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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2021-12-14
(45)【発行日】2022-01-13
(54)【発明の名称】豚コレラワクチン用組成物およびその製造方法
(51)【国際特許分類】
A61K 39/106 20060101AFI20220105BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20220105BHJP
A61K 39/385 20060101ALI20220105BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20220105BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220105BHJP
【ＦＩ】
A61K39/106 ZNA
A61P31/04 171
A61K39/385
A61K47/68
A61K48/00
【請求項の数】
15
(21)【出願番号】P 2020521575
(86)(22)【出願日】2019-09-16
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-03-04
(86)【国際出願番号】 KR2019011915
(87)【国際公開番号】W WO2020060117
(87)【国際公開日】2020-03-26
【審査請求日】2020-04-13
(31)【優先権主張番号】10-2018-0112445
(32)【優先日】2018-09-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】519142114
【氏名又は名称】バイオアプリケーションズ インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＩＮＣ．
(73)【特許権者】
【識別番号】520130373
【氏名又は名称】リパブリック オブ コリア（アニマル アンド プラント クオレンティン エージェンシー）
【氏名又は名称原語表記】ＲＥＰＵＢＬＩＣ ＯＦ ＫＯＲＥＡ（ＡＮＩＭＡＬ ＡＮＤ ＰＬＡＮＴ ＱＵＡＲＡＮＴＩＮＥ ＡＧＥＮＣＹ）
(74)【代理人】
【識別番号】110000729
【氏名又は名称】特許業務法人 ユニアス国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】イ、ヨンジク
(72)【発明者】
【氏名】アン、ドン－ジュン
(72)【発明者】
【氏名】チェ、セ ウン
(72)【発明者】
【氏名】ソン、ジェ－ヨン
(72)【発明者】
【氏名】チョ、イン－ス
【審査官】石井 裕美子
(56)【参考文献】
【文献】中国特許出願公開第１０６５１９０４１（ＣＮ，Ａ）
【文献】韓国公開特許第２０１０－１７３２６２４（ＫＲ，Ａ）
【文献】NCBI GenBank Accession No.BAM75542.1，2013年01月12日
【文献】NCBI GenBank Accession No.BAM66310.1，2012年
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３９／００－３９／４４
Ａ６１Ｋ ４７／００－４７／６９
Ａ６１Ｋ ４８／００
Ａ６１Ｐ １／００－４３／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号４で表される豚のＦｃ断片と融合した豚コレラ抗原Ｅ２タンパク質を有効成分として含む、豚コレラ予防用ワクチン組成物。
【請求項2】
前記Ｅ２タンパク質は、配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項3】
前記Ｅ２タンパク質は、Ｆｃ断片と融合することによってセルフ免疫増強反応（ｓｅｌｆ－ａｄｊｕｖａｎｔｉｎｇ）効果および増加した溶解性を有することを特徴とする 請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項4】
配列番号４で表される豚のＦｃ断片と融合した豚コレラ抗原Ｅ２タンパク質を有効成分として含む、豚コレラ予防用飼料組成物。
【請求項5】
配列番号４で表される豚のＦｃ断片をコードするポリヌクレオチドおよび豚コレラ抗原Ｅ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、Ｆｃ断片と融合した豚コレラ抗原Ｅ２タンパク質生産用組み換えベクター。
【請求項6】
前記Ｅ２タンパク質は、配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項５に記載の組み換えベクター。
【請求項7】
前記組み換えベクターは、プロモーター遺伝子、豚コレラ抗原Ｅ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびＦｃ断片をコードするポリヌクレオチドが順次に連結されていることを特徴とする 請求項５に記載の組み換えベクター。
【請求項8】
前記プロモーターは、カリフラワーモザイクウイルス（ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）由来３５Ｓプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）由来１９Ｓ ＲＮＡプロモーター、植物のアクチンタンパク質プロモーター、ユビキチンタンパク質プロモーター、ＣＭＶ（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）プロモーター、ＳＶ４０（Ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ ４０）プロモーター、ＲＳＶ（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）プロモーター、ｐＥＭＵプロモーター、ＭＡＳプロモーター、ヒストンプロモーター、ＣｌｐプロモーターおよびＥＦ－１ａ（Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ－１ ａｌｐｈａ）プロモーターよりなる群から選ばれるいずれか一つ以上であることを特徴とする請求項７に記載の組み換えベクター。
【請求項9】
前記組み換えベクターは、ＢｉＰ（Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードするポリヌクレオチドをさらに含むことを特徴とする請求項５に記載の組み換えベクター。
【請求項10】
前記組み換えベクターは、ＨＤＥＬ（Ｈｉｓ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ）ペプチドをコードする遺伝子をさらに含むことを特徴とする請求項５に記載の組み換えベクター。
【請求項11】
前記組み換えベクターは、Ｍ１７の５′ＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｉｏｎ）部位遺伝子をさらに含むことを特徴とする請求項５に記載の組み換えベクター。
【請求項12】
前記組み換えベクターは、Ｆｃ断片と融合した豚コレラ抗原Ｅ２タンパク質の発現量を増加させることを特徴とする請求項５に記載の組み換えベクター。
【請求項13】
請求項５～１２のいずれかに記載の組み換えベクターで形質転換された、形質転換体。
【請求項14】
（ａ）請求項１３に記載の形質転換体を培養する段階と；と（ｂ）前記形質転換体または培養液からＦｃ断片が融合した豚コレラ抗原Ｅ２タンパク質を分離および精製する段階と；を含む、セルフ免疫増強効果を有するＦｃ断片と融合した豚コレラ抗原Ｅ２タンパク質の生産方法。
【請求項15】
配列番号４で表される豚のＦｃ断片と融合した豚コレラ抗原Ｅ２タンパク質を有効成分として含む組成物を個体に投与する段階を含む豚コレラの予防または治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、豚のＦｃ断片と融合した豚コレラ抗原Ｅ２タンパク質生産用発現ベクター、前記発現ベクターで形質転換された形質転換体、前記形質転換体から分離した豚のＦｃ断片と融合した豚コレラ抗原Ｅ２タンパク質およびその用途などに関する。
【背景技術】
【0002】
豚コレラとは、古典的な豚コレラウイルス（ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ；ＣＳＦＶ）が原因病原体である疾病であって、ヒトや豚以外の他の動物には感染しないが、豚と野生のイノシシでは、一旦発病してしまうと、伝搬性が非常に高く、治療法がなく、感染した豚は、大部分が斃死する致死率が非常に高い伝染病である。豚コレラは、世界動物保健機構（ＯＩＥ）で非常に重要疾病と分類されており、韓国内でも、家畜伝染病予防法で第１種の家畜伝染病と分類される疾病であって、斃死率と罹患率が非常に高くて、豚コレラの根絶なしには養豚産業の未来を保障できないというほどに予防が重要な問題と認識される伝染病である。韓国では、疾病対策として弱毒生ウイルスであるＬＯＭ ｓｔｒａｉｎで製造した生ワクチンで予防接種を実施しているが、専門家および第一線の養豚従事者は、絶えずＬＯＭワクチンの病原性および安全性に対する問題を提起してきた（韓国特許登録１０－１６４２７２７）。
【0003】
ＬＯＭワクチン株の安全性に対する問題が提起された代表的な事件は、２００２年に豚コレラ清浄化宣言をし、非ワクチン政策をしたが、２００２年と２００３年に全国的に豚コレラが再発生して、２００４年からは、再び全国のすべての豚にＬＯＭワクチン接種を再開したが、この際、妊娠母豚接種で流死産の事例が多く発生してイシュー化になった事件がある。また、１９９９年から豚コレラ非ワクチン地域である済州島では、２００４年に飼料の添加剤に使用する血粉製剤の製品に豚コレラＬＯＭワクチン株が非意図的に汚染されて流通したが、済州島の３００個の農家のうち１５０個の農家のワクチン株感染豚において豚コレラと非常に類似した症状が発生し、豚の剖検時にも実質臓器に特異的な病変症状を示したこともある。最近、２０１４年度には、済州島で豚コレラＬＯＭワクチン株が間違って流通して妊娠母豚に接種されることによって、流死産と胎児にＬＯＭワクチン株が垂直感染したことが確認されて、ワクチンの安全性に関する問題が再度提起されており、これを代替する効果的なワクチンが要求されるのが現況である。したがって、安定的に豚コレラを効果的に予防できる新規のワクチンの必要性が提起されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本発明は、前記のような従来技術上の問題点を解決するために導き出されたものであって、豚のＦｃ断片と融合した豚コレラ抗原Ｅ２タンパク質、これを含むワクチン組成物、およびその製造方法などを提供することをその目的とする。
【0005】
しかしながら、本発明が解決しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていない他の課題は、下記の記載から本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者に明確に理解され得る。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明は、配列番号４で表される豚のＦｃ断片と融合した豚コレラ抗原Ｅ２タンパク質を有効成分として含む豚コレラ予防用ワクチン組成物を提供する。
【0007】
本発明の一具体例において、前記Ｅ２タンパク質は、配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含むことができるが、豚コレラ抗原の種類なら、これに制限されない。
【0008】
本発明の他の具体例において、前記Ｅ２タンパク質は、Ｆｃ断片と融合することによって、セルフ免疫増強反応（ｓｅｌｆ－ａｄｊｕｖａｎｔｉｎｇ）効果および増加した溶解性を有することを特徴とする。前記融合は、Ｆｃ断片のＮ末端またはＣ末端に抗原がペプチド結合で連結された形態でありうるが、Ｆｃ断片と抗原が結合されている形態であれば、これに制限されない。
【0009】
また、本発明は、配列番号４で表される豚のＦｃ断片と融合した豚コレラ抗原Ｅ２タンパク質を有効成分として含む豚コレラ予防用飼料組成物を提供する。
【0010】
また、本発明は、配列番号４で表される豚のＦｃ断片と融合した豚コレラ抗原Ｅ２タンパク質を有効成分として含む組成物を個体に投与する段階を含む豚コレラの予防または治療方法を提供する。
【0011】
また、本発明は、配列番号４で表される豚のＦｃ断片と融合した豚コレラ抗原Ｅ２タンパク質を有効成分として含む組成物の豚コレラの予防または治療用途を提供する。
【0012】
また、本発明は、配列番号４で表される豚のＦｃ断片と融合した豚コレラ抗原Ｅ２タンパク質の豚コレラの予防に用いられる薬剤を生産するための用途を提供する。
【0013】
また、本発明は、配列番号４で表される豚のＦｃ断片をコードするポリヌクレオチドおよび豚コレラ抗原Ｅ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＦｃ断片と融合した豚コレラ抗原Ｅ２タンパク質生産用組み換え発現ベクターを提供する。
【0014】
本発明の一具体例において、前記組み換え発現ベクターは、プロモーター遺伝子、Ｅ２抗原をコードするポリヌクレオチド、およびＦｃ断片をコードするポリヌクレオチドの順に、またはプロモーター遺伝子、Ｆｃ断片をコードするポリヌクレオチドおよびＥ２抗原をコードするポリヌクレオチドの順に作動可能に順次に連結され得る。
【0015】
本発明の他の具体例において、前記プロモーターは、カリフラワーモザイクウイルス（ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）由来３５Ｓプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）由来１９Ｓ ＲＮＡプロモーター、植物のアクチンタンパク質プロモーター、ユビキチンタンパク質プロモーター、ＣＭＶ（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）プロモーター、ＳＶ４０（Ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ ４０）プロモーター、ＲＳＶ（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）プロモーター、ＥＦ－１ａ（Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ－１ ａｌｐｈａ）プロモーター、ｐＥＭＵプロモーター、ＭＡＳプロモーター、ヒストンプロモーター、Ｃｌｐプロモーターなどであるが、これに制限されない。
【0016】
本発明のさらに他の具体例において、前記組み換え発現ベクターは、ＢｉＰ（Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードするポリヌクレオチド、ＨＤＥＬ（Ｈｉｓ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ）ペプチドをコードする遺伝子、Ｍ１７の５′ＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｉｏｎ）部位遺伝子などをさらに含むことができる。
【0017】
本発明のさらに他の具体例において、前記組み換え発現ベクターは、Ｆｃ断片と融合した豚コレラ抗原Ｅ２タンパク質の発現量を増加させ、Ｆｃ断片と融合した豚コレラ抗原Ｅ２タンパク質は、セルフ免疫増強効果および増加した溶解性を有することを特徴とする。
【0018】
また、本発明は、前記組み換え発現ベクターで形質転換された形質転換体を提供する。
【0019】
本発明の一具体例において、前記形質転換体は、大腸菌、バシルス、サルモネラ、酵母などのような微生物、昆虫細胞、ヒトを含む動物細胞、マウス、ラット、犬、猿、豚、馬、牛などのような動物、アグロバクテリウムツメファシエンス、植物などであってもよく、前記植物は、稲、小麦、麦、とうもろこし、豆、ジャガイモ、小豆、燕麦、およびモロコシを含む食糧作物類；シロイヌナズナ、ハクサイ、ダイコン、唐辛子、イチゴ、トマト、スイカ、キュウリ、キャベツ、マクワウリ、カボチャ、ネギ、タマネギ、およびニンジンを含む野菜作物類；高麗人参、タバコ、木花、ゴマ、サトウキビ、テンサイ、エゴマ、ピーナッツ、およびアブラナを含む特用作物類；およびリンゴの木、梨の木、ナツメの木、桃、ブドウ、ミカン、柿、スモモ、あんず、およびバナナを含む果樹類；およびバラ、カーネーション、菊、ユリ、およびチューリップを含む草花類などであってもよいが、本発明の組み換え発現ベクターで形質転換され得る生命体であれば、これに制限されない。
【0020】
また、本発明は、（ａ）前記形質転換体を培養する段階と；（ｂ）前記形質転換体または培養液からＦｃ断片が融合した豚コレラ抗原Ｅ２タンパク質を分離および精製する段階と；を含むセルフ免疫増強効果を有するＦｃ断片と融合した豚コレラ抗原Ｅ２タンパク質の生産方法を提供する。前記形質転換体は、好ましくは細胞自体、または細胞を含む培養物であり得、前記培養液は、好ましくは細胞を培養した後、細胞を除去した培養液でありうるが、本発明の組み換え抗原を含んでいると、これに制限されない。
【発明の効果】
【0021】
本発明による豚のＦｃ断片と融合した豚コレラ抗原Ｅ２タンパク質は、セルフ免疫増強効果を有するので、更なる免疫抗原補強剤を使用することなく、少量のワクチン組成物をもって効果的な豚コレラの予防効果を示すことができると共に、抗原の溶解性および安定性を増加させて、抗原の分離および保管が容易である。また、本発明による発現ベクターを利用することによって、Ｅ２タンパク質の生産量を顕著に増加させることができるので、ワクチンの高効率生産を可能にするものと期待される。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【発明を実施するための形態】
【0023】
本発明では、豚の免疫グロブリンＦｃ断片と豚コレラ抗原Ｅ２を結合させる場合、前記断片により抗原の発現量および生産性が増加すると共に、溶解性および安定性が増加することを確認し、前記豚のＦｃ断片と融合した抗原Ｅ２、前記豚のＦｃ断片をコードするポリヌクレオチドおよびＥ２をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターおよび前記発現ベクターを利用した組み換え抗原の生産方法を提供することを目的とする。
【0024】
本明細書において、「Ｆｃ断片（Ｆｃ ｆｒａｇｍｅｎｔ）」とは、免疫グロブリンがパパイン（ｐａｐａｉｎ）により消化されたとき、重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ；Ｈ ｃｈａｉｎ）部分だけがＳ－Ｓ結合で連結され、抗原結合部位を有しない部分をＦｃ断片と言い、本発明のＦｃ断片は、好ましくは豚のＦｃ断片であり、より好ましくは配列番号４で表される豚のＦｃ断片であるが、目的抗原と融合したとき、目的抗原の発現量および溶解性を増加させるＦｃ断片であれば、これに制限されない。また、本発明のＦｃ断片は、配列番号４の変異体が本発明の範囲に含まれる。具体的に、前記遺伝子は、配列番号４の塩基配列と９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の配列相同性を有する塩基配列を含むことができる。ポリヌクレオチドに対する「配列相同性の％」は、最適に配列された配列と比較領域を比較することによって確認され、比較領域でポリヌクレオチド配列の一部は、さらに、配列の最適配列に対する参考配列（追加または削除を含まない）に比べて追加または削除（すなわち、ギャップ）を含むことができる。
【0025】
本明細書において、「抗原（ａｎｔｉｇｅｎ）」とは、体内で免疫反応を起こすすべての物質を総称し、好ましくはウイルス、化合物質、細菌、花粉、癌細胞、エビなどまたはこれらの一部のペプチドまたはタンパク質であるが、体内で免疫反応を起こすことができる物質であれば、これに制限されない。
【0026】
本明細書において、「豚コレラウイルス（ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ）」は、Ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓに属する約１２．３～１２．５ｋｂ大きさのｅｎｖｅｌｏｐｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ（Ｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）の一種であるＥ２ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎに抗原決定部位を有していて、豚コレラウイルスのＥ２タンパク質は、ウイルス中和抗体反応を誘発し、免疫学的に豚コレラの防御機作に重要な役割をするものと知られている。前記豚コレラウイルスのＥ２タンパク質は、ｇｐ５５とも称し、好ましくは配列番号１8のアミノ酸配列で表される。また、本発明のＥ２タンパク質は、配列番号１7の変異体が本発明の範囲に含まれる。具体的に、前記遺伝子は、配列番号１7の塩基配列と７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上の配列相同性を有する塩基配列を含むことができる。
【0027】
本明細書において、「ワクチン（ｖａｃｃｉｎｅ）」とは、生体に免疫反応を起こす抗原を含有する生物学的な製剤であって、感染症の予防のためにヒトや動物に注射したり、経口投与することによって、生体に免疫ができるようにする免疫源をいう。前記動物は、ヒトまたは非ヒト動物であって、前記非ヒト動物は、豚、牛、馬、犬、山羊、羊などを指すが、これに制限されない。
【0028】
本明細書において、「目的タンパク質（ｔａｒｇｅｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）」とは、本発明による遺伝工学的方法で生産しようとするタンパク質を言うものであり、好ましくは商業的用途に用いられている大量で生産される必要があるタンパク質であり、より好ましくは抗原、抗体、抗体の断片、構造タンパク質、調節タンパク質、転写因子、毒素タンパク質、ホルモン、ホルモン類似体、サイトカイン、酵素、酵素の断片、酵素阻害剤、輸送タンパク質、受容体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、受容体の断片、生体防御誘導物質、貯蔵タンパク質、移動タンパク質（ｍｏｖｅｍｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）、エックスプロイティブタンパク質（ｅｘｐｌｏｉｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）、レポータータンパク質などであるが、本発明の組み換え発現ベクターで製造され得るタンパク質であれば、これに制限されない。
【0029】
本明細書において、「組み換えベクター（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖｅｃｔｏｒ）」とは、ベクター内に挿入された異種の核酸によりコードされるペプチドまたはタンパク質を発現できるベクターを示すものであり、好ましくは豚のＦｃ断片が融合した目的抗原を発現できるように製造されたベクターを意味する。前記「ベクター」は、試験管内、生体外または生体内で宿主細胞へ塩基の導入および／または転移のための任意の媒介物を言い、他のＤＮＡ断片が結合して結合された断片の複製をもたらすことができる複製単位（ｒｅｐｌｉｃｏｎ）であってもよく、「複製単位」とは、生体内でＤＮＡ複製の自家ユニットとして機能する、すなわち、自らの調節により複製可能な、任意の遺伝的単位（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルスなど）を言う。本発明の組み換え発現ベクターは、好ましくはＲＮＡ重合酵素が結合する転写開始因子であるプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、転写を調節するための任意のオペレーター配列、適合したｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列と転写および解読の終結を調節する配列、ターミネータなどを含むことができ、より好ましくはタンパク質の合成量を増加させるためのＭ１７の５′ＵＴＲ部位遺伝子、目的タンパク質を小胞体に移動させるためのＢｉＰ遺伝子、タンパク質が小胞体内で安定的に維持され得るようにタンパク質の分解を最小化するためのＨＤＥＬ遺伝子などをさらに含むことができ、より好ましくは組み換えタンパク質を容易に分離するためのタグ用遺伝子、形質転換体を選別するための抗生剤耐性遺伝子などの選別用マーカー遺伝子などをさらに含むことができる。
【0030】
前記タグ用遺伝子は、本発明のタグタンパク質であるＦｃ断片以外にさらに容易な分離のために含まれるものであって、代表的にＡｖｉタグ、Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎタグ、ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍａｔｅタグ、Ｅタグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、Ｓタグ、ＳＢＰタグ、ＩｇＧ－Ｆｃタグ、ＣＴＢタグ、Ｓｏｆｔａｇ １タグ、Ｓｏｆｔａｇ ３タグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ＴＣタグ、Ｖ５タグ、ＶＳＶタグ、Ｘｐｒｅｓｓタグなどが含まれ得、前記選別用マーカー遺伝子には、代表的にグリホサート（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ）またはホスフィノスリシン（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ）のような除草剤抵抗性遺伝子、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）、Ｇ４１８、ブレオマイシン（Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、ハイグロマイシン（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）、クロラムフェニコール（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）のような抗生剤耐性遺伝子、ａａｄＡ遺伝子などが含まれ得、前記プロモーターには、代表的にｐＥＭＵプロモーター、ＭＡＳプロモーター、ヒストンプロモーター、Ｃｌｐプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）由来３５Ｓプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）由来１９Ｓ ＲＮＡプロモーター、植物のアクチンタンパク質プロモーター、ユビキチンタンパク質プロモーター、ＣＭＶ（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）プロモーター、ＳＶ４０（Ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ ４０）プロモーター、ＲＳＶ（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）プロモーター、ＥＦ－１α（Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ－１ ａｌｐｈａ）プロモーターなどが含まれ得、前記ターミネータは、代表的にノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）、稲アミラーゼＲＡｍｙ１ Ａターミネータ、パセオリンターミネータ、アグロバクテリウムツメファシエンスのオクトパイン（Ｏｃｔｏｐｉｎｅ）遺伝子のターミネータ、大腸菌のｒｒｎＢ１／Ｂ２ターミネータなどであるが、前記例は、例示に過ぎず、これに制限されない。
【0031】
本明細書において、「融合抗原（ｆｕｓｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ）」とは、豚のＦｃ断片と目的抗原が融合した組み換え抗原を意味するものであり、好ましくは前記Ｆｃ断片と融合することによって溶解性が増加し、同時に免疫原性が増加した組み換えタンパク質を意味するが、本発明の豚のＦｃ断片と結合した組み換え抗原であれば、これに制限されない。
【0032】
本明細書において、「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」とは、注入されたＤＮＡにより生物の遺伝的な性質が変わることを総称し、「形質転換体（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｏｒｇａｎｉｓｍ）」とは、分子遺伝学的方法で外部の遺伝子を注入して製造された生命体であって、好ましくは本発明の組み換え発現ベクターにより形質転換された生命体であり、前記生命体は、微生物、真核細胞、昆虫、動物、植物など生命がある生物であれば、制限がなく、好ましくは大腸菌、サルモネラ、バシルス、酵母、動物細胞、マウス、ラット(rat)、犬、猿、豚、馬、牛、アグロバクテリウムツメファシエンス、植物などであるが、これに制限されない。前記形質転換体は、形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）－媒介形質転換方法、パーティクルガン衝撃法（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｇｕｎ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、超音波処理法（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）およびＰＥＧ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎ ｇｌｙｃｏｌ）－媒介形質転換方法などの方法で製造され得るが、本発明のベクターを注入できる方法であれば、制限がない。
【0033】
本明細書において、「溶解性（ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）」とは、目的タンパク質またはペプチドが人体に投与するのに適した溶媒に溶解することができる程度を意味する。具体的には、特定の温度で所定の溶媒に対して溶質が飽和した程度を示すものでありうる。溶解性は、溶質の飽和濃度を決定することによって測定することができ、例えば溶媒に溶質を過量に添加し、これを撹拌し、濾過した後、濃度をＵＶ分光器またはＨＰＬＣなどを使用して測定することができるが、これに制限されるものではなく、高い溶解性は、組み換えタンパク質の分離精製に有利であり、組み換えタンパク質の凝集が抑制されて、組み換えタンパク質の生理活性または薬理的な活性を維持するのに長所を有する。
【0034】
本明細書において、「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」とは、本発明によるワクチン組成物の投与によって豚コレラを抑制させたり、発病を遅延させるすべての行為を意味する。
【0035】
本明細書において、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、本発明による豚のＦｃ断片と目的抗原が融合した組み換えタンパク質の投与によって豚コレラを抑制させたり、その疾患の程度を緩和させたり、治癒または治療するすべての行為を意味する。
【0036】
本明細書において、「個体（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）」とは、本発明のワクチン組成物が投与され得る対象を言い、その対象には制限がない。
【0037】
本発明の「ワクチン組成物」は、それぞれ通常の方法によって散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾルなどの経口型剤形および滅菌注射溶液の形態に剤形化して使用することができる。製剤化する場合には、普通使用される充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調製することができる。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、前記レシチン類似乳化剤に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、デンプン、カルシウムカーボネート（ｃａｌｃｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）またはラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチンなどを混ぜて調製することができる。また、単純な賦形剤以外に、マグネシウムステアレート、タルクのような潤滑剤も使用することができる。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などを使用することができ、頻繁に使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に、様々な賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれ得る。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水溶性製剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤が含まれる。非水溶性製剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、エチルオレートのような注射可能なエステルなどを使用することができる。また、さらに既存に知られている「免疫抗原補強剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）」をさらに含むことができる。前記補強剤は、当該技術分野に知られているものであれば、いずれのものでも制限なしに使用することができるが、例えばフロイント（Ｆｒｅｕｎｄ）の完全補助剤または不完全補助剤をさらに含んで、その免疫性を増加させることができる。
【0038】
本発明のワクチン組成物または薬学的組成物は、それぞれ、通常の方法によって散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾルなどの経口型剤形、外用剤、坐剤または滅菌注射溶液の形態に剤形化して使用することができる。
【0039】
本発明によるワクチン組成物の投与経路は、これらに限定されるものではないが、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸管、局所、舌下または直腸が含まれる。経口または非経口投与が好ましい。本願に使用される用語「非経口」は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、硬膜内、病巣内および頭蓋骨内注射または注入技術を含む。また、本発明のワクチン組成物は、直腸投与のための坐剤の形態で投与され得る。
【0040】
本発明によるワクチン組成物または薬学的組成物の投与量は、個体の年齢、体重、性別、身体状態などを考慮して選択される。特別な副作用なしに個体に免疫保護反応を誘導するのに必要な量は、免疫原として使用された組み換えタンパク質および賦形剤の任意存在によって多様である。一般的にそれぞれの用量は、本発明の組み換えタンパク質の滅菌溶液ｍｌ当たり０．１～１，０００μｇのタンパク質、好ましくは０．１～１００μｇを含有する。ワクチン組成物の場合には、必要に応じて初期用量に引き続いて任意に繰り返された抗原刺激を行うことができる。
【0041】
本明細書において、「免疫抗原補強剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）」とは、一般的に抗原に対する体液および／または細胞免疫反応を増加させる任意の物質を示し、「セルフ免疫増強反応（ｓｅｌｆ－ａｄｊｕｖａｎｔｉｎｇ）」とは、既存の抗原と比較して組み換え抗原自体が抗原に対する体液および／または細胞免疫反応を増加させる反応を意味し、好ましくは抗原に豚のＦｃ断片を結合させることによって、抗原の免疫原性が増加したことを意味する。
【0042】
本発明の「飼料組成物」は、本発明の豚のＦｃ断片と融合した豚コレラ抗原Ｅ２タンパク質を含む飼料であって、前記飼料としては、豚肉、牛肉、鶏肉などの副産物をはじめとして、とうもろこし、米、一般わら、野草、牧草、エンシレージ、乾草、山野草などがあるが、これに制限されるものではなく、家畜の飼育に使用される飼料であれば、制限がない。このような飼料に本発明のＥ２タンパク質を添加して配合する方法としては、機械的混合、吸着、吸藏などの方法があるが、これに制限されるものではない。
【実施例】
【0043】
以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかしながら、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。
【0044】
［実施例］
実施例１：ｐＦｃ融合ＶＰ１組み換えタンパク質発現ベクターの製造
目的タンパク質の発現量を増加させると同時に、溶解性を改善して、分離精製効率を高めた組み換えタンパク質を製造するための発現ベクターを製造するために、豚の免疫グロブリンＦｃ断片（ｐｏｒｃｉｎｅ Ｆｃ ｆｒａｇｍｅｎｔ；ｐＦｃ）のｐＦｃ１（配列番号１）、ｐＦｃ２（配列番号３）、またはｐＦｃ３（配列番号５）を用いて発現ベクターを製作した。より詳しくは、図１および図２に示されたように、ｐＣＡＭＢＩＡ１３００ベクターのＣａＭＶ３５Ｓプロモーター遺伝子とＮＯＳターミネータ（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）との間にＭ１７の５′ＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｉｏｎ）部位遺伝子（配列番号７）、ＢｉＰ（ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）タンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号８）、口蹄疫ウイルス（Ｆｏｏｄ－ａｎｄ－ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ；ＦＭＤＶ）のＶＰ１遺伝子（配列番号９）；ｐＦｃ断片をコードするポリヌクレオチド；およびＨＤＥＬ（Ｈｉｓ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを順にクローニングして、発現ベクターを製作した。ｐＦｃ断片は、それぞれ、ｐＦｃ１、ｐＦｃ２、またはｐＦｃ３を挿入して、互いに異なる発現ベクターを製造した。
実施例１：ｐＦｃ融合ＶＰ１組み換えタンパク質発現ベクターの製造
目的タンパク質の発現量を増加させると同時に、溶解性を改善して、分離精製効率を高めた組み換えタンパク質を製造するための発現ベクターを製造するために、豚の免疫グロブリンＦｃ断片（ｐｏｒｃｉｎｅ Ｆｃ ｆｒａｇｍｅｎｔ；ｐＦｃ）のｐＦｃ１（配列番号１）、ｐＦｃ２（配列番号３）、またはｐＦｃ３（配列番号５）を用いて発現ベクターを製作した。より詳しくは、図１および図２に示されたように、ｐＣＡＭＢＩＡ１３００ベクターのＣａＭＶ３５Ｓプロモーター遺伝子とＮＯＳターミネータ（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）との間にＭ１７の５′ＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｉｏｎ）部位遺伝子（配列番号７）、ＢｉＰ（ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）タンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号８）、口蹄疫ウイルス（Ｆｏｏｄ－ａｎｄ－ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ；ＦＭＤＶ）のＶＰ１遺伝子（配列番号９）；ｐＦｃ断片をコードするポリヌクレオチド；およびＨＤＥＬ（Ｈｉｓ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを順にクローニングして、発現ベクターを製作した。ｐＦｃ断片は、それぞれ、ｐＦｃ１、ｐＦｃ２、またはｐＦｃ３を挿入して、互いに異なる発現ベクターを製造した。
【0045】
実施例２：ｐＦｃ融合ＶＰ１組み換えタンパク質の発現実験
２．１．ｐＦｃ融合ＶＰ１組み換えタンパク質の発現量の確認実験
実施例１と同じ方法で製造されたｐＦｃ融合ＶＰ１組み換えタンパク質発現ベクターのタンパク質の発現量を確認するために、前記ベクターをシロイヌナズナの葉から分離した原形質体（ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ）にＰＥＧ－媒介形質転換（ＰＥＧ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）方法で導入して形質転換体を製造した後に、培養された原形質体を収集および溶解して、これから発現する組み換えタンパク質であるＢｉＰ：ＦＭＤＶ－ＶＰ１：ｐＦｃ発現様相をｐＦｃを認識するａｎｔｉ－ｐｉｇ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ（１：５，０００，Ａｂｃａｍ）を用いてウェスタンブロッティングで確認した。より詳しくは、細胞溶解液３０μＬをＳＤＳ試料バッファーと混合した後に加熱した。そして、１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに電気泳動して、サイズ別にタンパク質を分離し、分離したタンパク質をＰＶＤＦ膜に移動させた後に、５％スキムミルク（ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ）を用いてブロッキング段階を経た後に、抗体とタンパク質を結合させ、ＥＣＬ溶液を製造社で提供する方法によって処理して、ｐＦｃ融合組み換えタンパク質を確認した。その結果は、図３に示した。
２．１．ｐＦｃ融合ＶＰ１組み換えタンパク質の発現量の確認実験
実施例１と同じ方法で製造されたｐＦｃ融合ＶＰ１組み換えタンパク質発現ベクターのタンパク質の発現量を確認するために、前記ベクターをシロイヌナズナの葉から分離した原形質体（ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ）にＰＥＧ－媒介形質転換（ＰＥＧ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）方法で導入して形質転換体を製造した後に、培養された原形質体を収集および溶解して、これから発現する組み換えタンパク質であるＢｉＰ：ＦＭＤＶ－ＶＰ１：ｐＦｃ発現様相をｐＦｃを認識するａｎｔｉ－ｐｉｇ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ（１：５，０００，Ａｂｃａｍ）を用いてウェスタンブロッティングで確認した。より詳しくは、細胞溶解液３０μＬをＳＤＳ試料バッファーと混合した後に加熱した。そして、１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに電気泳動して、サイズ別にタンパク質を分離し、分離したタンパク質をＰＶＤＦ膜に移動させた後に、５％スキムミルク（ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ）を用いてブロッキング段階を経た後に、抗体とタンパク質を結合させ、ＥＣＬ溶液を製造社で提供する方法によって処理して、ｐＦｃ融合組み換えタンパク質を確認した。その結果は、図３に示した。
【0046】
図３に示されたように、多様なｐＦｃ断片のうちｐＦｃ２断片を結合させた組み換えタンパク質の発現量が最も高いことを確認した。前記結果を通じて、同じ免疫グロブリン断片であるとしても、同じ効果を示さないことを確認することができた。
【0047】
２．２．ｐＦｃ融合ＶＰ１組み換えタンパク質の安定性の確認実験
実施例１と同じ方法で製造されたｐＦｃ融合組み換えタンパク質発現ベクターのタンパク質安定性を確認するために、組み換えタンパク質を抽出した当時試料（０）と４℃で一時間の間保管した後の試料（１）をそれぞれ実施例２．１と同じ方法でウェスタンブロッティングを実施して確認した。その結果は、図４に示した。
実施例１と同じ方法で製造されたｐＦｃ融合組み換えタンパク質発現ベクターのタンパク質安定性を確認するために、組み換えタンパク質を抽出した当時試料（０）と４℃で一時間の間保管した後の試料（１）をそれぞれ実施例２．１と同じ方法でウェスタンブロッティングを実施して確認した。その結果は、図４に示した。
【0048】
図４に示されたように、ｐＦｃ２断片が結合した組み換えタンパク質の発現量が最も高く、安定性も高いことを確認した。
【0049】
２．３．ｐＦｃ２融合ＶＰ１組み換えタンパク質の溶解性の確認実験
実施例１と同じ方法で製造されたｐＦｃ２融合組み換えタンパク質発現ベクターのタンパク質溶解性（ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）を確認するために、前記ベクターで形質転換されたアグロバクテリウムツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）をタバコ植物（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）の葉に接種する一過性発現（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）方式でｐＦｃ２融合組み換えタンパク質（ＢｉＰ：ＦＭＤＶ－ＶＰ１：ｐＦｃ２）を発現させた後に、植物の葉からタンパク質を抽出して遠心分離した後に、溶液に含まれている可溶性（ｓｏｌｕｂｌｅ）形態（Ｓ）のタンパク質とペレット（ｐｅｌｌｅｔ；Ｐ）部分にあるタンパク質を用いて実施例２．１と同じ方法でウェスタンブロッティングを実施した。対照群としては、既存に知られているセルロース結合モジュール（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｕｌｅ；ＣＢＭ３）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１３）をｐＦｃ断片の代わりに融合させた組み換えタンパク質を利用した。その結果は、図５に示した。
実施例１と同じ方法で製造されたｐＦｃ２融合組み換えタンパク質発現ベクターのタンパク質溶解性（ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）を確認するために、前記ベクターで形質転換されたアグロバクテリウムツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）をタバコ植物（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）の葉に接種する一過性発現（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）方式でｐＦｃ２融合組み換えタンパク質（ＢｉＰ：ＦＭＤＶ－ＶＰ１：ｐＦｃ２）を発現させた後に、植物の葉からタンパク質を抽出して遠心分離した後に、溶液に含まれている可溶性（ｓｏｌｕｂｌｅ）形態（Ｓ）のタンパク質とペレット（ｐｅｌｌｅｔ；Ｐ）部分にあるタンパク質を用いて実施例２．１と同じ方法でウェスタンブロッティングを実施した。対照群としては、既存に知られているセルロース結合モジュール（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｕｌｅ；ＣＢＭ３）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１３）をｐＦｃ断片の代わりに融合させた組み換えタンパク質を利用した。その結果は、図５に示した。
【0050】
図５に示されたように、ｐＦｃ２融合組み換えタンパク質は、ペレット部分では観察されない反面、溶液内に含まれていることを確認した。しかしながら、セルロース結合ドメインを融合させた組み換えタンパク質の場合には、ペレット部分で組み換えタンパク質が相当数観察された。前記結果を通じて、ｐＦｃ２融合組み換えタンパク質は、目的タンパク質とｐＦｃ２断片の結合による構造的変形を通じて溶解性が増加したことを確認することができ、これにより、ｐＦｃ２融合組み換えタンパク質は、分離精製に有利であり、組み換えタンパク質の凝集が抑制されて、組み換えタンパク質の生理活性または薬理的な活性を維持するのに効果的であることを確認することができた。
【0051】
実施例３：ｐＦｃ２融合ＧＰ５組み換え抗原溶解性の確認実験
ｐＦｃ２断片を豚繁殖・呼吸障害症候群（Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ；ＰＲＲＳ）のＧＰ５抗原タンパク質と融合させるために、豚ＧＰ５抗原タンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号１１）を実施例１の組み換えベクター内に含まれている口蹄疫ウイルスのＶＰ１遺伝子の代わりに挿入して、ＧＰ５：ｐＦｃ２組み換え抗原を発現する組み換えベクターを製造した。そして、前記ベクターで形質転換されたアグロバクテリウムツメファシエンスをタバコ植物の葉に接種する一過性発現方式でｐＦｃ２融合ＧＰ５組み換え抗原（ＧＰ５：ｐＦｃ２）を発現させた後に、植物の葉からタンパク質を抽出して遠心分離した後に、溶液に含まれている可溶性形態（Ｓ）のタンパク質とペレット（Ｐ）部分にあるタンパク質を用いて実施例２．１と同じ方法でウェスタンブロッティングを実施した。対照群としては、ｐＦｃ断片の代わりにＣＢＭ３（配列番号１４）が融合したＧＰ５組み換え抗原を利用し、ＣＢＭ３融合ＧＰ５組み換え抗原の場合には、ウェスタンブロッティングのためにＨＡ抗体を用いて実験を進めた。その結果は、図６に示した。
ｐＦｃ２断片を豚繁殖・呼吸障害症候群（Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ；ＰＲＲＳ）のＧＰ５抗原タンパク質と融合させるために、豚ＧＰ５抗原タンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号１１）を実施例１の組み換えベクター内に含まれている口蹄疫ウイルスのＶＰ１遺伝子の代わりに挿入して、ＧＰ５：ｐＦｃ２組み換え抗原を発現する組み換えベクターを製造した。そして、前記ベクターで形質転換されたアグロバクテリウムツメファシエンスをタバコ植物の葉に接種する一過性発現方式でｐＦｃ２融合ＧＰ５組み換え抗原（ＧＰ５：ｐＦｃ２）を発現させた後に、植物の葉からタンパク質を抽出して遠心分離した後に、溶液に含まれている可溶性形態（Ｓ）のタンパク質とペレット（Ｐ）部分にあるタンパク質を用いて実施例２．１と同じ方法でウェスタンブロッティングを実施した。対照群としては、ｐＦｃ断片の代わりにＣＢＭ３（配列番号１４）が融合したＧＰ５組み換え抗原を利用し、ＣＢＭ３融合ＧＰ５組み換え抗原の場合には、ウェスタンブロッティングのためにＨＡ抗体を用いて実験を進めた。その結果は、図６に示した。
【0052】
図６に示されたように、ｐＦｃ２融合ＧＰ５組み換え抗原は、ペレット部分では若干のタンパク質が観察される反面、ほとんどが溶液内に含まれていることを確認した。しかしながら、ＣＢＭ３を融合させたＧＰ５組み換え抗原の場合には、ペレット部分で組み換えタンパク質が相当数観察された。前記結果を通じて、ｐＦｃ２融合組み換えタンパク質は、タンパク質の種類に関係なく、溶解性が増加することを確認することができた。
【0053】
前記結果を通じて、豚の免疫グロブリンＦｃ断片、特に、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むｐＦｃ２断片を目的タンパク質に融合させることによって、目的タンパク質の発現量を増加させると同時に、溶解性を増加させて、目的タンパク質を安定的に容易に分離および保管できることを確認することができた。
【0054】
実施例４：ｐＦｃ２融合ＰＣＶ２組み換えタンパク質の生産性および溶解性の確認実験
ｐＦｃ２断片をブタサーコウイルス２型（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ ２；ＰＣＶ２）タンパク質と融合させるために、ブタサーコウイルス２型タンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号１５）を実施例１の組み換えベクター内に含まれている口蹄疫ウイルスのＶＰ１遺伝子の代わりに挿入して、ＰＣＶ２：ｐＦｃ２組み換えタンパク質を発現する組み換えベクターを製造した。そして、前記ベクターで形質転換されたアグロバクテリウムツメファシエンスをタバコ植物の葉に接種する一過性発現方式でｐＦｃ２融合ＰＣＶ２組み換えタンパク質を発現させた後に、植物の葉からタンパク質を抽出して遠心分離した後に、溶液に含まれている可溶性形態（Ｓ）のタンパク質とペレット（Ｐ）部分にあるタンパク質を用いて実施例２．１と同じ方法でウェスタンブロッティングを実施した。対照群としては、ｐＦｃ断片の代わりにＨｉｓ ｔａｇが融合したＰＣＶ２組み換えタンパク質を利用し、Ｈｉｓ－ｔａｇ融合ＰＣＶ２組み換えタンパク質の場合には、ウェスタンブロッティングのためにａｎｔｉ－Ｈｉｓ抗体を用いて実験を進めた。その結果は、図７に示した。
ｐＦｃ２断片をブタサーコウイルス２型（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ ２；ＰＣＶ２）タンパク質と融合させるために、ブタサーコウイルス２型タンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号１５）を実施例１の組み換えベクター内に含まれている口蹄疫ウイルスのＶＰ１遺伝子の代わりに挿入して、ＰＣＶ２：ｐＦｃ２組み換えタンパク質を発現する組み換えベクターを製造した。そして、前記ベクターで形質転換されたアグロバクテリウムツメファシエンスをタバコ植物の葉に接種する一過性発現方式でｐＦｃ２融合ＰＣＶ２組み換えタンパク質を発現させた後に、植物の葉からタンパク質を抽出して遠心分離した後に、溶液に含まれている可溶性形態（Ｓ）のタンパク質とペレット（Ｐ）部分にあるタンパク質を用いて実施例２．１と同じ方法でウェスタンブロッティングを実施した。対照群としては、ｐＦｃ断片の代わりにＨｉｓ ｔａｇが融合したＰＣＶ２組み換えタンパク質を利用し、Ｈｉｓ－ｔａｇ融合ＰＣＶ２組み換えタンパク質の場合には、ウェスタンブロッティングのためにａｎｔｉ－Ｈｉｓ抗体を用いて実験を進めた。その結果は、図７に示した。
【0055】
図７に示されたように、ｐＦｃ２融合ＰＣＶ２組み換えタンパク質の場合には、ほとんどが溶液内に含まれていると共に、Ｈｉｓ－ｔａｇが融合したＰＣＶ２組み換えタンパク質と比較して生産量が顕著に増加したことを確認した。
【0056】
実施例５：ｐＦｃ２融合Ｅ２組み換えタンパク質の発現実験
５．１．ｐＦｃ２融合抗原タンパク質の分離
ｐＦｃ２断片を抗原タンパク質に融合して使用可能であるかを確認するために、豚コレラ抗原であるＥ２タンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号１７）を実施例１の組み換えベクター内に含まれている口蹄疫ウイルスのＶＰ１遺伝子の代わりに挿入して、ＢｉＰ：Ｅ２：ｐＦｃ２組み換えタンパク質を発現する組み換えベクターを製造した。そして、製造された組み換えベクターをアグロバクテリウム－媒介形質転換方法でシロイヌナズナに形質転換させ、カナマイシンに対する耐性を有するシロイヌナズナを選別し、世代進展を通じてｐＦｃ２が融合したＥ２組み換えタンパク質の発現が安定したホモ種子を最終確保して、形質転換植物体を製造した。そして、タンパク質の抽出に普遍的に使用されるタンパク質抽出バッファーを用いて最終確保された形質転換植物体８ｇからタンパク質を分離し、ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ－ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｃｏｌｕｍｎを装着したＡＫＴＡ ｐｒｉｍｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてｐＦｃ融合Ｅ２組み換えタンパク質を分離した。そして、対照群としては、ｐＦｃ断片の代わりに、セルロース結合ドメイン（配列番号１９）を融合させたＢｉＰ：Ｅ２：ＣＢＤ組み換えタンパク質を使用した。ＣＢＤが融合したＥ２組み換えタンパク質は、非結晶セルロース（ａｍｏｒｐｈｏｕｓ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ；ＡＭＣ）を使用して形質転換植物体５ｇから分離した。そして、分離した組み換えタンパク質は、リン酸緩衝溶液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）を用いて透析後に遠心フィルターチューブ（Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｆｉｌｔｅｒ ｔｕｂｅ）を使用して濃縮した。そして、分離した組み換えタンパク質の量を定量するために、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを実施した後に、クマシブルー（ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ）で染色した。この際、ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）を利用した標準曲線（ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ）を用いて組み換えタンパク質を定量した。その結果は、図８に示した。
５．１．ｐＦｃ２融合抗原タンパク質の分離
ｐＦｃ２断片を抗原タンパク質に融合して使用可能であるかを確認するために、豚コレラ抗原であるＥ２タンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号１７）を実施例１の組み換えベクター内に含まれている口蹄疫ウイルスのＶＰ１遺伝子の代わりに挿入して、ＢｉＰ：Ｅ２：ｐＦｃ２組み換えタンパク質を発現する組み換えベクターを製造した。そして、製造された組み換えベクターをアグロバクテリウム－媒介形質転換方法でシロイヌナズナに形質転換させ、カナマイシンに対する耐性を有するシロイヌナズナを選別し、世代進展を通じてｐＦｃ２が融合したＥ２組み換えタンパク質の発現が安定したホモ種子を最終確保して、形質転換植物体を製造した。そして、タンパク質の抽出に普遍的に使用されるタンパク質抽出バッファーを用いて最終確保された形質転換植物体８ｇからタンパク質を分離し、ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ－ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｃｏｌｕｍｎを装着したＡＫＴＡ ｐｒｉｍｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてｐＦｃ融合Ｅ２組み換えタンパク質を分離した。そして、対照群としては、ｐＦｃ断片の代わりに、セルロース結合ドメイン（配列番号１９）を融合させたＢｉＰ：Ｅ２：ＣＢＤ組み換えタンパク質を使用した。ＣＢＤが融合したＥ２組み換えタンパク質は、非結晶セルロース（ａｍｏｒｐｈｏｕｓ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ；ＡＭＣ）を使用して形質転換植物体５ｇから分離した。そして、分離した組み換えタンパク質は、リン酸緩衝溶液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）を用いて透析後に遠心フィルターチューブ（Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｆｉｌｔｅｒ ｔｕｂｅ）を使用して濃縮した。そして、分離した組み換えタンパク質の量を定量するために、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを実施した後に、クマシブルー（ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ）で染色した。この際、ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）を利用した標準曲線（ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ）を用いて組み換えタンパク質を定量した。その結果は、図８に示した。
【0057】
図８に示されたように、セルロース結合ドメインが融合したＥ２組み換え抗原の場合には、植物体１ｇ当たり約３０μｇが生産される反面、ｐＦｃ２断片が融合したＥ２組み換え抗原の場合には、植物体１ｇ当たり３０２μｇが生産されることを確認した。前記結果を通じて、ｐＦｃ２断片を用いて目的抗原の発現量を１０倍以上増加させることができることを確認した。
【0058】
５．２．ｐＦｃ２融合Ｅ２組み換え抗原の免疫原性およびウイルス中和能確認実験
ｐＦｃ２融合Ｅ２組み換え抗原が生体内で抗体を誘導して免疫原性およびウイルス中和能を有するかを確認するために、６週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを用いて実験を進めた。より詳しくは、実験群マウスにｐＦｃ２融合Ｅ２組み換え抗原１μｇを１回（６週齢）、または２回（６週齢および８週齢）投与し、陰性対照群のマウスには、リン酸塩緩衝溶液を投与した。そして、陽性対照群としては、セルロース結合ドメインが融合したＥ２組み換え抗原を実験群と同じ量で同じ時期に投与した。それぞれの抗原投与時には、同量のフロイント免疫抗原補強剤（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ）を混合して投与し、１回投与群には、補助剤（ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ）を、２回投与群には、１次には補助剤を、２次には不完全補助剤（ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ）を投与した。そして、実験を始める時点と抗原を投与してから１週間後から毎週採血して豚コレラウイルスに対する臨床診断用抗体キット（ＣＳＦＶ－ａｂ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ、ＭＥＤＩＡＮ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）を用いて投与抗原に対する特異抗体の生成の有無および抗体の持続性を確認した。２回投与群は、２次投与をすべて完了した時点から１週間後に採血を始めた。それぞれの群ごとに５匹のマウスを用いて実験を進め、その結果は、表１、図９および図１０に示した。表１のＳ／Ｐ値は、０．１４以上の値である場合には、陽性と判定し、０．１４未満の値である場合には、陰性と判定した。
ｐＦｃ２融合Ｅ２組み換え抗原が生体内で抗体を誘導して免疫原性およびウイルス中和能を有するかを確認するために、６週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを用いて実験を進めた。より詳しくは、実験群マウスにｐＦｃ２融合Ｅ２組み換え抗原１μｇを１回（６週齢）、または２回（６週齢および８週齢）投与し、陰性対照群のマウスには、リン酸塩緩衝溶液を投与した。そして、陽性対照群としては、セルロース結合ドメインが融合したＥ２組み換え抗原を実験群と同じ量で同じ時期に投与した。それぞれの抗原投与時には、同量のフロイント免疫抗原補強剤（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ）を混合して投与し、１回投与群には、補助剤（ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ）を、２回投与群には、１次には補助剤を、２次には不完全補助剤（ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ）を投与した。そして、実験を始める時点と抗原を投与してから１週間後から毎週採血して豚コレラウイルスに対する臨床診断用抗体キット（ＣＳＦＶ－ａｂ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ、ＭＥＤＩＡＮ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）を用いて投与抗原に対する特異抗体の生成の有無および抗体の持続性を確認した。２回投与群は、２次投与をすべて完了した時点から１週間後に採血を始めた。それぞれの群ごとに５匹のマウスを用いて実験を進め、その結果は、表１、図９および図１０に示した。表１のＳ／Ｐ値は、０．１４以上の値である場合には、陽性と判定し、０．１４未満の値である場合には、陰性と判定した。
【0059】
【表1】
【0060】
図９に示されたように、抗原を１回投与したとき、ｐＦｃ２融合Ｅ２組み換え抗原の場合には、投与後１週間が経過した時点から高い反応性を示し、反応性が８週以上維持されることを確認した。他方で、セルロース結合ドメインが融合したＥ２組み換え抗原の場合には、陽性値を示すが、その反応性がｐＦｃ２融合Ｅ２組み換え抗原と比較して低いことを確認した。
【0061】
図１０および表１に示されたように、抗原を２回投与したときは、セルロース結合ドメインが融合したＥ２組み換え抗原の場合にも、反応性が１回投与時と比較して増加したが、ｐＦｃ２融合Ｅ２組み換え抗原と比較したときには、依然として反応性が低いことを確認した。
【0062】
また、同じマウスの血清試料は、農林畜産検疫本部に依頼して、ウイルス中和能を確認した。その結果は、表２に示した。
【0063】
【表2】
【0064】
表２に示されたように、セルロース結合ドメインが融合したＥ２組み換え抗原の場合には、抗原の１回投与時、一部のマウスでは陰性値を示すが、ｐＦｃ２融合Ｅ２組み換え抗原の場合には、１回投与時や２回投与時にいずれも高い力価のウイルス中和能を示すことを確認した。
【0065】
５．３．ｐＦｃ２融合Ｅ２組み換え抗原のウイルス中和能の確認実験
ｐＦｃ２融合Ｅ２組み換え抗原が子豚（ｐｉｇｌｅｔ）においても同一に高い力価のウイルス中和能を示すかを確認するために、豚コレラ抗体陰性の豚４頭を選別して、ｐＦｃ２融合Ｅ２組み換え抗原を２回投与し、２週間隔で獲得された血清を農林畜産検疫本部に依頼して、ウイルス中和能を確認した。その結果は、表３に示した。
ｐＦｃ２融合Ｅ２組み換え抗原が子豚（ｐｉｇｌｅｔ）においても同一に高い力価のウイルス中和能を示すかを確認するために、豚コレラ抗体陰性の豚４頭を選別して、ｐＦｃ２融合Ｅ２組み換え抗原を２回投与し、２週間隔で獲得された血清を農林畜産検疫本部に依頼して、ウイルス中和能を確認した。その結果は、表３に示した。
【0066】
【表3】
【0067】
表３に示されたように、実施例３．２のマウスを用いて進めた実験と同一に、すべての子豚において陽性値を示すことを確認した。
【0068】
前記結果を通じて、ｐＦｃ２断片を融合して製造した組み換え抗原の場合には、既存のセルロース融合Ｅ２組み換え抗原と比較して抗原の生産性が増加し、組み換え抗原の免疫反応が速いと共に、反応性が顕著に増加することを確認することができた。前記結果を通じて、ｐＦｃ２断片がセルフ免疫増強反応（ｓｅｌｆ－ａｄｊｕｖａｎｔｉｎｇ）効果を示して、既存の抗原にｐＦｃ２断片を融合させることによって、セルフ免疫抗原補強剤（ｓｅｌｆ－ａｄｊｕｖａｎｔ）効果を示して、目的抗原の免疫原性を顕著に増加させることができると共に、生産性および安定性を増加させることができることを確認することができた。また、前記ｐＦｃ２融合Ｅ２組み換え抗原を新規の豚コレラワクチン組成物として使用可能であることを確認することができた。
【0069】
以下、本発明の薬学的組成物および飼料組成物の製剤例を説明するが、これは、本発明を限定しようとするものではなく、ただ具体的に説明しようとするものである。
【0070】
製剤例１．薬学的組成物の製造
１．１．散剤の製造
ｐＦｃ２融合Ｅ２組み換え抗原 ２０ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
タルク １０ｍｇ
１．１．散剤の製造
ｐＦｃ２融合Ｅ２組み換え抗原 ２０ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
タルク １０ｍｇ
【0071】
前記の成分を混合し、気密袋に充填して、散剤を製造する。
【0072】
１．２．錠剤の製造
ｐＦｃ２融合Ｅ２組み換え抗原 １０ｍｇ
トウモロコシのでんぷん １００ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
ｐＦｃ２融合Ｅ２組み換え抗原 １０ｍｇ
トウモロコシのでんぷん １００ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
【0073】
前記の成分を混合した後、通常の錠剤の製造方法によって打錠して錠剤を製造する。
【0074】
１．３．カプセル剤の製造
ｐＦｃ２融合Ｅ２組み換え抗原 １０ｍｇ
結晶性セルロース ３ｍｇ
ラクトース １４．８ｍｇ
マグネシウムステアレート ０．２ｍｇ
ｐＦｃ２融合Ｅ２組み換え抗原 １０ｍｇ
結晶性セルロース ３ｍｇ
ラクトース １４．８ｍｇ
マグネシウムステアレート ０．２ｍｇ
【0075】
通常のカプセル剤の製造方法によって前記の成分を混合し、ゼラチンカプセルに充填して、カプセル剤を製造する。
【0076】
１．４．注射剤の製造
ｐＦｃ２融合Ｅ２組み換え抗原 １０ｍｇ
マンニトール １８０ｍｇ
注射用滅菌蒸留水 ２，９７４ｍｇ
Ｎａ２ＨＰＯ４２Ｈ２Ｏ ２６ｍｇ
ｐＦｃ２融合Ｅ２組み換え抗原 １０ｍｇ
マンニトール １８０ｍｇ
注射用滅菌蒸留水 ２，９７４ｍｇ
Ｎａ２ＨＰＯ４２Ｈ２Ｏ ２６ｍｇ
【0077】
通常の注射剤の製造方法によって１アンプル当たり（２ｍｌ）前記の成分含量で製造する。
【0078】
１．５．液剤の製造
ｐＦｃ２融合Ｅ２組み換え抗原 ２０ｍｇ
異性化糖 １０ｇ
マンニトール ５ｇ
精製水 適量
ｐＦｃ２融合Ｅ２組み換え抗原 ２０ｍｇ
異性化糖 １０ｇ
マンニトール ５ｇ
精製水 適量
【0079】
通常の液剤の製造方法によって精製水にそれぞれの成分を加えて溶解させ、レモン香を適正量加えた後、前記の成分を混合した後、精製水を加えて、全体を１００ｍＬに調節した後、茶色のビンに充填して、滅菌させて、液剤を製造する。
【0080】
製剤例２．飼料組成物の製造
ｐＦｃ２融合Ｅ２組み換え抗原 １００ｍｇ
ビタミンＥ ０．７ｍｇ
Ｌ－カルニチン ０．７ｍｇ
ｐＦｃ２融合Ｅ２組み換え抗原 １００ｍｇ
ビタミンＥ ０．７ｍｇ
Ｌ－カルニチン ０．７ｍｇ
【0081】
通常の飼料の製造方法によって前記成分を混合して飼料を製造する。
【0082】
前述した本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態に容易に変形可能であることを理解することができる。したがって、以上で記述した実施例は、すべての面において例示的なものであり、限定的でないものと理解すべきである。
【産業上の利用可能性】
【0083】
本発明の豚のＦｃ断片と融合した豚コレラ抗原Ｅ２タンパク質は、セルフ免疫増強効果を示すと共に、抗原の溶解性および安定性が増加してワクチンの安定性が増加すると共に、本発明による発現ベクターを利用することによって、豚コレラ抗原Ｅ２タンパク質の生産量を顕著に増加させることができるので、豚コレラワクチンの生産に効果的に使用され得るものと期待される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】