特許 6990776 ＴＨＡを有効成分として含む前立腺癌の治療用薬学的組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2021-12-08

(45)【発行日】2022-01-12

(54)【発明の名称】ＴＨＡを有効成分として含む前立腺癌の治療用薬学的組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/12 20060101AFI20220104BHJP

   A61P 13/08 20060101ALI20220104BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220104BHJP

   A61K 36/9066 20060101ALI20220104BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220104BHJP

【ＦＩ】

A61K31/12

A61P13/08

A61P35/00

A61K36/9066

A61P43/00 111

【請求項の数】 8

(21)【出願番号】P 2020537145

(86)(22)【出願日】2018-12-26

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2021-04-08

(86)【国際出願番号】 KR2018016625

(87)【国際公開番号】W WO2019139283

(87)【国際公開日】2019-07-18

【審査請求日】2020-07-03

(31)【優先権主張番号】10-2018-0003229

(32)【優先日】2018-01-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】515254389

【氏名又は名称】コリア ユナイテッド ファーマ． インコーポレーテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000729

【氏名又は名称】特許業務法人 ユニアス国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】カン、コン ウク

(72)【発明者】

【氏名】チョン、ソン ベク

【審査官】今村 明子

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１０－２０９０５５（ＪＰ，Ａ）

【文献】Cancer Letters，2002年，Vol.177，p.119-124

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ９／００－ ９／ ７２

Ａ６１Ｋ ３１／００－３１／ ８０

Ａ６１Ｋ ３３／００－３３／ ４４

Ａ６１Ｋ ４７／００－４７／ ６９

Ａ６１Ｋ ３６／００－３６／９０６８

Ａ６１Ｐ １／００－４３／ ００

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記化学式１で表される２，４，６－トリヒドロキシアセトフェノン（２，４，６－ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ（ＴＨＡ））またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む、前立腺癌の予防または治療用薬学的組成物であって、
前記前立腺癌は、Ｐｌｋ１（Ｐｏｌｏ－ｌｉｋｅ ｋｉｎａｓｅ １）過発現前立腺癌である、前立腺癌の予防または治療用薬学的組成物。
［化学式１］

【化1】

【請求項2】

前記ＴＨＡは、クルクマコモサ（Ｃｕｒｃｕｍａ ｃｏｍｏｓａ）から抽出したことを特徴とする請求項１に記載の薬学的組成物。

【請求項3】

前記組成物は、Ｐｌｋ１（Ｐｏｌｏ－ｌｉｋｅ ｋｉｎａｓｅ １）の活性を抑制させることを特徴とする請求項１に記載の薬学的組成物。

【請求項4】

前記組成物は、ｃｄｃ２５ｃの活性を抑制させることを特徴とする請求項１に記載の薬学的組成物。

【請求項5】

前記組成物は、サイクリンＢ１（ｃｙｃｌｉｎ Ｂ１）の活性を抑制させることを特徴とする請求項１に記載の薬学的組成物。

【請求項6】

前記組成物は、カスパーゼ－３／７（ｃａｓｐａｓｅ－３／７）の活性を増加させることを特徴とする請求項１に記載の薬学的組成物。

【請求項7】

前記組成物は、アポトーシス指数を増加させることを特徴とする請求項１に記載の薬学的組成物。

【請求項8】

２，４，６－トリヒドロキシアセトフェノン（２，４，６－ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ（ＴＨＡ））の、前立腺癌の予防または治療用薬学的組成物を製造するための使用であって、前立腺癌が、Ｐｌｋ１（Ｐｏｌｏ－ｌｉｋｅ ｋｉｎａｓｅ １）過発現前立腺癌であることを特徴とする、使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＴＨＡ（２，４，６－ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ）を有効成分として含む前立腺癌の予防または治療用組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

クルクマコモサ（Ｃｕｒｃｕｍａ Ｃｏｍｏｓａ）は、タイとベトナムなどの東南アジアで健康機能性食品の原料として広く使用されるウコン属植物であって、特に、女性ホルモンであるエストロゲン様作用により閉経期女性の膣萎縮や血管拡張などに効果があることが知られている。クルクマコモサの有効成分としては、ジアリールヘプタノイド（ｄｉａｒｙｌｈｅｐｔａｎｏｉｄ）系が知られており、前記化合物は、肝細胞保護（肝保護）、メラニン生成抑制（美白）、または造骨細胞の分化促進（骨粗しょう症の改善）過程に影響を及ぼすという事実が明らかになっている。また、クルクマコモサの抽出物は、血中コレステロールの減少効果があることが知られており、これは、クルクマコモサのさらに他の有効成分である２，４，６－トリヒドロキシアセトフェノン（２，４，６－ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ，ＴＨＡ，Ｐｈｌｏｒｏａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ（フロロアセトフェノン））の作用として知られているが、前記化合物の抗癌活性に関しては、まだ知られたことがない。

【0003】

一方、前立腺癌は、前立腺に発生した癌を意味するが、米国、ヨーロッパでは、全体男性癌のうち有病率１位、死亡率２位の代表的な男性癌疾患である。韓国では、西欧国家に比べて発生率は低いが、悪性度が高いという報告があり、西欧化した食生活の普遍化、老齢人口の増加、診断技術の発達などに伴い、男性癌のうち増加率１位を占めるなど前立腺癌が急速に増加している傾向にある。前立腺癌の発病原因は、まだ明確に明らかにされていないが、年齢、人種、家族歴および遺伝的素因の他にも、ホルモン、食習慣、除草剤のような化学薬品なども、発病に重要な要因として作用すると知られている。

【0004】

前立腺癌の治療は、病の進行段階によって差異があるが、早期前立腺癌は、外科的な手術と放射線治療で癌細胞を除去する根本的な治療が先行され、癌細胞が前立腺から外れて周囲に転移した場合、ホルモン治療を受けることになる。男性ホルモンは、前立腺癌の成長を促進させるものと知られていて、これを抑制することによって、前立腺癌の進行を遅らせたり防げることができる。ただし、このようなホルモン治療を長期間受けることになれば、結局、ホルモン治療に耐性ができて、転移性ホルモン不応性（去勢抵抗性）前立腺癌に進行されることになるが、患者の生存期間が９～１３ヶ月に過ぎない程度に予後が良くないため、積極的な治療が必要である。このときからは、抗癌化学療法としてドセタキセルを処方することができるが、前立腺癌患者は、大多数が高齢なので、化学的抗癌療法が有する副作用に耐えにくいという問題点がある。

【0005】

Ｐｌｋファミリーの一つであるポロ様キナーゼ１（Ｐｏｌｏ－ｌｉｋｅ ｋｉｎａｓｅ １，Ｐｌｋ１）は、増殖中の成体組織と分裂中の細胞だけで発現するキナーゼタンパク質であって、Ｐｌｋ１の発現量は、細胞増殖の指標になって、多様な癌の悪性化を追跡することができる。また、癌組織でＰｌｋ１の高い発現量は、増殖だけでなく、転移とも関連があると報告されたことがあるが、多様な癌組織において癌の悪性化に関与する代表的な原因であるＰ５３の変異が、Ｐｌｋ１の発現量に関連しており、Ｐ５３の変異は、Ｐｌｋ１の活性化を起こし、これを通じて、癌の悪性化が起こると知られている。

【0006】

Ｐｌｋ１は、セリン／スレオニン（ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）リン酸化酵素であって、中心体の形成、双極紡錘体の形成、染色体骨格、および分裂溝の形成を調節する細胞分裂を通した癌細胞増殖の核心信号に該当するが、癌細胞の増殖過程でＰｌｋ１が活性化して、ｃｄｃ２５ｃを作動させ、作動したｃｄｃ２５ｃは、サイクリンＢ１を脱リン酸化させて、癌細胞の有糸分裂を誘導することになる。これは、結局、癌細胞の増殖を起こすことになるが、これにより、Ｐｌｋ１の抑制剤であるボラセルチブ（Ｖｏｌａｓｅｒｔｉｂ）が、最近、希少疾病用医薬品（ｏｒｐｈａｎ ｄｒｕｇ）血液癌の治療剤として承認を受けるなど現在多くの合成Ｐｌｋ１抑制剤が抗癌薬物として臨床試験に進入した。また、最近、Ｐｌｋ１は、多様な種類の血液癌と固形癌において治療標的として関心を集めると共に、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）抵抗性すい臓癌細胞およびイマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ）抵抗性慢性骨髄性白血病などの抗癌剤抵抗性癌腫で薬物ターゲットとして適用可能性が提示されたところがある。しかしながら、未だＰｌｋ１の去勢抵抗性前立腺癌の治療可能性の評価は、現在全く行われていないのが現状である 。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、前記のような従来技術上の問題点を解決するためになされたものであって、本発明者らは、Ｐｌｋ１活性を抑制する薬物を開発するために研究努力した結果、クルクマコモサ（Ｃｕｒｃｕｍａ ｃｏｍｏｓａ）の主成分であるＴＨＡ（２，４，６－ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ）が、Ｐｌｋ１活性の抑制を起こして、前立腺癌の進行を抑制することを最初に確認し、本発明を完成した。

【0008】

これより、本発明の目的は、下記化学式１で表されるＴＨＡ（２，４，６－ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ）またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む前立腺癌の予防または治療用薬学的組成物を提供することにある。

【0009】

［化学式１］

【化1】

【0010】

しかしながら、本発明が達成しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていないさらに他の課題は、下記の記載から当業者に明確に理解され得る。

【課題を解決するための手段】

【0011】

前記のような本発明の目的を達成するために、本発明は、下記化学式１で表されるＴＨＡ（２，４，６－ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ）またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む前立腺癌の予防または治療用薬学的組成物を提供する。

【0012】

［化学式１］

【化2】

【0013】

本発明の一具現例において、前記ＴＨＡは、クルクマコモサ（Ｃｕｒｃｕｍａ ｃｏｍｏｓａ）から抽出したものでありうる。

【0014】

本発明の他の具現例において、前記前立腺癌は、Ｐｌｋ１（Ｐｏｌｏ－ｌｉｋｅ ｋｉｎａｓｅ １）過発現前立腺癌でありうるが、これに制限されない。

【0015】

本発明のさらに他の具現例において、前記薬学的組成物は、Ｐｌｋ１（Ｐｏｌｏ－ｌｉｋｅ ｋｉｎａｓｅ １）の活性を抑制させることができる。

【0016】

本発明のさらに他の具現例において、前記薬学的組成物は、ｃｄｃ２５ｃまたはサイクリンＢ１の活性を抑制させることができる。

【0017】

本発明のさらに他の具現例において、前記薬学的組成物は、カスパーゼ－３／７（ｃａｓｐａｓｅ－３／７）の活性を増加させることを特徴とするものでありうる。

【0018】

本発明のさらに他の具現例において、前記薬学的組成物は、アポトーシス指数を増加させることを特徴とするものでありうる。

【0019】

ひいては、本発明は、前立腺癌の治療を必要とする個体にＴＨＡ（２，４，６－ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ）を有効成分として含む薬学的組成物を投与する段階を含む前立腺癌の治療方法を提供する。

【0020】

また、本発明は、ＴＨＡ（２，４，６－ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ）を有効成分として含む薬学的組成物の前立腺癌の治療用途を提供する。

【発明の効果】

【0021】

本発明は、ＴＨＡ（２，４，６－ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ）を有効成分として含む前立腺癌の予防または治療用組成物に関し、本発明のＴＨＡは、クルクマコモサ（Ｃｕｒｃｕｍａ ｃｏｍｏｓａ）の主成分である。本発明の組成物は、特に、ＰＬＫ１（Ｐｏｌｏ－ｌｉｋｅ ｋｉｎａｓｅ １）の活性を抑制することによって、前立腺癌の増殖を効果的に抑制するところ、将来前立腺癌に対する予防、改善、および治療の用途に有用に利用され得るものと期待される。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】図１は、前立腺癌細胞株においてＰｌｋ１およびアンドロゲン受容体の発現変化を確認した結果を示す図である。

【図2】図２Aおよび図２Bは、前立腺癌細胞株においてＰｌｋ１および下位タンパク質の発現変化を確認した結果を示す図である。

【図3】図３は、前立腺癌細胞株にＴＨＡ，ＢＩ２５３６、およびプルプロガリン（ＰＰＧ）を処理した後、細胞増殖抑制効果を比較して示す図である。

【図4】図４Aおよび図４Bは、カスパーゼ－３／７（ｃａｓｐａｓｅ－３／７）の活性を通じてアポトーシス程度を確認した結果を示す図である。

【図5】図５Aおよび図５Bは、ｃｌｅａｖｅｄ ｃａｓｐａｓｅ－３（ＣＣ３）発現量を通じてアポトーシス程度を確認した結果を示す図である。

【図6】図６Aおよび図６Bは、前立腺癌細胞株にＴＨＡおよびＢＩ２５３６を処理した後、細胞周期遮断効果を確認した結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0023】

本発明者らは、前立腺癌の治療法について鋭意研究した結果、クルクマコモサ（Ｃｕｒｃｕｍａ ｃｏｍｏｓａ）の主成分であるＴＨＡ（２，４，６－ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ）が、特にＰＬＫ１活性抑制を通じて前立腺癌の増殖を抑制するのに効果的であるという事実を確認し、これに基づいて本発明を完成した。

【0024】

以下、本発明を詳細に説明する。

【0025】

本発明の一実施例では、前立腺癌細胞株におけるＰｌｋ１、アンドロゲン受容体および下位タンパク質の発現変化を確認した（実施例２参照）。

【0026】

本発明の他の実施例では、ＴＨＡ（２，４，６－ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ）処理による前立腺癌細胞の細胞増殖抑制効果を確認し（実施例３参照）、また、ＴＨＡ処理によるアポトーシスの増加効果を確認した（実施例４参照）。

【0027】

本発明のさらに他の実施例では、ＴＨＡ処理による前立腺癌細胞の細胞周期遮断効果を確認した（実施例５参照）。

【0028】

したがって、本発明によるＴＨＡ（２，４，６－ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ）を利用して前立腺癌の予防または治療が要求される多様な目的および用途に使用することができる。

【0029】

これにより、本発明は、下記化学式１で表されるＴＨＡ（２，４，６－ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ）またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む前立腺癌の予防または治療用薬学的組成物を提供する。

【0030】

［化学式１］

【化3】

【0031】

本発明において使用される用語「予防」とは、本発明の組成物の投与により前立腺癌または去勢抵抗性前立腺癌を抑制させたり発病を遅延させるすべての行為を意味する。

【0032】

本発明において使用される用語「治療」とは、本発明の組成物の投与により前立腺癌または去勢抵抗性前立腺癌による症状が好転したり有利に変更されるすべての行為を意味する。

【0033】

本発明において使用される「薬学的に許容可能な」という用語は、過度な毒性、刺激、アレルギー反応またはその他の問題点または合併症なしに利得／リスクの割合が合理的なので、対象体（例：ヒト）の組織と接触して使用するに適しており、健全な医学的判断の範疇以内である化合物または組成物を意味する。

【0034】

本発明において使用される用語「塩」は、薬学的に許容可能な遊離酸（ｆｒｅｅ ａｃｉｄ）により形成された酸付加塩が有用である。酸付加塩は、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜硝酸または亜リン酸のような無機酸類と脂肪族モノおよびジカルボキシレート、フェニル－置換されたアルカノエート、ヒドロキシアルカノエートおよびアルカンジオエート、芳香族酸類、脂肪族および芳香族スルホン酸類のような無毒性有機酸から得る。このような薬学的に無毒な塩類としては、サルフェート、ピロサルフェート、ビサルフェート、サルファイト、バイサルファイト、ニトレート、ホスフェート、モノヒドロゲンホスフェート、ジヒドロゲンホスフェート、メタホスフェート、ピロホスフェートクロリド、ブロミド、ヨージド、フルオライド、アセテート、プロピオネート、デカノエート、カプリレート、アクリレート、ホルメート、イソブチレート、カプレート、ヘプタノエート、プロピオレート、オキサレート、マロネート、スクシネート、スベレート、セバケート、フマレート、マレエート、ブチン－１，４－ジオエート、ヘキサン－１，６－ジオエート、ベンゾアート、クロロベンゾアート、メチルベンゾアート、ジニトロベンゾアート、ヒドロキシベンゾアート、メトキシベンゾアート、フタレート、テレフタレート、ベンゼンスルホネート、トルエンスルホネート、クロロベンゼンスルホネート、キシレンスルホネート、フェニルアセテート、フェニルプロピオネート、フェニルブチレート、シトレート、ラクテート、β－ヒドロキシブチレート、グリコレート、マレート、タルトレート、メタンスルホネート、プロパンスルホネート、ナフタレン－１－スルホネート、ナフタレン－２－スルホネートまたはマンデレートを含む。

【0035】

本発明による酸付加塩は、通常の方法、例えば、化学式１で表される化合物を過量の酸水溶液中に溶解させ、この塩を水混和性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンまたはアセトニトリルを使用して沈殿させて製造することができる。また、この混合物で溶媒や過量の酸を蒸発させた後、乾燥させたりまたは析出された塩を吸入濾過させて製造することもできる。

【0036】

また、塩基を使用して薬学的に許容可能な金属塩を作ることもできる。アルカリ金属またはアルカリ土類金属塩は、例えば、化合物を過量のアルカリ金属水酸化物またはアルカリ土類金属水酸化物溶液中に溶解し、非溶解化合物塩を濾過し、濾液を蒸発、乾燥させて得る。この際、金属塩としては、ナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩を製造することが製薬に適合する。これに対応する銀塩は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属塩を適当な銀塩（例えば、硝酸銀）と反応させて得る。

【0037】

本発明の薬学的組成物は、有効成分以外に薬剤学的に許容される担体を含むことができる。この際、薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾアート、プロピルヒドロキシベンゾアート、滑石、ステアリン酸マグネシウムおよびミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。また、前記成分以外に潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。

【0038】

本発明の薬学的組成物は、目的とする方法によって経口投与したり非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内または局所に適用）することができ、投与量は、患者の状態および体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路および時間によって異なるが、当業者により適宜選択され得る。

【0039】

本発明の薬学的組成物は、薬学的に有効な量で投与する。本発明において「薬学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的な恵み／リスクの割合で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量水準は、患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路および排出比率、治療期間、同時使用される薬物を含む要素およびその他医学分野によく知られた要素によって決定され得る。本発明による薬学的組成物は、個別治療剤として投与されたり、他の治療剤と併用して投与され得、従来の治療剤とは順次にまたは同時に投与され得、単一または多重投与され得る。上記した要素を全部考慮して副作用なしに最小の量で最大の効果を得ることができる量を投与することが重要であり、これは、当業者により容易に決定され得る。

【0040】

具体的に、本発明の薬学的組成物の有効量は、患者の年齢、性別、状態、体重、体内に活性成分の吸収度、不活性率および排泄速度、疾病の種類、併用される薬物によって変わり得、一般的には、体重１ｋｇ当り０．００１～１５０ｍｇ、好ましくは０．０１～１００ｍｇを毎日または隔日投与したり、１日１～３回に分けて投与することができる。しかしながら、投与経路、肥満の重症度、性別、体重、年齢などによって増減することができるので、前記投与量がいかなる方法でも本発明の範囲を限定するものではない。

【0041】

本発明の組成物による予防、治療対象疾病である「癌」は、正常ヒトの組織の細胞が何らかの原因により無制限に増殖して、その生体の生活現象や周囲の組織状態などに関係なく急速な発育を継続する疾患に区分され、本発明における癌は、前立腺癌であり得るが、これに制限されない。

【0042】

本発明の化合物は、ＰＬＫ１活性抑制を通じて癌細胞の増殖を抑制することによって、癌の予防、改善または治療するに効果がある。

【0043】

本発明において、前記ＴＨＡは、クルクマコモサから抽出され得、当業界に公知となった天然から抽出物を収得する方法であれば、全部使用することができ、好ましくは水または有機溶媒を添加して可溶抽出する方法を通じて収得することができる。

【0044】

前記クルクマコモサに水や有機溶媒を添加して抽出する過程は、撹拌または放置などの方法で行われ得るが、熱水抽出法、冷浸抽出法、還流冷却抽出法または超音波抽出法などを１回または数回繰り返して抽出することができ、この際、添加できる前記有機溶媒としては、これに制限されないが、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、アセトン、エーテル、ベンゼン、クロロホルム、エチルアセテート、またはメチレンクロリドなどを使用することができる。

【0045】

また、本発明は、前記薬学的組成物を個体に投与する段階を含む前立腺癌の治療方法を提供する。本発明において「個体」とは、疾病の治療を必要とする対象を意味し、より具体的には、ヒトまたは非ヒトである霊長類、マウス（ｒａｔ）、マウス（ｍｏｕｓｅ）、犬、猫、馬および牛などの哺乳類を意味する。

【0046】

以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかしながら、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記実施例により本発明の内容が限定されるものではない。

【実施例】

【0047】

実施例１．実験準備および実験方法
１－１．試薬および材料
ｃｌｅａｖｅｄ ｃａｓｐａｓｅ－３（ＣＣ３）、Ｃｄｃ２５ｃ、Ｐｏｌｏ－ｌｉｋｅ ｋｉｎａｓｅ １（Ｐｌｋ１）抗体は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）から購入し、サイクリンＢ１（Ｇ２／ｍｉｔｏｔｉｃ－ｓｐｅｃｉｆｉｅｃ ｃｙｃｌｉｎ－Ｂ１）、アンドロゲン受容体（ＡＲ）抗体およびＴＨＡ（２，４，６－ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ）は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ．ＵＳＡ）から購入した。また、ｐｈｏｓｐｈｏ－ＨＨ３（ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ３，ＰＨＨ３）抗体は、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ．ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。

【0048】

Ｉｎｃｕｃｙｔｅ^ＴＭ ｃａｓｐａｓｅ－３／７ ｇｒｅｅｎ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｓｓａｙ ｒｅａｇｅｎｔは、Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ，ＵＳＡ）から購入し、β－アクチン抗体およびフルタミドは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入し、クルクマコモサは、（株）韓国ユナイテッド製薬から提供されて使用した。

【0049】

１－２．前立腺癌細胞株の培養
ＬｎＣａＰ細胞、アンドロゲン受容体（ＡＲ）陰性細胞であるＰＣ３細胞、および去勢抵抗性を示すＣ４－２細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ，ＵＳＡ）と１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ－１６４０（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ，ＵＳＡ）培地を使用して培養した。

【0050】

フルタミド抵抗性ＬｎＣａＰ細胞（ＦＬＴＲＬＮＣａＰ細胞）は、９％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ，ＵＳＡ）と１％チャコール／デキストラン処理ウシ胎児血清（Ｇｅｍｉｎｉ，Ｗｅｓｔ Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を含む培地でＬｎＣａＰ細胞を培養した後、フルタミドを処理して構築したものであって、前記フルタミドの濃度を約１２ヶ月間１μＭから始めて次第に高めて、結果的に、３０μＭで抵抗性を獲得したフルタミド抵抗性ＬｎＣａＰ細胞を構築した。

【0051】

１－３．免疫化学的分析
ゲル電気泳動装置（Ｍｉｇｈｔｙ Ｓｍａｌｌ ＳＥ２５０，Ｈｏｅｆｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）を使用してＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ－ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を行った。細胞の溶解分画を試料希釈緩衝溶液［６３ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）、１０％グリセロール、２％ＳＤＳ、０．００１３％ブロモフェノールブルー、５％β－メルカプトエタノール］に希釈した後、８～１２％ゲルを使用して電極緩衝溶液（１Ｌ溶液のうちＴｒｉｓ １５ｇ、グリセリン７２ｇ、ＳＤＳ ５ｇ含有）内で電気泳動を行った。電気泳動が終わったゲルを転移用電気泳動装置を利用して転移緩衝溶液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭグリセリン、２０％ｖ／ｖメタノール（ｐＨ８．３））内で１９０ｍＡｍｐｓで７０分間ニトロセルロース膜にタンパク質を移転させた。１次抗体で前記ニトロセルロース膜に反応させた後、これに２次抗体で西洋ワサビペルオキシダーゼ－接合ヤギ抗－ウサギＩｇＧ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ）と西洋ワサビペルオキシダーゼ－接合ヤギ抗－マウス（ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ）ＩｇＧを６時間の間反応させ、ＥＣＬ検出システム（ＥＣＬ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｃｅｎｃｅ ｓｙｓｔｅｍ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｇａｉｔｈｅｓｂｅｒｇ，ＭＡ）を使用して発色した。

【0052】

１－４．リアルタイム細胞増殖の分析
細胞増殖を測定するために、細胞を９６－ｗｅｌｌ ｄｉｓｈ（５×１０^３細胞／ｗｅｌｌ）に敷いた。薬物を処置した後、４時間間隔で生きている細胞数をＩｎｃｕＣｙｔｅ ＺＯＯＭ Ｌｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ａｎａｙｌｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ，ＵＳＡ）を利用して測定した。

【0053】

１－５．リアルタイム細胞死の分析
細胞死を測定するために、細胞を９６－ｗｅｌｌ ｄｉｓｈ（５×１０^３細胞／ｗｅｌｌ）に敷いた。Ｔｈｅ ＩｎｃｕＣｙｔｅ ＺＯＯＭ^ＴＭ ９６－ｗｅｌｌ Ｃａｓｐａｓｅ－３／７ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｓｓａｙ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ，ＵＳＡ）を３時間前処理し、薬物を処置した後、４時間間隔で蛍光発現程度をＩｎｃｕＣｙｔｅ ＺＯＯＭ^ＴＭ Ｌｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ａｎａｙｌｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ，ＵＳＡ）を利用して測定した。

【0054】

１－６．細胞周期の分析
細胞周期分布を測定するために、細胞を１００ｍｍのディッシュ（５×１０^５細胞／ｗｅｌｌ）に敷いた。細胞を４℃でＰＢＳで固定し、７０％ＥｔＯＨに４℃で冷蔵して、２４時間培養した。７０％ＥｔＯＨを除去した後、１％ウシ血清アルブミン／０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００／０．２ｍｇ／ｍｌ ＥＤＴＡからなるライジングソリューション（ｌｙｓｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）にＰＨＨ３抗体を最終濃度１：５０で処理した後、３７℃で１５分間染色した。その後、前記ライジングソリューションを除去し、ＰＩ（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ）／Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００／ＤＮＡｓｅ－ｆｒｅｅ ＲＮＡｓｅ Ａを利用して３７℃で１５分間さらに染色した。次に、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ^ＴＭ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）機械を利用して実験群当たり２０，０００個の細胞を分析した。

【0055】

実施例２．前立腺癌細胞におけるＰｌｋ１発現様相の確認
２－１．前立腺癌細胞においてＰｌｋ１およびアンドロゲン受容体の発現変化の確認
前記実施例１－２の方法で培養したＬｎＣａＰ、Ｃ４－２、ＰＣ３、およびＦＬＴＲ－ＬｎＣａＰ細胞を６ウェルプレートに敷いた。３６時間が経過した後、実施例１－３の免疫化学的分析方法でＰｌｋ１（Ｐｏｌｏ－ｌｉｋｅ ｋｉｎａｓｅ １）およびアンドロゲン受容体（Ａｎｄｒｏｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＡＲ）の発現変化を観察した。

【0056】

その結果、図１に示されたように、Ｐｌｋ１の発現量は、去勢抵抗性を示すＣ４－２細胞とＰＣ３細胞（ＡＲ陰性細胞）で高く現れ、ＡＲの発現量は、Ｃ４－２細胞で最も高いことを確認した。一方、ＦＬＴＲ－ＬＮＣａＰ細胞の場合、ＡＲ拮抗剤を長期処置して、フルタミド抵抗性を起こした細胞であるが、Ｐｌｋ１の発現は高く現れなかった。以上より、Ｐｌｋ１は、去勢抵抗性前立腺癌細胞（Ｃ４－２）およびＡＲ陰性前立腺癌細胞（ＰＣ３）において選択的に過多発現することが分かる。

【0057】

２－２．前立腺癌細胞においてＰｌｋ１および下位タンパク質の発現変化の確認
前記実施例１－２の方法で培養した前立腺癌細胞のうち３種であるＬＮＣａＰ、ＰＣ３、およびＣ４－２細胞を６ウェルプレートに敷いた後、１２時間後、実施例１－３の免疫化学的分析方法でＰｌｋ１（Ｐｏｌｏ－ｌｉｋｅ ｋｉｎａｓｅ １）およびＰｌｋ１下位因子であるｃｄｃ２５ｃとサイクリンＢ１の発現変化を観察した。

【0058】

その結果、図２Aおよび図２Bに示されたように、ＰＣ３とＣ４－２細胞においてＰｌｋ１だけでなく、ｃｄｃ２５ｃ（Ｍ－ｐｈａｓｅ ｉｎｄｕｃｅｒ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ３）およびサイクリンＢ１（Ｇ２／ｍｉｔｏｔｉｃ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｙｃｌｉｎ－Ｂ１）の発現量が全部増加したが、反面、ＬＮＣａＰ細胞においては、発現量の変化がないことを確認した。以上より、Ｐｌｋ１発現が高い細胞においてＰｌｋ１下位信号の活性化が観察されることが分かる。

【0059】

実施例３．ＴＨＡ処理による前立腺癌細胞の細胞増殖抑制効果の確認
ＴＨＡを前立腺癌細胞に処理した後、これによる細胞増殖抑制効果を比較観察するために、ＴＨＡ（分子量：１６８．１５）０．１６８ｇを１ｍｌのＤＭＳＯに希釈して１Ｍを調製した。前記実施例１－２の方法で培養した前立腺癌細胞株（ＬｎＣａＰ、ＰＣ３、Ｃ４－２）にＴＨＡ（３、１０、３０μＭ）、Ｐｌｋ１抑制剤であるＢＩ２５３６（１、５、１０、５０、１００ｎＭ）およびプルプロガリン（ｐｕｒｐｕｒｏｇａｌｉｎｅ，ＰＰＧ）（３、１０、３０、１００μＭ）処理した後、実施例１－４によるリアルタイム細胞増殖分析方法で細胞増殖抑制効果を６８時間の間比較観察した。

【0060】

その結果、図３に示されたように、前立腺癌細胞においてＴＨＡ、ＢＩ２５３６、およびプルプロガリンの間の細胞増殖抑制効果を比較した結果、ＰＣ３およびＣ４－２細胞においてＴＨＡがＢＩ２５３６と同一に細胞増殖抑制効果を示した。

【0061】

以上より、ＴＨＡは、ＢＩ２５３６と同様に、Ｐｌｋ１の発現が高かったホルモン抵抗性前立腺癌細胞（Ｃ４－２およびＰＣ３）において選択的に細胞増殖を抑制することが分かり、ホルモン反応性であるＬＮＣａＰ細胞においては、５－０％以上の細胞増殖抑制が観察されないことが分かる。Ｐｌｋ１ ｐｏｌｏ－ｂｏｘ ｄｏｍａｉｎ抑制剤として知られたプルプロガリンは、ＬＮＣａＰ細胞およびＰＣ３において制限的な細胞増殖抑制活性を示し、Ｃ４－２細胞においては、１００ｕＭ濃度だけで非選択的に示される細胞増殖抑制効果が観察された。

【0062】

実施例４．ＴＨＡ処理による前立腺癌細胞のアポトーシス増加効果の確認
カスパーゼ－３／７（ｃａｓｐａｓｅ－３／７）は、ミトコンドリア媒介性または細胞死受容体媒介性アポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）誘導時に選択的に活性化する酵素であって、ＴＨＡを前立腺癌細胞に処理した後、これによる細胞死増加効果を比較観察するために、前記実施例１－２の方法で培養した前立腺癌細胞株であるＰＣ３およびＣ４－２細胞に３０μＭのＴＨＡおよび５ｎＭのＢＩ２５３６をそれぞれ処理した後、ＩｎｃｕＣｙｔｅ ＺＯＯＭ^ＴＭ Ｌｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ａｎａｙｌｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ，ＵＳＡ）を利用して４時間間隔でカスパーゼ－３／７選択的蛍光基質を定量して、アポトーシス程度を４８時間の間観察した。

【0063】

その結果、図４Aおよび図４Bに示されたように、ＴＨＡは、アポトーシス指数を有意的に増加させることを確認した。

【0064】

また、アポトーシス時の活性型カスパーゼ－３であるｃｌｅａｖｅｄ ｃａｓｐａｓｅ－３（ＣＣ３）の発現変化を確認してアポトーシス程度を観察したが、まず、前記実施例１－２の方法で培養したＣ４－２およびＰＣ３細胞を６ウェルプレートに敷いた後、１２時間が経過した後、３０μＭのＴＨＡおよび５ｎＭのＢＩ２５３６を４８時間の間処理した。その後、前記実施例１－３の免疫化学的分析方法でｃｌｅａｖｅｄ ｃａｓｐａｓｅ－３（ＣＣ３）の発現変化を観察した。

【0065】

その結果、図５Aおよび図５Bに示されたように、ｃｌｅａｖｅｄ ｃａｓｐａｓｅ－３の発現量が増加することを観察することができたところ、ＴＨＡは、アポトーシス指数を有意的に増加させることを確認した。以上より、ホルモン抵抗性前立腺癌細胞であるＰＣ３およびＣ４－２細胞においてＴＨＡおよびＢＩ２５３６処理時に全部アポトーシスを効果的に誘導することが分かる。

【0066】

実施例５．ＴＨＡ処理による前立腺癌細胞の細胞周期遮断効果の確認
Ｐｌｋ１は、代表的なＧ２／Ｍ細胞周期調節リン酸化酵素であって、ＴＨＡ処置による前立腺癌細胞の細胞周期遮断効果を確認するために、前記実施例１－２の方法で培養したＰＣ３細胞を６ウェルプレートに敷いた後、１２時間が経過した後、３０μＭのＴＨＡと５ｎＭのＢＩ２５３６を２４時間の間処理した。その後、前記実施例６の方法で各ｓｕｂ－Ｇ１、Ｓ、Ｇ２／Ｍ期の細胞分布図およびＰＨＨ３陽性細胞（Ｍ ｐｈａｓｅマーカー）の比率を変化観察した。

【0067】

その結果、図６Aおよび図６Bに示されたように、ＴＨＡは、Ｇ２／Ｍ周期に選択的に細胞周期の進行を遮断することを確認することができたが、ＢＩ２５３６やＴＨＡ処置時にＧ２／Ｍ周期に３０％以上の細胞が観察され、ＰＨＨ３陽性細胞の定量時にも対照群対比有意的な増加が観察された。したがって、以上より、ホルモン抵抗性前立腺癌細胞であるＰＣ３細胞においてＴＨＡおよびＢＩ２５３６処理時にＧ２／Ｍ期の進行抑制を誘導することが分かる。

【0068】

以上より、Ｐｌｋ１発現が高い前立腺癌細胞にＴＨＡが選択的に作用することが分かるところ、したがって、将来Ｐｌｋ１陽性前立腺癌の治療においてＴＨＡを有用に活用することができるものと期待される。

【0069】

前述した本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態に容易に変形可能であることを理解することができる。したがって、以上で記述した実施例は、すべての面において例示的なものであり、限定的でないものと理解しなければならない。

【産業上の利用可能性】

【0070】

本発明のＴＨＡは、クルクマコモサ（Ｃｕｒｃｕｍａ ｃｏｍｏｓａ）の主成分であって、本発明の組成物は、特にＰＬＫ１（Ｐｏｌｏ－ｌｉｋｅ ｋｉｎａｓｅ １）の活性を抑制することによって、前立腺癌の増殖を効果的に抑制するところ、前立腺癌に対する予防、改善、および治療の用途に利用され得るので、医療産業など関連産業分野において有用に利用されるものと期待される。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】