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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2021-12-14
(45)【発行日】2022-02-03
(54)【発明の名称】変異ボルデテラ菌株および使用方法
(51)【国際特許分類】
A61K 39/10 20060101AFI20220127BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220127BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20220127BHJP
A61P 11/06 20060101ALI20220127BHJP
A61P 11/02 20060101ALI20220127BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20220127BHJP
C12N 15/74 20060101ALN20220127BHJP
【ＦＩ】
A61K39/10 ZNA
C12N1/21
A61P11/00
A61P11/06
A61P11/02
A61P37/08
C12N15/74 Z
【請求項の数】
14
(21)【出願番号】P 2018551960
(86)(22)【出願日】2017-03-29
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2019-05-30
(86)【国際出願番号】 EP2017057468
(87)【国際公開番号】W WO2017167834
(87)【国際公開日】2017-10-05
【審査請求日】2020-02-21
(31)【優先権主張番号】62/314,843
(32)【優先日】2016-03-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【微生物の受託番号】CNCM CNCM I-5150
(73)【特許権者】
【識別番号】518344302
【氏名又は名称】アンスティチュ パスツール ドゥ リール
【氏名又は名称原語表記】Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ ｄｅ Ｌｉｌｌｅ
(73)【特許権者】
【識別番号】518344313
【氏名又は名称】アンスティチュ ナシオナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル（アンセルン）
【氏名又は名称原語表記】Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ ｌａ Ｓａｎｔｅ ｅｔ ｄｅ ｌａ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ Ｍｅｄｉｃａｌｅ（ＩＮＳＥＲＭ）
(74)【代理人】
【識別番号】110001302
【氏名又は名称】特許業務法人北青山インターナショナル
(72)【発明者】
【氏名】ソラン，ルイ
(72)【発明者】
【氏名】ロヒト，カミーレ
(72)【発明者】
【氏名】ツィコプーロス，アン
(72)【発明者】
【氏名】アイト ヤイア センディド，サリハ
【審査官】鳥居 敬司
(56)【参考文献】
【文献】特表２００１－５０７５６８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１２－５２５３４６（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１３／０６６２７２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】PLOS ONE, 2014，Vol.9, No.1，e83449
【文献】Euro Surveill，2014年，Vol.19, No.33，pii=20881
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３９／００－３９／４４
Ｃ１２Ｎ １／００－１／３８
Ａ６１Ｐ １１／００－１１／１６
Ａ６１Ｐ ３７／００－３７／０８
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
被験体における気道炎症の発生を低減または防止するための医薬の製造における、薬学的に許容可能なキャリアと生弱毒化ペルタクチン欠失ボルデテラ細菌とを含む組成物の使用であって、
前記生弱毒化ペルタクチン欠失ボルデテラ細菌が、気管細胞毒素（ＴＣＴ）、百日咳毒素（ＰＴＸ）、および皮膚壊死毒素（ＤＮＴ）を欠失しており、前記被験体の気道にコロニーを形成して増殖することが可能であり、これによって、前記被験体における気道炎症の発生を低減または防止する反応を被験体において誘導することを特徴とする使用。
【請求項2】
請求項１に記載の使用において、前記気道炎症が、気道抵抗により特徴付けられ、前記医薬が、前記被験体における気道抵抗の発生の低減または防止のための医薬であることを特徴とする、使用。
【請求項3】
請求項１に記載の使用において、前記気道炎症が、前記被験体の肺における好酸球浸潤により特徴付けられ、前記医薬が、前記好酸球浸潤の低減または防止のための医薬であることを特徴とする、使用。
【請求項4】
請求項１に記載の使用において、前記気道炎症が、前記被験体の肺における増大した量の炎症性サイトカインにより特徴付けられ、前記医薬が、前記増大した量の炎症性サイトカインの発生の低減または防止のための医薬であることを特徴とする、使用。
【請求項5】
請求項１に記載の使用において、前記生弱毒化ペルタクチン欠失ボルデテラ細菌が、ペルタクチンをコードする機能的遺伝子を欠くことを特徴とする、使用。
【請求項6】
請求項１に記載の使用において、前記生弱毒化ペルタクチン欠失ボルデテラ細菌が、受託番号ＣＮＣＭ－Ｉ－５１５０でＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓに寄託されたＢＰＺＥ１Ｐ菌株であることを特徴とする、使用。
【請求項7】
請求項１に記載の使用において、前記気道炎症が、アレルゲンへの曝露に起因することを特徴とする、使用。
【請求項8】
請求項１に記載の使用において、前記被験体が、喘息と診断されていることを特徴とする、使用。
【請求項9】
請求項１に記載の使用において、前記被験体が、間質性肺疾患と診断されていることを特徴とする、使用。
【請求項10】
請求項１に記載の使用において、前記被験体が、アレルギー性鼻炎と診断されていることを特徴とする、使用。
【請求項11】
請求項１に記載の使用において、前記被験体が、血清中に１０ｎｇ／ｍｌより多くの抗ペルタクチン抗体を有することを特徴とする、使用。
【請求項12】
請求項１に記載の使用において、前記被験体が、ペルタクチンまたはペルタクチン様抗原を含有するワクチンで予め免疫されていることを特徴とする、使用。
【請求項13】
被験体における気道炎症の発生を低減または防止するための組成物であって、前記組成物が、薬学的に許容可能なキャリアと生弱毒化ペルタクチン欠失ボルデテラ細菌とを含み、
前記生弱毒化ペルタクチン欠失ボルデテラ細菌が、気管細胞毒素（ＴＣＴ）、百日咳毒素（ＰＴＸ）、および皮膚壊死毒素（ＤＮＴ）を欠失しており、前記被験体の気道にコロニーを形成して増殖することが可能であり、これによって、前記被験体における気道炎症の発生を低減または防止する反応を被験体において誘導する
ことを特徴とする組成物。
【請求項14】
請求項１３に記載の組成物において、前記ボルデテラ細菌が、ペルタクチンをコードする機能的遺伝子を欠くことを特徴とする、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年３月２９日に出願された米国特許仮出願第６２／３１４，８４３号の優先権を主張する。
本出願は、２０１６年３月２９日に出願された米国特許仮出願第６２／３１４，８４３号の優先権を主張する。
【0002】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含有し、これによりその全体が参照により援用される。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１７年３月２７日に作成されたものであり、７０５６－００７３＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、サイズは２，１３４バイトである。
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含有し、これによりその全体が参照により援用される。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１７年３月２７日に作成されたものであり、７０５６－００７３＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、サイズは２，１３４バイトである。
【0003】
連邦政府助成研究に関する記載
該当なし。
該当なし。
【0004】
本発明は、概して、微生物学、免疫学、アレルギー、および医薬品の分野に関する。さらに特定すれば、本発明は、ペルタクチンを欠失した生弱毒化ボルデテラ・ペルツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）菌株、ならびに様々な疾患設定における予防薬および治療薬としてのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【0005】
微生物有機体およびそれらの成分は、哺乳動物の免疫系に影響を及ぼすことが長く知られている。毒性細菌およびウイルスへの感染は、深刻な病気または死をもたらし得る。この一因となるのであるが、細菌およびウイルスの精製成分もまた、炎症反応を惹起するかまたは他のやり方で免疫系を望ましくない様式で挙動させることにより病変をもたらし得る。これにも関わらず、完全な細菌、ウイルス、またはそれらの一部を含むワクチンは、重篤な感染症を予防するために医学が開発した最も強力な手段のうちの１つであることが分かっているだけでなく、他の有益な効果ももたらし得る。例えば、実験モデルにおいて、ＢＰＺＥ１と命名された生弱毒化百日咳ワクチン候補（国際公開第２００７／１０４４５１（Ａ１）号パンフレット参照）は、毒性ボルデテラ・ペルツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）に対して防御するだけでなく、アレルゲンに対する過免疫応答を鎮めることによって強力な抗アレルギー作用および抗喘息作用を発揮することも見出された（国際公開第２０１３／０６６２７２（Ａ１）号パンフレット参照）。
【0006】
それにも関わらず、安全かつ有効なワクチンを開発することは、いくつかの理由から、依然として困難である。この中で、最新の分子生物学技術ならびに我々の微生物学および免疫学の理解の著しい進歩にもかかわらず、著しい病変をもたらさないほど十分に弱毒化されており、同時に標的病原体に対する有効な長期間持続する免疫応答を惹起するほど十分に免疫原性であるワクチン製品を製造することは、依然として極めて困難である。生弱毒化全細胞細菌ワクチンの場合、毒性因子の量または活性を低減することによる過剰弱毒化は、不十分に免疫原性でありかつ／または免疫応答を惹起するのに十分な時間にわたり投与後に被験体において生存もしくは複製することができないワクチンを結果としてもたらし得るため、最適レベルの弱毒化に到達することは、特に困難である。
【発明の概要】
【0007】
本明細書に記述されるのは、ペルタクチン欠失ボルデテラ菌株の開発、ならびに病的なボルデテラ感染に対する防御免疫応答を惹起することおよび気道炎症（例えば、アレルギー性喘息において認められるもの）を処置または予防することにおけるそれらの使用である。ボルデテラ細菌の外膜タンパク質であるペルタクチンは、種々の細胞への付着を促進することにより毒性因子として機能する。後述する実験において、ＢＰＺＥ１Ｐと称されるＢＰＺＥ１のペルタクチン欠失変異体（ブダペスト条約の要件に従って受託番号ＣＮＣＭ－Ｉ－５１５０で２０１６年１２月１２日にＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（「ＣＮＣＭ」）（２５，Ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ，Ｐａｒｉｓ Ｃｅｄｅｘ １５，７５７２４，Ｆｒａｎｃｅ）に寄託された）が、気道にコロニーを形成し、ボルデテラに対する抗体産生応答を惹起し、アレルギー性肺疾患に対して防御し、かつそれを処置することができることが発見された。この発見は、他の者が、ボルデテラが好中球媒介性クリアランスに抵抗するためにはペルタクチンが必要とされることを明らかにしていたので、この毒性因子を欠失したＢ．ペルツシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）は、防御免疫応答の惹起を可能にし得ないほど迅速に浄化されると考えられていたであろうことから、驚くべきことであった。Ｉｎａｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．２０１０；７８：２９０１－２９０９を参照されたい。
【0008】
抗ペルタクチン抗体の不在下において、ＢＰＺＥ１Ｐは、ＢＰＺＥ１と同程度に効率的に肺にコロニーを形成し、ＢＰＺＥ１と同程度に効率的にＢ．ペルツシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）チャレンジに対する防御免疫を惹起した。抗ペルタクチン抗体の存在下において、ＢＰＺＥ１Ｐは、ＢＰＺＥ１よりも著しく良好にマウス肺にコロニーを形成した。したがって、ペルタクチン欠失Ｂ．ペルツシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）菌株（例えば、ＢＰＺＥ１Ｐ）は、ペルタクチン抗体の既存の力価が高い被験体（ペルタクチン含有無細胞ワクチンを予めワクチン接種したものを含む）において気道炎症に対して防御することにおいて有利であり得る。
【0009】
したがって、本明細書に記述されるのは、薬学的に許容可能なキャリアと生ペルタクチン欠失ボルデテラ細菌とを含む、被験体の気道にコロニーを形成し、それにより被験体における気道炎症の発生を低減または防止するのに十分な量の組成物を、被験体の気道に投与することにより、被験体における気道炎症の発生を低減または防止する方法である。これらの方法において、気道炎症は、気道抵抗、被験体の肺における好酸球浸潤、および／または被験体の肺における増大した量の炎症性サイトカインのうちの１つ以上と関連付けられ得る。被験体の気道でのコロニー形成は、そのような気道抵抗、好酸球浸潤、および／または増大した量の炎症性サイトカインの低減または防止を結果としてもたらし得る。
【0010】
さらに本明細書に記述されるのは、薬学的に許容可能なキャリアと、被験体の気道にコロニーを形成し、被験体における気道炎症の発生を低減または防止することが可能な生ペルタクチン欠失ボルデテラ細菌とを含む組成物である。
【0011】
本明細書に記述される方法および組成物において、生ペルタクチン欠失ボルデテラ細菌は、ペルタクチンをコードする機能的遺伝子を欠き、さらに気管細胞毒素（ＴＣＴ）、百日咳毒素（ＰＴＸ）、および／または皮膚壊死毒素（ＤＮＴ）を欠失したものであり得る。生ペルタクチン欠失ボルデテラ細菌は、ＢＰＺＥ１Ｐであり得る。気道炎症は、アレルゲンへの曝露に起因し得、被験体は、喘息、間質性肺疾患、もしくはアレルギー性鼻炎と診断されたもの；血清中に１０ｎｇ／ｍｌより多くの抗ペルタクチン抗体を有するもの；またはペルタクチンもしくはペルタクチン様抗原を含有するワクチンで予め免疫されたものであり得る。
【0012】
本明細書で使用される場合、「ペルタクチン」は、Ｌｅｉｎｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９１，８８：３４５－９に記述されるように、宿主細胞へのボルデテラ細菌の結合に関与する、ボルデテラ・ペルツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）およびそのごく近縁の種（例えば、ボルデテラ・パラペルツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ））により産生される外層膜タンパク質である。このタンパク質における保存領域（例えば、そのパッセンジャードメインおよびオートトランスポータードメイン）が、これらの有機体の全体的な毒性および病原性に直接寄与する。
【0013】
本明細書で使用される場合、「ＰＴＸ」という略語は、Ｓａｕｋｋｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，１９９２，８９：１１８－１２２に記述されるように、宿主において代謝変化を惹起し、免疫応答を変更する、Ｂ．ペルツシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の主要な毒性因子である、百日咳毒素をいう。
【0014】
本明細書で使用される場合、「ＤＮＴ」という略語は、Ｂ．ペルツシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）が気道にコロニーを形成する部位において炎症、血管収縮および皮膚壊死病変を惹起する、Ｂ．ペルツシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）に存在する毒素である、百日咳皮膚壊死毒素（致死性毒素とも呼ばれる）をいう。Ｆｕｋｕｉ－Ｍｉｙａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１０，１０：２４７を参照されたい。
【0015】
本明細書で使用される場合、「ＴＣＴ」という略語は、インターロイキン－１および一酸化窒素シンターゼの産生を惹起し、繊毛の静止および気道上皮細胞に対する致死的作用を引き起こす、ボルデテラにより合成されるペプチドグリカンの二糖テトラペプチド誘導体である、気管細胞毒素をいう。Ｌｕｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，１９９３，９０，２３６５－２３６９を参照されたい。
【0016】
本明細書で使用される場合、「ペルタクチン欠失」ボルデテラ菌株は、実施例の項において後述される条件下でＢＰＺＥ１において見出されるペルタクチン活性の少なくとも５０％未満（例えば、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満）を示すもの、検出可能なペルタクチン活性を何ら示さないもの、またはウェスタンブロットにより決定される場合に検出不可能なペルタクチンの発現を示すものである。
【0017】
細菌菌株における毒素または毒性因子に言及する場合の「機能的」という用語は、（ｉ）菌株によって発現される毒素／毒性因子がその酵素活性を排除するようにもしくは少なくとも、毒素／因子の非変異型に比べてその酵素活性を５０％より大きく低減するように変異されていないこと、および／または（ｉｉ）毒素／因子を発現する細菌菌株が、その毒素／因子を排除するようにもしくは少なくとも、遺伝子操作もしくは選択された菌株が由来する出発菌株に比べてその毒素／因子の分子数を５０％より大きく低減するように遺伝子操作もしくは選択されていないことを意味する。
【0018】
「哺乳動物」、「哺乳動物被験体」または「被験体」という用語は、哺乳鋼の様々な温血脊椎動物（ヒトを含む）のうちの任意のものを包含する。
【0019】
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記述されるものと同様または同等の方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得る。本明細書で言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、その全体が参照により援用される。矛盾する場合は本明細書（定義を含む）が優先する。さらに、以下に述べる特定の実施形態は、例示にすぎず、限定することが意図されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図4A】図４Ａは、ＢＰＳＭ菌株の１０６個の生Ｂ．ペルツシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）細菌で鼻腔内チャレンジされたＢａｌｂ／ｃマウスにおけるＢＰＺＥ１媒介性防御およびＢＰＺＥ１Ｐ媒介性防御を示すグラフである。
【図4B】図４Ｂは、ＢＰＳＭＰ菌株の１０６個の生Ｂ．ペルツシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）細菌で鼻腔内チャレンジされたＢａｌｂ／ｃマウスにおけるＢＰＺＥ１媒介性防御およびＢＰＺＥ１Ｐ媒介性防御を示すグラフである。
【図4C】図４Ｃは、Ｂ１９１７菌株の１０６個の生Ｂ．ペルツシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）細菌で鼻腔内チャレンジされたＢａｌｂ／ｃマウスにおけるＢＰＺＥ１媒介性防御およびＢＰＺＥ１Ｐ媒介性防御を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0021】
本明細書に記述されるのは、ペルタクチンを欠失したボルデテラ菌株、ならびに抗ボルデテラ免疫応答を刺激することならびに気道炎症を予防および処置することにおけるそれらの使用である。後述される実施形態が、これらの方法の代表例を例示する。それにも関わらず、以下に提供される説明に基づき、これらの実施形態の説明から、本発明の他の態様が作製および／または実施され得る。
【0022】
一般的方法
従来の微生物学的技術、免疫学的技術、分子生物学的技術、および医学的技術が関与する方法が、本明細書に記述される。微生物学的方法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（３ｄ Ｅｄ），Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓに記述されている。免疫学的方法は、当該技術分野において一般的に知られており、方法論専門書（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記述されている。分子生物学の技術は、専門書（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，ｖｏｌ．１－３，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２００１；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に詳述されている。医学的処置の一般的方法は、ＭｃＰｈｅｅ ａｎｄ Ｐａｐａｄａｋｉｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ２０１０，４９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ Ｍｅｄｉｃａｌ，２０１０；およびＦａｕｃｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１７ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ，２００８に記述されている。
従来の微生物学的技術、免疫学的技術、分子生物学的技術、および医学的技術が関与する方法が、本明細書に記述される。微生物学的方法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（３ｄ Ｅｄ），Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓに記述されている。免疫学的方法は、当該技術分野において一般的に知られており、方法論専門書（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記述されている。分子生物学の技術は、専門書（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，ｖｏｌ．１－３，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２００１；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に詳述されている。医学的処置の一般的方法は、ＭｃＰｈｅｅ ａｎｄ Ｐａｐａｄａｋｉｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ２０１０，４９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ Ｍｅｄｉｃａｌ，２０１０；およびＦａｕｃｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１７ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ，２００８に記述されている。
【0023】
ペルタクチン欠失ボルデテラ菌株
ペルタクチン発現を欠失したボルデテラ種（例えば、ボルデテラ・ペルツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ボルデテラ・パラペルツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、およびボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）（例えば、対応する菌株よりも少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％少ないペルタクチンを発現するもの）が、ボルデテラ種に対する免疫応答を生じさせるため、ならびに気道炎症（例えば、アレルギー性喘息で起こるもの）を処置および／または予防するために使用され得る。生弱毒化ペルタクチン欠失ボルデテラ・ペルツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）および生弱毒化ペルタクチン欠失ボルデテラ・パラペルツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）が、ヒト被験体におけるアレルギー性気道炎症を処置または予防するための使用に好ましい。本明細書に記述される生弱毒化ペルタクチン欠失ボルデテラ菌株は、当該技術分野において知られている方法（例えば、実施例の項において後述されるもの）を適合させることにより作製され得る。出発菌株は、任意の好適なボルデテラ種であり得る。ボルデテラ種の例としては、Ｂ．ペルツシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、Ｂ．パラペルツシス（Ｂ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、およびＢ．ブロンキセプチカ（Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）が挙げられる。Ｂ．ペルツシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）が、百日咳感染を予防するためのワクチンおよび方法のための出発菌株としての使用に好ましい。出発菌株としての使用に好適ないくつかのボルデテラ菌株は、確立された培養物コレクション（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）から入手可能であるか、または（例えば、Ａｏｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ，７３：１８５－９２，１９９１に記述されるような）知られている技術によって天然保有体（例えば、百日咳に罹っている患者）から分離され得る。
ペルタクチン発現を欠失したボルデテラ種（例えば、ボルデテラ・ペルツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ボルデテラ・パラペルツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、およびボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）（例えば、対応する菌株よりも少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％少ないペルタクチンを発現するもの）が、ボルデテラ種に対する免疫応答を生じさせるため、ならびに気道炎症（例えば、アレルギー性喘息で起こるもの）を処置および／または予防するために使用され得る。生弱毒化ペルタクチン欠失ボルデテラ・ペルツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）および生弱毒化ペルタクチン欠失ボルデテラ・パラペルツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）が、ヒト被験体におけるアレルギー性気道炎症を処置または予防するための使用に好ましい。本明細書に記述される生弱毒化ペルタクチン欠失ボルデテラ菌株は、当該技術分野において知られている方法（例えば、実施例の項において後述されるもの）を適合させることにより作製され得る。出発菌株は、任意の好適なボルデテラ種であり得る。ボルデテラ種の例としては、Ｂ．ペルツシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、Ｂ．パラペルツシス（Ｂ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、およびＢ．ブロンキセプチカ（Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）が挙げられる。Ｂ．ペルツシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）が、百日咳感染を予防するためのワクチンおよび方法のための出発菌株としての使用に好ましい。出発菌株としての使用に好適ないくつかのボルデテラ菌株は、確立された培養物コレクション（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）から入手可能であるか、または（例えば、Ａｏｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ，７３：１８５－９２，１９９１に記述されるような）知られている技術によって天然保有体（例えば、百日咳に罹っている患者）から分離され得る。
【0024】
機能的ペルタクチンを発現するボルデテラ菌株は、選択により、または好ましくは安定性のために突然変異誘発（例えば、後述されるような固有のｐｒｎ遺伝子の欠失）により、この分子またはその活性を欠失させられ得る。代替的に、ペルタクチンを欠失したボルデテラ種はまた、天然源（例えば、そのような菌株に感染したまたはコロニー形成されたヒト被験体または他の哺乳動物）から分離され得る。ボルデテラの病原性菌株の不十分な弱毒化が被験体における病的感染を引き起こし得るであろうことから、使用されるペルタクチン欠失ボルデテラ菌株はまた、より低いレベルの他の機能的毒性因子を有していることが好ましい。他方において、ペルタクチン欠失ボルデテラ菌株が被験体にコロニーを形成し、気道炎症に対する防御作用を発揮する能力を保持することを確実にするために、それは、弱毒化されすぎてはならない。弱毒化は、菌株を、そのペルタクチンの発現および以下：百日咳毒素（ＰＴＸ）、皮膚壊死毒素（ＤＮＴ）、気管細胞毒素（ＴＣＴ）、アデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）、リポ多糖類（ＬＰＳ）、糸状血球凝集素（ＦＨＡ）、またはｂｖｇ制御成分のうちの任意のもの、のうちの１つ以上（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上）の発現を低減するように変異させることにより達成され得るであろう。弱毒化はまた、菌株を、ペルタクチンの生物学的活性および以下：百日咳毒素（ＰＴＸ）、皮膚壊死毒素（ＤＮＴ）、気管細胞毒素（ＴＣＴ）、アデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）、リポ多糖類（ＬＰＳ）、糸状血球凝集素（ＦＨＡ）、またはｂｖｇ制御成分のうちの任意のもの、のうちの１つ以上（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上）の生物学的活性を低減するように変異させることによっても達成され得るであろう。そのような変異体を作製する方法の例は、本明細書および米国特許第９，１１９，８０４号明細書に記述されている。以下に提示される実験において、機能的ペルタクチン、機能的ＰＴＸ、機能的ＤＮＴ、および機能的ＴＣＴを欠失したボルデテラ菌株は、被験体の気道にコロニーを形成し、ボルデテラに対する免疫応答を惹起し、アレルギー反応および炎症反応の発生を低減または防止することができた。したがって、これらの４つの毒性因子を欠失しており、被験体にコロニーを形成し、かつボルデテラ菌株を標的とした免疫応答を惹起し、かつ／またはアレルギー反応および炎症反応の発生を低減もしくは防止し得るボルデテラ菌株（例えば、ＢＰＺＥ１Ｐ）が好ましい。
【0025】
感染性細菌菌株を弱毒化するための種々の方法が、当該技術分野において知られている。これらには、毒性が失われるまでインビトロで菌株を継代培養すること、非特異的化学的突然変異誘発とそれに続く表現型に基づくスクリーニングおよび選択、ならびに標的分子生物学技術（例えば、実施例の項において後述されるもの（対立遺伝子交換を含む）およびＭｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（３ｄ Ｅｄ），Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ．，ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓに記述されるもの）の使用が含まれる。これらの方法を用いて、ペルタクチン、ＰＴＸ、および／またはＤＮＴをコードする遺伝子を欠失させるかまたは酵素的に不活性な形態（毒素の抗原性を保持することが所望される場合に好ましい）に変異させ得る。ＴＣＴ産生は、固有のａｍｐＧ遺伝子（他の種と違って、Ｂ．ペルツシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）ａｍｐＧはＴＣＴ含有ペプチドグリカンを活発に再利用しない）を、異種の（例えば、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）または別のグラム陰性種からの）ａｍｐＧ遺伝子と置き換えることにより、または固有のａｍｐＧ遺伝子を、それがペプチドグリカンを再利用することに活発になるように変異させることにより、著しく（例えば、９９．９９％、９９．９０％、９９．８％、９９．７％、９９．６％、９９．５％、９９．０％、９８％、９７％、９６％、９５％、または９０％より大きく）低減され得る。
【0026】
毒素／毒性因子活性を低減または除去するための出発菌株の改変は、改変菌株の毒素をコードするゲノムＤＮＡまたは遺伝子を配列決定することにより確認され得る。サザンブロット、ノーザンブロット、および／またはウェスタンブロットもまた、標的遺伝子が欠失したこと、または標的因子の発現が低減もしくは除去されたことを確認するために使用され得るであろう。生物学的活性もまた、毒素／毒性因子活性の低減または除去を確認するために評価され得る。改変が確認されたら、改変菌株は、被験体にコロニーを形成する能力ならびにボルデテラ感染に対する防御免疫を惹起する能力またはアレルギー反応および炎症反応の発生を低減もしくは防止する能力について、知られている方法（例えば、実施例の項において後述されるもの）により試験され得る。
【0027】
免疫応答を調節するための組成物
本明細書に記述される生弱毒化ボルデテラ菌株は、哺乳動物被験体がボルデテラ感染（例えば、百日咳）を発生させるのを防ぐ、またはそのような感染の症状を緩和するための組成物において使用され得る。それらはまた、被験体におけるアレルギー反応および炎症反応（例えば、喘息、アレルギー性鼻炎、間質性肺疾患、食品アレルギー、ピーナッツアレルギー、毒液アレルギー、アトピー性皮膚炎、接触過敏症、およびアナフィラキシー）の発生を低減または防止するためにも使用され得る。治療用または予防用組成物における使用のために、生弱毒化ボルデテラ菌株は、典型的に、薬学的に許容可能な賦形剤と共に処方される。薬学的に許容可能な賦形剤の例としては、例えば、緩衝食塩水、蒸留水、エマルジョン（例えば、油／水エマルジョン）、様々な種類の湿潤剤、滅菌溶液などが挙げられる。
本明細書に記述される生弱毒化ボルデテラ菌株は、哺乳動物被験体がボルデテラ感染（例えば、百日咳）を発生させるのを防ぐ、またはそのような感染の症状を緩和するための組成物において使用され得る。それらはまた、被験体におけるアレルギー反応および炎症反応（例えば、喘息、アレルギー性鼻炎、間質性肺疾患、食品アレルギー、ピーナッツアレルギー、毒液アレルギー、アトピー性皮膚炎、接触過敏症、およびアナフィラキシー）の発生を低減または防止するためにも使用され得る。治療用または予防用組成物における使用のために、生弱毒化ボルデテラ菌株は、典型的に、薬学的に許容可能な賦形剤と共に処方される。薬学的に許容可能な賦形剤の例としては、例えば、緩衝食塩水、蒸留水、エマルジョン（例えば、油／水エマルジョン）、様々な種類の湿潤剤、滅菌溶液などが挙げられる。
【0028】
ワクチンは、被験体への簡便な投与のために、単位用量形態で包装され得る。例えば、選択された弱毒化ボルデテラ菌株の１×１０４～１×１０９個の間（例えば、１×１０４個、５×１０４個、１×１０５個、５×１０５個、１×１０６個、５×１０６個、１×１０７個、５×１０７個、１×１０８個、５×１０８個、または１×１０９個＋／－１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％）の生菌の単一用量および任意の賦形剤が、包装材料中または投与デバイス中に別個に含有され得る。ワクチンは、投与デバイス（例えば、注射器、噴霧デバイス、または注入器）内に含有され得る。
【0029】
処方物／投薬量／投与
本明細書に記述される組成物は、気道または他の粘膜区画に組成物内の細菌を沈着させる任意の好適な方法により、哺乳動物被験体（例えば、ヒト、ヒト小児または新生児、ヒト成人、百日咳由来の合併症を発生させる危険性の高いヒト、肺疾患に罹っているヒト、免疫抑制されているかまたはされることになるヒト、および気道炎症（例えば、喘息、アレルギー性鼻炎、または間質性肺疾患）に罹っているかまたはそれを発生させる危険性の高いヒト）に投与され得る。例えば、当該組成物は、例えば吸入器、注射器、注入器、噴霧デバイスなどを用いた、吸入または鼻腔内導入によって投与され得る。
本明細書に記述される組成物は、気道または他の粘膜区画に組成物内の細菌を沈着させる任意の好適な方法により、哺乳動物被験体（例えば、ヒト、ヒト小児または新生児、ヒト成人、百日咳由来の合併症を発生させる危険性の高いヒト、肺疾患に罹っているヒト、免疫抑制されているかまたはされることになるヒト、および気道炎症（例えば、喘息、アレルギー性鼻炎、または間質性肺疾患）に罹っているかまたはそれを発生させる危険性の高いヒト）に投与され得る。例えば、当該組成物は、例えば吸入器、注射器、注入器、噴霧デバイスなどを用いた、吸入または鼻腔内導入によって投与され得る。
【0030】
本明細書に記述されるペルタクチン欠失ボルデテラ菌株は、被験体への投与のための組成物として処方され得る。好適な数の生菌が、薬学的に好適な賦形剤またはキャリア（例えば、リン酸緩衝食塩水、蒸留水、エマルジョン（例えば、油／水エマルジョン）、様々な種類の湿潤剤、滅菌溶液など）と混合される。場合により、ワクチンは、凍結乾燥され、次いで、投与前に再構成され得る。粘膜（特に、鼻、気管支、または肺）投与に適合性の薬学的に好適な賦形剤またはキャリアの使用が、気道にコロニーを形成するためには好ましい。この分野における標準的な教科書であるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、およびＵＳＰ／ＮＦを参照されたい。
【0031】
粘膜投与用に処方される場合、組成物の各用量には、粘膜部位でのコロニー形成を結果としてもたらすのに十分な数の生ペルタクチン欠失ボルデテラ細菌（例えば、およそ（すなわち、＋／－５０％）５×１０３個～５×１０９個の細菌）が含まれ得る。ヒト被験体への投与の場合、当該用量には、およそ１×１０６個、５×１０６個、１×１０７個、５×１０７個、１×１０８個、５×１０８個、１×１０９個、５×１０９個、または１×１０１０個の生ペルタクチン欠失ボルデテラ細菌が含まれ得る。当該用量は、１回、または１日、２日、３日、４日、５日、もしくは６日、もしくは１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、もしくは６週間、もしくは１ヵ月、２ヵ月、３ヵ月、４ヵ月、５ヵ月、６ヵ月、もしくは１２ヵ月の間をおいて複数回（２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回またはそれ以上）にわたって投与され得る。一般的に、コロニー形成ならびに防御応答および／または抗炎症応答を結果としてもたらすのに十分な量の組成物が投与される。さらなる量は、惹起された防御応答および／または抗炎症応答が衰えた後に（例えば、被験体が気道炎症の症状を再び悪化させた後に）投与される。
【0032】
生ペルタクチン欠失ボルデテラ細菌を含有する組成物が投与され得る被験体には、選択された生ペルタクチン欠失ボルデテラ細菌菌株によりコロニー形成されることが可能な任意のものが含まれ得る。例えば、被験体は、哺乳動物（例えば、ヒト）であり得る。気道炎症に罹っている、または気道炎症を発生させる危険性の高いヒト被験体（例えば、アレルギー性喘息もしくはアレルギー性鼻炎に罹っているかまたはアレルギー性喘息もしくはアレルギー性鼻炎を生じやすいもの）が、当該組成物の好ましい受容者である。当該組成物は被験体においてその抗ペルタクチン抗体力価に関わらず使用され得るが、ペルタクチン欠失ボルデテラ細菌菌株はペルタクチン標的免疫応答の影響を受けないため、当該組成物は、測定可能な（例えば、血清１ｍｌ当たり１０ｎｇ、２０ｎｇ、５０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、または５００ｎｇよりも大きな）力価の抗ペルタクチン抗体を有するものおよびペルタクチンまたはペルタクチン様抗原を含有するワクチンで予め免疫されているものにおいて使用され得る。
【0033】
気道炎症を鎮めることにおける当該組成物の有効性は、知られている方法（例えば、気道から採取された流体（例えば、気管支肺胞洗浄流体）中の炎症細胞数、ＩｇＥ力価、炎症促進性サイトカイン／ケモカイン（例えば、エオタキシン、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮγ、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ｆ、ＩＬ－１８、およびＴＮＦα）のレベル、または臨床的パラメータ（例えば、肺活量測定、または呼吸困難、咳嗽、喘鳴、もしくは呼吸容量のレベル）を測定すること）により評価され得る。これらのパラメータのうちの１つ以上のうちの任意のものにおける改善（当該組成物を受けていない被験体に比べて少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上の改善）は、当該組成物が有効であることを示している。アレルギー性気道炎症の動物モデルもまた、組成物の有効性を評価するために使用され得る（例えば、米国特許第８，９８６，７０９号明細書参照）。
【実施例】
【0034】
実施例１－Ｂ．ペルツシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）のペルタクチン欠失菌株の構築および特徴付け
エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ５α、ＳＭ１０ならびにＢ．ペルツシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）ＢＰＺＥ１、ＢＰＳＭ（Ｍｅｎｏｚｚｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ １９９４；６２：７６９－７７８）およびＢ１９１７（Ｂａｒｔ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎｎｏｕｎｃ ２０１４；２（６））を、この研究で使用した。ボルデテラ菌株は、１％グリセロールおよび１０％脱線維素ヒツジ血液を補充したＢｏｒｄｅｔ－Ｇｅｎｇｏｕ寒天（ＢＧ）上で、３７℃で培養した。培養後、プレートを掻き取り、所望の密度でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁させることにより、細菌を採取した。液体培養の場合は、ボルデテラ菌株を、１ｇ／ｌのヘプタキス（２，６－ジ－ｏ－メチル）β－シクロデキストリン（Ｓｉｇｍａ）を含有する改変Ｓｔａｉｎｅｒ－Ｓｃｈｏｌｔｅ培地（Ｉｍａｉｚｕｍｉ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ １９８３；４１：１１３８－１１４３）中で、３７℃で培養した。クローニング手順に使用するＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）菌株は、ＬＢブロスまたはＬＢ寒天プレート中で培養した。必要な場合は、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｓｍ）、１０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン（Ｇｍ）、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン（Ａｍｐ）を使用した。
エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ５α、ＳＭ１０ならびにＢ．ペルツシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）ＢＰＺＥ１、ＢＰＳＭ（Ｍｅｎｏｚｚｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ １９９４；６２：７６９－７７８）およびＢ１９１７（Ｂａｒｔ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎｎｏｕｎｃ ２０１４；２（６））を、この研究で使用した。ボルデテラ菌株は、１％グリセロールおよび１０％脱線維素ヒツジ血液を補充したＢｏｒｄｅｔ－Ｇｅｎｇｏｕ寒天（ＢＧ）上で、３７℃で培養した。培養後、プレートを掻き取り、所望の密度でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁させることにより、細菌を採取した。液体培養の場合は、ボルデテラ菌株を、１ｇ／ｌのヘプタキス（２，６－ジ－ｏ－メチル）β－シクロデキストリン（Ｓｉｇｍａ）を含有する改変Ｓｔａｉｎｅｒ－Ｓｃｈｏｌｔｅ培地（Ｉｍａｉｚｕｍｉ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ １９８３；４１：１１３８－１１４３）中で、３７℃で培養した。クローニング手順に使用するＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）菌株は、ＬＢブロスまたはＬＢ寒天プレート中で培養した。必要な場合は、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｓｍ）、１０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン（Ｇｍ）、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン（Ａｍｐ）を使用した。
【0035】
ＢＰＺＥ１においてペルタクチンをコードする遺伝子であるｐｒｎを欠失させるために、ｐｒｎ遺伝子の下流の７３９ｂｐ断片（ｐｒｎ ＬＯ）およびｐｒｎ遺伝子の上流の７５９ｂｐ断片（ｐｒｎ ＵＰ）を、相同組換えによってＢＰＺＥ１およびＢＰＳＭゲノムにｐｒｎ欠失を導入するためのｐＳＳ４９４０にクローニングした。図１Ａおよび図１Ｂを参照して、上流および下流のｐｒｎフランキング領域を、ｐｒｎ＿ＫＯ＿ｆｗ（ＡＴＣＣＴＣＡＡＧＣＡＡＧＡＣＴＧＣＧＡＧＣＴＧ）（配列番号：１））およびＯＬ＿ｐｒｎ＿ＫＯ＿ｒｖ（ＧＧＧＧＡＴＡＧＡＣＣＣＴＣＣＴＣＧＣＴＴＧＧＡＴＧＣＣＡＧＧＴＧＧＡＧＡＧＣＡ）（配列番号：２））ならびにＯＬ＿ｐｒｎ＿ＫＯ＿ｆｗ（ＴＧＣＴＣＴＣＣＡＣＣＴＧＧＣＡＴＣＣＡＡＧＣＧＡＧＧＡＧＧＧＴＣＴＡＴＣＣＣＣ）（配列番号：３））およびｐｒｎ＿ＫＯ＿ｒｖ（ＣＣＡＴＣＡＴＣＣＴＧＴＡＣＧＡＣＣＧＣＣＴ）（配列番号：４））をそれぞれプライマーとして用いてＰＣＲ増幅した。次いで、これらの断片は、ｐｒｎ＿ＫＯ＿ｆｗおよびｐｒｎ＿ＫＯ＿ｒｖをプライマーとして用いたＰＣＲ伸長のための鋳型として機能した。結果として生じた断片（ｐｒｎ欠失を含有）をＴＯＰＯ ｂｌｕｎｔ（登録商標）ベクター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に挿入し、次いで、ＫｐｎＩ－ＮｏｔＩ断片として切り出した。切り出したＫｐｎＩ－ＮｏｔＩ断片を、ｐＳＳ４２４５（Ｉｎａｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ２０１０；７８ ２９０１－２９０９）誘導体であるＫｐｎＩおよびＮｏｔＩで消化したｐＳＳ４９４０に挿入した。結果として生じたプラスミドを、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＭ１０中に形質転換し、次いで、ＢＰＺＥ１とコンジュゲートさせた。他で記述されるような２つの連続する相同組換え事象（Ｍｉｅｌｃａｒｅｋ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ ２００６；２：ｅ６５）に続き、図１Ｂを参照して、ＰＣＲを用いて、５’領域についてはｐｒｎＫＯ＿ＵＰ（ＴＴＣＴＴＧＣＧＣＧＡＡＣＡＧＡＴＣＡＡＡＣ）（配列番号：５））－ｐｒｎＫＯｉｎ＿ＵＰｒｖ（ＣＴＧＣＴＧＧＴＣＡＴＣＧＧＣＧＡＡＧＴ）（配列番号：６））を、３’領域についてはｐｒｎＫＯｉｎ＿ＬＯｆｗ（ＣＧＣＣＣＡＴＴＣＴＴＣＣＣＴＧＴＴＣＣ）（配列番号：７））－ｐｒｎＫＯ＿ＬＯ（ＧＡＡＣＡＧＧＡＡＣＴＧＧＡＡＣＡＧＧＣＧ）（配列番号：８））を用いて構築物を網羅するフランキング領域を増幅することにより、ｐｒｎ遺伝子全体の欠失を確認した。ｐｒｎ欠失を有する菌株を選択し、ＢＰＺＥ１Ｐと命名した。同じ方策を用いて、ＢＰＳＭＰと命名したペルタクチン欠失ＢＰＳＭ変異体を構築した。
【0036】
ペルタクチンの存在を、正確なバンドサイズについてのコントロールとして精製Ｐｒｎ（Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、ＢＰＺＥ１およびＢＰＺＥ１Ｐの溶解産物および上清の免疫ブロットにより試験した。タンパク質抽出のために、ＢＰＺＥ１およびＢＰＺＥ１Ｐ菌株をＢＧ血液寒天上に播種（ｐｌａｔｅ）し、３７℃で４８時間インキュベートした。培養後、細菌をプレートから掻き取り、１０ｍｌのＳｔａｉｎｅｒ－Ｓｃｈｏｌｔｅ培地に再懸濁させ、３７℃で４日間培養した。次いで、遠心分離により細菌を採取した。上清を回収し、タンパク質濃縮のために、以前に記述された（Ｓｏｌａｎｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ ２０１４；１０：ｅ１００４１８３）ように、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）で処理した。細菌ペレットを、ＥＤＴＡ非含有プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）で補完したＰＢＳに再懸濁させ、フレンチ（Ｆｒｅｎｃｈ）圧力セルを用いて溶解させた。１５，０００×ｇでの３０分間の遠心分離により細菌破片を除去し、免疫ブロットのために上清を回収した。タンパク質を、１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離し、次いで、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ（商標）セルシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いてニトロセルロース膜上に移動させた。３０分間のＰＢＳ０．０１％Ｔｗｅｅｎ ２０中５％ｗ／ｖ脱脂粉乳でのブロッキング後に、膜を、１：１，０００希釈で抗ペルタクチンモノクローナル抗体と共にインキュベートした。次いで、ヤギ抗マウス－ＨＲＰ（Ａｂｃａｍ）を１：１０，０００希釈で添加し、化学発光基質（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてブロットを展開した。図１Ｃに示すように、精製ペルタクチンと共に移動した抗ペルタクチン抗体反応性タンパク質は、ＢＰＺＥ１の上清では検出されたが、ＢＰＺＥ１Ｐの上清では検出されなかった。このタンパク質は、ＢＰＺＥ１またはＢＰＺＥ１Ｐのどちらの細菌細胞溶解産物においても検出されなかった。
【0037】
実施例２－ＢＰＺＥ１ＰはＢＰＺＥ１と同程度に良好にマウスにコロニーを形成する。
１８匹の６週齢のマウスの群に、以前に記述された（Ｍｉｅｌｃａｒｅｋ ｅｔ ａｌ．，上記）ように、１０６個の生菌を含有する２０μｌのＰＢＳを鼻腔内接種した。指定された時点（３時間、３日、７日、１４日、２１日および２８日）にて、１群当たり３匹のマウスを犠牲にし、肺を採取し、コロニー形成単位（ＣＦＵ）の総数を測定するためにホモジナイズした。統計分析を、９５％信頼区間で事後比較ボンフェローニ検定を用いて、二元配置分散分析検定により行った。図２を参照すると、ＢＰＺＥ１およびＢＰＺＥ１Ｐの両方が、等しく良好に動物にコロニーを形成した。両菌株は、ワクチン接種の３日後に増殖のピークを示し、コロニー形成は４週間続いた。これらの菌株の間に、マウス肺にコロニーを形成するそれらの能力について統計的有意差は認められなかった。
１８匹の６週齢のマウスの群に、以前に記述された（Ｍｉｅｌｃａｒｅｋ ｅｔ ａｌ．，上記）ように、１０６個の生菌を含有する２０μｌのＰＢＳを鼻腔内接種した。指定された時点（３時間、３日、７日、１４日、２１日および２８日）にて、１群当たり３匹のマウスを犠牲にし、肺を採取し、コロニー形成単位（ＣＦＵ）の総数を測定するためにホモジナイズした。統計分析を、９５％信頼区間で事後比較ボンフェローニ検定を用いて、二元配置分散分析検定により行った。図２を参照すると、ＢＰＺＥ１およびＢＰＺＥ１Ｐの両方が、等しく良好に動物にコロニーを形成した。両菌株は、ワクチン接種の３日後に増殖のピークを示し、コロニー形成は４週間続いた。これらの菌株の間に、マウス肺にコロニーを形成するそれらの能力について統計的有意差は認められなかった。
【0038】
実施例３－ＢＰＺＥ１Ｐは毒性Ｂ．ペルツシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）でのチャレンジに対してＢＰＺＥ１と同程度に免疫原性および防御性である。
ＢＰＺＥ１と比べたＢＰＺＥ１Ｐにより惹起される免疫を、鼻内ワクチン接種後にマウス免疫血清の抗体滴定により測定した。８匹のマウスの群に、１０５個の生ＢＰＺＥ１またはＢＰＺＥ１Ｐを鼻腔内ワクチン接種した。４週間後にマウスから採血し、総ＩｇＧ力価を、全ＢＰＳＭ溶解産物に対して測定した。血液を５，０００×ｇで５分間遠心分離機にかけて、細胞から血清を分離した。Ｂ．ペルツシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）に対する抗体力価を、１ウェル当たり１μｇの総タンパクで全Ｂ．ペルツシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）ＢＰＳＭ溶解産物を用い、以前に記述された（Ｍｉｅｌｃａｒｅｋ ｅｔ ａｌ．，上記）ように酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）を用いて推定した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて統計分析を行った。図３に示すように、ＢＰＺＥ１ワクチン接種マウスおよびＢＰＺＥ１Ｐワクチン接種マウスは、ナイーブコントロールマウスよりもはるかに高い抗体力価を示した。ＢＰＺＥ１ワクチン接種マウスとＢＰＺＥ１Ｐワクチン接種マウスとの間に、抗体力価について有意差は検出されなかった。
ＢＰＺＥ１と比べたＢＰＺＥ１Ｐにより惹起される免疫を、鼻内ワクチン接種後にマウス免疫血清の抗体滴定により測定した。８匹のマウスの群に、１０５個の生ＢＰＺＥ１またはＢＰＺＥ１Ｐを鼻腔内ワクチン接種した。４週間後にマウスから採血し、総ＩｇＧ力価を、全ＢＰＳＭ溶解産物に対して測定した。血液を５，０００×ｇで５分間遠心分離機にかけて、細胞から血清を分離した。Ｂ．ペルツシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）に対する抗体力価を、１ウェル当たり１μｇの総タンパクで全Ｂ．ペルツシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）ＢＰＳＭ溶解産物を用い、以前に記述された（Ｍｉｅｌｃａｒｅｋ ｅｔ ａｌ．，上記）ように酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）を用いて推定した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて統計分析を行った。図３に示すように、ＢＰＺＥ１ワクチン接種マウスおよびＢＰＺＥ１Ｐワクチン接種マウスは、ナイーブコントロールマウスよりもはるかに高い抗体力価を示した。ＢＰＺＥ１ワクチン接種マウスとＢＰＺＥ１Ｐワクチン接種マウスとの間に、抗体力価について有意差は検出されなかった。
【0039】
ＢＰＺＥ１と比較したＢＰＺＥ１Ｐの防御効力を、チャレンジの７日後に肺中のＣＦＵ数を測定し、ナイーブ群をワクチン接種群と比較することにより、亜最適防御プロトコルで試験した。８匹の６週齢のマウスの群に、１０５個の生ＢＰＺＥ１もしくはＢＰＺＥ１Ｐを含有する２０μｌのＰＢＳを鼻腔内ワクチン接種するか、またはワクチン接種しないままにした。４週間後に、全てのマウスを、１０６個の生ＢＰＳＭ、ＢＰＳＭＰまたはＢ１９１７を含有する２０μｌのＰＢＳで鼻腔内チャレンジした。チャレンジの３時間後に、１群当たり３匹のマウスを犠牲にし、肺を採取し、ＣＦＵ計数のためにホモジナイズした。チャレンジの７日後に、ＣＦＵ計数のために１群当たり５匹の残りのマウスを犠牲にした。感染の３時間後に３匹のマウスを安楽死させ、それらの肺を採取して、チャレンジ直後のＣＦＵ数を決定した。感染の７日後に、残りの５匹のマウスを安楽死させ、それらの肺を採取し、ＣＦＵ数を測定した。統計分析を、９５％信頼区間で事後ボンフェローニ比較検定を用いて、パラメトリック二元配置分散分析検定を適用して行った。＊、ｐ＜０．００５；＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊、ｐ＜０．０００１。図４Ａ～Ｃに示すように、どちらの菌株でのワクチン接種も、ＢＰＳＭ、ＢＰＳＭＰおよびＢ１９１７でのチャレンジに対して等しく良好に防御した。これらの結果は、実験室菌株ＢＰＳＭ、そのペルタクチン欠失誘導体ＢＰＳＭＰ、または臨床分離株Ｂ１９１７のいずれに対しても、ｐｒｎの欠失が、生弱毒化ワクチンの防御能力に影響を及ぼさないことを示している。
【0040】
実施例４－ＢＰＺＥ１ＰはａＰｖワクチン接種マウスにおいて肺によるワクチン取り込みを増加させる。
ペルタクチンに対する既存の抗体を有するマウスの肺にコロニーを形成するＢＰＺＥ１Ｐの能力を調べた。８匹の６週齢のマウスの群に、ヒト用量の１／５の無細胞百日咳ワクチン（ａＰｖ；Ｉｎｆａｎｒｉｘ，ＧＳＫ；不活性化百日咳毒素、糸状血球凝集素およびペルタクチンを含有）を皮下ワクチン接種した。４週間後に、同用量のａＰｖをマウスに追加接種（ｂｏｏｓｔ）した。追加接種の４週間後に、マウスを１０６個のＢＰＺＥ１またはＢＰＺＥ１Ｐに鼻腔内感染させた。感染の３時間後に３匹のマウスを安楽死させ、肺を採取してＣＦＵ数を決定した。感染の７日後に、残りの５匹のマウスを安楽死させ、肺を採取し、ＣＦＵ数を測定した。統計分析を、９５％信頼区間で事後ボンフェローニ比較検定を用いて、パラメトリック二元配置分散分析検定を適用して行った。＊＊＊、ｐ＜０．０００１。図５を参照すると、投与の３時間後には、２つの菌株の間にコロニー形成について有意差は見られなかった。それに比べて、接種の７日後には、ＢＰＺＥ１Ｐは、ＢＰＺＥ１よりも有意に良好に肺にコロニーを形成していた。ＢＰＺＥ１Ｐに感染させたマウスは、投与の７日後に肺に約１０４ＣＦＵを有していたのに対して、ＢＰＺＥ１を投与されたマウスの肺におけるＣＦＵ数は１０２ＣＦＵになった。これらのデータは、ペルタクチン含有ａＰｖで予め免疫されたマウスにおいて、ｐｒｎ遺伝子の欠失が、肺によるＢＰＺＥ１の獲得を改善することを示している。
ペルタクチンに対する既存の抗体を有するマウスの肺にコロニーを形成するＢＰＺＥ１Ｐの能力を調べた。８匹の６週齢のマウスの群に、ヒト用量の１／５の無細胞百日咳ワクチン（ａＰｖ；Ｉｎｆａｎｒｉｘ，ＧＳＫ；不活性化百日咳毒素、糸状血球凝集素およびペルタクチンを含有）を皮下ワクチン接種した。４週間後に、同用量のａＰｖをマウスに追加接種（ｂｏｏｓｔ）した。追加接種の４週間後に、マウスを１０６個のＢＰＺＥ１またはＢＰＺＥ１Ｐに鼻腔内感染させた。感染の３時間後に３匹のマウスを安楽死させ、肺を採取してＣＦＵ数を決定した。感染の７日後に、残りの５匹のマウスを安楽死させ、肺を採取し、ＣＦＵ数を測定した。統計分析を、９５％信頼区間で事後ボンフェローニ比較検定を用いて、パラメトリック二元配置分散分析検定を適用して行った。＊＊＊、ｐ＜０．０００１。図５を参照すると、投与の３時間後には、２つの菌株の間にコロニー形成について有意差は見られなかった。それに比べて、接種の７日後には、ＢＰＺＥ１Ｐは、ＢＰＺＥ１よりも有意に良好に肺にコロニーを形成していた。ＢＰＺＥ１Ｐに感染させたマウスは、投与の７日後に肺に約１０４ＣＦＵを有していたのに対して、ＢＰＺＥ１を投与されたマウスの肺におけるＣＦＵ数は１０２ＣＦＵになった。これらのデータは、ペルタクチン含有ａＰｖで予め免疫されたマウスにおいて、ｐｒｎ遺伝子の欠失が、肺によるＢＰＺＥ１の獲得を改善することを示している。
【0041】
実施例５－ＢＰＺＥ１ＰおよびＢＰＺＥ１はアレルギー性気道炎症に対して等しく良好に防御する。
アレルギーマウスにおいて、気道反応性に対するＢＰＺＥ１Ｐのワクチン接種の効果を、図６に示したプロトコルに記述されるように調べた。４週齢のマウスの群に、１０６個の生ＢＰＺＥ１もしくはＢＰＺＥ１Ｐを含有する２０μｌのＰＢＳを鼻腔内ワクチン接種するか、またはワクチン接種しないままにした。４週間後に、マウスに、５反応性指数（ＩＲ）のデルマトファゴイデス・ファリナエ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｆａｒｉｎａｅ）抽出物（Ｄｅｒｆ ５ＩＲ）の２０μｌの室内塵ダニ（ＨＤＭ；Ｓｔａｌｌｅｒｇｅｎｅｓ Ｓ．Ａ．）またはコントロールとして２０μｌのＰＢＳを鼻腔内感作した。１０日後に、マウスを５日間毎日２０μｌのＤｅｒｆ ５ＩＲまたはＰＢＳで鼻腔内チャレンジし、２日後に、マウスに麻酔をかけ、ＦｌｅｘｉＶｅｎｔ（ＳＣＩＲＥＱ（登録商標））デバイスを用いた機械的換気のために気管内挿管した。次いで、増大する濃度の霧状メタコリン（ＰＢＳ中０～５０ｍｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）にマウスを曝露して、それらの気道における抵抗をプレチスモグラフィを用いて決定した。統計分析を、９５％信頼区間で事後ボンフェローニ比較検定を用いて、パラメトリック二元配置分散分析検定を適用することにより行った。＊＊＊、ｐ＜０．０００１；＊＊、ｐ＜０．００１；＊、ｐ＜０．００５。図６において、Ｄｅｒｆ ５ＩＲとＢＰＺＥ１＋Ｄｅｒｆ ５ＩＲの間の比較は実線で表され、Ｄｅｒｆ ５ＩＲとＢＰＺＥ１Ｐ＋Ｄｅｒｆ ５ＩＲの間の比較は破線で表されている。ＢＰＺＥ１ワクチン接種マウスおよびＢＰＺＥ１Ｐワクチン接種マウスの両方が、非ワクチン接種マウスに比べて、６ｍｇ／ｍｌ、１２ｍｇ／ｍｌおよび２５ｍｇ／ｍｌのメタコリンでの処理後に、それらの気道において有意により小さい抵抗を示した。ワクチン接種マウスの抵抗は、実験全体にわたって感作もチャレンジもされていない、ＰＢＳコントロール群のものに匹敵した。
アレルギーマウスにおいて、気道反応性に対するＢＰＺＥ１Ｐのワクチン接種の効果を、図６に示したプロトコルに記述されるように調べた。４週齢のマウスの群に、１０６個の生ＢＰＺＥ１もしくはＢＰＺＥ１Ｐを含有する２０μｌのＰＢＳを鼻腔内ワクチン接種するか、またはワクチン接種しないままにした。４週間後に、マウスに、５反応性指数（ＩＲ）のデルマトファゴイデス・ファリナエ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｆａｒｉｎａｅ）抽出物（Ｄｅｒｆ ５ＩＲ）の２０μｌの室内塵ダニ（ＨＤＭ；Ｓｔａｌｌｅｒｇｅｎｅｓ Ｓ．Ａ．）またはコントロールとして２０μｌのＰＢＳを鼻腔内感作した。１０日後に、マウスを５日間毎日２０μｌのＤｅｒｆ ５ＩＲまたはＰＢＳで鼻腔内チャレンジし、２日後に、マウスに麻酔をかけ、ＦｌｅｘｉＶｅｎｔ（ＳＣＩＲＥＱ（登録商標））デバイスを用いた機械的換気のために気管内挿管した。次いで、増大する濃度の霧状メタコリン（ＰＢＳ中０～５０ｍｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）にマウスを曝露して、それらの気道における抵抗をプレチスモグラフィを用いて決定した。統計分析を、９５％信頼区間で事後ボンフェローニ比較検定を用いて、パラメトリック二元配置分散分析検定を適用することにより行った。＊＊＊、ｐ＜０．０００１；＊＊、ｐ＜０．００１；＊、ｐ＜０．００５。図６において、Ｄｅｒｆ ５ＩＲとＢＰＺＥ１＋Ｄｅｒｆ ５ＩＲの間の比較は実線で表され、Ｄｅｒｆ ５ＩＲとＢＰＺＥ１Ｐ＋Ｄｅｒｆ ５ＩＲの間の比較は破線で表されている。ＢＰＺＥ１ワクチン接種マウスおよびＢＰＺＥ１Ｐワクチン接種マウスの両方が、非ワクチン接種マウスに比べて、６ｍｇ／ｍｌ、１２ｍｇ／ｍｌおよび２５ｍｇ／ｍｌのメタコリンでの処理後に、それらの気道において有意により小さい抵抗を示した。ワクチン接種マウスの抵抗は、実験全体にわたって感作もチャレンジもされていない、ＰＢＳコントロール群のものに匹敵した。
【0042】
実施例６－肺細胞浸潤およびサイトカインプロファイルの測定
図６に示される、すぐ上で述べた実験のアレルギーマウスにおける気道細胞個体群浸潤を評価した。プレチスモグラフィ測定後に、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）流体を収集して、気道における細胞浸潤を測定した。ＢＡＬ流体からの細胞を、４℃で５分間の１，２００ｒｐｍでの遠心分離により採取し、Ｓｈａｎｄｏｎ ｃｙｔｏｓｐｉｎ ４（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて細胞計数のためにＰＢＳに再懸濁させ、細胞種計数のためにＭａｙ Ｇｒｕｅｎｗａｌｄ Ｇｉｅｍｓａ（ＤｉｆｆＱｕｉｋ（登録商標））で染色した。総細胞数をマウスのＢＡＬ流体において測定し（図７Ａ）、好酸球（図７Ｂ）、好中球（図７Ｃ）、リンパ球（図７Ｄ）およびマクロファージ（図７Ｅ）の百分率を算出した。統計分析を、９５％信頼区間で事後ボンフェローニ比較検定を用いて、パラメトリック一元配置分散分析検定を適用することにより行った。＊＊＊、ｐ＜０．０００１；＊、ｐ＜０．００５。ＢＰＺＥ１またはＢＰＺＥ１Ｐワクチン接種は、非ワクチン接種マウスに比べて、アレルゲン曝露およびチャレンジ後に気道における全細胞の動員を著しく低減した（図７Ａ）。この低減は、ワクチン接種マウスにおける好酸球動員の減少（図７Ｂ）を本質的に反映しており、ワクチン接種マウスと非ワクチン接種マウスとの間で好中球またはリンパ球の百分率（図７ＣおよびＤ）に有意な変化はなかった。マクロファージの百分率の小さいが有意な増加が、ＢＰＺＥ１Ｐをワクチン接種したマウスにおいて認められた（図７Ｅ）。
図６に示される、すぐ上で述べた実験のアレルギーマウスにおける気道細胞個体群浸潤を評価した。プレチスモグラフィ測定後に、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）流体を収集して、気道における細胞浸潤を測定した。ＢＡＬ流体からの細胞を、４℃で５分間の１，２００ｒｐｍでの遠心分離により採取し、Ｓｈａｎｄｏｎ ｃｙｔｏｓｐｉｎ ４（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて細胞計数のためにＰＢＳに再懸濁させ、細胞種計数のためにＭａｙ Ｇｒｕｅｎｗａｌｄ Ｇｉｅｍｓａ（ＤｉｆｆＱｕｉｋ（登録商標））で染色した。総細胞数をマウスのＢＡＬ流体において測定し（図７Ａ）、好酸球（図７Ｂ）、好中球（図７Ｃ）、リンパ球（図７Ｄ）およびマクロファージ（図７Ｅ）の百分率を算出した。統計分析を、９５％信頼区間で事後ボンフェローニ比較検定を用いて、パラメトリック一元配置分散分析検定を適用することにより行った。＊＊＊、ｐ＜０．０００１；＊、ｐ＜０．００５。ＢＰＺＥ１またはＢＰＺＥ１Ｐワクチン接種は、非ワクチン接種マウスに比べて、アレルゲン曝露およびチャレンジ後に気道における全細胞の動員を著しく低減した（図７Ａ）。この低減は、ワクチン接種マウスにおける好酸球動員の減少（図７Ｂ）を本質的に反映しており、ワクチン接種マウスと非ワクチン接種マウスとの間で好中球またはリンパ球の百分率（図７ＣおよびＤ）に有意な変化はなかった。マクロファージの百分率の小さいが有意な増加が、ＢＰＺＥ１Ｐをワクチン接種したマウスにおいて認められた（図７Ｅ）。
【0043】
ＢＡＬに続き、右肺葉を採取し、タンパク質抽出のために液体窒素中で直接凍結させた。この肺葉を、０．５％ノニデットＰ４０およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ（登録商標））を含むＰＢＳである１ｍＬの溶解緩衝液に再懸濁させ、Ｔ－１８ Ｕｌｔｒａ－Ｔｕｒｒａｘ（Ｉｋａ（登録商標））を用いて４℃でホモジナイズした。試料を遠心分離機にかけ、製造業者の仕様に従うＰｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた総タンパク定量、ならびにＣｙｔｏｋｉｎｅ ２０－Ｐｌｅｘ Ｍｏｕｓｅ Ｐａｎｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標），Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いたサイトカインおよびケモカイン測定のために、上清を収集した。図８を参照すると、サイトカインレベルは、肺葉において測定された総タンパクに対してサイトカイン／ケモカイン定量を正規化したものとして表されている。統計分析を、９５％信頼区間で事後ボンフェローニ比較検定を用いて、パラメトリック一元配置分散分析検定を適用することにより行った。＊＊、ｐ＜０．００１；＊、ｐ＜０．００５。
【0044】
図８に示すように、ＨＤＭ（Ｄｅｒｆ ５ＩＲ）処理マウスは、非処理マウスに比べて、肺において有意に上昇したレベルのＩＬ１αおよびＩＬ１βを産生した。ＨＤＭ感作に先立つＢＰＺＥ１またはＢＰＺＥ１Ｐのワクチン接種は、これらのレベルを有意に低下させた（図８ＡおよびＢ）。ＩＬ６およびＩＬ１３については、ワクチン接種マウスと非ワクチン接種マウスとの間の差は統計的有意に達しなかったが、同様な傾向が認められた（図８ＣおよびＤ）。ＨＤＭで処理されただけのマウスに比べて有意により低いレベルの惹起されたＣＸＣＬ１（ＫＣ）、ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ－１０）およびＧＭ－ＣＳＦが、ワクチン接種マウスにおいて認められた（図８Ｆ～Ｈ）。概して、ＢＰＺＥ１ワクチン接種マウスとＢＰＺＥ１Ｐワクチン接種マウスとの間に統計的な差はなかった。
【0045】
実施例７－予め感作された被験体へのＢＰＺＥ１またはＢＰＺＥ１Ｐのいずれかのワクチン接種は、ワクチン接種されなかったものに比べて有意により低いレベルの気道抵抗を示す。図９の図に示すように、５週齢のマウスの群に、Ｄｅｒｆ ５ＩＲを鼻腔内感作するかまたはＰＢＳを投与し、次いで、１０６個のＢＰＺＥ１もしくはＢＰＺＥ１Ｐをワクチン接種するかまたはワクチン接種しないままにした。９日後に、マウスを５日間にわたりＤｅｒｆ ５ＩＲまたはＰＢＳで鼻腔内チャレンジした。最後のチャレンジから２日後に、マウスに麻酔をかけ、気道におけるそれらの抵抗を、上述したようにプレチスモグラフィにより測定した。統計分析を、９５％信頼区間で事後ボンフェローニ比較検定を用いて、パラメトリック二元配置分散分析検定を適用することにより行った。＊＊＊、ｐ＜０．０００１；＊＊、ｐ＜０．００１。Ｄｅｒｆ ５ＩＲとＢＰＺＥ１＋Ｄｅｒｆ ５ＩＲとの間の比較は実線で表され、Ｄｅｒｆ ５ＩＲとＢＰＺＥ１Ｐ＋Ｄｅｒｆ ５ＩＲとの間の比較は破線で表されている。ＢＰＺＥ１またはＢＰＺＥ１Ｐのいずれかをワクチン接種したマウスは、ワクチン接種しなかったものに比べて有意により低いレベルの気道抵抗を示す。この場合もまた、ワクチン接種マウスの気道抵抗は、Ｄｅｒｆ ５ＩＲで感作もチャレンジもされていないコントロール群のものと区別がつかなかった。
【0046】
他の実施形態
本発明をその詳細な説明に関連して記述してきたが、上述の説明は本発明の範囲を限定することではなく例示することを意図するものであり、本発明の範囲は添付の請求項の範囲によって規定されるものであることが理解されるべきである。他の態様、利点、および改変が、以下の請求項の範囲内にある。
本発明をその詳細な説明に関連して記述してきたが、上述の説明は本発明の範囲を限定することではなく例示することを意図するものであり、本発明の範囲は添付の請求項の範囲によって規定されるものであることが理解されるべきである。他の態様、利点、および改変が、以下の請求項の範囲内にある。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2】
【図3】
【図4A-4C】
【図5】
【図6】
【図7A-7D】
【図7E】
【図8A-8D】
【図8E-8H】
【図9】
【配列表】