転体１１が回転する前の初期状態では、図５に示すように、複数の細胞塊Ｗ２が比重調整液Ｗ１内でほぼ均等に分散しているとする。回転体１１が中心軸Ｃ周りに４分間、８分間、及び１２分間回転したときの状態を、図６、図７、及び図８にそれぞれ示す。回転体１１が中心軸Ｃ周りに回転する時間が長くなるに従い、複数の細胞塊Ｗ２が人工血管Ｄに近付くように移動する。１２分間回転した図８に示す状態では、人工血管Ｄ周囲に細胞塊Ｗ２が集合することが分かった。
【0032】
以上説明したように、本実施形態の集合方法Ｓ及び集合装置１によれば、回転体１１を中心軸Ｃ周りに回転させると、比重調整液Ｗ１の比重と細胞塊Ｗ２の比重との差で生じる向心力により、比重調整液Ｗ１に対して複数の細胞塊Ｗ２が中心軸Ｃの径方向外側から中心軸Ｃに向かって移動する。比重調整液Ｗ１は生体適合性を有するため、複数の細胞塊Ｗ２を生存したまま中心軸Ｃ上に集合させることができる。
【0033】
取付け部２１，２２により回転体１１の中心軸Ｃ上に人工血管Ｄを配置した状態で、細胞塊集合工程Ｓ９を行う。これにより、複数の細胞塊Ｗ２を人工血管Ｄ上に集合させることができる。
供給部２６により人工血管Ｄ内に第２液体培地を供給させながら、細胞塊集合工程Ｓ９を行う。このため、人工血管Ｄを通して第２液体培地中の栄養や酸素等を複数の細胞塊Ｗ２に供給することができる。
供給部２６により人工血管Ｄ内に第２液体培地を供給させながら、細胞塊集合工程Ｓ９を行う。このため、人工血管Ｄを通して第２液体培地中の栄養や酸素等を複数の細胞塊Ｗ２に供給することができる。
【0034】
集合方法Ｓにおいて、脱気工程Ｓ５を行う。これにより、回転体１１内に空気が入っていても、その空気により比重調整液Ｗ１内の流れが乱れることを抑制して、細胞塊Ｗ２を確実に集合させることができる。
脱気工程Ｓ５は、細胞塊集合工程Ｓ９よりも前に行う。従って、回転体１１内に空気が無い状態から、細胞塊集合工程Ｓ９において細胞塊Ｗ２をさらに確実に集合させることができる。
脱気工程Ｓ５は、細胞塊集合工程Ｓ９よりも前に行う。従って、回転体１１内に空気が無い状態から、細胞塊集合工程Ｓ９において細胞塊Ｗ２をさらに確実に集合させることができる。
【0035】
以上、本発明の一実施形態について図面を参照して詳述したが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の構成の変更、組み合わせ、削除等も含まれる。
例えば、前記実施形態では、集合装置１は、取付け部２１，２２を備えなくてもよい。この場合、集合方法Ｓでは取付け工程Ｓ１は行われない。人工血管Ｄを取付けずに細胞塊Ｗ２を集合させると、細胞塊Ｗ２は中心軸Ｃの周辺（中心軸Ｃ上）に集合する。中心軸Ｃ上の向心力が弱い場合には、細胞塊Ｗ２は管状に集合する。
集合装置１は、供給部２６を備えなくてもよい。集合方法Ｓでは、脱気工程Ｓ５を細胞塊集合工程Ｓ９と同時に行ってもよいし、脱気工程Ｓ５を行わなくてもよい。
例えば、前記実施形態では、集合装置１は、取付け部２１，２２を備えなくてもよい。この場合、集合方法Ｓでは取付け工程Ｓ１は行われない。人工血管Ｄを取付けずに細胞塊Ｗ２を集合させると、細胞塊Ｗ２は中心軸Ｃの周辺（中心軸Ｃ上）に集合する。中心軸Ｃ上の向心力が弱い場合には、細胞塊Ｗ２は管状に集合する。
集合装置１は、供給部２６を備えなくてもよい。集合方法Ｓでは、脱気工程Ｓ５を細胞塊集合工程Ｓ９と同時に行ってもよいし、脱気工程Ｓ５を行わなくてもよい。
【0036】
比重調整液の比重よりも細胞塊Ｗ２の比重が小さい場合には、比重調整液が比重調整剤を含まずに、第１液体培地を含んで構成されるようにしてもよい。
【0037】
〔実施例〕
以下では、本発明の実施例及び比較例を具体的に示してより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
表１に示すように、比重調整剤としてサンプルＮｏ．１～Ｎｏ．６のものを検討した。
回転体の中心軸上に、人工血管を配置した。ｉＰＳ細胞由来の肝前駆細胞、血管内皮細胞及び間葉系細胞を所定の比率で混ぜて細胞塊を作成した。図９に示すように、回転体内に比重調整液を充填し、複数の細胞塊を注入した状態で回転体を回転させた。回転体は、回転速度１５０ｒｐｍで、１２分間回転させた。
なお、比重調整剤（比重調整液）が合格となる判断基準は、比重調整剤が生体適合性を有し、細胞塊よりも比重が大きく、比重調整剤内で複数の細胞塊が生存することである。
以下では、本発明の実施例及び比較例を具体的に示してより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
表１に示すように、比重調整剤としてサンプルＮｏ．１～Ｎｏ．６のものを検討した。
回転体の中心軸上に、人工血管を配置した。ｉＰＳ細胞由来の肝前駆細胞、血管内皮細胞及び間葉系細胞を所定の比率で混ぜて細胞塊を作成した。図９に示すように、回転体内に比重調整液を充填し、複数の細胞塊を注入した状態で回転体を回転させた。回転体は、回転速度１５０ｒｐｍで、１２分間回転させた。
なお、比重調整剤（比重調整液）が合格となる判断基準は、比重調整剤が生体適合性を有し、細胞塊よりも比重が大きく、比重調整剤内で複数の細胞塊が生存することである。
【0038】
【表1】
【0039】
（実施例１）
比重調整剤として、サンプルＮｏ．１のリンパ球分離溶液（ナカライテスク株式会社製）を、第１液体培地に７０％（重量％）混合させて比重調整液を作成した。この場合、比重調整液中の３０％が第１液体培地である。比重調整液の比重は１．０６であり、ｐＨは７．８であった。作成した比重調整液を充填して回転体を回転させた結果、複数の細胞塊が生存しており、合格となることが分かった。
（実施例２）
比重調整剤として、サンプルＮｏ．２のＯｐｔｉＰｒｅｐ（登録商標、コスモ・バイオ株式会社製）を、第１液体培地に１４％混合させて比重調整液を作成した。比重調整液の比重は１．０６～１．０７であり、ｐＨは７．８であった。作成した比重調整液を充填して回転体を回転させた結果、図１０、及び図１１において矢頭に示すように、クサビラオレンジを発現した血管内皮細胞、間葉系細胞、及びＥＧＦＰを発現したＴｋＤＡ ３－４細胞（ｉＰＳ細胞）由来肝前駆細胞を含む細胞塊は、人工血管上に集合した。この際、図１２に示すように、複数の細胞塊が蛍光発現を保持、すなわち生存しており、合格となることが分かった。
比重調整剤として、サンプルＮｏ．１のリンパ球分離溶液（ナカライテスク株式会社製）を、第１液体培地に７０％（重量％）混合させて比重調整液を作成した。この場合、比重調整液中の３０％が第１液体培地である。比重調整液の比重は１．０６であり、ｐＨは７．８であった。作成した比重調整液を充填して回転体を回転させた結果、複数の細胞塊が生存しており、合格となることが分かった。
（実施例２）
比重調整剤として、サンプルＮｏ．２のＯｐｔｉＰｒｅｐ（登録商標、コスモ・バイオ株式会社製）を、第１液体培地に１４％混合させて比重調整液を作成した。比重調整液の比重は１．０６～１．０７であり、ｐＨは７．８であった。作成した比重調整液を充填して回転体を回転させた結果、図１０、及び図１１において矢頭に示すように、クサビラオレンジを発現した血管内皮細胞、間葉系細胞、及びＥＧＦＰを発現したＴｋＤＡ ３－４細胞（ｉＰＳ細胞）由来肝前駆細胞を含む細胞塊は、人工血管上に集合した。この際、図１２に示すように、複数の細胞塊が蛍光発現を保持、すなわち生存しており、合格となることが分かった。
【0040】
（実施例３）
比重調整剤として、サンプルＮｏ．３のＯｐｔｉＰｒｅｐを、第１液体培地に１５％混合させて比重調整液を作成した。比重調整液の比重は１．０７～１．０８であり、ｐＨは７．８であった。作成した比重調整液を充填して回転体を回転させた結果、血管内皮細胞、間葉系細胞、及びＥＧＦＰを発現したＴｋＤＡ ３－４細胞は正常な形態とは少し異なるが、複数の細胞塊が生存しており、合格となることが分かった。
（実施例４）
比重調整剤として、サンプルＮｏ．４のＰｅｒｃｏｌｌ（登録商標、ＧＥヘルスケア株式会社製）を、第１液体培地に７０％混合させて比重調整液を作成した。比重調整液の比重は１．０７～１．０８であり、ｐＨは８．１であった。作成した比重調整液を充填して回転体を回転させた結果、血管内皮細胞及び間葉系細は正常な形態とは少し異なるが、複数の細胞塊が生存しており、合格となることが分かった。
比重調整剤として、サンプルＮｏ．３のＯｐｔｉＰｒｅｐを、第１液体培地に１５％混合させて比重調整液を作成した。比重調整液の比重は１．０７～１．０８であり、ｐＨは７．８であった。作成した比重調整液を充填して回転体を回転させた結果、血管内皮細胞、間葉系細胞、及びＥＧＦＰを発現したＴｋＤＡ ３－４細胞は正常な形態とは少し異なるが、複数の細胞塊が生存しており、合格となることが分かった。
（実施例４）
比重調整剤として、サンプルＮｏ．４のＰｅｒｃｏｌｌ（登録商標、ＧＥヘルスケア株式会社製）を、第１液体培地に７０％混合させて比重調整液を作成した。比重調整液の比重は１．０７～１．０８であり、ｐＨは８．１であった。作成した比重調整液を充填して回転体を回転させた結果、血管内皮細胞及び間葉系細は正常な形態とは少し異なるが、複数の細胞塊が生存しており、合格となることが分かった。
【0041】
（比較例１）
比重調整剤として、サンプルＮｏ．５のポリタングステン酸ナトリウムを、第１液体培地に６％～８％混合させて比重調整液を作成した。比重調整液の比重は１．０６であり、ｐＨは６．６であった。作成した比重調整液を充填して回転体を回転させた結果、人工血管から細胞塊が剥がれ、細胞塊が壊死してしまうことが分かった。複数の細胞塊が生存できず、不合格であった。
（比較例２）
比重調整剤として、サンプルＮｏ．６のメチルセルロースを、第１液体培地に０．１０％混合させて比重調整液を作成した。比重調整液の比重は、０．９８であった。この比重調整液よりも比重が小さい細胞塊は想定されないため、不合格であった。
比重調整剤として、サンプルＮｏ．５のポリタングステン酸ナトリウムを、第１液体培地に６％～８％混合させて比重調整液を作成した。比重調整液の比重は１．０６であり、ｐＨは６．６であった。作成した比重調整液を充填して回転体を回転させた結果、人工血管から細胞塊が剥がれ、細胞塊が壊死してしまうことが分かった。複数の細胞塊が生存できず、不合格であった。
（比較例２）
比重調整剤として、サンプルＮｏ．６のメチルセルロースを、第１液体培地に０．１０％混合させて比重調整液を作成した。比重調整液の比重は、０．９８であった。この比重調整液よりも比重が小さい細胞塊は想定されないため、不合格であった。
【産業上の利用可能性】
【0042】
本実施形態の細胞塊を集合させる方法及び細胞塊を集合させる装置は、細胞塊を集合させるため等に好適に用いることができる。
【符号の説明】
【0043】
１ 集合装置（細胞塊を集合させる装置）
１１ 回転体
２１ 第１取付け部（取付け部）
２２ 第２取付け部（取付け部）
２６ 供給部
Ｃ 中心軸
Ｄ 人工血管（母材）
Ｓ 集合方法（細胞塊を集合させる方法）
Ｓ５ 脱気工程
Ｓ９ 細胞塊集合工程
Ｗ１ 比重調整液
Ｗ２ 細胞塊
１１ 回転体
２１ 第１取付け部（取付け部）
２２ 第２取付け部（取付け部）
２６ 供給部
Ｃ 中心軸
Ｄ 人工血管（母材）
Ｓ 集合方法（細胞塊を集合させる方法）
Ｓ５ 脱気工程
Ｓ９ 細胞塊集合工程
Ｗ１ 比重調整液
Ｗ２ 細胞塊
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
