特許 6992079 粒子分離

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2021-12-10

(45)【発行日】2022-01-13

(54)【発明の名称】粒子分離

(51)【国際特許分類】

   B03C 5/00 20060101AFI20220105BHJP

   B03C 5/02 20060101ALI20220105BHJP

   B01D 57/02 20060101ALI20220105BHJP

【ＦＩ】

B03C5/00 Z

B03C5/02

B01D57/02

【請求項の数】 15

(21)【出願番号】P 2019544877

(86)(22)【出願日】2017-04-23

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2020-03-12

(86)【国際出願番号】 US2017029028

(87)【国際公開番号】W WO2018199874

(87)【国際公開日】2018-11-01

【審査請求日】2019-08-19

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】511076424

【氏名又は名称】ヒューレット－パッカード デベロップメント カンパニー エル．ピー．

【氏名又は名称原語表記】Ｈｅｗｌｅｔｔ‐Ｐａｃｋａｒｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｌ．Ｐ．

(74)【代理人】

【識別番号】100087642

【弁理士】

【氏名又は名称】古谷 聡

(74)【代理人】

【識別番号】100082946

【弁理士】

【氏名又は名称】大西 昭広

(74)【代理人】

【識別番号】100195693

【弁理士】

【氏名又は名称】細井 玲

(72)【発明者】

【氏名】シュコルニコフ，ヴィクトル

(72)【発明者】

【氏名】チェン，チエン－フア

【審査官】目代 博茂

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１１／０６７９６１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１１／１０５５０７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２００７／０１２５９４１（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特開２０１４－１７８１１９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００４－１１３２２３（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｂ０３Ｃ３／００－１１／００

Ｂ０１Ｄ５７／００－５７／０２

Ｂ０１Ｄ３５／０６

Ｃ１２Ｍ１／００－３／１０

Ｇ０１Ｎ１／００－１／４４

Ｇ０１Ｎ１５／００－１５／１４

Ｂ０１Ｊ１９／００－１９／３２

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

流体内に同伴された粒子を方向づける入口通路；
前記入口通路から分岐する第１の分離通路；
前記入口通路から分岐する第２の分離通路；
前記粒子に誘電泳動力を及ぼす電界を生成して、前記粒子を前記第１の分離通路または前記第２の分離通路に方向づける電極、ここで前記入口通路、前記第１の分離通路、前記第２の分離通路、前記電界および前記誘電泳動力は同じ単一の平面に延びている、
を備え、
前記入口通路、前記第１の分離通路および前記第２の分離通路はそれぞれ、対向する側壁を含み、ここで前記電極は前記対向する側壁上に形成されると共に、前記対向する側壁に平行かつそれに沿った面を有し、対向する前記電極は関連する通路を横切って、分離される標的粒子の直径の少なくとも１０倍の距離だけ分離されている、流体同伴粒子分離器。

【請求項2】

前記粒子を前記入口通路内の層流に集めさせる粒子フォーカサをさらに備える、請求項１に記載の流体同伴粒子分離器。

【請求項3】

前記粒子フォーカサが流体力学的フォーカサを含む、請求項２に記載の流体同伴粒子分離器。

【請求項4】

前記流体力学的粒子フォーカサが、前記入口通路につながる第１のシース流路と、前記入口通路につながる第２のシース流路と、前記入口通路につながる粒子流路とを備え、前記粒子流路が、前記第１のシース流路および前記第２のシース流路からのシース流体の間に粒子を供給する、請求項３に記載の流体同伴粒子分離装置。

【請求項5】

前記粒子フォーカサが、自由流動負誘電泳動粒子フォーカサおよび自由流動等速電気泳動粒子フォーカサからなる粒子フォーカサの群から選択される、請求項２に記載の流体同伴粒子分離器。

【請求項6】

前記第１の分離通路から分岐する第３の分離通路；および
前記第１の分離通路から分岐する第４の分離通路、ここで前記電界が前記粒子に誘電泳動力を及ぼして、前記第１の分離通路内の前記粒子を前記第３の分離通路または前記第４の分離通路に方向づけ、ここで前記第３の分離通路および前記第４の分離通路は前記同じ単一の平面に延びている、
をさらに備える、請求項１から５の何れか１に記載の流体同伴粒子分離器。

【請求項7】

前記入口通路から分岐して前記同じ単一の平面に延びている第３の分離通路をさらに備え、ここで前記電界が前記粒子に誘電泳動力を及ぼして前記入口通路内の前記粒子を前記第１の分離通路、前記第２の分離通路または第３の分離通路に方向づける、請求項１から５の何れか１に記載の流体同伴粒子分離器。

【請求項8】

前記第１の分離通路および前記第２の分離通路のそれぞれが、少なくとも１０，０００オームセンチメートルのインピーダンスを有する材料から形成された床面を含む、請求項１から７の何れか１に記載の流体同伴粒子分離器。

【請求項9】

少なくとも１０，０００オームセンチメートルのインピーダンスを有する基材；
前記電極を形成する前記基材上の第１の層、ここで前記入口通路、前記第１の分離通路、および前記第２の分離通路は、前記第１の層に形成され；ならびに
前記第１の層上の第２の層、ここで前記基材および前記第２の層は、前記入口通路、前記第１の分離通路および前記第２の分離通路のそれぞれの床および天井をそれぞれ形成する、
をさらに備える、請求項１から８の何れか１に記載の流体同伴粒子分離器。

【請求項10】

少なくとも１０，０００オームセンチメートルのインピーダンスを有する層、前記層は前記入口通路、前記第１の分離通路および前記第２の分離通路を形成するチャネルを形成し、
前記電極を形成する前記チャネルの対向する側壁上の電極材料の層、
を備える、請求項１から８の何れか１に記載の流体同伴粒子分離器。

【請求項11】

流体内に同伴された粒子を分離する方法であって、
入口通路を通じてストリームに同伴された粒子を方向づけること；
単一の平面内の電界を前記ストリームに印加して、前記粒子に前記同じ単一の平面内の誘電泳動力を及ぼして、前記ストリーム内の前記粒子の第１のサブセットを前記同じ単一の平面内に延びている第１の分離通路に迂回させ、そして前記ストリーム内の前記粒子の第２のサブセットを前記同じ単一の平面内に延びている第２の分離通路に迂回させること、を含み、
前記電界は、前記ストリームを横切って分離された電極であって、分離される標的粒子の直径の少なくとも１０倍の距離だけ互いに分離された電極から印加される、方法。

【請求項12】

前記ストリーム内の前記粒子を集めることをさらに含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記入口通路、前記第１の分離通路、および前記第２の分離通路はそれぞれ床および側壁を有し、ここで前記側壁は、前記電界を印加する電極を形成する導電性材料の層を有し、そしてここで前記床は、前記ストリームのインピーダンスより高いインピーダンスを有する、請求項１１または１２に記載の方法。

【請求項14】

前記入口通路、前記第１の分離通路、および前記第２の分離通路は、少なくとも１０，０００オームセンチメートルのインピーダンスを有する基材上の第１の層に形成され、前記第１の層は前記電極を形成し、第２の層が前記第１の層上に形成され、
ここで前記基材および前記第２の層は、前記入口通路、前記第１の分離通路および前記第２の分離通路のそれぞれの床および天井をそれぞれ形成する、請求項１１または１２に記載の方法。

【請求項15】

流体同伴粒子分離器を形成する方法であって、
入口通路、前記入口通路から分岐する第１の分離通路、および前記入口通路から分岐する第２の分離通路を形成し、これらの通路が同じ単一の平面に延びること；
前記入口通路、前記第１の分離通路および前記第２の分離通路の側面上に沿って電極を形成すること；および
対向する側面上の前記電極を互いに電気的に絶縁すること、を含み、ここで対向する前記電極は関連する通路を横切って、分離される標的粒子の直径の少なくとも１０倍の距離だけ分離されており、同じ単一の平面内に誘電泳動力を及ぼす電界を印加する、方法。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

粒子の分離はさまざまな産業で行われている。たとえば、生物学や医学では、希少細胞が診断のために患者の血液から分離されることがよくある。希少な血球などの粒子の分離には、多くの課題がある。

【図面の簡単な説明】

【0002】

【図1】図１は、流体同伴粒子分離器の例の一部の概略図である。

【0003】

【図2】図２は、流体同伴粒子を分離する例示的な方法のフロー図である。

【0004】

【図3】図３は、流体同伴粒子分離器の別の例の一部の概略図である。

【0005】

【図4】図４は、流体同伴粒子分離器の別の例の一部の概略図である。

【0006】

【図5】図５は、流体同伴粒子分離器の別の例の一部の概略図である。

【0007】

【図6】図６は、図５のライン６－６に沿った流体同伴粒子分離器の断面図である。

【0008】

【図7】図７は、図５のライン７－７に沿った流体同伴粒子分離器の断面図である。

【0009】

【図8】図８は、流体同伴粒子分離器の別の例の一部の概略図である。

【0010】

【図9】図９は、図８のライン９－９に沿った流体同伴粒子分離器の断面図である。

【0011】

【図10】図１０は、図８のライン１０－１０に沿った流体同伴粒子分離器の断面図である。

【0012】

【図11】図１１は、図８のライン１１－１１に沿った液体同伴粒子分離器の別の例の断面図である。

【0013】

【図12】図１２は、図８のライン１２－１２に沿った図１１の流体同伴粒子分離器の断面図である。

【0014】

【図13】図１３は、流体同伴粒子分離器の別の例の一部の概略図である。

【0015】

【図14】図１４は、図１３のライン１４－１４に沿った流体同伴粒子分離器の断面図である。

【0016】

【図15】図１５は、図１３のライン１５－１５に沿った流体同伴粒子分離器の断面図である。

【0017】

【図16】図１６は、流体同伴粒子分離器を形成するための例示的な方法のフロー図である。

【0018】

【図17】図１７は、流体同伴粒子分離器の別の例の一部の上面斜視図である。

【0019】

【図18】図１８は、図１７の流体同伴粒子分離器の上面図である。

【0020】

【図19】図１９は、図１８の流体同伴粒子分離器の部分で発生した誘電泳動力を示すグラフである。

【0021】

【図20】図２０は、流体同伴粒子分離器の別の例を概略的に示す上面図である。

【0022】

【図21】図２１は、流体同伴粒子分離器の別の例を概略的に示す上面図である。

【0023】

図面全体を通して、同一の参照番号は、類似しているが必ずしも同一ではない要素を示している。図は必ずしも縮尺どおりではなく、一部の部分のサイズは、示されている例をより明確に示すために誇張されていることがある。さらに、図面は、説明と一致する例および／または実装を提供するが、説明は、図面で提供される例および／または実装に限定されない。

【発明を実施するための形態】

【0024】

本明細書に開示されるのは、その他および／または周囲の媒体に対する粒子のサイズおよび電気分極率に基づいて、生体細胞などの粒子を分離する粒子分離器の例である。粒子の分極特性は、課された電界周波数に応じている。フィールド周波数は簡単に変更できるため、このような粒子分離器は非常に適応性が高く、粒子やアプリケーションの範囲に適用できる。

【0025】

本明細書では、幾何学形状および均一な力場を促進する構造を有する粒子分離器の例が開示される。その結果、粒子分離の再現性と信頼性が向上される。開示された粒子分離器はさらに、生成された流体力学的力場内の予測可能な位置でストリーム（流れ）内の粒子を配置し得る。その結果、粒子は再現性よく確実に分離され、一貫した結果のため、２つの異なる領域または２つの異なる分離通路に方向づけられる。

【0026】

本明細書には、誘電泳動力を使用して異なる粒子の分離を促進する流体同伴粒子分離器の例が開示されている。分離される流体粒子は、入口通路を通って方向づけられる流体に同伴される。電極は、誘電泳動力を粒子に作用させて粒子を入口通路から異なる分離通路に方向づける電界を生成する。

【0027】

いくつかの実装形態では、粒子フォーカサを利用して、流体に同伴された粒子を、分離の前に入口通路内の層流に集めさせる。一実装形態では、粒子フォーカサは、粒子を含む溶液を挟む緩衝液の第１および第２のシース流を利用してそのような層流を提供する流体力学的フォーカサを備えてもよい。他の実装形態では、自由流動負誘電泳動粒子フォーカサおよび自由流動等速電気泳動粒子フォーカサなどの他の粒子フォーカサを使用することができる。

【0028】

一実装形態において、分離通路および電極は、電極によって生成される電界および結果として生じる誘電泳動力が分離通路とともに単一の平面内に広がるように配置および向き合わせされる。分離通路、電界、および誘電泳動力が単一の平面内に広がるため、粒子の分離がより予測可能になり、混乱が少なくなり、より信頼性の高い結果をもたらす。

【0029】

本明細書では、流体に同伴された粒子を方向付ける入口通路、入口通路から分岐する第１の分離通路、入口通路から分岐する第２の分離通路、および粒子に誘電泳動力を及ぼす電界を生成する電極を含み得る、流体同伴粒子分離器の例が開示されている。誘電泳動力は、粒子を第１の分離通路または第２の分離通路に方向付ける。第１の分離通路、第２の分離通路、電界および誘電泳動力は、１つの平面に延びている。

【0030】

本明細書では、流体に同伴される粒子を分離するための例示的な方法が開示される。この方法は、入口通路を通してストリームに同伴された粒子を方向づけることを含むことができる。この方法は、平面内の電界をストリームに印加して粒子に平面内の誘電泳動力を及ぼして、ストリーム内の粒子の第１のサブセットを平面に延びる第１の分離通路に迂回させ、そしてストリーム内の粒子の第２のサブセットを平面内に延びる第２の分離通路に迂回させることができる。

【0031】

本明細書では、流体同伴粒子分離器を形成するための例示的な方法が開示される。この方法は、入口通路、入口通路から分岐する第１の分離通路、および入口通路から分岐する第２の分離通路を形成することを含むことができる。第１の分離通路および第２の分離通路の側面に電極が形成されている。電極は、互いに対向する面にて電気的に絶縁されている。

【0032】

図１は、流体同伴粒子分離器２０の例のいくつかの部分を示す概略図である。分離器２０は、入口通路２４、分離通路２６、分離通路３６、および電極４０Ａ、４０Ｂおよび４０Ｃ（まとめて電極４０と称する）を含む。入口通路２４は、分離される粒子を含む溶液を案内するマイクロ流体チャネルなどのチャネルを含む。

【0033】

分離通路２６および３６は、入口通路２４から延びてそして分岐するマイクロ流体チャネルなどのチャネルを含む。分離通路２６、３６は、分離された粒子または細胞が収集および分析され得る別個の行先につながる。いくつかの実装形態では、分離通路２６に方向づけられたまたは分離通路３６に方向づけられた粒子は、下流でさらに分離され得る。図示の例では、分離通路２６、３６は、単一の水平面などの単一の平面に延びている。いくつかの実装形態では、分離通路２６、３６は、入口通路２４と同じ平面に延びている。通路２６、３６は、１３５°の角度で入口通路２４から分岐するように示されているが、通路２６および３６は、入口通路２４から他の角度で延びることができることが理解されよう。

【0034】

電極４０は、通路２４、２６、および３６にわたって電界を生成するために提供される。電極４０は、通路２４、２６、および３６と同じ平面内に延びる電界を生成するように単一の平面内に延びる。分離通路、電界、および誘電泳動力が単一の平面内に広がるため、粒子の分離がより予測可能になり、混乱が少なくなり、より信頼性の高い結果をもたらす。

【0035】

図示の例では、電極４０Ａは通路２４および２６に沿って延びている。電極４０Ｂは通路２４および３６に沿って延びている。電極４０Ｃは、通路２６および３６に沿って延びている。理解されるように、電極４０の各々は、連続電極であってもよく、または接地または交流周波数電流源などの電流源に接続された複数の別個の要素によって形成されてもよい。

【0036】

一実装形態では、電極４０Ａおよび４０Ｂは、分離される標的粒子の直径の少なくとも１０倍の距離による入口通路２４を横切る距離により分離される。同様に、電極４０Ａおよび４０Ｃならびに電極４０Ｂおよび４０Ｃも、分離される標的粒子の直径の少なくとも１０倍の距離による各々の分離通路２６および３６を横切る距離により分離される。この分離は、粒子の存在によってグローバル電界が大きく歪まない可能性を低減し、そして流れの内のすべての粒子で同様の分離が実行される。

【0037】

図２は、流体同伴粒子を分離するための例示的な方法１００のフロー図である。方法１００は、より予測可能で、混乱の少ない粒子分離を提供し、より信頼性の高い結果をもたらす。方法１００は分離器２０で実行されるものとして記載されているが、方法１００は、以下に記載する分離器または他の同様の粒子分離器のいずれかを用いて実施できることが理解されよう。

【0038】

ブロック１０６で示されるように、分離される粒子はストリームに同伴され、そして入口通路２４を通って方向づけられる。粒子は他の粒子と混ざっていてもよい。例えば、希少な生物細胞などの分離される特定の標的粒子は、他の生物細胞または他の粒子と混ざり合っていてもよい。以下に説明するように、いくつかの実装形態では、粒子は、分離される前に入口通路２４の前または内部にて集められてもよい。一実装形態において、粒子は、入口通路２４を通る層流を有するように集められてもよい。一実装形態では、粒子は、少なくとも１つの緩衝液のシート流の間に流体同伴粒子を挟む流体力学的フォーカサで集められてもよい。さらに他の実装形態では、流体同伴粒子は他の方法で集められてもよい。

【0039】

ブロック１０８によって示されるように、電極４０は、平面内の電界を流体同伴粒子のストリームに印加する。一実装形態では、所定の周波数の交流電流が電極４０に印加される。一実装形態では、電極４０に印加される交流電流は、２０ｋＨｚと２００ｋＨｚの間、公称６０ｋＨｚの周波数を有する。電界は、平面内の誘電泳動力を粒子に及ぼし、同じ平面に入口通路２４および分離通路２６、３６が延び、そして同じ平面に電界が延びる。粒子は、異なるサイズと電気分極率の結果として、誘電泳動力に対する異なる応答に基づいて分離される。誘電泳動力は、ストリーム内の粒子の第１のサブセットを平面内に延びる第１の分離通路２６に迂回させ、そしてストリーム内の粒子の第２のサブセットを平面内に延びる第２の分離通路３６に迂回させる。

【0040】

図３は、流体同伴粒子分離器２２０の別の例の概略図である。分離器２２０は、分離器２２０が粒子フォーカサ２２２をさらに含むことを除いて、上述の分離器２０と同様である。分離器２０の構成要素に対応する分離器２２０の残りの構成要素には、同様の番号が付けられている。

【0041】

粒子フォーカサ２２２は、分離される前に入口通路２４の前または内部で流体同伴粒子を集める。一実装形態では、フォーカサ２２２は、粒子を、入口通路２４を通る層流に集める。一実装形態では、フォーカサ２２２は、少なくとも１つの緩衝液のシース流の間に流体同伴粒子を挟む流体力学的フォーカサを含む。他の実装形態では、フォーカサ２２２は、自由流動負誘電泳動粒子フォーカサまたは自由流動等速電気泳動粒子フォーカサなどの他の粒子フォーカサを含んでもよい。さらに他の実装形態では、流体同伴粒子は他の方法で集められてもよい。分離される粒子を含む流体を集めることは、分離器２２０の分離性能を向上させる。しかし、いくつかの実装形態では、そのような粒子を集めることは省略されてもよい。

【0042】

図４は、流体同伴粒子フォーカサ３２０の別の例の概略図である。粒子フォーカサ３２０は、分離通路２６、３６が、第１の分離通路を備え、そして粒子フォーカサ３２０が、第２の分離通路３２８、３２９、３３８、３３９および電極３４０Ａ、３４０Ｂ（まとめて電極３４０と称する）をさらに備えることを除き、フォーカサ２２０に類似している。フォーカサ２２０の構成要素に対応するフォーカサ３２０の残りの構成要素には、同様の番号が付けられている。

【0043】

第２の分離通路３２８、３２９は、第１の分離通路２６から延び、そして分岐するマイクロ流体チャネルなどのチャネルを含む。分離通路３２８、３２９は、分離された粒子または細胞が収集および分析され得る別個の行先につながる。図示の例では、分離通路３２８、３２９は、単一の水平面などの単一の平面に延びている。いくつかの実装形態では、分離通路３２８、３２９は、分離通路２６と同じ平面内に延びる。通路３２８、３２９は、１３５°の角度で分離通路２６から分岐するように示されているが、通路３２８、３２９は、分離通路２６から他の角度で延びることができることが理解されよう。

【0044】

第２の分離通路３３８、３３９は、第１の分離通路２８から延び、そして分岐するマイクロ流体チャネルなどのチャネルを含む。分離通路３３８、３３９は、分離された粒子が収集および分析され得る別個の行先につながる。図示の例では、分離通路３３８、３３９は、単一の水平面などの単一の平面内に延びている。いくつかの実装形態では、分離通路３３８、３３９は、分離通路２８と同じ平面に延びている。通路３３８、３３９は、１３５°の角度で分離通路２８から分岐するように示されているが、通路３３８、３３９は、分離通路２８から他の角度で延びることができることが理解されよう。

【0045】

電極３４０は、第２の分離通路３２８、３２９、３３８、３３９にわたって電界を生成するために提供される。通路２４、２６、および３６ならびに通路３２８、３２９、３３８、３３９と同じ平面内に延びる電界を生成するように、電極３４０は単一の平面内に延びる。分離通路、電界、および誘電泳動力が単一の平面内に延びるため、粒子の分離がより予測可能になり、混乱が少なくなり、より信頼性の高い結果をもたらす。

【0046】

図示の例では、電極３４０Ａは通路３２８、３２９に沿って延びている。電極３４０Ｂは、通路３３８、３３９に沿って延びている。電極３４０Ａは、電極４０Ａと協働して、第２の分離通路３２８にわたる電界を確立する。電極３４０Ａは、電極４０Ｃと協働して、第２の分離通路３２９にわたる電界を確立する。電極３４０Ｂは、電極４０Ｃと協働して、第２の分離通路３３８にわたる電界を確立する。電極３４０Ｂは、電極４０Ｂとともに、第２の分離通路３３９にわたる電界を確立する。理解されるように、電極４０Ｂおよび４０Ｃのそれぞれは、連続電極であってもよく、または接地または交流周波数電流源などの電流源に接続された複数の別個の要素によって形成されてもよい。

【0047】

一実装形態では、電極３４０Ａおよび４０Ａは、分離される標的粒子の直径の少なくとも１０倍の距離による第２の分離通路３２８を横切る距離により分離される。同様に、電極３４０Ａおよび４０Ｃ、電極３４０Ｂおよび４０Ｃ、ならびに電極３４０Ｂおよび４０Ｂもまた、分離される標的粒子の直径の少なくとも１０倍の距離による各々の分離通路３２９、３３８および３３９を横切る距離により分離される。この分離は、粒子の存在によってグローバル電界が大きく歪まない可能性を低減し、流れ内のすべての粒子で同様の分離が実行される。

【0048】

粒子フォーカサ３２０は、多段階粒子分離を実行する。図示された例では、分離される粒子を含む流体の層流は、入口通路２４に沿って方向づけられる。通路２４ならびに通路２６および２８にわたって延びる電界は、粒子サイズおよび電気的極性の違いに基づいて異なる粒子を異なる方向に向ける誘電泳動力を生成する。誘電泳動力に対する異なる粒子の異なる応答により、流体の層流が分裂し、粒子の第１の部分が分離通路２６に沿って迂回され、粒子の第２の部分が分離通路２８に沿って迂回される。その後、通路３２８および３２９にわたって生成される電界は、粒子サイズおよび電気極性の違いに基づいて分離通路２６内の異なる粒子と異なって相互作用する誘電泳動力を生成し、第１の部分は分離通路３２８に沿ってさらに迂回され、第２の部分は分離通路３２９に沿ってさらに迂回されるように分離通路２６内の粒子のストリームをさらに分割する。

【0049】

同様に、通路３３８および３３９にわたって生成された電界は、粒子サイズと電気極性の違いに基づいて分離通路２８内の異なる粒子に異なって方向づける誘電泳動力を生じさせ、第１の部分は分離通路３３８に沿ってさらに迂回され、第２の部分は分離通路３３９に沿ってさらに迂回されるように分離通路２８内の粒子のストリームをさらに分割する。結果として、流体同伴粒子の元のストリームは、粒子の４つの異なる組または粒子の群に分離される。粒子の各群は、同様の粒子のサイズおよび／または電気極性を有する。粒子の各群は、他の群の粒子とは、サイズが異なるか、電気的極性が異なる。

【0050】

図５から図７は、流体同伴粒子分離器４２０の別の例を示している。図６は、図５のライン６－６に沿った分離器４２０の断面図である。図７は、図５のライン７－７に沿った断面図である。粒子分離器４２０は、基材４２２、誘電体層４２３、入口通路４２４、第１の分離通路４２６、４２８、電極４４０Ａ、４４０Ｂおよび４４０Ｃ、粒子２２２（上記）ならびにカバー層４５０を含む。

【0051】

基材４２２は、通路４２４、４２６および４２８を部分的に形成する内部に形成された一連の接続された分岐溝４５２を有する材料の少なくとも１つの層を含む。一実装形態では、溝４５２は、基材４２２を形成する層材料のインプリントまたは成形によって形成される。別の実装形態では、溝４５２は、基材４２２を形成する材料の層（単数または複数）上で実行される切断、アブレーション、エッチング、または他の材料除去プロセスによって形成される。別の実装形態では、溝４５２は、下にあるベース層またはプラットフォーム上で実行されるプリントまたは付加製造プロセスなどの選択的堆積によって形成される。

【0052】

図示された例では、基材４２２は、そのような通路４２４、４２６、４２８を通じて方向づけられる流体粒子のストリームのインピーダンスよりも小さいか、または不十分に大きいインピーダンスを有する材料を含む。一実装形態では、基材４２２は、１０，０００オームセンチメートル未満のインピーダンスを有する材料を含む。一実装形態では、基材８２２は、１０，０００オームセンチメートル未満のインピーダンスを有するシリコン材料を含む。

【0053】

誘電体層４２３は、溝４５２の床および対向する側壁上に形成または被覆する材料の層を含む。誘電体層４２３は、材料から形成され、電界が基材４２２を通過するというより、通路４２４、４２６、４２８内の流体を通りそしてわたって通過するような十分な厚さを有する。一実装形態では、誘電体層４２３は、十分な誘電特性を有する材料から形成され、層４２３を通る経路のインピーダンスが、通路４２４、４２６および４２８をわたる流体の経路のインピーダンスの少なくとも５倍のレベルになるように寸法決めされる。一実装形態では、層４２３は、十分な誘電特性を有する材料から形成され、層４２３を通る経路のインピーダンスが、通路４２４、４２６および４２８をわたる流体の経路のインピーダンスの少なくとも１０倍のレベルになるように寸法決めされる。一実装形態では、層４２３は、少なくとも１０，０００オームセンチメートルのインピーダンスを有する材料から形成される。一実装形態では、層４２３は、窒化ケイ素または二酸化ケイ素などの材料から形成される。さらに他の実装形態では、層４２３は、十分なインピーダンスを有する他の材料から形成されてもよい。

【0054】

電極４４０は、通路４２４、４２６、および４２８にわたって電界を生成するために提供される。電極４４０は、通路４２４、４２６、および４２８と同じ平面内に延びる電界を生成するように単一の平面内に延びる。分離通路、電界、および誘電泳動力が単一の平面内に延びるため、粒子の分離がより予測可能になり、混乱が少なくなり、より信頼性の高い結果をもたらす。

【0055】

図示の例では、電極４４０Ａは通路４２４および４２８に沿って延びている。電極４４０Ｂは、通路４２４および４２８に沿って延びている。電極４４０Ｃは、通路４２６および４２８に沿って延びている。電極４４０のそれぞれは、分離される粒子の分極特性に基づく所定の周波数を有する交流電流源などの電荷源に接続される。

【0056】

一実装形態では、電極４４０Ａおよび４４０Ｂは、分離される標的粒子の直径の少なくとも１０倍の距離による入口通路４２４を横切る距離により分離される。同様に、電極４４０Ａおよび４４０Ｃならびに電極４４０Ｂおよび４４０Ｃも、分離される標的粒子の直径の少なくとも１０倍の距離による各々の分離通路４２８および４２６を横切る距離により分離される。この分離は、粒子の存在によってグローバル電界が大きく歪まない可能性を低減し、流れ内のすべての粒子で同様の分離が実行される。

【0057】

一実装形態において、電極４４０は、溝４５２の床にわたって延びることなく、溝４５２の側面上の誘電体層４２３上に形成される。一実装形態では、電極４４０は、指向性スパッタリングまたは角度付きスパッタリングを使用して形成され、それは、溝４５２の床に堆積することなく、または最小限の堆積にて溝４５２の側面上の層４２３上に導電性材料を堆積する。さらに他の実装形態では、電極４４０を形成する導電性材料は、溝４５２の床上の層４２３上に堆積されてもよく、ここで溝４５２の床上の層４２３上に堆積された導電性材料は、電極４４０を形成するよう側面上の導電性材料を残しながら、その後除去される。

【0058】

通路４２４、４２６、および４２８は、カバー層またはカバーパネル４５０の形成または提供によって完了する。そのような実装形態では、カバーパネル４５０はまた、そのような通路４２４、４２６、４２８を通って方向づけられる流体粒子のストリームのインピーダンスよりも大きいインピーダンスを有しており、電極４４０により生成される電界は、カバーパネル４５０により提供される天井を通過するというよりも、流体粒子のストリームを通過することになる。一実装形態では、カバーパネル４５０は、少なくとも１０，０００オームセンチメートルのインピーダンスを有する材料から形成される。一実装形態では、カバーパネル４５０は、ガラス、窒化ケイ素または二酸化ケイ素などの材料から形成される。さらに他の実装形態では、カバーパネル４５０は、十分なインピーダンスを有する他の材料から形成されてもよい。

【0059】

図８から図１０は、異なる例の方法に従って形成された分離器４２０の別の例である分離器５２０を示す。図８は、分離器５２０の上面図である。図９は、ライン９－９に沿った分離器５２０の断面図である。分離器５２０は、分離器５２０が基材４２２の代わりに基材５２２を含み、誘電体層５２３を省略していることを除いて、分離器４２０と同様である。粒子分離器４２０の構成要素に対応する粒子分離器５２０の残りの構成要素は、同様の番号が付けられている。

【0060】

基材５２２は、基材５２２が通路４２４、４２６、および４２８を画定する溝４５２が内部に形成されているという点で、基材４２２と同様である。しかしながら、基材４２２とは異なり、基材５２２は、十分な誘電特性を有する材料から形成され、基材５２２を通る経路のインピーダンスが通路４２４、４２６および４２８にわたる流体の経路のインピーダンスの少なくとも５倍のレベルになるように寸法決めされる。一実装形態では、基材５２２は、十分な誘電特性を有する材料から形成され、基材５２２を通る経路のインピーダンスが、通路４２４、４２６および４２８にわたる流体の経路のインピーダンスの少なくとも１０倍のレベルになるように寸法決めされる。一実装形態では、基材５２２は、少なくとも１０，０００オームセンチメートルのインピーダンスを有する材料から形成される。一実装形態では、基材５２２は、窒化ケイ素、二酸化ケイ素またはガラスなどの材料から形成される。さらに他の実装形態では、基材５２２は、十分なインピーダンスを有する他の材料から形成されてもよい。基材５２２によって提供される高インピーダンスのために、誘電体層４２３は省略され、ここで電極４４０は、溝４５２の側面に沿った材料基材５２２上に直接形成される。一実装形態では、電極４４０は、通路の床に堆積させることなく、または最小限の堆積にて、通路４２４、４２６および４２８の側面に導電性材料を堆積する指向性スパッタリングまたは角度付きスパッタリングを使用して形成される。さらに他の実装形態では、電極４４０を形成する導電性材料は、通路４２４、４２６、および４２８の床に堆積されてもよく、ここで通路の床の材料はその後除去される。通路４２４、４２６、および４２８は、上述のカバー層またはカバーパネル４５０の形成または提供により完成する。

【0061】

図８、１１、および１２は、流体同伴粒子分離器６２０の別の例を示す。図１１は、ライン１１－１１に沿った分離器６２０の断面図である。図１２は、ライン１２－１２に沿った断面図である。分離器６２０は、分離器６２０が基材６２２を含み、さらに床層６５０を含むことを除いて、上述の分離器５２０と同様である。分離器５２０の構成要素に対応する分離器６２０の残りの構成要素には、同様の番号が付けられている。

【0062】

基材６２２は、基材６２２内に延びて、通路４２４、４２６、および４２８を少なくとも部分的に画定する溝４５２を有する代わりを除いて、基材５２２と同様であり、基材６２２は、基材６２２を完全に通って延びるスロット６２３を通じる一連の接続および分岐を有する。一実装形態において、スロット６２３は、基材６２２上で実行されるエッチング、アブレーション、または切断などの材料除去プロセスによって基材６２２を通して形成される。他の実装形態では、基材６２２の成形または付加製造／プリント中にスロット６２３を形成することができる。基材６２２は、通路４２４、４２６、および４２８の床を形成しないため、基材６２２は、基材５２２のインピーダンスよりも小さいインピーダンスを有する、より幅広い種類または範囲の材料から形成される。

【0063】

床層６５０は、カバー層４５０の反対側の基材６２２に接合された層またはパネルを含む。カバー層４５０と同様に、床層６５０は、そのような通路４２４、４２６、４２８に通じて方向づけられる流体粒子のストリームのインピーダンスよりも大きいインピーダンスを有し、電極４４０によって生成された電界は、床層６５０によりもたらされた床を通じるというよりは、流体粒子のストリームを通じて通過することになる。一実装形態では、床層６５０は、少なくとも１０，０００オームセンチメートルのインピーダンスを有する材料から形成される。一実装形態では、床層６５０は、ガラス、窒化ケイ素または二酸化ケイ素などの材料から形成される。さらに他の実装形態では、床層６５０は、十分なインピーダンスを有する他の材料から形成されてもよい。

【0064】

一実装形態では、チャネル４２４、４２６、および４２８が基材６２２を通して形成された後、および電極４４０がスロット６２３の側面に沿って形成された後に、床層６５０は、基材６２２に積層または結合される。さらに他の実装形態では、基材６２２は、基材６２２内にスロット６２３を形成する前に床層６５０上に形成される。通路４２４、４２６、および４２８は、上述のカバー層またはカバーパネル４５０の形成または提供により完成する。

【0065】

図１３から図１５は、流体同伴粒子分離器７２０の別の例を示している。分離器７２０は、分離器７２０が電極４４０も形成する基材７２２を含むことを除いて、分離器６２０と同様である。図１３は、分離器７２０の上面図である。図１４は、図１３のライン１４－１４に沿った分離器７２０の一例の断面図である。図１５は、図１３のライン１５－１５に沿った断面図である。図１３から図１５に示される例では、通路４２４、４２６、および４２８は、基材７２２を完全に通じるように延びるチャネルによって形成されており、ここで基材７２２は、電極４４０も形成する導電性材料のフィルムまたは層を含む。図１３に示すように、異なる電極４４０は、窒化ケイ素などの非導電性または絶縁材料７２７で満たされた基材７２２のギャップまたは開口部７２５によって互いに分離されている。他の実装形態では、異なる電極４４０は、材料のないギャップまたは開口部７２５によって互いに分離されてもよい。カバー層４５０および床層６５０（上述）は、それらの間に基材７２２を挟み、通路４２４、４２６および４２８を形成する。

【0066】

図１６は、流体同伴粒子分離器を形成するための例示的な方法８００のフロー図である。ブロック８０２で示されるように、入口通路、入口通路から分岐する第１の分離通路、および入口通路から分岐する第２の分離通路が形成される。ブロック８０４で示されるように、電極が、第１の分離通路および第２の分離通路の側面に沿って形成される。ブロック８０６で示されるように、第１の分離通路および第２の分離通路の対向する側面の電極は、互いに電気的に絶縁されている。方法８００は、上述の粒子分離器４２０、５２０、６２０および７２０のいずれかを形成するために利用され得る。

【0067】

図１７および図１８は、流体同伴粒子分離器８２０の別の例を示している。図１７は、粒子分離器８２０の上面斜視図である。図１８は、粒子分離器８２０の上面図である。粒子分離器８２０は、基材８２２、誘電体層８２３、床に関する入口通路、第１の分離通路８２６、８２８、第２の分離通路８３６、８３８、電極８４０Ａ、８４０Ｂおよび８４０Ｃ、粒子フォーカサ８４４、およびカバー層８５０を含む。基材８２２は、通路８２４、８２６、８２８、８３６および８３８を部分的に形成する、そこに形成された一連の接続された分岐溝８５２を有する材料の少なくとも１つの層を含む。一実装形態において、溝８５２は、基材８２２を形成する層材料のインプリントまたは成形によって形成される。別の実装形態では、溝８５２は、基材８２２を形成する材料の層（単数または複数）上で実行される切断、アブレーション、エッチングまたは他の材料除去プロセスによって形成される。別の実装形態では、溝８５２は、下にあるベース層またはプラットフォーム上で実行されるプリントまたは付加製造プロセスなどの選択的堆積によって形成される。

【0068】

図示の例では、基材８２２は、そのような通路２４、２６、２８を通るよう方向づけられた流体粒子のストリームのインピーダンスよりも小さいか、または不十分に大きいインピーダンスを有する材料を含む。一実装形態では、基材８２２は、１０，０００オームセンチメートル未満のインピーダンスを有する材料を含む。一実装形態では、基材８２２は、１０，０００オームセンチメートル未満のインピーダンスを有するシリケン材料を含む。

【0069】

誘電体層８２３は、溝８５２の床および対向する側壁上に形成または被覆する材料の層を含む。誘電体層８２３は、材料から形成され、電界が基材８２２を通過するというよりも、通路８２４、８２６、８２８、８３６、８３８内の流体を通りわたって通過するような十分な厚さを有する。一実装形態では、誘電体層８２３は、十分な誘電特性を有する材料から形成され、層５２３を通る経路のインピーダンスが、通路８２４、８２６、８２８、８３６および８３８にわたる流体の経路のインピーダンスの少なくとも５倍のレベルになるように寸法決めされる。一実装形態では、層５２３は、十分な誘電特性を有する材料から形成され、層８２３を通る経路のインピーダンスが、通路８２４、８２６、８２８、８３６および８３８にわたる流体の経路のインピーダンスの少なくとも１０倍のレベルになるように寸法決めされる。一実装形態では、層８２３は、少なくとも１０，０００オームセンチメートルのインピーダンスを有する材料から形成される。一実装形態では、層８２３は、窒化ケイ素または二酸化ケイ素などの材料から形成される。さらに他の実装形態では、層８２３は、十分なインピーダンスを有する他の材料から形成されてもよい。

【0070】

電極８４０は、通路８２４、８２６、８２８、８３６および８３８にわたって電界を生成するために提供される。電極８４０は、通路８２４、８２６、８２８、８３６、および８３８と同じ平面内に延びる電界を生成するように単一の平面内に延びる。分離通路、電界および誘電泳動力が単一の平面に延びるため、粒子の分離はより予測可能であり、混乱が少なく、より信頼性の高い結果をもたらす。

【0071】

図示の例では、電極８４０Ａは通路８２４および８２８に沿って延びている。電極８４０Ｂは、通路８２４および８２８に沿って延びている。電極８４０Ｃは、通路８２６および８２８に沿って延びている。理解されるように、電極８４０のそれぞれは、連続電極であってもよく、または接地または交流周波数電流源などの電流源に接続された複数の別個の要素によって形成されてもよい。

【0072】

一実装形態では、電極８４０Ａおよび８４０Ｂは、分離される標的粒子の直径の少なくとも１０倍の距離による入口通路８２４を横切る距離により分離される。同様に、電極８４０Ａおよび８４０Ｃならびに電極８４０Ｂおよび８４０Ｃも、分離される標的粒子の直径の少なくとも１０倍の距離による各々の分離通路８２８および８２６を横切る距離により分離される。この分離は、粒子の存在によってグローバル電界が大きく歪まない可能性を低減し、流れ内のすべての粒子で同様の分離が実行される。

【0073】

一実装形態では、電極８４０は、そのような溝８５２の床にわたって延びることなく、溝８５２の側面上の誘電体層８２３上に形成される。一実装形態では、電極８４０は、指向性スパッタリングまたは角度付きスパッタリングを使用して形成され、これは、そのような溝８５２の床に堆積することなく、または最小限の堆積にて、溝８５２の側面の層８２３上に導電性材料を堆積する。さらに他の実装形態では、電極８４０を形成する導電性材料は、溝８５２の床上の層８２３上に堆積されてもよく、ここで溝８５２の床上の層８２３上に堆積された導電性材料は、その後、電極８４０を形成するために側面に導電性材料を残しながら除去される。

【0074】

他の実装形態では、電極４４０により生成される電界が、基材８２２を通過するというよりも、流体粒子のストリームを通って通過することになるように、基材８２２は、そのような通路２４、２６、２８を通るよう方向づけられた流体粒子のストリームのインピーダンスより大きいインピーダンスを有する材料から形成されてもよい。一実装形態では、基材８２２は、少なくとも１０，０００オームセンチメートルのインピーダンスを有する材料から形成されてもよい。一実装形態では、基材８２２は、ガラス、窒化ケイ素または二酸化ケイ素などの材料から形成される。さらに他の実装形態では、基材８２２は、十分なインピーダンスを有する他の材料から形成されてもよい。そのような実装形態では、誘電体層８２３は省略されてもよく、ここで基材８２２は、通路８２４、８６、８２８、８３６、８３８の床を形成し、そしてここで電極８４０は、溝８５２の側面上に直接、基材８２２上に直接形成される。

【0075】

さらに他の実装形態では、粒子分離器８２０は構造を有してもよく、また粒子分離器６２０または７２０に関して上述したものと同様の方法で形成されてもよい。そのような実装形態では、通路８２４、８６、８２８、８３６、８３８は、溝ではなく、基材内の貫通スロットによって画定または形成され、ここで床層は基材の下にあり、通路の床を形成する。

【0076】

粒子フォーカサ８４４は、粒子フォーカサ８４４が流体力学的フォーカサとして具体的に示されていることを除いて、上述の粒子フォーカサ２２２と同様である。粒子フォーカサ８４４は、シース流路８７０、シース流路８７２、および粒子流路８７４を含む。シース流通路８７０、８７２は、粒子流通路８７４の両側に延び、血液流などの流体同伴粒子の供給を間に挟む緩衝液の直接層流またはストリームは、流体同伴粒子のストリームを層流へと集める。流体同伴粒子のストリームの層流は、ストリームからの異なる粒子のその後の分離に対するより優れた制御を促進する。通路８７０、８７２および８７４のそれぞれは、入口通路８２４で収束する。

【0077】

他の実装形態では、粒子フォーカサ８４４は、他の種類の粒子フォーカサを備えてもよい。例えば、粒子フォーカサ８４４は、自由流動負誘電泳動粒子フォーカサまたは自由流動等速電気泳動粒子フォーカサを備えてもよい。いくつかの実装形態では、粒子フォーカサ８４４は省略されてもよい。

【0078】

作動中、分離される粒子を含む流体のストリームは、入口８７５を介して通路８７４に供給される。同様に、緩衝液のストリームは、それぞれインプット８７１および８７３を介して通路８７８７２に供給される。緩衝溶液のストリームは、分離される部分を含む流体のストリームを挟むシート流を形成し、入口通路８２４を通る層流を形成する。一実装形態では、シース通路８７０、８７２のそれぞれの緩衝液は、分離される細胞パーサーを含む溶液が供給される速度よりも大きい速度で供給される。一実装形態では、緩衝溶液は毎分０．２ｍＬの速度で供給され、一方で分離される部分を含む溶液ストリームは毎分０．２ｍＬの速度で供給される。

【0079】

電極８４０Ａおよび８４０Ｂは、入口通路８２４にわたって電界を形成する異なる電位である。一実装形態では、電極８４０Ａは接地にあり、一方で電極８４０Ｂは正電荷である。電界は誘電泳動力を生成する。図１９は、生成された誘電泳動力を示す図である。サイズと電気分極率の違いにより、入口通路８２４内で第１のサイズおよび／または電気分極率を有する粒子の第１の画分または部分は、分離通路８２８に向かうようにされ、一方で第１の画分の粒子とは異なる第２のサイズおよび／または第２の電気分極率を有する粒子の第２の画分または部分は、分離通路８２６に向かうようにされる。分離通路８２８に向かわされた分離された粒子は、出口８８０に方向づけられる。

【0080】

分離通路８２６に方向づけられた分離された粒子は、電極８４０Ｂおよび８４０Ｃによって生成された電界によって生成された誘電泳動力によってさらに分離される。一実装形態では、電極８４０Ｂに正電荷が加えられると、電極８４０Ｃは負電荷になる。サイズと電気分極率の違いにより、分離通路８２６内の第１のサイズおよび／または電気分極率を有する粒子の第１の画分または部分は、分離通路８３６に向かうようにされ、一方で第１の画分の粒子とは異なる第２のサイズおよび／または第２の電気分極率を有する粒子の第２の画分または部分は、分離通路８３８に向かうようにされる。分離通路８３６に向かわされた分離された粒子は、出口８８２に方向づけられる。分離通路８３８にバイアスされた分離された粒子は、出口８８４に方向づけられる。

【0081】

図２０は、流体同伴粒子分離器９２０の別の例の上面図である。分離器９２０が、入口通路８２４から延びる３つの分離通路、通路９２６、９２８および９３０を含み、さらに異なる電荷を読む４つの電極、電極９４０Ａ、９４０Ｂ、９４０Ｃおよび９４０Ｃ（まとめて電極９４０と称する）をさらに含むことを除き、分離器９２０は分離器８２０と同様である。通路８２４、９２６、９２８および９３０は、通路８２４、８２６および８２８と同様の構造を有する。１つの制限では、そのような通路８２４、９２６、９２８および９３０は、基材に形成された溝によって形成され、ここで溝の床および側面は、上述の誘電体層４２３と同様の誘電体層で被覆されるか、さもなければ覆われ、そしてここで電極９４０は、通路の床にわたって延びることなく通路の側壁に形成される。基材が十分なインピーダンスを有する他の実装形態では、上述の基材５２２のインピーダンスと同様に、基材と電極との間の誘電体層は省略されてもよい。

【0082】

動作中、分離される粒子を含む溶液のストリームは、粒子フォーカサ８４４によって集められ、入口通路８２４に方向づけられる。電極９４０Ａおよび９４０Ｂによって通路８２４にわたり生成される電界は、異なるサイズの粒子または異なる電気分極率を有する粒子と異なるように相互作用して、そのような粒子を分離通路９２６、分離通路９２８または分離通路９３０のいずれかに方向づける誘電泳動力を形成する。いくつかの実装形態では、そのような分離通路は、上記の追加の第２の分離通路および電極を含み得る。

【0083】

図２１は、流体同伴粒子分離器１０２０の別の例の上面図である。分離器１０２０は、分離器１０２０がカラムまたはピラー１０８７をさらに含むことを除いて、分離器９２０と同様である。分離器９２０の構成要素に対応する分離器１０２０の残りの構成要素には、同様の番号が付けられている。

【0084】

ピラー１０８７は、通路８２４、９６、９２８および９３０の接合部で延びている。ピラー１０８７は、入口通路８２４から分離通路９３０までの、接合部を直接横切る溶液または粒子の流れを妨げる。ピラー１０８７は、粒子のサイズまたは電気分極率ではなく、入口通路８２４を通って流れる溶液の運動量により、粒子が分離通路９３０に入る可能性を低減する。

【0085】

本開示は、実装例を参照して説明されたが、当業者であれば、請求される主題の精神および範囲から逸脱することなく、形態および詳細に変更を加えることができることを認識するであろう。例えば、１つ以上の利点を提供する１つ以上の特徴を含むものとして異なる実装例が説明されていることがあるが、記載された特徴は、記載された実装例または他の代替実装例において、互いに交換され得るか、または代替的に互いに組み合わされ得ることが企図される。本開示の技術は比較的複雑であるため、技術のすべての変更が予見できるわけではない。例示的な実装を参照して説明され、添付の特許請求の範囲に記載される本開示は、可能な限り広くなることを明白に意図している。例えば、特に明記しない限り、単一の特定の要素を引用する請求項は、複数のそのような特定の要素も包含する。特許請求の範囲における用語「第１」、「第２」、「第３」などは、異なる要素を単に区別するものであり、特に明記しない限り、本開示における特定の順序または要素の特定の番号に特に関連付けられるべきではない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】