特許 6992892 グラジエント送液の濃度正確性を測定する方法及びその方法を実行する機能を有する液体クロマトグラフ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2021-12-13

(45)【発行日】2022-01-13

(54)【発明の名称】グラジエント送液の濃度正確性を測定する方法及びその方法を実行する機能を有する液体クロマトグラフ

(51)【国際特許分類】

   G01N 30/34 20060101AFI20220105BHJP

   G01N 30/26 20060101ALI20220105BHJP

   G01N 30/86 20060101ALI20220105BHJP

【ＦＩ】

G01N30/34 Z

G01N30/26 A

G01N30/86 J

【請求項の数】 4

(21)【出願番号】P 2020523499

(86)(22)【出願日】2018-12-19

(86)【国際出願番号】 JP2018046695

(87)【国際公開番号】W WO2019234955

(87)【国際公開日】2019-12-12

【審査請求日】2020-11-16

(31)【優先権主張番号】P 2018109120

(32)【優先日】2018-06-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000001993

【氏名又は名称】株式会社島津製作所

(74)【代理人】

【識別番号】100108523

【弁理士】

【氏名又は名称】中川 雅博

(74)【代理人】

【識別番号】100098305

【弁理士】

【氏名又は名称】福島 祥人

(74)【代理人】

【識別番号】100125704

【弁理士】

【氏名又は名称】坂根 剛

(74)【代理人】

【識別番号】100187931

【弁理士】

【氏名又は名称】澤村 英幸

(72)【発明者】

【氏名】渡辺 覚

【審査官】高田 亜希

(56)【参考文献】

【文献】特開２００６－２３４５２４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００６－３１３０９３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００７－１０１５６４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１３－５１８２８６（ＪＰ，Ａ）

【文献】MAGEE H. Megan et al.，“Measure Your Gradient”: A new way to measure gradients in high performance liquid chromatography，Journal of Chromatography A，2014年，1369，P73-82

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ３０／００－３０／９６

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

第１溶媒と第２溶媒の混合液からなる移動相を前記移動相中における前記第２溶媒の濃度を所定の設定値に調整して送液することができる送液部を有するとともに前記送液部からの移動相が流れる分析流路上に分離カラム及び検出器が設けられている液体クロマトグラフィー分析システムにおける、前記送液部によるグラジエント送液の濃度正確性を測定するための方法であって、
前記第１溶媒として、前記検出器による検出対象成分を含まない有機溶媒含有液を用い、前記第２溶媒として、前記検出対象成分を含み、当該検出対象成分を前記分離カラムに実質的に保持させない有機溶媒濃度に調整された有機溶媒含有液を用い、前記分析流路上に前記分離カラムが設けられている状態で移動相中における前記第２溶媒の濃度の設定値を時間的に変化させながら前記移動相を送液し、前記検出器の検出信号に基づいて各設定値で送液された移動相中における前記第２溶媒の実際濃度を求め、前記グラジエント送液の濃度正確性を測定する方法。

【請求項2】

前記第１溶媒は水とメタノールの混合液であり、前記第２溶媒はカフェインを含有する水とメタノールの混合液である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

第１溶媒と第２溶媒の混合液からなる移動相を前記移動相中における前記第２溶媒の濃度を所定の設定値に調整して送液することができる送液部と、
前記送液部からの移動相が流れる分析流路と、
前記分析流路上に設けられ、前記分析流路中に注入された試料を分離するための分離カラムと、
前記分析流路上における前記分離カラムよりも下流に設けられ、前記分離カラムにおいて分離した試料成分を検出するための検出器と、
前記第１溶媒として前記検出器による検出対象成分を含まない有機溶媒含有液を用い、前記第２溶媒として前記検出対象成分を含み、当該検出対象成分を前記分離カラムに実質的に保持させない有機溶媒含有液を用い、移動相中における前記第２溶媒の濃度の設定値を時間的に変化させながら前記移動相を送液し、前記検出器の検出信号に基づいて各設定値で送液された移動相中における前記第２溶媒の実際濃度を求め、グラジエント送液の濃度正確性を測定するように構成されたグラジエント正確性測定部と、を備えている液体クロマトグラフィー分析システム。

【請求項4】

前記第１溶媒は水とメタノールの混合液であり、前記第２溶媒はカフェインを含有する水とメタノールの混合液である、請求項３に記載の液体クロマトグラフィー分析システム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＬＣシステム（液体クロマトグラフィー分析システム）の性能評価の項目の１つであるグラジエント送液の正確性を測定するための方法と、その方法を実行する機能を有するＬＣシステムに関するものである。

【背景技術】

【0002】

ＬＣシステムの性能を評価するための測定項目として、ノイズ・ドリフト測定やグラジエント送液の濃度正確性測定、再現性測定などがある。

【0003】

ノイズ・ドリフト測定では、移動相を一定流量で送液し、そのときの検出器信号のノイズ値とドリフト値をそれぞれ測定する。

【0004】

グラジエント送液の濃度正確性測定では、水とカフェイン水溶液の２種類の液を移動相溶媒として用い、移動相中におけるカフェイン水溶液の濃度の設定値を時間的に変化させながら送液し、各設定値での送液時のカフェインの実際濃度を検出器信号に基づいて測定する。求めた実際濃度と設定値との差分が所定値以下（例えば、差分の設定値に対する割合が１％以下）であれば、グラジエント送液の濃度が正確であると評価することができる。

【0005】

再現性測定では、テスト試料を用いた分析を複数回実施し、ピーク面積の変動率を測定する。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

グラジエント送液の濃度正確性測定では、分析流路上に分離カラムが設けられていると、カフェインが分離カラムに保持されて濃縮されてしまい、送液部によるグラジエント送液の正確性を正しく評価することができない。そのため、グラジエント送液の濃度正確性測定を実施する際には、分析流路から分離カラムを取り外した状態にする必要がある。

【0007】

一方で、ノイズ・ドリフト測定や再現性測定は分析流路上に分離カラムを設けた状態で実施される。したがって、ＬＣシステムの性能評価を実施する際に、グラジエント送液の濃度正確性測定を実行するときにだけ、作業者が分離カラムを分析流路から取り外さなければならず、すべての測定項目を連続的に実行することができなかった。

【0008】

そこで、本発明は、ＬＣシステムの性能評価のための複数の測定項目を連続して実行できるようにすることを目的とするものである。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明に係る方法は、第１溶媒と第２溶媒の混合液からなる移動相を前記移動相中における前記第２溶媒の濃度を所定の設定値に調整して送液することができる送液部を有するとともに前記送液部からの移動相が流れる分析流路上に分離カラム及び検出器が設けられているＬＣシステムにおける、前記送液部による前記グラジエント送液の濃度正確性を測定するための方法である。当該方法では、前記第１溶媒として、前記検出器による検出対象成分を含まない有機溶媒含有液を用い、前記第２溶媒として、前記検出対象成分を含み、当該検出対象成分を前記分離カラムに実質的に保持させない有機溶媒濃度に調整された有機溶媒含有液を用いる。そして、前記分析流路上に前記分離カラムが設けられている状態で移動相中における前記第２溶媒の濃度の設定値を時間的に変化させながら前記移動相を送液し、前記検出器の検出信号に基づいて各設定値で送液された移動相中における前記第２溶媒の実際濃度を求め、前記グラジエント送液の濃度正確性を測定する。

【0010】

すなわち、本発明に係る方法では、送液部によって送液される第１溶媒と第２溶媒のいずれにも有機溶媒を含有する有機溶媒含有液を用い、分析流路を流れる移動相中の第２溶媒濃度がいかなる場合であっても、検出対象成分が分離カラムに実質的に保持されないようにする。これにより、分析流路上に分離カラムが設けられている状態でも、分離カラムによる検出対象成分の保持の影響を受けずにグラジエント送液の濃度正確性測定を実行することが可能である。したがって、本発明の方法を適用したグラジエント送液の濃度正確性測定は、ドリフト・ノイズ測定や再現性測定といった測定項目と連続して実行することができる。

【0011】

検出対象成分の一例はカフェインであり、有機溶媒の一例はメタノールである。すなわち、前記第１溶媒として水とメタノールの混合液を用いることができ、前記第２溶媒としてカフェインを含有する水とメタノールの混合液を用いることができる。

【0012】

本発明に係るＬＣシステムは、第１溶媒と第２溶媒の混合液からなる移動相を前記移動相中における前記第２溶媒の濃度を所定の設定値に調整して送液することができる送液部と、前記送液部からの移動相が流れる分析流路と、前記分析流路上に設けられ、前記分析流路中に注入された試料を分離するための分離カラムと、前記分析流路上における前記分離カラムよりも下流に設けられ、前記分離カラムにおいて分離した試料成分を検出するための検出器と、を備えたものであって、上述のグラジエント送液の濃度正確性の測定方法を実行する機能を備えるものである。すなわち、本発明に係る液体クロマトグラフは、前記第１溶媒として前記検出器による検出対象成分を含まない有機溶媒含有液を用い、前記第２溶媒として前記検出対象成分を含む有機溶媒含有液を用い、移動相中における前記第２溶媒の濃度の設定値を時間的に変化させながら前記移動相を送液し、前記検出器の検出信号に基づいて各設定値で送液された移動相中における前記第２溶媒の実際濃度を求め、前記グラジエント送液の濃度正確性を測定するように構成されたグラジエント正確性測定部を備えている。

【発明の効果】

【0013】

本発明に係る方法では、検出対象成分が分離カラムに実質的に保持されないように、第１溶媒と第２溶媒のいずれにも有機溶媒を含有する有機溶媒含有液を用いているので、分析流路上に分離カラムが設けられている状態でも、分離カラムによる検出対象成分の保持の影響を受けずにグラジエント送液の濃度正確性の測定を実行することができる。これにより、グラジエント送液の濃度正確性の測定をドリフト・ノイズ測定や再現性測定といったＬＣシステムの性能評価のための測定項目と連続して行なうことができる。

【0014】

本発明に係るＬＣシステムは、上述のグラジエント送液の正確性の測定方法を実行する機能を備えているので、分析流路に対する分離カラムの着脱作業を行なうことなく、ＬＣシステムの性能評価のための複数の測定項目を連続的に実行することができる。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】ＬＣシステムの一実施例を概略的に示す流路構成図である。

【図2】同実施例において実行されたグラジエント送液の正確性の測定結果を示すグラフである。

【図3】ＬＣシステムの性能評価の一連の流れの一例を説明するためのフローチャートである。

【発明を実施するための形態】

【0016】

以下に、本発明に係るグラジエント送液の正確性の測定方法及びその機能を備えるＬＣシステムの一実施例について説明する。

【0017】

図１に示されているように、ＬＣシステムは、分析流路２、送液部４、オートサンプラ６、分離カラム８、検出器１０及び演算制御装置１２を備えている。

【0018】

送液部４は、第１溶媒を送液するための送液ポンプ１４と、第２溶媒を送液するための送液ポンプ１６と、送液ポンプ１４、１６によって送液される第１溶媒と第２溶媒を混合するためのミキサ１８と、を備えている。ミキサ１８で混合された第１溶媒と第２溶媒の混合液が移動相として分析流路２を流れる。送液部４は、ミキサ１８で混合される第１溶媒と第２溶媒からなる移動相中の第２溶媒の濃度が、演算制御装置１２から与えられる設定値になるように送液ポンプ１４、１６の動作速度を調整する機能を有する。

【0019】

オートサンプラ６、分離カラム８及び検出器１０は、送液部４からの移動相が流れる分析流路２上において上流側からその順に設けられている。オートサンプラ６は分析流路２中に試料を注入するためのものである。分離カラム８は、オートサンプラ６によって分析流路２中に注入された試料を分離するためのものである。分離カラム８はカラムオーブン２０内に収容されている。カラムオーブン２０は分離カラム８の温度を設定された温度に制御するためのものである。検出器１０は分離カラム８において分離した試料成分を検出するためのものである。

【0020】

演算制御装置１２は、送液部４、オートサンプラ６及びカラムオーブン２０の動作制御を行なう機能を有するとともに、検出器１０で得られる検出信号に基づいて種々の演算やクロマトグラムの作成を行なう機能を有する。演算制御装置１２はさらに、機能としてグラジエント正確性測定部２２を備えている。演算制御装置１２は専用のコンピュータ又は汎用のパーソナルコンピュータによって実現される。グラジエント正確性測定部２２は演算制御装置１２に設けられている演算素子が所定のプログラムを実行することによって得られる機能である。

【0021】

グラジエント正確性測定部２２は、当該ＬＣシステムの性能評価のための測定項目の１つであるグラジエント送液の濃度正確性の測定を実行するように構成されている。グラジエント送液の濃度正確性の測定では、メタノールなどの有機溶媒を含有する有機溶媒含有液を第１溶媒として用い、カフェインなどの検出器１０による検出対象成分を含む有機溶媒含有液を第２溶媒として用いて、予め設定されたタイムプログラムにしたがって移動相中における第２溶媒の濃度の設定値を時間的に変化させ、各設定値で移動相が送液されているときの移動相中における第２溶媒の実際濃度を検出器１０からの検出信号に基づいて求める。

【0022】

第２溶媒の実際濃度は、第２溶媒濃度の設定値が０（％）のときの検出信号強度をＳ_（０）、第２溶媒濃度の設定値が１００（％）のときの検出信号強度をＳ_{（１００）}、第２溶媒濃度の設定値がｋ（％）のときの検出信号強度をＳ_（ｋ）として、次式により求めることができる。
（Ｓ_（ｋ）－Ｓ_（０））／（Ｓ_{（１００）}－（Ｓ_（０））

【0023】

上記式により求めた実際濃度と設定値との差分が基準値（例えば設定値の１％）以下であれば、送液部４による移動相のその設定値に対する濃度調整が正確であると評価される。

【0024】

図２は、グラジエント送液の濃度正確性の測定の際に得られたクロマトグラムの一例である。この測定では、水とメタノールの混合液（水とメタノールの体積比率＝７：３）を第１溶媒として用い、カフェインが添加された水とメタノールの混合液（水とメタノールの体積比率＝７：３、カフェイン濃度＝２０ｐｐｍ）を第２溶媒として用いた。また、分離カラム８としてＯＤＳカラムを用い、吸光度検出器１０にて波長２７２ｎｍの吸光度を測定した。送液部４に対する移動相中の第２溶媒濃度の設定値のタイムプログラムは以下のとおりである。
時間（分） 第２溶媒濃度の設定値（％）
０～１０ ０
１０～２０ １０
２０～３０ ５０
３０～４０ ９０
４０～５０ １００
５０～６０ ０

【0025】

第２溶媒濃度の各設定値とそのときの信号強度、その信号強度に基づいて求められる第２溶媒濃度の実際濃度は以下のとおりである。
設定値（％） 信号強度（μＶ） 実際濃度（％）
０ １ －
１０ １０７４０２ １０．０９
５０ ５３０６７５ ４９．８８
９０ ９５７９９９ ９０．０４
１００ １０６４０２２ １００

【0026】

上記の測定結果をみれば、第２溶媒濃度の設定値が１０％、５０％、９０％のときの実際濃度はいずれも設定値±１％の範囲内にあり、送液部４による移動相のグラジエント濃度の調整が正確であると評価することができる。

【0027】

このように、第１溶媒及び第２溶媒のいずれにも有機溶媒を含有させ、検出器１０による検出対象成分（カフェイン）が分離カラム８によって実質的に保持されないようにすることで、分析流路２上に分離カラム８が設けられている状態でも、グラジエント送液の濃度正確性の測定を正確に実施できることがわかる。分析流路２上に分離カラム８が設けられている状態でグラジエント送液の濃度正確性の測定を行なうことができるため、図３に示されているように、ＬＣシステムの性能評価の各測定項目、すなわち、ノイズ・ドリフト測定、グラジエント送液の濃度正確性測定及び再現性測定を連続して行なうことができる。

【0028】

なお、上記実施例では、送液部４として高圧グラジエント方式のものを用いているが、本発明は低圧グラジエント方式の送液部を備えるＬＣシステムにおいても同様に適用することができる。

【符号の説明】

【0029】

２ 分析流路
４ 送液部
６ オートサンプラ
８ 分離カラム
１０ 検出器
１２ 演算制御装置
１４，１６ 送液ポンプ
１８ ミキサ
２０ カラムオーブン
２２ グラジエント正確性測定部

【図1】

【図2】

【図3】