特許 6990656 固定化アルロースエピメラーゼの製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2021-12-08

(45)【発行日】2022-02-03

(54)【発明の名称】固定化アルロースエピメラーゼの製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 11/08 20200101AFI20220127BHJP

   C12N 9/90 20060101ALN20220127BHJP

   C13K 13/00 20060101ALN20220127BHJP

【ＦＩ】

C12N11/08

C12N9/90

C13K13/00

【請求項の数】 3

(21)【出願番号】P 2018539767

(86)(22)【出願日】2017-09-14

(86)【国際出願番号】 JP2017033178

(87)【国際公開番号】W WO2018052054

(87)【国際公開日】2018-03-22

【審査請求日】2020-08-17

(31)【優先権主張番号】P 2016179954

(32)【優先日】2016-09-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000188227

【氏名又は名称】松谷化学工業株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100124431

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 順也

(74)【代理人】

【識別番号】100174160

【弁理士】

【氏名又は名称】水谷 馨也

(72)【発明者】

【氏名】グラッパリ プシュパ キラン

(72)【発明者】

【氏名】新谷 知也

(72)【発明者】

【氏名】西岡 純一郎

(72)【発明者】

【氏名】島田 研作

【審査官】太田 雄三

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２００８／１４２８６０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開２００１－０１１０９０（ＪＰ，Ａ）

【文献】TAKESHITA, K., et al.，Mass Production of D-Psicose from D-Fructose by a Continuous Bioreactor System Using Immobilized D-Tagatose 3-Epimerase，Journal of Bioscience and Bioengineering，2000年，Vol. 90, No. 4，p. 453-455

【文献】LIM, B-C., et al.，A stable immobilized D-psicose 3-epimerase for the production of D-psicose in the presence of borate，Process Biochemistry，2009年，Vol. 44，p. 822-828

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １１／００

Ｃ１２Ｎ ９／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

比活性が５０Ｕ／ｍｇ以上であるアルロースエピメラーゼを含む酵素液を、負荷総タンパク質量が１．３～１５ｍｇ／ｍｌ-Ｒとなるように、スチレン系ポーラス型弱塩基性陰イオン交換樹脂又はスチレン系ゲル型弱塩基性陰イオン交換樹脂と接触させる工程を含み、
イオン交換樹脂と接触させる前記酵素液のアルロースエピメラーゼ単位数がイオン交換樹脂１ｍｌ当り２７０Ｕ以上である、固定化アルロースエピメラーゼの製造方法。

【請求項2】

スチレン系ポーラス型弱塩基性陰イオン交換樹脂又はスチレン系ゲル型弱塩基性陰イオン交換のイオン交換基が３級アミンである、請求項１に記載の製造方法。

【請求項3】

前記スチレン系ポーラス型弱塩基性陰イオン交換樹脂のイオン交換基が－Ｎ（ＣＨ₃）₂である、請求項１又は２に記載の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、固定化アルロースエピメラーゼの製造方法に関する。より具体的には、本発明は、比活性が高く、耐久性に優れた固定化アルロースエピメラーゼを効率的に製造する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

フラクトースにＤ－ケトヘキソース・３－エピメラーゼ（特許文献１）を作用させて生成されるアルロースは、別名をプシコースと称する希少糖の一種であり、エネルギー値がゼロ（非特許文献１）、食後血糖上昇抑制効果（非特許文献２）、抗肥満効果（非特許文献３）等の有用性が報告されており、生活習慣病予防素材として注目されている。

【0003】

このようにアルロースはダイエット甘味料として脚光を浴びており、食品産業分野でアルロースを効率的に生産できる方法の開発の必要性が高まっている。

【0004】

従来、アルロースの生産方法としては、例えばフルクトースを基質として用いて、微生物由来のＤ-ケトヘキソース３-エピメラーゼ（以下、「アルロースエピメラーゼ」とも言う）を作用させてアルロースを酵素的に生成する方法が知られている。

【0005】

アルロースエピメラーゼとしては、アルスロバクター・グロビホルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）又はアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のアルロースエピメラーゼ、及びシュードモナス・チコリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ）又はロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）由来のタガトースエピメラーゼ等が知られている。

【0006】

また、アルロースエピメラーゼを利用してアルロースを工業的に製造する場合には、製造効率を高めるために、固定化アルロースエピメラーゼが使用されている。従来、固定化アルロースエピメラーゼの製造方法としては、アルギン酸ナトリウム（特許文献２）、スチレン系ポーラス型弱塩基性イオン交換樹脂（特許文献３）、及びフェノール系ポーラス型弱塩基性イオン交換樹脂（特許文献４）を固定化担体として使用する方法が知られている。

【0007】

しかしながら、従来の固定化アルロースエピメラーゼの製造方法では、商業的生産に求められる経済性（製造コスト）や安定性（活性維持）等の性能が不十分であったり、連続生産に耐えられなかったりするという欠点がある。そこで、比活性が高く、耐久性に優れた固定化アルロースエピメラーゼを効率的に製造する方法の開発が切望されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【文献】特開平６－１２５７７６号公報

【文献】特表２０１３－５０１５１９号公報

【文献】特開２０１４－１４０３６１号公報

【文献】特表２０１５－５３０１０５号公報

【非特許文献】

【0009】

【文献】Ｊ．Ｎｕｔｒｉ．Ｓｃｉ．Ｖｉｔａｍｉｎｏｌ．，４８，７７－８０，２００２．

【文献】Ｊ．Ｎｕｔｒｉ．Ｓｃｉ．Ｖｉｔａｍｉｎｏｌ．，５４，５１１－５１４，２００８．

【文献】Ｉｎｔ．Ｊ．ｆｏｏｄ Ｓｃｉ．Ｎｕｔｒｉ．，６５，２４５－２５０，２０１４．

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

本発明は、比活性が高く、耐久性に優れた固定化アルロースエピメラーゼを効率的に製造する方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明者らは、前記課題を解決することを目的として、比活性が高く、耐久性に優れた固定化アルロースエピメラーゼを効率的に製造し得る方法について鋭意研究した。その結果、比活性が特定のレベル以上のアルロースエピメラーゼを含む酵素液をスチレン系ポーラス型弱塩基性陰イオン交換樹脂又はスチレン系ゲル型弱塩基性陰イオン交換樹脂に負荷総タンパク質量が１．３～１５ｍｇ／ｍｌ-Ｒとなるように接触させることにより、比活性が高く、耐久性に優れた固定化アルロースエピメラーゼが効率的に得られることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいてさらに検討を重ねることにより完成したものである。

【0012】

即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１． 比活性が５０Ｕ/ｍｇ以上であるアルロースエピメラーゼを含む酵素液を、負荷総タンパク質量が１．３～１５ｍｇ／ｍｌ-Ｒとなるように、スチレン系ポーラス型弱塩基性陰イオン交換樹脂又はスチレン系ゲル型弱塩基性陰イオン交換樹脂と接触させる工程を含む、記固定化アルロースエピメラーゼの製造方法。
項２． スチレン系ポーラス型弱塩基性陰イオン交換樹脂又はスチレン系ゲル型弱塩基性陰イオン交換のイオン交換基が３級アミンである、項１に記載の製造方法。
項３． 前記スチレン系ポーラス型弱塩基性陰イオン交換樹脂のイオン交換基が－Ｎ（ＣＨ₃）₂である、項１又は２に記載の製造方法。
項４． イオン交換樹脂と接触させる前記酵素液のアルロースエピメラーゼ単位数がイオン交換樹脂１ｍｌ当り２７０Ｕ以上である、項１～３のいずれかに記載の製造方法。

【発明の効果】

【0013】

本発明によれば、従来の固定化アルロースエピメラーゼと比べ、アルロースエピメラーゼ活性が高く、耐久性に優れた固定化アルロースエピメラーゼを得ることができる。また、本発明の方法で得られる固定化アルロースエピメラーゼを充填したカラムにフルクトース溶液を通液するという簡易な手法でアルロースを生産することが可能になる。更に、本発明の固定化アルロースエピメラーゼと既存の固定化グルコースイソメラーゼを組み合わせたカラムを用いれば、グルコースから異性化糖を含むアルロースを効率的に製造することもできる。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】実施例３において、固定化アルロースエピメラーゼを用いてフラクトースからアルロースの連続酵素反応を実施し、固定化アルロースエピメラーゼの半減期を評価した結果である。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本発明は、固定化アルロースエピメラーゼの製造方法であって、比活性が５０Ｕ/ｍｇ以上であるアルロースエピメラーゼを含む酵素液を、負荷総タンパク質量が１．３～１５ｍｇ／ｍｌ-Ｒとなるように、スチレン系ポーラス型弱塩基性陰イオン交換樹脂、又はスチレン系ゲル型弱塩基性陰イオン交換樹脂と接触させる工程を含むことを特徴とする。以下、本発明の製造方法について詳述する。

【0016】

［定義］
本発明において、「アルロースエピメラーゼの酵素活性（Ｕ）」は、アルロースを基質として、反応温度５０℃で反応させ、１分間に１μｍｏｌのフルクトースを生成する酵素力を１単位（Ｕ）としたものである。具体的には、２ｍＭの硫酸マグネシウムを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で溶解した０．２Ｍのアルロース溶液２５００μｌ、２ｍＭの硫酸マグネシウムを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）２１６７μｌ及びアルロースエピメラーゼ３３３μｌをスクリューキャップ付きの試験管に投入し、温水浴に浸して５０℃で１５分間反応させる。５質量％の塩酸水溶液を添加してｐＨ２．５～３．０に調整して酵素を失活させ、イオン交換樹脂による脱塩、フィルターろ過した後、ＨＰＬＣ分析する。生成したフルクトースのピーク面積比を用いて酵素活性を算出する。

【0017】

本発明において、「アルロースエピメラーゼの比活性（Ｕ／ｍｇ）」は、タンパク質１ｍｇがもつアルロースエピメラーゼの酵素活性（Ｕ）である。具体的には、(1)アルロースエピメラーゼを溶解させた酵素液を準備する、(2)当該酵素液のタンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）をブラッドフォード法で測定する、(3)当該酵素液のアルロースエピメラーゼの酵素活性（Ｕ／ｍｌ）を前述の方法で測定する、(4)得られたアルロースエピメラーゼの酵素活性（Ｕ／ｍｌ）をタンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）で除して、アルロースエピメラーゼの比活性（Ｕ／ｍｇ）を算出する、ことによって求めることができる。

【0018】

本発明において、「固定化アルロースエピメラーゼの比活性（Ｕ／ｍｌ-Ｒ）」は固定化樹脂１ｍｌ当たりの活性であり、以下の測定方法に基づいて測定される値である。具体的には、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で溶解した０．２Ｍのアルロース溶液２５００μｌ、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）２４８０μｌ、及び余計な水分を除いた膨潤状態の固定化アルロースエピメラーゼ２０ｍｇを１０ｍｌのスクリューキャップ付き試験管に投入し、温水浴に横に倒して浸漬させ、５０℃で１５分間振とう反応させる。その後５質量％の塩酸水溶液を添加してｐＨ３．０～２．５に調整して酵素を失活させて反応液を回収し、イオン交換樹脂による脱塩、フィルターろ過に供した後に、ＨＰＬＣ分析し、生成したフラクトースのピーク面積比から、固定化アルロースエピメラーゼの比活性（Ｕ／ｍｌ-Ｒ）を求める。

【0019】

本発明において「負荷総タンパク質量（ｍｇ／ｍｌ-Ｒ）」とは、接触させる酵素液の総量に含まれるタンパク質の質量（ｍｇ）を、当該酵素液に接触させたイオン交換樹脂の膨潤時の容量（１ｍｌ-Ｒ）で除することにより求められる値である。

【0020】

本発明において、「空間速度（ＳＶ）」とは、溶液をカラムに通液する速度の単位であり、「空間速度（ＳＶ）＝通液量（ｍｌ）／カラム体積（ｍｌ）／時間（ｈ）」にて算出される。

【0021】

［アルロースエピメラーゼ］
アルロースエピメラーゼとは、フルクトースとアルロースとの相互変換を触媒し得る酵素である。本発明で使用されるアルロースエピメラーゼの由来については特に制限されず、微生物、動物及び植物等の生物のいずれの由来であってもよい。例えば、アルロースエピメラーゼは、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ Ｍ３０株（寄託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－１１１１）、Ｐｓｅｕｄｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｅｕｍ ｓｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｃｉｎｄｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｅｕｍ ｂｏｌｔｅａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．等の微生物によって生産されることが知られている。

【0022】

また、本発明において固定化されるアルロースエピメラーゼは、前記生物を用いて製造したものであってもよく、また遺伝子工学的手法によって製造された組換えアルロースエピメラーゼであってもよい。更に、本発明で使用されるアルロースエピメラーゼは、前記生物由来のアルロースエピメラーゼに変異を施した変異体であってもよい。

【0023】

また、本発明において固定化されるアルロースエピメラーゼは、精製品又は粗精製品のいずれであってもよい。

【0024】

［固定化に供する酵素液］
本発明では、比活性が５０Ｕ／ｍｇ以上のアルロースエピメラーゼを含む酵素液を後述する固定化担体への固定化に供する。このように特定の比活性を有する酵素液と後述する固定化担体とを使用して、特定の負荷総タンパク質量でアルロースエピメラーゼの固定化を行うことによって、比活性が高く、耐久性に優れた固定化アルロースエピメラーゼを効率的に製造することが可能になる。

【0025】

固定化担体への固定化に供する酵素液のアルロースエピメラーゼの比活性については、５０Ｕ／ｍｇ以上であることを限度として特に制限されないが、比活性が高く耐久性に優れた固定化アルロースエピメラーゼをより一層効率的に製造するという観点から、好ましくは５０Ｕ／ｍｇ～２００Ｕ/ｍｇ、更に好ましくは５０～１６０Ｕ／ｍｇが挙げられる。

【0026】

固定化担体への固定化に供する酵素液の溶媒については、特に制限されず、水、緩衝液等のいずれであってもよい。

【0027】

［固定化担体］
本発明で使用されるアルロースエピメラーゼの固定化担体は、スチレン系ポーラス型弱塩基性陰イオン交換樹脂又はスチレン系ゲル型弱塩基性陰イオン交換樹脂である。このような特定の陰イオン交換樹脂を使用することによって、比活性が高く、耐久性に優れた固定化アルロースエピメラーゼを効率的に製造することが可能になる。

【0028】

スチレン系ポーラス型弱塩基性陰イオン交換樹脂とは、ポリスチレンジビニルベンゼンの共重合体のゲル状の樹脂基体からなり、物理的に穴（マクロポアー）を開けた多孔質の弱塩基性陰イオン交換樹脂である。

【0029】

スチレン系ポーラス型弱塩基性陰イオン交換樹脂の形態については、特に制限されず、例えば、粉状、球状、繊維状、膜状等のいずれであってもよい。

【0030】

スチレン系ポーラス型弱塩基性陰イオン交換樹脂におけるイオン交換基については、陰イオン交換が可能で弱塩基性を示す基であることを限度として特に制限されないが、例えば、第３級アミン、第４級アミン、ポリアミン等のアミンが挙げられる。これらのイオン交換基は、１種単独でスチレン系ポーラス型弱塩基性陰イオン交換樹脂に含まれていてもよく、２種以上を組み合わせてスチレン系ポーラス型弱塩基性陰イオン交換樹脂に含まれていてもよい。これらのイオン交換基の中でも、比活性が高く耐久性に優れた固定化アルロースエピメラーゼをより一層効率的に製造するという観点から、好ましくは第３級アミン、更に好ましくは基－Ｎ（ＣＨ₃）₂が挙げられる。

【0031】

スチレン系ポーラス型弱塩基性陰イオン交換樹脂としては、例えば、アーバンライトＥＰＡ９５、アンバーライトＩＲＡ９０４（以上、オルガノ社製）；デュオライトＡ３７８Ｄ（住化ケムテックス社製）；ピュロライトＡ１１１Ｓ、ピュロライトＡ１０３Ｓ（以上、ピュロライト社製）；ダイアイオンＷＡ２０、ダイアイオンＷＡ３０（以上、三菱レーヨンアクアソリューション社製）等が市販されており、本発明ではこれらの市販品を使用することもできる。

【0032】

スチレン系ゲル型弱塩基性陰イオン交換樹脂とは、ポリスチレンジビニルベンゼンの共重合体のゲル状の樹脂基体からなる弱塩基性陰イオン交換樹脂である。

【0033】

スチレン系ゲル型弱塩基性陰イオン交換樹脂の形態については、特に制限されず、例えば、粉状、球状、繊維状、膜状等のいずれであってもよい。

【0034】

スチレン系ゲル型弱塩基性陰イオン交換樹脂におけるイオン交換基については、陰イオン交換が可能で弱塩基性を示す基であることを限度として特に制限されないが、例えば、第３級アミン、第４級アミン、ポリアミン等のアミンが挙げられる。これらのイオン交換基は、１種単独でスチレン系ゲル型弱塩基性陰イオン交換樹脂に含まれていてもよく、２種以上を組み合わせてスチレン系ゲル型弱塩基性陰イオン交換樹脂に含まれていてもよい。これらのイオン交換基の中でも、比活性が高く耐久性に優れた固定化アルロースエピメラーゼをより一層効率的に製造するという観点から、好ましくは第３級アミンが挙げられる。

【0035】

スチレン系ゲル型弱塩基性陰イオン交換樹脂としては、例えば、ダイアイオンＨＰＡ２５Ｌ（三菱レーヨンアクアソリューション社製）、アンバーライトＩＲＡ４１１Ｓ（オルガノ社製）等が市販されており、本発明ではこれらの市販品を使用することもできる。

【0036】

スチレン系ポーラス型弱塩基性陰イオン交換樹脂及びスチレン系ゲル型弱塩基性陰イオン交換樹脂において、総交換容量（イオン交換樹脂が持っている最大のイオン交換量）については、特に制限されないが、比活性が高く耐久性に優れた固定化アルロースエピメラーゼをより一層効率的に製造するという観点から、通常１ｅｑ／ｌ－Ｒ以上、好ましくは１～２ｅｑ／ｌ－Ｒ、更に好ましくは１.２～１．５ｅｑ／ｌ－Ｒが挙げられる。

【0037】

本発明では、スチレン系ポーラス型弱塩基性陰イオン交換樹脂又はスチレン系ゲル型弱塩基性陰イオン交換樹脂のいずれか一方のみを使用してもよく、またこれらの双方を組み合わせて使用してもよい。

【0038】

これらの陰イオン交換樹脂の中でも、比活性が高く耐久性に優れた固定化アルロースエピメラーゼをより一層効率的に製造するという観点から、好ましくはスチレン系ポーラス型弱塩基性陰イオン交換樹脂、更に好ましくはイオン交換基として第３級アミンを有するスチレン系ポーラス型弱塩基性陰イオン交換樹脂が挙げられる。

【0039】

［アルロースエピメラーゼの固定化］
前記酵素液を前記固定化担体に対して負荷総タンパク質量が１．３～１５ｍｇ／ｍｌ-Ｒとなるように接触させることによって、アルロースエピメラーゼの比活性が高く、優れた耐久性を備える固定化アルロースエピメラーゼが得られる。

【0040】

前記酵素液を前記固定化担体に接触させるに先立って、緩衝液等の洗浄液を使用して、前記固定化担体を洗浄しておくことが望ましい。

【0041】

前記固定化担体に接触させる前記酵素液量は、負荷総タンパク質量が１．３～１５ｍｇ／ｍｌ-Ｒとなるように設定すればよいが、比活性が高い固定化アルロースエピメラーゼをより一層効率的に製造するという観点から、前記酵素液の負荷総タンパク質量として、好ましくは２～１５ｍｇ／ｍｌ-Ｒ、より好ましくは３～１０ｍｇ／ｍｌ-Ｒ、更に好ましくは５～１０ｍｇ／ｍｌ-Ｒが挙げられる。

【0042】

前記固定化担体と前記酵素液を接触させる工程において、前記酵素液に含まれるアルロースエピメラーゼ量と前記固定化担体の比率については、前記負荷総タンパク質量の範囲を充足できる範囲で適宜設定すればよいが、比活性が高い固定化アルロースエピメラーゼをより一層効率的に製造するという観点から、前記固定化担体の膨潤時の体積１ｍｌ当たり、接触させる前記酵素液に含まれるアルロースエピメラーゼの総量が２００～２０００Ｕ、好ましくは５００～１０００Ｕ、更に好ましくは６００～９００Ｕとなる比率が挙げられる。

【0043】

前記酵素液を前記固定化担体に接触させる方法については、特に制限されず、通常の固定化酵素の製造で採用されている方法を用いればよいが、具体的には、前記固定化担体を充填したカラムに前記酵素液を通液する方法、前記酵素液を入れた容器に前記固定化担体を添加する方法等が挙げられる。

【0044】

前記固定化担体を充填したカラムに前記酵素液を通液する方法の場合、前記固定化担体を充填したカラムに対する前記酵素液の空間速度については、特に制限されないが、例えば０．１～１．０ｈｒ^-1、好ましくは０．２～０．８ｈｒ^-1、更に好ましくは０．４～０．６ｈｒ^-1、が挙げられる。また、当該方法によって固定化アルロースエピメラーゼを製造する場合、カラムを通液して排出された酵素液は、再度カラムに通液することにより、酵素液を循環させて前記酵素液を繰り返し通液することが望ましい。

【0045】

また、前記固定化担体を充填したカラムに前記酵素液を通液する方法の場合、前記酵素液を通液する時間については、特に制限されないが、例えば５～２０時間、好ましくは１０～１８時間、更に好ましくは１２～１６時間が挙げられる。

【0046】

また、前記酵素液を入れた容器に前記固定化担体を添加する方法の場合、前記酵素液を入れた容器に前記固定化担体を添加して、必要に応じて撹拌を行い、アルロースエピメラーゼが前記固定化担体に固定化されるまでインキュベートすればよい。

【0047】

また、前記固定化担体を充填したカラムに前記酵素液を通液する方法の場合、記酵素液を入れた容器に前記固定化担体を添加してインキュベートする時間については、特に制限されないが、例えば１０～４０時間、好ましくは１５～３５時間、更に好ましくは２０～３０時間が挙げられる。

【0048】

斯くして得られた固定化アルロースエピメラーゼは、必要に応じて、緩衝液等の洗浄液を使用して洗浄を行ってもよい。また、得られた固定化アルロースエピメラーゼは、必要に応じて、グルタルアルデヒドやポリエチレンイミン等で架橋させて、アルロースエピメラーゼの固定化を強固にしてもよい。

【0049】

［固定化アルロースエピメラーゼの特性・用途］
斯くして得られた固定化アルロースエピメラーゼは、アルロースエピメラーゼの比活性が高く、優れた耐久性を備えることができている。

【0050】

本発明の製造方法で得られる固定化アルロースエピメラーゼが有する比活性として、通常１５０Ｕ／ｍｌ-Ｒ以上、好ましくは１５０～５００Ｕ／ｍｌ-Ｒ、更に好ましくは２００～５００Ｕ／ｍｌ-Ｒ、特に好ましくは２５０～５００Ｕ／ｍｌ-Ｒが挙げられる。

【0051】

また、本発明の製造方法で得られる固定化アルロースエピメラーゼが備える耐久性としては、以下の試験条件における固定化アルロースエピメラーゼの比活性の半減期が１５０日以上、好ましくは１６０～２５０日、更に好ましくは２００～２４０日が挙げられる。
（耐久性の試験条件）
ジャケット付きのガラス製カラム（内径２０ｍｍ、長さ４００ｍｍ）に、活性が４５００Ｕに相当する量の固定化アルロースエピメラーゼを充填する。別途、２ｍＭの硫酸マグネシウムを添加し、更に炭酸ナトリウムを添加してｐＨ７．８～８．０に調整した３５質量％のフラクトース溶液を準備する。当該フラクトース溶液を、固定化アルロースエピメラーゼが充填されたガラス製カラムに、ジャケット温度５５℃、上向流でフラクトース分が０．００４ｇ／ｈｒ／Ｕとなるように連続的に接触させる。例えば、比活性が４５０Ｕ／ｍｌ－Ｒの固定化アルロースエピメラーゼの場合、ジャケット付きのガラス製カラム（内径２０ｍｍ、長さ４００ｍｍ）に固定化アルロースエピメラーゼを１０ｍｌ充填し、上記フラクトース溶液を、空間速度５ｈｒ^-1で通液する。カラムから流出した流出液を２４時間毎に１回採取し、採取したそれぞれの液を、脱塩してフィルターろ過した後、ＨＰＬＣ分析し、フラクトース及びアルロースのピーク面積に占めるアルロースの面積を求め、変換率とした。変換率を経時的にプロットして近似直線を求め、その近似直線から試験開始１日後の変換効率の半分となる日数を求めて半減期とする。

【0052】

このように、本発明の製造方法で得られる固定化アルロースエピメラーゼは、アルロースエピメラーゼの比活性が高く、優れた耐久性を有しているので、フラクトース又はグルコースからアルロースを工業的に連続的に製造するのに適している。また、本発明の製造方法で得られる固定化アルロースエピメラーゼは、単独でアルロースの製造に使用してもよく、また他の固定化酵素（例えば、固定化グルコースイソメラーゼ等）と組み合わせてアルロースの製造に使用してもよい。

【実施例】

【0053】

以下に実施例を示して本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

【0054】

実施例１（固定化担体のスクリーニング）
１．固定化に使用するアルロースエピメラーゼの調製
固定化に使用するアルロースエピメラーゼは、次の（１）及び（２）に示す工程を経て調製した。

【0055】

（１）菌体培養と菌体回収
０．５質量％のアルロースを含む最少塩培地（ＭＳＭ培地）４ＬにＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ Ｍ３０株を植菌し、ジャーファメンターを用いて３０℃で２４時間、撹拌速度４００ｒｐｍ、通気量毎分０．１０Ｌ／培地Ｌで培養した。この培養液から遠心分離により菌体１００ｇ（湿重量）を回収し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した。

【0056】

（２）粗酵素の抽出工程
得られた菌体１００ｇ（湿重量）を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）１０００ｍｌに懸濁し、そこへ１０ｇ卵白リゾチーム（食品添加物、キューピー社製）及び５ｇ塩化ナトリウムを加え、３７℃で１２０分間加熱することにより、酵素の抽出反応を行った。その後、更に５５℃で１５分間の加熱を行い、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、３０分）により得られる上清を粗酵素液とした。当該租酵素液に含まれる総タンパク質１ｍｇ当りのアルロースエピメラーゼの比活性は４．９Ｕ/ｍｇであった。

【0057】

２．固定化担体の一次スクリーニング
アルロースエピメラーゼの固定化担体として、表１に示すイオン交換樹脂（市販品）を評価した。

【0058】

【表1】

【0059】

２ｍＭ硫酸マグネシウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した表１のイオン交換樹脂３５５ｍｇと前記で調製された３０Ｕのアルロースエピメラーゼを含む１０ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を混合し、２０℃に設定したチャンバー中でツイストミキサーを用いて２４時間ゆっくり撹拌させた。次いで、ピペットを用いて上清を除去し、１０ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で５回洗浄し、固定化アルロースエピメラーゼとした。

【0060】

一次スクリーニングにおける固定化アルロースエピメラーゼの酵素活性測定方法は次の通りである。即ち、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で溶解した０．２Ｍのアルロース溶液５００μｌ、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）４８０μｌ及び紙製のウエス（キムワイプ）で余計な水分を除いた固定化アルロースエピメラーゼ２０ｍｇをマイクロチューブに投入し、温水浴に浸して５０℃で１０分間反応させた。その後、９５℃の沸騰浴中に５分間投入して酵素を失活させ、イオン交換樹脂による脱塩、フィルターろ過した後、ＨＰＬＣ（分析カラム：ＭＣＩＧＥＬ ＣＫ０８ＥＣ 三菱化学社製）分析し、生成したフラクトースとアルロースの総ピーク面積に対するフラクトースのピーク面積比から、固定化アルロースエピメラーゼの比活性（Ｕ／ｍｌ-Ｒ）を求めた。

【0061】

得られた結果を表２に示す。その結果、スチレン系ポーラス型弱塩基性イオン交換樹脂及びスチレン系ゲル型弱塩基性イオン交換樹脂で固定化したアルロースエピメラーゼの比活性が高く、とりわけスチレン系ポーラス型で３級アミンを有するイオン交換樹脂、スチレン系ゲル型で３級アミンを有するイオン交換樹脂で固定化したアルロースエピメラーゼの比活性が高いという傾向が認められた。しかしながら、データには示していないが、フラクトースに固定化アルロースエピメラーゼを作用させてアルロースを連続的に生成させた別の実験においてスチレン系ポーラス型３級アミンであっても、強塩基性陰イオン交換樹脂は、生成したアルロースを分解し、純度を低くすることが認められ、固定化担体として不適当であることが分かった。

【0062】

【表2】

【0063】

３．固定化担体の二次スクリーニング
次に、一次スクリーニングで比活性が高く、効率的と評価されたＮｏ．１及び３のイオン交換樹脂について、固定化に使用するアルロースエピメラーゼの単位数を多くして、吸着固定化容量を評価した。

【0064】

アルロースエピメラーゼは大腸菌発現系を用いて生産されたものを用いた。即ち、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ Ｍ３０株由来のアルロースエピメラーゼ遺伝子をｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ社）に組み込み、それを大腸菌Ｍ１５（ＱＩＡＧＥＮ社）に導入して発現させ、得られた菌体１６ｇを８０ｍｌの２ｍＭ硫酸マグネシウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で懸濁して、超音波処理及び遠心分離により抽出及び精製した。得られたアルロースエピメラーゼの比活性は９３．８Ｕ／ｍｇであった。

【0065】

２ｍＭ硫酸マグネシウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した表１に示すＮｏ．１又は３のイオン交換樹脂１ｍｌと４５０Ｕ又は１０００Ｕのアルロースエピメラーゼを含む１０ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を混合し、２０℃に設定したチャンバー中でツイストミキサーを用いて２４時間ゆっくり撹拌させた。その後、ピペットを用いて上清を除去し、１０ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で５回洗浄し、固定化アルロースエピメラーゼとした。二次スクリーニングにおける固定化アルロースエピメラーゼの酵素活性測定方法は次の通りである。即ち、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で溶解した０．２Ｍのアルロース溶液２５００μｌ、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）２４８０μｌ及び紙製のウエス（キムワイプ）で余計な水分を除いた固定化アルロースエピメラーゼ２０ｍｇを１０ｍｌのスクリューキャップ付き試験管に投入し、温水浴に横に倒して置き、５０℃で１５分間振とう反応させた。５質量％の塩酸水溶液を添加してｐＨ３．０～２．５に調整して酵素を失活させ、イオン交換樹脂による脱塩、フィルターろ過した後、ＨＰＬＣ（分析カラム：ＭＣＩＧＥＬ ＣＫ０８ＥＣ 三菱化学社製）分析し、生成したフラクトースとアルロースの総ピーク面積に対するフラクトースのピーク面積比から、固定化アルロースエピメラーゼの比活性（Ｕ／ｍｌ-Ｒ）を求めた。

【0066】

得られた結果を表３に示す。その結果、意外なことに、負荷酵素単位数を多くした場合は、固定化アルロースエピメラーゼの比活性上昇することが認められた。そして、最も比活性の高い固定化アルロースエピメラーゼを与えるイオン交換樹脂は表１のＮｏ．１に示すイオン交換樹脂（オルガノ社製のアンバーライトＦＰＡ９５）であることも明らかとなった。

【0067】

【表3】

【0068】

更に、表１のＮｏ．１に示すイオン交換樹脂（オルガノ社製のアンバーライトＦＰＡ９５）を用いて、固定化に供するアルロースエピメラーゼの負荷酵素単位を代えて、アルロースエピメラーゼの固定化を行った。具体的には、２ｍＭ硫酸マグネシウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した表１に示すＮｏ．１又は３のイオン交換樹脂１ｍｌと、前記比活性９３．８Ｕ／ｍｇのアルロースエピメラーゼ５４０Ｕ、６３０Ｕ、９００Ｕ、１３５０Ｕ又は１８００Ｕを含む１０ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を混合し、２０℃に設定したチャンバー中でツイストミキサーを用いて２４時間ゆっくり撹拌させた。その後、ピペットを用いて上清を除去し、１０ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で５回洗浄して、固定化アルロースエピメラーゼを調製し、固定化アルロースエピメラーゼの比活性（Ｕ／ｍｌ-Ｒ）と固定化後に残存する酵素液の活性（Ｕ／ｍｌ）を測定した。具体的には、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で溶解した０．２Ｍのアルロース溶液２５００μｌ、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）２４８０μｌ及び紙製のウエス（キムワイプ）で余計な水分を除いた固定化アルロースエピメラーゼ２０ｍｇを１０ｍｌのスクリューキャップ付き試験管に投入し、温水浴に横に倒して置き、５０℃で１５分間振とう反応させた。５質量％の塩酸水溶液を添加してｐＨ３．０～２．５に調整して酵素を失活させ、イオン交換樹脂による脱塩、フィルターろ過した後、ＨＰＬＣ（分析カラム：ＭＣＩＧＥＬ ＣＫ０８ＥＣ 三菱化学社製）分析し、生成したフラクトースとアルロースの総ピーク面積に対するフラクトースのピーク面積比から、固定化アルロースエピメラーゼの比活性（Ｕ／ｍｌ-Ｒ）を求めた。また、２ｍＭの硫酸マグネシウムを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で溶解した０．２Ｍのアルロース溶液２５００μｌ、２ｍＭの硫酸マグネシウムを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）２１６７μｌ及び残存酵素液３３３μｌをスクリューキャップ付きの試験管に投入し、温水浴に浸して５０℃で１５分間反応させる。５質量％の塩酸水溶液を添加してｐＨ２．５～３．０に調整して酵素を失活させ、イオン交換樹脂による脱塩、フィルターろ過した後、ＨＰＬＣ分析する。生成したフルクトースのピーク面積比を用いて残存する酵素活性（Ｕ／ｍｌ）を求めた。

【0069】

得られた結果を表４に示す。この結果、負荷総タンパク質量が１．３～１５ｍｇ／ｍｌ-Ｒの範囲内であれば、比活性が高い固定化アルロースエピメラーゼを効率的に製造できることが分かった。

【0070】

【表4】

【0071】

４．他の微生物由来アルロースエピメラーゼの固定化
表１のＮｏ．１及び３のイオン交換樹脂について、他の微生物由来アルロースエピメラーゼの吸着固定化容量を同様に評価した。

【0072】

他の微生物由来アルロースエピメラーゼは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ Ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ Ｈ１０株由来アルロースエピメラーゼを用いた。即ち、Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社にて合成した当該アルロースエピメラーゼ遺伝子をｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ社）に組み込み、それを大腸菌Ｍ１５（ＱＩＡＧＥＮ社）に導入して発現させ、得られた菌体１６ｇを８０ｍｌの２ｍＭ硫酸マグネシウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で懸濁して、超音波処理及び遠心分離により抽出及び精製した。得られたアルロースエピメラーゼの比活性は１５６Ｕ／ｍｇであった。

【0073】

２ｍＭ硫酸マグネシウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した表１のＮｏ．１及び３のイオン交換樹脂１ｍｌと６３０Ｕのアルロースエピメラーゼ（タンパク質量で６．７ｍｇ）を含む１０ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を混合し、２０℃に設定したチャンバー中でツイストミキサーを用いて２４時間ゆっくり撹拌させた。次いで、ピペットを用いて上清を除去し、１０ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で５回洗浄し、固定化アルロースエピメラーゼを得た。２次スクリーニングと同様の方法で当該固定化アルロースエピメラーゼの比活性を測定した。

【0074】

得られた結果を表５に示す。この結果から、２次スクリーニングと同様に最も比活性の高い固定化アルロースエピメラーゼを与えるイオン交換樹脂は、表１のＮｏ．１に示すイオン交換樹脂（オルガノ社製のアンバーライトＦＰＡ９５）であった。

【0075】

【表5】

【0076】

実施例２（固定化アルロースエピメラーゼの製造）
１．固定化低活性アルロースエピメラーゼの製造（比較例）
固定化低活性アルロースエピメラーゼは、次の（１）～（３）に示す工程を経て調製した。

【0077】

（１）菌体培養と菌体回収工程
０．５質量％のアルロースを含む最少塩培地（ＭＳＭ培地）４ＬにＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ Ｍ３０株を植菌し、ジャーファメンターを用いて３０℃で２４時間、撹拌速度４００ｒｐｍ、通気量毎分０．１０Ｌ／培地Ｌで培養した。この培養液から遠心分離により菌体１００ｇ（湿重量）を回収し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した。

【0078】

（２）粗酵素の抽出工程
得られた菌体１００ｇ（湿重量）を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）１０００ｍｌに懸濁し、そこへ１０ｇ卵白リゾチーム（食品添加物、キューピー社製）及び５ｇ塩化ナトリウムを加え、３７℃で１２０分間加熱することにより、酵素の抽出反応を行った。その後、更に５５℃で１５分間の加熱を行い、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、３０分）により得られる上清を粗酵素液とした。粗酵素液に含まれる総タンパク質１ｍｇ当りのアルロースエピメラーゼの比活性は４．９Ｕ／ｍｇであった。

【0079】

（３）アルロースエピメラーゼの固定化
湿潤状態のイオン交換樹脂（表１のＮｏ．４に示すイオン交換樹脂、ピュロライト社製、商品名：ＰＵＲＯＬＩＴＥ Ａ１０３Ｓ）５０ｍｌをカラムに充填し、２ｍＭ硫酸マグネシウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した後、前記で調製したアルロースエピメラーゼを４５００Ｕ（タンパク質量で９１８ｍｇ）含む５００ｍｌの２ｍＭ硫酸マグネシウム含有５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を、４℃で１６時間、循環しながらイオン交換樹脂に通液して酵素を吸着させた後に、２ｍＭ硫酸マグネシウム含有５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄して固定化アルロースエピメラーゼを得た。この時負荷したタンパク質量は１８．３ｍｇ/ｍｌ-Ｒであった。得られた固定化アルロースエピメラーゼの比活性は５６Ｕ／ｍｌ-Ｒであった。

【0080】

２．固定化高活性アルロースエピメラーゼの製造
アルロースエピメラーゼは大腸菌発現系を用いて生産されたものを用いた。すなわち、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ Ｍ３０株由来のアルロースエピメラーゼ遺伝子をｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ社）に組み込み、それを大腸菌Ｍ１５株（ＱＩＡＧＥＮ社）に導入して発現させ、得られた菌体１６ｇを１６０ｍｌの２ｍＭ硫酸マグネシウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で懸濁して、超音波処理及び遠心分離により抽出及び精製し、アルロースエピメラーゼ液を得た。得られたアルロースエピメラーゼ液に含まれる総タンパク質１ｍｇ当りのアルロースエピメラーゼの比活性は５１．９Ｕ／ｍｇであった。

【0081】

湿潤状態のイオン交換樹脂（表１のＮｏ．１に示すイオン交換樹脂、オルガノ社製、商品名：アンバーライトＦＰＡ９５）５０ｍｌをカラムに充填し、２ｍＭ硫酸マグネシウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した後、前記で調製したアルロースエピメラーゼを１３５００Ｕ（タンパク質量で２６０ｍｇ）、２２５００Ｕ（タンパク質量で４３３ｍｇ）又は３１５００Ｕ（タンパク質量で６０７ｍｇ）含む５００ｍｌの２ｍＭ硫酸マグネシウム含有５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を、４℃で１６時間、循環しながらイオン交換樹脂に負荷して酵素を吸着させ後に、２ｍＭ硫酸マグネシウム含有５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄して固定化アルロースエピメラーゼを得た。得られた固定化アルロースエピメラーゼの比活性はそれぞれ、１６０Ｕ／ｍｌ-Ｒ、２０３Ｕ／ｍｌ-Ｒ、２４３Ｕ／ｍｌ-Ｒであった。

【0082】

実施例３（固定化アルロースエピメラーゼの連続使用）
実施例２で得られた固定化低活性アルロースエピメラーゼ（５６Ｕ／ｍｌ-Ｒ）及び固定化高活性アルロースエピメラーゼ（１６０Ｕ／ｍｌ-Ｒ、２０３Ｕ／ｍｌ-Ｒ、２４３Ｕ／ｍｌ-Ｒ）を用いてそれぞれ連続酵素反応を実施し、酵素反応の半減期を評価した。

【0083】

ジャケット付きのガラス製カラム（内径２０ｍｍ、長さ４００ｍｍ）に５６Ｕ／ｍｌ-Ｒの固定化低活性アルロースエピメラーゼを８０ｍｌ、１６０Ｕ／ｍｌ-Ｒの固定化高活性アルロースエピメラーゼを２８ｍｌ、２０３Ｕ／ｍｌ-Ｒの固定化高活性アルロースエピメラーゼを２２ｍｌ、及び２４３Ｕ／ｍｌ-Ｒの固定化高活性アルロースエピメラーゼを１８．５ｍｌそれぞれ充填した。また、別途、２ｍＭになるように硫酸マグネシウムを添加し、更に炭酸ナトリウムを添加してｐＨ７．８～８．０に調整した３５質量％のフラクトース溶液を準備した。前記カラムにフラクトース溶液を、ジャケット温度５５℃で、上向流で連続的に合計４３２０時間通液した。固定化したアルロースエピメラーゼ量（１Ｕ）あたり０．００７ｇ／ｈのフラクトースが接触するように、固定化低活性アルロースエピメラーゼの場合は空間速度をＳＶ＝１に、１６０Ｕ／ｍｌ－Ｒの固定化高活性アルロースエピメラーゼの場合は空間速度をＳＶ＝３に、２０３Ｕ／ｍｌ－Ｒの固定化高活性アルロースエピメラーゼの場合は空間速度をＳＶ＝３．６に、２４３Ｕ／ｍｌ－Ｒの固定化高活性アルロースエピメラーゼの場合は空間速度をＳＶ＝４．３にそれぞれ設定して通液した。流出液を２４時間毎に１回採取し、採取したそれぞれの液の一部を、イオン交換樹脂による脱塩及びフィルターろ過を行った後、ＨＰＬＣ（分析カラム：ＭＣＩＧＥＬ ＣＫ０８ＥＣ 三菱化学社製）分析に供し、フラクトース及びアルロースのピーク面積に占めるアルロースの面積を求め、変換率とした。変換率を経時的にプロットして近似直線を求め、その近似直線から試験開始１日後の変換効率の半分となる日数を求めて半減期として算出した。

【0084】

得られた結果を図１に示す。その結果、意外なことに、５６Ｕ／ｍｌ-Ｒの固定化低活性アルロースエピメラーゼの半減期が１４４日であるのに対し、１６０Ｕ／ｍｌ-Ｒの固定化高活性アルロースエピメラーゼの半減期は１５４日、２０３Ｕ／ｍｌ-Ｒの固定化高活性アルロースエピメラーゼの半減期は２０７日、２４３Ｕ／ｍｌ-Ｒの固定化高活性アルロースエピメラーゼの半減期は２３７日であった。即ち、比活性の高い固定化アルロースエピメラーゼは半減期が長くなり、耐久性に優れ、より連続反応に適していることが明らかとなった。

【図1】