特許 6990659 がん幹細胞（ＣＳＣ）含有細胞集団の培養のための化学的に規定された培地

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2021-12-08

(45)【発行日】2022-01-12

(54)【発明の名称】がん幹細胞（ＣＳＣ）含有細胞集団の培養のための化学的に規定された培地

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/095 20100101AFI20220104BHJP

   C12N 1/00 20060101ALI20220104BHJP

【ＦＩ】

C12N5/095

C12N1/00 G

【請求項の数】 15

(21)【出願番号】P 2018544270

(86)(22)【出願日】2017-02-17

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2019-03-14

(86)【国際出願番号】 EP2017053666

(87)【国際公開番号】W WO2017140876

(87)【国際公開日】2017-08-24

【審査請求日】2019-01-29

(31)【優先権主張番号】16156163.4

(32)【優先日】2016-02-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】518293239

【氏名又は名称】プロモセル・ゲー・エム・ベー・ハー

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】特許業務法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ビーラント，ハーゲン

【審査官】伊達 利奈

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１４－５１６５６２（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１４／１１８８１０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１０－５１６２５９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１３－２０８１０４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１５－５２６０８７（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１３／０３５８２４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１２／０４６７９７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開２０１０－２２７０８８（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１６／００２２７８９（ＵＳ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２００８／０２９９５４０（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ ５／００

Ｃ１２Ｎ １／００

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

水、少なくとも１つの炭素源、１つ以上のビタミン、１つ以上の塩、１つ以上の脂肪酸、１つ以上の緩衝成分、及び下記の微量元素
１．５ｎＭ～１５ｎＭの範囲の濃度のアルミニウム（Ａｌ）、
１．５ｎＭ～１５ｎＭの範囲の濃度のバリウム（Ｂａ）、
０．４ｎＭ～４ｎＭの範囲の濃度の臭素（Ｂｒ）、
４ｎＭ～４０ｎＭの範囲の濃度のカドミウム（Ｃｄ）、
１ｎＭ～１０ｎＭの範囲の濃度のコバルト（Ｃｏ）、
０．５ｎＭ～５ｎＭの範囲の濃度のクロム（Ｃｒ）、
２ｎＭ～２０ｎＭの範囲の濃度のゲルマニウム（Ｇｅ）、
０．２５ｎＭ～２．５ｎＭの範囲の濃度のヨウ素（Ｉ）、
１２ｎＭ～１２０ｎＭの範囲の濃度のフッ素（Ｆ）、
０．２ｎＭ～２ｎＭの範囲の濃度のニッケル（Ｎｉ）、
０．１ｎＭ～１ｎＭの範囲の濃度のマンガン（Ｍｎ）、
０．７ｎＭ～７ｎＭの範囲の濃度のモリブデン（Ｍｏ）、
４ｎＭ～４０ｎＭの範囲の濃度のルビジウム（Ｒｂ）、
４０ｎＭ～４００ｎＭの範囲の濃度のセレン（Ｓｅ）、
０．３ｎＭ～３ｎＭの範囲の濃度の銀（Ａｇ）、
１３０ｎＭ～１．３μＭの範囲の濃度のケイ素（Ｓｉ）、
０．１ｎＭ～１ｎＭの範囲の濃度のスズ（Ｓｎ）、
２ｎＭ～２２ｎＭの範囲の濃度のバナジウム（Ｖ）、及び
３．５ｎＭ～３５ｎＭの範囲の濃度のジルコニウム（Ｚｒ）
を含む、がん細胞の増殖に由来する３Ｄ球状体(3D tumorsphere)の培養のための化学的に規定された培地。

【請求項2】

いかなる成長因子も含まない、請求項１に記載の化学的に規定された細胞培養培地。

【請求項3】

１つ以上の成長因子を含む、請求項１に記載の化学的に規定された細胞培養培地。

【請求項4】

成分の全てが、がん幹細胞の増殖及び／又は維持を支持するのに十分な濃度で各々存在する、請求項１～３のいずれかに記載の化学的に規定された細胞培養培地。

【請求項5】

１つ以上の脂肪酸が、アラキドン酸、リノレン酸、リノール酸、オレイン酸、ミリスチン酸、パルチミン酸、ステアリン酸からなる群から選択される、請求項１～４のいずれかに記載の化学的に規定された培地。

【請求項6】

ポリソルベート、プルロニック（登録商標）Ｆ－６８、プルロニック（登録商標）１８８、ポロキサマー１８８の群から選択される少なくとも１つの非イオン性界面活性剤をさらに含む、請求項１～５のいずれかに記載の化学的に規定された培地。

【請求項7】

２つの非イオン性界面活性剤トゥイーン（登録商標）８０及びプルロニック（登録商標）Ｆ－６８を含む、請求項６に記載の化学的に規定された培地。

【請求項8】

１つ以上の成長因子が、上皮成長因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、インターロイキン６（ＩＬ－６）、インターロイキン８（ＩＬ－８）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）からなる群から選択される、請求項３～７のいずれかに記載の化学的に規定された培地。

【請求項9】

インスリン、トランスフェリン及び／又はアルブミンをさらに含む、請求項１～８のいずれかに記載の化学的に規定された培地。

【請求項10】

緩衝成分が、ＨＥＰＥＳ、無機炭酸水素塩、無機リン酸塩、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）から選択される、請求項１～９のいずれかに記載の化学的に規定された培地。

【請求項11】

少なくとも３つの緩衝成分、特に、ＨＥＰＥＳ、無機炭酸水素塩、無機リン酸塩を含む、請求項１～１０のいずれかに記載の化学的に規定された培地。

【請求項12】

コレステロール及び／又は酢酸トコフェロールをさらに含む、請求項１～１１のいずれかに記載の化学的に規定された培地。

【請求項13】

少なくとも２つの脂肪酸を含む、請求項６～１２のいずれかに記載の化学的に規定された培地。

【請求項14】

３Ｄ浮遊培養としてがん幹細胞を培養するための、請求項１～１３のいずれかに記載の化学的に規定された培地の使用。

【請求項15】

がん幹細胞、及び請求項１～１３のいずれかに記載の化学的に規定された培地を含む、細胞培養システム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、真核細胞培養のための化学的に規定された培地、並びにがん幹細胞の増殖及び／又は維持のための培地の使用に関する。

【背景技術】

【0002】

全てのタイプの幹細胞は、自己複製のホールマーク及び様々な最終的に成熟細胞タイプに分化する能力を共有する。これらの機構が正常な幹細胞において厳密に制御されているがゆえに、この潜在能力は幹細胞のゆるやかな複数段階の最終分化型成熟細胞へと向かう分化プロセスの間に次第に失われる［１］。

【0003】

１８６３年に、病理学者Ｒｕｄｏｌｆ Ｖｉｒｃｈｏｗは、「未成熟細胞」ががんの起源を代表することを述べる、がん幹細胞（ＣＳＣ）のモデルを最初に提唱している［２］。１９９７年に、Ｂｏｎｎｅｔは、骨髄球性白血病における「がんドライバー細胞（ｃａｎｃｅｒ ｄｒｉｖｅｒ ｃｅｌｌ）」としてのＣＳＣの特定の亜集団を記述している［３］。最近、ＣＳＣは、造血性の悪性疾患及びある範囲の固形腫瘍を含む様々ながんにおいて同定された［４］。

【0004】

腫瘍のがん幹細胞モデルにおいて、ＣＳＣは、腫瘍を自己複製及び維持する独占的な能力を有するアノイキス耐性悪性細胞の小さなサブセットとして規定される。それらは非腫瘍形成性がん細胞タイプの異質な集団に分化することができ、これらは通常、腫瘍のほとんどを構成する［５］。この状況において、悪性表現型であるにもかかわらず、ＣＳＣが、正常な幹細胞の共通のホールマークを共有し、これらの細胞に特別な生物学的な潜在能力を与えることは明らかである。

【0005】

ＣＳＣは、原発腫瘍から分離可能であり、身体を通って移動し、拡散して、そこで離れた器官に二次性の腫瘍（転移）を形成することができる。転移は、急速に起こることもあり、又は、原発腫瘍の処置が見た目上は成功した後に、数年にわたって起こることもある。伝統的な治療アプローチは、手術、照射、化学療法及び生物製剤（ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）の手段によって、腫瘍塊をできる限り排除することを目的としている。しかし、これらの措置は、急速に分裂している腫瘍の細胞塊（より無害である）を標的とするが、疾患の根源であると推定されるＣＳＣを根絶しないことが、積み上げられた証拠によって示唆されている。

【0006】

静止状態のＣＳＣは、その幹細胞特性により媒介される保護機構を使用して現在の治療レジメンを逃れることが可能であるので、それによって再発が引き起こされると考えられる。したがって、今、がん研究を、特に悪性疾患を処置する新しい臨床戦略を探索する場合に、変革する。ＣＳＣは、新しい治療標的であると解され、それらを排除することによって永久的な緩解をもたらすか又は治癒さえももたらすと考えられる。これは、ＣＳＣを直接的に根絶することによって達成されてもよく、又はＣＳＣ細胞分裂を非対称性から対称性へ特異的に適合させて、その自己複製能力をブロックすることによりＣＳＣ集団の排除をもたらすことによって達成されてもよい［５、６］。これを達成するため、ＣＳＣの詳細な特徴付けを可能にする、生物学的に関連性のある培養システムが必要とされている。

【0007】

倫理的な理由のために、それらの機能性の特徴付け及び評価が、間接的な方法に頼る必要があることは、全てのタイプのヒト起源の幹細胞に共通している。

【0008】

今日では、様々なタイプの幹細胞が十分に特徴付けされており、これらの細胞を確実に識別する技術も開発されている。一例として、多能性幹細胞に関して、免疫無防備状態のマウスにおける奇形腫のインビボ形成又は全ての三胚葉へと分化する胚様体のインビトロ生成が、多能性試験の代替方法として使用されている［７］。Ｏｃｔ－３／４、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ及びＴｒａ抗原などの多能性マーカー発現パターンに関する試験も、多能性の状態の間接的な証拠として現在広く受け入れられている（総説に関して［８］を参照されたい）。細かく規定されかつ最適化された培養システムの最近の進捗のおかげで、今日の科学者は、多能性幹細胞の完全に規定された／ヒト化誘導及び非制限的な成長を可能とすることができる。

【0009】

対照的に、ＣＳＣ生物学の探索及びそれらの信頼のおける特徴付けのためのツールとして、ＣＳＣの持続性維持のための生物学的に関連性のある培養システムの開発は、依然として不十分である。したがって、複数タイプの正常な幹細胞に関して首尾よく実証されたように、様々なアプローチが、マーカー検出に基づいてＣＳＣを特徴付けるため行われてきた。これらには、細胞内及び細胞外分子の染色、並びにアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ１）又はＡＢＣトランスポートシステムなどの小分子輸送体のような特定の細胞の酵素の活性を測定することが含まれる［９～１１］。しかし、研究は、異なるがんにおけるＣＳＣの不均一性［５、１２］、並びに腫瘍形成のような機能的なＣＳＣ特徴を有する確立されたマーカーの特異性、一貫性及び相関性の欠如［５、１３］によって妨げられている。したがって、ＣＳＣの検出及び特徴付けのための、頑強で、信頼のおける、とりわけ総合的な、マーカーに基づく方法は、遠い期待であるように思われてきた。結果として、現在、ＣＳＣ研究における最大の障壁は、十分な数の機能的で均質なＣＳＣ集団の単離及び精製である。生物学的に有意義なインビトロ培養システムが欠如していることから、これらの困難性は増しており、ほとんどの他のタイプの幹細胞については利用可能である技術的可能性と、きわめて対照的である。

【0010】

現在、ＣＳＣは、連続的に成長する腫瘍の生成を繰り返す、それらの能力によって実験的にのみ規定することができる［５］。現在まで、ＣＳＣの分析に関して最も受け入れられている戦略は、一般に、それらの基礎的な機能的特徴に基づいている。これらには、自己複製及び多能性のような典型的な幹細胞特性、並びに連続的に伝達される腫瘍形成の可能性及びアノイキス耐性のようながんの特異的なホールマークが含まれる。しかし、また主要なモデルシステムの欠如は、研究が、代替モデルシステム及び試験によって生成される間接的な読み出された情報に頼ることを強制されることを意味している。ＣＳＣに対するゴールドスタンダードであるインビボアッセイは、免疫無防備状態マウスの同所性部位への連続的な移植である。しかし、これは労力を要し、結果の解釈が困難であることがある［５］。もっぱら機能的基準においてＣＳＣの固有の特徴の組合せを選択的に活用する最も有意なインビトロ法の１つは、３Ｄ浮遊培養における連続的に継代可能な腫瘍様塊（ｔｕｍｏｒｓｐｈｅｒｅ）の形成である［５］。

【0011】

悪性腫瘍に匹敵して、確立されたがん細胞系の主な細胞塊は、がん及びそれらが由来する組織のタイプに依存する組織特異性を有する、幾分機能的に最終分化した細胞からなる。したがって、がん細胞系は、コストの理由ゆえに、及び、正常な初代細胞の限られた寿命により定められる制限を避ける普遍的な細胞の供給源であるがゆえに、広く受け入れられ十分に確立された初代培養に替わるモデルシステムとして、研究に広く使用されている。

【0012】

実際、これらの細胞系は、培養に対して無限の寿命及び増殖ポテンシャルを授ける、小さいが、安定的なＣＳＣの亜集団（ドライバー細胞）を含有する。したがって、今日、がん細胞系は、ＣＳＣ標的化アプローチを含むがん研究に関する最も重要なインビトロモデル及び明確に規定された細胞供給源も提示している［１４～１９；２７～２８］。

【0013】

これらの細胞系に使用される２つの最も顕著な培養技術は：
１）主として、様々な量のウシ胎児血清及び最終的に追加のサプリメントを補充したＤＭＥＭ又はＤＭＥＭ－ハムＦ１２栄養混合物などの標準基本培地中での接着性２Ｄ培養［１６］。
２）二番目に重要な培養方法は、非規定であるが、主として、ＤＭＥＭ－ハムＦ１２栄養混合物に基づく無血清培地を用いる、球（腫瘍様塊）としての３Ｄ浮遊培養である［１８～２０］である。

【0014】

非規定培地を使用する接着性２Ｄ培養技術は、以下のＣＳＣに関連する幾つかの欠点を有する：
ａ）幾つかのタイプの幹細胞について実証されたように、これらの培養培地は、その性質が規定されていないことにより、ＣＳＣを含む幹細胞特性に干渉し、幹細胞の分化を優先的に支持する場合がある［２１］。したがって、非規定培地における２Ｄ培養は、初代細胞代用品として分化型細胞を得るための適切な培養方法であるが、これらの条件下で通常＜１％であるＣＳＣ亜集団が目的の標的である場合には、より不適切な培養方法である。

【0015】

ｂ）非規定培養培地は、実験的な変動性の有力な発生源である。上述の培地は、規定されかつ制御される培養環境には許容されない。標的ＣＳＣに対する細胞単離又は薬物スクリーニングのような実験手順は、培養培地の非規定成分の効果に起因して誤った結果を伝える場合がある。さらに、細胞は、そのような培養条件によって有意に変化し得る［２２］。

【0016】

腫瘍様塊の３Ｄ浮遊培養技術は、初代ニューロン細胞並びに脳がん細胞、たとえばグリア芽細胞腫（連続的に継代及び増殖できるが、幹細胞プール（自己複製）及び分化ポテンシャルを維持している、いわゆる「神経幹細胞塊（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ）培養」［２３］）の培養に関して当初開発された方法から採用された。したがって、この培養方法は、多分化能ニューロン（がん）細胞の培養に関する強力なインビトロモデルとして、このタイプの細胞の探索を有意にスピードアップさせることを促すことが、既に証明されている。

【0017】

これらの神経幹細胞塊培養に関して確立された培地は、本出願において良好に機能し、中心的な培地として、ほぼ、ＤＭＥＭ－ハムＦ１２栄養混合物及び独自開発のＢ２７（登録商標）サプリメント（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、上皮成長因子（ＥＧＦ）及び塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ、ＦＧＦ－２）を補充したそのバリアントのみに基づく［２３］。最終的に、アルブミン、ヒドロコルチゾン及び／又はヘパリンなどでさらなる補充を行った。３Ｄ神経幹細胞塊培養技術が、単に機能的なレベルにおいてアノイキス耐性及び自己複製能力などのニューロン（がん）幹細胞の固有の生物学的特徴を選択的に活用しているので、この培養方法が、同じ生物学的特性を共有している他のタイプのがんからのＣＳＣの培養に有用であることも証明し得ることは明らかであった。

【0018】

結果として、「腫瘍様塊培養」と称される３Ｄ腫瘍モデルシステムとして他のがん細胞培養のための神経幹細胞塊培養システムを採用することが試みられた［１８、１９］。腫瘍様塊は小さい腫瘍様構造と構造的に似ており、幹細胞並びに腫瘍形成特性はこのタイプの培養において増強され得るので［２０］、研究者は、２Ｄ標準培養からの細胞の代わりに腫瘍様塊由来がん細胞を使用することを目的としている。

【0019】

しかし、球培養法は、神経（がん）幹細胞の培養における全ての前述の技術的及び生物学的利点を活用することができるが、他のがん細胞タイプの腫瘍様塊培養は、この培養システムにおける幾つかの短所をなおも受ける：
１）全てのタイプのがん細胞培養が、これらの「神経幹細胞塊培養条件」下で腫瘍様塊を形成することができるとは限らない［２４］。

【0020】

２）神経幹細胞塊培養とは極めて対照的に、腫瘍様塊培養の連続継代能力（ｓｅｒｉａｌ ｐａｓｓａｇｅａｂｉｌｉｔｙ）は、多くの場合、限られた期間（３～５の連続的な継代）しか支持されないか、又は全く支持されないことすらある［２４］。

【0021】

これは、望ましくない効果として、ドライバー細胞（すなわち、ＣＳＣ）が、これらの培養条件下で、何らかの様式で失われることを示唆している。これらの既存の制限にもかかわらず、研究は、インビトロ腫瘍モデルとして、その都合よい特性に関連する腫瘍様塊培養のユニークな利点を採用することを要求している。したがって、科学者は、２Ｄ培養から新たに確立された又は非常に低い連続継代にある、腫瘍様塊に由来する、がん細胞を使用することを強制されることが多い。しかし、そのような変質している腫瘍様塊から由来する細胞は、機能的なＣＳＣが既に枯渇している可能性がある。さらに、新たに確立された腫瘍様塊培養における細胞は、十連続継代の腫瘍様塊培養からの細胞と比較することができない可能性が高い。すなわち少ない継代で新たに確立された腫瘍様塊は、どちらかというと当初の血清含有２Ｄ標準培養由来の細胞の特徴を示すであろうが、十継代における連続的に継代された腫瘍様塊からの細胞は、この洗練された培養技術によって幹細胞集団へと仲介されるユニークな特徴の全てを、獲得することになる。

【0022】

それらは古典的な神経幹細胞塊培養培地の処方に遡るので、確立された市販の公開されたＣＳＣ培養培地は、広範囲のがん細胞タイプ／ＣＳＣの培養及び維持の支持に関連するこれらの強い制限をなお共有している。

【0023】

ＣＳＣは、異質であり、細胞周期の遅い細胞（ｓｌｏｗ－ｃｙｃｌｉｎｇ ｃｅｌｌｓ）である可能性のある、デリケートなグループである［２５］。そらの幹細胞特性に加えて、がん細胞に固有の遺伝的な及び代謝性の異常は、そらの拡大された培地要求性の一部の原因であり得る。実際、がん性細胞に形質転換を起こしている細胞が、それらの代謝を広範に順応させていることは周知されている［２６］。

【0024】

ＤＭＥＭ－ハムＦ１２栄養混合物（確立されたＣＳＣ培地に使用されるような）は、無血清培養培地及びさらに幾つかの細胞タイプに関するいくつかの化学的に規定された処方の開発に関する基礎として伝統的に使用されている。しかし、腫瘍様塊培養において観察されたように、ＤＭＥＭ－ハムＦ１２栄養混合物は、より規定された処方において、がん細胞の異質なグループの広範に変動する要求を、確実に充足することはできない。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0025】

【文献】Ｓａｎｇｅｓ、Ｄ． ａｎｄ Ｍ．Ｐ． Ｃｏｓｍａ、Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｃｅｌｌ ｆａｔｅ ｔｏ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ： ｔｈｅ ｄｅｃｉｓｉｏｎ－ｍａｋｉｎｇ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ． Ｉｎｔ Ｊ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ、２０１０． ５４（１１～１２）： ｐ． １５７５～８７．

【文献】Ｔｕ、Ｓ．Ｍ．、Ｃａｎｃｅｒ： ａ “ｓｔｅｍ－ｃｅｌｌ” ｄｉｓｅａｓｅ？ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｉｎｔ、２０１３． １３（１）： ｐ． ４０．

【文献】Ｂｏｎｎｅｔ、Ｄ． ａｎｄ Ｊ．Ｅ． Ｄｉｃｋ、Ｈｕｍａｎ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｓ ｏｒｇａｎｉｚｅｄ ａｓ ａ ｈｉｅｒａｒｃｈｙ ｔｈａｔ ｏｒｉｇｉｎａｔｅｓ ｆｒｏｍ ａ ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌ． Ｎａｔ Ｍｅｄ、１９９７． ３（７）： ｐ． ７３０～７．

【文献】Ｊｏｒｄａｎ、Ｃ．Ｔ．、Ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ： ｆｒｏｍ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｔｏ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、２００４． １６（６）： ｐ． ７０８～１２．

【文献】Ｃｌａｒｋｅ、Ｍ．Ｆ．、ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ－－ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｏｎ ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｕｓ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ： ＡＡＣＲ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ ｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、２００６． ６６（１９）： ｐ． ９３３９～４４．

【文献】Ｌａｍｂ、Ｒ．、ｅｔ ａｌ．、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ｔｈａｔ ｔａｒｇｅｔ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｅｒａｄｉｃａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ａｃｒｏｓｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｔｕｍｏｒ ｔｙｐｅｓ： ｔｒｅａｔｉｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｌｉｋｅ ａｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ、２０１５． ６（７）： ｐ． ４５６９～８４．

【文献】Ｓｈｅｒｉｄａｎ、Ｓ．Ｄ．、Ｖ． Ｓｕｒａｍｐｕｄｉ、ａｎｄ Ｒ．Ｒ． Ｒａｏ、Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｉｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｓ ａ ｍｅａｎｓ ｔｏ ａｓｓｅｓｓ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｉｎｔ、２０１２． ２０１２： ｐ． ７３８９１０．

【文献】Ｚｈａｏ、Ｗ．、ｅｔ ａｌ．、Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｍａｒｋｅｒｓ． Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２０１２． １７（６）： ｐ． ６１９６～２３６．

【文献】Ａｄｉｌ、Ｍ．、ｅｔ ａｌ．、Ａｌｄｅｈｙｄｅ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ： Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ． ２０１２．

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【文献】Ｇｒｅｖｅ、Ｂ．、ｅｔ ａｌ．、Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ． Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ａ、２０１２． ８１（４）： ｐ． ２８４～９３．

【文献】Ｓｔｕｅｌｔｅｎ、Ｃ．Ｈ．、ｅｔ ａｌ．、Ｃｏｍｐｌｅｘ ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｔｕｍｏｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ＮＣＩ６０ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｐａｎｅｌ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、２０１０． ２８（４）： ｐ． ６４９～６０．

【文献】Ｌｉｕ、Ｙ．、ｅｔ ａｌ．、Ｌａｃｋ ｏｆ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ、２０１４． １１０（８）： ｐ． ２０６３～７１．

【文献】Ｋｉｍ、Ｈ．Ｓ．、Ｙ．Ｊ． Ｓｕｎｇ、ａｎｄ Ｓ． Ｐａｉｋ、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｐａｎｅｌｓ Ｅｍｐｏｗｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ－Ｂａｓｅｄ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ． Ｙｏｎｓｅｉ Ｍｅｄ Ｊ、２０１５． ５６（５）： ｐ． １１８６～９８．

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【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0026】

したがって、連続的に継代可能な腫瘍様塊としてのＣＳＣ含有細胞集団の培養のための、化学的に規定された細胞培養培地を提供することが本発明の課題である。

【課題を解決するための手段】

【0027】

（発明の要旨）
この課題は、本発明の主題によって解決される。本発明は、水、少なくとも１つの炭素源、１つ以上のビタミン、１つ以上の塩、１つ以上の脂肪酸、１つ以上の緩衝成分、セレン及び１つ以上のさらなる微量元素を含む、真核細胞培養のための化学的に規定された培地を提供する。化学的に規定された培地は、１つ以上の成長因子を含み得る。あるいは、化学的に規定された培地は、成長因子を含まなくてよい。

【0028】

本発明者らは、標準化された培養環境における広範囲のＣＳＣ含有がん細胞系の３Ｄ腫瘍様塊培養を可能にする、化学的に規定された培養培地の必要な成分を同定した。本発明による化学的に規定された培地は、好ましくは、種々の脂肪酸及び種々の微量元素を含む。本発明による化学的に規定された培地は、ＣＳＣ自己複製を示す３Ｄ腫瘍様塊培養の連続的な増殖及び連続的な継代能力を与える。完全に順応させた腫瘍様塊培養が確立されたら、細胞は連続的に継代することができる。

【0029】

化学的に規定された培地は、ＣＳＣの維持のためのインビトロツールとして及び腫瘍形成のモデルとしての腫瘍様塊培養技術の完全な潜在能力及び生物学的有意性の活用を可能にする。

【0030】

本発明は、がん幹細胞を培養するための、化学的に規定された培地の使用をさらに提供する。

【図面の簡単な説明】

【0031】

【図1】ＣＳＣ培地１（三角形）対腫瘍様塊培養用比較ＣＳＣ培地（菱形）における、３Ｄ腫瘍様塊培養の連続的な継代の間の、ＭＣＦ－７乳癌細胞の累積的な集団倍加のプロットを示す。ウェル当たり４万個のＭＣＦ－７細胞（１０，０００／ｍｌ）を、６ウェル浮遊培養プレートを使用してそれぞれの培地中に三連でプレートに入れた。プロトコールによる酵素解離による連続的な継代を、９日毎に行った。腫瘍様塊形成及び増殖は、培養の間に維持されたが、これは十継代の後に、成長速度阻害の徴候なく中断された。

【図2】化学的に規定された培地における腫瘍様塊培養の連続的な継代の間の、異なる継代数でのＭＣＦ－７細胞の腫瘍様塊形成効率（ＴＦＥ）を示す。ＭＣＦ－７細胞を、ウェル当たり１つの単独細胞で、９６ウェルｕ底浮遊培養プレートに入れた。１０日後、全てのウェルを、腫瘍様塊の存在について確認した。腫瘍様塊を形成した、全てのプレートに入れた細胞の割合を、計算した（％におけるＴＦＥ）。化学的に規定された培地において腫瘍様塊として培養されたＭＣＦ－７細胞に関するＴＦＥは、一継代（Ｐ１）で２％であったが、Ｐ４において１４％に及びＰ９において２８％に増加した（バー）。

【図3】ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ ＣＳＣ培地２において培養されたＭＣＦ－７細胞の３Ｄ培養内の三次（三継代）腫瘍様塊の顕微鏡画像を示す。細胞の拡大率は、１００倍である。

【発明を実施するための形態】

【0032】

明細書及び特許請求の範囲明瞭かつ矛盾のない理解、並びに以下のような用語の範囲を提供するため、以下の定義が提供される。

【0033】

本明細書で使用する用語「成分（ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ）」は、化学的起源であろうと生物学的起源であろうと、細胞培養培地に使用して、細胞の成長又は増殖を維持又は促進することができる、任意の化合物を指す。用語「成分（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）」、「栄養分（ｎｕｔｒｉｅｎｔ）」及び「成分（ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ）」は、交換可能に使用することができ、全てがそのような化合物を指すことを意味する。細胞培養培地において使用される典型的な成分は、アミノ酸、塩、金属、糖、脂質、核酸、ホルモン、ビタミン、脂肪酸、タンパク質などを含む。エクスビボで細胞の成長を促進又は維持する他の成分は、特定の必要性に従って、当業者が選択することができる。

【0034】

本明細書で使用する用語「培地」、「細胞培養培地」、「培養培地」及び「培地処方」は、細胞を培養する又は成長させるための栄養溶液を指す。

【0035】

本明細書で使用する「細胞培養」は、人工的なインビトロ環境において維持され、培養され又は成長する細胞又は組織を意味する。用語「培養する（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｎｇ）」及び「培養する（ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ）」は、同義である。

【0036】

本明細書で使用する「化学的に規定された培地」は、全ての成分及び濃度が知られる培地である。それは、特に「無血清」であり、つまり培地は血清（たとえば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ヒト血清、ウマ血清、ヤギ血清など）を含有しない。

【0037】

「培養器」は、成長している細胞のための無菌的な環境を提供することができる様々なサイズのガラス容器、プラスチック容器又は他の容器を意味する。たとえば、フラスコ、単一ウェルプレート又はマルチウェルプレート、単一ウェル皿又はマルチウェル皿、又はマルチウェルマイクロプレートを、使用することができる。

【0038】

本明細書で使用する用語「栄養補給（ｆｅｅｄｉｎｇ）」及び「培地交換」は、細胞が培養される培地を置き換えることを指す。本明細書で使用する用語「継代（ｐａｓｓａｇｅ）」及び「継代すること（ｐａｓｓａｇｉｎｇ）」は、以前の培養から新鮮な細胞培養培地にいくつか又は全ての細胞を移すことを意味する。

【0039】

本明細書で使用する用語「微量元素」は、わずか微量で細胞培養培地中に存在する部分（ｍｏｉｅｔｙ）を指す。本発明においては、この用語は、Ｓｅ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｆｅ、Ａｇ、Ａｌ、Ｂａ、Ｃｄ、Ｃｏ、Ｃｒ、Ｇｅ、Ｓｅ、Ｂｒ、Ｉ、Ｍｎ、Ｆ、Ｓｉ、Ｖ、Ｍｏ、Ｎｉ、Ｒｂ、Ｓｎ又はＺｒのような元素を特に指すが、これらの元素を異なる酸化状態で含む、それぞれの塩も指し得る。

【0040】

本明細書で使用する用語「塩」又は「無機塩」は、微量を超えて細胞培養培地中に存在する要素の塩を指す。

【0041】

本明細書で使用する「微量」は、特に１ｍｇ／Ｌ未満の濃度を指す。

【0042】

用語「無血清培養条件」及び「無血清条件」は、いかなるタイプの血清も排除された細胞培養条件を指す。

【0043】

当該技術分野における定義と一致して、本発明による用語「成長因子」は、細胞の成長、増殖、治癒、及び細胞の分化を刺激することができる天然に存在する物質に関し、特に、上皮成長因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）又はトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）のような名の用語をもつ成長因子、及びインターロイキン６（ＩＬ－６）、インターロイキン８（ＩＬ－８）のようなサイトカインのクラスに関する。

【0044】

本発明は、水、少なくとも１つの炭素源、１つ以上のビタミン、１つ以上の塩、１つ以上の成長因子、１つ以上の脂肪酸、１つ以上の緩衝成分、セレン及び１つ以上のさらなる微量元素を含む、真核細胞培養のための化学的に規定された培地を提供する。

【0045】

本発明による化学的に規定された培地は、腫瘍様塊培養のための、価値あるツールである。実施例に示されるように、本発明による化学的に規定された培地は、３Ｄ腫瘍様塊の形態におけるがん細胞培養の連続的な継代を支持する。さらに、それは、異なるがん細胞タイプに対して普遍的に適用可能である。

【0046】

腫瘍の形成において、悪性疾患の発生を最終的にもたらす、異常細胞を生成させる可能性のある事象／変異の不均一性は、異なるタイプのがんを比較する場合に（及び単一腫瘍内での細胞を比較する場合においてさえも）、がん細胞において見出される同じ遺伝的な不均一性及び生理的な不均一性に反映される。全ての主要なタイプのがんの確立された細胞系は、培地要求性の変動をも示す。これらの細胞系は、これらの異なるタイプの悪性疾患の広く受け入れられるインビトロモデルを代表する。化学的に規定された培地は、異なるタイプ及び組織起源のがんにおける代謝要求性の変動の範囲を網羅する（表１）。

【0047】

さらに、本発明による化学的に規定された培地を用い、普通の浮遊培養プラスチック製品中でがん細胞培養物を成長させることが可能である。コスト的に低い付着性プラスチック製品は、必要ではない。

【0048】

１つの実施形態によると、この化学的に規定された培地の成分は、がん幹細胞の増殖及び／又は維持を支持するのに十分な濃度で各々存在する。いかなる成分の濃度も、化学的に規定された培地の総容積に基づく。

【0049】

真核細胞培養のための全ての培地と同様に、本発明による化学的に規定された培地は、水、少なくとも１つの炭素源、１つ以上のビタミン、１つ以上の塩及びセレンを含有する。これらの成分は、本明細書で「基礎培地成分」とも呼ばれる。本発明による化学的に規定された培地の調製において、基礎培地成分は、基礎培地によって提供され得る。用語「基礎培地」は、真核細胞の成長を支持し、追加の成分の補充を使用して、本発明による細胞培養のための培地を形成することができる、任意の培地を指す。基礎培地は、塩、たとえば、マグネシウム、カルシウム、ナトリウム及びカリウムの塩及び微量元素の任意選択的な塩、並びにビタミン、グルコース、緩衝系及び必須アミノ酸を供給する。本発明に使用することができる基礎培地は、ダルベッコ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、基礎培地イーグル（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆ－１０、ハムＦ－１２、α最小必須培地（αＭＥＭ）、Ｇｌａｓｇｏｗの最小必須培地（Ｇ－ＭＥＭ）、及びＩｓｃｏｖｅの修正ダルベッコ培地を含むが、それらに限定されない。

【0050】

したがって、化学的に規定された培地は、少なくとも１つの炭素源を含む。炭素源は、好ましくは、グルコース、ガラクトース、マンノース及びフルクトースの群から選択されるヘキソース糖である。糖は、特にＤ－グルコースである。炭素源の濃度は、好ましくは、０．４５ｇ／Ｌ～４．５ｇ／Ｌの範囲である。

【0051】

また、化学的に規定された培地は、１つ以上の塩を含む。塩は、好ましくは、硝酸カルシウム四水和物、塩化カルシウム、二塩化マグネシウム六水和物、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、硝酸カリウム、塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、炭酸水素ナトリウム及び酢酸ナトリウムからなる群から選択される。

【0052】

塩は、好ましくは、がん幹細胞の増殖及び／又は維持を支持するのに十分な濃度で存在する。塩は、たとえば、以下の濃度で培地中に含有される：硝酸カルシウム四水和物を１２ｍｇ／Ｌ～１２０ｍｇ／Ｌの範囲、二塩化マグネシウム六水和物を９ｍｇ／Ｌ～９０ｍｇ／Ｌの範囲、硫酸マグネシウム無水物を４ｍｇ／Ｌ～４０ｍｇ／Ｌの範囲、塩化カリウムを８０ｍｇ／Ｌ～８００ｍｇ／Ｌの範囲、塩化ナトリウムを１ｇ／Ｌ～１０ｇ／Ｌの範囲、リン酸水素二ナトリウム無水物を５０ｍｇ／Ｌ～５００ｍｇ／Ｌの範囲、及びリン酸二水素ナトリウム無水物を４ｍｇ／Ｌ～４０ｍｇ／Ｌの範囲。

【0053】

さらに、基礎培地成分は、１つ以上のビタミンである。１つ以上のビタミンは、好ましくは、Ｄ－ビオチン、Ｄ－Ｃａパントテン酸塩、葉酸、ニコチンアミド、ピリドキサール塩酸塩、ピリドキシン塩酸塩、リボフラビン、チアミン塩酸塩、ビタミンＢ１２、トコフェロール酢酸塩、レチノール、コレカルシフェロール、ビタミンＫ１／２及びアスコルビン酸（アスコルビン酸リン酸塩を含む）から選択される。

【0054】

ビタミンは、がん幹細胞の増殖及び／又は維持を支持するのに十分な濃度で存在する。ビタミンは、たとえば、以下の濃度で培地中に含有される：Ｄ－ビオチンを０．０４ｍｇ／Ｌ～０．４ｍｇ／Ｌの範囲、Ｄ－Ｃａパントテン酸塩を０．３ｍｇ／Ｌ～３ｍｇ／Ｌの範囲、葉酸を０．３ｍｇ／Ｌ～３ｍｇ／Ｌの範囲、ニコチンアミドを０．３ｍｇ／Ｌ～３ｍｇ／Ｌの範囲、ピリドキサール塩酸塩を０．１ｍｇ／Ｌ～１ｍｇ／Ｌの範囲、ピリドキシン塩酸塩を０．０９ｍｇ／Ｌ～０．９ｍｇ／Ｌの範囲、リボフラビンを０．０７ｍｇ／Ｌ～０．７ｍｇ／Ｌの範囲、チアミン塩酸塩を０．６ｍｇ／Ｌ～６ｍｇ／Ｌの範囲、トコフェロール酢酸塩を８μｇ／Ｌ～８０μｇ／Ｌの範囲、ビタミンＢ１２を０．１ｍｇ／Ｌ～１ｍｇ／Ｌの範囲。

【0055】

化学的に規定された培地は、１つ以上のアミノ酸を含む。１つ以上の「アミノ酸」は、アミノ酸又はそれらの誘導体（たとえば、アミノ酸類似体）、並びにそれらのＤ－及びＬ－体を指す。１つ以上のアミノ酸は、好ましくは、グリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－システイン、Ｌ－シスチン、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－プロリン、Ｌ－ヒドロキシ－プロリン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－トレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリンから選択される。より好ましくは、化学的に規定された培地は、全てのこれらのアミノ酸を含有する。

【0056】

アミノ酸は、好ましくは、以下に規定する濃度範囲において培地に含有される：グリシンを２ｍｇ／Ｌ～２０ｍｇ／Ｌの範囲、Ｌ－アラニンを０．５ｍｇ／Ｌ～５ｍｇ／Ｌの範囲、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミンを２３０ｍｇ／Ｌ～２．３ｇ／Ｌの範囲、Ｌ－アルギニン一塩酸塩を１３ｍｇ／Ｌ～１３０ｍｇ／Ｌの範囲、Ｌ－アルギニン遊離塩基を１５ｍｇ／Ｌ～１５０ｍｇ／Ｌの範囲、Ｌ－アスパラギン一水和物を１．２ｍｇ／Ｌ～１２ｍｇ／Ｌの範囲、Ｌ－アスパラギン無水物を６ｍｇ／Ｌ～６０ｍｇ／Ｌの範囲、Ｌ－アスパラギン酸３ｍｇ／Ｌ～３０ｍｇ／Ｌ、Ｌ－システイン一塩酸塩一水和物を１．２ｍｇ／Ｌ～１２ｍｇ／Ｌの範囲、Ｌ－シスチン二塩酸塩を５．５ｍｇ／Ｌ～５５ｍｇ／Ｌの範囲、Ｌ－グルタミン酸を２ｍｇ／Ｌ～２０ｍｇ／Ｌの範囲、Ｌ－ヒスチジン一塩酸塩一水和物を２．５ｍｇ／Ｌ～２５ｍｇ／Ｌの範囲、Ｌ－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンを３．５ｍｇ／Ｌ～３５ｍｇ／Ｌの範囲、Ｌ－イソロイシンを１６ｍｇ／Ｌ～１６０ｍｇ／Ｌの範囲、Ｌ－ロイシンを７ｍｇ／Ｌ～７０ｍｇ／Ｌの範囲、Ｌ－リジン一塩酸塩を１１ｍｇ／Ｌ～１１０ｍｇ／Ｌの範囲、Ｌ－メチオニンを１．８ｍｇ／Ｌ～１８ｍｇ／Ｌの範囲、Ｌ－フェニルアラニンを７ｍｇ／Ｌ～７０ｍｇ／Ｌの範囲、Ｌ－プロリンを６ｍｇ／Ｌ～６０ｍｇ／Ｌの範囲、Ｌ－セリンを４ｍｇ／Ｌ～４０ｍｇ／Ｌの範囲、Ｌ－トレオニンを５ｍｇ／Ｌ～５０ｍｇ／Ｌの範囲、Ｌ－トリプトファンを２ｍｇ／Ｌ～２０ｍｇ／Ｌの範囲、Ｌ－チロシン二ナトリウム塩二水和物を１０ｍｇ／Ｌ～１００ｍｇ／Ｌの範囲、Ｌ－バリンを６ｍｇ／Ｌ～６０ｍｇ／Ｌの範囲。

【0057】

１つの実施形態によると、化学的に規定された培地は、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン及びグリシル－Ｌ－グルタミン及びＮ－アセチル－Ｌ－グルタミンからなる群から選択される１つ以上のジペプチドをさらに含む。

【0058】

１つ以上のビタミンは、Ｄ－ビオチン、Ｄ－Ｃａパントテン酸塩、葉酸、ニコチンアミド、ピリドキサール塩酸塩、ピリドキシン塩酸塩、リボフラビン、チアミン塩酸塩、トコフェロール酢酸塩、ビタミンＢ１２から選択され得る。

【0059】

微量元素セレンは、本発明による基礎成分である。好ましくは、セレン含有塩は、４０ｎＭ～４００ｎＭの範囲の濃度において存在する。化学的に規定された培地は、銅（Ｃｕ）、鉄（Ｆｅ）、亜鉛（Ｚｎ）から選択される、標準的な微量元素を付加的に含み得る。化学的に規定された培地は、好ましくは、Ｆｅを含む。化学的に規定された培地は、たとえば、標準的な微量元素Ｃｕ及びＦｅを含み得る。あるいは、化学的に規定された培地は、Ｆｅ及びＺｎを含み得る。より好ましくは、化学的に規定された培地は、Ｃｕ、Ｆｅ及びＺｎを含む。

【0060】

標準的な微量元素は、好ましくは、がん幹細胞の増殖及び／又は維持を支持するのに十分な濃度で存在する。Ｚｎは、好ましくは、８０ｎＭ～８００ｎＭの範囲において化学的に規定された培地中に存在する。Ｃｕは、好ましくは、０．３ｎＭ～３．０ｎＭの範囲において化学的に規定された培地中に存在する。Ｆｅは、好ましくは、１５０ｎＭ～１．５μＭの範囲において化学的に規定された培地中に存在する。

【0061】

発明者らは、標準的な微量元素以外に少なくとも１つのさらなる微量元素の存在が、培養中の３Ｄ腫瘍様塊の成長に必要であることを観察した。これらの、もう１つのさらなる微量元素は、アルミニウム（Ａｌ）、バリウム（Ｂａ）、臭素（Ｂｒ）、カドミウム（Ｃｄ）、クロム（Ｃｒ）、コバルト（Ｃｏ）、ゲルマニウム（Ｇｅ）、ヨウ素（Ｉ）、マンガン（Ｍｎ）、ニッケル（Ｎｉ）、フッ素（Ｆ）、モリブデン（Ｍｏ）、ルビジウム（Ｒｂ）、ケイ素（Ｓｉ）、銀（Ａｇ）、スズ（Ｓｎ）、バナジウム（Ｖ）及びジルコニウム（Ｚｒ）からなる群から選択され得る。

【0062】

発明者らは、一種を超えるさらなる微量元素の存在が、３Ｄ腫瘍様塊の成長の改善を導くことをさらに同定した。１つの実施形態によると、化学的に規定された培地は、少なくとも３つのさらなる微量元素を含む。さらにより良い結果は、少なくとも５つのさらなる微量元素で得られる。好ましくは、それは、少なくとも５つのさらなる微量元素、より好ましくは少なくとも８つのさらなる微量元素を含む。３Ｄ腫瘍様塊培養のための最高の結果は、全ての以下のさらなる微量元素を含有する培地で観察された：Ａｌ、Ｂａ、Ｂｒ、Ｃｄ、Ｃｒ、Ｃｏ、Ｇｅ、Ｉ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｆ、Ｍｏ、Ｒｂ、Ａｇ、Ｓｉ、Ｓｎ、Ｖ及びＺｒ。したがって、１つの実施形態によると、それは、さらなる微量元素Ａｌ、Ｂａ、Ｂｒ、Ｃｄ、Ｃｒ、Ｃｏ、Ｇｅ、Ｉ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｆ、Ｍｏ、Ｒｂ、Ａｇ、Ｓｉ、Ｓｎ、Ｖ及びＺｒを含む。

【0063】

微量元素は、好ましくは、それらの参照される水溶性塩として化学的に規定された培地に導入される。たとえば、アルミニウムは、アルミニウム塩酸塩、アルミニウム硝酸塩又はアルミニウム硫酸塩として導入される。バリウムは、バリウム炭酸塩、バリウム塩酸塩又はバリウム酢酸塩として導入される。臭素は、臭化マグネシウム、臭化カリウム又は臭化ナトリウムとして導入される。カドミウムは、塩化カドミウム、硝酸カドミウム又は硫酸カドミウムとして導入される。クロムは、塩化クロム、硝酸クロム又は硫酸クロムとして導入される。コバルトは、塩化コバルト、硝酸コバルト又は硫酸コバルトとして導入される。銅は、塩化銅、硝酸銅又は硫酸銅として導入される。フッ素は、フッ化マグネシウム、フッ化カリウム又はフッ化ナトリウムとして導入される。ゲルマニウムは、酸化ゲルマニウムとして導入される。ヨウ素は、ヨウ化マグネシウム、ヨウ化カリウム又はヨウ化ナトリウムとして導入される。鉄は、塩化鉄、クエン酸鉄、硝酸鉄又は硫酸鉄として導入される。マンガンは、塩化マンガン、硝酸マンガン又は硫酸マンガンとして導入される。モリブデンは、塩化モリブデン、モリブデン酸アンモニウム又はモリブデン酸ナトリウムとして導入される。ニッケルは、塩化ニッケル、硝酸ニッケル又は硫酸ニッケルとして導入される。ルビジウムは、塩化ルビジウム、硝酸ルビジウム又は硫酸ルビジウムとして導入される。銀は、炭酸銀、硝酸銀又は硫酸銀として導入される。セレンは、亜セレン酸ナトリウム、セレン酸ナトリウム又はセレノメチオニンとして導入される。ケイ素は、ケイ酸カリウム又はケイ酸ナトリウムとして導入される。スズは、塩化スズ又はピロリン酸スズとして導入される。バナジウムは、塩化バナジウム、硫酸バナジル又はバナジン酸アンモニウムとして導入される。亜鉛は、塩化亜鉛、硝酸亜鉛又は硫酸亜鉛として導入される。ジルコニウムは、オキシ塩化ジルコニウムとして導入される。

【0064】

微量元素は、好ましくは、がん幹細胞の増殖及び／又は維持を支持するのに十分な濃度で、化学的に規定された培地中に存在する。さらなる微量元素の好ましい濃度範囲は、以下に示される。

【0065】

Ｓｅは、好ましくは、４０ｎＭ～４００ｎＭの範囲において化学的に規定された培地中に存在する。Ｍｎは、好ましくは、０．１ｎＭ～１ｎＭの範囲において化学的に規定された培地中に存在する。Ｓｉは、好ましくは、１３０ｎＭ～１．３μＭの範囲において化学的に規定された培地中に存在する。Ｍｏは、好ましくは、０．７ｎＭ～７ｎＭの範囲において化学的に規定された培地中に存在する。Ｖは、好ましくは、２ｎＭ～２２ｎＭの範囲において化学的に規定された培地中に存在する。Ｎｉは、好ましくは、０．２ｎＭ～２ｎＭの範囲において化学的に規定された培地中に存在する。Ｓｎは、好ましくは、０．１ｎＭ～１ｎＭの範囲において化学的に規定された培地中に存在する。Ａｌは、好ましくは、１．５ｎＭ～１５ｎＭの範囲において化学的に規定された培地中に存在する。Ａｇは、好ましくは、０．３ｎＭ～３ｎＭの範囲において化学的に規定された培地中に存在する。Ｂａは、好ましくは、１．５ｎＭ～１５ｎＭの範囲において化学的に規定された培地中に存在する。Ｂｒは、好ましくは、０．４ｎＭ～４ｎＭの範囲において化学的に規定された培地中に存在する。Ｃｄは、好ましくは、４ｎＭ～４０ｎＭの範囲において化学的に規定された培地中に存在する。Ｃｏは、好ましくは、１ｎＭ～１０ｎＭの範囲において化学的に規定された培地中に存在する。Ｃｒは、好ましくは、０．５ｎＭ～５ｎＭの範囲において化学的に規定された培地中に存在する。Ｆは、好ましくは、１２ｎＭ～１２０ｎＭの範囲において化学的に規定された培地中に存在する。Ｇｅは、好ましくは、２ｎＭ～２０ｎＭの範囲において化学的に規定された培地中に存在する。Ｉは、好ましくは、０．２５ｎＭ～２．５ｎＭの範囲において化学的に規定された培地中に存在する。Ｒｂは、好ましくは、４ｎＭ～４０ｎＭの範囲において化学的に規定された培地中に存在する。Ｚｒは、好ましくは、３．５ｎＭ～３５ｎＭの範囲において化学的に規定された培地中に存在する。

【0066】

理論に制限されることなく、１つ以上の脂肪酸は、成長させることが難しいがん細胞における脂質関連細胞成分の生成を促進することによって、腫瘍様塊培養において効果を有するはずである。未規定培地において、これらの化合物は、伝統的に血清の付加によって大量に提供される。

【0067】

本発明による１つ以上の脂肪酸は、飽和及び不飽和脂肪酸から選択され得る。１つ以上の脂肪酸は、たとえば、アラキドン酸、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルチミン酸、ステアリン酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、サピエン酸、エライジン酸、バクセン酸、リノエライジン酸、エイコサペンタエン酸、エルカ酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、セロチン酸からなる群から選択され得る。化学的に規定された培地中のこれらの脂肪酸の任意で、３Ｄ腫瘍様塊培養は、達成可能であるはずである。

【0068】

本発明者らは、３Ｄ腫瘍様塊成長に対する及びそれにおける優れた結果が、脂肪酸のアラキドン酸、リノレン酸、オレイン酸、ミリスチン酸、パルチミン酸又はステアリン酸を含有する化学的に規定された培地で得られることを見出した。したがって、１つの実施形態によると、１つ以上の脂肪酸は、アラキドン酸、リノレン酸、オレイン酸、ミリスチン酸、パルチミン酸、ステアリン酸からなる群から選択される。

【0069】

実施例に示されるように、３Ｄ腫瘍様塊培養に関して優れた結果が、１つを超える脂肪酸で得られる。１つの実施形態によると、化学的に規定された培地は、少なくとも２つの脂肪酸を含む。好ましくは、それは、少なくとも３つの脂肪酸、より好ましくは少なくとも４つの脂肪酸を含む。１つの実施形態によると、それは、アラキドン酸、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルチミン酸及びステアリン酸を含む。

【0070】

脂肪酸は、好ましくは、がん幹細胞の増殖及び／又は維持を支持するのに十分な濃度で、化学的に規定された培地中に存在する。脂肪酸の総濃度は、好ましくは、１～１００μｇ／Ｌの範囲にある。個々の脂肪酸の適切な濃度範囲は、以下に示される。アラキドン酸は、好ましくは、０．８μｇ／Ｌ～８μｇ／Ｌの範囲において化学的に規定された培地中に存在する、リノール酸は、好ましくは、３μｇ／Ｌ～３０μｇ／Ｌの範囲において化学的に規定された培地中に存在する、リノレン酸は、好ましくは、１．２μｇ／Ｌ～１２μｇ／Ｌの範囲において化学的に規定された培地中に存在する、ミリスチン酸は、好ましくは、２．５μｇ／Ｌ～２５μｇ／Ｌの範囲において化学的に規定された培地中に存在する、オレイン酸は、好ましくは、３μｇ／Ｌ～３０μｇ／Ｌの範囲において化学的に規定された培地中に存在する、パルミチン酸は、好ましくは、２．５μｇ／Ｌ～２５μｇ／Ｌの範囲において化学的に規定された培地中に存在する、ステアリン酸は、好ましくは、３．８μｇ／Ｌ～３８μｇ／Ｌの範囲において化学的に規定された培地中に存在する。

【0071】

本発明による化学的に規定された培地は、特に、さらなる微量元素Ａｌ、Ｂａ、Ｂｒ、Ｃｄ、Ｃｒ、Ｃｏ、Ｇｅ、Ｉ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｆ、Ｍｏ、Ｒｂ、Ｓｉ、Ａｇ、Ｓｎ、Ｖ及びＺｒ、並びに脂肪酸のアラキドン酸、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルチミン酸及びステアリン酸を含有し得る。

【0072】

本発明による化学的に規定された培地は、３Ｄ浮遊培養における剪断力を減少させるため適切な１つ以上の因子を含み得る。そのような因子は、たとえば、プルロニック（登録商標）Ｆ－６８、プルロニック（登録商標）１８８及びポロキサマー１８８のような界面活性剤又はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような巨大分子である。

【0073】

１つの実施形態によると、任意の本発明による化学的に規定された培地は、少なくとも１つの界面活性剤をさらに含む。界面活性剤は、脂肪酸の溶解性を改善する。界面活性剤は、３Ｄ浮遊培養における剪断力をさらに減少させ得る。界面活性剤は、好ましくは、非イオン性である。非イオン性界面活性剤は、それらが、水ベース溶液（たとえば、細胞培養培地）における親油性物質の可溶化を可能にし、細胞に対して生物が利用可能な形態において、これらの親油性物質を提供するとの利点を有する。

【0074】

界面活性剤（特に非イオン性界面活性剤）の総濃度は、好ましくは、１ｍｇ／Ｌ～１ｇ／Ｌの範囲、より好ましくは５０ｍｇ／Ｌ～５００ｍｇ／Ｌの範囲、より好ましくは１００～３００ｍｇ／Ｌの範囲にある。

【0075】

非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート、プルロニック（登録商標）Ｆ－６８、プルロニック（登録商標）１８８及びポロキサマー１８８からなる群から選択され得る。１つの実施形態によると、界面活性剤は、プルロニック（登録商標）Ｆ－６８である。この界面活性剤は、細胞に対して毒性がなく、剪断応力の効率的な減少化及び浮遊培養における培養器表面に対する細胞付着の阻害を可能とするとの有利な効果を有する。プルロニック（登録商標）Ｆ－６８は、好ましくは、４０～４００ｍｇ／Ｌの範囲の濃度において存在する。

【0076】

１つの実施形態によると、界面活性剤は、トゥイーン（登録商標）８０である。この界面活性剤は、適用される濃度において細胞に対して毒性がなく、水ベース溶液（たとえば、細胞培養培地）における親油性物質に対して強い乳化／分散効果を保有するとの有利な効果を有する。トゥイーン（登録商標）８０は、好ましくは、１～１０ｍｇ／Ｌの範囲の濃度において存在する。

【0077】

１つの実施形態によると、化学的に規定された培地は、２つの非イオン性界面活性剤トゥイーン（登録商標）８０及びプルロニック（登録商標）Ｆ－６８を含む。

【0078】

１つの実施形態によると、化学的に規定された培地は、成長因子無しであってもよい。すなわち、それは、上皮成長因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、若しくはトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）のような成長因子又はインターロイキン６（ＩＬ－６）、インターロイキン８（ＩＬ－８）のようなサイトカインとして作用するいかなる成分も含有しない。

【0079】

実施例に示されるように、本発明による化学的に規定された培地の組成物は、（特に微量元素及び脂肪酸の存在に起因して）いかなる成長因子無しであっても、３Ｄ腫瘍様塊の成長を継続するように、生理的に良好にバランスが取れている。成長因子の非存在は、腫瘍様塊培養に関する特定の実験上の問題にとって有益であることがある。

【0080】

代替的な１つの実施形態によると、化学的に規定された培地は、１つ以上の成長因子を含む。培地中の１つ以上の成長因子の存在は、増殖の増加を導く（実施例を参照されたい）。化学的に規定された培地中の１つ以上の成長因子は、上皮成長因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、インターロイキン６（ＩＬ－６）、インターロイキン８（ＩＬ－８）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）からなる群から選択され得る。１つの実施形態によると、化学的に規定された細胞培養培地の１つ以上の成長因子は、ＥＧＦ及びｂＦＧＦである。

【0081】

１つの実施形態によると、化学的に規定された培地は、インスリン若しくはインスリン代替物、トランスフェリン若しくはトランスフェリン代替物、及び／又はアルブミン若しくはアルブミン代替物をさらに含む。これらの成分の各々は、好ましくは、がん幹細胞の増殖及び／又は維持を支持するのに十分な濃度で、化学的に規定された培地中に存在する。

【0082】

用語「アルブミン代替物」は、アルブミンの任意の機能的な均等物を指す。例は、ウシ下垂体抽出物、植物加水分解物（たとえば、コメ／大豆加水分解物）、フェチュイン、卵アルブミン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）又は別の動物由来アルブミン、ニワトリ抽出物（ｃｈｉｃｋ ｅｘｔｒａｃｔ）、ウシ胚抽出物、ＡｌｂｕＭＡＸ（登録商標）Ｉ及びＡｌｂｕＭＡＸ（登録商標）ＩＩを含むが、それらに限定されない。アルブミン代替物のさらなる例は、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のようなポリマーである。

【0083】

用語「トランスフェリン代替物」は、サプリメント中のトランスフェリンの任意の機能的な均等物を指す。トランスフェリン代替物の例は、任意の鉄キレート化合物を含むが、それらに限定されない。使用され得る鉄キレート化合物は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール－ｂｉｓ（β－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－四酢酸（ＥＧＴＡ）、デフェロキサミンメシレート、ジメルカプトプロパノール、ジエチレントリアミン－五酢酸（ＤＰＴＡ）及びトランス－１，２－ジアミノシクロヘキサン－Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－四酢酸（ＣＤＴＡ）、オーリントリカルボン酸の鉄キレート、並びにクエン酸酸化鉄キレート（ｆｅｒｒｉｃ ｃｉｔｒａｔｅ ｃｈｅｌａｔｅ）及び硫酸第一鉄キレート（ｆｅｒｒｏｕｓ ｓｕｌｆａｔｅ ｃｈｅｌａｔｅ）又はＰｒｏｘｙｆｅｒｒｉｎ（登録商標）を含むが、それらに限定されない。

【0084】

用語「インスリン代替物」は、インスリンの機能的な均等物を指す。インスリン代替物の例は、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）グループ、たとえばＩＧＦ－１、ＩＧＦ－２、ＬＯＮＧ（登録商標）Ｒ３ＩＧＦ－Ｉの成長因子並びに微量金属インスリン模倣体、たとえばＺｎ^２＋を含むが、それらに限定されない。

【0085】

化学的に規定された細胞培養培地のさらなる成分は、好ましくは、以下の濃度範囲において使用される：プトレシン二塩酸塩は、好ましくは、０．０１５ｍｇ／Ｌ～０．１５ｍｇ／Ｌの範囲において化学的に規定された培地中に存在する、ピルビン酸ナトリウムは、好ましくは、３．１４ｍｇ／Ｌ～３１．４ｍｇ／Ｌの範囲において化学的に規定された培地中に存在する、チオクト酸は、好ましくは、０．０１５ｍｇ／Ｌ～０．１５ｍｇ／Ｌの範囲において化学的に規定された培地中に存在する、チミジンは、好ましくは、０．０２５ｍｇ／Ｌ～０．２５ｍｇ／Ｌの範囲において化学的に規定された培地中に存在する、アルブミンは、好ましくは、１．２ｇ／Ｌ～１２ｇ／Ｌの範囲において化学的に規定された培地中に存在する、インスリンは、好ましくは、０．１ｍｇ／Ｌ～１．０ｍｇ／Ｌの範囲において化学的に規定された培地中に存在する、トランスフェリンは、好ましくは、９ｍｇ／Ｌ～９０ｍｇ／Ｌの範囲において化学的に規定された培地中に存在する、ヒポキサンチンは、好ましくは、０．１６ｍｇ／Ｌ～１．６ｍｇ／Ｌの範囲において化学的に規定された培地中に存在する、パラ－アミノ安息香酸は、好ましくは、０．０５ｍｇ／Ｌ～０．５ｍｇ／Ｌの範囲において化学的に規定された培地中に存在する、ミオ－イノシトールは、好ましくは、７．５ｍｇ／Ｌ～７５ｍｇ／Ｌの範囲において化学的に規定された培地中に存在する、塩化コリンは、好ましくは、０．７ｍｇ／Ｌ～７．０ｍｇ／Ｌの範囲において化学的に規定された培地中に存在する。

【0086】

好ましくは、本発明による化学的に規定された培地は、アルブミン、インスリン及びトランスフェリンを含む。

【0087】

１つの実施形態によると、化学的に規定された培地は、ＨＥＰＥＳ、無機炭酸水素塩、無機リン酸塩、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）から選択される緩衝成分を含む。

【0088】

１つの実施形態によると、化学的に規定された培地は、少なくとも３つの緩衝成分を含有する。３つの緩衝成分は、好ましくは、ＨＥＰＥＳ、無機炭酸水素塩及び無機リン酸塩である。これらの緩衝成分の組合せにより、改善されたｐＨ安定性（細胞代謝産物による培地酸性化の阻害の観点から）を導き、継代間の培地交換をスキップすることを可能にすると同時に細胞の健康は維持されることが見出された。これは、３Ｄ浮遊培養の効率的な維持に関して有意な技術的な利点であり、またアップスケール及び自動化を促進する。

【0089】

本発明による化学的に規定された培地は、好ましくは、付加的に１つ以上のラジカルスカベンジャーを含む。そのようなラジカルスカベンジャーの例は、グルタチオン、酢酸トコフェロール、ｓ－メルカプトエタノール、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（ＮＡＣ）、ビタミンＬ－アスコルビン酸又はその安定なリン酸塩形態である。

【0090】

１つの実施形態によると、化学的に規定された培地のさらなる成分は、好ましくは、がん幹細胞の増殖及び／又は維持を支持するのに十分な濃度における酢酸トコフェロールである。酢酸トコフェロールは、好ましくは、０．００８４ｍｇ／Ｌ～０．０８４ｍｇ／Ｌの範囲において化学的に規定された培地中に存在する。ラジカルスカベンジャーとしての酢酸トコフェロールは、有害な脂質過酸化を最小限にするとの利点を有する。１つの実施形態によると、化学的に規定された培地は、２．１４ｍｇ／Ｌ～２１．４２ｍｇ／Ｌの濃度においてグルタチオンを含有する。

【0091】

１つの実施形態によると、化学的に規定された培地のさらなる成分は、好ましくは、がん幹細胞の増殖及び／又は維持を支持するのに十分な濃度におけるコレステロールである。特殊なタイプの細胞の成長速度及び生合成の能力に応じて、コレステロールが成長制限栄養分であることがある。特に成長させることが難しい細胞、たとえばがん細胞は、コレステロール補充から利益をもたらされ得、効率的な細胞膜合成の手段により急速な細胞大量生産が可能となる。規定されない伝統的な培地においては、追加コレステロールは、血清補充によって供給される。コレステロールは、好ましくは、０．０７ｍｇ／Ｌ～０．７５ｍｇ／Ｌの範囲の濃度において化学的に規定された培地中に存在する、

【0092】

本発明による化学的に規定された培地は、好ましくは、Ｂ２７（登録商標）のような複雑な非規定の独自開発サプリメントを含有しない。さらに、１つの実施形態によると、本発明による化学的に規定された培地は、ヒドロコルチゾンを含有しない。ヒドロコルチゾンが、幹細胞の分化を促進させ得ることが示唆される。１つの実施形態によると、細胞培養培地は、明確に規定されない動物由来物質であるヘパリンを含有しない。

【0093】

本発明の好ましい実施形態は、以下に列挙される成分を含む化学的に規定された培地である。硝酸カルシウム四水和物、二塩化マグネシウム六水和物、硫酸マグネシウム無水物、塩化カリウム、塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム無水物、リン酸二水素ナトリウム無水物、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｓｅ、Ｍｎ、Ｓｉ、Ｍｏ、Ｖ、Ｎｉ、Ｓｎ Ｍ、Ａｌ、Ａｇ、Ｂａ、Ｂｒ、Ｃｄ、Ｃｏ、Ｃｒ、Ｆ、Ｇｅ、Ｉ、Ｒｂ、Ｚｒ、グリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－アルギニン一塩酸塩、Ｌ－アルギニン遊離塩基、Ｌ－アスパラギン一水和物、Ｌ－アスパラギン無水物、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－システイン一塩酸塩一水和物、Ｌ－シスチン二塩酸塩、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－ヒスチジン一塩酸塩一水和物、Ｌ－ヒドロキシ－Ｌ－プロリン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン一塩酸塩、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－トレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン二ナトリウム塩二水和物、Ｌ－バリン、Ｄ－ビオチン、Ｄ－Ｃａパントテン酸塩、葉酸、ニコチンアミド、ピリドキサール塩酸塩、ピリドキシン塩酸塩、リボフラビン、チアミン塩酸塩、酢酸トコフェロール、ビタミンＢ１２、アラキドン酸、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルチミン酸、ステアリン酸、プトレシン二塩酸塩、ピルビン酸ナトリウム、チオクト酸、チミジン、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、ヒポキサンチン、パラ－アミノ安息香酸、ミオ－イノシトール、塩化コリン、ＨＥＰＥＳ、Ｌ－グルタチオン還元型、Ｄ－グルコース無水物、コレステロール、トゥイーン（登録商標）８０、プルロニック（登録商標）Ｆ－６８、フェノールレッドナトリウム塩、炭酸水素ナトリウム、最終体積までの水。

【0094】

別の好ましい実施形態は、同じ成分を含有するが、付加的に上皮成長因子、塩基性線維芽細胞成長因子を含有する。

【0095】

好ましくは、成分は、以下の濃度において存在する：硝酸カルシウム四水和物 ６．１８×１０^１ｍｇ／Ｌ、二塩化マグネシウム六水和物 ４．１８×１０^１ｍｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム無水物 ２．０９×１０^１ｍｇ／Ｌ、塩化カリウム ４．０６×１０^２ｍｇ／Ｌ、塩化ナトリウム ５．５６×１０^３ｍｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム無水物 ２．４８×１０^２ｍｇ／Ｌ、リン酸二水素ナトリウム無水物 ２．０６×１０^１ｍｇ／Ｌ、Ｚｎ ４．１３×１０^２ｎＭ、Ｃｕ １．５６ｎＭ、Ｆｅ ７．３１×１０^２ｎＭ、Ｓｅ １．９５×１０^２ｎＭ、Ｍｎ ５．５３×１０^－１ｎＭ、Ｓｉ ６．４×１０^２ｎＭ、Ｍｏ ３．４８ｎＭ、Ｖ １．０８×１０^１ｎＭ、Ｎｉ ９．６４×１０^－１ｎＭ、Ｓｎ ５．７０×１０^－１ｎＭ、Ａｌ ７．４６ｎＭ、Ａｇ １．４０ｎＭ、Ｂａ ７．９９ｎＭ、Ｂｒ １．８２ｎＭ、Ｃｄ ２．１１×１０^１ｎＭ、Ｃｏ ５．５０ｎＭ、Ｃｒ ２．８３ｎＭ、Ｆ ６．００×１０^１ｎＭ、Ｇｅ ９．８８ｎＭ、Ｉ １．３３ｎＭ、Ｒｂ １．９０×１０^１ｎＭ、Ｚｒ １．８０×１０^１ｎＭ、グリシン ９．５６ｍｇ／Ｌ、Ｌ－アラニン ２．５４ｍｇ／Ｌ、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン １．１４×１０^３ｍｇ／Ｌ、Ｌ－アルギニン一塩酸塩 ６．３１×１０^１ｍｇ／Ｌ、Ｌ－アルギニン遊離塩基 ７．６０×１０^１ｍｇ／Ｌ、Ｌ－アスパラギン一水和物 ６．０６ｍｇ／Ｌ、Ｌ－アスパラギン無水物 ２．８５×１０^１ｍｇ／Ｌ、Ｌ－アスパラギン酸 １．６５×１０^１ｍｇ／Ｌ、Ｌ－システイン一塩酸塩一水和物 ５．８４ｍｇ／Ｌ、Ｌ－シスチン二塩酸塩 ２．７５×１０^１ｍｇ／Ｌ、Ｌ－グルタミン酸 １．０４×１０^１ｍｇ／Ｌ、Ｌ－ヒスチジン一塩酸塩一水和物 １．３２×１０^１ｍｇ／Ｌ、Ｌ－ヒドロキシ－Ｌ－プロリン １．８５×１０^１ｍｇ／Ｌ、Ｌ－イソロイシン ７．９４×１０^１ｍｇ／Ｌ、Ｌ－ロイシン ３．３６×１０^１ｍｇ／Ｌ、Ｌ－リジン一塩酸塩 ５．６１×１０^１ｍｇ／Ｌ、Ｌ－メチオニン ９．１９ｍｇ／Ｌ、Ｌ－フェニルアラニン ３．３６×１０^１ｍｇ／Ｌ、Ｌ－プロリン ３．０１×１０^１ｍｇ／Ｌ、Ｌ－セリン ２．１４×１０^１ｍｇ／Ｌ、Ｌ－トレオニン ２．４４×１０^１ｍｇ／Ｌ、Ｌ－トリプトファン ９．３２ｍｇ／Ｌ、Ｌ－チロシン二ナトリウム塩二水和物 ５．２３×１０^１ｍｇ／Ｌ、Ｌ－バリン ３．１１×１０^１ｍｇ／Ｌ、Ｄ－ビオチン １．８８×１０^－１ｍｇ／Ｌ、Ｄ－Ｃａパントテン酸塩 １．４２ｍｇ／Ｌ、葉酸 １．５６ｍｇ／Ｌ、ニコチンアミド １．５８ｍｇ／Ｌ、ピリドキサール塩酸塩 ５．７０×１０^－１ｍｇ／Ｌ、ピリドキシン塩酸塩 ４．４１×１０^－１ｍｇ／Ｌ、リボフラビン ３．５８×１０^－１ｍｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩 ２．８６ｍｇ／Ｌ、酢酸トコフェロール ４．２０×１０^－２ｍｇ／Ｌ、ビタミンＢ１２×５．２１×１０^－１ｍｇ／Ｌ、アラキドン酸 ３．８０×１０^－３ｍｇ／Ｌ、リノール酸 １．６２×１０^－２ｍｇ／Ｌ、リノレン酸 ６．００×１０^－３ｍｇ／Ｌ、ミリスチン酸 １．３０×１０^－２ｍｇ／Ｌ、オレイン酸 １．６０×１０^－２ｍｇ／Ｌ、パルミチン酸 １．２０×１０^－２ｍｇ／Ｌ、ステアリン酸 １．９０×１０^－２ｍｇ／Ｌ、プトレシン二塩酸塩 ７．５０×１０^－２ｍｇ／Ｌ、ピルビン酸ナトリウム １．５７×１０^１ｍｇ／Ｌ、チオクト酸 ７．４８×１０^－２ｍｇ／Ｌ、チミジン １．２１×１０^－１ｍｇ／Ｌ、アルブミン ６．００×１０^３ｍｇ／Ｌ、インスリン ４．９７×１０^－１ｍｇ／Ｌ、トランスフェリン ４．４５×１０^１ｍｇ／Ｌ、ヒポキサンチン ７．９８×１０^－１ｍｇ／Ｌ、パラ－アミノ安息香酸 ２．６１×１０^－１ｍｇ／Ｌ、ミオ－イノシトール ３．８４×１０^１ｍｇ／Ｌ、塩化コリン ３．４１ｍｇ／Ｌ、ＨＥＰＥＳ ４．５６×１０^３ｍｇ／Ｌ、Ｌ－グルタチオン還元型１．０７×１０^１ｍｇ／Ｌ、Ｄ－グルコース無水物 ２．２５×１０^３ｍｇ／Ｌ、コレステロール ３．７４×１０^－１ｍｇ／Ｌ、トゥイーン（登録商標）８０×３．９６ｍｇ／Ｌ、プルロニック（登録商標）Ｆ－６８×１．９０×１０^２ｍｇ／Ｌ、フェノールレッドナトリウム塩 ５．９３ｍｇ／Ｌ、炭酸水素ナトリウム ２．３９×１０^３ｍｇ／Ｌ、最終体積までの水。成長因子を有する細胞培養培地の実施形態は、１．１０×１０^－２ｍｇ／Ｌの濃度において上皮成長因子及び３．６０×１０^－２ｍｇ／Ｌの濃度において塩基性線維芽細胞成長因子を含有する。

【0096】

化学的に規定された培地の成分は、当技術分野において知られている任意の方法によって組み合わせることができる。

【0097】

本発明による化学的に規定された培地は、以下のプロトコールに従って調製され得る。最初に、最終的な体積の９０％の細胞培養グレードの水が、混合器中に入れられる。次に、参照物質のストック溶液の計量した量又は適切な量が、連続的な撹拌下で加えられる。最終的に、体積が調整され、培地は０．２２μｍフィルターユニットを使用してフィルター滅菌される。

【0098】

本発明は、ＣＳＣ（特にＣＳＣを含むがん細胞培養物）を培養するための、化学的に規定された培地の使用をさらに提供する。本発明による化学的に規定された培地で培養され得るがん細胞系の例は、Ｕ－８７ＭＧ、ＭＣＦ－７、ＨＴ－２９、ＨＴ１０８０、ＨｅｐＧ２、Ａ－５４９、Ｐａｎｃ－１、ＬＮＣａＰ及びＡ－４３１である。

【0099】

１つの実施形態によると、ＣＳＣの培養は、３Ｄ浮遊培養として行われる。

【0100】

ＣＳＣの培養は、成長因子を含有している化学的に規定された細胞培養培地及び成長因子無しの化学的に規定された細胞培養培地の使用を用いてもよい。

【0101】

本発明は、特にがん幹細胞を含むがん細胞及び本発明による化学的に規定された培地を含む細胞培養システムにさらに関する。細胞培養システムの１つの実施形態によると、がん細胞は原発性腫瘍細胞である。細胞培養システムのさらなる実施形態によると、がん細胞は、脳、乳房、結腸、結合組織、肝臓、肺、膵臓、前立腺及び皮膚から選択される組織に由来するがん細胞系である。がん細胞系は、特に、Ｕ－８７ＭＧ、ＭＣＦ－７、ＨＴ－２９、ＨＴ１０８０、ＨｅｐＧ２、Ａ－５４９、Ｐａｎｃ－１、ＬＮＣａＰ及びＡ－４３１から選択される。好ましい実施形態によると、がん細胞系はＭＣＦ－７である。

【0102】

また、本発明は：
ａ）患者から以前に得られた腫瘍試料を用意するステップ、
ｂ）本発明による化学的に規定された培地中で腫瘍試料を培養し、ここで、この培養により、腫瘍細胞の増殖が導かれるステップを含む、がん細胞培養を確立する方法に関する。腫瘍試料の供給は、好ましくは、ヒト又は動物の身体の手術又は処置のいかなるステップも含まない。腫瘍試料は、好ましくは、脳、乳房、結腸、結合組織、肝臓、肺、膵臓、前立腺及び皮膚から選択される任意の組織に由来する。

【0103】

さらに、本発明は：
ａ）３Ｄ腫瘍様塊の形態におけるがん細胞を用意するステップ、
ｂ）本発明による化学的に規定された培地に３Ｄ腫瘍様塊を加えるステップ、
ｃ）化学的に規定された培地において３Ｄ腫瘍様塊を培養し、この培養により、腫瘍細胞の増殖及び／又は腫瘍様塊の成長が導かれるステップを含む、３Ｄ浮遊培養においてがん細胞を増殖させる方法に関する。

【0104】

方法の１つの実施形態によると、がん細胞は、脳、乳房、結腸、結合組織、肝臓、肺、膵臓、前立腺及び皮膚から選択される組織に由来するがん細胞系である。がん細胞系は、特に、Ｕ－８７ＭＧ、ＭＣＦ－７、ＨＴ－２９、ＨＴ１０８０、ＨｅｐＧ２、Ａ－５４９、Ｐａｎｃ－１、ＬＮＣａＰ及びＡ－４３１から選択される。好ましい実施形態によると、がん細胞系はＭＣＦ－７である。

【0105】

この方法は、腫瘍様塊を継代することをさらに含んでもよい。

【0106】

本発明は、以下の非限定的な例によりさらに規定される。

【実施例】

【0107】

材料
がん幹細胞培地
Ｃａ^＋＋／Ｍｇ^＋＋なしのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ ＃Ｃ－４０２３２）
Ｄｅｔａｃｈ－Ｋｉｔ（トリプシン－ＥＤＴＡ及びトリプシン中和溶液；ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ ＃Ｃ－４１２１０）
６－ウェル浮遊培養プレート（たとえば、Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ Ｏｎｅ、＃６５７ １８５）

【0108】

［実施例１］
本発明によるＣＳＣ培地の調製
最初に、最終的な体積の９０％の細胞培養グレードの水を、混合器中に入れる。炭酸水素ナトリウムを除き、次に、成分の貯蔵溶液の計量した量又は適切な量を、連続的な撹拌下で、およそ以下に規定されるような量で加える。全てのものを溶液に入れてから、炭酸水素ナトリウムを加え、最終的に体積を調整し、培地をフィルター滅菌する。最終的な培地は、以下の組成を有した：硝酸カルシウム四水和物 ６．１８×１０^１ｍｇ／Ｌ、二塩化マグネシウム六水和物 ４．１８×１０^１ｍｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム無水物 ２．０９×１０^１ｍｇ／Ｌ、塩化カリウム ４．０６×１０^２ｍｇ／Ｌ、塩化ナトリウム ５．５６×１０^３ｍｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム無水物 ２．４８×１０^２ｍｇ／Ｌ、リン酸二水素ナトリウム無水物 ２．０６×１０^１ｍｇ／Ｌ、Ｚｎ ４．１３×１０^２ｎＭ、Ｃｕ １．５６ｎＭ、Ｆｅ ７．３１×１０^２ｎＭ、Ｓｅ １．９５×１０^２ｎＭ、Ｍｎ ５．５３×１０^－１ｎＭ、Ｓｉ ６．４×１０^２ｎＭ、Ｍｏ ３．４８ｎＭ、Ｖ １．０８×１０^１ｎＭ、Ｎｉ ９．６４×１０^－１ｎＭ、Ｓｎ ５．７０×１０^－１ｎＭ、Ａｌ ７．４６ｎＭ、Ａｇ １．４０ｎＭ、Ｂａ ７．９９ｎＭ、Ｂｒ １．８２ｎＭ、Ｃｄ ２．１１×１０^１ｎＭ、Ｃｏ ５．５０ｎＭ、Ｃｒ ２．８３ｎＭ、Ｆ ６．００×１０^１ｎＭ、Ｇｅ ９．８８ｎＭ、Ｉ １．３３ｎＭ、Ｒｂ １．９０×１０^１ｎＭ、Ｚｒ １．８０×１０^１ｎＭ、グリシン ９．５６ｍｇ／Ｌ、Ｌ－アラニン ２．５４ｍｇ／Ｌ、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン １．１４×１０^３ｍｇ／Ｌ、Ｌ－アルギニン一塩酸塩 ６．３１×１０^１ｍｇ／Ｌ、Ｌ－アルギニン遊離塩基 ７．６０×１０^１ｍｇ／Ｌ、Ｌ－アスパラギン一水和物 ６．０６ｍｇ／Ｌ、Ｌ－アスパラギン無水物 ２．８５×１０^１ｍｇ／Ｌ、Ｌ－アスパラギン酸 １．６５×１０^１ｍｇ／Ｌ、Ｌ－システイン一塩酸塩一水和物 ５．８４ｍｇ／Ｌ、Ｌ－シスチン二塩酸塩 ２．７５×１０^１ｍｇ／Ｌ、Ｌ－グルタミン酸 １．０４×１０^１ｍｇ／Ｌ、Ｌ－ヒスチジン一塩酸塩一水和物 １．３２×１０^１ｍｇ／Ｌ、Ｌ－ヒドロキシ－Ｌ－プロリン １．８５×１０^１ｍｇ／Ｌ、Ｌ－イソロイシン ７．９４×１０^１ｍｇ／Ｌ、Ｌ－ロイシン ３．３６×１０^１ｍｇ／Ｌ、Ｌ－リジン一塩酸塩 ５．６１×１０^１ｍｇ／Ｌ、Ｌ－メチオニン ９．１９ｍｇ／Ｌ、Ｌ－フェニルアラニン ３．３６×１０^１ｍｇ／Ｌ、Ｌ－プロリン ３．０１×１０^１ｍｇ／Ｌ、Ｌ－セリン ２．１４×１０^１ｍｇ／Ｌ、Ｌ－トレオニン ２．４４×１０^１ｍｇ／Ｌ、Ｌ－トリプトファン ９．３２ｍｇ／Ｌ、Ｌ－チロシン二ナトリウム塩二水和物 ５．２３×１０^１ｍｇ／Ｌ、Ｌ－バリン ３．１１×１０^１ｍｇ／Ｌ、Ｄ－ビオチン １．８８×１０^－１ｍｇ／Ｌ、Ｄ－Ｃａパントテン酸塩 １．４２ｍｇ／Ｌ、葉酸 １．５６ｍｇ／Ｌ、ニコチンアミド １．５８ｍｇ／Ｌ、ピリドキサール塩酸塩 ５．７０×１０^－１ｍｇ／Ｌ、ピリドキシン塩酸塩 ４．４１×１０^－１ｍｇ／Ｌ、リボフラビン ３．５８×１０^－１ｍｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩 ２．８６ｍｇ／Ｌ、酢酸トコフェロール ４．２０×１０^－２ｍｇ／Ｌ、ビタミンＢ１２ ５．２１×１０^－１ｍｇ／Ｌ、アラキドン酸 ３．８０×１０^－３ｍｇ／Ｌ、リノール酸 １．６２×１０^－２ｍｇ／Ｌ、リノレン酸 ６．００×１０^－３ｍｇ／Ｌ、ミリスチン酸 １．３０×１０^－２ｍｇ／Ｌ、オレイン酸 １．６０×１０^－２ｍｇ／Ｌ、パルミチン酸 １．２０×１０^－２ｍｇ／Ｌ、ステアリン酸 １．９０×１０^－２ｍｇ／Ｌ、プトレシン二塩酸塩 ７．５０×１０^－２ｍｇ／Ｌ、ピルビン酸ナトリウム １．５７×１０^１ｍｇ／Ｌ、チオクト酸 ７．４８×１０^－２ｍｇ／Ｌ、チミジン １．２１×１０^－１ｍｇ／Ｌ、アルブミン ６．００×１０^３ｍｇ／Ｌ、インスリン ４．９７×１０^－１ｍｇ／Ｌ、トランスフェリン ４．４５×１０^１ｍｇ／Ｌ、ヒポキサンチン ７．９８×１０^－１ｍｇ／Ｌ、パラ－アミノ安息香酸 ２．６１×１０^－１ｍｇ／Ｌ、ミオ－イノシトール ３．８４×１０^１ｍｇ／Ｌ、塩化コリン ３．４１ｍｇ／Ｌ、上皮成長因子 １．１０×１０^－２ｍｇ／Ｌ、塩基性線維芽細胞成長因子 ３．６０×１０^－２ｍｇ／Ｌ、ＨＥＰＥＳ ４．５６×１０^３ｍｇ／Ｌ、Ｌ－グルタチオン還元型１．０７×１０^１ｍｇ／Ｌ、Ｄ－グルコース無水物 ２．２５×１０^３ｍｇ／Ｌ、コレステロール ３．７４×１０^－１ｍｇ／Ｌ、トゥイーン（登録商標）８０ ３．９６ｍｇ／Ｌ、プルロニック（登録商標）Ｆ－６８×１．９０×１０^２ｍｇ／Ｌ、フェノールレッドナトリウム塩 ５．９３ｍｇ／Ｌ、炭酸水素ナトリウム ２．３９×１０^３ｍｇ／Ｌ。

【0109】

［実施例２］
接着性２Ｄ培養から３Ｄ腫瘍様塊培養への乳癌細胞系の移行
非規定標準培養培地中での接着性２Ｄ培養から実施例１（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ ＣＳＣ培地）によるＣＳＣ培養培地中での３Ｄ腫瘍様塊培養への乳癌細胞系ＭＣＦ－７の移行を、以下のプロトコールを使用して試験した。参照として、がん細胞系の腫瘍様塊培養のための比較のＣＳＣ培地を、同時に同じ実験で試験した。比較のＣＳＣ培地は、Ｐｒｏｍａｂ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃによって製造されたＣａｎｃｅｒ Ｓｔｅｍ Ｐｒｅｍｉｕｍ（商標）である。この培地の正確な組成は、開示されていない。

【0110】

プロトコールにおいて、両方の培養培地、ＣＳＣ培地１及び比較のＣＳＣ培地は、ＣＳＣ培地と呼ばれる。

【0111】

２．１接着性細胞の回収
ヒトのＣＳＣを含有し、接着して成長するがん細胞系（ＭＣＦ－７）の細胞を、標準的な手順、すなわちＤｅｔａｃｈ Ｋｉｔを使用するトリプシン－ＥＤＴＡでのトリプシン処理を使用して脱離させた。細胞は、８０～９０％集密であり、良好な状態であった。細胞懸濁液を３００×ｇで５分間遠心分離し、上清を吸引した。細胞を、５ｍｌのＣＳＣ培地に再懸濁した。

【0112】

２．２．細胞の計数
生存可能なＭＣＦ－７細胞を、ＶｉａＣｏｕｎｔ（商標）試薬及びＭｕｓｅ（商標）細胞分析計（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して計数し、体積をＣＳＣ培地で調整して１００万個細胞／ｍｌの濃度を得た。

【0113】

２．３腫瘍様塊培養の設定
ＭＣＦ－７細胞は、１０，０００個細胞／ｍｌ（すなわち、６ウェル浮遊培養プレートの各ウェルにおいて４ｍｌのＣＳＣ培地中に４０，０００個の細胞）で適切な浮遊培養器に播種した。

【0114】

２．４．腫瘍様塊の成長を可能にする
培養物を、９（８～１０）日インキュベートした。新鮮なＣＳＣ培地を、培養体積の５０％の体積で３～４日毎に加えた。培地を、除去しなかった。

【0115】

［実施例３］
３Ｄ腫瘍様塊培養の連続的な継代
腫瘍様塊を、以下のプロトコールに従って、９（８～１０）日毎にＣＳＣ培地における３Ｄ腫瘍様塊培養での連続的な継代にかけた。単一細胞への腫瘍様塊の解離及び再プレーティングの手段による継代を行った。

【0116】

３．１．腫瘍様塊の収集
腫瘍様塊を含有する培地を、血清ピペットを使用して１５ｍｌコニカルチューブに移した。

【0117】

３．２．腫瘍様塊の重力沈殿
球を、室温で１０分間重力沈殿させることによって、定着させた。上清を吸引したが、約２００μｌをコニカルチューブに残した。

【0118】

３．３．腫瘍様塊の洗浄
沈殿（ステップ３．２）を、等しい体積のＰＢＳで繰り返した。穏やかにＰＢＳを吸引して約２００μｌをコニカルチューブに残す。

【0119】

３．４．腫瘍様塊の酵素消化
１ｍｌのトリプシン－ＥＤＴＡを、腫瘍様塊に加え、室温で３分間インキュベートした。

【0120】

３．５．残りの細胞凝集物の解体
球を、１０００μｌピペットチップを使用して１０～１５回ピペットで上げ下げして、単一細胞の懸濁液を生成した。細胞懸濁液は正常に吸引されたが、細胞を排出する場合には、ピペットチップをチューブの底でわずかに傾けた。発生した剪断力により、任意の残留する細胞凝集物の解体を促進した。視覚的な点検を行い、大きい細胞凝集物が残っていないことを確認した。粉砕直後、二倍体積のトリプシン中和溶液（ＴＮＳ）を加えた。

【0121】

３．６．細胞数及び生存度の決定
新鮮なＣＳＣ培地で体積を５ｍｌにし、細胞数及び生存度を決定した。細胞を、３００×ｇで５分間スピンダウンした。上清を廃棄し、細胞を１００万個細胞／ｍｌで新鮮な培地に再懸濁した。

【0122】

３．７．細胞のプレーティング
細胞を、新しい浮遊培養器に１０，０００個細胞／ｍｌで再播種した。これに関して、ウェル毎に４ｍｌの培地中に４０，０００個細胞を有する６ウェルプレートを使用した。継続的で連続的な継代に関して、完全な手順をステップ２．４から開始して繰り返した。

【0123】

３．８．結果
図１は、行われた試験の結果を代表して要約する。２Ｄ標準培養から市販されている競合ＣＳＣ培地に移したＭＣＦ－７細胞は、緩徐に成長する腫瘍様塊を生成した。しかし、これらの腫瘍様塊は、増殖を停止し、一継代前でさえも衰退（ｄｅｃａｙ）が始まった。

【0124】

対照的に、ここで提示される培地において培養した腫瘍様塊は、着実に増殖し、腫瘍様塊培養として十連続の継代を経た。試験を停止したが、培養物は消耗の徴候を示さなかった。

【0125】

ここで記載した培地及び競合ＣＳＣ培地中で培養した場合、匹敵する結果がＨＴ１０８０線維肉腫細胞系で得られた。競合培地における腫瘍様塊培養は四連続の継代後に停止したが、ここで提示される培地における培養は、いかなる消耗の徴候もなく１０回継代することができた（データは示さず）。

【0126】

［実施例４］
ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ ＣＳＣ培地中のＭＣＦ－７細胞の腫瘍様塊形成効率（ＴＦＥ）の決定
実施例１及び２により培養したＭＣＦ－７細胞に関して、腫瘍様塊形成効率（ＴＦＥ）の反復決定を、腫瘍様塊培養の連続的な継代の間の異なる継代数で行った。ＴＦＥを、化学的に規定された培地を使用するＭＣＦ－７腫瘍様塊培養の連続的な一継代、四継代及び九継代（Ｐ１、Ｐ４及びＰ９）において決定した。

【0127】

腫瘍様塊培養の継代プロセスの間に、単一細胞が酵素解離によって得られる（実施例３、ステップ３．４を参照されたい）。腫瘍様塊解離からのＰ１、Ｐ４及びＰ９単一細胞を、２つの９６ウェルｕ底浮遊培養プレートに入れた（１００μｌの化学的に規定された培地を有するウェル毎に１つの単一細胞）。５～６日後、１００μｌの新鮮な培地を加えた。１０日後、全ての１９２ウェルを腫瘍様塊の存在について確認し、腫瘍様塊を形成した全てのプレートに入れた細胞の割合を計算した。腫瘍様塊形成を可能とする細胞の割合は、細胞のＴＦＥである。

【0128】

化学的に規定された培地において腫瘍様塊として培養したＭＣＦ－７細胞に関するＴＦＥは、Ｐ１で２％であったが、Ｐ４において１４％に及びＰ９において２８％に増加した（図２を参照されたい）。ＣＳＣだけが、単一細胞から腫瘍様塊を形成する能力を有すると考えられるので、これらの結果は、化学的に規定された培地において腫瘍様塊培養としてのＭＣＦ－７細胞の連続的な継代が時間／継代数依存的な様式で培養内でＣＳＣの数及び割合を有意に増強することを示唆している。

【0129】

［実施例５］
ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ ＣＳＣ培地におけるがん細胞系の３Ｄ腫瘍様塊培養
３Ｄ腫瘍様塊培養としての異なる起源のがん細胞系の維持のための提示された培地の広い適応性を検証するため、ヒト悪性疾患の最も頻出するタイプに位置する表１に列挙される細胞系を、連続的な増殖及び連続的な継代能力について試験した。試験した全ての細胞系は、腫瘍様塊培養として増殖することができ、十連続の継代の間に連続的な増殖を示した。全ての培養を、いかなる成長速度阻害の徴候もなく十継代にて中止した。

【0130】

【表1】

【0131】

［実施例６］
ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ ＣＳＣ培地２におけるがん細胞系の３Ｄ腫瘍様塊培養
以下の実施例は、本発明による化学的に規定された培地が、成長因子の非存在下でさえも細胞系の３Ｄ腫瘍様塊成長を支持することを示す。

【0132】

第二の細胞培養培地、すなわち上皮成長因子及び塩基性線維芽細胞成長因子が含まれていない以外は、実施例１によるＰｒｏｍｏＣｅｌｌ ＣＳＣ培地と同じ成分を有するＰｒｏｍｏＣｅｌｌ ＣＳＣ培地２を製造した。ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ ＣＳＣ培地２を、２つの上記成長因子を省いて、実施例１におけるＰｒｏｍｏＣｅｌｌ ＣＳＣ培地についての記載のように製造した。

【0133】

ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ ＣＳＣ培地２を、２つの異なるがん細胞系の腫瘍様塊成長を支持する能力において試験した。ＭＣＦ－７は、細胞系であり、ヒト乳がんから由来し、細胞系ＨＴ－２９は、結腸がんから由来する細胞系である。

【0134】

２つの細胞系ＭＣＦ－７及びＨＴ－２９を、成長因子含有ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ ＣＳＣ培地の代わりに成長因子無しのＰｒｏｍｏＣｅｌｌ ＣＳＣ培地２を使用して実施例３のプロトコールに従って培養した。

【0135】

したがって、細胞系を、ＭＣＦ－７について１４～１６日及びＨＴ－２９について１０～１２日の定常的な継代間隔で３回の逐次的な（連続的な）継代にかけた。両方の細胞系は、１継代毎に約三集団の倍加をともなう頑強な増殖を示した。

【0136】

第三の継代後、細胞系を分析した。培養は、成長阻害の徴候を示さなかった。ＭＣＦ－７細胞培養の画像を、図３に示す（１００×拡大率）。図３から、加えた成長因子（すなわち、ＥＧＦ及びｂＦＧＦ）の非存在下でさえも、培養が、ＭＣＦ－７細胞培養における腫瘍様塊の頑強な形成及び成長を可能とすることを結論付けることができる。さらに、球を形成する細胞は、均一な及び健常な形態パターンを示す。

【0137】

培養の（いくらか減速されるとしても）持続性である増殖速度との組合せにおいて、これらの結果は、化学的に規定された培地の成長因子無しのバリアントでさえも、ヒトがん細胞系の継続的で連続的な３Ｄ腫瘍様塊培養を支持することを指し示す。

【0138】

本明細書に記載された本発明の多くの改変及び他の実施形態が、本発明が属する当業者によって想到され、前述の記載及び関連する図面において提示される教示の利益を有する。したがって、本発明は、開示する具体的な実施形態に限定されず、改変及び他の実施形態を、添付の特許請求の範囲内に含むことを意図していると理解される。本明細書において特定の用語を用いるが、これらは包括的及び説明のための意味でのみ用いられ、限定する目的のためではない。

【0139】

【表2】

【図1】

【図2】

【図3】