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▶ フンダシオ プリバダ インスティトゥト デ レセルカ デラ シダ−カイサの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2021-12-09
(45)【発行日】2022-02-03
(54)【発明の名称】抗ウイルスおよび免疫調節の二重活性を有するＨＩＶ抗体誘導体
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20220127BHJP
A61K 38/17 20060101ALI20220127BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20220127BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220127BHJP
A61P 31/18 20060101ALI20220127BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220127BHJP
A61K 38/19 20060101ALI20220127BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20220127BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20220127BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220127BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20220127BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20220127BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20220127BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20220127BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220127BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220127BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20220127BHJP
G01N 33/569 20060101ALI20220127BHJP
C07K 14/16 20060101ALI20220127BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20220127BHJP
C07K 16/18 20060101ALI20220127BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20220127BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20220127BHJP
C12N 15/49 20060101ALI20220127BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20220127BHJP
C12N 15/85 20060101ALN20220127BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00
A61K38/17
A61K47/68
A61K48/00
A61P31/18
A61P43/00 111
A61K38/19
A61K39/395 D
A61K39/395 N
A61K39/395 Y
A61K39/395 S
A61K38/16
C12N15/63 Z
C12P21/08
C12P21/02 C
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12N7/01
G01N33/569 H
C07K14/16
C07K14/705
C07K16/18
C12N15/13
C12N15/12
C12N15/49
C12N15/62 ZNA
C12N15/85 Z
【請求項の数】
19
(21)【出願番号】P 2018526548
(86)(22)【出願日】2016-11-19
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2019-08-08
(86)【国際出願番号】 IB2016001868
(87)【国際公開番号】W WO2017085563
(87)【国際公開日】2017-05-26
【審査請求日】2019-11-14
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】513210116
【氏名又は名称】フンダシオ プリバダ インスティトゥト デ レセルカ デラ シダ－カイサ
【氏名又は名称原語表記】ＦＵＮＤＡＣＩＯ ＰＲＩＶＡＤＡ ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＤＥ ＲＥＣＥＲＣＡ ＤＥ ＬＡ ＳＩＤＡ－ＣＡＩＸＡ
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】カーリロ モリナ，ジョージ
(72)【発明者】
【氏名】クロテット サラ，ボナヴェンツナ
(72)【発明者】
【氏名】ブランコ アルブエス，ジュリアン エム．
【審査官】林 康子
(56)【参考文献】
【文献】特表２００４－５１８６２４（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１１／１５６７４７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】JOURNAL OF INFECTIOUS DISEASES，UNIVERSITY OF CHICAGO PRESS，2001年，VOL:183, NR:7，PAGE(S):1121 - 1125，http://dx.doi.org/10.1086/319284
【文献】Nature，2015年03月05日，vol.519, no.7541，pp.87-91
【文献】Cell，2014年09月，vol.158, no.6，pp. 1243-1253
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００
Ｃ０７Ｋ １９／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｎ末端からＣ末端までに（ａ）ヒトＣＤ４のＤ１細胞外ドメインおよびＤ２細胞外ドメイン、
（ｂ）ヒトＩｇＧのＦｃ部分、
（ｃ）（ｉ）４≦ｎ≦１０である配列（ＧＧＧＧＳ）ｎのリンカーポリペプチド、（ｉｉ）ヒトＣＣＲ５受容体配列、および（ｉｉｉ）それらの組合せ、からなる群から選択される部分、ならびに
（ｄ）ｇｐ４１の７つ揃いの反復１（ＨＲ１）または７つ揃いの反復２（ＨＲ２）モチーフに由来する、ｇｐ４１由来ポリペプチド
を含む、融合タンパク質。
【請求項2】
前記ヒトＩｇＧのＦｃ部分がＩｇＧ１を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項3】
前記ヒトＩｇＧまたはＩｇＧ１のＦｃ部分が、点変異Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０ＬおよびＩ３３２Ｅを含む、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項4】
前記ヒトＣＣＲ５受容体配列が、配列番号６を含む、請求項１～３のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項5】
前記ｇｐ４１由来ポリペプチドが、配列番号７を含む、請求項１～４のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項6】
請求項１に記載の融合タンパク質をコードする、単離された核酸。
【請求項7】
コドンが最適化されている、請求項６に記載の核酸。
【請求項8】
請求項６または７に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項9】
請求項１から５のいずれか１項に記載の融合タンパク質、請求項６または７に記載の核酸、または請求項８に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項10】
治療有効量の請求項１から５のいずれか１項に記載の融合タンパク質、請求項６または７に記載の核酸、請求項８に記載の発現ベクター、請求項９に記載の宿主細胞、またはそれらの混合物を含む医薬組成物。
【請求項11】
医薬としての使用のための請求項１から５のいずれか１項に記載の融合タンパク質、請求項６または７に記載の核酸、請求項８に記載の発現ベクター、請求項９に記載の宿主細胞、または請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項12】
ＨＩＶ感染またはＡＩＤＳの治療での使用のための請求項１から５のいずれか１項に記載の融合タンパク質、請求項６または７に記載の核酸、請求項８に記載の発現ベクター、請求項９に記載の宿主細胞、または請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項13】
ＨＩＶ感染またはＡＩＤＳの予防での使用のための請求項１から５のいずれか１項に記載の融合タンパク質、請求項６または７に記載の核酸、請求項８に記載の発現ベクター、請求項９に記載の宿主細胞、または請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項14】
請求項１から５のいずれか１項に記載の融合タンパク質、請求項６または７に記載の核酸、請求項８に記載の発現ベクター、請求項９に記載の宿主細胞、請求項１０に記載の医薬組成物、および少なくとも１つの治療剤を含む組成物。
【請求項15】
前記治療剤がＨＩＶ抗レトロウイルスである、請求項１４に記載の組成物。
【請求項16】
（ａ）請求項６または７に記載の核酸を含む宿主細胞を培養すること、（ｂ）前記核酸を発現させること、および（ｃ）前記宿主細胞の培養物から融合タンパク質を回収することを含む、請求項１から５のいずれか１項に記載の融合タンパク質を調製するための方法。
【請求項17】
ＨＩＶウイルスを請求項１から５のいずれか１項に記載の融合タンパク質に接触させることを含む、ＨＩＶウイルスを不活化させる方法で使用するための、請求項１から５のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含む組成物。
【請求項18】
（ａ）試料を請求項１から５のいずれか１項に記載の融合タンパク質に接触させること、および（ｂ）前記融合タンパク質が前記試料の分子に特異的に結合するか否かを決定することを含む、試料中のＨＩＶを検出する方法。
【請求項19】
請求項１から５のいずれか１項に記載の融合タンパク質、請求項６または７に記載の核酸、請求項８に記載の発現ベクター，請求項９に記載の宿主細胞、請求項１０に記載の医薬組成物、請求項１４または１５に記載の組成物、またはそれらの混合物、および使用のための指示資料を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗ウイルス活性および免疫調節活性が増強された、ＨＩＶに対する抗体誘導体に関する。本発明の抗体誘導体は、（ｉ）ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の宿主細胞内への進入を遮断するための、および（ｉｉ）ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および他の免疫系細胞の活性化を通じてエフェクター機能を誘発するための能力が増加しているという特徴を有する。これらのポリペプチドの各種形状を開示および例示する。単離された核酸、ベクター、およびこれらのポリペプチドを発現する宿主細胞、ならびにヒトの健康におけるそれらの治療および診断での適用も、本発明の範囲内にある。
【背景技術】
【0002】
ＨＩＶ感染は、地球規模のヒトの健康の主要な脅威の１つである。１９８１年以来、世界中で７，８００万人超がヒト免疫不全ウイルスに感染しているものと推定されている。これらの感染者のほぼ半数が、結果として生じる後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）により同じ時間枠の間に死亡している。UNAIDS, http://www.unaids.org/、２０１５年１０月を参照されたい。
【0003】
防御抗体の生成は、ヒト病原体に対するワクチンを開発するための主たる機構である。しかし、ＨＩＶに対するそのような抗体を誘発することが可能な免疫原の開発は、今までのところ失敗している。これらの免疫原の設計には、第１に、保存されているエピトープを特定して、継続的で安定な応答を確保し、第２に、それらのエピトープを適正に提示する、新しくかつより効率の良い免疫原を考案する必要がある。Haynes B, Curr Opin Immunol., 2015, 35:39-47を参照されたい。このように免疫原の設計が充分に進展していないのに対して、最近、ＨＩＶ感染者から単離された、ＨＩＶ外被糖タンパク質に対する数多くの新しい強力な広域スペクトル抗体（すなわち、広域中和抗体、ｂＮＡｂ）が、特定されている。Mascola J, et al., Immunol Rev. 2013; 254:225-244を参照されたい。さらに、抗体の構造に基づく合成分子も新しい治療剤として提案されている。Gardner M, et al., Nature 2015; 519:87-91を参照されたい。確かに、非常に強力な抗体は、非感染者をＨＩＶ獲得から防御する可能性があり、ＨＩＶ感染患者での根絶戦略に使用されうる。前掲Mascola, 2013を参照されたい。ｉｎ ｖｉｖｏでのＨＩＶの複製を予防するために、外被糖タンパク質およびそのサブユニットに対する中和抗体の使用も提案されている。Yang X, et al., J. Virol. 2005; 79:3500-3508を参照されたい。
【0004】
治療の見地から、抗体が特に適切であるが、それはなぜなら、ＨＩＶ外被糖タンパク質への結合を介してＨＩＶ複製を遮断することが可能な抗ウイルス剤として、および抗体鎖の定常領域(Ｆｃ)とＮＫ細胞および他の細胞の表面に発現するＦｃ受容体ＣＤ１６との相互作用を介するＮＫ細胞アクティベーターとして、二重の機能があるためである。この相互作用によって、ＣＤ１６+免疫細胞は、抗体依存性細胞傷害活性(ＡＤＣＣ)として知られる機構を介して感染細胞を死滅させることができる。Milligan C, et al., Cell Host Microbe. 2015; 17:500-506を参照されたい。どちらの活性も、非感染対象の防御に必要であるものと思われる。それゆえ、当技術分野では、抗ウイルス活性およびＡＤＣＣ活性の増加した中和抗体が必要とされている。
【発明の概要】
【0005】
第１の態様では、本発明は、Ｎ末端からＣ末端までに
（ａ）ヒトＣＤ４受容体のＤ１細胞外ドメインおよびＤ２細胞外ドメイン、
（ｂ）ヒトＩｇＧのＦｃ部分、
（ｃ）
（ｉ）１≦ｎ≦１０である配列（ＧＧＧＧＳ）ｎのリンカーポリペプチド、
（ｉｉ）ヒトＣＣＲ５受容体配列、および
（ｉｉｉ）それらの組合せ
からなる群から選択される部分、ならびに
（ｄ）ｇｐ４１由来ポリペプチド
を含む、抗体誘導体を指す。
（ａ）ヒトＣＤ４受容体のＤ１細胞外ドメインおよびＤ２細胞外ドメイン、
（ｂ）ヒトＩｇＧのＦｃ部分、
（ｃ）
（ｉ）１≦ｎ≦１０である配列（ＧＧＧＧＳ）ｎのリンカーポリペプチド、
（ｉｉ）ヒトＣＣＲ５受容体配列、および
（ｉｉｉ）それらの組合せ
からなる群から選択される部分、ならびに
（ｄ）ｇｐ４１由来ポリペプチド
を含む、抗体誘導体を指す。
【0006】
本発明の抗体誘導体は、当技術分野に公知のいかなる他の同等の抗体誘導体よりも高い抗ウイルスかつＡＤＣＣの活性を有する。前掲Gardner, 2015を参照されたい。
【0007】
追加の一態様では、本発明は、本発明の抗体誘導体をコードする核酸、前述の核酸を含むベクター、ならびに前に示した核酸およびベクターを含む宿主細胞に関する。
【0008】
さらに別の一態様では、本発明は、本発明の抗体誘導体、核酸、ベクター、および宿主細胞、またはそれらの混合物を含む医薬組成物を指す。
【0009】
別の態様では、本発明は、本発明の抗体誘導体、核酸、ベクター、宿主細胞、および医薬組成物、ならびに少なくとも１つの治療剤を含む組合せに向けられる。
【0010】
いっそうさらに別の一態様では、本発明は、本発明の抗体誘導体、核酸、ベクター、宿主細胞、医薬組成物、および組合せ、またはそれらの混合物の、医薬としての使用に関する。この態様のさらに別のバージョンでは、本発明は、本発明の抗体誘導体、核酸、ベクター、宿主細胞，医薬組成物、および組合せ、またはそれらの混合物のＨＩＶ感染またはＡＩＤＳの治療または予防での使用を指す。この態様の代替の一形態では、本発明は、治療有効量の本発明の抗体誘導体、核酸、ベクター、宿主細胞、医薬組成物、および組合せ、またはそれらの混合物を対象に投与することを含む、対象でＨＩＶ感染またはＡＩＤＳを治療または予防する方法に関する。この態様のさらに別の代替の一形態では、本発明は、ＨＩＶ感染またはＡＩＤＳの治療または予防のための医薬の製造における、本発明の抗体誘導体、核酸、ベクター、宿主細胞，医薬組成物、および組合せ、またはそれらの混合物の使用を指す。
【0011】
さらに、本発明は、（ａ）本発明による核酸を含む宿主細胞を培養すること、（ｂ）核酸配列を発現させること、および（ｃ）宿主細胞の培養物から抗体誘導体を回収することを含む、本発明の抗体誘導体を調製する方法に関する。
【0012】
別の態様では、本発明は、ウイルスを本発明の抗体誘導体に接触させることを含む、ＨＩＶを不活化させる方法を指す。
【0013】
追加の一態様では、本発明は、ＨＩＶ感染細胞でｇｐ１２０の発現を誘導する方法であって、感染細胞を本発明の抗体誘導体、核酸、ベクター、宿主細胞、医薬組成物、および組合せ、またはそれらの混合物に接触させることを含む方法に向けられる。
【0014】
さらに別の一態様では、本発明は、（ａ）試料を本発明の抗体誘導体に接触させること、および（ｂ）抗体誘導体が試料の分子に特異的に結合するか否かを決定することを含む、試料中のＨＩＶを検出する方法に関する。
【0015】
いっそうさらに別の一態様では、本発明は、本発明の抗体誘導体、核酸、ベクター、宿主細胞、および医薬組成物、またはそれらの混合物を含むキットに関する。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図3】図３は分子５のリンカーポリペプチドの長さを決定するための原理の略図である。（ｉ）ｇｐ１２０の補助受容体結合部位とＴ－２０標的領域（三量体の中央のｇｐ４１）との間の距離が３０Åであり、（ｉｉ）１．５Åのペプチド結合距離を有するアルファヘリックス構造をリンカーが採るものと仮定すると、少なくとも２０残基のリンカーが、ＣＣＲ５配列およびＴ－２０配列とそのそれぞれの標的とを同時に相互作用させることを可能にする必要があるものと考えられた。上記の考察を考慮し、ｎ＝４である可動性のリンカー（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号５）を、ＣＣＲ５配列とＴ－２０配列との間に含めた。
【図7A】図７ａはＨＩＶ分離株ＮＬ４－３、ＢａＬ、およびＡＣ１０のパネルに対する、第２世代の抗体誘導体である分子７～８および分子１０～１１の中和能を示す図である。分子０、分子１、および分子５を参照として分析に含め、ＨＩＶ ＮＬ４－３分離株の中和を示す。
【図7B】図７ｂはＨＩＶ分離株ＮＬ４－３、ＢａＬおよびＡＣ１０のパネルに対する、第２世代の抗体誘導体である分子７～８および分子１０～１１の中和能を示す図である。分子０、分子１、および分子５を参照として分析に含め、ＨＩＶ ＢａＬ分離株の中和を示す。
【図7C】図７ｃはＨＩＶ分離株ＮＬ４－３、ＢａＬ、およびＡＣ１０のパネルに対する、第２世代の抗体誘導体である分子７～８および分子１０～１１の中和能を示す図である。分子０、分子１、および分子５を参照として分析に含め、ＨＩ ＶＡＣ１０分離株の中和を示す。
【0017】
微生物の寄託
プラスミドｐＡＢＴ－５、ｐＡＢＴ－７、およびｐＡＢＴ－８は、２０１５年１０月２７日にそれぞれ受入番号ＤＳＭ32188、ＤＳＭ32189、およびＤＳＭ32190の下、ＤＳＭＺ－ドイツ微生物細胞培養コレクション、インホッフェンシュトラーセ７Ｂ、Ｄ－３８１２４ブラウンシュヴァイク、ドイツ連邦共和国に寄託された。
プラスミドｐＡＢＴ－５、ｐＡＢＴ－７、およびｐＡＢＴ－８は、２０１５年１０月２７日にそれぞれ受入番号ＤＳＭ32188、ＤＳＭ32189、およびＤＳＭ32190の下、ＤＳＭＺ－ドイツ微生物細胞培養コレクション、インホッフェンシュトラーセ７Ｂ、Ｄ－３８１２４ブラウンシュヴァイク、ドイツ連邦共和国に寄託された。
【0018】
配列表
当技術分野で従来適用されてきた標準的な略字およびコードを使用して、添付の配列表に描かれている核酸配列およびアミノ酸配列を示す。各核酸配列の一方の鎖のみを示すが、相補鎖は、提示される鎖を任意に参照することにより含まれるものと理解される。添付の配列表は以下である。
配列番号１は、ヒトＣＤ４受容体のＤ１ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号２は、ヒトＣＤ４受容体のＤ２ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号３は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のアミノ酸配列である。
配列番号４は、点変異Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、およびＩ３３２Ｅを有するヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のアミノ酸配列である。
配列番号５は、リンカーポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号６は、ヒトＣＣＲ５受容体のＮ末端領域のアミノ酸配列である。
配列番号７は、Ｔ－２０ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号８は、Ｔ－１２４９ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号９は、Ｃ３４ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号１０は、Ｔ－２６３５ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号１１は、分子０のアミノ酸配列である。
配列番号１２は、分子１のアミノ酸配列である。
配列番号１３は、分子２のアミノ酸配列である。
配列番号１４は、分子３のアミノ酸配列である。
配列番号１５は、分子４のアミノ酸配列である。
配列番号１６は、分子５のアミノ酸配列である。
配列番号１７は、分子６のアミノ酸配列である。
配列番号１８は、分子７のアミノ酸配列である。
配列番号１９は、分子８のアミノ酸配列である。
配列番号２０は、分子１０のアミノ酸配列である。
配列番号２１は、分子１１のアミノ酸配列である。
配列番号２２は、ヒトＣＤ４受容体のＤ１ドメインのヌクレオチド配列である。
配列番号２３は、ヒトＣＤ４受容体のＤ２ドメインのヌクレオチド配列である。
配列番号２４は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のヌクレオチド配列である。
配列番号２５は、点変異Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、およびＩ３３２Ｅを有するヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のヌクレオチド配列である。
配列番号２６は、リンカーポリペプチドのヌクレオチド配列である。
配列番号２７は、ヒトＣＣＲ５受容体の５’末端領域のヌクレオチド配列である。
配列番号２８は、Ｔ－２０ポリペプチドのヌクレオチド配列である。
配列番号２９は、Ｔ－１２４９ポリペプチドのヌクレオチド配列である。
配列番号３０は、Ｃ３４ポリペプチドのヌクレオチド配列である。
配列番号３１は、Ｔ－２６３５ポリペプチドのヌクレオチド配列である。
配列番号３２は、分子０のヌクレオチド配列である。
配列番号３３は、分子１のヌクレオチド配列である。
配列番号３４は、分子２のヌクレオチド配列である。
配列番号３５は、分子３のヌクレオチド配列である。
配列番号３６は、分子４のヌクレオチド配列である。
配列番号３７は、分子５のヌクレオチド配列である。
配列番号３８は、分子６のヌクレオチド配列である。
配列番号３９は、分子７のヌクレオチド配列である。
配列番号４０は、分子８のヌクレオチド配列である。
配列番号４１は、分子１０のヌクレオチド配列である。
配列番号４２は、分子１１のヌクレオチド配列である。
当技術分野で従来適用されてきた標準的な略字およびコードを使用して、添付の配列表に描かれている核酸配列およびアミノ酸配列を示す。各核酸配列の一方の鎖のみを示すが、相補鎖は、提示される鎖を任意に参照することにより含まれるものと理解される。添付の配列表は以下である。
配列番号１は、ヒトＣＤ４受容体のＤ１ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号２は、ヒトＣＤ４受容体のＤ２ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号３は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のアミノ酸配列である。
配列番号４は、点変異Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、およびＩ３３２Ｅを有するヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のアミノ酸配列である。
配列番号５は、リンカーポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号６は、ヒトＣＣＲ５受容体のＮ末端領域のアミノ酸配列である。
配列番号７は、Ｔ－２０ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号８は、Ｔ－１２４９ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号９は、Ｃ３４ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号１０は、Ｔ－２６３５ポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号１１は、分子０のアミノ酸配列である。
配列番号１２は、分子１のアミノ酸配列である。
配列番号１３は、分子２のアミノ酸配列である。
配列番号１４は、分子３のアミノ酸配列である。
配列番号１５は、分子４のアミノ酸配列である。
配列番号１６は、分子５のアミノ酸配列である。
配列番号１７は、分子６のアミノ酸配列である。
配列番号１８は、分子７のアミノ酸配列である。
配列番号１９は、分子８のアミノ酸配列である。
配列番号２０は、分子１０のアミノ酸配列である。
配列番号２１は、分子１１のアミノ酸配列である。
配列番号２２は、ヒトＣＤ４受容体のＤ１ドメインのヌクレオチド配列である。
配列番号２３は、ヒトＣＤ４受容体のＤ２ドメインのヌクレオチド配列である。
配列番号２４は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のヌクレオチド配列である。
配列番号２５は、点変異Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、およびＩ３３２Ｅを有するヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のヌクレオチド配列である。
配列番号２６は、リンカーポリペプチドのヌクレオチド配列である。
配列番号２７は、ヒトＣＣＲ５受容体の５’末端領域のヌクレオチド配列である。
配列番号２８は、Ｔ－２０ポリペプチドのヌクレオチド配列である。
配列番号２９は、Ｔ－１２４９ポリペプチドのヌクレオチド配列である。
配列番号３０は、Ｃ３４ポリペプチドのヌクレオチド配列である。
配列番号３１は、Ｔ－２６３５ポリペプチドのヌクレオチド配列である。
配列番号３２は、分子０のヌクレオチド配列である。
配列番号３３は、分子１のヌクレオチド配列である。
配列番号３４は、分子２のヌクレオチド配列である。
配列番号３５は、分子３のヌクレオチド配列である。
配列番号３６は、分子４のヌクレオチド配列である。
配列番号３７は、分子５のヌクレオチド配列である。
配列番号３８は、分子６のヌクレオチド配列である。
配列番号３９は、分子７のヌクレオチド配列である。
配列番号４０は、分子８のヌクレオチド配列である。
配列番号４１は、分子１０のヌクレオチド配列である。
配列番号４２は、分子１１のヌクレオチド配列である。
【発明を実施するための形態】
【0019】
本発明は、抗ウイルスおよび免疫調節の二重活性が増強されたＨＩＶ抗体誘導体に関する。本発明の抗体誘導体は、（ｉ）ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の宿主細胞内への進入を遮断するための、および（ｉｉ）ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化を通じてエフェクター機能を誘発するための、増加された能力を有することを特徴とする。
１．一般用語および表現の定義
１．一般用語および表現の定義
【0020】
用語「ＡＣ１０」とは、本明細書に使用される際には、抗ＣＤ４結合部位抗体に対する抵抗性があるという特徴を持つＨＩＶ初代分離株を指す。ＡＣ１０は、ｔｉｅｒ２分離株に分類される。Seaman M, et al., J. Virol. 2010; 84:1439-1452を参照されたい。
【0021】
用語「アデノ随伴ウイルス」または「ＡＡＶ」は、本明細書に使用される際には、約５，０００ヌクレオチドの線状の一本鎖ＤＮＡゲノムを含む、Parvoviridaeファミリーのウイルスメンバーを指す。少なくとも１１のＡＡＶの公認血清型（ＡＡＶｌ～１１）が、当技術分野では公知である。
【0022】
用語「ＡＡＶベクター」とは、本明細書に使用される際には、転写調節因子（例えばプロモーター、エンハンサー）およびポリアデニル化配列に機能的に連結されたポリペプチドコード配列の両側に、ＡＡＶ ５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列およびＡＡＶ ３’ＩＴＲが位置する核酸を指す。ＡＡＶベクターは、任意選択で、ポリペプチドコード配列のエクソンとエクソンとの間に挿入された１つまたは複数のイントロンを含むことがある。Samulski J, et al., Annu. Rev. Virol. 2014; 1:427-451を参照されたい。
【0023】
用語「ＡＩＤＳ」とは、本明細書に使用される際には、ＨＩＶ感染の症候性相を指し、後天性免疫不全症候群（通例はＡＩＤＳとして公知である）と「ＡＲＣ」またはＡＩＤＳ関連症候群のどちらも含む。Adler M, et al., Brit. Med. J. 1987; 294:1145-1147を参照されたい。ＡＩＤＳの免疫学的または臨床的な兆候は、当技術分野では周知であり、例えば、免疫不全に起因する日和見感染およびがんが挙げられる。
【0024】
用語「アミノ酸」とは、本明細書に使用される際には、天然および合成のアミノ酸、ならびに天然のアミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。アミノ酸は、本明細書では、その一般に知られる３文字の記号のいずれかによって、またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名委員会によって推奨される１文字の記号によって、指示されることがある。ヌクレオチドは、同様に、その一般に受け入れられている単文字コードによって指示されることがある。
【0025】
用語「抗体薬剤コンジュゲート」または「ＡＤＣ」は、本明細書に使用される際には、治療剤にコンジュゲーションされた抗体、抗原結合抗体断片、抗体誘導体、抗体複合体、または抗体融合タンパク質を指す。コンジュゲーションは、共有結合によるものでも非共有結合によるものでもよい。好ましくは、コンジュゲーションは共有結合によるものである。
【0026】
用語「抗レトロウイルス療法」または「ＡＴ」は、本明細書に使用される際には、ＨＩＶの複製を阻害するための１つまたは複数の抗レトロウイルス薬（すなわちＨＩＶ抗レトロウイルス）の投与を指す。典型的には、ＡＴは、少なくとも１つの抗レトロウイルス剤（または一般的には抗レトロウイルスのカクテル）、例えばヌクレオシド逆転写酵素阻害剤［例えばジドブジン（ＡＺＴ、ラミブジン（３ＴＣ）、およびアバカビル］、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（例えばネビラピンおよびエファビレンツ）やプロテアーゼ阻害剤（例えばインジナビル、リトナビル、およびロピナビル）などの投与を含む。用語の高活性抗レトロウイルス療法（「ＨＡＡＲＴ」）とは、ＨＩＶの複製および疾患の進行を積極的に抑制するように設計された治療レジメンを指す。ＨＡＡＲＴは、例えば２つのヌクレオシド逆転写酵素阻害剤と１つのプロテアーゼ阻害剤など、通常は３つ以上の異なる薬剤からなる。
【0027】
用語「結合効能」とは、本明細書に使用される際には、ＣＤ４受容体との、および好ましくは、前述の受容体のＤ１ドメインおよびＤ２ドメインとの、分子の親和性を指す。本発明のコンテクストでは、「親和性」とは、抗体誘導体が例えばｇｐ１２０のＣＤ４結合部位と結合する強度を意味する。本明細書に使用される際には、用語「結合」または「特異的に結合すること」とは、結合対（例えば２つのタンパク質または化合物の間の、好ましくは（ｉ）ｇｐ１２０のＣＤ４結合部位と（ｉｉ）ＣＤ４受容体またはＣＤ４受容体のＤ１ドメインおよびＤ２ドメインとの間の相互作用を指す。実施形態によっては、この相互作用は、最高１０－６モル／リットルの、最高１０－７モル／リットルの、または最高１０－８モル／リットルの親和性定数を有する。概して、語句「結合」または「特異的に結合すること」とは、ある化合物と別のものとの特異的な結合を指し、ここでは、結合のレベルは、任意の標準的なアッセイによって測定される際に、そのアッセイのバックグラウンド対照よりも統計学的に有意に高い。
【0028】
用語「Ｃ３４」とは、本明細書に使用される際には、ｇｐ４１のＨＲ２領域の部分をカバーする配列番号９のｇｐ４１由来ポリペプチドを指す。Eggink D, et al., J. Virol. 2008; 82(13):6678-6688を参照されたい。
【0029】
用語「ＣＣＲ５」とは、本明細書に使用される際には、ヒトＣ－Ｃケモカイン受容体５を指し、これはＣＤ１９５としても知られ、Ｇタンパク質と共役する７回膜貫通ドメイン受容体である。ＣＣＲ５は、様々なケモカインに結合し、標的細胞内へのＨＩＶの進入の過程の間に、ＨＩＶのＥｎｖの補助受容体としての役割を果たす。ＨＩＶの補助受容体の機能には、ＣＣＲ５の様々な領域が関与する。ただし、最初の相互作用は、ＣＣＲ５のＮ末端の細胞外領域と、ｇｐ１２０サブユニットに位置するＨＩＶのＥｎｖの補助受容体結合部位との間で確立される。Lagenaur L, et al., Retrovirology 2010; 7:11を参照されたい。ヒトＣＣＲ５の完全長タンパク質配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号P51681（２０１５年８月１８日）を有する。
【0030】
用語「ＣＤ４」または「ＣＤ４受容体」は、本明細書に使用される際には、分化クラスター４を指し、これは、Ｔヘルパー細胞、単球、マクロファージ、および樹状細胞の表面に発現している糖タンパク質である。ＣＤ４は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を、その抗原提示細胞との接合の際に支援する。Ｔ細胞の内側に存在する部分を用いて、ＣＤ４は、チロシンキナーゼｌｃｋとして知られる酵素をリクルートすることによって、ＴＣＲによって生成されるシグナルを増幅し、このｌｃｋは、活性化Ｔ細胞のシグナル伝達カスケードに関わる数多くの分子を活性化するために不可欠である。ヒトＣＤ４の完全長タンパク質配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号P01730（２０１２年６月１８日）を有する。
【0031】
用語「コドンが最適化されている」とは、本明細書に使用される際には、宿主生物の典型的なコドン使用を反映させて、アミノ酸配列を変えることなく参照ポリペプチドの発現を向上させるための、核酸のコドンの変更を指す。コドン最適化のための、当技術分野に公知のいくつかの方法およびソフトウェアツールがある。Narum D, et al., Infect. Immun. 2001; 69(12):7250-7253）、Outchkourov N, et al., Protein Expr. Purif. 2002; 24(1):18-24、Feng L, et al., Biochemistry 2000; 39(50):15399-15409、およびHumphreys D, et al., Protein Expr. Purif. 2000; 20(2):252-264を参照されたい。
【0032】
用語「含むこと」または「含む」とは、本明細書に使用される際には、一般に受け入れられている特許の実務による「からなること」をも明示する。
【0033】
用語「Ｅｎｖ」または「ｇｐ１６０」とは、本明細書に使用される際には、ＨＩＶの外側の外被タンパク質（Ｅｎｖ）の抗原特異性または生物学的機能のどちらかを有し、２つのサブユニット、すなわちｇｐ１２０糖タンパク質およびｇｐ４１糖タンパク質を包含する、糖タンパク質を指す。野生型（ｗｔ）ｇｐ１６０ポリペプチドの例示的な配列は入手可能である。ＧｅｎＢａｎｋ受入番号AAB05604およびAAD12142を参照されたい。
【0034】
用語「断片結晶化可能領域」または「Ｆｃ領域」とは、本明細書に使用される際には、Ｆｃ受容体と呼ばれる細胞表面の受容体および補体系のいくつかのタンパク質と相互作用する、抗体の尾部領域を指す。
【0035】
表現「機能的に等価なバリアント」とは、本明細書に使用される際には、（ｉ）改変、欠失、もしくは挿入または１つもしくは複数のアミノ酸の結果生じた、実質的にその参照ポリペプチドの活性を保持するポリペプチド、および（ｉｉ）改変、欠失、もしくは挿入または１つもしくは複数の塩基の結果生じた、実質的にその参照核酸によって発現されるポリペプチドの活性を保持するポリヌクレオチドを指す。本発明のコンテクストで想定される機能的に等価なバリアントとしては、配列番号１～１０の配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９９％の類似性もしくは同一性を示すポリペプチド、または配列番号２２～３１の配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９９％の類似性もしくは同一性を示すポリヌクレオチドが挙げられる。２つのポリペプチド間のまたは２つのポリヌクレオチド間の同一性または類似性の程度は、当技術分野に広く公知であるコンピュータ実装されたアルゴリズムおよび方法を使用することによって決定される。２つのアミノ酸の配列間の 同一性および類似性は、好ましくは、BLASTPアルゴリズムを用いて決定される。Altschul S, et al., “BLAST Manual”（NCBI NLM NIH, Bethesda, MD, USA, 2001)を参照されたい。
【0036】
用語「融合タンパク質」とは、本明細書に使用される際には、異なるタンパク質由来の２つ以上の機能ドメインからなる、遺伝子技術によって生成されるタンパク質に関する。融合タンパク質は、従来の手法によって（例えば、適した細胞で、前述の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を遺伝子発現させることによって）取得されてもよい。
【0037】
用語「ｇｐ４１」とは、本明細書に使用される際には、ヒト免疫不全ウイルス１外被糖タンパク質ｇｐ４１を指す。ｇｐ４１は、ｇｐ１２０と共にＨＩＶ－１のＥｎｖ糖タンパク質を形成するサブユニットである。Ｅｎｖは、３つの外部サブユニット（ｇｐ１２０）と３つの膜貫通サブユニット（ｇｐ４１）とから構成される三量体である。ｇｐ４１タンパク質の細胞外部分は、３つの必須の機能領域、すなわち融合ペプチド（ＦＰ）、Ｎ末端の７つ揃いの反復（ＨＲ１）、およびＣ末端の７つ揃いの反復（ＨＲ２）を含有する。ＨＲ１領域およびＨＲ２領域は、コイル構造を形成する傾向を持つ複数のロイシンジッパー様モチーフを含有する。Peisajovich S, Shai Y, Biochem. Biophys. Acta 2003; 1614:122-129; Suarez T, et al., FEBS Lett. 2000; 477:145-149; Chan D, et al., Cell 1997; 89:263-273を参照されたい。数多くのＨＩＶのｇｐ－４１の核酸配列およびアミノ酸配列が、公的に容易に入手可能である。ＨＩＶ配列データベース、http://www.HIV.lanl.gov/content/sequence/HIV/mainpage.html、２０１５年１１月を参照されたい。
【0038】
用語「ｇｐ４１阻害物質」は、本明細書に使用される際には、ｇｐ４１のＨＲ２領域をカバーする様々な長さの一連のポリペプチドを含む。これらの阻害物質としては、以下に限定されないが、ｇｐ４１由来ポリペプチドＴ－２０、Ｃ３４、Ｔ－１２４９、およびＴ－２６３５が挙げられる。
【0039】
表現「ｇｐ４１由来ポリペプチド」は、本明細書に使用される際には、ｇｐ４１の７つ揃いの反復１（ＨＲ１）モチーフまたは７つ揃いの反復２（ＨＲ２）モチーフに由来するポリペプチドを指す。ｇｐ４１のＨＲｌ配列およびＨＲ２配列は、当技術分野に周知である。Lupas A, Trends Biochem. Sci. 1996; 21:375-382 および Chambers P, et al., J. Gen. Virol. 1990; 71:3075-3080を参照されたい。好ましくは、ｇｐ４１由来ポリペプチドは、ＨＲ２に源を発する。ｇｐ４１由来ポリペプチドは、Ｎ末端またはＣ末端に位置する追加の外因性アミノ酸を含有することがある。好ましくは、外因性アミノ酸は１０個未満であり、さらに好ましくは５個未満であり、最も好ましくは３個未満である。
【0040】
用語「ｇｐ１２０」とは、本明細書に使用される際には、ＨＩＶの外側の外被タンパク質（ｅｎｖ）の抗原特異性または生物学的な機能のどちらかを有する糖タンパク質を指す。「ｇｐ１２０タンパク質」は、Ｅｎｖポリペプチドのｇｐ１２０領域に由来する分子である。ｇｐ１２０のアミノ酸配列は、およそ５１１アミノ酸である。ｇｐ１２０は、１２０ｋＤの見かけ上の分子量を有する、稠密にＮ－グリコシル化されたタンパク質である。ｇｐｌ２０は、５つの可変ドメイン（Ｖｌ～Ｖ５）が散在する、５つの比較的保存されたドメイン（Ｃ１～Ｃ５）を含有する。可変ドメインは、広範囲にわたってアミノ酸の置換、挿入、および欠失を含有する。「ｇｐｌ２０ポリペプチド」は、単一のサブユニットおよび多量体のどちらも含む。ｇｐ４１部分は、ビリオンの膜二重層に係留されている（および広がっている）が、一方、ｇｐｌ２０セグメントは、周囲の環境内へ突き出ている。ｇｐ１２０の受容体結合ドメインは、タンパク質のＮ末端半分に局在する。これにプロリンに富む領域（ＰＲＲ）が続くが、この領域は、受容体結合を融合機構に伝えるヒンジまたはトリガーのいずれかとして挙動する。ｇｐ１２０のＣ末端は、高度に保存されており、ｇｐ４１と相互作用する。ＧｅｎＢａｎｋ受入番号AAB05604およびAAD12142を参照されたい。
【0041】
用語「ＨＩＶ」としては、本明細書に使用される際には、ＨＩＶ－１およびＨＩＶ－２、ＳＨＩＶおよびＳＩＶが挙げられる。「ＨＩＶ－１」とは、ヒト免疫不全ウイルス１型を意味する。ＨＩＶ－１は、以下に限定されないが、細胞外ウイルス粒子と、ＨＩＶ－１感染細胞に随伴するＨＩＶ－１の形態とを含む。ＨＩＶ－１ウイルスは、公知の主要なサブタイプ（クラスＡ、Ｂ、Ｃ、ＤＥ、Ｆ、ＧおよびＨ）、またはそれとは離れた実験室株および初代分離株を含むサブタイプ（グループＯ）のうちいずれを表してもよい。「ＨＩＶ－２」とは、ヒト免疫不全ウイルス２型を意味する。ＨＩＶ－２は、以下に限定されないが、細胞外ウイルス粒子と、ＨＩＶ－２感染細胞に随伴するＨＩＶ－２の形態とを含む。用語「ＳＩＶ」とは、サル、チンパンジー、および他の非ヒト霊長類に感染するＨＩＶ様ウイルスである、シミアン免疫不全ウイルスを指す。ＳＩＶは、以下に限定されないが、細胞外ウイルス粒子と、ＳＩＶ感染細胞に随伴するＳＩＶの形態とを含む。
【0042】
用語「ＨＩＶ曝露」とは、本明細書に使用される際には、非感染の対象がＨＩＶ感染またはＡＩＤＳの対象に接触すること、またはそのようなＨＩＶ感染対象からの体液に接触することを指し、ここでは、感染対象からのそのような液は、非感染対象の組織の粘膜、切創、もしくは擦過創（例えば針刺し、無防備の性交）、または他の表面に接触し、それゆえウイルスが、感染対象または感染対象の体液から非感染対象に伝播する可能性がある。
【0043】
用語「ＨＩＶ感染」とは、本明細書に使用される際には、個体におけるＨＩＶウイルスの存在の徴候を指し、そのようなものとしては、無症候性血清陽性、ＡＩＤＳ関連症候群（ＡＲＣ）、および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）が挙げられる。
【0044】
用語「ＩＣ５０」とは、本明細書に使用される際には、所与の生物学的な過程または生物学的な過程の構成成分（すなわち酵素、細胞、細胞受容体、または微生物）の５０％を阻害するために必要な具体的な活性剤の量を指す。
【0045】
２つ以上の核酸またはポリペプチドのコンテクストにおける用語「同一の」またはパーセント「同一性」は、同じものであるか、または特定のヌクレオチドまたはアミノ酸残基のパーセンテージを有する、２つ以上の配列または部分配列を指し、それらの配列は、いかなる保存されたアミノ酸置換も配列同一性の一環として考慮せずに、最大の対応付けを行うために（必要に応じてギャップを導入して）比較および整列された際に、同じものである。パーセント同一性は、配列比較のソフトウェアもしくはアルゴリズムを用いて、または視覚的な検査によって、測定することができる。アミノ酸配列またはヌクレオチド配列のアラインメントを取得するために使用できる、各種アルゴリズムおよびソフトウェアは、当技術分野に公知である。配列類似性を決定するために適したアルゴリズムの例としては、以下に限定されないが、BLASTアルゴリズム、Gapped BLASTアルゴリズム、およびBLAST 2.0アルゴリズム、WU-BLAST-2アルゴリズム、ALIGNアルゴリズム、およびALIGN-2 アルゴリズムが挙げられる。Altschul S, et al., Nuc. Acids Res. 1977; 25:3389-3402、Altschul S, et al., J. Mol. Biol. 1990; 215:403-410、Altschul S, et al., Meth. Enzymol. 1996; 266:460-480、Karlin S, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990; 87:2264-2268、Karlin S, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993; 90:5873-5877、Genentech Corp、サウスサンフランシスコ、カリフォルニア州、米国、http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi、２０１５年１１月を参照されたい。比較のための配列のアラインメントの方法は、当技術分野に周知である。比較のための最適な配列のアラインメントは、例として、Smith-Waterman局所相同性アルゴリズムによって、Needleman-Wunsch相同性アラインメントアルゴリズムによって、Pearson-Lipman類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ実装によって、または手動のアラインメントおよび視覚的な検査によって、実施することができる。Smith T, et al., Adv. Appl. Math. 1981; 2:482-489、Needleman S, et al., J. Mol. Biol. 1970; 48:443-453、Pearson W, et al., Lipman D, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988; 85:2444-2448、GAPプログラム、BESTFITプログラム、FASTAプログラム、およびTFASTAプログラム、Wisconsin Genetticsソフトウェアパッケージ、Genetics Computer Group、マディソン、ウィスコンシン州、米国； Ausubel F, et al., Eds., “Short Protocols in Molecular Biology”, 5th Ed. (John Wiley and Sons, Inc.,NY, USA, 2002)を参照されたい。
【0046】
用語「キット」とは、本明細書に使用される際には、輸送および保管を可能にするために梱包された、本発明の使用および方法を実施するのに必要な様々な試薬を含有する製品を指す。キットの構成物の梱包に適した素材としては、クリスタルガラス、プラスチック（例えばポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート）、ビン、バイアル、紙、または封筒が挙げられる。
【0047】
用語「中和抗体」とは、本明細書に使用される際には、細胞外分子（例えば病原性ウイルスの表面のタンパク質またはタンパク質ドメイン）に結合して、細胞外分子の、細胞に感染する、またはその活性を変調する能力に干渉する、任意の抗体、抗原結合断片、または抗体誘導体である。典型的には、本発明の抗体誘導体は、細胞外分子の表面に結合することができ、前述の抗体誘導体の非存在下または陰性対照の存在下で細胞外分子が細胞に付加するのに比べて、細胞との連係を少なくとも９９％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６０％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、または１０％阻害することが可能である。抗体誘導体が中和しているか否かを確認するための方法は、当技術分野で記載されている。Li M, et al., J. Virol. 2005; 79:10108-10125、Wei X, et al., Nature 2003; 422:307-312、およびMontefiori D, Curr. Protoc. Immunol. 2005; Jan, Chapter 12:Unit 12.11を参照されたい。本発明のコンテクストでは、病原体は、好ましくはＨＩＶであり、さらに明確にはＨＩＶウイルス外被のｇｐ１２０タンパク質である。特に、用語「ＨＩＶ中和抗体」とは、ｇｐ１２０のＣＤ４結合部位との親和性を有する抗体誘導体、例えばＩｇＧｂ１２などを指す。用語「中和抗体」は、ｂｎＡｂのサブクラスを含む。本明細書に使用される際には、「広域中和抗体」または「ｂｎＡｂ」は、任意の方法によって取得される抗体であるものと理解され、この抗体は、有効な用量で送達される際に、７株超のＨＩＶに、好ましくは８株超、９株、１０株、１１株、１２株、１３株、１４株、１５株、１６株、１７株、１８株、１９株、２０株、またはそれを超える株数のＨＩＶに対する、ＨＩＶ感染またはＡＩＤＳの予防または治療のための治療剤として使用することができる。
【0048】
用語「ＮＫ細胞」とは、本明細書に使用される際には、先天免疫系にとって決定的に重要な細胞毒性リンパ球の１タイプである「ナチュラルキラー細胞」を指す。ＮＫ細胞は、ウイルスによる感染細胞への迅速な応答を与え、腫瘍の形成に応答して、感染後３日目頃に作用する。典型的には，免疫細胞は、感染細胞表面上に提示されたＨＬＡを検出し、サイトカイン放出を誘発して溶解またはアポトーシスを引き起こす。しかし、ＮＫ細胞は、ストレスを受けた細胞を抗体およびＨＬＡの非存在下で認識するための能力を有することから、異色であり、はるかに早い免疫反応を可能にする。ＮＫ細胞は、大型顆粒リンパ球として定義され、Ｂリンパ球およびＴリンパ球を生成する共通のリンパ球前駆体から分化する第３の種類の細胞を構成する。ＮＫ細胞は、循環内に入る場である骨髄、リンパ節、脾臓、扁桃、および胸腺で分化および成熟することが知られている。ＮＫ細胞は、ヒトで、通常は表面マーカーＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）およびＣＤ５６を発現する。
【0049】
用語「ＮＬ４－３」および「ＢａＬ」とは、本明細書に使用される際には、実験室で一般に使用される２つの異なるＨＩＶ分離株を指す。ＮＬ４－３分離株は、ＮＹ５プロウイルスおよびＬＡＶプロウイルスからクローニングされた。Adachi A, et al., J. Virol. 1986; 59:284-291を参照されたい。ＢａＬ分離株は、外植された肺組織から成長した接着細胞の初代培養から取得された。Gartner S, et al., Science 1986; 233:215-219を参照されたい。
【0050】
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「ヌクレオチド配列」は、本明細書に互換的に使用される際には、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドから構成される任意の長さのヌクレオチドの任意のポリマー形状に関する。この用語は、一本鎖ポリヌクレオチドおよび二本鎖ポリヌクレオチドの両方、ならびに修飾ポリヌクレオチド（例えばメチル化、保護化）を含む。典型的には、核酸は、本明細書に使用される際には、適切な調節配列の制御下に配された場合に宿主細胞でポリペプチドに転写および翻訳されるＤＮＡ配列を指す、「コード配列」である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定される。コード配列としては、以下に限定されないが、原核配列、真核ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核（例えば哺乳類）ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列さえも挙げることができる。転写終結配列は、通常はコード配列の３’に位置するものとする。
【0051】
用語「機能的に連結された」とは、本明細書に使用される際には、（例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系で、またはベクターが宿主細胞内に導入されている場合には宿主細胞で）ヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で、目的のヌクレオチド配列が調節配列に連結されていることを意味する。Auer H, Nature Biotechnol. 2006; 24: 41-43を参照されたい。
【0052】
表現「ＨＩＶ分離株のパネル」とは、本明細書に使用される際には、標準化ｔｉｅｒ２／３の中和抗体応答の評価を容易にするためのＥｎｖシュードタイプウイルスとして使用するために設計された、参照のＨＩＶ分離株のコレクションを指す。Mascola R, et al., J. Virol. 2005; 79(16):10103を参照されたい。シュードウイルスは、多くの初代ＨＩＶ－１分離株の典型である、中和の表現型を示す。ｇｐ１６０遺伝子は、性行為による急性／初期感染からクローニングされ、サブタイプＢ内で広範囲の遺伝子的な、抗原性の、および地理的な多様性を含む。これらのクローンは、ＣＣＲ５を補助受容体として使用する。Li, et al., J. Virol. 2005; 79(16):10108-10125を参照されたい。
【0053】
表現「非経口の投与」および「非経口で投与する」とは、本明細書に使用される際には、通常は注射による、経腸および局所投与以外の投与の方式を意味し、そのようなものとしては、限定はないが、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、および胸骨内の注射および注入が挙げられる。
【0054】
表現「医薬的に許容可能な担体」は、本明細書に使用される際には、本発明の抗体誘導体、核酸、ベクター、および宿主細胞と生理的に適合性のある任意のまたは全ての溶媒、分散媒、被覆、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤を含む。
【0055】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すために互換的に本明細書に使用される。これらの用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が対応の天然アミノ酸の人工の化学模倣体であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然のアミノ酸ポリマーおよび非天然のアミノ酸ポリマーに適用される。
【0056】
用語「予防する」、「予防すること」、および「予防」とは、本明細書に使用される際には、対象での疾患の開始を阻害することまたは発生を減少させることを指す。予防は完全であることがある（例えば、対象で病態細胞が全く不在である）。また、予防は部分的であることがあり、例えば、対象で病態細胞の発生を低下させるなどがある。また、予防は、臨床状態への罹患性の低減を指す。本発明のコンテクストでは、用語「予防する」、「予防すること」、および「予防」とは、明確には、ＨＩＶ曝露を被っている対象でＨＩＶ感染の可能性を回避または低減することを指す。
【0057】
用語「試料」とは、本明細書に使用される際には、任意の生体液、および特に、対象から得られる血液、血清、血漿、リンパ液、唾液、末梢血液細胞、または組織細胞血清、精液、痰、脳脊髄液（ＣＲＬ）、涙、粘液、汗、乳汁、または脳抽出物を指す。身体組織は、胸腺、リンパ節、脾臓、骨髄、または扁桃の組織を含むことがある。また、用語「試料」は、非生体試料（例えば水、飲料から得られる）を指す。
【0058】
用語「対象」とは、本明細書に使用される際には、個人、植物または動物、例えばヒト、非ヒト霊長類（例えばチンパンジーおよび他の類人猿およびサル種）、農業動物、例えば鳥、魚、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギやウマなど；家畜哺乳類、例えばイヌやネコなど；齧歯類を含む実験動物、例えばマウス、ラットやモルモットを指す。この用語は、具体的な年齢または性別を表さない。用語「対象」は、胚および胎児を包含する。好適な実施形態では、対象とはヒトである。
【0059】
用語「Ｔ－１２４９」とは、本明細書に使用され、ｇｐ４１のＨＲ２領域の部分をカバーする、配列番号８のｇｐ４１由来ポリペプチドを指す。前掲Eggink, 2008を参照されたい。
【0060】
用語「Ｔ－２０」とは、本明細書に使用され、ｇｐ４１のＨＲ２領域の部分をカバーする、配列番号７のｇｐ４１由来ポリペプチドを指し、エンフビルチドとしても公知である。ＣＡＳ［159519-65-0］および米国特許第５，４６４，９３３号を参照されたい。このポリペプチドは、ナノモルの範囲で抗ウイルス活性を有し、ＨＩＶ感染に対する療法に使用されている。Zhang D, et al., Expert Opin Ther Pat. 2015; 25:159-173および前掲Eggink, 2008を参照されたい。
【0061】
用語「Ｔ－２６３５」とは、本明細書に使用され、ｇｐ４１のＨＲ２領域の部分をカバーする、配列番号１０のｇｐ４１由来ポリペプチドを指す。前掲Eggink, 2008を参照されたい。
【0062】
用語「治療剤」とは、本明細書に使用される際には、疾患の治療または予防に有用な原子、分子、または化合物を指す。治療剤の例としては、以下に限定されないが、抗体、抗体断片、ＨＩＶ抗レトロウイルス、薬剤、細胞毒性剤、アポトーシス促進剤、毒素、ヌクレアーゼ（例えばＤＮＡｓｅｓおよびＲＮＡｓｅｓ）、ホルモン、免疫調節剤、キレート剤、ホウ素化合物、光活性剤または染料、放射性核種、オリゴヌクレオチド、干渉性ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、抗血管新生剤、化学療法剤、サイトカイン、ケモカイン、プロドラッグ、酵素、結合タンパク質、ペプチド、またはそれらの組合せが挙げられる。
【0063】
用語「治療有効量」とは、本明細書に使用される際には、対象で治療応答または所望の効果を生み出す本発明の抗体誘導体、核酸、ベクター、医薬組成物、またはそれらの混合物の用量または量を指す。
【0064】
用語「療法」または「治療の」とは、本明細書に使用され、疾患の治療または予防のどちらかのための本発明の抗体誘導体、核酸、ベクター、医薬組成物、またはそれらの混合物の使用を指し、そのような疾患としては、以下に限定されないが、ＨＩＶおよびＡＩＤＳが挙げられる。
【0065】
用語「治療する」または「治療」とは、本明細書に使用される際には、臨床徴候が現れた後の疾患の進行を制御するために、本発明の抗体誘導体、核酸、ベクター、宿主細胞、または医薬組成物を投与することを指す。疾患の進行の制御は、有益なまたは所望の臨床結果を意味するものと理解され、そのようなものとしては、以下に限定されないが、症状の低減、疾患の持続期間の低減、病的状態の安定化（明確には、いっそうの悪化を避けるための）、疾患の進行の遅延、病的状態の改善、および緩和（部分的および全体的の両方）が挙げられる。また、疾患の進行の制御は、治療が適用されなかった場合の予想される生存期間に比べて生存期間が延びることも含む。本発明のコンテクストでは、用語「治療する」および「治療」とは、明確には、ＨＩＶ感染対象における健康なＣＤ４＋Ｔ細胞の感染および破壊を止めることまたは遅らせることを指す。また、それは、例えばＣＤ４＋Ｔ細胞数が極めて僅かであったり、日和見性病原体によって感染が繰り返されたりといった、後天性免疫不全疾患の症状の開始を止めることおよび遅らせることを指す。有益なまたは所望の臨床結果としては、以下に限定されないが、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の絶対数の増加（幅１０～３５２０）、循環免疫細胞全体にわたるＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージの増加（幅１～５０％）、または非感染対象における正常ＣＤ４＋Ｔ細胞数のパーセンテージとしてのＣＤ４＋Ｔ細胞数の増加（幅１～１６１％）が挙げられる。また、「治療」とは、対象がＨＩＶ標的治療を何も受けない場合に予想される生存期間に比べて、感染対象の生存期間を延長することを意味することもできる。
【0066】
用語「ベクター」とは、本明細書に使用される際には、線状または環状の核酸分子を指し、この核酸分子は、宿主細胞における自律複製をもたらす追加のセグメントに機能的に連結されているかまたは上記核酸分子の発現カセットに従う、本発明の核酸を含む。
２．抗体誘導体
２．抗体誘導体
【0067】
第１の態様では、本発明は、Ｎ末端からＣ末端までに
（ａ）ヒトＣＤ４受容体のＤ１細胞外ドメインおよびＤ２細胞外ドメイン、
（ｂ）ヒトＩｇＧのＦｃ部分、
（ｃ）（ｉ）１≦ｎ≦１０である配列（ＧＧＧＧＳ）ｎのリンカーポリペプチド、（ｉｉ）ヒトＣＣＲ５受容体配列、および（ｉｉｉ）それらの組合せ、からなる群から選択される部分、ならびに
（ｄ）ｇｐ４１由来ポリペプチド
を含む、抗体誘導体を指す。
（ａ）ヒトＣＤ４受容体のＤ１細胞外ドメインおよびＤ２細胞外ドメイン、
（ｂ）ヒトＩｇＧのＦｃ部分、
（ｃ）（ｉ）１≦ｎ≦１０である配列（ＧＧＧＧＳ）ｎのリンカーポリペプチド、（ｉｉ）ヒトＣＣＲ５受容体配列、および（ｉｉｉ）それらの組合せ、からなる群から選択される部分、ならびに
（ｄ）ｇｐ４１由来ポリペプチド
を含む、抗体誘導体を指す。
【0068】
本発明の抗体誘導体は、抗ウイルス活性およびＡＤＣＣ活性が増加しているという特徴を有する。
【0069】
一実施形態では、本発明の抗体誘導体のＤ１ドメインは、ヒトＣＤ４受容体（すなわちＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベース受入番号P01730）のアミノ酸２６～１２５またはその機能的に等価なバリアントを含む。別の実施形態では、抗体誘導体のＤ２ドメインは、ヒトＣＤ４受容体のアミノ酸１２６～２０３またはその機能的に等価なバリアントを含む。好ましくは、Ｄ１ドメインおよびＤ２ドメインは、それぞれ配列番号１および配列番号２の配列、またはそれらの機能的に等価なバリアントを含む。
【0070】
さらに別の一実施形態では、ヒトＩｇＧのＦｃ部分は、アイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のＦｃ部分を含む。好ましくは、ＩｇＧのアイソタイプはＩｇＧ１である。さらに好ましくは、ヒトＩｇＧのＦｃ部分は、点変異Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、およびＩ３３２Ｅまたはその機能的に等価なバリアントを含む。配列番号４を含むヒトＩｇＧ１のＦｃ部分またはその機能的に等価なバリアントが、最も好適である。
【0071】
別の実施形態では、本発明の抗体誘導体の部分は、（ｉ）１≦ｎ≦１０である配列（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号５）のリンカーポリペプチド、（ｉｉ）ヒトＣＣＲ５受容体配列、（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）との組合せ、ならびに（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）の機能的に等価なバリアントからなる群から選択される。この実施形態の１バージョンでは、当該部分は、リンカー、またはヒトＣＣＲ５受容体配列、またはそれらの機能的に等価なバリアントのみを含む。この実施形態の別のバージョンでは、当該部分は、リンカーとヒトＣＣＲ５受容体配列との組合せ、またはその機能的に等価なバリアントを含む。好ましくは、リンカーは、組合せが採用される際には、ヒトＣＣＲ５受容体配列のＣ末端に付加される。好ましくは、当該部分は、リンカーのみ、またはリンカーとヒトＣＣＲ５受容体配列との組合せ、またはそれらの機能的に等価なバリアントを含む。好ましくは、ヒトＣＣＲ５受容体配列は、配列番号６またはその機能的に等価なバリアントを含む。
【0072】
さらに別の一実施形態では、ｇｐ４１由来ポリペプチドは、Ｔ－２０、Ｔ－４９１２、Ｃ３４、Ｔ－２６３５ポリペプチド、それらの組合せ、またはそれらの機能的に等価なバリアントを含む。好ましくは、ｇｐ４１由来ポリペプチドは、Ｔ－２０ポリペプチドまたはその機能的に等価なバリアントを含む。さらに好ましくは、Ｔ－２０ポリペプチドは配列番号７を含む。
【0073】
追加の一実施形態では、本発明の抗体誘導体は、分子５、分子６、分子７、分子８、分子１０、分子１１、またはそれらの機能的に等価なバリアントを含む。好ましくは、抗体誘導体は、分子５、分子７、分子８、またはそれらの機能的に等価なバリアントを含む。さらに好ましくは、抗体誘導体は分子７を含む。この実施形態の１バージョンでは、分子５、分子６、分子７、分子８、分子１０、および分子１１は、それぞれ配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、および配列番号２１の配列、またはそれらの機能的に等価なバリアントを含む。
好ましくは、本発明の抗体誘導体は、
好ましくは、本発明の抗体誘導体は、
【0074】
（１）（ａ）ヒトＣＤ４受容体のＤ１細胞外ドメインおよびＤ２細胞外ドメイン、（ｂ）ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分、（ｃ）（ｉ）１≦ｎ≦１０である配列（ＧＧＧＧＳ）ｎのリンカーポリペプチド、（ｉｉ）ヒトＣＣＲ５受容体配列、および（ｉｉｉ）それらの組合せ、からなる群から選択される部分、ならびに（ｄ）Ｔ－２０、Ｔ－１２４９、Ｃ３４、およびＴ－２６３５からなる群から選択されるｇｐ４１由来ポリペプチドであって、ここで、ＩｇＧ１は野生型であるか、または点変異Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、およびＩ３３２Ｅを含有し、
（２）（ａ）ヒトＣＤ４受容体のＤ１細胞外ドメインおよびＤ２細胞外ドメイン、（ｂ）ヒトＩｇＧ２のＦｃ部分、（ｃ）（ｉ）１≦ｎ≦１０である配列（ＧＧＧＧＳ）ｎのリンカーポリペプチド、（ｉｉ）ヒトＣＣＲ５受容体配列、および（ｉｉｉ）それらの組合せ、からなる群から選択される部分、ならびに（ｄ）Ｔ－２０、Ｔ－１２４９、Ｃ３４、およびＴ－２６３５からなる群から選択されるｇｐ４１由来ポリペプチド、
（３）（ａ）ヒトＣＤ４受容体のＤ１細胞外ドメインおよびＤ２細胞外ドメイン、（ｂ）ヒトＩｇＧ３のＦｃ部分、（ｃ）（ｉ）１≦ｎ≦１０である配列（ＧＧＧＧＳ）ｎのリンカーポリペプチド、（ｉｉ）ヒトＣＣＲ５受容体配列、および（ｉｉｉ）それらの組合せ、からなる群から選択される部分、ならびに（ｄ）Ｔ－２０、Ｔ－１２４９、Ｃ３４、およびＴ－２６３５からなる群から選択されるｇｐ４１由来ポリペプチド、ならびに
（２）（ａ）ヒトＣＤ４受容体のＤ１細胞外ドメインおよびＤ２細胞外ドメイン、（ｂ）ヒトＩｇＧ２のＦｃ部分、（ｃ）（ｉ）１≦ｎ≦１０である配列（ＧＧＧＧＳ）ｎのリンカーポリペプチド、（ｉｉ）ヒトＣＣＲ５受容体配列、および（ｉｉｉ）それらの組合せ、からなる群から選択される部分、ならびに（ｄ）Ｔ－２０、Ｔ－１２４９、Ｃ３４、およびＴ－２６３５からなる群から選択されるｇｐ４１由来ポリペプチド、
（３）（ａ）ヒトＣＤ４受容体のＤ１細胞外ドメインおよびＤ２細胞外ドメイン、（ｂ）ヒトＩｇＧ３のＦｃ部分、（ｃ）（ｉ）１≦ｎ≦１０である配列（ＧＧＧＧＳ）ｎのリンカーポリペプチド、（ｉｉ）ヒトＣＣＲ５受容体配列、および（ｉｉｉ）それらの組合せ、からなる群から選択される部分、ならびに（ｄ）Ｔ－２０、Ｔ－１２４９、Ｃ３４、およびＴ－２６３５からなる群から選択されるｇｐ４１由来ポリペプチド、ならびに
【0075】
（４）（ａ）ヒトＣＤ４受容体のＤ１細胞外ドメインおよびＤ２細胞外ドメイン、（ｂ）ヒトＩｇＧ４のＦｃ部分、（ｃ）（ｉ）１≦ｎ≦１０である配列（ＧＧＧＧＳ）ｎのリンカーポリペプチド、（ｉｉ）ヒトＣＣＲ５受容体配列、および（ｉｉｉ）それらの組合せ、からなる群から選択される部分、ならびに（ｄ）Ｔ－２０、Ｔ－１２４９、Ｃ３４、およびＴ－２６３５からなる群から選択されるｇｐ４１由来ポリペプチド
を含む。
を含む。
【0076】
さらに好ましくは、本発明の抗体誘導体は、（ａ）ヒトＣＤ４受容体のＤ１細胞外ドメインおよびＤ２細胞外ドメイン、（ｂ）点変異Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、およびＩ３３２Ｅを含有するヒトＩｇＧ１のＦｃ部分、（ｃ）（ｉ）１≦ｎ≦１０である配列（ＧＧＧＧＳ）ｎのリンカーポリペプチド、（ｉｉ）ヒトＣＣＲ５受容体配列、および（ｉｉｉ）それらの組合せ、からなる群から選択される部分、ならびに（ｄ）Ｔ－２０、Ｔ－１２４９、Ｃ３４、およびＴ－２６３５からなる群から選択されるｇｐ４１由来ポリペプチド、を含む。
【0077】
本発明の抗体誘導体は、前述のクラスターを表面に発現している細胞（例えばＴヘルパー細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞）において、分子（例えばＨＩＶ）のヒトＣＤ４受容体への付加を予防する（すなわち中和する）ために有用である。好ましくは、本発明の抗体誘導体は、ＨＩＶのウイルス外被に位置するｇｐ１６０タンパク質が、Ｔヘルパー細胞にみられるヒトＣＤ４受容体に付加することを、予防するために利用される。本発明の抗体誘導体の中和能は、ＩＣ５０が１０ｎｇ／ｍＬ以下、好ましくは、ＩＣ５０が５ｎｇ／ｍＬ未満、２．５ｎｇ／ｍＬ未満、１．２５ｎｇ／ｍＬ未満、０．６２５ｎｇ／ｍＬ未満、０．３１２μｇ／ｍＬ未満、０．１５６ｎｇ／ｍＬ未満、０．０７ｎｇ／ｍＬ未満、または０．０３５ｎｇ／ｍＬ未満であるという特徴を有する。
【0078】
追加の一実施形態では、本発明の抗体誘導体は、ポリマーへの共有結合によるコンジュゲーションによって、例えば循環半減期を延ばすために、化学的に修飾することができる。ポリペプチドをポリマーに付加する方法は、当技術分野に公知である。米国特許第４，７６６，１０６号、米国特許第４，１７９，３３７号、米国特許第４，４９５，２８５号、および米国特許第４，６０９，５４６号を参照されたい。好ましくは、ポリマーは、ポリオキシエチレンポリオールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧは、全体式：Ｒ（Ｏ－－ＣＨ２－－ＣＨ２）ｎＯ－－Ｒを有する水溶性のポリマーであり、上式で、Ｒは、水素、またはアルキル基やアルカノール基などの保護基とすることができる。好ましくは、保護基は、１個と８個との間の炭素を有し、さらに好ましくは、それはメチルである。好ましくは、ｎは１と１，０００との間の、さらに好ましくは、２と５００との間の整数である。ＰＥＧは、１，０００と４０，０００との間の、さらに好ましくは２，０００と２０，０００との間の、最も好ましくは３，０００と１２，０００との間の、好適な平均分子量を有する。
【0079】
さらに別の一実施形態では、本発明の抗体誘導体は、治療剤に付加されて抗体薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）を形成する。例として、ＡＩＤＳが始まることによって発生するかまたは起こり易くなる、例えばカポジ肉腫などの日和見性の疾患および状態の治療に使用される治療剤は、本発明の抗体誘導体とインターフェロン－α、リポソーム化アントラサイクリン（例えばドキシル）またはパクリタキセルとにより形成されるＡＤＣを用いて治療されることがある。さらに、ウイルス感染および細菌感染（例えば帯状疱疹、肺炎、結核）、皮膚疾患、ならびにＡＩＤＳに随伴する他のタイプのがん（例えばリンパ腫）など、他の日和見性疾患の治療に有効なＡＤＣが、本発明の抗体誘導体と適切な治療剤とを組み合わせることによって考案されることもある。
３．核酸、ベクター、および宿主細胞
３．核酸、ベクター、および宿主細胞
【0080】
別の態様では、本発明は、本発明の抗体誘導体をコードする核酸、ならびに前述の核酸を含む発現カセットおよびベクターに関する。
【0081】
好ましくは、核酸はポリヌクレオチドであり、そのようなものとしては、以下に限定されないが、ヌクレオチド間リン酸ジエステル結合連鎖によって連結されているデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）およびリボヌクレオチド（ＲＮＡ）が挙げられる。好適な一実施形態では、本発明の核酸は、ヒトＣＤ４受容体のＤ１細胞外ドメインおよびＤ２細胞外ドメインをコードするポリヌクレオチド（配列番号２２、配列番号２３）、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分（配列番号２４）、リンカーポリペプチド（配列番号２６）、ヒトＣＣＲ５受容体（配列番号２７）、およびＴ－２０ポリペプチド（配列番号２８）、またはそれらの機能的に等価なバリアントを含む。好ましくは、本発明の核酸は、分子５（配列番号３７）、分子６（配列番号３８）、分子７（配列番号３９）、分子８（配列番号４０）、分子１０（配列番号４１）、分子１１（配列番号４２）、またはそれらの機能的に等価なバリアントをコードする。本発明の核酸の機能的に等価なバリアントは、その参照配列について１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換によって取得されてもよい。好ましくは、本発明の核酸の機能的に等価なバリアントをコードするポリヌクレオチドとは、高度に制限的な条件でそれ自体を参照の核酸にハイブリダイズすることをその配列が可能にする、ポリヌクレオチドである。高度に制限的なハイブリダイゼーションの典型的な条件としては、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ：０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）および４０％ホルムアミド中、４２℃で１４時間インキュベーションした後、６０℃で０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用いて１回または複数回の洗浄サイクルを行うことが挙げられる。あるいは、高度に制限的な条件としては、６×ＳＳＣ中およそ５０°～５５℃の温度でハイブリダイゼーションすることと、１～３×ＳＳＣ中６８℃の温度で最終的に洗浄することとを含むものが挙げられる。中度に制限的な条件は、およそ０．２または０．３Ｍ ＮａＣｌ中５０℃の温度で６５℃ぐらいまでハイブリダイゼーションした後、およそ０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）中５０℃で５５℃ぐらいまで洗浄することを含む。さらに別の一実施形態では、本発明の核酸は、コドンが最適化されている。
【0082】
別の実施形態では、参照核酸と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の類似性を有する核酸のバリアントが代わりに使用され、ここでは、前述のバリアントは、本発明の抗体誘導体またはその機能的に等価なバリアントをコードする。
【0083】
本発明の核酸は、ベクター内にライゲーションするために、制限酵素で切断される必要がある場合がある（例えば１個、２個、または３個の末端ヌクレオチドが除去されることがある）。追加の一実施形態では、本発明は、制限酵素を用いて各端を切断されている、前述の核酸に関する。
【0084】
別の実施形態では、本発明は、本発明の核酸、プロモーター配列、および３’－ＵＴＲ、ならびに任意選択的に選択マーカーを含む、発現カセットに関する。
【0085】
さらに別の実施形態では、本発明は、本発明の核酸を含むベクターに関する。この実施形態の追加の一態様では、本発明の核酸は、前述のベクターによって構成される発現カセットに含有される。本発明による適したベクターとしては、以下に限定されないが、原核ベクター、例えばpUC18プラスミド、pUC19プラスミドやBluescriptプラスミドなど、ならびにそれらの誘導体、例えばmp18プラスミド、mp19プラスミド、pBR322プラスミド、pMB9プラスミド、ColE1プラスミド、pCRlプラスミドおよびRP4プラスミドのようなもの；ファージおよびシャトルベクター、例えばpSA3ベクターやpAT28ベクターなど；酵母での発現ベクター、例えば２ミクロンプラスミドタイプベクターなど；組み込み（integration）プラスミド；YEPベクター；セントロメアプラスミドおよび類似体；昆虫細胞での発現ベクター、例えばpACシリーズやpVLシリーズのベクターなど；植物での発現ベクター、例えばpIBIシリーズ、pEarleyGateシリーズ、pAVAシリーズ、pCAMBIAシリーズ、pGSAシリーズ、pGWBシリーズ、pMDCシリーズ、pMYシリーズ、pOREシリーズのベクターや類似体など；ならびに以下のどちらかに基づく高等真核細胞での発現ベクター、すなわちウイルスベクター（例えばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス）ならびに非ウイルスベクター、例えばpSilencer4.1-CMVベクター［Ambion（登録商標）、Life Technologies Corp.、カールスバッド、カリフォルニア州、米国］、pcDNA3ベクター、pcDNA3.1ベクター、pcDNA3.1/hygベクター、pHCMV/Zeoベクター、pCR3.1ベクター、pEFl/Hisベクター、pIND/GSベクター、pRc/HCMV2ベクター、pSV40/Zeo2ベクター、pTRACER-HCMVベクター、pUB6/V5-Hisベクター、pVAXlベクター、pZeoSV2ベクター、pCIベクター、pSVLベクターおよびpKSV-10ベクター、pBPV-1ベクター、pML2dベクター、およびpTDTlベクターが挙げられる。好ましくは、ベクターはpcDNA3.1ベクターである。さらに好ましくは、ベクターは、pABT-5、pABT-7、およびpABT-8である。
【0086】
追加の一実施形態では、ウイルスベクターはＡＡＶベクターである。本発明の抗体誘導体をコードするＡＡＶベクターは、当技術分野に周知の分子生物学手法に従って構築されてもよい。Brown T, “Gene Cloning” (Chapman & Hall, London, GB, 1995)；Watson R, et al., “Recombinant DNA”, 2nd Ed. (Scientific American Books, New York, N.Y., US, 1992)；Alberts B, et al., “Molecular Biology of the Cell” (Garland Publishing Inc., New York, N.Y., US, 2008)；Innis M, et al., Eds., “PCR protocols. A Guide to methods and Applications” (Academic Press Inc., San Diego, Calif., US, 1990)；Erlich H, Ed., “PCR Technology. Principles and Applications for DNA Amplification” (Stockton Press, New York, N.Y., US, 1989)；Sambrook J, et al., “Molecular Cloning. A Laboratory Manual” (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., US, 1989)；Bishop T, et al., “Nucleic Acid and Protein Sequence. A Practical Approach” (IRL Press, Oxford, GB, 1987)；Reznikoff W, Ed., “Maximizing Gene Expression” (Butterworths Publishers, Stoneham, Mass., US, 1987); Davis L, et al., “Basic Methods in Molecular Biology” (Elsevier Science Publishing Co., New York, N.Y., US, 1986), Schleef M, Ed., “Plasmid for Therapy and Vaccination” (Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim, Del., 2001)を参照されたい。
【0087】
例として、ＨＥＫ－２９３細胞（Ｅ１遺伝子を発現）、アデノウイルス機能をもたらすヘルパープラスミド、血清型２由来のＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子と所望の血清型（例えばＡＡＶ８）由来のｃａｐ遺伝子とをもたらすヘルパープラスミド、および最後に、ＩＴＲと目的の構築物（例えば分子５、分子７）とを有する骨格プラスミドが採用されることがある。本発明の抗体誘導体を発現するＡＡＶベクターを生成するために、抗体誘導体のｃＤＮＡが、ユビキタスな（例えばＣＡＧ）または細胞特異的なプロモーターの制御下にあるＡＡＶ骨格プラスミド内にクローニングされることがある。
【0088】
ＡＡＶベクター（ウイルスベクター粒子）は、改変を含む３つのプラスミドを用いた、ＨＥＫ２９３細胞のヘルパーウイルス不含のトランスフェクションによって生成されてもよい。Matsushita T, et al., Gene Ther. 1998；5:938-945およびWright J, et al., Mol. Ther. 2005；12:171-178を参照されたい。細胞は、ローラーボトル（ＲＢ）（Corning Inc.、コーニング、ニューヨーク州、米国）で、１０％ＢＦＳ（ウシ胎児血清）が補充されたＤＭＥＭ（Dulbeccos's改変Eagle培地）中、７０％の集密度に培養し、次いで、１）両側にウイルスＩＴＲが位置している発現カセットを担持するプラスミド（上に記載）；２）ＡＡＶ ｒｅｐ２と対応のｃａｐ（ｃａｐ１遺伝子およびｃａｐ９遺伝子とを担持するヘルパープラスミド；ならびに３）アデノウイルスのヘルパー機能を担持するプラスミド、を用いて共導入してもよい。次いで、以前に記載されたような標準プロトコールまたは最適化プロトコールのどちらかを用いて、２回連続の塩化セシウム勾配によって、ベクターを精製してもよい。Ayuso E, et al., Gene Ther. 2010; 17:503-510を参照されたい。ベクターをさらにＰＢＳに対し透析し、濾過し、ｑＰＣＲ（定量的ポリメラーゼ連鎖反応）によって力価を測定し、使用するまで－８０℃で保存してもよい。
【0089】
別の実施形態では、本発明は、本発明の核酸、発現カセット、またはベクターを含む宿主細胞に関する。本発明に従って使用される宿主細胞は、真核細胞と原核細胞の両方を含む任意の細胞のタイプとすることができる。好ましくは、細胞としては、原核細胞、酵母細胞、または哺乳類細胞が挙げられる。さらに好ましくは、宿主細胞は、ＨＥＫ－２９３細胞およびＣＨＯ細胞である。
４．医薬組成物
４．医薬組成物
【0090】
さらに別の一態様では、本発明は、本発明の抗体誘導体、核酸、ベクター、もしくは宿主細胞（以降、単独でまたは併せて「本発明の活性剤」と称する）、またはそれらの混合物のうち少なくとも１つを含有し、医薬的に許容可能な担体と共に製剤化された医薬組成物を指す。前述の医薬組成物は、対象のＨＩＶまたはＡＩＤＳを治療するために、または非感染対象のＨＩＶ感染を予防するために使用される。一実施形態では、組成物は、複数の（例えば２つまたは３つの）本発明の抗体誘導体、核酸、ベクター、または宿主細胞の混合物を含む。本発明の一実施形態では、組成物は、少なくとも分子３、分子４、分子５、分子６、分子７、分子８、分子１０、分子１１、または核酸、ベクター、もしくは前述の抗体誘導体を発現する宿主細胞、またはそれらの混合物を含む。好ましくは、組成物は、少なくとも分子５、分子７、分子８、または核酸、ベクター、または前述の抗体誘導体を発現する宿主細胞、またはそれらの混合物を含む。さらに好ましくは、組成物は、少なくとも分子７、または核酸、ベクター、もしくは前述の抗体誘導体を発現する宿主細胞、またはそれらの混合物を含む。本発明の抗体誘導体を含む医薬組成物の調製は、当技術分野に公知である。McNally E, et al., Eds., “Protein Formulation and Delivery” (Marcel Dekker, Inc., New York, NY, USA, 2000)、Hovgaard L, et al., Eds., “Pharmaceutical Formulation Development of Peptideｓ and Proteinｓ”, 2nd Ed. (CRC Press, Boca Raton, FL, USA, 2012)、およびAkers M, et al., Pharm Biotechnol. 2002; 14:47-127を参照されたい。
【0091】
好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄、または上皮の投与（例えば注射または注入による）に適する。投与の経路に応じて、本発明の活性剤は、その剤を不活化しうる条件の影響から剤を保護するために素材中に被覆されていてもよい。
【0092】
本発明のさらに別の一実施形態では、遺伝子療法（「受動免疫」）に特に適した医薬組成物が提供される。前述の医薬組成物は、本発明の核酸もしくはベクターまたはそれらの混合物のうち少なくとも１つを含み、当技術分野に公知の方法に従って調製される。Andre S, et al., J. Virol. 1998, 72:1497-1503; Mulligan M, Webber J, AIDS 1999; 13(Suppl A):S105-S112; O'Hagan D, et al., J. Virol. 2001; 75:9037-9043およびRainczuk A, et al., Infect. Immun. 2004; 72:5565-5573を参照されたい。本発明の核酸が内部に挿入される具体的なベクター骨格は、前述の核酸が対象で適切に発現する限り重要ではない。適したベクターの例としては、以下に限定されないが、ウイルスおよびプラスミドが挙げられる。好ましくは、ＡＡＶベクターは、ウイルスベクターが採用される際に使用される。好ましくは、プラスミド性ベクターが採用される際には、pcDNA3.1およびpVAX1（Invitrogen、カールスバッド、カリフォルニア州、米国）；ＤＮＡ配列はInvitrogenのウェブサイトhttp://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/invitrogen.html、２０１５年１０月で入手可能）；pNGVL（国立遺伝子ベクター研究所、ミシガン大学、ミシガン州、米国）；ならびにp414cyc（ＡＴＣＣ受入番号87380）およびp414GALS（ＡＴＣＣ受入番号87344）が使用される。さらに好ましくは、pcDNA3.1プラスミドがプラスミド性ベクターとして利用される。最も好ましくは、プラスミド性ベクターは、pABT-5、pABT-7、およびpABT-8である。
【0093】
受動免疫のデザインおよび適用は、当技術分野に公知である。Donnelly J, et al., Annu. Rev. Immunol. 1997; 15:617-648；Robinson H, Pertmer T, Adv. Virus Res. 2000; 55:1-74；Gurunathan S, et al., Annu. Rev. Immunol. 2000; 18:927-974 (2000)およびUlmer J, Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 2001; 4:192-197を参照されたい。簡潔に述べれば、本発明のコンテクスト内にある受動免疫は、対象におけるｉｎ ｖｉｖｏの抗体誘導体の発現に向けて構成される。Ulmer J, et al., Science 1993; 259:1745-1749を参照されたい。典型的には、核は、真核生物での発現に最適化された細菌プラスミド内にクローニングされ、以下からなる。すなわち、（ｉ）細菌で増殖するための複製の起点であって、通常はＣｏｌＥ１などのＥ．ｃｏｌｉの起点、（ｉｉ）抗生物質耐性遺伝子であって、通常はカナマイシンであり、細菌におけるプラスミドの選抜のためのもの、（ｉｉｉ）哺乳類細胞における最適な発現のための強いプロモーターであって、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）またはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のようなもの、（ｉｖ）プロモーターの下位にある、目的の遺伝子を挿入するための多重クローニング部位および（ｖ）ｍＲＮＡを安定化させるためのＳＶ４０またはウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）のポリアデニル化シグナルである。
【0094】
本発明のさらに別の目的は、本発明の抗体誘導体を発現することが可能なプラスミドを有する非病原性のまたは弱毒化した細菌株を利用して、ベクターを送達することであり、そのような株としては例えば、以下に制限されないが、Escherichia spp.、Salmonella spp.、Shigella spp.、Mycobacterium spp.、およびListeria spp.などがある。
【0095】
採用される具体的なEscherichia株は、本発明にとっては決定的に重要ではない。本発明に採用することのできるEscherichia株の例としては、Escherichia coli株DH5a、HB 101、HS-4、4608-58、1184-68、53638-C-17、13-80、および6-81、腸毒素原性E. coli、腸病原性E. coli、および腸管出血性E. coliが挙げられる。前掲のSambrook, 1989；Sansonetti P, et al., Ann. Microbiol. 1982; 132A:351-355)；Evans D, et al., Infect. Immun. 1975; 12:656-667；Donnenberg S, et al., J. Infect. Dis. 1994; 169:831-838、およびMcKee M, O'Brien A, Infect. Immun. 1995; 63:2070-2074を参照されたい。
【0096】
採用される具体的なSalmonella株は、本発明にとっては決定的に重要ではない。本発明に採用することのできるSalmonella株の例としては、S. typhi（ＡＴＣＣ受入番号7251）、S. typhimurium（ＡＴＣＣ受入番号13311）、S. galinarum（ＡＴＣＣ受入番号9184）、S. enteriditis（ＡＴＣＣ受入番号4931）、S. typhimurium（ＡＴＣＣ受入番号6994）、S. typhi aroC, aroD二重変異株（Hone D, et al., Vaccine 1991; 9:810-816）およびS. typhimurium aroA変異株（Mastroeni D, et al., Micro. Pathol. 1992; 13:477-491）が挙げられる。
【0097】
採用される具体的なShigella株は、本発明にとっては決定的に重要ではない。本発明に採用することのできるShigella株の例としては、S. flexneri（ＡＴＣＣ受入番号29903）、S. flexneri CVD1203（ＡＴＣＣ受入番号55556）、S. flexneri 15D（Sizemore D, et al., Vaccine 1997; 15:804-807; Sizemore D, et al., Science 1995, 270:299-302）、S. sonnei （ＡＴＣＣ受入番号29930）およびS. dysenteriae（ＡＴＣＣ受入番号13313）が挙げられる。
【0098】
採用される具体的なMycobacterium株は、本発明にとっては決定的に重要ではない。本発明に採用することのできるMycobacterium株の例としては、M. tuberculosis CDC1551株（Griffith T, et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1995; 152:808-811）、M. tuberculosis Beijing株（van Soolingen D, et al., J. Clin. Microbiol. 1995; 33:3234-3238）、M. tuberculosis H37Rv株（ＡＴＣＣ受入番号25618）、M. tuberculosisパントテン酸要求性株（Sambandamurthy V, Nat. Med. 2002; 8:1171-1174、M. tuberculosis rpoV 変異株（Collins D, et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1995; 92: 8036、M. tuberculosisロイシン要求性株（Hondalus M, et al., Infect. Immun. 2000; 68(5):2888-2898）、ＢＣＧデンマーク株（ＡＴＣＣ受入番号35733）、ＢＣＧ日本株（ＡＴＣＣ受入番号35737）、ＢＣＧシカゴ株（ＡＴＣＣ受入番号27289）、ＢＣＧコペンハーゲン株（ＡＴＣＣ番号27290）、ＢＣＧパスツール株（ＡＴＣＣ受入番号35734）、ＢＣＧグラクソ株（ＡＴＣＣ受入番号35741）、ＢＣＧコノート株（ＡＴＣＣ受入番号35745）およびＢＣＧモントリオール（ＡＴＣＣ受入番号35746）が挙げられる。
【0099】
採用される具体的なListeria株は、本発明にとっては決定的に重要ではない。本発明に採用することのできるListeria monocytogenes株の例としては、以下に制限されないが、 L. monocytogenes株10403S（Stevens R, et al., J. Virol. 2004; 78:8210-8218）、L. ivanoviiおよびL. seeligeri 株（Haas A, et al., Biochim. Biophys. Acta. 1992; 1130:81-84）または変異体 L. monocytogenes 株、例えば（ｉ）actA plcB二重変異株（Peters C, et al., FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2003; 35:243-253およびAngelakopoulos H, et al., Infect. Immun. 2002; 70:3592-3601）もしくは（ｉｉ）アラニンラセマーゼ遺伝子およびＤ－アミノ酸アミノ転移酵素遺伝子についてのdal dat二重変異株（Thompson R, et al., Infect. Immun. 1998; 66:3552-3561）が挙げられる。
【0100】
細菌性媒体を使用するベクターを送達するための方法は、当技術分野に周知である。米国特許第６，５００，４１９号、米国特許第５，８７７，１５９号、および米国特許第５，８２４，５３８号；Shata M, et al., Mol. Med. Today 2000；6:66-71；Hone D, Shata M, J. Virol. 2001；75:9665-9670；Shata M, et al., Vaccine 2001；20:623-629; Rapp UおよびKaufmann S, Int. Immunol. 2004, 16:597-605；Dietrich G, et al., Curr. Opin. Mol. Ther. 2003；5:10-19 およびGentschev I, et al., J. Biotechnol. 2000；83:19-26を参照されたい。本発明の抗体誘導体を発現するために前述の細菌性媒体によって送達されるプラスミドのタイプは、決定的に重要ではない。
【0101】
追加の一実施形態では、本発明の核酸を送達するためのＡＡＶベクターの使用も提供される。
【0102】
本発明の医薬組成物は、当技術分野に公知の種々の方法によって投与することができる。当業者によって認識されることになるように、投与の経路または方式は、所望の結果に応じて変わるものとなる。本発明の活性剤は、徐放性製剤など、速やかな放出に対し剤を保護するようにする担体を用いて調製することができ、そのような製剤としては、埋め込み物、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化された送達システムが挙げられる。生分解性かつ生体適合性のポリマーを使用することができ、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などがある。そのような製剤を調製するための数多くの方法が、当技術分野に一般的に公知である。Robinson J, et al., Eds., “Sustained and controlled Release Drug Delivery Systems” (Marcel Dekker, Inc., New York, NY, USA, 1978)を参照されたい。
【0103】
本発明の活性剤をある種の投与経路によって投与するために、当該剤を素材で被覆するか、または当該剤を素材と共投与して、不活化を予防するか、またはｉｎ ｖｉｖｏでの適正な分布を確実に生じることが必要である場合がある。例えば、当該剤は、適切な担体（例えばリポソーム）または希釈剤中で対象に投与されてもよい。医薬的に許容可能な希釈剤としては、以下に限定されないが、生理食塩水および水性緩衝溶液が挙げられる。リポソームは、水中油中水型ＣＧＦエマルジョンならびに従来のリポソームを含む。Strejan G, et al., J. Neuroimmunol. 1984; 7:27-41を参照されたい。リポソームを製造する数多くの方法が、当技術分野に公知である。米国特許第４，５２２，８１１号、米国特許第５，３７４，５４８号、および米国特許第５，３９９，３３１号を参照されたい。リポソームは、特異的な細胞内または器官内に選択的に輸送され、そうして標的を定めた薬剤送達を増強する、１つまたは複数の部分を含んでいてもよい。例示的なターゲティング部分としては、葉酸またはビオチン、マンノシド、およびサーファクタントタンパク質Ａ受容体が挙げられる。本発明の一実施形態では、本発明の活性剤は、リポソームに製剤化され、さらに好適な実施形態では、リポソームは、ターゲティング部分を含む。最も好適な実施形態では、リポソーム中の活性剤は、ボーラス注射によって送達される。
【0104】
医薬的に許容可能な担体は、滅菌された水溶液または分散物、および滅菌された注射可能な溶液または分散物の即時調製のための滅菌された粉末を含む。本発明の医薬組成物の調製におけるそのような媒体の使用は、それらの使用が本発明の活性剤と両立しないことがない限り、本明細書では想定される。また、補足の活性化合物を医薬組成物内に組み込むことができる。
【0105】
医薬組成物は、典型的には、製造および保管の条件下で滅菌状態にあり安定である。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または活性剤の濃度に適した他の規則正しい構造として、製剤化することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）、または適したそれらの混合物を含有する、溶媒または分散媒とすることができる。適正な流動性は、例えば、レシチンなどの被覆を使用することによって、分散物の場合には必要な粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤を使用することによって、維持することができる。数多くの場合で、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール（例えばマンニトール、ソルビトール）や塩化ナトリウムなどを、組成物に含むことが好ましいことになる。注射可能な組成物の吸収の延長は、吸収を遅延させる化合物（例えばモノステアリン酸塩、ゼラチン）を組成物に含むことによってもたらすことができる。
【0106】
滅菌された注射可能な溶液は、必要量の本発明の活性剤を、必要に応じて、上記に列挙された成分の１つまたは組合せを含む適切な溶媒中に組み込んだ後に、滅菌精密濾過を行うことよって、調製することができる。概して、分散物は、基本的な分散媒および上記の列挙にある他の必要な成分を含有する滅菌された媒体内に、活性剤を組み込むことによって、調製される。滅菌された注射可能な溶液の調製に用いる滅菌された粉末の場合、好適な調製の方法は、活性成分と任意の追加の所望の成分とを足し合わせた粉末を、その予め滅菌濾過された溶液から産生する、真空乾燥および凍結乾燥［すなわち凍結乾燥（lyophilization）］である。
【0107】
投薬レジメンは、最適な所望の応答（例えば治療応答）をもたらすように調整される。例えば、ただ１つのボーラスが投与されてもよいし、複数の分割用量が時間をかけて投与されてもよいし、または治療状況の緊急性の示すように用量が比例的に低減または増加されてもよい。例えば、本発明の抗体誘導体は、皮下注射によって週に１回もしくは２回でも、皮下注射によって月に１回もしくは２回でも、投与されてよい。
【0108】
投与の容易さと均一な投薬のために、非経口の組成物を単位剤形で製剤化することは、特に有利である。本明細書に使用する際の単位剤形とは、治療される対象に用いる単一の投薬量として適した、物理的に別個の単位を指す。すなわち、各単位は、必要な医薬担体を伴って、所望の治療効果を生み出すように計算された所定の分量の活性剤を含有する。本発明の単位剤形についての明細は、活性剤の特有の特徴および達成される具体的な治療効果によって、ならびにそれらに直接的に依存して、規定される。
【0109】
医薬的に許容可能な抗酸化剤の例としては、以下に限定されないが、水溶性の抗酸化剤（例えばアスコルビン酸、システイン塩酸塩、硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム）、油溶性の抗酸化剤（例えばパルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ－トコフェロール）、および金属キレート剤［例えばクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸］が挙げられる。本発明の医薬組成物の製剤としては、経口、鼻，局所（例えば頬側および舌下）、直腸、膣、または非経口の投与に適したものが挙げられる。製剤は、単位剤形で便利よく提供されてもよく、当技術分野に公知の任意の方法によって調製されてもよい。担体素材と組み合わせて単一の剤形を生産することのできる活性剤の量は、治療中の対象および具体的な投与の方式に応じて変わることになる。担体素材と組み合わせて単一の剤形を生産することのできる活性剤の量は、概して、治療効果を生み出す組成物の量となる。概して、この量は、活性剤の約０．００１％から約９０％まで、好ましくは約０．００５％から約７０％まで、最も好ましくは約０．０１％から約３０％までとなる。
【0110】
また、膣投与に適した本発明の製剤としては、適切となることが当技術分野に公知であるような担体を含有する、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム、またはスプレー製剤が挙げられる。本発明の組成物の局所または経皮の投与に用いる剤形としては、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ、および吸入剤が挙げられる。本発明の活性剤は、滅菌された条件下で、医薬的に許容可能な担体、および必要であることのある任意の保存剤、緩衝液、または噴射剤と、混合されてもよい。
【0111】
本発明の医薬組成物は、保存剤、潤滑剤、乳化剤や分散剤などのアジュバントを含有することもある。微生物の存在の予防は、滅菌手順によって、ならびに各種抗細菌剤および抗真菌剤（例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール ソルビン酸）を含むことによっての両方で、確実になる場合がある。また、等張剤（例えば糖、塩化ナトリウム）を組成物内に含むことが望ましい場合もある。
【0112】
本発明の医薬組成物中の活性剤の実際の投薬レベルは、対象で所望の治療応答を達成するように変えられることがある。選択される投薬レベルは、種々の薬物動態学的な要因に依存するものとなり、そのようなものとしては、採用される本発明の具体的な剤の活性、その量、投与の経路、投与の時間、採用される具体的な活性剤の排出または発現の速さ、治療の持続期間、採用される具体的な医薬組成物と組み合わせて使用される他の薬剤、化合物、または素材、治療中の対象の年齢、性別、体重、状態、全体的な健康状態、および過去の医療歴、ならびに医療分野に公知の他の同様の要因が挙げられる。当技術分野の通常の技能を有した医師または獣医師は、必要な活性剤の治療有効量を容易に決定し規定することができる。例えば、医師または獣医師は、所望の治療効果を達成するために必要とされるよりも低いレベルで、医薬組成物中に採用された本発明の活性剤の用量投与を開始し、所望の効果が達成されるまで徐々に投薬を増加することができよう。概して、本発明の組成物の適切な１日用量は、治療効果を生み出すのに有効な最も低い用量である、活性剤の量となる。そのような有効な用量は、概して、上に記載された要因に依存することになる。投与は非経口であり、さらに好ましくは静脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下であることが好適である。所望に応じて、医薬組成物の有効な１日用量は、２個、３個、４個、５個、６個またはそれ以上の部分用量として投与されてもよく、その部分用量は、その日にわたって適切な間隔で別々に適用され、任意選択で、単位剤形である。本発明の活性剤を単独で投与することが可能である一方で、前述の剤を医薬組成物として投与することが好ましい。
【0113】
本発明の医薬組成物は、当技術分野に公知の医療デバイスを用いて投与することができる。例えば、好適な実施形態では、本発明の医薬組成物は、無針皮下注射デバイスを用いて投与することができる。米国特許第５，３９９，１６３号、米国特許第５，３８３，８５１号、米国特許第５，３１２，３３５号、米国特許第５，０６４，４１３号、米国特許第４，９４１，８８０号、米国特許第４，７９０，８２４号、または米国特許第４，５９６，５５６号を参照されたい。本発明で有用な周知の埋め込み物およびモジュールの例としては、以下に限定されないが、様々な速さで医薬を分注するための注入ポンプ［例えば米国特許第４，４４７，２３３号（非埋め込み式、制御速度）、米国特許第４，４４７，２２４号（埋め込み式、可変速度）、米国特許第４，４８７，６０３号（埋め込み式、制御速度）］、皮膚を通して医薬を投与するためのデバイス（例えば米国特許第４，４８６，１９４号）、および浸透性薬物送達システム（例えば米国特許第４，４３９，１９６号および米国特許第４，４７５，１９６号）が挙げられる。数多くの他のそのような埋め込み物、送達システム、およびモジュールが、当業者に公知である。
【0114】
本発明の医薬組成物は、滅菌され、シリンジによって組成物を送達可能な程度に流動性を有するものでなければならない。水に加えて、担体は、等張の緩衝生理食塩水溶液、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）、および適したそれらの混合物とすることができる。適正な流動性は、例えば、レシチンなどの被覆を使用することによって、分散物の場合は必要な粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤を使用することによって、維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール（例えばマンニトール、ソルビトール）および塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい。注射可能な組成物の長期の吸収は、吸収を遅延させる剤（例えばモノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン）を組成物中に含むことによってもたらすことができる。
５．治療および予防の方法
５．治療および予防の方法
【0115】
別の態様では、本発明は、対象でＨＩＶ感染またはＡＩＤＳを治療することまたは予防することのどちらかのための方法に向けられ、この方法は、本発明の抗体誘導体、核酸、ベクター、宿主細胞、もしくは医薬組成物、またはそれらの混合物のうち少なくとも１つを前述の対象に投与することを含む。ＨＩＶ感染またはＡＩＤＳの症状との関連での本発明の活性剤および医薬組成物の有益な治療的または予防的な効果としては、例えば、ＨＩＶに曝露された対象の初期感染を予防または遅延させること、ＨＩＶに感染した対象でウイルス負担を低減すること、ＨＩＶ感染の無症候性相を延長すること、抗レトロウイルス療法（ＡＴ）を介してウイルスレベルが低下しているＨＩＶ感染対象で、ウイルス負荷を低く維持すること、薬剤未処理の対象でおよびＡＴで治療された対象で、ＨＩＶ－１特異的におよび非特異的にのどちらでも、ＣＤ４ Ｔ細胞のレベルを増加させるかまたはＣＤ４ Ｔ細胞の減少を小さくすること、ＡＩＤＳに罹患した対象で全体の健康または生活の質を増加させること、およびＡＩＤＳに罹患した対象の予想寿命を延長することが挙げられる。医師または獣医師は、治療前の対象の状態と、または非治療対象の予想される状態と、治療の効果とを比較して、ＡＩＤＳを阻害する際にこの治療が有効であるか否かを決定することができる。好適な実施形態では、本発明の活性剤および医薬組成物は、ＨＩＶ感染またはＡＩＤＳの予防のために使用される。別の好適な実施形態では、本発明の活性剤および医薬組成物は、ＨＩＶ感染またはＡＩＤＳの治療のために使用される。
【0116】
本発明の活性剤および医薬組成物は、ＨＩＶ感染またはＡＩＤＳの治療に有用である場合がある。ＨＩＶまたはそれらの等価型に罹っている可能性のある全ての対象をこの方式で治療することができる（例えばチンパンジー、マカク、ヒヒ、またはヒト）一方で、本発明の活性剤および医薬組成物は、具体的にはヒトにおける治療での使用に向けられる。多くの場合、１回を超える投与が、所望の治療効果をもたらすのに必要であることがある。ここで、正確なプロトコール（投薬量および頻度）は、標準的な臨床手順によって確立することができる。
【0117】
本発明は、ＨＩＶ感染またはＡＩＤＳに随伴する症状を低減または排除することにさらに関する。これらには、ＨＩＶ感染の軽微な症候性相に随伴する症状が含まれ、そのようなものとしては、例えば、帯状疱疹、皮疹および爪感染、口のひりつく痛み、再発性の鼻咽喉感染、および体重減少が挙げられる。さらに、ＨＩＶ感染の主要な症候性相に随伴するさらに別の症状としては、例として、口腔および膣の鵞口瘡（カンジダ）、持続性の下痢、体重減少、持続性の咳および再賦活化された結核、または再発性のヘルペス感染、例えば口唇ヘルペス（単純ヘルペス）などが挙げられる。本発明に従って治療することのできる末期のＡＩＤＳの他の症状としては、例として、下痢、吐き気および嘔吐、鵞口瘡および口のひりつく痛み、持続性かつ再発性の膣感染および子宮頚がん、持続性の全身性リンパ節腫脹（ＰＧＬ）、重度の皮膚感染、いぼおよび白癬、呼吸器感染、肺炎、特にPneumocystis carinii肺炎（ＰＣＰ）、帯状ヘルペス（または帯状疱疹）、神経系の問題、例えば痛み、手足の痺れまたは「ピリピリした感覚（pins and needles）」、神経異常、カポジ肉腫、リンパ腫、結核または他の同様の日和見感染が挙げられる。
【0118】
別の好適な実施形態では、本発明の活性剤または医薬組成物は、少なくとも１つの治療剤と組合せてＨＩＶ感染対象またはＨＩＶに曝露された対象に投与される。好ましくは、その治療剤は、ＨＩＶまたはＡＩＤＳの予防または治療のために一般に指示される。適した治療剤としては、以下に限定されないが、現在の抗レトロウイルス療法（ＡＴ）および高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）のプロトコールの一部を形成する薬剤、例えば非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（例えばエファビレンツ、ネビラピン、デラビルジン、エトラビリン、リルピビリン）、ヌクレオシド類似体逆転写酵素阻害剤（例えばジドブジン、テノホビル、ラミブジン、エムトリシタビン）、およびプロテアーゼ阻害剤（例えばサキナビル、リトナビル、インジナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル）などが挙げられ、これらは以降、独立してまたは併せて「ＨＩＶ抗レトロウイルス」と称する。この実施形態の１バージョンでは、少なくとも１つの本発明の活性剤または医薬組成物と、少なくとも１つのＨＩＶ抗レトロウイルスとが、共に対象に同時に投与される。別のバージョンでは、少なくとも１つの本発明の活性剤または医薬組成物は、任意のＨＩＶ抗レトロウイルスが対象に適用される前に投与される。さらに別のバージョンでは、少なくとも１つの本発明の活性剤または医薬組成物は、ＨＩＶ抗レトロウイルスが対象に適用されるようになった後に、例えば、ＡＴまたはＨＡＡＲＴのプロトコールを中断した後などに、投与される。
【0119】
さらに、本発明の抗体誘導体は、潜在的に感染している細胞の表面にＨＩＶ ｇｐ１２０の発現を誘導しうる治療剤と共に投与することもでき、そのようにして、それらの細胞をＮＫ細胞によって速やかに除去することが可能になる。Siliciano J, et al, J Allergy Clin Immunol. 2014; 134(1):12-19を参照されたい。
６．中和および検出の方法
６．中和および検出の方法
【0120】
追加の一態様では、本発明は、ウイルスを少なくとも１つの本発明の抗体誘導体に接触させることを含む、ＨＩＶを不活化する方法に関する。好ましくは、この方法は、ＨＩＶを含有するかまたはＨＩＶを含有する疑いがある試料について実施される。この方法は、当技術分野に記載されるような、抗体誘導体がＨＩＶに連係し易い条件下で実行されてもよい。Lu L, et al., Retrovirology 2012; 9(104), 1-14を参照されたい。
【0121】
さらに別の一態様では、本発明は、試料中のヒトＣＤ４受容体のＤ１ドメインおよびＤ２ドメインに付加する分子またはその断片（例えばＨＩＶ、ｇｐ１２０）を検出する方法に関し、この方法は、（ａ）試料を本発明の抗体誘導体に接触させること、および（ｂ）抗体誘導体が試料中の分子に特異的に結合するか否かを決定することを含む。試料は、生体試料としてもよく、そのようなものとしては、以下に限定されないが、非感染の、感染の、または強力に感染している対象（例えば断続的または間欠的なＨＩＶ曝露を持続している対象）由来の血液、血清、尿、組織、または他の生体材料が挙げられる。また、試料は、非生体としてもよい（例えば水、飲料から得られる）。好ましくは、分子はＨＩＶであり、さらに好ましくはＨＩＶのｇｐ１２０ウイルス外被タンパク質である。
【0122】
この態様の好適な一実施形態では、本発明は、（ａ）試料を本発明の抗体誘導体に接触させること、および（ｂ）抗体誘導体が試料中のＨＩＶ分子に特異的に結合するか否かを決定することを含む、試料中のＨＩＶを検出する方法に関する。好ましくは、試料は、血漿試料または血清試料である。
【0123】
試料は、まず、検出の方法にさらに適したものとするために操作されることがある。好適な実施形態では、試料と抗体誘導体との間の接触が延長される（すなわち、試料および抗体誘導体の安定性に適した条件下でのインキュベーション）。接触工程の間の条件は、定型の方式で当業者が決定することができる。接触工程で使用することのできる適切な緩衝液としては、実施されるアッセイに干渉しない生理的緩衝液が挙げられる。例えば、Ｔｒｉｓまたはトリエタノールアミン（ＴＥＡ）緩衝液を採用することができる。緩衝液（および結果として得られる、その緩衝溶液を含む溶解試薬）のｐＨは、約２．０から約１０．０まで、任意選択で約４．０から約９．０まで、好ましくは約７．０から約８．５まで、およびいっそうさらに好ましくは約７．５から約８．０までに及ぶか、または約７．０、約７．５、約８．０、もしくは約８．５とすることができる。例示的な「接触」条件は、１５分間から４時間（例えば４℃、３７℃または室温で１時間）のインキュベーションを含むことがある。しかし、これらは、例えば相互作用の結合相手の特質に従って、適切であるように変わることがある。試料は、任意選択で、緩やかな振盪、混合、または回転に供してもよい。さらに、他の適切な試薬、例えば非特異的な結合を低減するためのブロッキング剤などを添加してもよい。例えば、１～４％ＢＳＡまたは他の適したブロッキング剤（例えばミルク）を使用してもよい。接触条件は、検出方法の目標に応じて変化および適応させることができる。例として、インキュベーション温度が、例えば室温または３７℃である場合、このことによって、これらの条件下で安定な（例えば、ヒトの身体に見られる条件下で安定な）バインダーを特定する可能性が増すことがある。
【0124】
好ましくは、本発明の抗体誘導体は、抗体誘導体と試料中に存在する分子またはその断片との間で複合体の形成を可能にする条件下で、試料に接触させられる。複合体の形成、例えば、試料中のＨＩＶの存在を標示するその形成は、次いで、適した手段によって検出および測定される。これらの検出および測定の手段は、結合相手の特質に依存し、そのようなものとしては、以下に限定されないが、同種結合アッセイおよび異種結合アッセイ、例えば、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光、免疫組織化学、フローサイトメトリー（例えばＦＡＣＳ）、ＢＩＡＣＯＲＥ、およびウェスタンブロット分析などが挙げられる。好適なアッセイ手法は、特に対象の血清および血液および血液由来産物の大規模分析に用いるものは、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、およびウェスタンブロット手法である。
【0125】
好適な実施形態では、測定は、フローサイトメトリー（例えばＦＡＣＳ）によって実施される。本明細書に使用される際には、用語「フローサイトメトリー」とは、素材を標識し（例えば、標識化抗体を素材に結合させることによって）、素材を含有する流体の流れが光ビームを通り抜けるようにして、試料から発された光を一連のフィルターおよび鏡によって成分波長に分離し、その光を検出することによって、試料中の素材の割合が決定されるアッセイを指す。フローサイトメトリーによって、相対的なサイズ複雑度や内在的な蛍光など、単細胞のいくつかの特長の高感度の検出および迅速な定量、ならびに蛍光色素で標識することのできる任意の細胞性化合物の定量分析が可能になる。Melamed M, et al., “Flow Cytometry and Cell Sorting”, 2nd Ed. (Wiley-Liss, New York, NY, USA, 1990)を参照されたい。フローサイトメトリーの主な利点の１つは、多数の粒子上または細胞上の被検物を速やかに定量することである。概して、検出マーカーとして使用するために選択される蛍光色素は、レーザーによって使用される波長を有する光によって励起された際に蛍光を発する能力に基づいて選択される。蛍光色素がレーザービームによって励起されると、光を発し、次いで、光はフローサイトメーターの光電子増倍管によって評価される。この手法は、１分から２分以内に１０，０００細胞個／粒子を分析することが可能である。フローサイトメーターは、各種蛍光色素からエミッタンスを検出するためのフィルターを有し、この蛍光色素は、異なる波長で蛍光を発することから、４つ以上の異なる蛍光色素を検出マーカーとして使用することが可能になる。このことは、現在は少なくとも４つの異なる分子を同時に検出し得ることを意味する。試料を分析するためのこれらの方法および装置は、商業的に入手可能であり、当技術分野に周知である（例えばFACSCaliburフローサイトメーター；BD Biosciences Corp.、フランクリンレイクス、ニュージャージー州、米国）。
【0126】
好適な実施形態では、前述の測定は試料の分析を含み、好ましくは、その分析は抗体誘導体、好ましくは前述の抗体誘導体のＦｃ領域に、結合可能なレポーターを使用する、フローサイトメトリーによるものである。好ましくは、レポーターは、検出可能な部分を含み、さらに好ましくは、それは、検出部分に連係されるＦｃ特異的な二次抗体である。
【0127】
有用な検出部分としては、蛍光団が挙げられる。「蛍光団」（または「蛍光色素」もしくは「発色団」）によって、光励起があると光を再び発することができる蛍光化合物が理解される。 使用できる蛍光団としては、生物学的蛍光団（例えばタンパク質）および化学蛍光団が挙げられる。例示的な生物学的蛍光団は、T-サファイア、Cerulean、mCFPm、CyPet、EGFP、PA-EGFP、Emerald、EYFP、Venus、mCitrine、mKO、mOrange、DSRed、JRed、mStrawberry、mCherry、PA-mCherry、mRuby、Tomato、mPlum、mKate、mKatushka、Kaede、Halotag、およびsuperecliptic fluorineを含む。例示的な化学蛍光団は、 Alexafluor、Rhodamine、BODIPY、テトラメチルローダミン、Cyaninダイ、Fluorescein、Quantumドット、IRダイ、FMダイ、ATTOダイを含む。二次抗体は、検出するのに有用な酵素で標識化することもでき、そのようなものとしては、例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、またはグルコースオキシダーゼなどがある。抗体が検出酵素で標識化されている場合は、酵素が使用する追加の試薬を添加して、識別可能な反応産物を触媒することによって、それを検出することができる。例えば、剤セイヨウワサビペルオキシダーゼがある際には、過酸化水素およびジアミノベンジジンを添加することによって、可視的に検出可能な着色反応産物を生じる。また、抗体を、ビオチンで標識化し、アビジンまたはストレプトアビジンの結合を間接的に測定することを通じて検出してもよい。アビジン自体は酵素または蛍光標識で標識化できることに留意するべきである。
【0128】
好ましくは、採用されるＦｃ二次抗体は、一次抗体が由来とする種（例えばヒト）に特異的である。一実施形態では、前述のＦｃ特異的な二次抗体は、ＩｇＡ（例えばＩｇＡ１、ＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、およびＩｇＭからなる群から選択される。好ましくは、二次抗体はＩｇＧであり、さらに好ましくはＩｇＧ１である。前述のＦｃ特異的な二次抗体は、任意の脊椎動物抗体、好ましくは任意の哺乳類抗体、およびさらに好ましくは任意の非ヒト抗体（例えばウサギ、マウス、ラット、ヤギ、ウマ、ヒツジ、またはロバの抗体）とすることができる。
【0129】
前述のアッセイで試薬として使用するために、本発明の抗体誘導体が、マイクロタイターウェルの内部表面に便利よく結合されることがある。本発明の抗体誘導体は、マイクロタイターウェルに直接的に結合されることがある。しかし、抗体誘導体のウェルとの最大の結合は、抗体誘導体を添加する前にウェルをポリリジンで予め処理することによって、達成される可能性がある。さらに、本発明の抗体誘導体は、当技術分野に公知の手段によって、共有結合によりウェルに付加されていてもよい。概して、本発明の抗体誘導体は、０．０１から１００μｇ／ｍＬの間で被覆に使用されるが、そもそもそれよりも高いならびに低い量も使用されることがある。次いで、試料は、本発明の抗体誘導体で被覆されたウェルに添加される。
７．キット
７．キット
【0130】
さらに別の一態様では、本発明は、本発明の抗体誘導体、核酸、ベクター、宿主細胞、医薬組成物、もしくは組合せ、またはそれらの混合物のうち少なくとも１つを含むキットを指す。本発明のキットの構成成分は、任意選択で、適した容器中に梱包されて、ＨＩＶもしくはＡＩＤＳまたはそれらに関連する状態を検出、不活化、診断、予防、または治療するために標識化されることがある。キットの構成成分は、水性の、好ましくは滅菌された溶液として、または再構成のための凍結乾燥の、好ましくは滅菌された製剤として、単位または複数回用量の容器で保管されてもよい。容器は、種々の素材、例えばガラスやプラスチックなどから形成されてもよく、滅菌されたアクセスポートを有していてもよい（例えば、コンテナは、皮下注入の注射針による貫通が可能なストッパーを有する、静脈内の溶液バッグまたはバイアルとしてもよい）。キットは、医薬的に許容可能な担体を含むさらに多くの容器をさらに含んでいてもよい。それらは、商業用またはユーザの観点から望ましい、他の素材をさらに含むことがあり、そのようなものとしては、以下に限定されないが、緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、適切な宿主細胞のうち１つもしくは複数に用いる培養培地、または他の活性剤が挙げられる。キットは、診断製品および治療製品の商業用パッケージに通例含まれる指示書を含むことができ、その指示書は、情報、例えば、適応症、使用量、投薬量、製造、投与、そのような診断製品および治療製品の使用に関する禁忌または注意についてを含む。
【0131】
本明細書に言及される全ての刊行物は、参照によりその全体が組み込まれる。ここまで本発明が概ね記載されてきたが、同じことは、以下の実施例を参照することを通じてさらに容易に理解されよう。この実施例は、図説によって提供され、指定のない限り、本発明を限定することを意図するものではない。
基本手順
１．ＣＤ４－ｈｕＩｇＧ誘導体の構築
基本手順
１．ＣＤ４－ｈｕＩｇＧ誘導体の構築
【0132】
ヒトＣＤ４分子の２つの細胞外ドメイン（Ｄ１およびＤ２）を、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含むヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に接合して、ＣＤ４－ＩｇＧ１分子を産生した。ＣＤ４－ＩｇＧ１スキャフォールドに基づき、以下の特徴を有した抗体誘導体を設計した。
【0133】
（ａ）ＡＤＣＣ媒介性応答を増加させるためのＦｃ鎖の位置Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅでの変異。Bournazos S, et al., Cell 2014; 158:1243-1253を参照されたい。
（ｂ）Ｆｃ鎖のＣ末端でのヒトＣＣＲ５のＮ末端細胞外配列（ＭＤＹＱＶＳＳＰＩＹＤＩＮＹＹＴＳＥＰＣＱＫＩＮＶＫＱＩＡ）（配列番号６）の添加。
（ｃ）Ｆｃ鎖のＣ末端でのＴ－２０配列（ＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＫＫＮＥＱＥＬＬＥＬＤＫＡＳＬＷＮＷＦ）（配列番号７）の添加。
（ｂ）Ｆｃ鎖のＣ末端でのヒトＣＣＲ５のＮ末端細胞外配列（ＭＤＹＱＶＳＳＰＩＹＤＩＮＹＹＴＳＥＰＣＱＫＩＮＶＫＱＩＡ）（配列番号６）の添加。
（ｃ）Ｆｃ鎖のＣ末端でのＴ－２０配列（ＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＫＫＮＥＱＥＬＬＥＬＤＫＡＳＬＷＮＷＦ）（配列番号７）の添加。
【0134】
（ｄ）数可変の可動性連結（ＧＧＧＧＳ）（配列番号５）を伴うＣＣＲ５配列（ＭＤＹＱＶＳＳＰＩＹＤＩＮＹＹＴＳＥＰＣＱＫＩＮＶＫＱＩＡ）（配列番号６）およびＴ－２０配列（ＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＫＫＮＥＱＥＬＬＥＬＤＫＡＳＬＷＮＷＦ）（配列番号７）の連続的な添加。
【0135】
本発明の抗体誘導体を発現する全てのポリヌクレオチドは、GeneArtプロセスならびにpcDNA3.1発現プラスミドおよびpcDNA3.4発現プラスミドを使用して合成された。
【0136】
プラスミドを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８で再構成して０．５μｇ／μＬとした。１μＬのプラスミドを用いて、製造業者の指示書に従い、OneShot TOP10ケミカルコンピテントE.coli（Life Technologies Corp.、カールスバッド、カリフォルニア州、米国）を形質転換した。簡潔に述べれば、１μＬのプラスミドを１バイアルの細菌に添加し、氷上で１５分間インキュベーションした。その後、そのチューブを４２℃で３０秒間インキュベーションし、直ちに氷上に２分間放置した。細菌を２５０μＬのＳＯＣ培地（Life Technologies Corp.、カールスバッド、カリフォルニア州、米国）に懸濁し、Innova 4000インキュベーターシェーカー（New Brunswick Scientific Co., Inc.、エンフィールド、コネチカット州、米国）中、３７℃かつ２２５ｒｐｍで、１時間インキュベーションした。その後、１／１００希釈の細胞培養物１００μＬをアンピシリン選択（１００μｇ／ｍＬ）ＬＢ－寒天プレート上に広げた。プレートをHeraeusインキュベーター（Thermo Fisher Scientific、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）内で３７℃で１６～２４時間からインキュベーションした。１コロニーを単離し、５ｍＬのアンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）選択ＬＢ培地内に播種し、Innova 4000インキュベーターシェーカー（New Brunswick Scientific Co., Inc.、エンフィールド、コネチカット州、米国）中、３７℃かつ２２５ｒｐｍで、８時間インキュベーションした。その後、５００ｍＬのアンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）選択ＬＢ培地に、５００μＬの前出に記載の培養物を播種し、既に記載されたように、３７℃かつ２２５ｒｐｍで１６時間インキュベーションした。Eppendorf遠心機5810R（Thermo Fisher Scientific、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）で室温、３０００×ｇで４５分間遠心分離することによって、細菌を回収し、Qiagen Plasmid Maxiキット（Qiagen NV、フェンロー、オランダ）を使用して、製造業者の指示書に従ってプラスミドを単離した。ナノドロップ1000機器（Thermo Fisher Scientific、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）を使用して、分光測光によって精製プラスミドを定量した。
２．タンパク質の生産、定量、および精製
２．タンパク質の生産、定量、および精製
【0137】
Calphosトランスフェクションキット［Clontech（登録商標）Takara Bio Inc.、大津、日本］を使用して、製造業者の指示書に従い、種々の本発明の抗体誘導体をコードするプラスミドを用いて、ＨＥＫ－２９３細胞をトランスフェクションした。４８時間後、上清を収集し、０．４５μｍフィルター（EMD Millipore, Merck KGaA、ダルムシュタット、ドイツ）を通す濾過によって清澄化し、使用するまで－２０℃で保管した。
【0138】
抗体誘導体をＥＬＩＳＡによって定量した。簡潔に述べれば、Maxisorp 96-Fプレート（Nunc、Thermo Fisher Scientific、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）を、ＰＢＳ中１μｇ／ｍＬのＦ（ａｂ）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）抗体（Jackson ImmunoResearch Labs, Inc.、ウェストグローブ、ペンシルバニア州、米国）１００μＬ／ウェルと共に、４℃で一晩インキュベーションした。ＰＢＳ／１０％ＦＢＳ／０．０５％ｔｗｅｅｎ２０を用いてブロッキングして洗浄した後、培養上清（組換えタンパク質を含有）のブロッキング緩衝液中希釈系列をプレートに添加し（１００μＬ／ウェル）、４℃で一晩インキュベーションした。標品として、精製ｅＣＤ４－Ｉｇタンパク質の０．１μｇ／ｍＬ、０．０５μｇ／ｍＬ、および０．０２５μｇ／ｍＬの希釈物を使用した。プレートを再度洗浄し、ブロッキング緩衝液中１／１００００希釈の二次抗体ＨＲＰ－Ｆ（ａｂ）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）（Jackson ImmunoResearch Labs, Inc.、ウェストグローブ、ペンシルバニア州、米国）を添加し（１００μＬ／ウェル）、室温で１時間インキュベーションした。プレートを洗浄し、ＯＰＤ基質を用いて結合抗体を検出し、４Ｎ Ｈ２ＳＯ４を添加して反応を停止させた。産物をＥＬＩＳＡプレートリーダー中４９２ｎｍで測定した。
【0139】
プロテインＡセファロース（GE Healthcare, Inc.、スタムフォード、コネチカット州、米国）カラムを使用して、タンパク質を精製した。上記に示したように、血清不含培地を用いた一過的トランスフェクションによって、タンパク質を生産した。上清を回収し、３０００×ｇで１０分間遠心分離し、０．４５μｍで濾過して細胞の残骸を除去した。予め洗浄されたプロテインＡセファロースビーズに、清澄化された上清を添加して、端々まで回転させながら４℃で一晩インキュベーションした。プロテインＡをＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）で洗浄し、結合タンパク質を４Ｍ ＭｇＣｌ２で溶出した。代替的に、CaptureSelect FcXL Affinity Matrix（Thermo Fisher Scientific、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）カラムを使用して、タンパク質を精製し、グリシン緩衝液ｐＨ＝３．５で溶出した。精製タンパク質をＰＢＳに対し透析し、限外濾過によって濃縮し、ＥＬＩＳＡまたは分光測光によって定量して、使用するまで－８０℃で保管した。
３．中和アッセイ
３．中和アッセイ
【0140】
ＨＩＶ－１分離株ＮＬ４－３、ＢａＬ、ＡＣ１０、ＳＶＢＰ６、ＳＶＢＰ８、ＳＶＢＰ１１、ＳＶＢＰ１２、ＳＶＢＰ１４、ＳＶＢＰ１５、ＳＶＢＰ１７、ＳＶＢＰ１８、およびＳＶＢＰ１９は、Ｅｎｖ発現プラスミドおよびpSG3ベクターを使用して、シュードウイルスとして生成された。Sanchez-Palomino S, et al., Vaccine 2011; 29:5250-5259を参照されたい。標準的なＴＺＭ－ｂｌベースのアッセイによって、抗体誘導体による細胞不含のウイルスの中和を試験した。前掲Li, 2005を参照されたい。簡潔に述べれば、９６ウェル培養プレート中で、１００μＬの予め希釈された抗体誘導体を、５０μＬのシュードウイルスのストックと共に、２００ＴＣＩＤ５０（組織培養に感染性がある用量）を用いて、３７℃で１時間プレインキュベーションした。次いで、ウェル当たり１０，０００個のＴＺＭ－ｂｌルシフェラーゼ－レポーター標的細胞を含有する１００μＬを添加した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で４８時間、培養した。抗体誘導体の希釈系列を１０００から０．１ｎｇ／ｍＬまで試験した。ＴＺＭ－ｂｌレポーター細胞をデキストラン（Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国）で処理して、感染力を増強させた。ルシフェラーゼ基質Britelite Plus（PerkinElmer, Inc.、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）を読み取りに使用した。可変のＨｉｌｌスロープを用いて１部位阻害（one-site inhibition）カーブにフィットされた正規化値を使用して、中和データの非線形フィットを計算した。全ての統計分析および非線形フィッティングは、GraphPad Prism v5.0ソフトウェアを使用して実施した。
４．ＡＤＣＣアッセイ
４．ＡＤＣＣアッセイ
【0141】
様々な抗体誘導体がＮＫ細胞によるＨＩＶ感染細胞のＮＫ媒介性の破壊を活性化させる能力を評価するために、Alpert M, et al., J. Virol. 2012, 86:12039-12052に従って、ＡＤＣＣアッセイを実施した。簡潔に述べれば、ＮＫ細胞株ＫＨＹＧ－１ ＣＤ１６＋をエフェクター細胞源として採用し、ＣＥＭ．ＮＫＲ．ＣＣＲ５＋Ｌｕｃ細胞株を標的細胞源として利用した。アッセイの５日前に、高い感染性を有するＢａＬ分離株ストックを用いて標的細胞を感染させ、Ｒ１０培地（１０％ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ）中３７℃で培養した。アッセイをセットアップするために、Ｕ底９６ウェルプレート中総体積２００μＬで、１０Ｕ／ｍＬの組換えＩＬ－２を補充したＲ１０培地中、異なる濃度の抗体誘導体または抗体ベースの分子の存在下で、１０４個の標的細胞（それらの＞４０％は生産的に感染）を１０５個のエフェクター細胞と共に培養した。３７℃で８時間インキュベーションした後、細胞を再懸濁して、１５０μＬの細胞懸濁液を５０μＬのルシフェラーゼ基質Britelite Plus(PerkinElmer, Inc.、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）と混合した。ルシフェラーゼ単位を読み取りのために使用した。標的細胞はＨＩＶに感染するとルシフェラーゼを発現することから、ルシフェラーゼ活性の減少は、抗体媒介性およびＮＫ媒介性の殺細胞性の直接的な測定である。
実施例１
工学的に改変されたＣＤ４ ＩｇＧ融合タンパク質の設計
実施例１
工学的に改変されたＣＤ４ ＩｇＧ融合タンパク質の設計
【0142】
ｈｕＣＤ４－マウスＩｇＧ融合タンパク質を以前報告されたように調製した。この融合タンパク質は、抗ＣＤ４結合部位抗体を特定するためにこれまで使用されてきた。Carrillo J, et al., PLOS One 2015; 10(3):0120648；図１を参照されたい。しかし、ＣＤ４－ＩｇＧ１分子は、治療潜在性が限定的であることが知られていることから、その抗ウイルス活性およびＡＤＣＣ活性を増加させるために、いくつかの変更がＣＤ４－ＩｇＧ１タンパク質の配列に導入された。Jacobson J, et al., Antimicrob Agentｓ Chemother. 2004; 48(2):423-429を参照されたい。
【0143】
最初に、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域を、当技術分野で記載されるように、位置Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、およびＩ３３２Ｅで変異させ、ＡＤＣＣ媒介性応答を増加させた。前掲Bournazos, 2014を参照されたい。さらに進んだ改変は、ＨＩＶ Ｅｎｖとの相互作用を増加させることを目的とし、ＣＣＲ５のＮ末端細胞外領域（配列番号６）に対応する２９アミノ酸配列の添加、またはＦｃ鎖のＣ末端終端部でのＴ－２０（配列番号７）配列の添加を含んでいた。前掲Gardner, 2015を参照されたい。ｇｐ４１に結合すること、およびＨＩＶ進入の融合前の事象を遮断することが可能なペプチドの添加によって、抗ウイルス活性に相乗効果がもたらされる可能性があるものと推測された。そのため、ＣＣＲ５（配列番号６）配列とＴ－２０（配列番号７）配列の両方を含有する抗体誘導体を設計した。図１および図２を参照されたい。
【0144】
さらに、ＣＣＲ５配列およびＴ－２０配列がそのそれぞれの標的領域と同時に相互作用することができた場合に、相乗性が発生することになるものと推測された。それゆえ、補助受容体結合部位からｇｐ４１までに広がるリンカーを提案した。図３を参照されたい。
【0145】
また、比較の目的で、ｅＣＤ４－ＩｇＧ１融合タンパク質も既に記載されたように調製した（分子１）。現在は、ｅＣＤ４－ＩｇＧ１融合タンパク質が、当技術分野に公知の最も強力な抗ＨＩＶ工学改変抗体である。前掲Gardner, 2015を参照されたい。より良い比較の根拠を提供するために、分子１のＦｃ鎖を、本発明の抗体誘導体にあるようにさらに変異（すなわち位置Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、およびＩ３３２Ｅで）させて、ｅＣＤ４－ｍＩｇＧ１融合タンパク質（分子２）を産生した。
実施例２
第１世代の抗体誘導体の抗ウイルス活性
実施例２
第１世代の抗体誘導体の抗ウイルス活性
【0146】
３つの異なるウイルス：（ｉ）Ｘ４モノトロピック実験室分離株であるＨＩＶ－１株ＮＬ４－３、（ｉｉ）Ｒ５モノトロピック実験室分離株であるＨＩＶ－１株ＢａＬ、および（ｉｉｉ）中和するのが特に難しいｔｉｅｒ２型ウイルスであるＨＩＶ－１株ＡＣ１０分離株を使用して、本発明の抗体誘導体の抗ウイルス活性を評価するために、標準的な中和アッセイを実施した。さらに、周知のＨＩＶサブタイプＢウイルスのパネルを使用して、中和活性のさらに深い特性解析を実施した。前掲Li, 2005を参照されたい。
【0147】
簡潔に述べれば、９６ウェル培養プレート中で、予め希釈された１００μＬの血漿試料を、５０μＬのシュードウイルスのストックと共に、２００ＴＣＩＤ５０を用いて、３７℃で１時間プレインキュベーションした。次いで、ウェル当たり１０，０００個のＴＺＭ－ｂｌルシフェラーゼレポーター標的細胞を含有する１００μＬを添加した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で４８時間培養した。抗体誘導体の希釈系列を１０００から０．１ｎｇ／ｍＬまで試験した。ＴＺＭ－ｂｌレポーター細胞をデキストラン（Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国）で処理して、感染力を増強させた。ルシフェラーゼ基質Britelite Plus（PerkinElmer, Inc.、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）を読み取りに使用した。可変のＨｉｌｌスロープを用いて１部位阻害（one-site inhibition）カーブにフィットされた正規化値を使用して、中和データの非線形フィットを計算した。全ての統計分析および非線形フィッティングは、GraphPad Prism v5.0ソフトウェアを使用して実施した。
【0148】
供試した全ての分子が、ＮＬ４－３分離株およびＢａＬ分離株の感染力の遮断に有効であった。ＮＬ４－３の中和については、ＣＣＲ５を含有する分子４がＩＣ５０値７．１ｎｇ／ｍＬを示し、一方、Ｔ－２０を含有する分子３はさらに強力であり、ＩＣ５０値２．２ｎｇ／ｍＬを示した。参照分子ｅＣＤ４－ＩｇＧ（分子１、ＩＣ５０値：１．２ｎｇ／ｍＬ）およびそのＦｃ変異型誘導体である分子２（ＩＣ５０＝１．１ｎｇ／ｍＬ）では、より低い値が観察された。最も強力な化合物は、ＣＣＲ５配列およびＴ－２０配列を含有する抗体誘導体（分子５）であり、それは示したおよびＩＣ５０値０．０６ｎｇ／ｍＬ。このデータは、ＣＣＲ５配列およびＴ－２０配列と可動性のリンカーとの組合せが、抗ウイルス効能の向上をもたらすことを示唆した。図４（ａ）；表１を参照されたい。ＣＤ４配列のみを含有する分子０および分子６では、より低い中和活性が観察された。
【0149】
同様の結果が、ＢａＬ分離株を用いて観察された。ＢａＬ中和アッセイにおける抗ウイルス活性の序列は、分子４＜分子３＜分子１（ｅＣＤ４－ＩｇＧ）＜分子２（ｅＣＤ４－ｍＩｇＧ１）＜分子５であった。やはり分子５は、ＩＣ５０値０．０１ｎｇ／ｍＬという最も高い効能を示し、その値は、ｅＣＤ４－ＩｇＧ１タンパク質よりも１００倍強力なものであった。図４（ｂ）；表１を参照されたい。やはりより低い中和活性が、ＣＤ４配列のみを含有する分子０および分子６で観察された。
【0150】
驚くべきことに、分子５のみがＡＣ１０分離株に対し何らかの抗ウイルス活性を示した。そして残りの抗体誘導体は、供試した濃度の範囲では効果がなかった。図４（ｃ）；表１を参照されたい。
【0151】
【表1】
【0152】
実施例３
第１世代の抗体誘導体の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性
第１世代の抗体誘導体の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性
【0153】
本発明の抗体誘導体の追加の特長は、ＮＫ細胞を活性化させてＡＤＣＣを媒介する能力である。この機構は、ＨＩＶ感染細胞を効率良くかつ迅速に除去するために重要であり、ＨＩＶへの曝露および獲得に対し非感染対象の保護を与える。Euler Z, et al., AIDS Res Hum Retroviruses 2015;31(1):13-24を参照されたい。
【0154】
当技術分野で既に報告された試験を用いて、本発明の抗体誘導体のＡＤＣＣ活性を評価した。Alpert M, et al., J. Virol. 2012, 86:12039-12052を参照されたい。このアッセイでは、ＨＩＶで感染されたレポーター細胞株におけるルシフェラーゼの発現の減少によって、ＮＫ細胞の殺傷能を測定する。ＣＣＲ５配列およびＴ－２０配列を含有する抗体誘導体（分子５）のＡＤＣＣを誘導する能力を、ＣＤ４－ＩｇＧ１融合タンパク質（すなわち分子６、変異型Ｆｃ断片を含有）およびｅＣＤ４－ＩｇＧ１融合タンパク質（分子１）と比較した。ＨＩＶ ＢａＬ分離株で感染された細胞に対する用量応答カーブの分析は、分子１およびＩｇＧｂ１２のＩＣ５０値がそれぞれ７１．４および６６．２ｎｇ／ｍＬであったことを示し、一方で、変異型Ｆｃ残基を含有する分子は、より低いＩＣ５０値を示した。分子６および分子５は、それぞれＩＣ５０値１５．０および１４．９ｎｇ／ｍＬでＨＩＶ感染細胞を破壊した。図５を参照されたい。これらのデータは、抗体のＦｃ領域での変異の添加によってその防御能が著しく増強されることがあることを示唆する。
実施例４
リンカーの長さの最適化およびＣＣＲ５配列の役割の分析
実施例４
リンカーの長さの最適化およびＣＣＲ５配列の役割の分析
【0155】
分子５は、参照のｅＣＤ４－ＩｇＧ１融合タンパク質（分子１）よりも相当に高い抗ウイルス活性（＋１０，０００％）およびＡＤＣＣ（５００％）活性を示すとはいえ、それらの活性を増強するために、本発明の抗体誘導体の本来のデザインにさらに別の改変を行うことを提案した。これらの改変の提案とは、（ｉ）リンカーの長さを最適化すること、および（ｉｉ）ＣＣＲ５配列を含むことが、抗体誘導体の抗ウイルス活性およびＡＤＣＣ活性に著しく寄与したか否かを評価することである。上記のプロトコールに従い、抗体誘導体の新しいコレクションを調製した。これらの抗体誘導体は、様々なリンカーの長さを示し、ＣＣＲ５配列を含むかまたは含まないものである。図６を参照されたい。
実施例５
第２世代の抗体誘導体の抗ウイルス活性
実施例５
第２世代の抗体誘導体の抗ウイルス活性
【0156】
標準的な中和アッセイを実施して、実施例２に記載されたような改変型抗体誘導体の抗ウイルス活性を評価した。
【0157】
供試した全ての分子が、ＮＬ４－３分離株およびＢａＬ分離株の感染力の遮断に有効であった。ＮＬ４－３の中和については、分子５、分子７、および分子８はそれぞれ、同様のＩＣ５０値０．０６、０．０１７、および０．０３１ｎｇ／ｍＬという最も高い効能を示した。分子１０は、ＩＣ５０１．８ｎｇ／ｍＬという最も低い効能を示し、一方、分子１１は、ＩＣ５００．３５ｎｇ／ｍＬという中間の活性を示した。参照化合物である分子１（ｅＣＤ４－ＩｇＧ１）および分子０（ＣＤ４－ＩｇＧ１）についてのＩＣ５０値は、それぞれ１．２および８．９ｎｇ／ｍＬであった。注目すべきは、分子５、分子７、および分子８が、分子１よりも強力であったことである。例として、分子７は、ＮＬ４－３ウイルスについて分子１よりも１０００％強力であった。図７（ａ）；表２を参照されたい。
【0158】
同様の結果がＢａＬ分離株について観察された。抗ウイルス活性の序列は、分子７≦分子８≦分子５＜分子１１＜分子１（ｅＣＤ４－ＩｇＧ１）＜分子１０であった。やはり分子７は、ＩＣ５０値０．００５ｎｇ／ｍＬという最も高い効能を示し、この値は、分子１（ｅＣＤ４－ＩｇＧ１）参照タンパク質よりも２０，０００％強力なものである。図７（ｂ）；表２を参照されたい。
【0159】
重要なことに、本発明による改変型抗体誘導体（すなわち分子７、分子５、分子１１、および分子８）のみが、ＡＣ１０分離株に対する抗ウイルス活性を示した。分子７は、ＩＣ５０値１．３ｎｇ／ｍＬという最も高い抗ウイルス活性を示し、一方で、分子８および分子５は、２倍／３倍低い効能を示したが、その効能は、依然として分子１（ｅＣＤ４－ＩｇＧ１、ＩＣ５０＞１００ｎｇ／ｍＬを示した）よりもはるかに高いものであった。図７（ｃ）；表２を参照されたい。
【0160】
上記のデータは、分子５と分子７のどちらも同様の抗ウイルス活性を示したことから、驚くべきことにＣＣＲ５配列が抗ウイルス活性に必要ではない可能性があるということを示唆する。ＣＣＲ５配列は、抗ウイルス活性にメリットを与えるというよりも、スペーサー配列としての役割を果たす可能性がある。このことは、ＣＣＲ５のＮ末端領域とｇｐ１２０との相互作用の親和性が、ＣＤ４のｇｐ１２０に対するまたはＴ－２０ポリペプチドのｇｐ４１に対する親和性に比べて低いことに一致するということもあり得る。さらに、これらの結果はまた、（ａ）リンカーの長さがそれ自体で、または（ｂ）Ｆｃ領域に導入される変異との組合せのどちらかで、本発明の抗体誘導体の抗ウイルス活性への効果を及ぼすことを示す。この性質は、３つ全ての分離株について分子５および分子８と分子１とでＩＣ５０値を比較することによって示唆されるものと思われ、この比較では、リンカーを含むがＣＣＲ５配列を含まない変異型タンパク質（分子８）が、リンカーおよびＣＣＲ５配列を含む変異型タンパク質（分子５）に匹敵する効能と、リンカーを含まない非変異型タンパク質（分子１）よりもはるかに高い効能とを有することが示されている。図７（ａ）～（ｃ）；表２を参照されたい。
【0161】
【表2】
【0162】
実施例６
第２世代の抗体誘導体の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性
第２世代の抗体誘導体の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性
【0163】
改変型抗体誘導体のＡＤＣＣ活性を、実施例3に記載のプロトコールに従って評価した。
【0164】
分子５、分子７、および分子８がＡＤＣＣ活性を誘導する能力を、ｅＣＤ４－ＩｇＧ１（分子１）および中和抗体ＩｇＧｂ１２と比較した。ＨＩＶ ＢａＬ分離株で感染された細胞に対する用量応答カーブの分析では、分子５、分子７、および分子８が、それぞれＩＣ５０値１４．９、２３．８、および１４．３ｎｇ／ｍＬという同様の効能を有していたことが示された。一方、参照分子である分子１およびＩｇＧｂ１２は、それぞれＩＣ５０値７１．４および６６．２ｎｇ／ｍＬを示し、このことは、それらが分子５、分子７、および分子８よりも効能が低いことを示す。図８を参照されたい。
【0165】
やはりこれらの結果は、抗体誘導体のＦｃ領域に導入された変異が、ＡＤＣＣ活性を増強することを示唆する。分子５および分子８は、分子１よりも５００％強力であり、一方、分子７は、分子１よりも３００％強力である。
【0166】
抗体誘導体の抗ウイルスまたは中和ＡＤＣＣ活性の増加の特徴をさらに明らかにするために、周知のＨＩＶサブタイプＢウイルスのパネルに対し、分子５、分子７、および分子８を分析した。前掲Li, 2005を参照されたい。分子０および分子１を比較の目的で再度使用した。概要を述べると、分子０は、低い抗ウイルス活性を示し、初代分離株を１００ｎｇ／ｍＬで中和することができなかった。分子１は、僅かに高い活性を示したが、パネルのたった１つのウイルスを１００ｎｇ／ｍＬ未満で中和したに過ぎなかった。図９を参照されたい。それに対して、分子５、分子７、および分子８は、全ての初代分離株を、１から２５ｎｇ／ｍＬまでに及ぶＩＣ５０値で遮断することができた。図１０を参照されたい。
実施例７
抗レトロウイルス薬との組合せた抗体誘導体の抗ウイルス活性
実施例７
抗レトロウイルス薬との組合せた抗体誘導体の抗ウイルス活性
【0167】
実施例２に記載されたように、標準的な中和アッセイを実施して、様々な濃度の以下の抗レトロウイルス薬：３ＴＣ／ラミブジン、エファビレンツ（ＥＦＶ）、およびラルテグラビル（ＲＡＬ）の存在下における、分子５のＨＩＶ分離株ＮＬ４－３に対する抗ウイルス活性を評価した。以下の濃度の抗レトロウイルス薬の存在下における分子５のＩＣ５０値を決定した（濃度幅：０．０２から０．００００１μｇ／ｍＬ）。
３ＴＣ－４０、８、１．６、０．３２、０．０６４、０．０１３、０．００２６、および０．０００５μＭ；
ＥＦＶ－０．１、０．０２、０．００４、０．０００８、０．０００２、０．００００３、０．０００００６、および０．０００００１μＭ；ならびに
ＲＡＬ－０．０５、０．０１、０．００２、０．０００４、０．００００８、０．００００２、０．０００００３、および０．００００００６μＭ。
３ＴＣ－４０、８、１．６、０．３２、０．０６４、０．０１３、０．００２６、および０．０００５μＭ；
ＥＦＶ－０．１、０．０２、０．００４、０．０００８、０．０００２、０．００００３、０．０００００６、および０．０００００１μＭ；ならびに
ＲＡＬ－０．０５、０．０１、０．００２、０．０００４、０．００００８、０．００００２、０．０００００３、および０．００００００６μＭ。
【0168】
分子５は、高いｐｇ／ｍＬの範囲のＩＣ５０（１０４ｐｇ／ｍＬが検出の最低値であり、一方、２５７ｐｇ／ｍＬが最高である）で、全ての場合においてＨＩＶ感染力を有効に遮断した。図１１（ａ）～（ｃ）を参照されたい。
実施例８
抗体誘導体のウイルス不活化活性
実施例８
抗体誘導体のウイルス不活化活性
【0169】
抗体誘導体によって誘導されるＨＩＶの不可逆的な不活化を評価するために、高い感染性を有するＨＩＶ ＢａＬウイルスのストックを、ＤＭＥＭ培養培地中、分子５の希釈系列（濃度範囲：０．７μｇ／ｍＬから０．７ｐｇ／ｍＬ）または分子７のＣ３４誘導体（濃度範囲：１μｇ／ｍＬから１ｐｇ／ｍＬ）と共にインキュベーションした。３７℃での１時間のインキュベーション後、試料をＤＭＥＭで希釈して、LentiX Concentrator試薬（Takara/Clontech Laboratories, Inc.、マウンテンビュー、カリフォルニア州、米国）を添加することによって、ウイルスおよび可溶性タンパク質を分離した。混合物を４℃で３０分間インキュベーションし、続いて、４℃、１，５００×ｇで４５分間遠心分離した。上清を除去し、ウイルスのペレットをＤＭＥＭに再懸濁した。処理されたウイルスの感染力を、ＴＺＭ－ｂｌ細胞における力価測定によって分析した。Li M, et al., J. Virol. 2005; 79:10108-10125を参照されたい。ＴＣＩＤ５０値を各調製物について算出し、処理されたウイルスの残存の感染力を評価した。
【0170】
供試された分子はどちらも、ＢａＬウイルスのストックの感染力を不可逆的に不活化するのに有効であり、分子５について、および分子７のＣ３４誘導体について、それぞれＩＣ５０値０．０５５および０．０４４μｇ／ｍＬであった。特筆すべきことに、どちらのタンパク質も、０．１μｇ／ｍＬよりも高い濃度では、ウイルス感染力は検出されなかった。したがって、５ｌｏｇを超えるウイルス感染力価の低減が達成された。図１２を参照されたい。
実施例９
異なるｇｐ４１ペプチドを提示する抗体誘導体の抗ウイルス活性
実施例９
異なるｇｐ４１ペプチドを提示する抗体誘導体の抗ウイルス活性
【0171】
サイレント変異を分子５および分子７の完全配列に導入し、Ｔ２０配列（配列番号２８）を切り出せるようにした。この配列を以下の配列：Ｔ１２４９（配列番号２９）、Ｃ３４（配列番号３０）、およびＴ２６３５（配列番号３１）に置換した。
【0172】
上記に記載されたようにＨＥＫ－２９３Ｔ細胞の一過的トランスフェクションによって分子を生産し、これら新しい分子５および分子７の誘導体の抗ウイルス活性を評価するために、標準的な中和アッセイを実施した。上記抗ウイルス活性は、実験室仕様の分離株および初代分離株を含む、ＨＩＶ ＳＶＢＰサブタイプＢ分離株のパネルに対するものである。図１３を参照されたい。
【0173】
分子５および分子７の誘導体である分子５－Ｔ－１２４９、分子５－Ｃ３４、分子５－Ｔ－２６３５、分子７－Ｔ－１２４９、分子７－Ｃ３４および分子７－Ｔ－２６３５全てが、ｐｇ／ｍＬまたはｎｇ／ｍＬの幅のＩＣ５０で、全ての場合においてＨＩＶ感染力を有効に遮断しており、対照分子である分子１または分子６よりも高い効能および適用範囲を示した。図１３を参照されたい。
実施例１０
異なるヒトＩｇＧ配列を提示する抗体誘導体の抗ウイルス活性
実施例１０
異なるヒトＩｇＧ配列を提示する抗体誘導体の抗ウイルス活性
【0174】
ＫｐｎＩおよびＮｈｅＩ制限部位を分子５および分子７のＣ３４誘導体の完全配列に導入して、点変異Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、およびＩ３３２Ｅを有するヒトＩｇＧのＦｃ部分（配列番号２５）を切り出せるようにした。この配列を野生型ヒトＩｇＧ１（配列番号２４）、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３、およびヒトＩｇＧ４配列に置換した。
【0175】
上記に記載されたようにＨＥＫ－２９３Ｔ細胞の一過的トランスフェクションによって分子を生産し、抗ウイルス活性を評価するために、標準的な中和アッセイを実施した。上記抗ウイルス活性は、ＮＬ４－３ウイルスおよびＢａＬウイルス（新しい分子５誘導体に用いる）に対するもの、ならびに新しい分子７誘導体に用いる実験室仕様の分離株および中和の困難な初代分離株を含む、ＨＩＶ ＳＶＢＰサブタイプＢ分離株のパネルに対するものである。
【0176】
分子５誘導体である分子５－ＩｇＧ１、分子５－ＩｇＧ２、分子５－ＩｇＧ３、および分子５－ＩｇＧ４の全てが、ｐｇ／ｍＬまたはｎｇ／ｍＬの幅のＩＣ５０で、全ての場合においてＨＩＶ感染力を同様に有効に遮断しており、このことは効能が同様であることを示す。表３を参照されたい。分子７誘導体である分子７－ＩｇＧ１、分子７－ＩｇＧ２、分子７－ＩｇＧ３、および分子７－ＩｇＧ４の全てが、ｐｇ／ｍＬまたはｎｇ／ｍＬの幅のＩＣ５０で、全ての場合においてＨＩＶ感染力を同様に有効に遮断しており、このことは効能および適用範囲が同様であることを示す。図１４を参照されたい。
【0177】
【表3】
Ｉｎ ｖｉｖｏにおける抗体誘導体のＡＡＶ媒介性発現
【0178】
ＮＳＧマウス（Jackson Laboratory、バーハーバー、メイン州、米国）を、特殊な病原体不含（ＳＰＦ）条件下で同胞交配によって維持した。
【0179】
これらの動物で抗体誘導体の安定な発現を誘導するために、分子５（配列番号３７）、分子６（配列番号３８）、分子７（配列番号３９）、および分子８（配列番号４０）をコードする配列を、ＡＡＶ８発現プラスミド（CBATEG、Universitat Autonoma de Barcelona、バルセロナ、スペイン）内にクローニングした。１×１０１１個のウイルス粒子を４０μＬの１００ｍＭクエン酸ナトリウム、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８緩衝液中に希釈し、８週齢のマウスの腓腹筋内に注射した。同時に、マウスを、健常人から単離された１０，０００，０００個のＰＢＭＣの腹腔内注射によってヒト化した。２週間後、マウスを、１０，０００ＴＣＩＤ５０のＮＬ４－３ ＨＩＶウイルス分離株の腹腔内注射によって感染させた。血液試料を毎週収集し、Perfect Countビーズ（Cytognos SL、サラマンカ、スペイン）を以下の抗体：抗ヒトＣＤ４５－Ｖ４５０、ＣＤ３－ＡＰＣ／Ｃγ７、ＣＤ４－ＡＰＣ、ＣＤ８－Ｖ５００、ＣＤ１４－ＰｅｒＣＰ／Ｃγ５．５、ＣＤ５６－ＰＥ、ＣＤ１６－Ｆｉｔｃ、および抗マウスＣＤ４５ＰＥ／Ｃγ７と組み合わせて使用して、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞のカウントをフローサイトメトリーによって分析した。試料を、LSRIIフローサイトメーター（BD Biosciences Corp.、フランクリンレイクス、ニュージャージー州、米国）を使用して解析した。また、上に記載のＥＬＩＳＡアプローチを用いて、抗体誘導体レベルについて試料をアッセイした。感染から３週間後、マウスを屠殺し、血液試料および組織試料を収集した。試料をフローサイトメトリーによって分析し、ウイルス負荷および総ＨＩＶ ＤＮＡをｑＰＣＲによって決定した。
【0180】
抗体誘導体の検出レベルは、ＡＡＶ処置の２週間後および３週間後、無処置群に比べて、処置動物の多くに見られた。さらに、発現レベルは全ての動物で安定であった。図１５（ａ）および図１５（ｂ）を参照されたい。
実施例１２
プラスミド性ベクターを用いる受動免疫のプロトコール
実施例１２
プラスミド性ベクターを用いる受動免疫のプロトコール
【0181】
ＮＳＧ マウス（Jackson Laboratory、バーハーバー、メイン州、米国）を、特殊な病原体不含（ＳＰＦ）条件下で同胞交配によって維持した。
【0182】
プラスミドpABT-5、pABT-7、およびpABT-8を、EndoFree Plasmid Kits（Qiagen NV、フェンロー、オランダ）を使用してエンドトキシン不含条件で生産した。ｉｎ ｖｉｖｏで抗体誘導体を一過的に発現するため、プラスミドを筋肉内注射または静脈内注射によってＮＧＳマウスに投与した。プラスミド投与後、血液試料を毎週収集し、上に記載のＥＬＩＳＡアプローチを使用して、抗体誘導体レベルについてアッセイした。プラスミド投与から４週間後、マウスを屠殺し、血液試料および組織試料を収集して、抗体誘導体レベルおよび抗イディオタイプ抗体について分析した。
実施例１３
分子５のｉｎ ｖｉｖｏ活性
実施例１３
分子５のｉｎ ｖｉｖｏ活性
【0183】
分子５を、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞の大量培養で一過的トランスフェクションによって生産した。CaptureSelect FcXL Affinity Matrix（Thermo Fisher Scientific、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）カラムに上清をロードして結合タンパク質をグリシン緩衝液ｐＨ＝３．５で溶出したのち、組換えタンパク質が精製された。ｐＨ中和、透析および濃縮の後、高純度の５ｍｇ／ｍＬのストックを得た。
【0184】
ＮＳＧ免疫不全マウスを、健常人から単離された１０，０００，０００個のＰＢＭＣの腹腔内注射によってヒト化した。２週間後、１０，０００ＴＣＩＤ５０のＮＬ４－３ ＨＩＶウイルス分離株の静脈内注射によって、マウスを感染させた。感染の２４時間前および２４時間後に、２００μＬ中の精製した０．５ｍｇの分子５を用いて、または同じ体積のＰＢＳを用いて、腹腔内注射によってマウスを処置した。血液試料を、感染の１週間後に上顎静脈の穿刺によって収集し、加工処理して血漿試料を取得し、この血漿試料を、Abbott Real Time HIV-1（Abbott Laboratories、アボットパーク、イリノイ州、米国）を使用して、ウイルス血症のレベルについてアッセイした。分子５で処置した動物は、感染の１週間後、無処置の動物よりも著しく低いレベルのウイルス血症を示した。図１６を参照されたい。
実施例１３
ＨＩＶ Ｅｎｖグロコタンパク質の検出
実施例１３
ＨＩＶ Ｅｎｖグロコタンパク質の検出
【0185】
本発明の抗体誘導体が試料中のＨＩＶタンパク質を特定する能力を評価するために、ＨＩＶ分離株ＮＬ４－３またはＢａＬを用いて慢性的に感染させたＭＯＬＴ細胞を、量を増加させた分子５と共にインキュベーションした。これらの細胞に結合していた抗体を、蛍光色素フィコエリスリンと連係させたマウス抗ヒトＩｇＧ抗体（PE/Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.、ウェストグローブ、ペンシルバニア州、米国）を用いて明らかにし、LSRIIフローサイトメーター（BD Biosciences Corp.、フランクリンレイクス、ニュージャージー州、米国）で、フローサイトメトリーによって分析した。
【0186】
分子５は、両方のＨＩＶ感染細胞に親和性の高い飽和した結合を示した。図１７を参照されたい。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15A】
【図15B】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】