特許 6995812 ＮＴ３の発現増強用組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2021-12-17

(45)【発行日】2022-01-17

(54)【発明の名称】ＮＴ３の発現増強用組成物

(51)【国際特許分類】

   A23L 33/105 20160101AFI20220107BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220107BHJP

   A61K 31/352 20060101ALI20220107BHJP

   A61K 36/75 20060101ALI20220107BHJP

   A61K 36/8962 20060101ALI20220107BHJP

【ＦＩ】

A23L33/105

A61P43/00 105

A61K31/352

A61K36/75

A61K36/8962

【請求項の数】 2

(21)【出願番号】P 2019175637

(22)【出願日】2019-09-26

(65)【公開番号】P2021048818

(43)【公開日】2021-04-01

【審査請求日】2021-07-01

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】593106918

【氏名又は名称】株式会社ファンケル

(74)【代理人】

【識別番号】100162396

【弁理士】

【氏名又は名称】山田 泰之

(74)【代理人】

【識別番号】100122954

【弁理士】

【氏名又は名称】長谷部 善太郎

(74)【代理人】

【識別番号】100194803

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 理弘

(74)【代理人】

【識別番号】100202430

【弁理士】

【氏名又は名称】太田 千香子

(72)【発明者】

【氏名】坂井 友美

(72)【発明者】

【氏名】渡邉 知倫

(72)【発明者】

【氏名】澤野 健史

【審査官】田ノ上 拓自

(56)【参考文献】

【文献】International Journal of Developmental Neuroscience, 2019年2月，Vol.74，p.18-26

【文献】Bratisl Med. J., 2018年，Vol.119, No.1，p.28-31

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ２３Ｌ ３１／００－３３／２９

Ａ６１Ｐ ４３／００

Ａ６１Ｋ ３１／３５２

Ａ６１Ｋ ３６／７５

Ａ６１Ｋ ３６／８９６２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＦＳＴＡ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ケルセチンアグリコンを有効成分として含有する、ＮＴ３の発現増強用組成物。

【請求項2】

ケルセチンアグリコンが、植物抽出由来である、請求項１に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、神経栄養因子であるＮＴ３の、発現増強作用を有する組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ－３（ＮＴ３）は、ＮＧＦ（Ｎｅｒｖｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）ファミリーに属する神経栄養因子の１つである。ＮＴ３は主として中枢神経や末梢神経、シナプスで発現し、Ｔｒｋレセプターを通したシグナル伝達を行う。海馬や小脳などでは、ＮＴ３が絶えず産生され、神経細胞及びグリア細胞の生存と成長、神経新生の促進に関与することが知られている。また、非特許文献１ではＮＴ３がシナプスの興奮を促し、神経伝達の促進に作用することが報告されており、非特許文献２では、加齢性難聴と内耳細胞におけるＮＴ３発現の関係が報告されるなど、神経系における役割が注目されている。

【0003】

一方、ＮＴ３は視覚機能における役割も報告されている。網膜に達した光は視細胞が受容し、電気信号へと変換するが、ＮＴ３は視細胞を光刺激などによるダメージから保護する作用があること、視細胞の分化や再生を促進する作用があることが非特許文献３に記載されている。また、ＮＴ３は網膜の支持細胞であるミュラー細胞に作用し、視細胞変性抑制作用が知られているｂＦＧＦの発現を増強する作用も報告されており、直接的にも間接的にも視細胞に保護的な作用をもたらす。網膜中でＮＴ３を産生する主要な細胞の１つにミュラー細胞がある。
これらの先行技術から、中枢神経系や末梢（聴覚、視覚）神経系において、神経栄養因子であるＮＴ３の役割の重要性が注目されている。

【0004】

一方、ケルセチン（またはクエルセチンとも呼ばれる、英：Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）は、フラボノイドの一種で、フラボノールを骨格に持つ物質である。配糖体（ルチン、クエルシトリンなど）または遊離した形で柑橘類、タマネギやソバをはじめ多くの植物に含まれ、古くから染料としても用いられてきた。ケルセチンは、植物体内では一般的に配糖体として存在する。
ケルセチンには、抗酸化作用、抗炎症作用、抗動脈硬化作用、脳血管疾患の予防、抗腫瘍効果、降圧作用、強い血管弛緩作用などが知られている。特許文献１には、破骨細胞分化抑制因子産生促進剤としての用途、特許文献２にはアミラーゼ阻害物質としての用途、特許文献３には植物成長促進剤の用途が記載されている。このように、ケルセチンはヒトへの様々な生理作用や、植物体への作用など様々な用途が知られているが、ＮＴ３などの神経栄養因子の産生やＮＴ３の発現に関わる作用や用途は、これまで知られていない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【文献】特開２００６－１１７５５０号公報

【文献】特開平５－２３６９１０号公報

【文献】特開平８－１４３４０６号公報

【非特許文献】

【0006】

【文献】Nature. 1993 May 27;363(6427):350-3.

【文献】Elife. 2014 Oct 20;3.

【文献】Neuron. 2000 May;26(2):533-41.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、新規なＮＴ３の発現を増強する組成物を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、多数の天然物や化合物の網膜由来ミュラー細胞に対する作用を研究する過程で、ミュラー細胞に作用してＮＴ３の発現を増強する効果を有する物質を見出し、本発明をなした。
本発明は、ＮＴ３の発現を増強する組成物を提供することを課題とする。
すなわち、
本発明は、以下の構成からなる。
（１）ケルセチンを有効成分として含有する、ＮＴ３の発現増強用組成物。
（２）ケルセチンが、植物抽出物由来である（１）に記載の組成物。

【発明の効果】

【0009】

本発明により、ケルセチンを有効成分とする、新規なＮＴ３の発現を増強する作用を有する組成物が提供される。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】ケルセチンがＮＴ３の発現を増強することを示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0011】

本発明について具体的に説明する。
なお、本発明でいう「組成物」とは、ケルセチンを含有し、ＮＴ３の発現を増強するものをいう。「組成物」には食品、医薬品、健康食品、動物用飼料を包含する。

【0012】

本発明に用いられるケルセチンとしては、その由来を特に限定されるものではない。しかし安全性の観点から、植物由来のものが好ましい。ケルセチンは、フラボノイドのうち、フラボノールに分類されるポリフェノール化合物で、タマネギ、ホウレン草、ケール、パセリなどに多く含まれている。

【0013】

ケルセチンを得る技術は確立されているので、通常行われている方法に基づいてケルセチンを得ることができる。また、市販のものを用いてもよい。ケルセチンは、精製されているものであっても良いし、植物から抽出された抽出物であっても良い。植物から抽出されたものとしては、タマネギ外皮から熱水によって抽出された横浜油脂工業株式会社製「タマネギケルセチンＧＰ－１」を例示することができる。また、ケルセチンの生体吸収性、生体利用率を高めることを目的として加工された原料を用いてもよい。このような原料としては、ケルセチン配糖体を配合した太陽化学株式会社製「サンアクティブＥＮ」や、ケルセチンをフィトソーム製剤化したインデナ社製「ケルセフィット」を例示することができる。

【0014】

ケルセチンを含む上記抽出物は、公知の分離精製方法を適宜組み合わせてさらに含有量と活性を高めることもできる。
ケルセチンをヒトに投与する場合は、経口投与が好ましく、具体的には、飲食品、医薬品、サプリメント等の健康食品として使用可能である。

【0015】

ケルセチンを食品・飲料として使用する場合、例えば、果汁飲料、炭酸飲料、茶系飲料、乳飲料、アルコール飲料、清涼飲料等の飲料、ゼリー状食品や各種スナック類、焼き菓子、ケーキ類、チョコレート、ガム、飴、スープ類等、あらゆる食品・飲料形態とすることができる。

【0016】

また、ケルセチンをサプリメントや医薬品として使用する場合、例えば、錠剤、顆粒剤等の経口用固形成形剤、内服液剤、シロップ剤等の経口用液体製剤として利用することができる。

【0017】

ケルセチンを医薬品やサプリメントの製剤とする場合は、ケルセチンの抽出物を一般的な製造法により、直接又は製剤上許容し得る担体とともに混合、分散した後、所望の形態に加工することによって、容易に得ることができる。この場合、本発明に用いられる抽出物の他に、かかる形態に一般的に用いられる植物油、動物油等の油性分、ビタミン類、ｐＨ調整剤、防腐剤、増粘剤、色素、香料等を本発明の効果を妨害しない範囲で適宜配合することができる。

【0018】

本発明のケルセチンを含有する組成物は、特に限定されるものではないが、好ましくは、ケルセチンとして通常全組成の０．００００１～９９．５質量％の範囲で含有される組成物とする。

【実施例】

【0019】

実施例を示し、本発明についてさらに説明する。
＜実施例１．初代ミュラー細胞を用いた一次スクリーニング＞
網膜の支持細胞であるミュラー細胞の初代培養を用いて、ＮＴ３の発現増強作用のある組成物のスクリーニングを実施した。
（１）初代ミュラー細胞の調製
初代ミュラー細胞は次の方法で調製した。
７日齢のＳＤラット１０匹から網膜を単離した。単離した網膜は、ＰＢＳ（－）で５倍希釈したトリプシン－ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ Ｔ３９２４）にＤＮａｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ）を終濃度１００ｎｇ／ｍｌで添加した溶液１０ｍＬ中で、３７℃で３０分間静置した。ピペッティング操作により網膜組織を分散させ、２，４００ｒｐｍ、室温で５分間遠心した。上清を吸引除去した後、１０％ ＦＢＳ（ｂｉｏｓｅｒａ）、１％ ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）を含むＤＭＥＭ－Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ）２５ｍＬに懸濁した。懸濁液を７０μＭのセルストレーナー（ＦＡＬＣＯＮ）に通した後、細胞数を計測し、４．２ｘ１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度になるよう希釈した。Ｔ－７５細胞培養用フラスコ（住友ベークライト）に１０ｍＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ_２下で培養した（培養０日目）。培養３日目に、培地を吸引除去し、新しい培地２０ｍＬに交換し、再び３７℃、５％ＣＯ_２下で培養した。培養７日目に、Ｗｅｉ－Ｔａｏ Ｓｏｎｇらの方法（Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ２０１３；６（６）：７７８－７８４）に準じて、ミュラー細胞を純化した。培養８日目に、ミュラー細胞を剥がし、４ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度になるよう懸濁し、９６ｗｅｌｌ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ（ＦＡＬＣＯＮ）に１００μＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ_２下で培養した。

【0020】

（２）スクリーニング方法
培養９日目の初代ミュラー細胞の培地を全量除去し、１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ－Ｆ１２培地１００μＬに交換し、３７℃、５％ＣＯ_２で９０分間培養することで血清飢餓状態に置いた。ライブラリとして所有する化合物（ケルセチンを含む）約４００種を終濃度２μＭになるように添加し、９０分間培養後に上清を除去し、ＲＮｅａｓｙ ９６ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い添付の説明書に従ってＲＮＡを調製した。ＲＮＡ調製の際、ＤＮａｓｅＩＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、ゲノムＤＮＡの除去を行った。約４０ｎｇの調製したＲＮＡは、Ｐｒｉｍｅ Ｓｃｒｉｐｔ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いて添付の説明書に従いｃＤＮＡを調製した。

【0021】

ＮＴ３の発現量はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙを用い、内在性コントロールにはラットＧａｐｄｈ Ｔａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅを用いて、次の方法で定量した。１μＬのｃＤＮＡとラットＧａｐｄｈ Ｔａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅ、ラットＮＴ３ Ｔａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅ、Ｔａｑｍａｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを所定の割合で混合し、計１０μＬとなるようにＰＣＲ ｇｒａｄｅ ｗａｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し、混合したものを反応液とした。調製した反応液は、Ｑｕａｎｔ Ｓｔｕｄｉｏ ５（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、［（９５℃、２０秒）→（９５℃、１秒）→（６０℃、２０秒）］ｘ４５サイクルの反応条件で測定を行った。
測定により得られたＣｔ値からＧａｐｄｈを内部標準としてΔΔＣｔ法により、各サンプルの相対的遺伝子発現量を求めた。

【0022】

使用したＴａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅの製品情報、仕様は以下のとおりである。
Ｇａｐｄｈ：Ａｐｐｉｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ａｓｓａｙ ＩＤ：Ｒｎ０１４６２６６２＿ｇ１（Ｄｙｅ：ＶＩＣ， Ｑｕｅｎｃｈｅｒ：ＭＧＢ）
ＮＴ３：Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ａｓｓａｙ ＩＤ：Ｒｎ００５７９２８０ｍ１（Ｄｙｅ：ＦＡＭ， Ｑｕｅｎｃｈｅｒ：ＭＧＢ）

【0023】

上記の方法によるスクリーニングの結果、ケルセチンにＮＴ３の発現増強作用が認められた。

【0024】

＜実施例２．ケルセチンによるＮＴ３の発現増強作用＞
一次スクリーニングの結果、ケルセチンにＮＴ３の発現増強作用が認められたので、ケルセチンのＮＴ３発現増強作用について濃度依存性の活性を確認するため、以下の方法で試験した。
（１）試験方法
１）試験試料
ケルセチンは、市販の試薬（ＳＩＧＭＡ社製、純度９５％以上）を用いて、ＤＭＳＯで溶解し使用した。

【0025】

２）ＮＴ３発現増強
実施例１に記載の方法で調製した培養９日目の初代ミュラー細胞の培地を全量除去し、１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ－Ｆ１２培地１００μＬに交換し、３７℃、５％ＣＯ_２で９０分間培養することで血清飢餓状態に置いた。
上記のケルセチンを３μＭ、３０μＭの終濃度になるように添加し、９０分間培養後に上清を除去し、ＲＮｅａｓｙ ９６ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い添付の説明書に従ってＲＮＡを調製した。次いで、実施例１に記載の方法で、ＮＴ３の相対的遺伝子発現量を定量した。

【0026】

（２）結果
測定結果を図１に示した。
ラット初代ミュラー細胞において、ＮＴ３のｍＲＮＡの発現量は、コントロール（０．１％ＤＭＳＯのみ）の発現量を１とした時、ケルセチン３μＭの添加では１．２９倍、３０μＭの添加では１．５２倍に発現が増強された。この結果から、ケルセチンは、添加濃度依存的にＮＴ３の発現を増強させることが明らかとなった。

【図1】