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▶ リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2021-12-13
(45)【発行日】2022-02-04
(54)【発明の名称】抗ジカ（ＺＩＫＡ）ウイルス抗体およびその使用方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20220128BHJP
C07K 16/10 20060101ALI20220128BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220128BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20220128BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20220128BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220128BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220128BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20220128BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20220128BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220128BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20220128BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20220128BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20220128BHJP
A61P 17/02 20060101ALI20220128BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20220128BHJP
C12P 21/08 20060101ALN20220128BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13 ZNA
C07K16/10
C12N15/63 Z
C12N1/19
C12N1/15
C12N5/10
C12N1/21
A61K39/395 D
A61K39/395 S
A61P31/14
A61P43/00 121
A61P29/00
A61P21/00
A61P19/02
A61P17/02
A61K45/00
C12P21/08
【請求項の数】
16
(21)【出願番号】P 2019502258
(86)(22)【出願日】2017-07-17
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2019-10-10
(86)【国際出願番号】 US2017042447
(87)【国際公開番号】W WO2018017497
(87)【国際公開日】2018-01-25
【審査請求日】2020-07-10
(31)【優先権主張番号】62/474,753
(32)【優先日】2017-03-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/363,546
(32)【優先日】2016-07-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】597160510
【氏名又は名称】リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＲＥＧＥＮＥＲＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】100127926
【弁理士】
【氏名又は名称】結田 純次
(74)【代理人】
【識別番号】100140132
【弁理士】
【氏名又は名称】竹林 則幸
(72)【発明者】
【氏名】クリストス・カイラトゥース
(72)【発明者】
【氏名】ウィリアム・オルソン
(72)【発明者】
【氏名】ピーター・メイスン
【審査官】西垣 歩美
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１０－５１８０４７（ＪＰ，Ａ）
【文献】BARBA‐SPAETH, Giovanna，Nature，2016年06月23日，Vol.536 ，Page.48-53
【文献】PRIYAMVADA Lalita，PNAS，2016年07月12日，Vol.113,No.28 ，Page.7852-7857
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ジカウイルス（ＺＩＫＶ）エンベロープ糖タンパク質（Ｅ）へ特異的に結合する単離された組換えモノクローナル抗体であって、前記抗体は、それぞれ配列番号１１６、１１８および１２０のアミノ酸配列を含む３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲｓ）、ＨＣＤＲ１、ＨＣＲ２およびＨＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、並びに、それぞれ配列番号１２４、１２６および１２８のアミノ酸配列を含む３つの軽鎖ＣＤＲｓ、ＬＣＤＲ１、ＬＣＲ２およびＬＣＤＲ３を含む、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含み、また、配列番号３５７または配列番号３５８のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む、単離された組換えモノクローナル抗体。
【請求項2】
ＨＣＶＲが配列番号１１４のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離された組換えモノクローナル抗体。
【請求項3】
ＬＣＶＲが配列番号１２２のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離された組換えモノクローナル抗体。
【請求項4】
ＨＣＶＲが配列番号１１４のアミノ酸配列を含み、ＬＣＶＲが配列番号１２２のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離された組換えモノクローナル抗体。
【請求項5】
前記抗体が、配列番号３５７のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の単離された組換えモノクローナル抗体。
【請求項6】
前記抗体が、配列番号３５８のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の単離された組換えモノクローナル抗体。
【請求項7】
完全ヒトモノクローナル抗体である、請求項１～６のいずれか１項に記載の単離された組換えモノクローナル抗体。
【請求項8】
請求項１～７のいずれか１項に記載の単離された組換えモノクローナル抗体と、医薬として許容され得る担体または希釈剤と、を含む、医薬組成物。
【請求項9】
ＺＩＫＶエンベロープ糖タンパク質（Ｅ）へ特異的に結合し、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１３０／１３８、１４６／１５４、１６２／１７０、１７８／１８６、１９４／２０２、２１０／２１８、２２６／２３４、２４２／２５０、２５８／２６６、２７４／２８２、２９０／２９８、３０６／３１４、３２２／３３０および３３８／３４６からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、１つ以上の単離された組換えモノクローナル抗体を、さらに含む、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項10】
前記１つ以上の単離されたモノクローナル抗体が、配列番号６６／７４、および２５８／２６６からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項11】
配列番号１１４／１２２のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む第１の組換えモノクローナル抗体、および配列番号２５８／２６６のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む第２の組換えモノクローナル抗体を含む、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項12】
前記１つ以上の単離された組換えモノクローナル抗体が、ＭＲ７６６（ウガンダ１９４７）株、ＰＲＶＡＢＣ５９（プエルトリコ２０１５）株およびＦＬＲ（コロンビア２０１５）株からなる群から選択される１つ以上のＺＩＫＶ株を中和する、請求項８～１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項13】
請求項１～７のいずれか１項に記載の組換えモノクローナル抗体をコードする、単離された核酸分子。
【請求項14】
請求項１３に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項15】
請求項１４に記載のベクターを発現する、単離された宿主細胞。
【請求項16】
ＺＩＫＶ感染の少なくとも１つの症状を予防、治療もしくは寛解させるための、またはＺＩＫＶ感染の少なくとも１つの症状の頻度もしくは重症度を低下させる、請求項１～７のいずれか１項に記載の抗体を含む、または、請求項８～１２のいずれか１項に記載の、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ジカウイルスエンベロープ糖タンパク質へ結合する抗体、これらの抗体を含む医薬組成物およびその使用方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ジカウイルス（ＺＩＫＶ）は、フラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）科フラビウイルス属ファミリーにおけるプラス鎖ＲＮＡ節足動物媒介性ウイルス（アルボウイルス）である（非特許文献１）。ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）という蚊によってヒトへ主として伝播すると考えられていると考えられている。ＺＩＫＶは、蚊による伝播に加えて、性的に（非特許文献２）および垂直に（非特許文献３）伝播し得、または、血液製剤もしくは組織試料を介して伝播し得る。ＺＩＫＶは概して、軽度の疾患を発症させ、大部分の症候性個人において発疹および軽度の熱性疾患を伴う。しかしながら、妊婦がＺＩＫＶに感染した場合、胎児における小頭症（非特許文献４）または他の発達異常（非特許文献５）を発症するリスクが高まる。ＺＩＫＶは、このウイルスに感染した患者のギラン・バレー症候群と関連しているという報告もある（非特許文献６）。加えて、ＺＩＫＶと脳虚血、脊髄炎および髄膜脳炎との関連も報告されている（非特許文献７）。
【0003】
ＺＩＫＶの向性および病原性は、ほとんど知られていない。概して、フラビウイルスは、カプシドタンパク質の複数のコピーと複合体形成した約１１，０００塩基の一本鎖ＲＮＡゲノムを含んでおり、すべて脂質膜に固定されたエンベロープ糖タンパク質（Ｅ）（約５００アミノ酸）、膜タンパク質（Ｍ）（約７５アミノ酸）または前駆体膜タンパク質（ｐｒＭ）（約１６５アミノ酸）のそれぞれ１８０コピーからなる正二十面体のシェルに囲まれた、エンベロープウイルスである。このゲノムはまた、複製および集合に関与する７つの非構造タンパク質をコードする（非特許文献８）。
【0004】
ジカウイルスの生活環の間、フラビウイルスビリオンは、未成熟（非感染性）状態および成熟（感染性）状態で存在する（非特許文献９）。
【0005】
ＺＩＫＶエンベロープ糖タンパク質（Ｅ）は、防御抗体のための標的であり得るが、今日まで、ＺＩＫＶエンベロープ糖タンパク質に特異的な抗体は臨床試験中ではない。したがって、ＺＩＫＶ感染を予防または治療するために使用することのできる新たな抗体を識別する必要性が、当該技術分野において依然として存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【文献】Ｇｕｂｌｅｒ，ＤＪ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ：Ｋｎｉｐｅ，ＤＭ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第５版，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，２００７：１１５５－２２７
【文献】Ｆｏｙ，ＢＤ，ｅｔ ａｌ．，（２０１１），Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７：８８０－８８２
【文献】Ｍｌａｋａｒ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（２０１６），Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３７４：９５１－９５８
【文献】Ｓｃｈｕｌｅｒ－Ｆａｃｃｉｎｉ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，（２０１６），ＭＭＷＲ Ｍｏｒｂ．Ｍｏｒｔａｌ．Ｗｋｌｙ Ｒｅｐ．６５：５９－６２
【文献】Ｂｒａｓｉｌ ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，Ｍａｒｃｈ ４
【文献】Ｃａｏ－Ｌｏｒｍｅａｕ，ＶＭ，ｅｔ ａｌ．，（２０１６），Ｌａｎｃｅｔ，Ａｐｒ ９；３８７（１００２７）：１５３１－９
【文献】Ｃａｒｔｅａｕｘ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．（２０１６），Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３７４（１６）：１５９５
【文献】Ｓｉｒｏｈｉ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，（２０１６），Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５２：４６７－４７０
【文献】Ｌｉｎｄｅｎｂａｃｈ，ＢＤ，Ｉｎ：Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｋｎｉｐｅ，ＤＭ ａｎｄ Ｈｏｗｌｅｙ，ＰＭ，ｅｄｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｅｄ．６，Ｖｏｌ．１，２０１３，Ｃｈａｐｔｅｒ ２５，ｐｐ．７１２－７４６
【発明の概要】
【0007】
本発明は、ＺＩＫＶ Ｅを結合する抗体およびその抗原結合フラグメントを提供する。本発明の抗体は、ＺＩＫＶの活性を阻害または中和するのに有用である。いくつかの実施形態において、抗体は、宿主細胞へのＺＩＫＶの付着を遮断するために、または宿主細胞膜へのこのウイルスの融合を防止するために有用である。その際、本発明の抗体は宿主細胞へのウイルスの侵入を遮断する。ある特定の実施形態において、抗体は、対象におけるＺＩＫＶ感染の少なくとも１つの症状を予防、治療または寛解させるのに有用である。ある特定の実施形態において、本発明の抗体は、ウイルスを中和することができ、その際、妊婦から胎児へのウイルスが伝播するのを予防し、したがって妊婦の胎児における小頭症（またはその他の発達異常）を予防する。ある特定の実施形態において、抗体は、ＺＩＫＶ感染に罹患しているか、またはその危険性があるか、または伝播するリスクがある対象へ、予防上または治療上投与することができる。ある特定の実施形態において、本発明の少なくとも１つの抗体を含有する組成物は、ワクチンが禁忌である対象、またはワクチンの効能がほとんどない対象、例えば、高齢患者、非常に若い患者、妊娠中の女性患者、ワクチンの任意の何らかの１つ以上の成分にアレルギー性であるかもしれない患者、またはワクチン中の免疫原に対して非応答性であるかもしれない免疫無防備状態の患者である。ある特定の実施形態において、本発明の少なくとも１つの抗体を含有する組成物は、妊娠中の女性、医療スタッフ、入院患者または養護老人ホーム居住者、ＺＩＫＶの爆発的流行を有していることが知られている国へ旅行する個人、またはＺＩＫＶを保有する蚊がいることが知られている国へ旅行する個人、あるいはＺＩＫＶの爆発的流行における他の高リスクの患者へ投与されることができる。ある特定の実施形態において、本発明の少なくとも１つの抗体を含有する組成物は、既にＺＩＫＶへ曝露されてしまった患者へ第１の選択の治療として投与することができる。
【0008】
本発明の抗体は、完全長（例えば、ＩｇＧ１抗体またはＩｇＧ４抗体）であり得、または抗原結合部分（例えばＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントまたはｓｃＦｖフラグメント）のみを含んでいてもよく、機能性に影響するよう、例えば、宿主における持続性を高めるよう、または残存するエフェクター機能を除去するよう修飾されていてもよい（Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：１９２５－１９３３）。ある特定の実施形態において、抗体は二重特異性であってもよい。
【0009】
第１の態様において、本発明は、ＺＩＫＶエンベロープ糖タンパク質（Ｅ）へ特異的に結合する、単離された組換えモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【0010】
一実施形態において、本発明は、ＺＩＫＶをインビトロで１０－９Ｍ以下のＩＣ５０で中和し、ＺＩＫＶ感染動物におけるインビボでの防御作用を示す、ＺＩＫＶおよび／またはＺＩＫＶ Ｅへ特異的に結合する、単離された組換え抗体またはその抗原結合フラグメ
ントを提供する。
ントを提供する。
【0011】
一実施形態において、本発明は、次の特徴：
（ａ）完全ヒトモノクローナル抗体であるか、または
（ｂ）ジカｐｒＭ／Ｅを発現するＶＬＰへ約８０ｐＭ～約１５０ｎＭの範囲のＥＣ５０で結合するか、または
（ｃ）表面プラズモン共鳴アッセイで測定する場合、ＺＩＫＶ Ｅへ１０－７Ｍ未満の解離定数（ＫＤ）で結合するか、または
（ｄ）ｐＨ７．４に対するｐＨ５またはｐＨ６での解離半減期（ｔ１／２）の変化を示しても示さなくてもよい、のうちの１つ以上を有する、ＺＩＫＶおよび／またはＺＩＫＶ Ｅへ特異的に結合する、単離された組換え抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
（ａ）完全ヒトモノクローナル抗体であるか、または
（ｂ）ジカｐｒＭ／Ｅを発現するＶＬＰへ約８０ｐＭ～約１５０ｎＭの範囲のＥＣ５０で結合するか、または
（ｃ）表面プラズモン共鳴アッセイで測定する場合、ＺＩＫＶ Ｅへ１０－７Ｍ未満の解離定数（ＫＤ）で結合するか、または
（ｄ）ｐＨ７．４に対するｐＨ５またはｐＨ６での解離半減期（ｔ１／２）の変化を示しても示さなくてもよい、のうちの１つ以上を有する、ＺＩＫＶおよび／またはＺＩＫＶ Ｅへ特異的に結合する、単離された組換え抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【0012】
本発明の例示的な抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体を本明細書の表１および表２に列挙する。表１は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）、および例示的な抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列識別子を説明する。表２は、例示的な抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２ ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３の核酸配列識別子を説明する。
【0013】
本発明は、表１に列挙されたＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ、またはＨＣＶＲと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【0014】
本発明は、表１に列挙されたＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ、またはＬＣＶＲと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。
【0015】
本発明は、表１に列挙されたＬＣＶＲアミノ酸配列と対形成した、表１に列挙されたＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかを含む、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲのアミノ酸配列対（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。ある特定の実施形態によると、本発明は、表１に列挙された例示的な抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体のいずれかに含有されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【0016】
一実施形態において、単離された抗ＺＩＫＶモノクローナル抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、１７８、１９４、２１０、２２６、２４２、２５８、２７４、２９０、３０６、３２２および３３８のアミノ酸配列からなる群から選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）配列のいずれか１つに含有される３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）と、配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、１８６、２０２、２１８、２３４、２５０、２６６、２８２、２９８、３１４、３３０および３４６からなる群から選択される軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）配列のうちのいずれか１つに含有される３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）と、を含む。
【0017】
一実施形態において、単離された抗ＺＩＫＶモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、１７８、１９４、２１０、２２６、２４２、２５８、２７４、２９０、３０６、３２２および３３８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む、
【0018】
一実施形態において、単離された抗ＺＩＫＶモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、１８６、２０２、２１８、２３４、２５０、２６６、２８２、２９８、３１４、３３０および３４６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む。
【0019】
一実施形態では、単離された抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４、１６２／１７０、１７８／１８６、１９４／２０２、２１０／２１８、２２６／２３４、２４２／２５０、２５８／２６６、２７４／２８２、２９０／２９８、３０６／３１４、３２２／３３０および３３８／３４６からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む。
【0020】
ある特定の実施形態において、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対は、配列番号６６／７４（Ｈ４Ｈ２５５９８Ｐ）、配列番号１１４／１２２（Ｈ４Ｈ２５６１９Ｐ）、および配列番号２５８／２６６（Ｈ４Ｈ２５７０３Ｎ）からなる群から選択される。一実施形態において、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対は、配列番号１１４／１２２（Ｈ４Ｈ２５６１９Ｐ）および配列番号２５８／２６６（Ｈ４Ｈ２５７０３Ｎ）からなる群から選択される。
【0021】
一実施形態において、単離された抗体または抗原結合フラグメントは、
（ａ）配列番号４、２０、３６、５２、６８、８４、１００、１１６、１３２、１４８、１６４、１８０、１９６、２１２、２２８、２４４、２６０、２７６、２９２、３０８、３２４および３４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１ドメインと、
（ｂ）配列番号６、２２、３８、５４、７０、８６、１０２、１１８、１３４、１５０、１６６、１８２、１９８、２１４、２３０、２４６、２６２、２７８、２９４、３１０、３２６および３４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２ドメインと、
（ｃ）配列番号８、２４、４０、５６、７２、８８、１０４、１２０、１３６、１５２、１６８、１８４、２００、２１６、２３２、２４８、２６４、２８０、２９６、３１２、３２８および３４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３ドメインと、
（ｄ）配列番号１２、２８、４４、６０、７６、９２、１０８、１２４、１４０、１５６、１７２、１８８、２０４、２２０、２３６、２５２、２６８、２８４、３００、３１６、３３２および３４８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１ドメインと、
（ｅ）配列番号１４、３０、４６、６２、７８、９４、１１０、１２６、１４２、１５８、１７４、１９０、２０６、２２２、２３８、２５４、２７０、２８６、３０２、３１８、３３４、３５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２ドメインと、
（ｆ）配列番号１６、３２、４８、６４、８０、９６、１１２、１２８、１４４、１６０、１７６、１９２、２０８、２２４、２４０、２５６、２７２、２８８、３０４、３２０、３３６および３５２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３ドメインと、を含む。
（ａ）配列番号４、２０、３６、５２、６８、８４、１００、１１６、１３２、１４８、１６４、１８０、１９６、２１２、２２８、２４４、２６０、２７６、２９２、３０８、３２４および３４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１ドメインと、
（ｂ）配列番号６、２２、３８、５４、７０、８６、１０２、１１８、１３４、１５０、１６６、１８２、１９８、２１４、２３０、２４６、２６２、２７８、２９４、３１０、３２６および３４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２ドメインと、
（ｃ）配列番号８、２４、４０、５６、７２、８８、１０４、１２０、１３６、１５２、１６８、１８４、２００、２１６、２３２、２４８、２６４、２８０、２９６、３１２、３２８および３４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３ドメインと、
（ｄ）配列番号１２、２８、４４、６０、７６、９２、１０８、１２４、１４０、１５６、１７２、１８８、２０４、２２０、２３６、２５２、２６８、２８４、３００、３１６、３３２および３４８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１ドメインと、
（ｅ）配列番号１４、３０、４６、６２、７８、９４、１１０、１２６、１４２、１５８、１７４、１９０、２０６、２２２、２３８、２５４、２７０、２８６、３０２、３１８、３３４、３５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２ドメインと、
（ｆ）配列番号１６、３２、４８、６４、８０、９６、１１２、１２８、１４４、１６０、１７６、１９２、２０８、２２４、２４０、２５６、２７２、２８８、３０４、３２０、３３６および３５２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３ドメインと、を含む。
【0022】
一実施形態において、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号６８のＨＣＤＲ１アミノ酸配列と、配列番号７０のＨＣＤＲ２アミノ酸配列と、配列番号７２のＨＣＤＲ３アミノ酸配列と、配列番号７６のＬＣＤＲ１アミノ酸配列と、配列番号７８のＬＣＤＲ２アミノ酸配列と、配列番号８０のＬＣＤＲ３アミノ酸配列と、を含む。
【0023】
一実施形態において、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１１６のＨＣＤＲ１アミノ酸配列と、配列番号１１８のＨＣＤＲ２アミノ酸配列と、配列番号１２０のＨＣＤＲ３アミノ酸配列と、配列番号１２４のＬＣＤＲ１アミノ酸配列と、配列番号１２６のＬＣＤＲ２アミノ酸配列と、配列番号１２８のＬＣＤＲ３アミノ酸配列と、を含む。
【0024】
一実施形態において、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２６０のＨＣＤＲ１アミノ酸配列と、 配列番号２６２のＨＣＤＲ２アミノ酸配列と、配列番号２６４のＨＣＤＲ３アミノ酸配列と、配列番号２６８のＬＣＤＲ１アミノ酸配列と、配列番号２７０のＬＣＤＲ２アミノ酸配列と、配列番号２７２のＬＣＤＲ３アミノ酸配列と、を含む。
【0025】
本発明は、表１に列挙された重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含むＨＣＤＲ１を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。
【0026】
本発明は、表１に列挙された重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含むＨＣＤＲ２を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【0027】
本発明は、表１に列挙された重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含むＨＣＤＲ３を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。
【0028】
本発明は、表１に列挙された軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含むＬＣＤＲ１を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【0029】
本発明はまた、表１に列挙された軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含むＬＣＤＲ２を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。
【0030】
本発明は、表１に列挙された軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含むＬＣＤＲ３を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【0031】
本発明は、表１に列挙されたＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかと対形成した表１に列挙されたＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかを含むＨＣＤＲ３およびＬＣＤＲ３のアミノ酸配列対（ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３）を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。ある特定の実施形態によると、本発明は、表１に列挙された例示的な抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体のいずれかに含有されるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。ある特定の実施形態において、ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対は、配列番号７２／８０（例えば、Ｈ４Ｈ２５５９８Ｐ）および２６４／２７２（例えば、Ｈ４Ｈ２５７０３Ｎ）である。
【0032】
本発明は、表１に列挙された例示的な抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体のいずれかに含有される６つのＣＤＲのセット（すなわち、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。ある特定の実施形態において、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットは、配列番号６８－７０－７２－７６－７８－８０（例えば、Ｈ４Ｈ２５５９８Ｐ）、配列番号１１６、１１８、１２０、１２４、１２６および１２８（Ｈ４Ｈ２５６１９Ｐ）ならびに配列番号２６０－２６２－２６４－２６８－２７０－２７２（例えば、Ｈ４Ｈ２５７０３Ｎ）からなる群から選択される。
【0033】
関連する実施形態において、本発明は、表１に列挙された例示的な抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体のいずれかによって定義されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対内に含有される６つのＣＤＲのセット（すなわち、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。例えば、本発明は、配列番号６６／７４（例えば、Ｈ４Ｈ２５５９８Ｐ）、配列番号１１４／１２２（例えば、Ｈ４Ｈ２５６１９Ｐ）および配列番号２５８／２６６（例えば、Ｈ４Ｈ２５７０３Ｎ）からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対内に含有されるＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットを含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。ＨＣＶＲアミノ酸配列およびＬＣＶＲアミノ酸配列の内部にあるＣＤＲを識別するための方法および技術は、当該技術分野において周知であり、本明細書に開示される具体的なＨＣＶＲアミノ酸配列および／またはＬＣＶＲアミノ酸配列の内部にあるＣＤＲを識別するために使用することができる。ＣＤＲの境界を識別するために使用することができる例示的な規則は、例えば、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、およびＡｂＭ定義を含む。一般的にいえば、Ｋａｂａｔの定義は配列の可変性に基づいており、Ｃｈｏｔｈｉａの定義は構造ループ領域の位置に基づいており、ＡｂＭの定義はＫａｂａｔのアプローチとＣｈｏｔｈｉａのアプローチの間の折衷案である。例えば、Ｋａｂａｔ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）、Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７－９４８（１９９７）、およびＭａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：９２６８－９２７２（１９８９）を参照されたい。抗体内のＣＤＲ配列を識別するために、公開データベースも利用可能である。
【0034】
一実施形態において、本発明は、ＺＩＫＶへ特異的に結合し、配列番号３６７の重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列と配列番号３６８の軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列とを有する抗ＺＩＫＶ抗体を提供する。
【0035】
一実施形態において、本発明は、ＺＩＫＶへ特異的に結合し、配列番号３７０の重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列と配列番号３７１の軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列とを有する抗ＺＩＫＶ抗体を提供する。
【0036】
一実施形態において、本発明は、ＺＩＫＶへ特異的に結合し、配列番号３７３の重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列と配列番号３７４の軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列とを有する抗ＺＩＫＶ抗体を提供する。
【0037】
一実施形態において、本発明は、ＺＩＫＶへ特異的に結合し、配列番号３６９の重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列と配列番号３６８の軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列とを有する抗ＺＩＫＶ抗体を提供する。
【0038】
一実施形態において、本発明は、ＺＩＫＶへ特異的に結合し、配列番号３７２の重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列と配列番号３７１の軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列とを有する抗ＺＩＫＶ抗体を提供する。
【0039】
一実施形態において、本発明は、ＺＩＫＶへ特異的に結合し、配列番号３７５の重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列と配列番号３７４の軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列とを有する抗ＺＩＫＶ抗体を提供する。
【0040】
一実施形態において、本発明の抗体は、ＭＲ７６６（ウガンダ１９４７）株、ＰＲＶＡＢＣ５９（プエルトリコ２０１５）株およびＦＬＲ（コロンビア２０１５）株からなる群から選択されるＺＩＫＶ株を中和することができる。
【0041】
本発明の一態様において、本発明は、抗体依存性増強（ＡＤＥ）に寄与しないか、ＡＤＥを引き起こさないか、または誘導しない、ＺＩＫＶを中和するヒト抗体、抗体変異体、またはその抗原結合フラグメントを提供する。一実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＺＩＫＶ感染の抗体依存性増強（ＡＤＥ）に寄与しないか、ＡＤＥを引き起こさないか、もしくは誘導しないか、またはフラビウイルス科における１つ以上の他のウイルス、例えばデングウイルスによる感染に寄与しないか、引き起こすか、もしくは誘導しない。
【0042】
一実施形態において、本発明は、野生型Ｅタンパク質（例えば配列番号３７６を参照されたい）を有するＺＩＫＶを中和するが、Ｅタンパク質の変異型を有するＺＩＫＶを中和しない抗体を提供し、この変異は、配列番号３７６の位置３０２のセリンからフェニルアラニンへのもの（Ｓ３０２Ｆ）、配列番号３７６の位置３１１のトレオニンからイソロイシンへのもの（Ｔ３１１Ｉ）、または配列番号３７６の位置３６９のリジンからグルタミン酸へのもの（Ｋ３６９Ｅ）である。
【0043】
一実施形態において、本発明は、Ｆｃ領域に１つ以上の変異を含み、この１つ以上の変異が、細胞上のＦｃ受容体への抗体の結合を低下させる、ＺＩＫＶを中和するヒト抗体、抗体変異体、またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【0044】
一実施形態において、本発明は、Ｆｃ領域に１つ以上の変異を含み、１つ以上の突然変異が、抗体の血清半減期をより長くする、ＺＩＫＶを中和するヒト抗体、抗体変異体、またはその抗原結合フラグメントを提供する。一実施形態において、変異は、配列番号３５７の位置１３１、１３３および１３５におけるＹＴＥ修飾（Ｍ１３１Ｙ、Ｓ１３３ＴおよびＴ１３５Ｅ）からなる。これらの変化は、配列番号３５８のこれらの位置に示されている。
【0045】
一実施形態において、本発明は、細胞上のＦｃ受容体への抗体の結合を低下させるＦｃ領域における少なくとも１つの変異と、抗体の血清半減期を延長させる少なくとも１つの変異と、を含む、ＺＩＫＶを中和するヒト抗体、抗体変異体、またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【0046】
本発明は、本明細書の他の箇所で説明されるようなＩｇＧ１アイソタイプまたはＩｇＧ４アイソタイプを含むＦｃドメインを含む抗ＺＩＫＶ抗体を含む。
【0047】
ある特定の実施形態において、本発明の抗ＺＩＫＶ抗体は、配列番号３５６（ＩｇＧ１）、３５７（ＹＴＥ変異を伴わないＩｇＧ４）、３５８（ＹＴＥ変異を伴うＩｇＧ４）、３６５（ＹＴＥ変異を伴わないＩｇＧ４）および３６６（ＹＴＥ変異を伴うＩｇＧ４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＦｃドメインを含む。
【0048】
一実施形態において、本発明の抗ＺＩＫＶ抗体は、配列番号３５７のアミノ酸配列を有するＦｃドメインを含む。
【0049】
一実施形態において、本発明の抗ＺＩＫＶ抗体は、配列番号３５８のアミノ酸配列を有するＦｃドメインを含む。
【0050】
一実施形態において、本発明の抗ＺＩＫＶ抗体は、配列番号２５８／２６６のＨＣＶＲ／ＬＶＣＲアミノ酸配列対と、配列番号３５７または３５８のアミノ酸配列を有するＦｃドメインとを含む。
【0051】
一実施形態において、本発明の抗ＺＩＫＶ抗体は、配列番号１１４／１２２のＨＣＶＲ／ＬＶＣＲアミノ酸配列対と、配列番号３５７または３５８のアミノ酸配列を有するＦｃドメインとを含む。
【0052】
一実施形態において、本発明の抗ＺＩＫＶ抗体は、配列番号１１４／１２２のＨＣＶＲ／ＬＶＣＲアミノ酸配列対と、配列番号３５７のアミノ酸配列を有するＦｃドメインとを含む。
【0053】
一実施形態において、本発明の抗ＺＩＫＶ抗体は、配列番号６６／７４のＨＣＶＲ／ＬＶＣＲアミノ酸配列対と、配列番号３５７または３５８のアミノ酸配列を有するＦｃドメインとを含む。
【0054】
一実施形態において、本発明の抗ＺＩＫＶ抗体は、配列番号６６／７４のＨＣＶＲ／ＬＶＣＲアミノ酸配列対と、配列番号３５７のアミノ酸配列を有するＦｃドメインとを含む。
【0055】
本発明は、修飾されたグリコシル化パターンを有する抗ＺＩＫＶ抗体を含む。いくつかの実施形態では、望ましくないグリコシル化部位を除去する修飾、または例えば抗体依存性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）機能を増大させるためにオリゴ糖鎖上に存在するフコース部分を欠失している抗体が有用であり得る（Ｓｈｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（２００２）ＪＢＣ ２７７：２６７３３を参照されたい）。他の応用において、ガラクトシル化の修飾は、補体依存性細胞障害作用（ＣＤＣ）を修飾するために行うことができる。
【0056】
本発明は、ＺＩＫＶへの結合と交差競合するか、またはＨＣＶＲのＣＤＲとＬＣＶＲのＣＤＲとを含み、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲの各々が、表１に列挙されるＨＣＶＲ配列およびＬＣＶＲ配列から選択されるアミノ酸配列を有する、参照抗体もしくはその抗原結合フラグメントと同じエピトープを結合する抗体およびその抗原結合フラグメントも提供する。
【0057】
本発明は、細胞へのＺＩＫＶの付着を遮断するかまたは細胞膜へのウイルスの融合を防止し、それにより宿主細胞の中へのウイルスの侵入を防止する、単離された抗体およびその抗原結合フラグメントも提供する。
【0058】
ある特定の実施形態において、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、ＺＩＫＶにおける第１のエピトープに対する第１の結合特異性と、ＺＩＫＶにおける第２のエピトープに対する第２の結合特異性と、を含む、二重特異性であり、第１および第２のエピトープは異なっており、重複しない。ある特定の実施形態において、二重特異性は、ウイルスエンベロープ糖タンパク質中のエピトープへ結合する第１のアームと、異なるウイルス抗原中のエピトープへ結合する第２のアームと、を含み得る。
【0059】
第２の態様において、本発明は、抗ＺＩＫＶ抗体またはその一部をコードする核酸分子を提供する。例えば、本発明は、表１に列挙されたＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し、ある特定の実施形態において、この核酸分子は、表２に列挙されたＨＣＶＲ核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む。
【0060】
本発明は、表１に列挙されたＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供し、ある特定の実施形態において、この核酸分子は、表２に列挙されたＬＣＶＲ核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む。
【0061】
本発明は、表１に列挙されたＨＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供し、ある特定の実施形態において、この核酸分子は、表２に列挙されたＨＣＤＲ１核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列も含む。
【0062】
本発明は、表１に列挙されたＨＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供し、ある特定の実施形態において、この核酸分子は、表２に列挙されたＨＣＤＲ２核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む。
【0063】
本発明は、表１に列挙されたＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供し、ある特定の実施形態において、この核酸分子は、表２に列挙されたＨＣＤＲ３核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む。
【0064】
本発明は、表１に列挙されたＬＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供し、ある特定の実施形態では、この核酸分子は、表２に列挙されたＬＣＤＲ１核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む。
【0065】
本発明は、表１に列挙されたＬＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供し、ある特定の実施形態において、この核酸分子は、表２に列挙されたＬＣＤＲ２核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれえと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む。
【0066】
本発明は、表１に列挙されたＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供し、ある特定の実施形態において、この核酸分子は、表２に列挙されたＬＣＤＲ３核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはその少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む。
【0067】
本発明は、ＨＣＶＲが３つのＣＤＲのセット（すなわち、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３）を含み、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３アミノ酸配列セットが、表１に列挙された例示的な抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体のいずれかによって定義される通りである、ＨＣＶＲをコードする核酸分子も提供する。
【0068】
本発明は、ＬＣＶＲが、３つのＣＤＲのセット（すなわち、ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）を含み、ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットが、表１に列挙された例示的な抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体のいずれかによって定義される通りである、ＬＣＶＲをコードする核酸分子も提供する。
【0069】
本発明は、ＨＣＶＲが、表１に列挙されたＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含み、ＬＣＶＲが、表１に列挙されたＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含む、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲの両方をコードする核酸分子も提供する。ある特定の実施形態において、この核酸分子は、表２に列挙されたＨＣＶＲ核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列と、表２に列挙されたＬＣＶＲ核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列と、を含む。本発明のこの態様によるある特定の実施形態において、この核酸分子は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲが両方とも、表１に列挙された同じ抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体に由来する、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲをコードする。
【0070】
本発明は、表１に列挙された重鎖アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供する。本発明は、表１に列挙された軽鎖アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供する。
【0071】
関連する態様において、本発明は、抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域を含むポリペプチドを発現することのできる組換え発現ベクターを提供する。例えば、本発明は、上述の核酸分子、すなわち表１に示されるＨＣＶＲ配列、ＬＣＶＲ配列および／またはＣＤＲ配列のいずれかをコードする核酸分子のいずれかを含む組換え発現ベクターを含む。本発明の範囲内にはまた、このようなベクターが導入された宿主細胞と、抗体または抗体フラグメントの産生を可能にする条件下で宿主細胞を培養することによって抗体またはその一部を産生する方法、ならびにそのように産生された抗体および抗体フラグメントを回収する方法とが含まれる。
【0072】
第３の態様において、本発明は、ＺＩＫＶ Ｅへ特異的に結合する１つ以上の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと、医薬として許容され得る担体または希釈剤と、を含む医薬組成物を提供する。１つ以上の単離された抗体は、表１に列挙されるＨＣＶＲ配列およびＬＣＶＲ配列からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む。一実施形態において、ＺＩＫＶへ特異的に結合する１つ以上の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、１７８、１９４、２１０、２２６、２４２、２５８、２７４、２９０、３０６、３２２および３３８からなる群から選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）配列のいずれか１つに含有される３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）と、配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、１８６、２０２、２１８、２３４、２５０、２６６、２８２、２９８、３１４、３３０および３４６からなる群から選択される軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）配列のいずれか１つに含有される３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）と、を含む。一実施形態において、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対は、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４、１６２／１７０、１７８／１８６、１９４／２０２、２１０／２１８、２２６／２３４、２４２／２５０、２５８／２６６、２７４／２８２、２９０／２９８、３０６／３１４、３２２／３３０および３３８／３４６からなる群から選択される。一実施形態において、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対は、配列番号６６／７４、１１４／１２２および２５８／２６６からなる群から選択される。一実施形態において、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対は、配列番号１１４／１２２および２５８／２６６からなる群から選択される。
【0073】
一実施形態において、医薬組成物は、
ａ）配列番号１１６のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１と、配列番号１１８のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２と、配列番号１２０のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３と、配列番号１２４のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１と、配列番号１２６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２と、配列番号１２８のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３と、を含む、ＺＩＫＶへ特異的に結合する単離された第１のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと、
ｂ）配列番号２６０のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１と、配列番号２６２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２と、配列番号２６４のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３と、配列番号２６８のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１と、配列番号２７０のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２と、配列番号２７２のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３と、を含む、ＺＩＫＶへ特異的に結合する単離された第２のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと、
ｃ）医薬として許容され得る担体または希釈剤と、を含む。
ａ）配列番号１１６のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１と、配列番号１１８のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２と、配列番号１２０のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３と、配列番号１２４のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１と、配列番号１２６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２と、配列番号１２８のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３と、を含む、ＺＩＫＶへ特異的に結合する単離された第１のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと、
ｂ）配列番号２６０のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１と、配列番号２６２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２と、配列番号２６４のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３と、配列番号２６８のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１と、配列番号２７０のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２と、配列番号２７２のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３と、を含む、ＺＩＫＶへ特異的に結合する単離された第２のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと、
ｃ）医薬として許容され得る担体または希釈剤と、を含む。
【0074】
関連する態様において、本発明は、本発明の少なくとも２つの抗体と、医薬として許容され得る担体または希釈剤と、を含む医薬組成物を特徴とする。
【0075】
一実施形態において、医薬組成物は、ＺＩＫＶへ特異的に結合する少なくとも２つの単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと、医薬として許容され得る担体または希釈剤と、を含み、２つのモノクローナル抗体の少なくとも１つは、インビトロで約１０－９Ｍ以下のＩＣ５０でＺＩＫＶを中和し、ＺＩＫＶ感染した動物におけるインビボでの防御作用を示す。
【0076】
一実施形態において、少なくとも２つの単離された抗体は、配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、１７８、１９４、２１０、２２６、２４２、２５８、２７４、２９０、３０６、３２２および３３８からなる群から選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）配列のいずれか１つに含有される３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）と、配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、１８６、２０２、２１８、２３４、２５０、２６６、２８２、２９８、３１４、３３０および３４６からなる群から選択される軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）配列のいずれか１つに含有される３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）と、を含む第１および第２の抗ＺＩＫＶモノクローナル抗体または抗原結合フラグメントから選択される。
【0077】
一実施形態において、少なくとも２つの単離された抗体は、第１および第２の抗ＺＩＫＶモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントから選択され、第１の抗ＺＩＫＶモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１１６のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１と、配列番号１１８のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２と、配列番号１２０のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３と、配列番号１２４のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１と、配列番号１２６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２と、配列番号１２８のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３と、を含み、ＺＩＫＶへ特異的に結合する第２の抗ＺＩＫＶモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２６０のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１と、配列番号２６２のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２と、配列番号２６４のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３と、配列番号２６８のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１と、配列番号２７０のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２と、配列番号２７２のアミノ酸を有するＬＣＤＲ３と、を含む。
【0078】
関連する態様において、本発明は、本発明の少なくとも３つの抗体と、医薬として許容され得る担体または希釈剤と、を含む組成物を特徴とする。
【0079】
ある特定の実施形態において、本発明は、（ａ）表１に記載のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対またはその抗原結合フラグメントを含む第１の抗ＺＩＫＶ抗体と、（ｂ）表１に記載のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む第２の抗ＺＩＫＶ抗体、またはその抗原結合フラグメントであって、第１の抗体がＺＩＫＶ Ｅ上の第１のエピトープへ結合し、第２の抗体がＺＩＫＶ Ｅ上の第２の異なるエピトープへ結合し、第１および第２のエピトープが異なっており重複していないものと、（ｃ）医薬として許容され得る担体または希釈剤と、を含む、医薬組成物を提供する。
【0080】
別の関連する態様において、本発明は、抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体と第２の治療剤との組み合わせを含む組成物を特徴とする。
【0081】
一実施形態において、第２の治療剤は、抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体と有利に組み合わされる任意の薬剤である。抗ＺＩＫＶ抗体と有利に組み合わせることができる例示的な薬剤には、ＺＩＫＶ活性を結合および／または阻害する他の薬剤（他の抗体またはその抗原結合フラグメントなどを含む）ならびに／あるいはＺＩＫＶを直接結合することはないが、それにもかかわらずウイルス活性（宿主細胞の感染性を含む）および／またはウイルス病原性を阻害する薬剤が含まれるが、これらに限定しない。
【0082】
ある特定の実施形態において、本発明は、（ａ）第１の抗ＺＩＫＶ抗体またはその抗原結合フラグメントと、（ｂ）ＺＩＫＶへの結合について第１の抗体が第２の抗体と交差競合しない、第２の抗ＺＩＫＶ抗体またはその抗原結合フラグメントと、（ｃ）医薬として許容され得る担体または希釈剤と、を含む医薬組成物を提供する。
【0083】
ある特定の実施形態において、本発明は、（ａ）第１の抗ＺＩＫＶ抗体またはその抗原結合フラグメントと、（ｂ）異なるＺＩＫＶ抗原と相互作用する第２の抗ＺＩＫＶ抗体またはその抗原結合フラグメントであって、第１の抗体がＺＩＫＶ Ｅ上のエピトープへ結合し、第２の抗体が異なるＺＩＫＶ抗原上のエピトープへ結合するものと、（ｃ）医薬として許容され得る担体または希釈剤と、を含む医薬組成物を提供する。
【0084】
ある特定の実施形態において、本発明は、（ａ）第１の抗ＺＩＫＶ抗体またはその抗原結合フラグメントと、（ｂ）第２の抗ＺＩＫＶ抗体またはその抗原結合フラグメントと、（ｃ）第１の抗体がＺＩＫＶ Ｅ上の第１のエピトープへ結合し、第２および／または第３の抗体がＺＩＫＶ Ｅ上の異なるエピトープへ結合する第３の抗ＺＩＫＶ抗体またはその抗原結合フラグメントであって、第１、第２および第３のエピトープが異なっており重複していないものと、（ｄ）医薬として許容され得る担体または希釈剤と、を含む医薬組成物を提供する。
【0085】
ある特定の実施形態において、本発明は、（ａ）第１の抗ＺＩＫＶ抗体またはその抗原結合フラグメントと、（ｂ）第２の抗ＺＩＫＶ抗体またはその抗原結合フラグメントと、（ｃ）ＺＩＫＶへの結合について第１の抗体が第２の抗体および／または第３の抗体と交差競合してもよいし、交差競合しなくてもよい、第３の抗ＺＩＫＶ抗体またはその抗原結合フラグメントと、（ｄ）医薬として許容され得る担体または希釈剤と、を含む医薬組成物を提供する。
【0086】
ある特定の実施形態において、本発明は、（ａ）第１の抗ＺＩＫＶ抗体またはその抗原結合フラグメントと、（ｂ）異なるＺＩＫＶ抗原と相互作用する第２および／または第３の抗ＺＩＫＶ抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記第１の抗体がＺＩＫＶ Ｅ上のエピトープへ結合し、第２および／または第３の抗体が異なるＺＩＫＶ抗原上のエピトープへ結合するものと、（ｃ）医薬として許容され得る担体または希釈剤と、を含む医薬組成物を提供する。
【0087】
一実施形態において、医薬組成物は、ＺＩＫＶの１つの株上の１つのエピトープへ結合または相互作用する第１の抗ＺＩＫＶ抗体またはその抗原結合フラグメントと、ＺＩＫＶの同じ株上のまたは異なる株上の第２および／または第３のエピトープへ結合または相互作用する第２および／または第３の抗ＺＩＫＶ抗体またはその抗原結合フラグメントと、を含む。
【0088】
関連する態様において、本発明は、ＺＩＫＶ Ｅへ特異的に結合する、配列番号６８のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７０のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、配列番号７２のＨＣＤＲ３アミノ酸配列、配列番号７６のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７８のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号８０のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、第１の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと、医薬として許容され得る担体または希釈剤と、を含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、ＺＩＫＶ Ｅへ特異的に結合する、配列番号１１６または２６０のＨＣＤＲ１アミノ酸配列と、配列番号１１８または２６２のＨＣＤＲ２アミノ酸配列と、配列番号１２０または２６４のＨＣＤＲ３アミノ酸配列と、配列番号１２４または２６８のＬＣＤＲ１アミノ酸配列と、配列番号１２６または２７０のＬＣＤＲ２アミノ酸配列と、配列番号１２８または２７２のＬＣＤＲ３アミノ酸配列と、を含む、第２の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントをさらに含み得る。
【0089】
一実施形態において、医薬組成物は、ＺＩＫＶへ特異的に結合する、配列番号１１６のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１１８のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、配列番号１２０のＨＣＤＲ３アミノ酸配列、配列番号１２４のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１２６のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号１２８のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む第１の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと、医薬として許容され得る担体または希釈剤と、を含む。医薬組成物は、ＺＩＫＶへ特異的に結合する、配列番号２６０のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号２６２のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、配列番号２６４のＨＣＤＲ３アミノ酸配列、配列番号２６８のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号２７０のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号２７２のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、第２の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントをさらに含み得る。医薬組成物は、ＺＩＫＶ Ｅへ特異的に結合する、表１に示される抗体のいずれかに由来するＨＣＤＲ１アミノ酸配列、ＨＣＤＲ２アミノ酸配列、ＨＣＤＲ３アミノ酸配列、ＬＣＤＲ１アミノ酸配列、ＬＣＤＲ２アミノ酸配列およびＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、第３の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントをさらに含み得る。
【0090】
関連する態様において、本発明は、ＺＩＫＶへ特異的に結合し、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４、１６２／１７０、１７８／１８６、１９４／２０２、２１０／２１８、２２６／２３４、２４２／２５０、２５８／２６６、２７４／２８２、２９０／２９８、３０６／３１４、３２２／３３０および３３８／３４６からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む少なくとも２つの抗体の混合物を含む、抗体カクテルを提供する。
【0091】
一実施形態において、カクテルは、配列番号１１４／１２２および２５８／２６６のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む２つの抗体の混合物を含む。一実施形態において、抗体カクテルは、表１に示される抗体から選択されるアミノ酸配列対を含む第３の抗体を含み得る。一実施形態において、第３の抗体は、配列番号６６／７４のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む。
【0092】
一実施形態では、抗体カクテルは、配列番号３６７／３６８および３７０／３７１の重鎖（ＨＣ）／軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列対を含む２つの抗体の混合物を含む。一実施形態において、抗体カクテルは、配列番号３７３／３７４のＨＣ／ＬＣアミノ酸配列対を含む第３の抗体を含み得る。
【0093】
ある特定の実施形態において、各抗体は、別個の製剤として製剤することができ、最大の治療効力を達成するために１つを超える抗体が必要であると決定された場合、抗体製剤の各々は必要に応じて併用投与され得る（同時に、または連続的に）。あるいは、抗体カクテルを併用製剤してもよい。
【0094】
ある特定の実施形態において、２つ以上の抗体が１つの医薬組成物中で一緒に組み合わされる場合、これらの抗体はＺＩＫＶタンパク質上の同じまたは重複しているエピトープを結合してもしなくてもよい。本発明の抗ＺＩＫＶ抗体を包含する追加の併用療法および併用製剤は、本明細書の他の箇所に開示されている。
【0095】
ある実施形態において、本発明は、少なくとも１つの抗体が細胞へのウイルスの付着を防止することができ、第２の抗体が、宿主細胞膜へのウイルスの融合を防止することができ、このようなものとして、細胞へのウイルス侵入の防止および細胞内での複製を準備し得る、ＺＩＫＶ Ｅを結合する２つ以上のヒト抗体またはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を提供する。関連する実施形態において、ＺＩＫＶ感染の抗体依存性増強（ＡＤＥ）に寄与しない２つの抗ジカ抗体を含む組成物は、宿主細胞へのＺＩＫＶ侵入の予防を提供し得る。
【0096】
ある特定の実施形態において、ＡＤＥに寄与することなくジカウイルスを中和する本発明の抗ＺＩＫＶ抗体は、配列番号３５７に示されるＦｃアミノ酸配列を各々有する、配列番号２５８／２６６、１１４／１２２および６６／７４からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む。
【0097】
ある特定の実施形態において、ＡＤＥに寄与することなくジカウイルスを中和する本発明の抗ＺＩＫＶ抗体は、配列番号３６７／３６８（Ｈ４Ｈ２５７０３Ｎ）および配列番号３７０／３７１（Ｈ４Ｈ２５６１９Ｐ）のＨＣ／ＬＣアミノ酸配列対を含む。
【0098】
ある特定の実施形態において、ＡＤＥに寄与することなくジカウイルスを中和し、延長された血清半減期を有し得る本発明の抗ＺＩＫＶ抗体は、配列番号３５８（本明細書中の他の箇所で説明されたＹＴＥ変異を有するＩｇＧ４）に示されるようなＦｃアミノ酸配列を各々有する、配列番号２５８／２６６、１１４／１２２および６６／７４からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む。
【0099】
ある特定の実施形態において、ＡＤＥに寄与することなくジカウイルスを中和し、延長された血清半減期を有し得る本発明の抗ＺＩＫＶ抗体は、配列番号３６９／３６８のＨＣ／ＬＣアミノ酸配列対（本明細書の他の箇所で説明されたＹＴＥ変異を有するＨ４Ｈ２５７０３Ｎ）、配列番号３７２／３７１（本明細書の他の箇所で説明されたＹＴＥ変異を有するＨ４Ｈ２５６１９Ｐ）および配列番号３７５／３７３（本明細書の他の箇所で説明されたＹＴＥ変異を有するＨ４Ｈ２５５９８Ｐ）のＨＣ／ＬＣアミノ酸配列対を含む。
【0100】
第４の態様において、本発明は、本発明の抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体もしくは抗体の抗原結合部分、または本発明の少なくとも２つ以上の抗体のカクテルを用いて、ＺＩＫＶと関連した疾患もしくは障害（対象におけるウイルス感染など）、またはウイルス感染と関連した少なくとも１つの症状、またはＺＩＫＶ感染と関連した少なくとも１つの症状の頻度もしくは重症度を治療するための治療方法を提供し、この治療方法は、それを必要とする対象へ、治療有効量の本発明の１つ以上の抗体または抗原結合フラグメントを投与することを含む。一実施形態において、本方法は、本発明の少なくとも２つまたは少なくとも３つの抗体の組み合わせ（カクテル）を投与することを含む。一実施形態において、抗体カクテルは、配列番号１１４／１２２および２５８／２６６に示されるアミノ酸配列対を有する２つの抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体を含む。治療される障害は、ＺＩＫＶ活性の阻害によって改善、寛解、抑制または予防されるいずれかの疾患または容態である。ある特定の実施形態において、本発明は、ＺＩＫＶ感染の少なくとも１つの症状を予防、治療または寛解させる方法を提供し、本方法は、それを必要とする対象へ、治療有効量の少なくとも１つ以上の抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体またはその抗原結合フラグメントを投与することを含む。
【0101】
関連する態様において、本発明は、ＺＩＫＶに感染した細胞を、１つ以上の抗ＺＩＫＶ抗体またはその抗原結合フラグメントを含む組成物へ曝露することを含む、感染性ＺＩＫＶを中和する方法を提供し、この曝露は、細胞をウイルス感染からの、または細胞死からの防御の増強をもたらす。ある特定の実施形態において、曝露することは、インビトロまたはインビボであり得る。一実施形態において、１つ以上の抗ＺＩＫＶ抗体またはその抗原結合フラグメントは、野生型Ｅタンパク質を有する感染性ＺＩＫＶを中和し、この野生型Ｅタンパク質は、配列番号３７６の位置３０２にセリンを、配列番号３７６の位置３１１にトレオニンを、および配列番号３７６の位置３６９にリジンを有するが、Ｅタンパク質の変異型を有する感染性ＺＩＫＶを中和することはないことになっており、このＥタンパク質の変異型は、以下の変化：配列番号３７６の位置３０２のフェニルアラニン、配列番号３７６の位置３１１のイソロイシン、または配列番号３７６の位置３６９のグルタミン酸、のうちの１つ以上を含有する。一実施形態において、本方法は、本発明の１つ以上の抗体を投与することを含む。一実施形態において、本方法は、本発明の少なくとも２つの抗体の組み合わせ（カクテル）を投与することを含む。一実施形態において、抗体カクテルは、配列番号１１４／１２２および２５８／２６６に示されるアミノ酸配列対を有する２つの抗ＺＩＫＶ抗体を含む。
【0102】
いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の１つ以上の抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体を投与することによって対象におけるＺＩＫＶ感染の少なくとも１つの症状の重症度、期間または発生頻度を寛解または低下する方法を提供し、この少なくとも１つの症状は、発熱、頭痛、関節痛、筋肉痛および斑状丘疹性発疹からなる群から選択される。
【0103】
ある特定の実施形態において、本発明は、対象へ、ＺＩＫＶ Ｅを結合して細胞膜への付着、細胞膜との融合および／または宿主細胞への侵入を遮断する有効量の本発明の１つ以上の抗体またはそのフラグメントを投与して、雄性生殖器官への播種の尤度を低下させることを含む、対象におけるウイルス量を減少させる方法を提供する。
【0104】
一実施形態において、本発明は、感染した個人から別の個人へのＺＩＫＶの伝播の尤度を低下させることを準備する。一実施形態において、感染した母体から胎児へのウイルスの伝播は、本発明の少なくとも１つの抗体を用いて予防することができる。関連する実施形態において、感染した母体から胎児へのＺＩＫＶの伝播は、本発明の少なくとも２つの抗体を用いて予防することができる。そうすることで、本発明の１つ以上の抗体を用いた妊婦の治療は、乳児における小頭症（または発達異常）の発症を予防することができる。
【0105】
ある特定の実施形態において、性的パートナーへのＺＩＫＶの伝播は、本発明の少なくとも１つの抗体を用いて予防することができる。関連する実施形態において、性的パートナーへのＺＩＫＶの伝播は、本発明の少なくとも２つの抗体を用いて予防することができる。
【0106】
一実施形態において、それを必要とする対象とは、ＺＩＫＶ感染への曝露についてのまたはＺＩＫＶ感染を獲得することについてのリスクのある対象であり、この対象は、ＺＩＫＶへ曝露された妊婦またはＺＩＫＶを保有していると疑われる蚊に刺された妊婦、ＺＩＫＶの爆発的流行がある地域に住んでいる女性、またはＺＩＫＶの爆発的流行がある地域を訪れており、妊娠中とみなされている女性、免疫不全状態の個人、医療従事者、ＺＩＫＶを保有している人へ曝露されたと疑われる人、感染した個人と物理的に接触しているもしくは物理的に緊密な人、感染した個人と物理的に接触しているもしくは物理的に緊密な人、病院職員、医薬研究者、ＺＩＫＶ患者が治療された病院施設もしくは研究所を清掃する責任のあるメンテナンス業者、ＺＩＫＶの爆発的流行を有していることが知られているもしくは有していると疑われる地域もしくは国を訪れたもしくは訪れることを計画している個人、またはＺＩＫＶを保有しているかもしれない蚊を有していることが知られている国からなる群から選択される。
【0107】
一実施形態において、それを必要とする対象は、本発明の少なくとも１つの抗ＺＩＫＶ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または第２の治療剤との組み合わせにおいて本発明の少なくとも１つの抗体もしくはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を投与され得る。第２の治療剤は、抗ウイルス薬、抗炎症薬（コルチコステロイドなど、ならびにＴＮＦに対する抗体、ＺＩＫＶに対する異なる抗体、ＺＩＫＶに対するワクチンおよび／またはインターフェロン（アルファ／ベータ／またはラムダ）などの非ステロイド系抗炎症薬からなる群から選択され得る。
【0108】
一実施形態において、医薬組成物は、皮下に、静脈内に、皮内に、筋肉内に、鼻腔内に、または経口で投与され得る。
【0109】
関連する実施形態において、防御の増強は、哺乳類が本発明の１つ以上の抗ＺＩＫＶ抗体を含む医薬組成物を用いて、または本発明の少なくとも２つ以上の抗体を含む抗体カクテルを用いて治療されるときに、ＺＩＫＶへ曝露された、またはＺＩＫＶに感染した哺乳類において観察され得る。
【0110】
一実施形態において、観察される防御の増強は、ＺＩＫＶ感染と関連した少なくとも１つの症状の重症度もしくは頻度の低下によって、またはウイルス量の減少によって測定され得る。少なくとも１つの症状は、発熱、頭痛、関節痛、筋肉痛および斑状丘疹性発疹からなる群から選択され得る。
【0111】
一実施形態において、防御の増強は、ウイルス感染後に体重の実質的な減少がないとき、本発明の１つ以上の抗体を用いて治療されたＺＩＫＶ感染哺乳類において観察される。
【0112】
一実施形態において、本発明の１つ以上の抗体を用いて治療されてはいないＺＩＫＶウイルス感染哺乳類と比較した場合に１つ以上の抗ＺＩＫＶ抗体を用いて治療したＺＩＫＶ感染哺乳類の生存の増加によって測定されるように、防御の増強は、本発明の１つ以上の抗体を用いて治療したＺＩＫＶ感染哺乳類において観察される。
【0113】
１つ以上の抗体が単独で使用される場合、または１つ以上の抗体が１つ以上のさらなる治療剤もしくは抗ＺＩＫＶ治療様式との組み合わせで使用される場合、防御の増強が観察され得る。
【0114】
１つ以上のさらなる治療剤は、抗ウイルス薬、抗炎症薬（コルチコステロイドなど、ならびにＴＮＦ）に対する抗体、ＺＩＫＶに対する異なる抗体、ＺＩＫＶに対するワクチンおよび／またはインターフェロン（アルファ／ベータ／またはラムダ）などの非ステロイド系抗炎症薬からなる群から選択され得る。
【0115】
一実施形態において、１つ以上のさらなる治療剤は、１つ以上の抗ＺＩＫＶ抗体を含む。
【0116】
一実施形態において、１つ以上の抗ＺＩＫＶ抗体は、表１の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）および軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）アミノ酸配列のいずれかからなる群から選択されるＨＣＶＲおよびＬＣＶＲアミノ酸配列を含む。
【0117】
関連する実施形態において、１つ以上の抗ＺＩＫＶ抗体は、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４、１６２／１７０、１７８／１８６、１９４／２０２、２１０／２１８、２２６／２３４、２４２／２５０、２５８／２６６、２７４／２８２、２９０／２９８、３０６／３１４、３２２／３３０および３３８／３４６からなる群から選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）および軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）のアミノ酸配列対を含む。
【0118】
別の関連する実施形態において、１つ以上の抗ＺＩＫＶ抗体は、配列番号６６／７４および２５８／２６６からなる群から選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）および軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）のアミノ酸配列対を含む。
【0119】
ある特定の実施形態において、１つ以上の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＺＩＫＶ感染を有するか、またはＺＩＫＶ感染を有するリスクがあるか、またはＺＩＫＶ感染を発症しやすい対象へ、予防上または治療上投与され得る。リスクがある対象には、ＺＩＫＶへ曝露された、もしくはＺＩＫＶを保有していると疑われる蚊に刺された妊婦、ＺＩＫＶの爆発的流行のある地域に居住していてもしくはその地域を訪れていて、妊娠中とみなされている女性、免疫不全の人、例えば、自己免疫疾患のために免疫不全である人、または免疫抑制療法を受けている人（例えば、臓器移植後）、ＺＩＫＶに感染した人から移植もしくは血液試料を受けている人、または、ヒト免疫不全症候群（ＨＩＶ）もしくは後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）に罹患している人、白血球を枯渇もしくは破壊するある特定の種の貧血、放射線療法もしくは化学療法を受けている人、または炎症性障害に罹患している人が含まれるが、これらに限定されない。ＺＩＫＶ感染を獲得することについてのリスクがある他の対象には、医療従事者、あるいは感染した個人と物理的に接触しているもしくは物理的に緊密な、または感染した個人からの体液もしくは組織へ曝露され、ＺＩＫＶ感染を発症するリスクも高い何らかの人が含まれる。そのうえ、対象は、疾患の爆発的流行に対して近くにいることにより、ＺＩＫＶ感染に罹患するリスクがあり、例えば、対象は、人口密度の高い都市にまたはＺＩＫＶ感染を確認されたもしくは疑われた対象に緊密に居住しており、あるいは雇用の選択にあり、例えば、ジカ患者が治療された病院施設もしくは研究所を清掃する責任のあるメンテナンス業者、病院職員、医薬研究者、ＺＩＫＶの爆発的流行を有していることが知られているもしくは有していると疑われる地域もしくは国またはＺＩＫＶを保有しているかもしれない蚊を有していることが知られている地域もしくは国を訪れたもしくは訪れることを計画している個人である。
【0120】
ある特定の実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、それを必要とする対象へ、第２の治療剤との組み合わせで投与される。第２の治療剤は、抗炎症薬（コルチコステロイドおよび非ステロイド系抗炎症薬、例えば抗ＴＮＦ抗体）、抗感染薬、抗ウイルス薬、ＺＩＫＶに対する異なる抗体、ＺＩＫＶに対するワクチン、またはインターフェロン、抗酸化剤などの栄養補助食品、およびＺＩＫＶ感染の少なくとも１つの症状を寛解させるために、または患者におけるウイルス量を減少させるために有用な当該技術分野で既知の何らかの他の薬剤または療法からなる群から選択され得る。ある特定の実施形態において、第２の治療剤は、本発明の抗体または抗原結合フラグメントと関連した何らかの起こり得る副作用（複数可）が生じるであろう場合、この副作用に対処またはこれを軽減するのを助ける薬剤であり得る。抗体またはそのフラグメントは、皮下に、静脈内に、皮内に、腹腔内に、経口で、鼻腔内に、筋肉内に、または頭蓋内に投与することができる。一実施形態において、抗体は、対象の血清中の抗体の最大濃度のための単回静脈内注入として投与することができる。抗体またはそのフラグメントは、対象の体重１ｋｇあたり約０．１ｍｇ～約１００ｍｇの用量で投与され得る。ある特定の実施形態において、本発明の抗体は、５０ｍｇ～６００ｍｇを含む１つ以上の用量で投与され得る。
【0121】
本発明には、ＺＩＫＶを有しているか、もしくはＺＩＫＶを有していると疑われるか、もしくはＺＩＫＶへ曝露された対象を治療する上での使用のための、または細胞へのＺＩＫＶの付着、もしくは細胞膜とのＺＩＫＶの融合の遮断から利益を得るであろう疾患もしくは障害の治療のための薬剤の製造における使用のための、本発明の抗ＺＩＫＶ抗体またはその抗原結合フラグメントも含まれる。
【0122】
他の実施形態は、後述の詳細な説明の再検討から明らかとなることになっている。
【図面の簡単な説明】
【0123】
【図1】すべてのフラビウイルスと交差反応するキメラ抗体を用いて抗体依存性増強（ＡＤＥ）を測定するための免疫蛍光アッセイの結果を示す。
【図2】ジカウイルス感染マウスにおける体重減少の予防に及ぼす抗ジカ抗体Ｈ４Ｈ２５７０３Ｎの防御効果を示す。
【図3】ジカウイルス感染マウスにおける体重減少の予防に及ぼす抗ジカ抗体Ｈ４Ｈ２５６１９Ｐの防御効果を示す。
【図4】ジカウイルス感染マウスにおける生存に及ぼす抗ジカ抗体Ｈ４Ｈ２５７０３Ｎの防御効果を示す。
【図5】ジカウイルス感染マウスにおける生存に及ぼす抗ジカ抗体Ｈ４Ｈ２５６１９Ｐの防御効果を示す。
【図6】ＩｇＧ１またはＩｇＧ４のいずれかとして調製された抗ジカウイルス抗体Ｈ４Ｈ２５７０３Ｎを用いて抗体依存性増強（ＡＤＥ）を測定するためのアッセイの結果を示す。
【図7】ＩｇＧ１またはＩｇＧ４のいずれかとして調製された抗ジカウイルス抗体Ｈ４Ｈ２５６１９Ｐを用いて抗体依存性増強（ＡＤＥ）を測定するためのアッセイの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0124】
本発明の方法を説明する前に、本発明は、特定の方法および説明される実験条件が変わり得るので、このような方法および条件に制限されないことは理解されることになっている。本明細書で使用する用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ制限されるので、制限することを企図するものではないことも理解されることになっている。
【0125】
別段の定義がない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明の属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に説明されるものと類似のまたは等価の何らかの方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料をこれから説明する。本明細書で言及される特許、出願および非特許刊行物はすべて、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0126】
定義
「ジカウイルス」または「ＺＩＫＶ」は、フラビウイルス科のメンバーであり、ウイルスへ曝露された妊婦の胎児における小頭症および他の発達異常と関連しており（Ｓｃｈｕｌｅｒ－Ｆａｃｃｉｎｉ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，（２０１６），ＭＭＷＲ Ｍｏｒｂ．Ｍｏｒｔａｌ．Ｗｋｌｙ Ｒｅｐ．６５：５９－６２）、成人におけるギラン・バレー症候群とも関連している（Ｃａｏ－Ｌｏｒｍｅａｕ，ＶＭ，ｅｔ ａｌ．，（２０１６），Ｌａｎｃｅｔ，Ａｐｒ ９；３８７（１００２７）：１５３１－９）。「ＺＩＫＶ」という用語には、異なるＺＩＫＶ単離株から単離されたＺＩＫＶの変異体も含まれる。
「ジカウイルス」または「ＺＩＫＶ」は、フラビウイルス科のメンバーであり、ウイルスへ曝露された妊婦の胎児における小頭症および他の発達異常と関連しており（Ｓｃｈｕｌｅｒ－Ｆａｃｃｉｎｉ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，（２０１６），ＭＭＷＲ Ｍｏｒｂ．Ｍｏｒｔａｌ．Ｗｋｌｙ Ｒｅｐ．６５：５９－６２）、成人におけるギラン・バレー症候群とも関連している（Ｃａｏ－Ｌｏｒｍｅａｕ，ＶＭ，ｅｔ ａｌ．，（２０１６），Ｌａｎｃｅｔ，Ａｐｒ ９；３８７（１００２７）：１５３１－９）。「ＺＩＫＶ」という用語には、異なるＺＩＫＶ単離株から単離されたＺＩＫＶの変異体も含まれる。
【0127】
本明細書中で「ＺＩＫＶ Ｅ」と記載されるＺＩＫＶエンベロープ糖タンパク質（Ｅ）のアミノ酸配列は、受託番号ＡＬＵ３３３４１．１としてＧｅｎＢａｎｋにおいて認められるポリタンパク質アミノ酸配列内に例示されている（配列番号３５３も参照されたい）。この用語は、例えば、ヒスチジンタグ（例えば、ヒスチジンタグ（配列番号３５４および３５５）を有する受託番号ＡＬＵ３３３４１．１を参照されたい）、マウスＦｃもしくはヒトＦｃ、またはシグナル配列へ連結されたＺＩＫＶ Ｅまたはそのフラグメントも包含する。ＺＩＫＶ Ｅのアミノ酸配列も配列番号３７６に示されている。Ｈ４Ｈ２５７０３ＮについてのＥタンパク質エスケープ変異は、配列番号３７７の位置３０２（Ｓ３０２Ｆ）に示されている。Ｈ４Ｈ２５６１９ＰについてのＥタンパク質エスケープ変異は、配列番号３７８の位置３１１（Ｔ３１１Ｉ）および位置３６９（Ｋ３６９Ｅ）に示されている。
【0128】
本明細書で使用する「ＺＩＫＶ感染」または「ＺＩＫＶ感染」という用語は、ウイルスへの（例えば、ウイルスを保有する蚊によって刺された後）、もしくは感染した動物への、もしくは感染したヒト患者への曝露、またはＺＩＫＶ感染を有する動物もしくはヒト患者に由来する体液もしくは組織との接触からもたらされる疾患または容態を指す。「ＺＩＫＶ感染と関連した症状」には、発熱、頭痛、関節痛、筋肉痛および斑状丘疹性発疹が含まれる。「ウイルスへの曝露からもたらされる容態」または「ウイルスへの曝露と関連した容態」には、ウイルスを保有している蚊に刺された後にウイルスに感染した妊婦の胎児の小頭症（または発達異常）も含まれる。別の「ウイルスへの曝露からもたらされる容態」または「ウイルスへの曝露と関連した容態」には、ギラン・バレー症候群が含まれる。
【0129】
本明細書で使用する「抗体」という用語は、４つのポリペプチド鎖、すなわちジスルフィド結合によって相互接続された２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖からなる免疫グロブリン分子（すなわち、「完全抗体分子」）、ならびにこれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）またはその抗原結合フラグメントを指すよう企図される。各重鎖は、重鎖可変領域（「ＨＣＶＲ」または「ＶＨ」）および重鎖定常領域（ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインからなる）からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（「ＬＣＶＲまたは「ＶＬ」）および軽鎖定常領域（ＣＬ）からなる。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が点在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域へとさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなる。本発明のある特定の実施形態において、抗体（またはその抗原結合フラグメント）のＦＲは、ヒト生殖系列配列と同一であってもよく、または天然にもしくは人工的に修飾されていてもよい。アミノ酸コンセンサス配列は、２つ以上のＣＤＲの並列分析に基づいて定義され得る。
【0130】
１つ以上のＣＤＲ残基の置換または１つ以上のＣＤＲの省略も可能である。抗体は、１つまたは２つのＣＤＲが結合のために省かれることができると科学文献に説明されている。Ｐａｄｌａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５ ＦＡＳＥＢ Ｊ．９：１３３－１３９）は、公開された結晶構造に基づいて、抗体とこれらの抗原の間の接触領域を分析し、ＣＤＲ残基の約１／５～１／３のみが実際に抗原と連絡すると結論づけた。Ｐａｄｌａｎは、１つまたは２つのＣＤＲが抗原と接触しているアミノ酸を有さない多くの抗体も発見した（Ｖａｊｄｏｓ ｅｔ ａｌ．２００２ Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３２０：４１５－４２８も参照されたい）。
【0131】
抗原と連絡していないＣＤＲ残基は、先行研究に基づいて、ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲの外側にあるＫａｂａｔのＣＤＲの領域から、分子モデリングによっておよび／または演繹的に識別することができる（例えば、ＣＤＲＨ２中の残基Ｈ６０～Ｈ６５はしばしば必要ではない）。ＣＤＲまたはその残基（複数可）が省略される場合、そのＣＤＲまたはその残基（複数可）は、別のヒト抗体配列またはこのような配列のコンセンサスにおける対応する位置を占有するアミノ酸と置換される。ＣＤＲ内の置換のための位置および置換すべきアミノ酸も演繹的に選択することができる。演繹的な置換は、保存的置換または非保存的置換であり得る。
【0132】
本明細書に開示する完全ヒト抗ＺＩＫＶモノクローナル抗体は、対応する生殖系列配列と比較して、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域に１つ以上のアミノ酸置換、挿入および／または欠失を含み得る。このような変異は、本明細書中に開示するアミノ酸配列を、例えば公共の抗体配列データベースから入手可能な生殖系列配列と比較することによって容易に確認することができる。本発明は、本明細書に開示するアミノ酸配列のいずれかに由来する抗体およびその抗原結合フラグメントを含み、１以上のフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内の１以上のアミノ酸は、抗体が由来した生殖系列配列の対応する残基（複数可）へ、または別のヒト生殖系列配列の対応する残基（複数可）へ、または対応する生殖系列残基（複数可）の保存的アミノ酸置換へ変異する（このような配列変化はまとめて、「生殖系列変異」と本明細書で呼ばれる）。当業者は、本明細書に開示する重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列から出発して、１つ以上の個々の生殖系列変異またはこれらの組み合わせを含む多数の抗体および抗原結合フラグメントを容易に産生することができる。ある特定の実施形態において、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメイン内のフレームワークおよび／またはＣＤＲ残基はすべて、抗体が由来した元の生殖系列配列において認められる残基へと変異し戻される。他の実施形態において、ある特定の残基のみが元の生殖系列配列へと変異し戻され、例えば、変異した残基はＦＲ１の最初の８個のアミノ酸内に、もしくは変異した残基はＦＲ４の最後の８個のアミノ酸内に認められ、または変異した残基は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３内にのみ認められる。他の実施形態において、フレームワークおよび／またはＣＤＲ残基（複数可）の１つ以上は、異なる生殖系列配列（すなわち、抗体が本来由来した生殖系列配列とは異なる生殖系列配列）の対応する残基（複数可）へ変異する。さらに、本発明の抗体は、フレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内に２つ以上の生殖系列変異の何らかの組み合わせを含有してもよく、例えば、ある特定の個々の残基は、特定の生殖系列配列の対応する残基へ変異するのに対し、元の生殖系列配列とは異なるある特定の他の残基は、維持され、または異なる生殖系列配列の対応する残基へ変異する。いったん得られれば、１つ以上の生殖系列変異を含有する抗体および抗原結合フラグメントは、結合特異性の改善、結合親和性の増大、アンタゴニストまたはアゴニストの生物学的特性の改善または亢進（場合により得る）、免疫原性の低下などの１つ以上の所望の特性について容易に試験することができる。この一般的な様式で得られた抗体および抗原結合フラグメントは、本発明に包含される。
【0133】
本発明は、１つ以上の保存的置換を有する本明細書に開示するＨＣＶＲアミノ酸配列、ＬＣＶＲアミノ酸配列、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかの変異体を含む完全ヒト抗ＺＩＫＶモノクローナル抗体も含む。例えば、本発明は、本明細書に開示するＨＣＶＲアミノ酸配列、ＬＣＶＲアミノ酸配列、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかに対して、例えば１０個以下、８個以下、６個以下または４個以下などの保存的アミノ酸置換を有するＨＣＶＲアミノ酸配列、ＬＣＶＲアミノ酸配列、および／またはＣＤＲアミノ酸配列を有する抗ＺＩＫＶ抗体を含む
【0134】
「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むよう企図される。本発明のヒトｍＡｂは、例えば、ＣＤＲ、特にＣＤＲ３における、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的変異誘発によってまたはインビボでの体細胞突変異によって導入された変異）によってコードされないアミノ酸残基を含み得る。しかしながら、「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、別の哺乳類種（例えば、マウス）の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトＦＲ配列へと移植されたｍＡｂを含むよう企図されるものではない。この用語は、非ヒト哺乳類において、または非ヒト哺乳類の細胞において組換え産生された抗体を含む。この用語は、ヒト対象から単離された、またはヒト被験体において生成された抗体を含むよう企図されるものではない。
【0135】
本明細書で使用する「組換え」という用語は、例えばＤＮＡスプライシングおよび遺伝子導入発現を含む組換えＤＮＡ技術として当該技術分野で既知の技術または方法によって作製、発現、単離または得られた本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントを指す。この用語は、非ヒト哺乳類（トランスジェニック非ヒト哺乳類、例えばトランスジェニックマウスを含む）、もしくは細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）発現系において発現した抗体、または組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体を指す。
【0136】
「～を特異的に結合する」という用語もしくは「～へ特異的に結合する」という用語、またはこれらに類するものは、抗体またはその抗原結合フラグメントが、生理学的条件下で比較的安定である抗原と複合体を形成することを意味する。特異的結合は、少なくとも約１×１０－７Ｍ以下の平衡解離定数を特徴とすることができる（例えば、より小さなＫＤはより緊密な結合を示す）。２つの分子が特異的に結合するかどうかを決定するための方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴、およびこれらに類するものを含む。本明細書で説明するように、抗体は、ＺＩＫＶへ特異的に結合する表面プラズモン共鳴、例えばＢＩＡＣＯＲＥ（商標）によって識別されている。そのうえ、ＺＩＫＶにおける１つのドメインおよび１つ以上のさらなる抗原へ結合する多重特異性抗体またはＺＩＫＶの２つの異なる領域へ結合する二重特異性は、それにもかかわらず、本明細書で使用する「特異的に結合する」抗体とみなされる。
【0137】
「高親和性」抗体という用語は、表面プラズモン共鳴、例えばＢＩＡＣＯＲＥ（商標）または溶液親和性ＥＬＩＳＡによって測定されるように、少なくとも１０－７Ｍ、好ましくは１０－８Ｍ、より好ましくは１０－９Ｍ、さらにより好ましくは１０－１０Ｍ、さらにより好ましくは１０－１１Ｍ、さらにより好ましくは１０－１２ＭのＫＤとして表される、ＺＩＫＶに対する結合親和性を有するｍＡｂを指す。
【0138】
「緩徐なオフ速度」、「Ｋｏｆｆ」または「ｋｄ」という用語によって意味されるのは、速度定数が表面プラズモン共鳴、例えばＢＩＡＣＯＲＥ（商標）によって測定されるような、１×１０－３秒－１以下、好ましくは１×１０－４秒－１以下である、ＺＩＫＶから解離する抗体、またはＺＩＫＶ Ｅを表すウイルス様粒子である。
【0139】
抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合フラグメント」という用語、およびこれらに類するものは、本明細書で使用する場合、抗原を特異的に結合して複合体を形成する何らかの天然の、酵素によって入手可能な、合成の、または遺伝子操作されたポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。抗体の「抗原結合フラグメント」、または「抗体フラグメント」という用語は、本明細書で使用する場合、ＺＩＫＶへ結合する能力を保持する抗体の１つ以上のフラグメントを指す。
【0140】
具体的な実施形態において、本発明の抗体または抗体フラグメントは、ＺＩＫＶに起因する感染を治療するのに有用な抗ウイルス薬、第２の抗ＺＩＫＶ抗体、または任意の他の治療部分など、このようなリガンドまたは治療部分（「免疫複合体」）の部分へ結合し得る。
【0141】
「単離された抗体」は、本明細書で使用する場合、異なる抗原特異性を有する他の抗体（Ａｂ）を実質的に含まない抗体を指すよう企図される（例えば、ＺＩＫＶを特異的に結合する単離された抗体またはそのフラグメントは、ＺＩＫＶ以外の抗原を特異的に結合するＡｂを実質的に含まない。
【0142】
「遮断抗体」または「中和抗体」は、本明細書で使用する場合、（または「ＺＩＫＶ活性を中和する抗体」もしくは「アンタゴニスト抗体」）は、ＺＩＫＶへの結合がＺＩＫＶの少なくとも１つの生物活性の阻害をもたらす抗体を指すよう企図される。例えば、本発明の抗体は、宿主細胞へのＺＩＫＶの付着、融合および／または侵入を防止または遮断することができる。さらに、「中和抗体」とは、宿主における感染を開始および／または持続させる病原体の能力を中和することができる、すなわち防止、阻害、低減、妨害または干渉することができるものである。「中和抗体」および「中和する抗体（ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈａｔ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅｓ）」または「中和する抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅ）」という用語は、本明細書で相互交換可能に使用される。これらの抗体は、単独でまたは組み合わせにおいて、適切な処方の際に他の抗ウイルス薬とともに予防薬または治療薬として、あるいは活性ワクチン接種と関連して、あるいは診断ツールとして使用することができる。
【0143】
「抗体依存性増強」または「ＡＤＥ」とは、抗ウイルス抗体へ結合したときにウイルスがＦｃ受容体を有する細胞に侵入し、この細胞における感染性の増大をもたらす機序である。ＡＤＥは、実験室で培養された細胞においては一般的であるが、フラビウイルス科のメンバーであるデングウイルスの感染を除き、インビボではほとんど起こらない。このウイルスは、この機序を用いてマクロファージを感染させ、通常軽度のウイルス感染が生命を脅かすこととなり得る。
【0144】
「表面プラズモン共鳴」という用語は、本明細書で使用する場合、例えばＢＩＡＣＯＲＥ（商標）システム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ，スウェーデン国ウプサラ市およびニュージャージー州ピスカタウェイ郡区）を用いて、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化の検出によってリアルタイムでの生体分子相互作用の分析を可能にする光学現象を指す。
【0145】
「ＫＤ」という用語は、本明細書で使用する場合、特定の抗体－抗原相互作用の平衡解離定数を指すよう企図される。
【0146】
「エピトープ」という用語は、パラトープとして既知の抗体分子の可変領域における特異的抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を指す。単一の抗原は２つ以上のエピトープを有してもよい。したがって、異なる抗体は、抗原上の異なる領域へ結合し得、異なる生物学的効果を有し得る。「エピトープ」という用語は、Ｂ細胞および／またはＴ細胞が応答する抗原上の部位も指す。この用語は、抗体が結合する抗原の領域も指す。エピトープは、構造的または機能的と定義され得る。機能的エピトープは概して、構造エピトープのサブセットであり、相互作用の親和性に直接寄与する残基を有する。エピトープは、立体配座的でもあり得、すなわち、非線形アミノ酸から構成され得る。ある特定の実施形態において、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、またはスルホニル基などの分子の化学的に活性のある表面群である決定基を含み得、ある特定の実施形態において、特異的三次元構造特徴および／または比電荷特徴を有し得る。
【0147】
「交差競合」という用語は、本明細書で使用する場合、抗原へ結合し、別の抗体またはその抗原結合フラグメントの結合を阻害または遮断する抗体または抗原結合フラグメントを意味する。この用語は、両方の配向における２つの抗体間の競合、すなわち結合して第２の抗体の結合を遮断する第１の抗体、およびその逆も含む。ある特定の実施形態において、第１の抗体および第２の抗体は、同じエピトープへ結合し得る。あるいは、第１および第２の抗体は、例えば、立体障害を介して、あるものの結合が第２の抗体の結合を阻害または遮断するように、異なってはいるが重複しているエピトープへ結合し得る。抗体間の交差競合は、当該技術分野で既知の方法によって、例えば、リアルタイムの無標識バイオ層干渉測定アッセイによって測定してもよい。試験抗体が本発明の参照抗ＺＩＫＶ抗体と交差競合するかどうかを判定するために、参照抗体を飽和条件下でＺＩＫＶ Ｅまたはペプチドへ結合させておく。次に、ＺＩＫＶ Ｅへ結合する試験抗体の能力を評価する。試験抗体が、参照抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体との飽和結合後にＺＩＫＶ Ｅへ結合することができる場合、試験抗体は参照抗ＺＩＫＶ抗体とは異なるエピトープへ結合すると結論づけることができる。その一方で、試験抗体が、参照抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体との飽和結合後にＺＩＫＶ Ｅへ結合できない場合、試験抗体は、本発明の参照抗ＺＩＫＶ Ｅによって結合したエピトープと同じエピトープへ結合し得る。
【0148】
「実質的な同一性」または「実質的に同一である」という用語は、核酸またはそのフラグメントを指す場合、別の核酸（またはその相補鎖）との適切なヌクレオチド挿入または欠失と最適に整列した場合、以下に考察するように、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＧＡＰなど、配列同一性の何らかの周知のアルゴリズムによって測定されるように、ヌクレオチド塩基の少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％においてヌクレオチド配列同一性があることを示す。参照核酸分子と実質的な同一性を有する核酸分子は、ある特定の場合において、参照核酸分子によってコードされるポリペプチドと同じまたは実質的に類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。
【0149】
ポリペプチドへ適用される場合、「実質的な類似性」または「実質的に類似の」という用語は、２つのペプチド配列が、既定のギャップ重みを用いてプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適に整列した場合、少なくとも９０％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％、９８％または９９％の配列同一性を共有する。好ましくは、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換だけ異なる。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を備えた側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されたものである。概して、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させないことになっている。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換だけ互いに異なる場合、相同性の百分率または程度は、置換の保存的性質を補正するために上向きに調整してもよい。この調整を行うための手段は、当業者に周知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＰｅａｒｓｏｎ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７－３３１を参照されたい。類似の化学的特性を備えた側鎖を有するアミノ酸の基の例としては、１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン、２）脂肪族－ヒドロキシル側鎖：セリンおよびトレオニン、３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン、４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、およびヒスチジン、６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸、ならびに７）含硫側鎖：システインおよびメチオニンが挙げられる。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、グルタミン酸－アスパラギン酸およびアスパラギン－グルタミンである。あるいは、保存的置換とは、参照により本明細書に組み込まれるＧｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３ ４５に開示されるＰＡＭ２５０対数尤度行列において正の値を有する何らかの変化である。「適度に保存的な」置換とは、ＰＡＭ２５０対数尤度行列において負以外の値を有する何らかの変化である。
【0150】
ポリペプチドについての配列類似性は、典型的には、配列解析ソフトウェアを用いて測定される。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む種々の置換、欠失および他の修飾へ割り当てられた類似性の測定値を用いて類似の配列と一致させる。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、異なる種の生物由来の相同ポリペプチドのような密接に関連するポリペプチド間の、または野生型タンパク質とその変異タンパク質の間の配列相同性または配列同一性を決定するための既定パラメータとともに使用することができるＧＡＰおよびＢＥＳＴＦＩＴなどのプログラムを含有する。例えば、ＧＣＧ第６．１版を参照されたい。ポリペプチド配列は、ＧＣＧ第６．１版におけるプログラムである、既定パラメータまたは推奨パラメータを備えたＦＡＳＴＡを使用して比較することもできる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）は、問い合わせ配列と検索配列の間の最良重複の領域の整列およびパーセント配列同一性を提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００）上述）。本発明の配列を、異なる生物由来の多数の配列を含有するデータベースと比較する場合の別の好ましいアルゴリズムは、既定パラメータを用いるコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、各々が参照により本明細書に組み込まれるＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０および（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２を参照されたい。
【0151】
「治療有効量」という句によって意味されるのは、所望の効果のために投与されて所望の効果を生じる量である。正確な量は、治療の目的によることになっており、既知の技術を用いて当業者によって確認できることになっている（例えば、Ｌｌｏｙｄ（１９９９）Ｔｈｅ Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇを参照されたい）。
【0152】
本明細書で使用する場合、「対象」という用語は、ウイルス感染などの疾患または障害の寛解、予防および／または治療を必要とする動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトを指す。対象は、ＺＩＫＶ感染症を有し得るか、またはＺＩＫＶ感染を発症する素因がある。「ＺＩＫＶ感染を発症しやすい」対象、または「ＺＩＫＶ感染にかかりやすいリスクの高まった可能性のある」対象とは、自己免疫疾患のために免疫系が損なわれた対象、免疫抑制療法を受けている対象（例えば、臓器移植後）、ヒト免疫不全症候群（ＨＩＶ）もしくは後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）に罹患している対象、ＺＩＫＶの爆発的流行を有していることがわかっている地域に居住しているもしくは訪れていて、かつ妊娠しているとみなされている女性に加えて、ＺＩＫＶの爆発的流行を有している地域に居住しているもしくは訪れている場合にＺＩＫＶへ曝露されたもしくは曝露された可能性のある妊婦、白血球を枯渇させるか破壊するある特定の型の貧血、放射線もしくは化学療法を受けている対象、または炎症性障害に罹患している対象である。さらに、非常に若年のまたは高齢の対象はリスクが高まっている。感染した動物もしくはヒト患者との物理的な接触もしくは密接な物理的緊密性がある、または感染した動物もしくはヒト患者に由来する体液もしくは組織へ曝露された何らかの人は、ＺＩＫＶ感染を発症するリスクが高まっている。そのうえ、対象は、この疾患の爆発的流行に近いためにＺＩＫＶ感染にかかるリスクがあり、例えば、対象は、人口密度の高い都市に、またはＺＩＫＶの感染が確認されもしくは疑われた対象に緊密に居住しており、あるいは雇用の選択、例えば、病院勤務者、医薬研究者、またはＺＩＫＶの爆発的流行を有していることがわかっているかもしくは疑われる地域もしくは国を訪れたもしくは訪れることを計画中である個人である。ＺＩＫＶ感染症に罹患した場合、対象において重度の転帰のリスクも高まる。妊婦がＺＩＫＶに感染すると、小頭症または他の発達異常を伴って生まれるかもしれないリスクが高まる。したがって、女性が妊娠しているか、または子供を妊娠しているとみなされていて、ＺＩＫＶの爆発的流行がある地域に住んでいるか、ＺＩＫＶの爆発的流行がある地域を訪れているか、ＺＩＫＶを保有している蚊を有していることがわかっている地域にいる場合、彼女はＺＩＫＶ感染にかかるリスクがある。対象をＺＩＫＶへ曝露した後ではギラン・バレー症候群を発症するリスクも高まる。
【0153】
本明細書で使用する場合、「治療する」、「治療すること」、または「治療」という用語は、本発明の抗体などの治療剤を必要とする対象へのこの治療剤の投与による、ＺＩＫＶ感染の少なくとも１つの症状または徴候の重症度の軽減または寛解を指す。この用語には、疾患の進行の抑制または感染の悪化の抑制が含まれる。この用語には、疾患の正の予後も含まれ、すなわち、本発明の抗体などの治療剤の投与の際に対象は感染がなくてもよく、またはウイルス力価が低下しているか、もしくは全くなくてもよい。治療剤は、対象へ治療量で投与され得る。
【0154】
「予防する」、「予防すること」または「予防」という用語は、本発明の抗体の投与の際の、ＺＩＫＶ感染の症状発現の抑制またはＺＩＫＶ感染の何らかの症状もしくは徴候の抑制を指す。この用語には、ウイルスへ曝露されたまたはＺＩＫＶ感染を有するリスクがある対象における感染の広がりの予防が含まれる。
【0155】
本明細書で使用する場合、「抗ウイルス薬」という用語は、化学的部分であろうと生物学的療法であろうと、対象におけるウイルス感染を治療、予防、または寛解するために使用される、何らかの抗感染剤または抗感染療法を指す。例えば、本発明において、抗ウイルス薬には、ＺＩＫＶに対する抗体（一実施形態において、ＺＩＫＶに対する抗体は、本明細書に説明される抗体とは異なることがある）、ＺＩＫＶに対するワクチン、直接作用性抗ウイルス剤、およびインターフェロン（または他の免疫調節薬）が含まれ得るが、これらに限定されない。本発明において、治療されることになっている感染は、ＺＩＫＶによって引き起こされる。
【0156】
一般的な説明
ＺＩＫＶ感染とは概して、健康な対象における軽度の疾患であるが、ウイルスへ曝露された妊婦は、小頭症または他の発達異常を有する乳児を出産するリスクがある。このウイルスは、フラビウイルス科の一員である。
ＺＩＫＶ感染とは概して、健康な対象における軽度の疾患であるが、ウイルスへ曝露された妊婦は、小頭症または他の発達異常を有する乳児を出産するリスクがある。このウイルスは、フラビウイルス科の一員である。
【0157】
このウイルスのゲノムは、長さおよそ１１ｋｂの一本鎖のポジティブセンスＲＮＡからなり、約１０個の遺伝子をコードする。ジカビリオンは、カプシドタンパク質（Ｃ）、膜タンパク質／前膜タンパク質（Ｍ／ｐｒＭ）、およびエンベロープ糖タンパク質（Ｅ）の３つの構造タンパク質を含有する。ウイルスゲノムは、７つの非構造タンパク質もコードする。
【0158】
ＺＩＫＶ Ｅへ特異的に結合し、ＺＩＫＶと宿主細胞との相互作用を調節する、完全ヒト抗体およびその抗原結合フラグメントが本明細書に説明される。抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体は、高親和性でＺＩＫＶへ結合し得る。ある特定の実施形態において、本発明の抗体は、細胞へのウイルスの付着を予防し得るか、または宿主細胞膜へのウイルスの融合を遮断し得る。そうすることで、抗体は細胞へのウイルス侵入を遮断し、このようにして宿主細胞のウイルス感染を抑制または中和する。いくつかの実施形態において、抗体は、ＺＩＫＶ感染に罹患している対象、またはＺＩＫＶ感染を獲得するリスクがある対象（例えば、ＺＩＫＶの爆発的流行を有する国に住んでいるか、またはその国を訪れている妊婦）を治療するために有用であり得る。抗体は、それを必要とする対象へ投与された場合、対象におけるＺＩＫＶのようなウイルスによる感染を低減し得る。抗体は、対象におけるウイルス量を減少させるために使用され得る。抗体は、単独で、またはウイルス感染を治療するための当該技術分野で既知の他の治療部分または治療様式を用いた補助療法として使用され得る。識別された抗体は、哺乳類を感染から保護するために予防上（感染前に）使用することができ、または既に確立された感染を寛解するために、もしくは感染と関連した少なくとも１つの症状を寛解するために治療上使用することができる。
【0159】
例示的なＺＩＫＶポリタンパク質の完全長アミノ酸配列は、受託番号ＡＬＵ３３３４１．１としてＧｅｎＢａｎｋにおいて、および配列番号３５３においても示されている。ＺＩＫＶ Ｅのフラグメントは、配列番号３５４または３５５に示されるようなヒスチジンタグへカップリングし得る。ある特定の実施形態において、本発明の抗体は、ｐｒＭと、またはＺＩＫＶ Ｅの組換え形態もしくはそのフラグメントまたはｐｒＭおよびＥからなる粒子と同時発現する完全長ＺＩＫＶ Ｅなどの一次免疫原を用いて免疫化した後に、二次免疫原を用いて、またはＺＩＫＶ Ｅの免疫原として活性のあるフラグメントを用いて免疫化したマウスから得られる。ある特定の実施形態において、抗体は、ＺＩＫＶ ｐｒＭ／ＥをコードするＤＮＡで免疫化したマウスから得られる。
【0160】
免疫原は、ＺＩＫＶ Ｅの生物活性のあるおよび／もしくは免疫原性フラグメントまたはその活性のあるフラグメントをコードするＤＮＡであり得る。フラグメントは、ウイルスＥの何らかの領域に由来し得る。ペプチドは、タグ付けのために、またはＫＬＨなどの担体分子への結合の目的のために、ある特定の残基の付加または置換を含むように修飾され得る。例えば、システインは、ペプチドのＮ末端もしくはＣ末端のいずれかに付加されてもよく、またはリンカー配列を付加して、例えば、免疫化のためのＫＬＨへの結合のためのペプチドを調製してもよい。
【0161】
本発明のある特定の抗ＺＩＫＶ抗体は、インビトロアッセイまたはインビボアッセイによって測定されるように、ＺＩＫＶへ結合してその活性を中和することができる。本発明の抗体がＺＩＫＶへ結合してその活性を中和する能力、したがって宿主細胞へのウイルスの付着および／または侵入に続いて結果として起こるウイルス感染は、本明細書に説明されるような、結合アッセイまたは活性アッセイを含む、当業者に既知の何らかの標準的な方法を用いて測定され得る。
【0162】
結合活性を測定するための非限定的な、例示的なインビトロアッセイは、本明細書の実施例３に説明されている。実施例３において、抗ＺＩＫＶ Ｅの結合を、ｐｒＭ／Ｅを発現する細胞において産生されたウイルス様粒子（ＶＬＰ）への結合を評価することによって測定した。実施例４において、平衡解離定数を、Ｂｉａｃｏｒｅ４０００機におけるリアルタイム表面プラズモン共鳴を用いて測定した。中和アッセイを用いて、実施例５におけるＺＩＫＶの感染力に及ぼす抗ジカ抗体の効果を測定した。実施例６において交差競合アッセイを実施して、抗ジカ抗体の交差反応性を測定した。
【0163】
ＺＩＫＶ Ｅに特異的な抗体は、さらなる標識もしくは部分を含有していないことがあるか、またはＮ末端もしくはＣ末端の標識もしくは部分を含有していることがある。一実施形態において、標識または部分はビオチンである。結合アッセイにおいて、標識（存在する場合）の位置は、ペプチドが結合した表面に対するペプチドの向きを決定し得る。例えば、表面がアビジンでコーティングされている場合、Ｎ末端ビオチンを含有するペプチドは、このペプチドのＣ末端部分が表面から遠位になるように向けられることになっている。一実施形態において、標識は放射性核種、蛍光色素またはＭＲＩ検出可能標識であり得る。ある特定の実施形態において、このような標識された抗体は、撮像アッセイを含む診断アッセイにおいて使用され得る。
【0164】
抗体の抗原結合フラグメント
別段の具体的な記載がない限り、「抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、２つの免疫グロブリン重鎖および２つの免疫グロブリン軽鎖を含む抗体分子（すなわち、「完全抗体分子」）ならびにその抗原結合フラグメントを包含すると理解される。抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合フラグメント」という用語、およびこれらに類するものは、本明細書で使用する場合、天然の、酵素によって入手可能な、合成の、または遺伝子操作された、抗原を特異的に結合して複合体を形成するポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。抗体の「抗原結合フラグメント」または「抗体フラグメント」という用語は、本明細書で使用する場合、ＺＩＫＶへ特異的に結合する能力を保有する抗体の１つ以上のフラグメントを指す。抗体フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、ｄＡｂフラグメント、ＣＤＲを含有するフラグメント、または単離されたＣＤＲを含み得る。ある特定の実施形態において、「抗原結合フラグメント」という用語は、多重特異性抗原結合分子のポリペプチドフラグメントを指す。抗体の抗原結合フラグメントは、例えば、ＤＮＡコード抗体可変ドメインおよび（場合により）定常ドメインの操作および発現を包含するタンパク質消化技術または組換え遺伝子操作技術などの何らかの適切な標準的技術を用いて、完全抗体分子から得られ得る。このようなＤＮＡは既知であり、および／または例えば市販の供給源、ＤＮＡライブラリー（例えばファージ－抗体ライブラリーを含む）から容易に入手可能であるか、または合成することができる。ＤＮＡは、例えば、１つ以上の可変ドメインおよび／もしくは定常ドメインを適切な配置変更と配置し、またはコドンを導入し、システイン残基を作製し、アミノ酸を修飾、付加もしくは欠失などするために、化学的にまたは分子生物学技術を用いて配列決定および操作され得る。
別段の具体的な記載がない限り、「抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、２つの免疫グロブリン重鎖および２つの免疫グロブリン軽鎖を含む抗体分子（すなわち、「完全抗体分子」）ならびにその抗原結合フラグメントを包含すると理解される。抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合フラグメント」という用語、およびこれらに類するものは、本明細書で使用する場合、天然の、酵素によって入手可能な、合成の、または遺伝子操作された、抗原を特異的に結合して複合体を形成するポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。抗体の「抗原結合フラグメント」または「抗体フラグメント」という用語は、本明細書で使用する場合、ＺＩＫＶへ特異的に結合する能力を保有する抗体の１つ以上のフラグメントを指す。抗体フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、ｄＡｂフラグメント、ＣＤＲを含有するフラグメント、または単離されたＣＤＲを含み得る。ある特定の実施形態において、「抗原結合フラグメント」という用語は、多重特異性抗原結合分子のポリペプチドフラグメントを指す。抗体の抗原結合フラグメントは、例えば、ＤＮＡコード抗体可変ドメインおよび（場合により）定常ドメインの操作および発現を包含するタンパク質消化技術または組換え遺伝子操作技術などの何らかの適切な標準的技術を用いて、完全抗体分子から得られ得る。このようなＤＮＡは既知であり、および／または例えば市販の供給源、ＤＮＡライブラリー（例えばファージ－抗体ライブラリーを含む）から容易に入手可能であるか、または合成することができる。ＤＮＡは、例えば、１つ以上の可変ドメインおよび／もしくは定常ドメインを適切な配置変更と配置し、またはコドンを導入し、システイン残基を作製し、アミノ酸を修飾、付加もしくは欠失などするために、化学的にまたは分子生物学技術を用いて配列決定および操作され得る。
【0165】
抗原結合フラグメントの非限定例としては、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント、（ｉｖ）Ｆｖフラグメント、（ｖ）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、（ｖｉ）ｄＡｂフラグメント、および（ｖｉｉ）抗体の超可変領域（例えば、ＣＤＲ３ペプチドなどの単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））を模倣するアミノ酸残基または拘束ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４ペプチドからなる最小認識単位が挙げられる。ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ（例えば、一価ナノボディ、二価ナノボディなど）、小型モジュール型免疫医薬品（ＳＭＩＰ）、およびサメ可変ＩｇＮＡＲドメインなどの他の操作された分子も、本明細書で使用する「抗原結合フラグメント」という表現内に包含される。
【0166】
抗体の抗原結合フラグメントは、典型的には、少なくとも１つの可変ドメインを含むことになっている。可変ドメインは、何らかの大きさまたはアミノ酸組成物であり得、概して、１つ以上のフレームワーク配列に隣接しているかまたは１つ以上のフレームワーク配列とともにインフレームである少なくとも１つのＣＤＲを含む。ＶＬドメインと結合したＶＨドメインを有する抗原結合フラグメントにおいて、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、何らかの適切な配置で互いに対して配置され得る。例えば、可変領域は二量体であり、ＶＨ－ＶＨ、ＶＨ－ＶＬまたはＶＬ－ＶＬ二量体を含有し得る。あるいは、抗体の抗原結合フラグメントは、単量体のＶＨドメインまたはＶＬドメインを含有し得る。
【0167】
ある特定の実施形態において、抗体の抗原結合フラグメントは、少なくとも１つの定常ドメインへ共有結合した少なくとも１つの可変ドメインを含有し得る。本発明の抗体の抗原結合フラグメント内に認められ得る可変ドメインおよび定常ドメインの非限定的な例示的な立体配置には、（ｉ）ＶＨ－ＣＨ１、（ｉｉ）ＶＨ－ＣＨ２、（ｉｉｉ）ＶＨ－ＣＨ３、（ｉｖ）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２、（ｖ）ＶＨ －ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３、（ｖｉ）ＶＨ－ＣＨ２－ＣＨ３、（ｖｉｉ）ＶＨ－ＣＬ、（ｖｉｉｉ）ＶＬ－ＣＨ１、（ｉｘ）ＶＬ－ＣＨ２、（ｘ）ＶＬ－ＣＨ３、（ｘｉ）ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２、（ｘｉｉ）ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３、（ｘｉｉｉ）ＶＬ－ＣＨ２－ＣＨ３、および（ｘｉｖ）ＶＬ－ＣＬが含まれる。先に列挙した例示的な立体配置のいずれかを含む、可変ドメインおよび定常ドメインの何らかの立体配置において、可変ドメインおよび定常ドメインは、互いに直接連結されていてもよく、または完全もしくは部分的ヒンジ領域もしくはリンカー領域によって連結されていてもよい。ヒンジ領域は、単一のポリペプチド分子において隣接する可変ドメインおよび／または定常ドメイン間の可撓性または半可撓性の結合をもたらす少なくとも２つの（例えば、５、１０、１５、２０、４０、６０またはそれより多数の）アミノ酸からなり得る。そのうえ、本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、互いとのおよび／または１つ以上の単量体ＶＨドメインもしくはＶＬドメインとの非共有結合において、先に列挙した可変ドメイン立体配置および定常ドメイン立体配置の何らかのホモ二量体またはヘテロ二量体（または他の多量体）を含み得る。
【0168】
完全抗体分子と同様に、抗原結合フラグメントは、単一特異性または多重特異性（例えば、二重特異性）であり得る。抗体の多重特異性抗原結合フラグメントは、典型的には、少なくとも２つの異なる可変ドメインを含むことになっており、各可変ドメインは、別個の抗原へまたは同じ抗原上の異なるエピトープへ特異的に結合することができる。本明細書に開示される例示的な二重特異性抗体フォーマットを含む何らかの多重特異性抗体フォーマットは、当該技術分野で利用可能な通例の技術を使用して、本発明の抗体の抗原結合フラグメントの脈絡における使用に適合し得る。
【0169】
ヒト抗体の調製
トランスジェニックマウスにおいてヒト抗体を作製する方法は、当該技術分野で既知である。ＺＩＫＶ Ｅへ特異的に結合するヒト抗体を作製するために、いずれかのこのような既知の方法を本発明の脈絡において使用することができる。ＺＩＫＶに対する抗体を生成するために、以下のいずれか１つを含む免疫原を使用することができる。ある特定の実施形態において、本発明の抗体は、ｐｒＭ／Ｅまたはそのフラグメントからなる完全長ＺＩＫＶポリタンパク質のフラグメント（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＬＵ３３３４１．１（配列番号３５３）を参照されたい）で免疫化したマウスから得られる。あるいは、ＺＩＫＶ Ｅまたはそのフラグメントは、標準的な生化学的技術を用いて産生され得、免疫原として修飾および使用され得る。一実施形態において、免疫原は、組換え産生されたＺＩＫＶ Ｅまたはそのフラグメントである。本発明のある特定の実施形態において、免疫原は市販のＺＩＫＶ Ｅであってもよい。ある特定の実施形態において、１回以上のブースター注射が投与され得る。ある特定の実施形態において、ブースター注射は、１つ以上の市販のＺＩＫＶエンベロープ糖タンパク質を含み得る。ある特定の実施形態において、免疫原は、大腸菌においてまたはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの何らかの他の真核細胞もしくは哺乳類細胞において発現した組換えＺＩＫＶ Ｅであり得る。
トランスジェニックマウスにおいてヒト抗体を作製する方法は、当該技術分野で既知である。ＺＩＫＶ Ｅへ特異的に結合するヒト抗体を作製するために、いずれかのこのような既知の方法を本発明の脈絡において使用することができる。ＺＩＫＶに対する抗体を生成するために、以下のいずれか１つを含む免疫原を使用することができる。ある特定の実施形態において、本発明の抗体は、ｐｒＭ／Ｅまたはそのフラグメントからなる完全長ＺＩＫＶポリタンパク質のフラグメント（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＬＵ３３３４１．１（配列番号３５３）を参照されたい）で免疫化したマウスから得られる。あるいは、ＺＩＫＶ Ｅまたはそのフラグメントは、標準的な生化学的技術を用いて産生され得、免疫原として修飾および使用され得る。一実施形態において、免疫原は、組換え産生されたＺＩＫＶ Ｅまたはそのフラグメントである。本発明のある特定の実施形態において、免疫原は市販のＺＩＫＶ Ｅであってもよい。ある特定の実施形態において、１回以上のブースター注射が投与され得る。ある特定の実施形態において、ブースター注射は、１つ以上の市販のＺＩＫＶエンベロープ糖タンパク質を含み得る。ある特定の実施形態において、免疫原は、大腸菌においてまたはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの何らかの他の真核細胞もしくは哺乳類細胞において発現した組換えＺＩＫＶ Ｅであり得る。
【0170】
モノクローナル抗体を生成するためにＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）技術（例えば、ＵＳ６，５９６，５４１，Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）を参照されたい）または何らかの他の既知の方法を使用して、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する、ＺＩＫＶ Ｅに対する高親和性キメラ抗体をまず単離する。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）技術は、マウスが抗原刺激に対する応答においてヒト可変領域とマウス定常領域とを含む抗体を産生するように、ヒト重鎖可変領域とヒト軽鎖可変領域とを含むゲノムが内在性マウス定常領域座へ操作可能に連結されたトランスジェニックマウスの生成を包含する。抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを単離し、ヒト重鎖定常領域およびヒト軽鎖定常領域をコードするＤＮＡへ操作可能に連結する。次に、完全ヒト抗体を発現することができる細胞においてＤＮＡを発現させる。
【0171】
概して、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスに関心対象の抗原を負荷し、抗体を発現するマウスからリンパ細胞（Ｂ細胞など）を回収さする。リンパ細胞を骨髄腫細胞株と融合させて不死化ハイブリドーマ細胞株を調製し得、関心対象の抗原に特異的な抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を識別するためにこのようなハイブリドーマ細胞株をスクリーニングおよび選択する。重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを単離し得、重鎖および軽鎖の望ましいアイソタイプ定常領域へ連結することができる。このような抗体タンパク質は、ＣＨＯ細胞などの細胞において産生され得る。あるいは、抗原特異的キメラ抗体または軽鎖および重鎖の可変ドメインをコードするＤＮＡを抗原特異的リンパ球から直接単離することができる。
【0172】
まず、ヒト可変領域とマウス定常領域とを有する高親和性キメラ抗体を単離する。以下の実験セクションと同様に、抗体を、親和性、選択性、エピトープなどを含む望ましい特徴について特徴付け、選択する。マウス定常領域を、所望のヒト定常領域で置換して、例えば本発明の完全ヒト抗体、例えば、野生型のまたは修飾されたＩｇＧ１またはＩｇＧ４を生成する。選択した定常領域は特定の用途に応じて変化し得るが、高親和性抗原結合特徴および標的特異性特徴は可変領域に存在する。
【0173】
生物学的等価物
本発明の抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体および抗体フラグメントは、説明された抗体のアミノ酸配列とは異なるがＺＩＫＶと反応する能力を保有するアミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。このような変異体抗体および抗体フラグメントは、親配列と比較してアミノ酸の１つ以上の付加、欠失、または置換を含むが、説明された抗体の生物学的活性とは本質的に等価である生物学的活性を呈する。同様に、本発明の抗体コードＤＮＡ配列は、開示された配列と比較してヌクレオチドの１つ以上の付加、欠失、または置換を含むが、本発明の抗体または抗体フラグメントと本質的に生物学的に等価である抗体または抗体フラグメントをコードする配列を包含する。
本発明の抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体および抗体フラグメントは、説明された抗体のアミノ酸配列とは異なるがＺＩＫＶと反応する能力を保有するアミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。このような変異体抗体および抗体フラグメントは、親配列と比較してアミノ酸の１つ以上の付加、欠失、または置換を含むが、説明された抗体の生物学的活性とは本質的に等価である生物学的活性を呈する。同様に、本発明の抗体コードＤＮＡ配列は、開示された配列と比較してヌクレオチドの１つ以上の付加、欠失、または置換を含むが、本発明の抗体または抗体フラグメントと本質的に生物学的に等価である抗体または抗体フラグメントをコードする配列を包含する。
【0174】
２つの抗原結合タンパク質または抗体は、例えば、それらが類似の実験条件下で単回用量または複数回用量のいずれかで同じモル用量で投与された場合に、吸収速度および吸収の程度が有意差を示さない医薬的等価物または医薬的選択肢である場合、生物学的等価物とみなされる。いくつかの抗体は、これらの吸収の程度は等価であるが吸収速度は等価ではなく、吸収速度のこのような差が意図的であり、標識することに反映されているので生物学的に等価とみなされ得る場合、等価物または医薬選択肢とみなされることになっており、例えば長期使用に及ぼす有効な身体薬剤濃度の達成に必須ではなく、研究した特定の薬剤製品にとって医学的に有意ではないとみなされる。
【0175】
一実施形態において、２つの抗原結合タンパク質は、これらの安全性、純度、または効力において臨床的に意味のある差がない場合、生物学的に等価である。
【0176】
一実施形態において、２つの抗原結合タンパク質は、免疫原性の臨床的に有意な変化または有効性の減退を含む有害作用のリスクの期待される上昇なしで参照製品と生物製品の間での切り替えなしで持続される療法と比較して、患者が１回以上切り替えられることができる場合、生物学的に等価である。
【0177】
一実施形態において、２つの抗原結合タンパク質は、これらが両方とも、１つまたは複数の使用条件についての１つのまたは複数の共通の作用機序によって、このような機序が既知である程度まで作用する場合、生物学的に等価である。
【0178】
生物学的等価性は、インビボおよび／またはインビトロの方法によって実証され得る。生物学的等価性測定法には、例えば、（ａ）抗体またはその代謝産物の濃度が血液、血漿、血清または他の生物学的流体中で時間の関数として測定される、ヒトまたは他の哺乳類におけるインビボでの試験、（ｂ）ヒト生物学的利用能データと相関した、このデータを合理的に予測しているインビトロ試験、（ｃ）抗体（またはその標的）の適切な急性薬理学的効果が時間の関数として測定されるヒトまたは他の哺乳類におけるインビボ試験、および（ｄ）抗体の安全性、効能、または生物学的利用能もしくは生物学的等価性を確立する、十分に管理された臨床試験が含まれる。
【0179】
本発明の抗体の生物学的に等価な変異体は、例えば、残基もしくは配列の種々の置換を生じること、または生物活性に必要とされない末端もしくは内部の残基もしくは配列を欠失することによって構築され得る。例えば、生物学的活性にとって必須ではないシステイン残基は、再生の際の不必要または不正確な分子内ジスルフィド架橋の形成を防止するために、欠失または他のアミノ酸で置換することができる。他の脈絡において、生物学的に等価の抗体には、抗体のグリコシル化特徴を修飾するアミノ酸変化、例えばグリコシル化を排除または除去する変異を含む抗体変異体が含まれ得る。
【0180】
Ｆｃ変異体を含む抗ＺＩＫＶ抗体
本発明のある特定の実施形態によると、ＦｃＲｎ受容体への抗体結合を減退させる１つ以上の変異を含むＦｃドメインを含む抗ＺＩＫＶ抗体を調製することができる。
本発明のある特定の実施形態によると、ＦｃＲｎ受容体への抗体結合を減退させる１つ以上の変異を含むＦｃドメインを含む抗ＺＩＫＶ抗体を調製することができる。
【0181】
一実施形態において、本発明は、キメラ重鎖定常（ＣＨ）領域を含む抗ＺＩＫＶ抗体を含み、キメラＣＨ領域は、２つ以上の免疫グロブリンアイソタイプのＣＨ領域に由来するセグメントを含む。例えば、本発明の抗体は、ヒトＩｇＧ１分子、ヒトＩｇＧ２分子またはヒトＩｇＧ４分子に由来するＣＨ３ドメインの一部または全部と組み合わせて、ヒトＩｇＧ１分子、ヒトＩｇＧ２分子またはヒトＩｇＧ４分子に由来するＣＨ２ドメインの一部または全部を含むキメラＣＨ領域を含み得る。ある特定の実施形態によると、本発明の抗体は、キメラヒンジ領域を有するキメラＣＨ領域を含む。例えば、キメラヒンジは、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域、ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域またはヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「下部ヒンジ」配列（ＥＵ番号付けによる位置２２８～２３６のアミノ酸残基）と組み合わされた、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域、ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域またはヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「上部ヒンジ」アミノ酸配列（ＥＵ番号付けによる位置２１６～２２７のアミノ酸残基）を含むことができる。ある特定の実施形態によると、キメラヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１上部ヒンジまたはヒトＩｇＧ４上部ヒンジに由来するアミノ酸残基と、ヒトＩｇＧ２下部ヒンジに由来するアミノ酸残基とを含む。本明細書に説明されるキメラＣＨ領域を含む抗体は、ある特定の実施形態において、抗体の治療特性または薬物動態学的特性に負に影響を与えることなく修飾Ｆｃエフェクター機能を呈し得る。（例えば、その開示が全体として参照により本明細書により組み込まれる米国特許第９，３５９，４３７号を参照されたい）。
【0182】
本発明のある特定の実施形態において、本発明の脈絡における使用のための修飾Ｆｃドメインは、配列番号３５６に示されるアミノ酸配列を含むＩｇＧ１ Ｆｃを含み得る。あるいは、本発明の脈絡における使用のための修飾Ｆｃは、配列番号３５７または配列番号３５８に示されるアミノ酸配列を含むＩｇＧ４ Ｆｃを含み得る。本発明の脈絡において使用することのできる非限定的な例示的な修飾Ｆｃ領域は、その開示が全体として参照により本明細書により組み込まれる米国特許第９，３５９，４３７号およびＵＳ６２／１４０，３５０に示されている修飾Ｆｃ領域の何らかの機能的に等価の変異体と同様に示されている。
【0183】
ある特定の実施形態において、本発明には、以下の変異：Ｍ１３１Ｙ、Ｓ１３３ＴおよびＴ１３５Ｅ（配列番号３５８において番号付けされた残基に基づく）を有するＦｃドメインを含む抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体も含まれ、この変異は、抗体の血清半減期の延長を準備する。
【0184】
本発明の脈絡において使用することができる他の修飾ＦｃドメインおよびＦｃ修飾には、その開示がそれらの全体として参照により本明細書により組み込まれるＵＳ２０１４／０１７１６２３、ＵＳ８，６９７，３９６、ＵＳ２０１４／０１３４１６２、ＷＯ２０１４／０４３３６１において示される修飾のうちの何らかが含まれる。本明細書に説明される修飾Ｆｃドメインを含む抗体または他の抗原結合融合タンパク質を構築する方法は、当該技術分野で既知である。
【0185】
抗体依存性増強
抗体依存性増強（ＡＤＥ）とは、抗ウイルス抗体へ結合したときにウイルスがＦｃ受容体を有する細胞に侵入し、細胞における感染力の上昇をもたらす機序である。ＡＤＥは、多くのウイルス（ＺＩＫＶを含む）についてインビトロで実証されてきたが、ヒトにおけるＡＤＥについての唯一の注目せざるを得ないデータはデングウイルス感染に由来する。このウイルスは、この機序を利用してマクロファージを感染させ、通常軽度のウイルス感染を、生命を脅かすものとさせることができる。例えば、初回デング熱ウイルス感染は、自己制限有熱性疾患であるデング熱（ＤＦ）による症例の大部分について臨床的に明らかにされている。まれに致死的ではあるが、ＤＦはしばしば重度の播種性の身体痛、頭痛、発熱、発疹、リンパ節腫および白血球減少症を特徴とする。異種性デング熱ウイルスによるその後の感染は、デング出血熱（ＤＨＦ）またはデングショック症候群（ＤＳＳ）の致命的な疾患へとはるかにより重症にする可能性がある。一次感染を引き起こす血清型に対する抗体の存在は、二次感染における異種性血清型による感染を増強するという仮説が立てられている。このような二次感染の間に、異なる血清型のデングウイルスでは、中和していない交差反応性抗体は、単球およびランゲルハンス細胞（樹状細胞）に取り込まれ、感染細胞の数を増加させるウイルス－抗体複合体を形成する。このことは、細胞傷害性リンパ球の活性化をもたらし、このことが、血漿漏出ならびにＤＨＦおよびＤＳＳに特徴的な出血性特徴をもたらし得る。この感染の抗体依存性増強は、デング熱ウイルスに対する成功したワクチンの開発が非常に困難であると立証した１つの理由である。あまり頻繁ではないが、ＤＨＦ／ＤＳＳは一次感染の後に起こる可能性があるので、ウイルス毒力および免疫活性化もこの疾患の病原性に寄与すると考えられている。
抗体依存性増強（ＡＤＥ）とは、抗ウイルス抗体へ結合したときにウイルスがＦｃ受容体を有する細胞に侵入し、細胞における感染力の上昇をもたらす機序である。ＡＤＥは、多くのウイルス（ＺＩＫＶを含む）についてインビトロで実証されてきたが、ヒトにおけるＡＤＥについての唯一の注目せざるを得ないデータはデングウイルス感染に由来する。このウイルスは、この機序を利用してマクロファージを感染させ、通常軽度のウイルス感染を、生命を脅かすものとさせることができる。例えば、初回デング熱ウイルス感染は、自己制限有熱性疾患であるデング熱（ＤＦ）による症例の大部分について臨床的に明らかにされている。まれに致死的ではあるが、ＤＦはしばしば重度の播種性の身体痛、頭痛、発熱、発疹、リンパ節腫および白血球減少症を特徴とする。異種性デング熱ウイルスによるその後の感染は、デング出血熱（ＤＨＦ）またはデングショック症候群（ＤＳＳ）の致命的な疾患へとはるかにより重症にする可能性がある。一次感染を引き起こす血清型に対する抗体の存在は、二次感染における異種性血清型による感染を増強するという仮説が立てられている。このような二次感染の間に、異なる血清型のデングウイルスでは、中和していない交差反応性抗体は、単球およびランゲルハンス細胞（樹状細胞）に取り込まれ、感染細胞の数を増加させるウイルス－抗体複合体を形成する。このことは、細胞傷害性リンパ球の活性化をもたらし、このことが、血漿漏出ならびにＤＨＦおよびＤＳＳに特徴的な出血性特徴をもたらし得る。この感染の抗体依存性増強は、デング熱ウイルスに対する成功したワクチンの開発が非常に困難であると立証した１つの理由である。あまり頻繁ではないが、ＤＨＦ／ＤＳＳは一次感染の後に起こる可能性があるので、ウイルス毒力および免疫活性化もこの疾患の病原性に寄与すると考えられている。
【0186】
ＺＩＫＶ感染は、ＺＩＫＶと密接に関連しているデングウイルスへ既に曝露された地域において起こる。さらに、最近、デングウイルスに対する患者免疫由来の血漿がＺＩＫＶに対して実質的な交差反応性を示すことが示されている。加えて、デングウイルスエンベロープタンパク質と反応するヒト血清およびヒト抗体のパネルを用いて、これらの抗体もＺＩＫＶと反応することが示された。これらの抗体のいくつかは、ＺＩＫＶを結合することができたが、ウイルスを中和することはできず、代わりにインビトロでＡＤＥを促進した。
【0187】
ＡＤＥが起こる提唱された機序とは、豊富なＦｃγＲを含有するが低レベルの他のウイルス付着因子を含有する細胞の表面へウイルスを結合させることによるものである。このことは、他のウイルス付着因子の非存在下での細胞内在化をもたらし、正常な感染経路によるウイルス感染を開始する。
【0188】
ある特定の実施形態において、本発明の抗ＺＩＫＶ抗体は、エフェクター機能が低下した修飾Ｆｃドメインを含む。本明細書で使用する場合、「エフェクター機能が低下した修飾Ｆｃドメイン」は、修飾ＦｃがＦｃ部分の野生型の天然版を含む比較分子と比較して、細胞殺滅（例えば、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ）、補体活性化、食作用およびオプソニン化からなる群から選択される少なくとも１つの作用の重症度または程度の低減を呈するように、野生型の天然のＦｃドメインと比較して、修飾され、変異し、切断された免疫グロブリンの何らかのＦｃ部分を意味する。ある特定の実施形態において、「エフェクター機能が低下した修飾Ｆｃドメイン」とは、Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃγＲ）への結合が低下または弱化したＦｃドメインである。
【0189】
したがって、本発明のある特定の実施形態において、抗ＺＩＫＶ抗体は、ウイルスを中和する能力を維持すると同時に、そうすることで、正常なウイルス付着および／または融合の中和を通じてウイルス感染力の低下を可能にすると同時に、ＡＤＥが生じるのを防止するよう作用しながら、マクロファージおよびＦｃ受容体を有する他の細胞上のＦｃ受容体への結合の低下を可能にする抗体のＦｃ領域に対する修飾を含む。
【0190】
ある特定の実施形態によると、エフェクター機能が低下した修飾Ｆｃドメインとは、先に説明したように、配列番号３５７（位置１３１、１３３および１３５でのＹＴＥ修飾を伴わない）または位置３５８（位置１３１、１３３および１３５でのＹＴＥ修飾を有する）のいずれかに示されるアミノ酸配列を含む変異体ＩｇＧ４ Ｆｃである。このように、ＹＴＥ修飾のない変異体ＩｇＧ４ Ｆｃを有する抗体は、抗体依存性増強を実証しないであろうし、半減期の延長を有しないであろう（例えば、配列番号３６７／３６８のＨＣ／ＬＣを有するＨ４Ｈ２５７０３Ｎ）のに対し、ＹＴＥ修飾を有する変異体ＩｇＧ４ Ｆｃ（例えば、配列番号３６９／３６８のＨＣ／ＬＣを有するＨ４Ｈ２５７０３）を有する抗体は、抗体依存性増強を実証しないであろうが、半減期の延長を有するであろう。このように、野生型ＩｇＧ４ Ｆｃと比較して、抗体のエフェクター機能の低下およびより長い血清半減期のいずれか一方または両方をもたらすＦｃ修飾を行うことができる。
【0191】
本発明の一態様において、本発明は、ＺＩＫＶを中和するヒト抗体、抗体変異体、またはこれらの抗原結合フラグメントを含み、抗体、抗体変異体、または抗原結合フラグメントは、ＺＩＫＶ感染の抗体依存性増強に寄与しない。一実施形態において、本発明は、ＺＩＫＶを中和するヒト抗体、抗体変異体、またはその抗原結合フラグメントを含み、抗体、抗体変異体、または抗原結合フラグメントは、Ｆｃ領域において変異を含み、この変異は、Ｆｃ受容体への抗体の結合を低下させる。
【0192】
本発明の別の実施形態において、本発明は、ＺＩＫＶ Ｅを結合する２つ以上のヒト抗体またはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を含む。抗体または抗原結合フラグメントは、細胞へのウイルスの付着を防止し得るか、または宿主細胞膜へのウイルスの融合を防止し得、このように、細胞へのウイルスの侵入および細胞内の複製を防止し、ＺＩＫＶ感染の抗体依存性増強に寄与しない。
【0193】
抗体の生物学的特徴
概して、本発明の抗体は、ＺＩＫＶエンベロープ糖タンパク質（Ｅ）へ結合することによって機能する。例えば、本発明は、例えば、本明細書に説明されるアッセイフォーマットを用いた表面プラズモン共鳴によって測定されるように、１０－７Ｍ未満のＫＤでＺＩＫＶ Ｅを（例えば、２５℃または３７℃で）結合する抗体および抗体の抗原結合フラグメントを含む。ある特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば、本明細書に説明されるアッセイフォーマットを用いた表面プラズモン共鳴または実質的に類似のアッセイによって測定されるように、約１００ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約５００ｐＭ未満、２５０ｐＭ未満、約１００ｐＭ未満、または約１ｐＭ未満のＫＤでＺＩＫＶ Ｅを結合する。
概して、本発明の抗体は、ＺＩＫＶエンベロープ糖タンパク質（Ｅ）へ結合することによって機能する。例えば、本発明は、例えば、本明細書に説明されるアッセイフォーマットを用いた表面プラズモン共鳴によって測定されるように、１０－７Ｍ未満のＫＤでＺＩＫＶ Ｅを（例えば、２５℃または３７℃で）結合する抗体および抗体の抗原結合フラグメントを含む。ある特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば、本明細書に説明されるアッセイフォーマットを用いた表面プラズモン共鳴または実質的に類似のアッセイによって測定されるように、約１００ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約５００ｐＭ未満、２５０ｐＭ未満、約１００ｐＭ未満、または約１ｐＭ未満のＫＤでＺＩＫＶ Ｅを結合する。
【0194】
本発明はまた、例えば、本明細書で定義されたアッセイフォーマットを用いて２５℃で表面プラズモン共鳴によって、または実質的に類似のアッセイを使用して測定されるような約０．５分を超える、または３７℃で表面プラズモン共鳴によって測定されるような約０．３分を超える解離半減期（ｔ１／２）でＺＩＫＶを結合する抗体およびその抗原結合フラグメントも含み、ｐＨ７．４に対するｐＨ５．４またはｐＨ６での解離半減期（ｔ１／２）の変化を実証してもよくまたは実証しなくてもよい。ある特定の実施形態において、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、２５℃でまたは３７℃で、例えば本明細書で定義されるアッセイフォーマット（例えば、ｍＡｂ捕捉または抗原捕捉フォーマット）を用いる表面プラズモン共鳴または実質的に類似のアッセイによって測定されるような約１０分超、約３０分超、約６０分超、約１００分超、約２００分超、約３００分超、約４００分超、約５００分超、約６００分超、約７００分超、約８００分超、約９００分超、または約１０００分超のｔ１／２でＺＩＫＶを結合する。
【0195】
本発明は、ＺＩＫＶの宿主細胞に対するＺＩＫＶの感染力を中和する抗体またはその抗原結合フラグメントも含む。いくつかの実施形態において、抗体は、約１０－１１Ｍ～約１０－９Ｍの範囲のＩＣ５０でＺＩＫＶに対する中和効力を呈する。本発明の抗体は、ＭＲ７６６（ウガンダ１９４７）、ＰＲＶＡＢＣ５９（プエルトリコ２０１５）、およびＦＬＲ（コロンビア２０１５）を含むＺＩＫＶ株との交差反応もする。本発明の抗体は、約８０ｐＭ～約１５０ｎＭの範囲のＥＣ５０でＺＩＫＶ ｐｒＭ／Ｅを発現する細胞に由来するＶＬＰへも結合する。さらに、本発明の抗体は、ＺＩＫＶ Ｅを結合する他の抗体と交差競合する。
【0196】
一実施形態において、本発明は、ＺＩＫＶおよび／またはＺＩＫＶ Ｅへ特異的に結合する単離された組換え抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、この抗体は、以下の特徴：
（ａ）配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、１７８、１９４、２１０、２２６、２４２、２５８、２７４、２９０、３０６、３２２および３３８からなる群から選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）配列のいずれか１つの内部に含有される３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）と、配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、１８６、２０２、２１８、２３４、２５０、２６６、２８２、２９８、３１４、３３０および３４６からなる群から選択される軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）配列のいずれか１つの内部に含有される３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）とを含み、
（ｂ）完全ヒトモノクローナル抗体であり、
（ｃ）約８０ｐＭ～約１５０ｎＭの範囲のＥＣ５０でジカｐｒＭ／Ｅを発現するＶＬＰへ結合し、
（ｄ）表面プラズモン共鳴アッセイにおいて測定されるように、１０－７Ｍ未満の解離定数（ＫＤ）でＺＩＫＶ Ｅへ結合し、
（ｅ）ｐＨ７．４に対するｐＨ５またはｐＨ６での解離半減期（ｔ１／２）の変化を示しても示さなくてもよく、
（ｆ）約１０－１１Ｍ～約１０－９Ｍの範囲のＩＣ５０でＺＩＫＶの中和を示し、
（ｇ）ＺＩＫＶ感染動物におけるインビボでの防御作用を示し、
（ｈ）参照抗体と交差競合する、の１つ以上を有し、参照抗体は、表１のＨＣＶＲアミノ酸配列およびＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかからなる群から選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）と軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）アミノ酸配列とを含む。
（ａ）配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、１７８、１９４、２１０、２２６、２４２、２５８、２７４、２９０、３０６、３２２および３３８からなる群から選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）配列のいずれか１つの内部に含有される３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）と、配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、１８６、２０２、２１８、２３４、２５０、２６６、２８２、２９８、３１４、３３０および３４６からなる群から選択される軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）配列のいずれか１つの内部に含有される３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）とを含み、
（ｂ）完全ヒトモノクローナル抗体であり、
（ｃ）約８０ｐＭ～約１５０ｎＭの範囲のＥＣ５０でジカｐｒＭ／Ｅを発現するＶＬＰへ結合し、
（ｄ）表面プラズモン共鳴アッセイにおいて測定されるように、１０－７Ｍ未満の解離定数（ＫＤ）でＺＩＫＶ Ｅへ結合し、
（ｅ）ｐＨ７．４に対するｐＨ５またはｐＨ６での解離半減期（ｔ１／２）の変化を示しても示さなくてもよく、
（ｆ）約１０－１１Ｍ～約１０－９Ｍの範囲のＩＣ５０でＺＩＫＶの中和を示し、
（ｇ）ＺＩＫＶ感染動物におけるインビボでの防御作用を示し、
（ｈ）参照抗体と交差競合する、の１つ以上を有し、参照抗体は、表１のＨＣＶＲアミノ酸配列およびＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかからなる群から選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）と軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）アミノ酸配列とを含む。
【0197】
本発明の抗体は、上述の生物学的特徴の１つ以上、またはこれらの何らかの組み合わせを有することができる。本発明の抗体の特性のいくつかを以下に要約する。本発明の抗体の他の生物学的特徴は、本明細書で機能する実施例を含む本開示の再吟味から当業者に明らかであることになっている。
【0198】
エピトープマッピングおよび関連技術
本発明は、ＺＩＫＶのＥ内に認められる１つ以上のアミノ酸と相互作用する抗ＺＩＫＶ抗体を含む。抗体が結合するエピトープは、３つ以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれより多数）のＺＩＫＶ Ｅ（例えばドメイン中の線状エピトープ）内に位置するアミノ酸の単一連続配列を含み得る。あるいは、エピトープは、ＺＩＫＶ Ｅ（例えば、立体配座エピトープ）内に位置する複数の非連続アミノ酸（またはアミノ酸配列）からなっていてもよい。
本発明は、ＺＩＫＶのＥ内に認められる１つ以上のアミノ酸と相互作用する抗ＺＩＫＶ抗体を含む。抗体が結合するエピトープは、３つ以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれより多数）のＺＩＫＶ Ｅ（例えばドメイン中の線状エピトープ）内に位置するアミノ酸の単一連続配列を含み得る。あるいは、エピトープは、ＺＩＫＶ Ｅ（例えば、立体配座エピトープ）内に位置する複数の非連続アミノ酸（またはアミノ酸配列）からなっていてもよい。
【0199】
当業者に既知の種々の技術を用いて、抗体がポリペプチドまたはタンパク質内にある「１つ以上のアミノ酸と相互作用する」かどうかを判定することができる。例示的な技術としては、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）に説明されているような通例の交差遮断アッセイが挙げられる。他の方法には、アラニン走査変異分析、ペプチドブロット分析（Ｒｅｉｎｅｋｅ（２００４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８：４４３－６３）、ペプチド切断分析結晶学的研究およびＮＭＲ分析が含まれる。加えて、エピトープ切除、エピトープ抽出および抗原の化学修飾などの方法を採用することができる（Ｔｏｍｅｒ（２０００）Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．９：４８７－４９６）。抗体が相互作用するポリペプチドの内部にあるアミノ酸を識別するために用いることができる別の方法は、質量分析によって検出される水素／重水素交換である。一般的にいえば、水素／重水素交換法は、関心対象のタンパク質を重水素標識した後、抗体を重水素標識タンパク質へ結合させることを包含する。次に、タンパク質／抗体複合体を水に移し、抗体複合体によって保護されたアミノ酸の内部にある交換可能なプロトンは、界面の一部ではないアミノ酸の内部にある交換可能なプロトンよりも低速で重水素から水素への逆交換を受ける。結果として、タンパク質／抗体界面の一部を形成するアミノ酸は、重水素を保持することができ、それゆえ、界面に含まれないアミノ酸と比較して相対的に大きな質量を呈する。抗体の解離後、標的タンパク質をプロテアーゼ切断および質量分析へ供し、それにより、抗体が相互作用する特定のアミノ酸に対応する重水素標識残基を明らかにする。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ（１９９９）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６７：２５２－２５９、Ｅｎｇｅｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（２００１）Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．７３：２５６Ａ－２６５Ａを参照されたい。
【0200】
「エピトープ」という用語は、Ｂ細胞および／またはＴ細胞が応答する抗原上の部位を指す。Ｂ細胞エピトープは、タンパク質の三次元折りたたみによって並置された連続的なアミノ酸または非連続的なアミノ酸の両方から形成されることができる。連続的なアミノ酸から形成されたエピトープは、典型的には、変性溶媒への曝露の際に保持されるのに対し、三次元折りたたみによって形成されたエピトープは、典型的には、変性溶媒を用いた処理の際に失われる。エピトープは、典型的には、独特の空間的立体配座で少なくとも３個、より通常は少なくとも５個または８～１０個のアミノ酸を含む。
【0201】
抗原構造ベースの抗体プロファイリング（ＡＳＡＰ）としても既知の修飾支援プロファイリング（ＭＡＰ）とは、化学的にまたは酵素により修飾された抗原表面に対する各抗体の結合特性の類似性により、同じ抗原に対する多数のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）をカテゴリー分類する方法である（そのすべてが全体として参照により本明細書に具体的に組み込まれるＵＳ２００４／０１０１９２０を参照されたい）。各カテゴリーは、別のカテゴリーによって表されるエピトープとは明確に異なるか、または部分的に重複するかのいずれかの独特のエピトープを反映し得る。この技術は、特徴づけが遺伝的に異なる抗体に的を絞ることができるよう、遺伝的に同一の抗体の迅速なフィルタリングを可能にする。ハイブリドーマスクリーニングへ適用する場合、ＭＡＰは、所望の特徴を有するｍＡｂを産生する稀なハイブリドーマクローンの識別を容易にし得る。ＭＡＰを使用して、本発明の抗体を、異なるエピトープを結合する抗体の群に選別することができる。
【0202】
ある特定の実施形態において、ＺＩＫＶ抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＺＩＫＶ Ｅにおいて例示される何らかの１つ以上の領域の内部にあるエピトープを、天然形態で、または組換え産生されてかのいずれかで結合するか、またはそのフラグメントへ結合する。
【0203】
一実施形態において、Ｈ４Ｈ２５７０３Ｎ抗体およびＨ４Ｈ２５６１９Ｐ抗体を用いてエスケープ変異体を生成した。これらの研究の結果は、セリンからフェニルアラニンへの変化が、変異したＥタンパク質への結合の喪失をもたらし、また、Ｈ４Ｈ２５７０３Ｎ抗体のウイルス中和能力の喪失ももたらしたので、配列番号３７６の位置３０２のセリンがＥタンパク質へ結合するＨ４Ｈ２５７０３Ｎ抗体において役割を担っていることを実証した。同様に、Ｈ４Ｈ２５６１９Ｐ抗体を使用して生成されたエスケープ変異体を用いた結果は、配列番号３７６の位置３１１のトレオニンからイソロイシンへの変化および位置３６９のリジンからグルタミン酸への変化が、変異したＥタンパク質への抗体の結合の喪失をもたらし、Ｈ４Ｈ２５６１９Ｐ抗体のウイルス中和能力の喪失ももたらしたので、配列番号３７６の位置３１１位のトレオニンおよび配列番号３７６の位置３６９のリジンがＥタンパク質へのＨ４Ｈ２５６１９Ｐの結合において役割を担っていることを実証した。
【0204】
本発明は、同じエピトープまたはこのエピトープの一部へ結合する抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体を含む。同様に、本発明は、ＺＩＫＶ Ｅまたはそのフラグメントへの結合について、本明細書に説明する特定の例示的な抗体のいずれかと競合する抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体も含む。例えば、本発明は、ＺＩＫＶへの結合について、表１および表２に説明する抗体から得られた１つ以上の抗体と交差競合する抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体を含む。
【0205】
当該技術分野で既知の通例の方法を使用することによって、抗体が参照抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体と同じエピトープへ結合するか、または結合について参照抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体と競合するかを容易に決定することができる。例えば、試験抗体が本発明の参照抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体と同じエピトープへ結合するかどうかを決定するために、参照抗体を飽和条件下でＺＩＫＶ Ｅまたはペプチドへ結合させておく。次に、ＺＩＫＶ Ｅへ結合する試験抗体の能力を評価する。試験抗体が、参照抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体との飽和結合後にＺＩＫＶ Ｅへ結合することができる場合、この試験抗体は参照抗ＺＩＫＶ抗体とは異なるエピトープへ結合すると結論づけることができる。その一方で、試験抗体が、参照抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体との飽和結合後にＺＩＫＶ Ｅへ結合できない場合、試験抗体は、本発明の参照抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体によって結合したエピトープと同じエピトープへ結合し得る。
【0206】
抗体が参照抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体との結合について競合するかどうかを決定するために、上述の結合方法を２つの向きで実施する。第１の向きにおいて、参照抗体を飽和条件下でＺＩＫＶ Ｅへ結合させておいた後、ＺＩＫＶ Ｅへの試験抗体の結合を評価する。第２の向きにおいて、試験抗体を飽和条件下でＺＩＫＶ Ｅへ結合させておいた後、ＺＩＫＶ Ｅへの参照抗体の結合を評価する。両方の向きにおいて、第１の（飽和している）抗体のみがＺＩＫＶ Ｅへ結合することができる場合、試験抗体および参照抗体はＺＩＫＶ Ｅへの結合について競合すると結論づけられる。当業者によって認識されることになっているように、参照抗体との結合について競合する抗体は、必ずしも参照抗体と同一のエピトープへ結合する必要はないかもしれないが、重複しているまたは隣接しているエピトープを結合することによって、参照抗体の結合を立体的に遮断するかもしれない。
【0207】
２つの抗体は、それぞれが抗原へのその他の結合を競合的に阻害する（遮断する）場合、同じかまたは重複するエピトープへ結合する。すなわち、１倍、５倍、１０倍、２０倍または１００倍過剰量の一方の抗体は、競合結合において測定されるように、少なくとも５０％、しかし好ましくは７５％、９０％またはさらには９９％ほど、もう一方の抗体の結合を阻害する（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９０ ５０：１４９５－１５０２を参照されたい）。あるいは、一方の抗体の結合を低減または排除する抗原における本質的にすべてのアミノ酸変異がもう一方の抗体の結合を低減または排除する場合、２つの抗体は同じエピトープを有する。一方の抗体の結合を低減または排除するいくつかのアミノ酸変異がもう一方の結合を低減または排除する場合、２つの抗体は重複しているエピトープを有する。
【0208】
次に、試験抗体の結合の観察された欠失が、実際に、参照抗体と同じエピトープへの結合によるものであるか、それとも立体遮断（または別の現象）が、観察された結合の欠失の原因であるのかを確認するために、さらなる通例の実験（例えば、ペプチド変異および結合分析）を実施することができる。この種の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリーまたは当該技術分野で利用可能な何らかの他の定量的または定性的な抗体結合アッセイを用いて行うことができる。
【0209】
免疫複合体
本発明は、ＺＩＫＶ感染を治療するための抗ウイルス薬などの、治療部分へ結合したヒト抗ＺＩＫＶ Ｅモノクローナル抗体（「免疫複合体」）を包含する。本明細書で使用する場合、「免疫複合体」という用語は、放射性物質、サイトカイン、インターフェロン、標的部分もしくはレポーター部分、酵素、ペプチドもしくはタンパク質または治療剤へ化学的にまたは生物学的に連結した抗体を指す。抗体は、その標的へ結合することができる限り、分子に沿った何らかの位置で、放射性物質、サイトカイン、インターフェロン、標的部分もしくはレポーター部分、酵素、ペプチドまたは治療剤へ連結され得る。免疫複合体の例としては、抗体薬剤複合体および抗体－毒素融合タンパク質が挙げられる。一実施形態において、薬剤は、ＺＩＫＶまたはＺＩＫＶ Ｅに対する第２の異なる抗体であってもよい。ある特定の実施形態において、抗体は、ウイルス感染した細胞に特異的な薬剤へ結合し得る。抗ＺＩＫＶ抗体へ結合し得、治療されることになっている容態および達成されることになっている所望の治療効果を考慮することになっている治療部分のタイプ。免疫複合体を形成するのに適した薬剤の例は、当該技術分野で既知であり、例えばＷＯ０５／１０３０８１を参照されたい。
本発明は、ＺＩＫＶ感染を治療するための抗ウイルス薬などの、治療部分へ結合したヒト抗ＺＩＫＶ Ｅモノクローナル抗体（「免疫複合体」）を包含する。本明細書で使用する場合、「免疫複合体」という用語は、放射性物質、サイトカイン、インターフェロン、標的部分もしくはレポーター部分、酵素、ペプチドもしくはタンパク質または治療剤へ化学的にまたは生物学的に連結した抗体を指す。抗体は、その標的へ結合することができる限り、分子に沿った何らかの位置で、放射性物質、サイトカイン、インターフェロン、標的部分もしくはレポーター部分、酵素、ペプチドまたは治療剤へ連結され得る。免疫複合体の例としては、抗体薬剤複合体および抗体－毒素融合タンパク質が挙げられる。一実施形態において、薬剤は、ＺＩＫＶまたはＺＩＫＶ Ｅに対する第２の異なる抗体であってもよい。ある特定の実施形態において、抗体は、ウイルス感染した細胞に特異的な薬剤へ結合し得る。抗ＺＩＫＶ抗体へ結合し得、治療されることになっている容態および達成されることになっている所望の治療効果を考慮することになっている治療部分のタイプ。免疫複合体を形成するのに適した薬剤の例は、当該技術分野で既知であり、例えばＷＯ０５／１０３０８１を参照されたい。
【0210】
多重特異性抗体
本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性または多重特異性であり得る。多重特異性抗体は、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的であり得るか、または２つ以上の標的ポリペプチドに特異的な抗原結合ドメインを含有し得る。例えば、Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０－６９、Ｋｕｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：２３８－２４４を参照されたい。
本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性または多重特異性であり得る。多重特異性抗体は、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的であり得るか、または２つ以上の標的ポリペプチドに特異的な抗原結合ドメインを含有し得る。例えば、Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０－６９、Ｋｕｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：２３８－２４４を参照されたい。
【0211】
本発明の多重特異性抗原結合分子のいずれか、またはその変異体は、当業者に既知であることになっているように、標準的な分子生物学的技術（例えば、組換えＤＮＡおよびタンパク質発現技術）を用いて構築され得る。
【0212】
いくつかの実施形態において、ＺＩＫＶ特異的抗体は、ＺＩＫＶの異なるドメインへ結合する可変領域が一緒に連結されて、単一の結合分子内に二重ドメイン特異性を付与する二重特異性フォーマット（「二重特異性」）で生成される。適切に設計された二重特異性は、特異性および結合力の両方を増大させることを通じて全体的なＺＩＫＶタンパク質阻害効力を増強し得る。個々のドメインに対して特異性を有する可変領域（例えば、Ｎ末端ドメインのセグメント）、または１つのドメイン内の異なる領域へ結合することができる可変領域は、各領域を別個のエピトープへ、または１つのドメイン内の異なる領域へ、同時に結合させる構造的足場の上で対形成している。二重特異性についての一例において、１つのドメインに対する特異性を備えた結合剤由来の重鎖可変領域（ＶＨ）は、第２のドメインに対する特異性を備えた一連の結合剤由来の軽鎖可変領域（ＶＬ）と組み合わされて、ＶＨに対する元の特異性を破壊することなく、元のＶＨと対形成することができる非同族ＶＬのパートナーを識別する。このように、単一のＶＬセグメント（例えば、ＶＬ１）を２つの異なるＶＨドメイン（例えば、ＶＨ１およびＶＨ２）と組み合わせて、２つの結合「アーム」（ＶＨ１－ＶＬ１およびＶＨ２－ＶＬ１）から構成される二重特異性を生じることができる。単一のＶＬセグメントの使用は、このシステムの複雑性を低減させ、それにより、二重特異性を生成するために使用されるクローニング過程、発現過程、および精製過程における効率を単純化し、増大させる（例えば、ＵＳＳＮ１３／０２２７５９およびＵＳ２０１０／０３３１５２７を参照されたい）。
【0213】
あるいは、例えば第２の異なる抗ＺＩＫＶ抗体などであるがこれに限定されない、２つ以上のドメインおよび第２の標的を結合する抗体は、本明細書に説明される技術または当業者に既知の他の技術を使用して、二重特異性フォーマットで調製することができる。異なる領域へ結合する抗体可変領域は、単一の結合分子内に二重抗原特異性を付与するために、例えばＺＩＫＶ上の関連部位へ結合する可変領域と一緒に連結され得る。この性質の適切に設計された二重特異性は、二重の機能を果たす。細胞外ドメインに対する特異性を備えた可変領域は、細胞外ドメインの外側に対する特異性を備えた可変領域と組み合わされ、各可変領域が別々の抗原へ結合することを可能にする構造的足場の上で対形成する。
【0214】
本発明の脈絡において使用することのできる例示的な二重特異性抗体フォーマットは、第１の免疫グロブリン（Ｉｇ）ＣＨ３ドメインおよび第２のＩｇＣＨ３ドメインの使用を包含し、第１および第２のＩｇＣＨ３ドメインは、少なくとも１つのアミノ酸ほど互いに異なっており、少なくとも１つのアミノ酸の相違は、このアミノ酸の相違を欠失する二重特異性抗体と比較して、プロテインＡへの二重特異性抗体の結合を低減させる。一実施形態において、第１のＩｇＣＨ３ドメインはプロテインＡを結合し、第２のＩｇＣＨ３ドメインはＨ９５Ｒ修飾（ＩＭＧＴエクソン番号付けによるものであり、ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）などのプロテインＡ結合を低減または消失させる変異を含有する。第２のＣＨ３は、Ｙ９６Ｆ修飾（ＩＭＧＴによるものであり、ＥＵによるＹ４３６Ｆ）をさらに含み得る。第２のＣＨ３内に認められ得るさらなる修飾には、ＩｇＧ１抗体の場合、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによるものであり、ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、およびＶ４２２Ｉ）、ＩｇＧ２抗体の場合、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴであって、ＥＵによるＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）、ならびにＩｇＧ４抗体の場合、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによるものであり、ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）が含まれる。上述の二重特異性抗体フォーマットの変形は、本発明の範囲内で熟慮される。
【0215】
本発明の脈絡において使用することのできる他の例示的な二重特異性フォーマットには、例えば、ｓｃＦｖ系フォーマットまたはダイアボディ二重特異性フォーマット、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ融合、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）－Ｉｇ、Ｑｕａｄｒｏｍａ、ノブズ－イントゥ－ホールズ（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ）、共通の軽鎖（例えば、ノブズ－イントゥ－ホールズを備えた共通の軽鎖など）、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＣｒｏｓｓＦａｂ、（ＳＥＥＤ）ボディ、ロイシンジッパー、Ｄｕｏｂｏｄｙ、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、二重作用型Ｆａｂ（ＤＡＦ）－ＩｇＧ、およびＭａｂ２二重特異性フォーマットが含まれるが、これらに限定されない（上述のフォーマットの総説については、例えば、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．２０１２，ｍＡｂｓ ４：６，１－１１、およびそこに引用されている参考文献を参照されたい）。二重特異性抗体は、ペプチド／核酸結合を用いて構築することもでき、例えば、直交化学反応性を有する非天然アミノ酸を使用して、部位特異的抗体－オリゴヌクレオチド複合体を生成し、これが次に、規定される組成物、原子価および幾何学的形状を有する多量体複合体へと自己集合する。（例えば、Ｋａｚａｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．［Ｅｐｕｂ：２０１２年１２月４日］を参照されたい）。
【0216】
治療用の投与および製剤
本発明は、本発明の抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体またはその抗原結合フラグメントを含む治療用組成物を提供する。本発明に従った治療用組成物は、改善された移動、送達、寛容、およびこれらに類するものを提供するために、製剤へと組み込まれた適切な担体、賦形剤、および他の薬剤とともに投与されることになっている。多くの適切な製剤は、製薬化学者全員に既知の処方集：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡにおいて認めることができる。これらの製剤には、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、ベシクル（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）など）を含有する脂質（カチオン性またはアニオン性）、ＤＮＡ複合体、無水吸収ペースト、水中油エマルションおよび油中水エマルション、エマルションカーボワックス（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、ならびにカーボワックスを含有する半固体混合物が含まれる。Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”ＰＤＡ（１９９８）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ ５２：２３８－３１１も参照されたい。
本発明は、本発明の抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体またはその抗原結合フラグメントを含む治療用組成物を提供する。本発明に従った治療用組成物は、改善された移動、送達、寛容、およびこれらに類するものを提供するために、製剤へと組み込まれた適切な担体、賦形剤、および他の薬剤とともに投与されることになっている。多くの適切な製剤は、製薬化学者全員に既知の処方集：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡにおいて認めることができる。これらの製剤には、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、ベシクル（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）など）を含有する脂質（カチオン性またはアニオン性）、ＤＮＡ複合体、無水吸収ペースト、水中油エマルションおよび油中水エマルション、エマルションカーボワックス（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、ならびにカーボワックスを含有する半固体混合物が含まれる。Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”ＰＤＡ（１９９８）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ ５２：２３８－３１１も参照されたい。
【0217】
抗体の用量は、投与されることになっている対象の年齢およびサイズ、標的疾患、容態、投与経路、ならびにこれらに類するものによって変わり得る。本発明の抗体を、成人患者における疾患もしくは障害を治療することに、またはこのような疾患を予防するために使用する場合、本発明の抗体を通常体重１ｋｇあたり約０．１～約６０ｍｇ、より好ましくは約５～約６０、約１０～約５０、または約２０～約５０ｍｇの単回用量で投与することが有利である。容態の重症度に応じて、治療の頻度および期間を調整することができる。ある特定の実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、少なくとも約０．１ｍｇ～約８００ｍｇ、約１～約５００ｍｇ、約５～約３００ｍｇ、または約１０～約２００ｍｇ、～約１００ｍｇ、もしくは～約５０ｍｇの１次用量として投与することができる。ある特定の実施形態において、１次用量に続いて、この１次用量とおよそ同じまたはそれ未満であり得る量で、第２のまたは複数のその後の用量の抗体またはその抗原結合フラグメントが投与され得、このその後の用量は、少なくとも１日間～３日間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、少なくとも９週間、少なくとも１０週間、少なくとも１２週間、または少なくとも１４週間離れている。
【0218】
種々の送達系が既知であり、本発明の医薬組成物を投与するために使用することができ、例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセルにおける封入、変異ウイルスを発現することのできる組換え細胞、受容体仲介性食作用である（例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９－４４３２を参照されたい）。導入方法には、皮内経路、経皮経路、筋肉内経路、腹腔内経路、静脈内経路、皮下経路、鼻腔内経路、硬膜外経路および経口経路が含まれるが、これらに限定されない。組成物は、例えば、注入もしくはボーラス注射による、上皮もしくは粘膜皮膚の裏打ち（例えば、口腔粘膜、直腸および腸の粘膜など）を通じての吸収による何らかの簡便な経路によって投与され得、他の生物学的に活性のある薬剤とともに投与され得る。投与は全身または局所であり得る。医薬組成物は、ベシクル、特にリポソーム中で送達されることもできる（例えば、Ｌａｎｇｅｒ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３を参照されたい）。
【0219】
本発明の抗体を送達するためのナノ粒子の使用もまた、本明細書において熟慮される。抗体結合ナノ粒子は、治療用途および診断用途の両方に使用され得る。抗体結合ナノ粒子ならびに調製方法および使用方法は、参照により本明細書に組み込まれるＡｒｒｕｅｂｏ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．２００９（“Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ“ｉｎ Ｊ．Ｎａｎｏｍａｔ．Ｖｏｌｕｍｅ ２００９，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４３９３８９，２４ ｐａｇｅｓ，ｄｏｉ：１０．１１５５／２００９／４３９３８９）によって詳細に説明されている。ナノ粒子は、ウイルス感染細胞を標的とするために開発され得、医薬組成物中に含有される抗体と結合され得る。薬物送達のためのナノ粒子は、例えば、各々がその全体として本明細書に組み込まれるＵＳ８２５７７４０、またはＵＳ８２４６９９５にも説明されている。
【0220】
ある特定の状況において、医薬組成物は徐放系で送達することができる。一実施形態において、ポンプを使用してもよい。別の実施形態において、ポリマー材料を使用することができる。さらに別の実施形態において、徐放系を組成物の標的の近傍に配置することができ、したがって全身用量のほんの一部しか必要としない。
【0221】
注射可能な調製物には、静脈内注射、皮下注射、皮内注射、頭蓋内注射、腹腔内注射および筋肉内注射、点滴注入などのための剤形が含まれ得る。これらの注射可能な調製物は、公共的に既知の方法によって調製され得る。例えば、注射可能な調製物は、例えば、注射用に従来通り使用される滅菌水性媒体または油性媒体中に上述の抗体またはその塩を溶解、懸濁または乳化させることによって調製され得る。注射用水性媒体としては、例えば、生理塩類溶液、グルコースを含有する等張液、および他の助剤などがあり、これらは、アルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ－５０（水素化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０モル）付加物）］などの適切な可溶化剤と併用され得る。油性媒体としては、例えば、ゴマ油、ダイズ油などが採用され、これらは安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどの可溶化剤と併用され得る。このようにして調製した注射液は、好ましくは、適切なアンプル中に充填される。
【0222】
本発明の医薬組成物は、標準的な針および注射器を用いて皮下にまたは静脈内に送達することができる。加えて、皮下送達に関して、ペン送達装置は、本発明の医薬組成物を送達する上での適用を容易に有する。このようなペン送達装置は、再利用可能または使い捨て可能であり得る。再利用可能なペン送達装置は、概して、医薬組成物を含有する交換可能なカートリッジを使用する。いったん、カートリッジ内の医薬組成物がすべて投与され、カートリッジが空になると、この空のカートリッジは容易に廃棄することができ、医薬組成物を含有する新しいカートリッジと容易に交換することができる。次に、ペン送達装置は再利用することができる。使い捨てのペン送達装置において、交換可能なカートリッジはない。むしろ、使い捨てペン送達装置は、この装置内の貯蔵器の中に保持された医薬組成物が事前に充填されている。いったん、貯蔵器が医薬組成物に関して空になると、装置全体が廃棄される。
【0223】
数多くの再利用可能なペン送達装置および自動注射送達装置は、本発明の医薬組成物の皮下送達における応用を有する。例としては、ＡＵＴＯＰＥＮ（商標）（Ｏｗｅｎ Ｍｕｍｆｏｒｄ，Ｉｎｃ．，英国ウッドストック町）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣ（商標）ペン（Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，スイス国ブルクドルフ市）、ＨＵＭＡＬＯＧ ＭＩＸ７５／２５（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＯＧ（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＩＮ ７０／３０（商標）ペン（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏ．，インディアナ州インディアナポリス市）、ＮＯＶＯＰＥＮ（商標）Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ，デンマーク国コペンハーゲン市）、ＮＯＶＯＰＥＮ ＪＵＮＩＯＲ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ，デンマーク国コペンハーゲン市）、ＢＤ（商標）ペン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ニュージャージー州フランクリンレイク地区）、ＯＰＴＩＰＥＮ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ ＰＲＯ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ ＳＴＡＲＬＥＴ（商標）、およびＯＰＴＩＣＬＩＫ（商標）（Ｓａｎｏｆｉ－Ａｖｅｎｔｉｓ，ドイツ国フランクフルト市）が挙げられるが、確かにこれらに限定されず、ほんの数種類しか挙げていない。本発明の医薬組成物の皮下送達における用途を有する使い捨てペン送達装置の例としては、ＳＯＬＯＳＴＡＲ（商標）ペン（Ｓａｎｏｆｉ－Ａｖｅｎｔｉｓ）、ＦＬＥＸＰＥＮ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）、およびＫＷＩＫＰＥＮ（商標）（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、ＳＵＲＥＣＬＩＣＫ（商標）自動注射装置（Ａｍｇｅｎ，カリフォルニア州サウザンドオークス市）、ＰＥＮＬＥＴ（商標）（Ｈａｓｅｌｍｅｉｅｒ，ドイツ国シュトゥットガルト市）、ＥＰＩＰＥＮ（Ｄｅｙ，Ｌ．Ｐ．）およびＨＵＭＩＲＡ（商標）ペン（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ，イリノイ州アボットパーク地区）が挙げられるが、ほんの数種類しか挙げていない。
【0224】
有利なことに、先に説明した経口または非経口での使用のための医薬組成物は、有効成分の用量に適合するのに適した単位用量の剤形へと調製される。単位用量におけるこのような剤形には、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル剤）、坐剤などが含まれる。含有される抗体の量は概して、単位用量で１剤形あたり約５～約５００ｍｇであり、特に注射の形態では、抗体は、約５～約１００ｍｇで、他の剤形について約１０～約２５０ｍｇで含有されることが好ましい。
【0225】
抗体の予防用または治療用の使用
本発明の抗体は、ＺＩＫＶ感染と関連した疾患もしくは障害もしくは容態の治療および／もしくは予防に、ならびに／またはこのような疾患、障害もしくは容態と関連した少なくとも１つの症状の寛解に有用である。
本発明の抗体は、ＺＩＫＶ感染と関連した疾患もしくは障害もしくは容態の治療および／もしくは予防に、ならびに／またはこのような疾患、障害もしくは容態と関連した少なくとも１つの症状の寛解に有用である。
【0226】
いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、宿主におけるウイルス力価を低下させるか、または宿主におけるウイルス量を低減するのに有用である。一実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＺＩＫＶ感染を有する患者へ治療用量で投与され得る。
【0227】
本発明の１つ以上の抗体は、疾患または障害の症状または容態の１つ以上の重症度を緩和または予防または低下させるために投与され得る。この抗体は、発熱、頭痛、関節痛、筋肉痛、および斑状丘疹発疹を含むがこれらに限定されないＺＩＫＶ感染の少なくとも１つの症状の重症度を寛解または低減するために使用され得る。
【0228】
本明細書において、免疫無防備状態の個人、ＺＩＫＶを保有していると考えられる蚊に刺された人、ＺＩＫＶへ曝露された妊婦、ＺＩＫＶの爆発的流行を有していることが既知の国に居住しているかもしくは訪れていて、妊娠しているとみなされている女性、ＺＩＫＶを持っていることが疑われる蚊を保有していることが既知の地域を訪れているかまたはこの地域に居住している個人、ＺＩＫＶの爆発的流行を有していることが既知であるかまたは有していることが疑われる地域または国を訪れたまたは訪れる計画をしている個人など、ＺＩＫＶ感染を発症するリスクがある対象へ、本発明の１つ以上の抗体を予防として使用することも熟慮される。
【0229】
本発明のさらなる実施形態において、本抗体は、ＺＩＫＶ感染にかかっている患者、またはこのウイルスを保有する蚊によって刺されたことを介してＺＩＫＶへ曝露された患者を治療するための医薬組成物の調製に使用される。本発明の別の実施形態において、本抗体は、ＺＩＫＶ感染を治療または寛解するために有用な、当業者に既知の何らかの他の薬剤または何らかの他の療法とともに補助療法として使用される。
【0230】
併用療法
併用療法には、本発明の抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体および本発明の抗体と、または本発明の抗体の生物学的に活性のあるフラグメントと有利に組み合わされ得る何らかの追加の治療剤が含まれ得る。本発明の抗体は、ＺＩＫＶ感染を治療するために使用される１つ以上の薬または薬剤と相乗的に組み合わされ得る。
併用療法には、本発明の抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体および本発明の抗体と、または本発明の抗体の生物学的に活性のあるフラグメントと有利に組み合わされ得る何らかの追加の治療剤が含まれ得る。本発明の抗体は、ＺＩＫＶ感染を治療するために使用される１つ以上の薬または薬剤と相乗的に組み合わされ得る。
【0231】
例えば、ウイルス感染を治療するための例示的な薬剤には、例えば、抗ウイルス薬、抗炎症薬（コルチコステロイド、および抗ＴＮＦなどの非ステロイド系抗炎症薬）、ＺＩＫＶに対する異なる抗体、ＺＩＫＶ用ワクチン、インターフェロン、免疫調節薬、またはＺＩＫＶ感染を治療するための何らかの他の緩和療法が含まれ得る。
【0232】
いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、ＺＩＫＶ感染を有する患者におけるウイルス量を低減させるために、あるいは感染の１つ以上の症状および／または胎児もしくは男性生殖器官への伝播を寛解するために、第２の治療剤と組み合わされ得る。。
【0233】
ある特定の実施形態において、第２の治療剤は、ＺＩＫＶ Ｅに特異的な別の異なる抗体または抗体カクテルであり、カクテル内の１つのまたは複数の異なる抗体は、本発明の抗体として、同じエピトープまたは重複エピトープへ結合してもよく、または結合しなくてもよい。ある特定の実施形態において、第２の治療剤は、異なるＺＩＫＶタンパク質に対する抗体である。第２の抗体は、ウイルスの異なる株に由来する１つ以上の異なるＺＩＫＶタンパク質に特異的であり得る。ＺＩＫＶに対する中和活性または阻害活性を有する本発明の抗体の組み合わせ（「カクテル」）を使用することは、本明細書で熟慮されている。いくつかの実施形態において、非競合抗体を組み合わせて、それを必要とする対象へ投与して、変異によりＺＩＫＶの回避能力を低減させ得る。いくつかの実施形態において、この組み合わせを含む抗体は、Ｅ上の異なる重複しないエピトープへ結合する。この組み合わせを含む抗体は、細胞へのウイルス付着を遮断し得、および／またはウイルスと細胞膜との融合を阻害し得、そうすることにより、宿主細胞へのＺＩＫＶ侵入を遮断し得る。抗体は、ＭＲ７６６（ウガンダ１９４７）株、ＰＲＶＡＢＣ５９（プエルトリコ２０１５）株およびＦＬＲ（コロンビア２０１５）株から選択されるＺＩＫＶ株由来のＥと相互作用し得、単独で、または先に記載の何らかの１つ以上の薬剤と併用される場合、記載したＺＩＫＶ株のいずれか１つ以上、またはその変異体を中和し得る。
【0234】
本明細書では、本発明の抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体の組み合わせを使用することも熟慮され、この組み合わせは、交差競合しない１つ以上の抗体を含む。ある特定の実施形態において、この組み合わせには、本発明の少なくとも２つまたは少なくとも３つの抗体の混合物を含むカクテルが含まれる。カクテル内の抗体は、ウイルスまたはウイルス感染細胞を中和する能力、または細胞へのウイルス付着を遮断する能力、もしくは細胞膜へのウイルスの融合を遮断する能力、またはＺＩＫＶ Ｅを結合する能力が異なり得る。
【0235】
本明細書で使用する場合、「との組み合わせにおける」という用語は、追加の治療活性成分（複数可）が、本発明の少なくとも１つの抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体、または本発明の抗体の２つ以上を含むカクテルの投与の前に、投与と同時に、または投与の後に投与され得ることを意味する。「との組み合わせにおける」という用語は、抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体および第２の治療剤の連続投与または同時投与も含む。
【0236】
追加の治療活性成分（複数可）は、本発明の抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体の投与前に対象へ投与され得る。例えば、第１の成分が、第２の成分の投与から１週間前、７２時間前、６０時間前、４８時間前、３６時間前、２４時間前、１２時間、６時間前、５時間前、４時間前、３時間前、２時間前、１時間前、３０分前、１５分前、１０分前、５分前、または１分未満で投与される場合、第１の成分は、第２の成分の「前に」投与されるとみなされ得る。他の実施形態において、追加の治療活性成分（複数可）は、本発明の抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体の投与後に対象へ投与され得る。例えば、第１の成分が第２の成分の投与から１分後、５分後、１０分後、１５分後、３０分後、１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、６時間後、１２時間後、２４時間後、３６時間後、４８時間後、６０時間後、７２時間後に投与される場合、第１の成分は、第２の成分の「後に」投与されるとみなされ得る。さらに他の実施形態において、追加の治療活性成分（複数可）は、本発明の抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体の投与と同時に、対象へ投与され得る。本発明の目的のための「同時」投与には、例えば、対象への抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体および追加の治療活性成分の、単回剤形での、または互いに約３０分以内に対象へ投与される別個の剤形での投与が含まれる。別個の剤形で投与される場合、各剤形は同じ経路を介して投与され得（例えば、抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体および追加の治療活性成分の両方は、静脈内などで投与され得る）、あるいは、各剤形は、異なる経路を介して投与され得る（例えば、抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体は静脈内投与され得、追加の治療活性成分は経口投与され得る）。いずれの事象においても、単回剤形で、同じ経路による別個の剤形で、または異なる経路による別個の剤形でこの成分を投与することはすべて、本開示の目的のために、「同時投与」とみなされる。本開示の目的のために、追加の治療活性成分の投与「の前の」、「と同時の」、または「の後の」抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体の投与は、追加の治療活性成分「との組み合わせにおける」抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体の投与とみなされる。
【0237】
本発明には、本発明の抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体が、本明細書の他の箇所に説明されているような追加の治療活性成分（複数可）の１つ以上と同時製剤された医薬組成物が含まれる。
【0238】
投与様式
ある特定の実施形態によると、本発明の抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体（または本発明の１つ以上の抗体を含む医薬組成物、または１つ以上の抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体と本明細書に記載の追加の治療有効剤のいずれかとの組み合わせ）の単回用量は、それを必要とする対象へ投与され得る。本発明のある特定の実施形態によると、抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体（または抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体もしくは本発明の１つ以上の抗体と、本明細書に記載の追加の治療活性剤のいずれかとを含む医薬組成物）の複数回用量は、規定された時間経過にわたって対象へ投与され得る。本発明のこの態様による方法は、本発明の１つ以上の抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体の複数回用量を対象へ連続的に投与することを含む。本明細書で使用する場合、「連続的に投与すること」は、抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体の各用量が、異なる時点、例えば、事前に決めておいた間隔（例えば、数時間、数日間、数週間または数か月間）によって分けられた異なる日に対象へ投与されることを意味する。本発明には、抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体の単回１次用量に続いで、抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体の１回以上の２次用量、次いで場合により抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体の１回以上の３次用量を患者へ連続的に投与することを含む方法が含まれる。
ある特定の実施形態によると、本発明の抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体（または本発明の１つ以上の抗体を含む医薬組成物、または１つ以上の抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体と本明細書に記載の追加の治療有効剤のいずれかとの組み合わせ）の単回用量は、それを必要とする対象へ投与され得る。本発明のある特定の実施形態によると、抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体（または抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体もしくは本発明の１つ以上の抗体と、本明細書に記載の追加の治療活性剤のいずれかとを含む医薬組成物）の複数回用量は、規定された時間経過にわたって対象へ投与され得る。本発明のこの態様による方法は、本発明の１つ以上の抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体の複数回用量を対象へ連続的に投与することを含む。本明細書で使用する場合、「連続的に投与すること」は、抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体の各用量が、異なる時点、例えば、事前に決めておいた間隔（例えば、数時間、数日間、数週間または数か月間）によって分けられた異なる日に対象へ投与されることを意味する。本発明には、抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体の単回１次用量に続いで、抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体の１回以上の２次用量、次いで場合により抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体の１回以上の３次用量を患者へ連続的に投与することを含む方法が含まれる。
【0239】
「１次用量」、「２次用量」および「３次用量」という用語は、本発明の抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体の投与の時間的な連続を指す。したがって、「１次用量」とは、治療様式の開始時に投与される用量（「ベースライン用量」とも呼ばれる）であり、「２次用量」とは、１次用量後に投与される用量であり、「３次用量」とは、２次用量後に投与される用量である。１次用量、２次用量、および３次用量はすべて、同じ量の抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体を含有し得るが、概して、投与頻度に関して互いに異なり得る。しかしながら、ある特定の実施形態において、１次用量、２次用量および／または３次用量に含有される抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体の量は、治療経過の間、互いに異なる（例えば、適宜上下に調整される）。ある特定の実施形態において、２回以上（例えば、２回、３回、４回、または５回）の用量が、「負荷用量」として治療様式の開始時に投与された後、その後の用量が、それより低い頻度ベースで投与される（例えば、維持用量」）。
【0240】
本発明のある特定の例示的な実施形態において、各２次用量および／または３次用量は、直前の用量の１～４８時間（例えば、１、１と１／２、２、２と１／２、３、３と１／２、４、４と１／２、５、５と１／２、６、６と１／２、７、７と１／２、８、８と１／２、９、９と１／２、１０、１０と１／２、１１、１１と１／２、１２、１２と１／２、１３、１３と１／２、１４、１４と１／２、１５、１５と１／２、１６、１６と１／２、１７、１７と１／２、１８、１８と１／２、１９、１９と１／２、２０、２０と１／２、２１、２１と１／２、２２、２２と１／２、２３、２３と１／２、２４、２４と１／２、２５、２５と１／２、２６、２６と１／２、またはそれ以上）後に投与される。「直前の用量」という句は、本明細書で使用する場合、一連の複数回投与において、抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体の用量を意味し、これは、何ら介入用量のない直後の用量の投与の前に患者へ投与される。
【0241】
本発明のこの態様による方法は、抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体の２次用量および／または３次用量のいずれかの回数を患者へ投与することを含み得る。例えば、ある特定の実施形態において、単回の２次用量のみが患者へ投与される。他の実施形態において、２回以上（例えば、２，３、４、５、６、７、８またはそれより多数）の２次用量が患者へ投与される。同様に、ある特定の実施形態において、単回３次用量のみが患者へ投与される。他の実施形態において、２回以上（例えば、２，３、４、５、６、７、８またはそれより多数）の３次用量が患者へ投与される。
【0242】
本発明のある特定の実施形態において、２次用量および／または３次用量が患者へ投与される頻度は、治療様式の経過にわたって変わり得る。投与頻度はまた、臨床検査後の個々の患者の必要性に応じて、医師によって治療過程の間に調整され得る。
【0243】
抗体の診断上の使用
本発明の抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体は、例えば、診断目的のために、試料中のＺＩＫＶを検出および／または測定するために使用され得る。いくつかの実施形態は、ウイルス感染などの疾患または障害を検出するためのアッセイにおいて、本発明の１つ以上の抗体の使用を熟慮する。ＺＩＫＶについての例示的な診断アッセイは、例えば、患者から得られた試料を、本発明の抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体と接触させることを含み得、抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体は、検出可能な標識もしくはレポーター分子で標識されるか、または患者試料からＺＩＫＶを選択的に単離するために捕捉リガンドとして使用される。あるいは、標識されていない抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体は、それ自体が検出可能に標識された２次抗体との組み合わせで診断用途に使用することができる。検出可能な標識またはレポーター分子は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓもしくは１２５Ｉなどの放射性同位体、フルオレセインイソチオシアナートもしくはローダミンなどの蛍光部分もしくは化学発光部分、またはアルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、もしくはルシフェラーゼなどの酵素であり得る。試料中のＺＩＫＶを検出または測定するために使用することのでき
る具体的な例示的アッセイには、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）が含まれる。
本発明の抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体は、例えば、診断目的のために、試料中のＺＩＫＶを検出および／または測定するために使用され得る。いくつかの実施形態は、ウイルス感染などの疾患または障害を検出するためのアッセイにおいて、本発明の１つ以上の抗体の使用を熟慮する。ＺＩＫＶについての例示的な診断アッセイは、例えば、患者から得られた試料を、本発明の抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体と接触させることを含み得、抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体は、検出可能な標識もしくはレポーター分子で標識されるか、または患者試料からＺＩＫＶを選択的に単離するために捕捉リガンドとして使用される。あるいは、標識されていない抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体は、それ自体が検出可能に標識された２次抗体との組み合わせで診断用途に使用することができる。検出可能な標識またはレポーター分子は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓもしくは１２５Ｉなどの放射性同位体、フルオレセインイソチオシアナートもしくはローダミンなどの蛍光部分もしくは化学発光部分、またはアルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、もしくはルシフェラーゼなどの酵素であり得る。試料中のＺＩＫＶを検出または測定するために使用することのでき
る具体的な例示的アッセイには、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）が含まれる。
【0244】
本発明によるＺＩＫＶ診断アッセイにおいて使用することのできる試料には、正常条件または病理学的条件下で、検出可能な量のＺＩＫＶまたはそのフラグメントのいずれかを含有する、患者から得ることのできる何らかの組織または体液試料が含まれる。概して、健常な患者（例えば、ＺＩＫＶと関連した疾患に罹患していない患者から得られた特定の試料中のＺＩＫＶのレベルは、ＺＩＫＶのベースラインレベルまたは標準レベルをまず確立するために測定されることになっている。次に、ＺＩＫＶのこのベースラインレベルは、ＺＩＫＶ関連容態、またはこのような容態と関連した症状を有すると疑われる個人から得られた試料において測定されるＺＩＫＶのレベルと比較することができる。
【0245】
ＺＩＫＶに特異的な抗体は、追加の標識もしくは部分を全く含有していなくてもよく、またはＮ末端もしくはＣ末端の標識もしくは部分を含有していてもよい。一実施形態において、標識または部分はビオチンである。結合アッセイにおいて、標識（存在する場合）の位置は、ペプチドが結合した表面に対するペプチドの向きを決定し得る。例えば、表面がアビジンでコーティングされている場合、Ｎ末端ビオチンを含有するペプチドは、ペプチドのＣ末端部分が表面から遠位になるように向くことになっている。
【実施例】
【0246】
以下の実施例は、本発明の方法および組成物をどのように作製および使用するかに関する完全な開示および説明を当業者に提供するために提示されており、本発明者らが本発明とみなすことの範囲を制限するよう企図するものではない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保するための努力はしたが、いくつかの実験上の誤差および偏差が考慮されるべきである。別段の記載がない限り、部分は重量部分であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、室温は約２５℃であり、圧力は大気圧またはそれに近い圧力である。
【0247】
実施例１：ＺＩＫＶに対するヒト抗体の生成
ＺＩＫＶに対するヒト抗体を、ヒト免疫グロブリン重鎖領域とカッパ軽鎖可変領域とをコードするＤＮＡを含むマウスにおいて生成した。一実施形態において、ＺＩＫＶに対するヒト抗体を、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにおいて生成した。一実施形態において、ＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅ（登録商標）（ＶＩ）マウスを、ＺＩＫＶ ｐｒＭ／ＥをコードするＤＮＡで免疫化した（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＬＵ３３３４１．１および配列番号３５３も参照されたい）。２週間空けての２回の免疫化を含む加速様式後に抗体を生成した。抗体の免疫応答を、ＺＩＫＶ Ｅ特異的イムノアッセイによってモニターした。例えば、ＺＩＫＶ ｐｒＭ／Ｅを発現する細胞から産生されたウイルス様粒子（ＶＬＰ）に特異的な抗体の力価について血清をアッセイした。Ｂ細胞選別技術（ＢＳＴ）およびハイブリドーマ法の両方を用いて、抗体産生クローンを単離した。例えば、所望の免疫応答が達成されたとき、脾細胞を収集し、マウス骨髄腫細胞と融合させて、それらの生存率を維持し、ハイブリドーマ細胞株を形成した。ハイブリドーマ細胞株をスクリーニングおよび選択して、ＺＩＫＶ Ｅ特異的抗体を産生する細胞株を識別した。この技術および先に説明した種々の免疫原を用いて、いくつかのキメラ抗体（すなわち、ヒト可変ドメインとマウス定常ドメインとを有する抗体）を得た。この様式で生成された例示的な抗体を、Ｈ２ａＭ２５７０３Ｎ、Ｈ２ａＭ２５７０４Ｎ、Ｈ２ａＭ２５７０８Ｎ、Ｈ２ａＭ２５７０９Ｎ、Ｈ２ａＭ２５７１０ＮおよびＨ２ａＭ２５７１１Ｎと命名した。
ＺＩＫＶに対するヒト抗体を、ヒト免疫グロブリン重鎖領域とカッパ軽鎖可変領域とをコードするＤＮＡを含むマウスにおいて生成した。一実施形態において、ＺＩＫＶに対するヒト抗体を、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにおいて生成した。一実施形態において、ＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅ（登録商標）（ＶＩ）マウスを、ＺＩＫＶ ｐｒＭ／ＥをコードするＤＮＡで免疫化した（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＬＵ３３３４１．１および配列番号３５３も参照されたい）。２週間空けての２回の免疫化を含む加速様式後に抗体を生成した。抗体の免疫応答を、ＺＩＫＶ Ｅ特異的イムノアッセイによってモニターした。例えば、ＺＩＫＶ ｐｒＭ／Ｅを発現する細胞から産生されたウイルス様粒子（ＶＬＰ）に特異的な抗体の力価について血清をアッセイした。Ｂ細胞選別技術（ＢＳＴ）およびハイブリドーマ法の両方を用いて、抗体産生クローンを単離した。例えば、所望の免疫応答が達成されたとき、脾細胞を収集し、マウス骨髄腫細胞と融合させて、それらの生存率を維持し、ハイブリドーマ細胞株を形成した。ハイブリドーマ細胞株をスクリーニングおよび選択して、ＺＩＫＶ Ｅ特異的抗体を産生する細胞株を識別した。この技術および先に説明した種々の免疫原を用いて、いくつかのキメラ抗体（すなわち、ヒト可変ドメインとマウス定常ドメインとを有する抗体）を得た。この様式で生成された例示的な抗体を、Ｈ２ａＭ２５７０３Ｎ、Ｈ２ａＭ２５７０４Ｎ、Ｈ２ａＭ２５７０８Ｎ、Ｈ２ａＭ２５７０９Ｎ、Ｈ２ａＭ２５７１０ＮおよびＨ２ａＭ２５７１１Ｎと命名した。
【0248】
その全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれる米国特許第７５８２２９８号において説明されているように、骨髄腫細胞と融合していない抗原陽性マウスＢ細胞から抗ＺＩＫＶ抗体を直接単離した。この方法を用いて、いくつかの完全ヒト抗ＺＩＫＶ Ｅ抗体（すなわち、ヒト可変ドメインとヒト定常ドメインとを有する抗体）を得、この様式で生成した例示的な抗体をＨ４Ｈ２５５６６Ｐ、Ｈ４Ｈ２５５８７Ｐ、Ｈ４Ｈ２５５９１Ｐ、Ｈ４Ｈ２５５９２Ｐ、Ｈ４Ｈ２５５９８Ｐ、Ｈ４Ｈ２５６０２Ｐ、Ｈ４Ｈ２５６１７Ｐ、Ｈ４Ｈ２５６１９Ｐ、Ｈ４Ｈ２５６２２Ｐ、Ｈ４Ｈ２５６２６Ｐ、Ｈ４Ｈ２５６３０Ｐ、Ｈ４Ｈ２５６３３Ｐ、Ｈ４Ｈ２５６３４Ｐ、Ｈ４Ｈ２５６３７Ｐ、Ｈ４Ｈ２５６４０Ｐ、Ｈ４Ｈ２５６４１Ｐ、Ｈ４Ｈ２５７０３Ｎ、Ｈ４Ｈ２５７０４Ｎ、Ｈ４Ｈ２５７０８Ｎ、Ｈ４Ｈ２５７０９Ｎ、Ｈ４Ｈ２５７１０Ｎ、Ｈ４Ｈ２５７１１Ｎと命名した。
【0249】
この実施例の方法に従って生成された例示的な抗体の生物学的特性を、以下に示す実施例において詳細に説明する。
【0250】
実施例２：重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸およびヌクレオチド配列
表１は、本発明の選択された抗ＺＩＫＶ抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域ならびにＣＤＲのアミノ酸配列識別子を示す。対応する核酸配列識別子を表２に示す。
表１は、本発明の選択された抗ＺＩＫＶ抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域ならびにＣＤＲのアミノ酸配列識別子を示す。対応する核酸配列識別子を表２に示す。
【表1】
【表2】
【0251】
抗体は、以下の命名法：Ｆｃ接頭辞（表１または表２に示すように、例えば、「Ｈ１Ｈ」、「Ｈ４Ｈ」、「Ｈ２ａＭ」など）、続いて数値識別子（例えば、「２５５６６」、「２５５８７」、「２５７１０」など）、続いて「Ｐ」、「Ｐ２」、「Ｎ」、Ｎ２、または「Ｂ」の接尾辞）により、本明細書で典型的に参照される。本明細書で使用される抗体名の上のＨ１ＨおよびＨ４Ｈという接頭辞は、抗体の特定のＦｃ領域アイソタイプを示す。したがって、この命名法によると、抗体は、例えば、「Ｈ４Ｈ２５５６６Ｐ」、「Ｈ２ａＭ２５７０３Ｎ」などと本明細書で参照され得る。例えば、「Ｈ４Ｈ」抗体はヒトＩｇＧ４ Ｆｃを有し、「Ｈ２ａＭ」抗体はマウスＩｇＧ２ａ Ｆｃを有する（可変領域はすべて、抗体名における最初の「Ｈ」によって示されるように，完全にヒトである）。当業者によって認識されることになっているように、特定のＦｃアイソタイプを有する抗体は、異なるＦｃアイソタイプを有する抗体へ変換することができる（例えば、マウスＩｇＧ１ Ｆｃを有する抗体は、ヒトＩｇＧ４を有する抗体へ変換することができる、など）が、いずれの事象においても、表１または表２に示す数値識別子によって示される可変ドメイン（ＣＤＲを含む）は同じままであることになっており、抗原に対する結合特性はＦｃドメインの性質にかかわらず、同一であるかまたは実質的に類似していると期待される。
【0252】
実施例３．ジカ前膜エンベロープ中間体（ｐｒＭ／Ｅ）ポリタンパク質に対するモノクローナル抗体の結合を評価するための結合アッセイ
ＺＩＫＶ Ｅを結合する抗ＺＩＫＶモノクローナル抗体のパネルの能力を調べるために、電気化学発光ベースの検出プラットフォーム（ＭＳＤ）におけるｐｒＭ／Ｅ発現細胞から調製されたＺＩＫＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）を利用するインビトロ結合アッセイを展開した。
ＺＩＫＶ Ｅを結合する抗ＺＩＫＶモノクローナル抗体のパネルの能力を調べるために、電気化学発光ベースの検出プラットフォーム（ＭＳＤ）におけるｐｒＭ／Ｅ発現細胞から調製されたＺＩＫＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）を利用するインビトロ結合アッセイを展開した。
【0253】
ＶＬＰを、ＺＩＫＶ ｐｒＭ／Ｅポリタンパク質を一過性に発現するＨＥＫ２９３Ｔ／１７細胞（受託番号ＡＬＵ３３３４１．１（配列番号３５３としても示される）、ＺＩＫＶポリタンパク質のアミノ酸残基１２３～７９５）から生成した。また、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）糖タンパク質（Ｇ）を発現する細胞から調製されたＶＬＰを、陰性結合対照として生成した。実験には、ＩｇＧ検出抗体とは無関係な陰性対照として、ヒトＩｇＧ４抗体およびマウスＩｇＧ２ａ抗体についての陰性対照が含まれている。
【0254】
実験は以下の手順により実施した。先に説明した２つの供給源からのＶＬＰをＰＢＳ中に希釈し、９６ウェル炭素電極プレート（ＭＵＬＴＩ－ＡＲＲＡＹ高結合プレート，ＭＳＤ）へと播種し、４℃で一晩インキュベートして、ＶＬＰを接着させておいた。非特異的結合部位を、ＰＢＳ中の２％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）により室温で１時間遮断した。プレートに結合した粒子へ、１×ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ緩衝液中の１．７ｐＭ～１００ｎＭの範囲の連続希釈物中の抗ＺＩＫＶ抗体および対照抗体、ならびに緩衝液のみを２つ組で添加し、このプレートを室温で１時間インキュベートした。次に、ＡｑｕａＭａｘ２０００プレート洗浄機（ＭＤＳ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、このプレートを１×ＰＢＳで洗浄し、結合していない抗体を除去した。プレートに結合した抗体を、ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ（商標）結合抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）またはＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ（商標）結合抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて室温で１時間検出した。洗浄後、このプレートを製造元の推奨する手順により、リードバッファー（ＭＳＤ）で顕色させ、発光シグナルをＳＥＣＴＯＲ Ｉｍａｇｅｒ ６００（ＭＳＤ）機で記録した。直接結合シグナル（ＲＬＵにおける）を抗体濃度の関数として解析し、データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）ソフトウェアを用いたシグモイド（４パラメータロジスティック）用量応答モデルにあてはめた。最大結合シグナルの５０％が検出された抗体の濃度として定義されるＥＣ５０値を、各抗体の効力を示すためにＺＩＫＶ ｐｒＭ／Ｅ ＶＬＰについて測定した。加えて、無関係のＶＳＶ Ｇ ＶＬＰに対するＺＩＫＶ ｐｒＭ／Ｅ ＶＬＰに関する１１．１ｎＭでの抗体の結合シグナルの比を計算した。結合比が２未満の抗体を、表３においてＮＢとして標識した。ＮＢは、アッセイ条件下で観察される特異的結合がないことを指す。
【0255】
結果の要約および結論：
無関係なＶＳＶ Ｇ含有ＶＬＰへの結合と比較して、ｐｒＭ／Ｅ発現細胞から調製したＺＩＫＶ ＶＬＰを特異的に結合する抗ＺＩＫＶモノクローナル抗体の能力を、免疫結合アッセイを用いて評価した。ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ（商標）を結合した抗ヒトＩｇＧ抗体または抗マウスＩｇＧ抗体を用いて、最高１００ｎＭの抗体濃度で９６ウェル高結合プレート（ＭＳＤ）上に固定したＶＬＰに対する抗体用量依存的結合を検出し、電気化学発光における結合シグナルをＳｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ６００（ＭＳＤ）で記録した。ＶＬＰへ結合する抗体についてはＲＬＵ値を測定した。ＺＩＫＶ ｐｒＭ／Ｅ ＶＬＰのＥＣ５０値を、効力の尺度として計算した。ＺＩＫＶ結合特性に影響する無関係な背景を有する抗体については、より高い濃度をＥＣ５０値の計算から除外し、値を表中で斜字体にした。ＺＩＫＶ ｐｒＭ／Ｅおよび無関係に発現するＶＬＰに対する１１．１ｎＭの抗体の結合シグナルの比較を用いて、ＺＩＫＶタンパク質に対する結合特異性を評価した。特異的結合は、その濃度で無関係なＶＬＰと比較して、ＺＩＫＶ ｐｒＭ／Ｅ発現ＶＬＰに対する２倍以上の結合比を有する抗体として定義される。
無関係なＶＳＶ Ｇ含有ＶＬＰへの結合と比較して、ｐｒＭ／Ｅ発現細胞から調製したＺＩＫＶ ＶＬＰを特異的に結合する抗ＺＩＫＶモノクローナル抗体の能力を、免疫結合アッセイを用いて評価した。ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ（商標）を結合した抗ヒトＩｇＧ抗体または抗マウスＩｇＧ抗体を用いて、最高１００ｎＭの抗体濃度で９６ウェル高結合プレート（ＭＳＤ）上に固定したＶＬＰに対する抗体用量依存的結合を検出し、電気化学発光における結合シグナルをＳｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ６００（ＭＳＤ）で記録した。ＶＬＰへ結合する抗体についてはＲＬＵ値を測定した。ＺＩＫＶ ｐｒＭ／Ｅ ＶＬＰのＥＣ５０値を、効力の尺度として計算した。ＺＩＫＶ結合特性に影響する無関係な背景を有する抗体については、より高い濃度をＥＣ５０値の計算から除外し、値を表中で斜字体にした。ＺＩＫＶ ｐｒＭ／Ｅおよび無関係に発現するＶＬＰに対する１１．１ｎＭの抗体の結合シグナルの比較を用いて、ＺＩＫＶタンパク質に対する結合特異性を評価した。特異的結合は、その濃度で無関係なＶＬＰと比較して、ＺＩＫＶ ｐｒＭ／Ｅ発現ＶＬＰに対する２倍以上の結合比を有する抗体として定義される。
【0256】
結合結果を表３に要約する。ＺＩＫＶ ｐｒＭ／Ｅ ＶＬＰへの結合についてのＥＣ５０値が報告され、試験抗体については８７ｐＭ～１３３ｎＭの範囲である。抗体Ｈ４Ｈ２５６４０Ｐおよび抗体Ｈ４Ｈ２５７０４Ｎについては、無関係のＶＳＶ Ｇ ＶＬＰについての高い背景を補うために、より高い濃度での結合値をＥＣ５０値の計算から除外した。ＺＩＫＶ ｐｒＭ／Ｅ ＶＬＰ上の結合とＶＳＶ Ｇ ＶＬＰへの１１．１ｎＭ濃度での結合との比も報告する。評価した試験抗体はすべて、ＺＩＫＶ ｐｒＭ／Ｅ ＶＬＰに特異的に結合した。陰性アイソタイプ対照抗体は、予期した通り、特異的に結合しなかった（データ非表示）。
【表3】
【0257】
実施例４：表面プラズモン共鳴によって測定されるＺＩＫＶ ｐｒＭ８０Ｅへの抗体結合
Ａ．ｐＨ依存性解離速度定数
Ｂｉａｃｏｒｅ４０００機（カタログ番号２８－９６４３－２１）を用いたリアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサーを用いて、精製抗ＺＩＫＶ ｍＡｂへのジカ（ｐｒＭ８０Ｅ）－ｍｍＨ結合についての解離速度定数を測定した。Ｂｉａｃｏｒｅ ＣＭ５センサー表面を、ポリクローナルヤギ抗ヒトＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，＃ＢＲ－１０９００５－０９８）とのアミンカップリングにより誘導体化し、発現した抗ＺＩＫＶ抗体をヒト定常領域で捕捉した。ＢｉａｃｏｒｅのｐＨチェイス研究を、０．０１ＭのＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０５％ｖ／ｖの界面活性剤Ｐ２０からなる緩衝液（ＰＢＳ－Ｐランニングバッファー）において
、ｐＨ７．４、６．０、５．５および５．０で行った。ＺＩＫＶ－ｍｍＨと本明細書により呼ばれる、Ｃ末端のｍｙｃ－ｍｙｃ－ｈｉｓタグを有するＺＩＫＶ（ｐｒＭ８０Ｅ）（配列番号３５４）をＰＢＳ－Ｐランニングバッファー中で（３０ｎＭの濃度で）調製し、抗ＺＩＫＶ ｍＡｂ捕捉表面上で３０μＬ／分の流量で注入した。捕捉したモノクローナル抗体に対するＺＩＫＶ－ｍｍＨの結合を、ｐＨ７．４のＰＢＳ－Ｐランニングバッファー中で３分間モニターし、ｐＨ７．４、ｐＨ６．０、ｐＨ５．５またはｐＨ５．０のＰＢＳ－Ｐランニングバッファー中のＺＩＫＶ－ｍｍＨの解離を１０分間モニターした。ｐＨチェイス実験はすべて、３７℃で行った。動的解離（ｋｄ）速度定数は、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ ２．０ｃ曲線適合ソフトウェアを用いて、リアルタイムセンサーグラムを１：１結合モデルへあてはめることによって測定した。解離半減期（ｔ１／２）は、動的速度定数から次のように計算した：
ｔ１／２（分）＝ｌｎ２／（６０×ｋｄ）
Ａ．ｐＨ依存性解離速度定数
Ｂｉａｃｏｒｅ４０００機（カタログ番号２８－９６４３－２１）を用いたリアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサーを用いて、精製抗ＺＩＫＶ ｍＡｂへのジカ（ｐｒＭ８０Ｅ）－ｍｍＨ結合についての解離速度定数を測定した。Ｂｉａｃｏｒｅ ＣＭ５センサー表面を、ポリクローナルヤギ抗ヒトＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，＃ＢＲ－１０９００５－０９８）とのアミンカップリングにより誘導体化し、発現した抗ＺＩＫＶ抗体をヒト定常領域で捕捉した。ＢｉａｃｏｒｅのｐＨチェイス研究を、０．０１ＭのＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０５％ｖ／ｖの界面活性剤Ｐ２０からなる緩衝液（ＰＢＳ－Ｐランニングバッファー）において
、ｐＨ７．４、６．０、５．５および５．０で行った。ＺＩＫＶ－ｍｍＨと本明細書により呼ばれる、Ｃ末端のｍｙｃ－ｍｙｃ－ｈｉｓタグを有するＺＩＫＶ（ｐｒＭ８０Ｅ）（配列番号３５４）をＰＢＳ－Ｐランニングバッファー中で（３０ｎＭの濃度で）調製し、抗ＺＩＫＶ ｍＡｂ捕捉表面上で３０μＬ／分の流量で注入した。捕捉したモノクローナル抗体に対するＺＩＫＶ－ｍｍＨの結合を、ｐＨ７．４のＰＢＳ－Ｐランニングバッファー中で３分間モニターし、ｐＨ７．４、ｐＨ６．０、ｐＨ５．５またはｐＨ５．０のＰＢＳ－Ｐランニングバッファー中のＺＩＫＶ－ｍｍＨの解離を１０分間モニターした。ｐＨチェイス実験はすべて、３７℃で行った。動的解離（ｋｄ）速度定数は、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ ２．０ｃ曲線適合ソフトウェアを用いて、リアルタイムセンサーグラムを１：１結合モデルへあてはめることによって測定した。解離半減期（ｔ１／２）は、動的速度定数から次のように計算した：
ｔ１／２（分）＝ｌｎ２／（６０×ｋｄ）
【0258】
３７℃での精製抗ＺＩＫＶ ｍＡｂに対するＺＩＫＶ－ｍｍＨ結合についての結合動態パラメータを表４Ａおよび表４Ｂに示す。
【表4】
【表5】
【0259】
結果と要約
抗ＺＩＫＶ抗体からのＺＩＫＶ．ｍｍＨの解離（ｋｄおよびｔ１／２）に及ぼすｐＨの効果を、ｐＨ７．４、６．０、５．５および５．０で３７℃で研究した。本発明の抗ＺＩＫＶ抗体Ｈ４Ｈ２５７１０Ｎ、Ｈ４Ｈ２５６０２ＰおよびＨ４Ｈ２５５９８Ｐは、解離において最も高いｐＨ依存性変化を示した。抗ＺＩＫＶ抗体Ｈ４Ｈ２５５６６Ｐは、解離において中程度のｐＨ依存性変化を示したが、残りのＺＩＫＶ抗体は解離において有意なｐＨ依存性変化を示さなかった。
抗ＺＩＫＶ抗体からのＺＩＫＶ．ｍｍＨの解離（ｋｄおよびｔ１／２）に及ぼすｐＨの効果を、ｐＨ７．４、６．０、５．５および５．０で３７℃で研究した。本発明の抗ＺＩＫＶ抗体Ｈ４Ｈ２５７１０Ｎ、Ｈ４Ｈ２５６０２ＰおよびＨ４Ｈ２５５９８Ｐは、解離において最も高いｐＨ依存性変化を示した。抗ＺＩＫＶ抗体Ｈ４Ｈ２５５６６Ｐは、解離において中程度のｐＨ依存性変化を示したが、残りのＺＩＫＶ抗体は解離において有意なｐＨ依存性変化を示さなかった。
【0260】
Ｂ．２５℃および３７℃での結合親和性および動態
精製抗ＺＩＫＶモノクローナル抗体へのＺＩＫＶ（ｐｒＭ８０Ｅ）－ｍｍＨタンパク質結合についての平衡解離定数（ＫＤ値）を、Ｂｉａｃｏｒｅ４０００機におけるリアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサーアッセイを用いて測定した。Ｂｉａｃｏｒｅセンサー表面を、ポリクローナルヤギ抗ヒトＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，＃ＢＲ－１０９００５－０９８）とのアミンカップリングによって誘導体化して、発現した抗ＺＩＫＶ抗体をヒト定常領域で捕捉した。Ｂｉａｃｏｒｅ結合研究は、ＨＢＳ－Ｐランニングバッファー（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ｖ／ｖ界面活性剤Ｐ２０）中で行った。Ｃ末端ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグ（ｍｍＨ）を有するＺＩＫＶ（ｐｒＭ８０Ｅ）タンパク質を実験室において調製し、本明細書ではＺＩＫＶ－ｍｍＨ（配列番号３５４を参照されたい）と呼んだ。ＨＢＳ－Ｐランニングバッファー中で調製した異なる濃度（３倍希釈）のＺＩＫＶ－ｍｍＨ（３０ｎＭ～０．３７ｎＭの範囲）を抗ＺＩＫＶ抗体捕捉表面上に３０μＬ／分の流量で注入した。捕捉した各モノクローナル抗体に対するＺＩＫＶ－ｍｍＨの結合を３分間モニターし、解離をＨＢＳ－Ｐランニングバッファー中で８分間モニターした。結合動態実験はすべて、２５℃または３７℃のいずれかで行った。Ｓｃｒｕｂｂｅｒ ２．０ｃ曲線適合ソフトウェアを用いてリアルタイムセンサーグラムを１：１結合モデルへあてはめることによって、動的結合（ｋａ）速度定数および動的解離（ｋｄ）速度定数を測定した。結合解離平衡定数（ＫＤ）および解離半減期（ｔ１／２）を、動的速度定数から以下のように計算した：
精製抗ＺＩＫＶモノクローナル抗体へのＺＩＫＶ（ｐｒＭ８０Ｅ）－ｍｍＨタンパク質結合についての平衡解離定数（ＫＤ値）を、Ｂｉａｃｏｒｅ４０００機におけるリアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサーアッセイを用いて測定した。Ｂｉａｃｏｒｅセンサー表面を、ポリクローナルヤギ抗ヒトＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，＃ＢＲ－１０９００５－０９８）とのアミンカップリングによって誘導体化して、発現した抗ＺＩＫＶ抗体をヒト定常領域で捕捉した。Ｂｉａｃｏｒｅ結合研究は、ＨＢＳ－Ｐランニングバッファー（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ｖ／ｖ界面活性剤Ｐ２０）中で行った。Ｃ末端ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグ（ｍｍＨ）を有するＺＩＫＶ（ｐｒＭ８０Ｅ）タンパク質を実験室において調製し、本明細書ではＺＩＫＶ－ｍｍＨ（配列番号３５４を参照されたい）と呼んだ。ＨＢＳ－Ｐランニングバッファー中で調製した異なる濃度（３倍希釈）のＺＩＫＶ－ｍｍＨ（３０ｎＭ～０．３７ｎＭの範囲）を抗ＺＩＫＶ抗体捕捉表面上に３０μＬ／分の流量で注入した。捕捉した各モノクローナル抗体に対するＺＩＫＶ－ｍｍＨの結合を３分間モニターし、解離をＨＢＳ－Ｐランニングバッファー中で８分間モニターした。結合動態実験はすべて、２５℃または３７℃のいずれかで行った。Ｓｃｒｕｂｂｅｒ ２．０ｃ曲線適合ソフトウェアを用いてリアルタイムセンサーグラムを１：１結合モデルへあてはめることによって、動的結合（ｋａ）速度定数および動的解離（ｋｄ）速度定数を測定した。結合解離平衡定数（ＫＤ）および解離半減期（ｔ１／２）を、動的速度定数から以下のように計算した：
【数1】
【0261】
２５℃および３７℃での抗ＺＩＫＶ抗体へのＺＩＫＶ－ｍｍＨ結合についての結合動態パラメータを表５および表６に示す。
【表6】
【表7】
【0262】
結果と要約
２５℃で、本発明の２０種の抗ジカ抗体はすべて、７０ｐＭ～２７．７ｎＭの範囲のＫＤ値でＺＩＫＶ－ｍｍＨへ結合した（表５）。３７℃で、本発明の抗ＺＩＫＶ抗体は、６２１ｐＭ～５２．５ｎＭの範囲のＫＤ値でＺＩＫＶ－ｍｍＨへ結合した（表６）。予想通り、陰性アイソタイプ対照は結合を示さなかった（データ非表示）。
２５℃で、本発明の２０種の抗ジカ抗体はすべて、７０ｐＭ～２７．７ｎＭの範囲のＫＤ値でＺＩＫＶ－ｍｍＨへ結合した（表５）。３７℃で、本発明の抗ＺＩＫＶ抗体は、６２１ｐＭ～５２．５ｎＭの範囲のＫＤ値でＺＩＫＶ－ｍｍＨへ結合した（表６）。予想通り、陰性アイソタイプ対照は結合を示さなかった（データ非表示）。
【0263】
実施例５：ＺＩＫＶ Ｅに特異的な抗体によるＺＩＫＶの中和
ベロ細胞（アフリカミドリザル腎臓－ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ８１）を、１０％の熱失活ＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ－グルタミンを含有するＭＥＭ－アルファ完全培地中の透明底部を有するＣｏｒｎｉｎｇ黒色９６ウェル細胞培養プレート中に、１ウェルあたり１０，０００個で、ＺＩＫＶによる感染の１日前に播種した。
ベロ細胞（アフリカミドリザル腎臓－ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ８１）を、１０％の熱失活ＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ－グルタミンを含有するＭＥＭ－アルファ完全培地中の透明底部を有するＣｏｒｎｉｎｇ黒色９６ウェル細胞培養プレート中に、１ウェルあたり１０，０００個で、ＺＩＫＶによる感染の１日前に播種した。
【0264】
ベロ細胞の感染に使用するＺＩＫＶの株は、ＭＲ７６６（ウガンダのセンチネルアカゲザルから単離、１９４７年、受託番号ＡＹ６３２５３５）、ＦＬＲ（２０１５年１２月にコロンビアでヒトから単離。受託番号ＫＵ８２０８９７）およびＰＲＶＡＢＣ５９（２０１５年１２月にプエルトリコでヒトから単離。受託番号ＫＵ５０１２１５）とした。
【0265】
中和／感染当日、試験抗体を、２％熱失活ＦＢＳペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ－グルタミンを含有するＤＭＥＭ中で２倍濃度に希釈し、ＺＩＫＶと１：１で３７℃で３０分間混合した。
【0266】
播種したベロ細胞から培地を取り出した後、抗体とウイルスとの１：１混合物とともに３７℃で１時間、アッセイプレートを１５分毎に穏やかに撹拌しながらインキュベートした。抗体で処置したウイルス接種物を取り出し、細胞を１％熱失活ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ－グルタミンおよび１％メチルセルロースを含有する１００μＬのＤＭＥＭで覆い、３７℃、５％ＣＯ２で一晩（１２～１６時間）インキュベートした。翌日、重ねた培地を細胞から吸引し、この細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、アセトンとメタノールとの氷冷１：１混合物で４℃で３０分間固定した。固定した細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、室温で１５分間０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘおよび５％ＦＢＳを含有するＰＢＳで透過処理した。細胞をＰＢＳ単独で１回洗浄した後、非特異的結合を遮断するために室温で３０分間、５％ＦＢＳを含有するＰＢＳとともにインキュベートした。次に、細胞を、５％ＦＢＳおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０を含有するＰＢＳ中での１：１０，０００希釈のポリクローナル抗体（ＵＴＭＢから得たジカマウス腹水）とともに、室温で１時間インキュベートした。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＡｑｕａＭａｘ ４０００プレート洗浄機を用いて細胞を３００μＬのＰＢＳで６回洗浄した後、２次抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ａｌｅｘａ－４８８結合ヤギ抗マウスＩｇＧ）とともに室温で１時間、暗所でインキュベートした。プレート洗浄器で細胞を６回洗浄し、分析前に１００μＬのＰＢＳを添加した。Ｍｉｎｉ Ｍａｘプレートリーダーを備えたＳｐｅｃｔｒａＭａｘを使用して。各ウェルを撮像し、異なる蛍光フォーカスを計数するための設定を用いて分析を完了した。
【0267】
中和率は以下のように計算した。
【数2】
【0268】
中和％として表した結果を、Ｐｒｉｓｍ５ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）を用いた非線形回帰（４パラメータロジスティクス）を用いて解析し、ＩＣ５０値を得た。結果を以下の表７および表８に示す。
【0269】
結果の要約および結論：
以下の表７および８に示すデータは、本明細書に説明する実験設計を用いて、本発明の２０種の抗ＺＩＫＶウイルス抗体のうち１８種が、ＺＩＫＶ株ＭＲ７６６、ＰＲＶＡＢＣ５９（プエルトリコ２０１５）およびＦＬＰ（コロンビア２０１５）の感染力を、約１０－１１Ｍ～約１０－９Ｍの範囲のＩＣ５０で強力に中和することを示している。予想通り、陰性アイソタイプ対照は中和を示さなかった（データ非表示）。
以下の表７および８に示すデータは、本明細書に説明する実験設計を用いて、本発明の２０種の抗ＺＩＫＶウイルス抗体のうち１８種が、ＺＩＫＶ株ＭＲ７６６、ＰＲＶＡＢＣ５９（プエルトリコ２０１５）およびＦＬＰ（コロンビア２０１５）の感染力を、約１０－１１Ｍ～約１０－９Ｍの範囲のＩＣ５０で強力に中和することを示している。予想通り、陰性アイソタイプ対照は中和を示さなかった（データ非表示）。
【表8】
【表9】
【0270】
実施例６：Ｏｃｔｅｔ交差競合アッセイ
２つの抗体が、ＺＩＫＶ．ｍｍＨ（配列番号３５４）と本明細書により呼ばれるＺＩＫＶ（ｐｒＭ８０Ｅ）－ｍｍＨ上のこれらのエピトープへの結合について互いに競合するかどうかを評価するために、抗ＺＩＫＶモノクローナル抗体間の結合競合をＯｃｔｅｔ ＲＥＤ３８４バイオセンサー（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｃｏｒｐ．）上のリアルタイムの無標識生体層干渉アッセイを用いて測定した。交差競合実験を、０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ｖ／ｖ界面活性剤Ｔｗｅｅｎ－２０、０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ（ＨＢＳ－Ｐ緩衝液）中で、２５℃で、プレートを１０００ｒｐｍの速度で振盪させながら行った。試験した抗ＺＩＫＶ抗体およびＺＩＫＶ－ｍｍＨ溶液はすべて、Ｏｃｔｅｔ ＨＢＳ－Ｐ緩衝液中で調製した。２つの抗体がＺＩＫＶ－ｍｍＨ上のそれぞれの各エピトープへの結合について互いに競合することができるかどうかを評価するために、およそ約０．９７～０．１１２ｎｍのＺＩＫＶ－ｍｍＨを、１０μｇ／ｍＬのＺＩＫＶ－ｍｍＨを含有するウェルから、抗ＨｉｓコーティングしたＯｃｔｅｔバイオセンサーチップ上にまず９０秒間捕捉した。ＺＩＫＶ－ｍｍＨ捕捉したＯｃｔｅｔバイオセンサーチップを、２０μｇ／ｍｌの第１の抗ＺＩＫＶモノクローナル抗体（本明細書によりｍＡｂ－１と呼ぶ）を含有するウェル中へ５分間浸漬した後、第２の抗ＺＩＫＶモノクローナル抗体（本明細書によりｍＡｂ－２と呼ぶ）を含有するウェル中に浸漬することによって飽和させた。工程間で、ＯｃｔｅｔバイオセンサーチップをＨＢＳ－Ｐ緩衝液中で３０秒間洗浄した。
２つの抗体が、ＺＩＫＶ．ｍｍＨ（配列番号３５４）と本明細書により呼ばれるＺＩＫＶ（ｐｒＭ８０Ｅ）－ｍｍＨ上のこれらのエピトープへの結合について互いに競合するかどうかを評価するために、抗ＺＩＫＶモノクローナル抗体間の結合競合をＯｃｔｅｔ ＲＥＤ３８４バイオセンサー（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｃｏｒｐ．）上のリアルタイムの無標識生体層干渉アッセイを用いて測定した。交差競合実験を、０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ｖ／ｖ界面活性剤Ｔｗｅｅｎ－２０、０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ（ＨＢＳ－Ｐ緩衝液）中で、２５℃で、プレートを１０００ｒｐｍの速度で振盪させながら行った。試験した抗ＺＩＫＶ抗体およびＺＩＫＶ－ｍｍＨ溶液はすべて、Ｏｃｔｅｔ ＨＢＳ－Ｐ緩衝液中で調製した。２つの抗体がＺＩＫＶ－ｍｍＨ上のそれぞれの各エピトープへの結合について互いに競合することができるかどうかを評価するために、およそ約０．９７～０．１１２ｎｍのＺＩＫＶ－ｍｍＨを、１０μｇ／ｍＬのＺＩＫＶ－ｍｍＨを含有するウェルから、抗ＨｉｓコーティングしたＯｃｔｅｔバイオセンサーチップ上にまず９０秒間捕捉した。ＺＩＫＶ－ｍｍＨ捕捉したＯｃｔｅｔバイオセンサーチップを、２０μｇ／ｍｌの第１の抗ＺＩＫＶモノクローナル抗体（本明細書によりｍＡｂ－１と呼ぶ）を含有するウェル中へ５分間浸漬した後、第２の抗ＺＩＫＶモノクローナル抗体（本明細書によりｍＡｂ－２と呼ぶ）を含有するウェル中に浸漬することによって飽和させた。工程間で、ＯｃｔｅｔバイオセンサーチップをＨＢＳ－Ｐ緩衝液中で３０秒間洗浄した。
【0271】
リアルタイムの結合応答を実験の過程の間モニターし、あらゆる工程の終了時の結合応答を記録した。ｍＡｂ－１に対する、次いでブロッキングｍＡｂに対するＺＩＫＶ－ｍｍＨの結合の応答を、背景結合について補正し、比較し、異なる抗ＺＩＫＶモノクローナル抗体の競合的／非競合的挙動を測定した。
【0272】
表９は、結合の桁数とは独立して、両方向で競合する抗体の関連性を明白に規定する。２つの抗ＺＩＫＶモノクローナル抗体Ｈ４Ｈ２５６１９ＰおよびＨ４Ｈ２５７０３Ｎは、本発明に説明する残りの抗体と交差競合しなかった。
【表10】
【表11】
【表12】
【表13】
【0273】
実施例７－免疫蛍光アッセイを用いた抗体依存性増強（ＡＤＥ）の測定
免疫蛍光アッセイ（以下に説明）を用いて、抗体依存性増強（ＡＤＥ）に及ぼすＺＩＫＶ抗体の効果を測定するために実験を行った。
免疫蛍光アッセイ（以下に説明）を用いて、抗体依存性増強（ＡＤＥ）に及ぼすＺＩＫＶ抗体の効果を測定するために実験を行った。
【0274】
１つの実験において、フラビウイルス全部と交差反応するキメラ抗体を、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＫＪ４３８７８４（カッパ軽鎖）およびＫＪ４３８７８５．１（重鎖）において認められる重鎖配列および軽鎖配列を用いて作製した。３つの抗体を作製し、ＲＥＧＮ４２０３（ｈＩｇＧ１）、ＲＥＧＮ４２０４（ｈＩｇＧ４ｓ）およびＲＥＧＮ４２０６（ｈＩｇＧ４ｕｓ）と命名した。ＲＥＧＮ４２０３は、配列番号３５９に示される重鎖（ＨＣ）と、配列番号３６０に示される軽鎖（ＬＣ）とを有する。ＲＥＧＮ４２０４は、配列番号３６１に示される重鎖（ＨＣ）と、配列番号３６２に示される軽鎖（ＬＣ）とを有し、ＲＥＧＮ４２０６は、配列番号３６３に示される重鎖（ＨＣ）と、配列番号３６４に示される軽鎖（ＬＣ）とを有する。
【0275】
別の実験において、Ｈ４Ｈ２５７０３Ｎ（配列番号２５８／２６６のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対）およびＨ４Ｈ ２５６１９Ｐ（配列番号１１４／１２２のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対）と称する２種の抗ジカウイルス抗体を、同じ免疫蛍光アッセイを用いてＡＤＥへの影響について試験した。抗ジカ抗体Ｈ４Ｈ２５７０３ＮおよびＨ４Ｈ２５６１９Ｐの各々は、配列番号３５６のアミノ酸配列を含むＦｃを有するＩｇＧ１としてか、または配列番号３５７に示されるアミノ酸配列を含むＦｃを有するＩｇＧ４のいずれかとして調製した。Ｈ４Ｈ２５７０３Ｎの重鎖（ＨＣ）の完全長アミノ酸配列を配列番号３６７として示し、Ｈ４Ｈ２５７０３Ｎの軽鎖（ＬＣ）の完全長アミノ酸配列を配列番号３６８として示す。Ｈ４Ｈ２５６１９Ｐの重鎖（ＨＣ）の完全長アミノ酸配列を配列番号３７０として示し、Ｈ４Ｈ２５６１９Ｐの軽鎖（ＬＣ）の完全長アミノ酸配列を配列番号３７１として示す。
【0276】
抗体を、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ、１×ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン中、終濃度が５０、１０、２、０．４、および０．０８ｕｇ／ｍＬになるように２倍に希釈した。次に、各抗体１００ｕＬを、２５００ｆｆｕ（蛍光フォーカス単位）のウイルスを含有するＲＰＭＩ完全培地と３７℃、５％ＣＯ２で３０分間、１：１で混合した。次に、３００ｕＬのＲＰＭＩ完全培地中の８０，０００個のＫ５６２細胞を抗体／ウイルス混合物へ添加し、３７℃、５％ＣＯ２で３日間インキュベートした。感染の１日後および２日後に、１００ｕＬの上清を取り出し、－８０℃へ凍結させた。３日後、上清の残りを回収し、－８０℃へ凍結した。
【0277】
上清のウイルス量を検出するために、１０％ＦＢＳ、１×ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミンを含有するＭＥＭ－アルファ中の黒色／透明底９６ウェル細胞培養プレート中にベロ細胞を１０，０００個／ウェルで播種した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。感染当日、上述由来の上清試料をＲＰＭＩ完全培地中に希釈した。各希釈液５０ｕＬをベロ細胞に添加し、３７℃、５％ＣＯ２で１時間、プレートを１５分毎に穏やかに撹拌しながらインキュベートした。接種源を細胞から取り出し、細胞を１００ｕＬのＤＭＥＭ＋１％ＦＢＳ、１×ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン、１％メチルセルロースで覆い、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。
【0278】
感染した細胞を、実施例５において既に説明したように免疫蛍光アッセイによって定量化した。
【0279】
結果
図１に示すように、ＲＥＧＮ４２０３は、抗体の濃度が１０－１０Ｍから１０－７Ｍまで上昇した場合のウイルス収量の増加によって示されるように、ＡＤＥの増大を実証した。ＲＥＧＮ４２０４は、抗体の濃度が１０－１０Ｍから１０－７Ｍまで上昇するにつれて、ウイルス収量が適度に増加することを示した。しかしながら、ＲＥＧＮ４２０６は、抗体の濃度が１０－１０Ｍから１０－７Ｍまで上昇するにつれて、ウイルス収量を増加させることができないことによって示されるように、ＡＤＥに何ら影響を及ぼさなかった。実際、ＲＥＧＮ４２０６は、ウイルスのみの対照と比較して差異を示さなかった。
図１に示すように、ＲＥＧＮ４２０３は、抗体の濃度が１０－１０Ｍから１０－７Ｍまで上昇した場合のウイルス収量の増加によって示されるように、ＡＤＥの増大を実証した。ＲＥＧＮ４２０４は、抗体の濃度が１０－１０Ｍから１０－７Ｍまで上昇するにつれて、ウイルス収量が適度に増加することを示した。しかしながら、ＲＥＧＮ４２０６は、抗体の濃度が１０－１０Ｍから１０－７Ｍまで上昇するにつれて、ウイルス収量を増加させることができないことによって示されるように、ＡＤＥに何ら影響を及ぼさなかった。実際、ＲＥＧＮ４２０６は、ウイルスのみの対照と比較して差異を示さなかった。
【0280】
【0281】
実施例８．ＺＩＫＶ感染マウスにおける防御に及ぼす抗ＺＩＫＶ抗体の効果
ＺＩＫＶ感染のマウスモデルにおける抗ＺＩＫＶ抗体の効果を決定するために研究を行った。
ＺＩＫＶ感染のマウスモデルにおける抗ＺＩＫＶ抗体の効果を決定するために研究を行った。
【0282】
簡潔には、感染の１日前に、Ｈ４Ｈ２５７０３ＮおよびＨ４Ｈ２５６１９Ｐと称する２種の抗ＺＩＫＶ抗体を、２００μＬ用量あたり２００、５０、または１２．５μｇの終濃度のＰＢＳ中に希釈した。１日後、インターフェロンアルファ／ベータ受容体１（ＩＦＮＡＲ１）ノックアウトマウスに、皮下注射を介して、たるんだ背側頚部領域へと抗体を投与した。感染当日、ＺＩＫＶ株ＦＳＳ１３０２５を、２００μＬ用量あたり１０５ｆｆｕまで、１×ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミンを有する２％熱失活ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ培地中に希釈した。マウスに、腹腔内注射を介してウイルスを投与した。マウスを、感染２１日後までの実験の経過を通して体重減少についてモニターした。体重が８０％閾値を下回った動物、または極度の病的状態（震え、衰弱、および非応答性）のある動物は安楽死させた。安楽死させたこれらの動物は、安楽死１日後として死亡日を示す（例えば、感染６日後に処分した動物は、７日後まで生存と示される）。
【0283】
結果
図２～図５に示されるように、結果は、アイソタイプ対照抗体を受けたマウスがすべて、感染９日後までに体重の２０％超が減少し、ＩＡＣＵＣ指針によって屠殺しなければならなかったことを示す。Ｈ４Ｈ２５７０３抗ＺＩＫＶ抗体（図２）またはＨ４Ｈ２５６１９Ｐ抗ＺＩＫＶ抗体（図３）のいずれかを受けたマウスは、感染２１日後まで体重減少をより良好に制御することができ、２００ｕｇ群および５０ｕｇ群のマウスでは、２０％の閾値を超える体重減少をいずれも示さず、１２．５ｕｇ群のマウスの４０％は、体重減少を示した。Ｈ４Ｈ２５７０３Ｎ（図４）またはＨ４Ｈ２５６１９（図５）によるマウスの前処理も、これらのマウスの生存を改善し、抗体２００ｕｇもしくは５０ｕｇで処置したマウスの１００％、または各抗体１２．５ｕｇで処置したマウスの６０％は、ＺＩＫＶによる負荷を生き延びた。
図２～図５に示されるように、結果は、アイソタイプ対照抗体を受けたマウスがすべて、感染９日後までに体重の２０％超が減少し、ＩＡＣＵＣ指針によって屠殺しなければならなかったことを示す。Ｈ４Ｈ２５７０３抗ＺＩＫＶ抗体（図２）またはＨ４Ｈ２５６１９Ｐ抗ＺＩＫＶ抗体（図３）のいずれかを受けたマウスは、感染２１日後まで体重減少をより良好に制御することができ、２００ｕｇ群および５０ｕｇ群のマウスでは、２０％の閾値を超える体重減少をいずれも示さず、１２．５ｕｇ群のマウスの４０％は、体重減少を示した。Ｈ４Ｈ２５７０３Ｎ（図４）またはＨ４Ｈ２５６１９（図５）によるマウスの前処理も、これらのマウスの生存を改善し、抗体２００ｕｇもしくは５０ｕｇで処置したマウスの１００％、または各抗体１２．５ｕｇで処置したマウスの６０％は、ＺＩＫＶによる負荷を生き延びた。
【0284】
実施例９．Ｈ４Ｈ２５７０３ＮおよびＨ４Ｈ２５６１９Ｐについての結合部位を決定するためのＺＩＫＶ回避変異体のインビトロでの生成
４×１０５のｆｆｕのＭＲ７６６ ＺＩＫＶを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（対数（阻害剤）と応答、つまり変数傾斜（４パラメータ））においてプロットしたときの中和曲線解析のＩＣ５０および丘傾斜から計算されるような各抗体のＩＣ５０、ＩＣ７５、ＩＣ８５、ＩＣ９９、ＩＣ９９、およびＩＣ９９．９９でＨ４Ｈ２５７０３ＮまたはＨ４Ｈ２５６１９Ｐ（またはアイソタイプ対照抗体）の濃度を上昇させながら組み合わせた。計算は次のように完了させ、式中、ｆ＝所望の分数（ＩＣ８５については、ｆ＝８５）およびＨ＝丘の傾斜とした：
４×１０５のｆｆｕのＭＲ７６６ ＺＩＫＶを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（対数（阻害剤）と応答、つまり変数傾斜（４パラメータ））においてプロットしたときの中和曲線解析のＩＣ５０および丘傾斜から計算されるような各抗体のＩＣ５０、ＩＣ７５、ＩＣ８５、ＩＣ９９、ＩＣ９９、およびＩＣ９９．９９でＨ４Ｈ２５７０３ＮまたはＨ４Ｈ２５６１９Ｐ（またはアイソタイプ対照抗体）の濃度を上昇させながら組み合わせた。計算は次のように完了させ、式中、ｆ＝所望の分数（ＩＣ８５については、ｆ＝８５）およびＨ＝丘の傾斜とした：
【数3】
【0285】
ウイルスおよび抗体を一緒に３７℃で３０分間インキュベートした後、２４ウェルプレートにおいて感染させる１日前に播種しておいた２×１０５ベロ細胞＊上へと添加した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートし、細胞変性効果について毎日検査した。アイソタイプ対照抗体で処理したウェルにおいて細胞変性効果が明らかになったら、ウイルス上清をＨ４Ｈ２５７０３Ｎで処理したウェルおよびＨ４Ｈ２５６１９Ｐで処理したウェルから回収し、遠心分離によって細片を除去した。細胞変性効果が認められた最高濃度の抗体を含むウェルに由来するウイルス上清を新鮮な抗体とともにインキュベートし、事前に播種しておいた新鮮な細胞へと移し、細胞変性効果が明らかになるまで３７℃、５％ＣＯ２で再度インキュベートした。最高抗体濃度（ＩＣ９９．９９）で細胞変性効果が認められるまで、この周期を反復した。ウイルス上清をＩＣ９９．９９ウェルから回収し、６×１０６個のベロ細胞を事前に播種しておいたＴ２５フラスコへ移した。これらの細胞で細胞変性効果が可視化すると、ウイルスを回収し、遠心分離により清澄化し、中和アッセイに使用して、その回避を確認し、ウイルスが依然として第２の抗体によってなおも中和されることができるどうかも判定した。また、ＲＮＡの単離およびウイルスの配列分析のために、このウイルス増殖由来の感染細胞を１ｍＬのＴｒｉｚｏｌ中へと回収した。
【0286】
中和アッセイ＊＊
Ｈ４Ｈ２５７０３ＮおよびＨ４Ｈ２５６１９Ｐの圧力下で生成した回避変異体が中和に対して耐性を持っているかどうかを確認するために、ベロ細胞における中和アッセイを行った。簡潔にいえば、中和を完了させるために、ウイルスを、１１点曲線について１０ｕｇ／ｍＬから３倍希釈で２００ｐｇ／ｍＬまでの濃度の低下する濃度のＨ４Ｈ２５７０３Ｎ、Ｈ４Ｈ２５６１９Ｐ、またはアイソタイプ対照抗体のいずれかと組み合わせた。ウイルスおよび抗体を一緒に３７℃で３０分間インキュベートした後、黒色透明底９６ウェル細胞培養プレート中に事前に播種しておいた１０，０００個のベロ細胞へと添加した。細胞は、ウイルス／抗体混合物とともに、インキュベーション中、定期的に穏やかに撹拌しながら、１時間インキュベートした。インキュベーション後、接種源を取り出し、細胞を１％メチルセルロース＊＊＊を含有するＤＭＥＭで覆い、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。メチルセルロース重層物を細胞から吸引した後、この細胞をＰＢＳで２回洗浄し、アセトンとメタノールとの氷冷１：１混合物で４℃で３０分間固定した。固定した細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、室温で１５分間、５％ＦＢＳおよび０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘを含有するＰＢＳで透過処理した。細胞をＰＢＳで洗浄した後、５％ＦＢＳを含有するＰＢＳとともにインキュベートして、室温で３０分間、非特異的結合を遮断した。次に、細胞をＰＢＳ＋５％ＦＢＳおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０中、１：１０，０００希釈の１次抗体（ポリクローナル免疫化マウス腹水）とともに、室温で１時間インキュベートした。細胞を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＡｑｕａＭａｘ ４０００プレート洗浄機を用いてＰＢＳで６回洗浄した後、ＰＢＳ＋５％ＦＢＳおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０中で１ｕｇ／ｍＬの２次抗体（Ａｌｅｘａ－４８８結合ヤギ抗マウスＩｇＧ）とともに室温で暗所で１時間インキュベートした。細胞をプレート洗浄器で６回洗浄し、ＭｉｎｉＭａｘプレートリーダーを備えたＳｐｅｃｔｒａｍａｘでの分析のために１００ｕＬのＰＢＳ中に放置して、蛍光フォーカスを計数した。中和百分率を以下のように計算するので、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍで非線形回帰（ｌｏｇ（阻害剤）対応答、すなわち変数傾斜（４パラメータ））でプロットした：
中和％＝（１－（（ウェル値－培地のみの対照）／（ウイルスのみの対照－培地のみの対照））））＊１００
中和が確認されたら、製造元のプロトコルに従って、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてウイルス増殖由来の感染細胞からＲＮＡを単離した。得られたＲＮＡを、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓシステムを用いるｃＤＮＡ合成に使用した。このｃＤＮＡを、ＰＣＲにおけるテンプレートとして使用し、以下のパラメータを用いてジカＥ配列を増幅した。
Ｈ４Ｈ２５７０３ＮおよびＨ４Ｈ２５６１９Ｐの圧力下で生成した回避変異体が中和に対して耐性を持っているかどうかを確認するために、ベロ細胞における中和アッセイを行った。簡潔にいえば、中和を完了させるために、ウイルスを、１１点曲線について１０ｕｇ／ｍＬから３倍希釈で２００ｐｇ／ｍＬまでの濃度の低下する濃度のＨ４Ｈ２５７０３Ｎ、Ｈ４Ｈ２５６１９Ｐ、またはアイソタイプ対照抗体のいずれかと組み合わせた。ウイルスおよび抗体を一緒に３７℃で３０分間インキュベートした後、黒色透明底９６ウェル細胞培養プレート中に事前に播種しておいた１０，０００個のベロ細胞へと添加した。細胞は、ウイルス／抗体混合物とともに、インキュベーション中、定期的に穏やかに撹拌しながら、１時間インキュベートした。インキュベーション後、接種源を取り出し、細胞を１％メチルセルロース＊＊＊を含有するＤＭＥＭで覆い、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。メチルセルロース重層物を細胞から吸引した後、この細胞をＰＢＳで２回洗浄し、アセトンとメタノールとの氷冷１：１混合物で４℃で３０分間固定した。固定した細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、室温で１５分間、５％ＦＢＳおよび０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘを含有するＰＢＳで透過処理した。細胞をＰＢＳで洗浄した後、５％ＦＢＳを含有するＰＢＳとともにインキュベートして、室温で３０分間、非特異的結合を遮断した。次に、細胞をＰＢＳ＋５％ＦＢＳおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０中、１：１０，０００希釈の１次抗体（ポリクローナル免疫化マウス腹水）とともに、室温で１時間インキュベートした。細胞を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＡｑｕａＭａｘ ４０００プレート洗浄機を用いてＰＢＳで６回洗浄した後、ＰＢＳ＋５％ＦＢＳおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０中で１ｕｇ／ｍＬの２次抗体（Ａｌｅｘａ－４８８結合ヤギ抗マウスＩｇＧ）とともに室温で暗所で１時間インキュベートした。細胞をプレート洗浄器で６回洗浄し、ＭｉｎｉＭａｘプレートリーダーを備えたＳｐｅｃｔｒａｍａｘでの分析のために１００ｕＬのＰＢＳ中に放置して、蛍光フォーカスを計数した。中和百分率を以下のように計算するので、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍで非線形回帰（ｌｏｇ（阻害剤）対応答、すなわち変数傾斜（４パラメータ））でプロットした：
中和％＝（１－（（ウェル値－培地のみの対照）／（ウイルスのみの対照－培地のみの対照））））＊１００
中和が確認されたら、製造元のプロトコルに従って、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてウイルス増殖由来の感染細胞からＲＮＡを単離した。得られたＲＮＡを、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓシステムを用いるｃＤＮＡ合成に使用した。このｃＤＮＡを、ＰＣＲにおけるテンプレートとして使用し、以下のパラメータを用いてジカＥ配列を増幅した。
【表14】
【0287】
得られたＰＣＲ産物（予想サイズ：２１１３ｂｐ）を１ＸＳｙｂｒ Ｓａｆｅ ＤＮＡ Ｓｔａｉｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有する１％アガロースＴＢＥゲル上で１２０Ｖで１時間泳動した。アンプリコンを切り出し、Ｑｉａｇｅｎ ＱｉａＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを製造元の説明書に従って用いて精製した。得られた精製産物を、以下のプライマーを用いるＳａｎｇｅｒ法を用いて配列決定した：
【表15】
【0288】
配列を分析し、完全長ジカＥ配列を構成するように組み立てた。
配列アセンブリの翻訳は回避変異を明らかにした。
配列アセンブリの翻訳は回避変異を明らかにした。
【0289】
結果
配列分析は、Ｈ４Ｈ２５７０３Ｎの回避変異がジカウイルスＥタンパク質の位置３０２において認められることを確認した（配列番号３７６；Ｓ３０２Ｅ）。Ｈ４Ｈ２５６１９Ｐの回避変異は、ジカウイルスＥタンパク質のアミノ酸位置３１１および３６９において認められた（それぞれ配列番号３７６；Ｔ３１１ＩおよびＫ３６９Ｅ）。Ｈ４Ｈ２５７０３ＮについてのＥタンパク質回避変異（Ｓ３０２Ｆ）を示すアミノ酸配列を配列番号３７７として示す。Ｈ４Ｈ２５６１９ＰについてのＥタンパク質回避変異（Ｔ３１１ＩおよびＫ３６９Ｅ）を示すアミノ酸配列を配列番号３７８として示す。これらの研究からのデータは、ウイルス中和において主要な役割を担い得るＺＩＫＶ Ｅタンパク質上のＨ４Ｈ２５７０３ＮおよびＨ４Ｈ２５６１９Ｐについての結合部位を示唆している。加えて、図８Ａおよび図８Ｂに示す結果は、１つの抗体がＥタンパク質における変異のためにＺＩＫＶを中和しないかもしれないが、第２の抗体がＥタンパク質の変異を含有するこのウイルスを中和することができるかもしれず、したがって、抗体カクテルの使用のための支持を提供するかもしれないことを実証している。
配列分析は、Ｈ４Ｈ２５７０３Ｎの回避変異がジカウイルスＥタンパク質の位置３０２において認められることを確認した（配列番号３７６；Ｓ３０２Ｅ）。Ｈ４Ｈ２５６１９Ｐの回避変異は、ジカウイルスＥタンパク質のアミノ酸位置３１１および３６９において認められた（それぞれ配列番号３７６；Ｔ３１１ＩおよびＫ３６９Ｅ）。Ｈ４Ｈ２５７０３ＮについてのＥタンパク質回避変異（Ｓ３０２Ｆ）を示すアミノ酸配列を配列番号３７７として示す。Ｈ４Ｈ２５６１９ＰについてのＥタンパク質回避変異（Ｔ３１１ＩおよびＫ３６９Ｅ）を示すアミノ酸配列を配列番号３７８として示す。これらの研究からのデータは、ウイルス中和において主要な役割を担い得るＺＩＫＶ Ｅタンパク質上のＨ４Ｈ２５７０３ＮおよびＨ４Ｈ２５６１９Ｐについての結合部位を示唆している。加えて、図８Ａおよび図８Ｂに示す結果は、１つの抗体がＥタンパク質における変異のためにＺＩＫＶを中和しないかもしれないが、第２の抗体がＥタンパク質の変異を含有するこのウイルスを中和することができるかもしれず、したがって、抗体カクテルの使用のための支持を提供するかもしれないことを実証している。
【0290】
実施例１０．ＺＩＫＶ感染マウスにおける防御に及ぼす抗ＺＩＫＶ抗体の組み合わせの効果
ＺＩＫＶ感染のマウスモデルにおいて、単独でまたは組み合わせで使用する場合、抗ＺＩＫＶ抗体の効果を決定するために研究を行った。
ＺＩＫＶ感染のマウスモデルにおいて、単独でまたは組み合わせで使用する場合、抗ＺＩＫＶ抗体の効果を決定するために研究を行った。
【0291】
インターフェロンアルファ／ベータ受容体１（ＩＦＮＡＲ１）ノックアウトマウスを６～８週齢で受け取り、１個体あたり２００、５０、または１２．５μｇの最終用量の抗体のために陰性アイソタイプ対照抗体、または抗ＺＩＫＶ抗体のいずれかを含有する２００μＬのＰＢＳを皮下注射した。抗体のうちの２つを組み合わせた場合、各抗体は１００、２５、または６．２５μｇの用量で与えられ、それにより、いずれの抗体の総用量も、組み合わせた場合、２００、５０または１２．５μｇであった。処置の１日後、マウスを、ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ、１×ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン（ＰＳＧ）中に希釈した１０５ｆｆｕのジカウイルス株ＦＳＳ１３０２５で、腹腔内注射を介して感染させた。体重減少または極度の疾病について動物を最大３週間モニターした。動物は、開始体重の８０％の体重閾値を下回った場合、または極度の疾病を呈した場合、安楽死させた（振戦または非応答性によって正規化－後肢麻痺を有する動物を本実験における回復についてモニターした）。
【0292】
結果
本結果は、アイソタイプ対照抗体を受けたマウスがすべて、感染９日後までに体重の２０％超を減少させ、ＩＡＣＵＣ指針により屠殺しなければならないことを示した。２００ｕｇまたは５０ｕｇの用量のＨ４Ｈ２５７０３ＮまたはＨ４Ｈ２５６１９を用いたマウスの前処理は、１００％の生存をもたらした。１２．５ｕｇのＨ４Ｈ２５７０３で処置したマウスの６０％が、ＺＩＫＶを用いた負荷を生き延びた。１２．５ｕｇのＨ４Ｈ２５６１９で処置したマウスの７５％がＺＩＫＶを用いた負荷を生き延びた。２００ｕｇ（各抗体１００ｕｇ）または５０ｕｇ（各抗体２５ｕｇ）の総用量の両抗体を用いたマウスの前処理は、１００％の生存率をもたらした。総用量１２．５ｕｇ（各抗体６．２５ｕｇ）を用いたマウスの前処理も１００％の生存率をもたらした。これらの結果は、各抗体を単独で使用する場合に達成される効力と比較して、より低用量の各抗体を組み合わせで使用して、より大きな効力を達成することができることを示唆する。結果を以下の表１０に示す。
本結果は、アイソタイプ対照抗体を受けたマウスがすべて、感染９日後までに体重の２０％超を減少させ、ＩＡＣＵＣ指針により屠殺しなければならないことを示した。２００ｕｇまたは５０ｕｇの用量のＨ４Ｈ２５７０３ＮまたはＨ４Ｈ２５６１９を用いたマウスの前処理は、１００％の生存をもたらした。１２．５ｕｇのＨ４Ｈ２５７０３で処置したマウスの６０％が、ＺＩＫＶを用いた負荷を生き延びた。１２．５ｕｇのＨ４Ｈ２５６１９で処置したマウスの７５％がＺＩＫＶを用いた負荷を生き延びた。２００ｕｇ（各抗体１００ｕｇ）または５０ｕｇ（各抗体２５ｕｇ）の総用量の両抗体を用いたマウスの前処理は、１００％の生存率をもたらした。総用量１２．５ｕｇ（各抗体６．２５ｕｇ）を用いたマウスの前処理も１００％の生存率をもたらした。これらの結果は、各抗体を単独で使用する場合に達成される効力と比較して、より低用量の各抗体を組み合わせで使用して、より大きな効力を達成することができることを示唆する。結果を以下の表１０に示す。
【表16】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】