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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2021-12-20
(45)【発行日】2022-02-04
(54)【発明の名称】食中毒原因菌の迅速検出方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/689 20180101AFI20220128BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20220128BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/689 Z ZNA
C12N15/09 Z
【請求項の数】
4
(21)【出願番号】P 2016178375
(22)【出願日】2016-09-13
(65)【公開番号】P2018042483
(43)【公開日】2018-03-22
【審査請求日】2019-08-26
(73)【特許権者】
【識別番号】000003160
【氏名又は名称】東洋紡株式会社
(72)【発明者】
【氏名】肥山 貴圭
【審査官】林 康子
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１６－０４２８０２（ＪＰ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０３６４２９１５（ＣＮ，Ａ）
【文献】Journal of Food Protection，2007年，Vol.70, no.6，pp. 1366-1372
【文献】日本食品微生物学会雑誌，2012年，Vol.29, no.2，pp.101-107
【文献】Journal of Medical Microbiology，2004年，Vol. 53，pp. 617-622
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ １／６８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の第一のプライマーセット、第二のプライマーセット、第三のプライマーセットおよび第四のプライマーセットを含むことを特徴とする食中毒原因菌の検出用試薬：
サルモネラ菌のｉｎｖＡ遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、
（１）配列番号１に示される塩基配列若しくはその相補鎖である塩基配列の少なくとも１５塩基を含むプライマー及び配列番号３に示される塩基配列若しくはその相補鎖である塩基配列の少なくとも１５塩基を含むプライマーを含み、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に対して相補的であるプライマーセット、又は
（２）配列番号２に示される塩基配列若しくはその相補鎖である塩基配列の少なくとも１５塩基を含むプライマー及び配列番号４に示される塩基配列若しくはその相補鎖である塩基配列の少なくとも１５塩基を含むプライマーを含み、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に対して相補的であるプライマーセットのいずれか或いは両方を含む第一のプライマーセット；
腸管出血性大腸菌のｖｔｘ１遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、
（３）配列番号６に示される塩基配列若しくはその相補鎖である塩基配列の少なくとも１５塩基を含むプライマー及び配列番号７に示される塩基配列若しくはその相補鎖である塩基配列の少なくとも１５塩基を含むプライマーを含み、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に対して相補的であるプライマーセット、又は
（４）配列番号５に示される塩基配列若しくはその相補鎖である塩基配列の少なくとも１５塩基を含むプライマー及び配列番号８に示される塩基配列若しくはその相補鎖である塩基配列の少なくとも１５塩基を含むプライマーを含み、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に対して相補的であるプライマーセットのいずれか或いは両方を含む第二のプライマーセット；
腸管出血性大腸菌のｖｔｘ２遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、
（５）配列番号９に示される塩基配列若しくはその相補鎖である塩基配列の少なくとも１５塩基を含むプライマー及び配列番号１０に示される塩基配列若しくはその相補鎖である塩基配列の少なくとも１５塩基を含むプライマーを含み、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に対して相補的であるプライマーセット、又は
（６）配列番号１０に示される塩基配列若しくはその相補鎖である塩基配列の少なくとも１５塩基を含むプライマー及び配列番号１１に示される塩基配列若しくはその相補鎖である塩基配列の少なくとも１５塩基を含むプライマーを含み、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に対して相補的であるプライマーセットのいずれか或いは両方を含む第三のプライマーセット；および、
赤痢菌のｉｐａＨ遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、
（７）配列番号１２に示される塩基配列若しくはその相補鎖である塩基配列の少なくとも１５塩基を含むプライマー及び配列番号１３に示される塩基配列若しくはその相補鎖である塩基配列の少なくとも１５塩基を含むプライマーを含み、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に対して相補的であるプライマーセット、又は
（８）配列番号１３に示される塩基配列若しくはその相補鎖である塩基配列の少なくとも１５塩基を含むプライマー及び配列番号１４に示される塩基配列若しくはその相補鎖である塩基配列の少なくとも１５塩基を含むプライマーを含み、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に対して相補的であるプライマーセットのいずれか或いは両方を含む第四のプライマーセット。
【請求項2】
サルモネラ菌のｉｎｖＡ遺伝子を検出するための蛍光プローブであって、第一のプライマーセットとして、前記（１）のプライマーセットを使用する場合に用いられる配列番号１５の塩基配列又はその相補鎖である塩基配列の少なくとも１５塩基を含む蛍光プローブ又は前記（２）のプライマーセットを使用する場合に用いられる配列番号１６の塩基配列又はその相補鎖である塩基配列の少なくとも１５塩基を含む蛍光プローブである、第一の蛍光プローブと、腸管出血性大腸菌のｖｔｘ１遺伝子を検出するための蛍光プローブであり、配列番号１７の塩基配列又はその相補鎖である塩基配列の少なくとも１５塩基を含む第二の蛍光プローブと、
腸管出血性大腸菌のｖｔｘ２遺伝子を検出するための蛍光プローブであって、第三のプライマーセットとして、前記（５）のプライマーセットを使用する場合に用いられる配列番号１９の塩基配列又はその相補鎖である塩基配列の少なくとも１５塩基を含む蛍光プローブ又は前記（６）のプライマーセットを使用する場合に用いられる配列番号１８の塩基配列又はそれらの相補鎖である塩基配列の少なくとも１５塩基を含む蛍光プローブである、第三の蛍光プローブ、および、
赤痢菌のｉｐａＨ遺伝子を検出するための蛍光プローブであり、配列番号２０の塩基配列又はその相補鎖である塩基配列の少なくとも１５塩基を含む第四の蛍光プローブのうちから選択される少なくともいずれか一つの蛍光プローブを含むことを特徴とする請求項１に記載の食中毒原因菌の検出用試薬。
【請求項3】
ＰＣＲ反応液に、ＤＮＡポリメラーゼを含み、ＤＮＡポリメラーゼがＴａｑ、Ｔｔｈ、またはそれらの変異体から選択されることを特徴とする請求項１又は２に記載の食中毒原因菌の検出用試薬。
【請求項4】
ＰＣＲ反応液に、ウシ血清アルブミン、グリセロール、グリコールおよびゼラチンよりなる群から選択された少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の食中毒原因菌の検出用試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、核酸増幅による食中毒原因菌の検出方法に関する。具体的には、サルモネラ菌、腸管出血性大腸菌、赤痢菌を短時間で同時検出することが可能なＰＣＲ用プライマーセット、蛍光プローブ、ＰＣＲ用反応液、及び検出方法に関する。
【背景技術】
【0002】
核酸増幅法は数コピーの標的核酸を可視化レベル、すなわち数億コピー以上に増幅する技術である。代表的な核酸増幅法はＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）である。ＰＣＲは、（１）熱処理によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの解離）、（２）鋳型１本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という３ステップを１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことによって、試料中の標的核酸を増幅する方法である。
【0003】
ＰＣＲ技術を用いた検査は遺伝子診断、臨床診断といった法医学分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等において、広く利用されている。ＰＣＲ増幅産物の検出には、電気泳動をすることなく、簡便に微量核酸の検出が可能なリアルタイムＰＣＲ法が広く利用されている。
【0004】
食中毒を予防する上で、食中毒原因菌の保菌者を早期に発見することは重要である。そのため、食品調理従事者に対しては、食中毒原因菌であるサルモネラ菌、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌の検査が行われている。従来、サルモネラ菌、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌の検査は、塗沫培養法により行われてきた。具体的には、検体を所定条件下において培養してある程度まで増殖させた後、検出したい細菌類のみが増殖し得るような選択培地中で培養を行い、増殖によってできたコロニーを観察することによって検出するという方法である。
【0005】
しかしながら、このような従来の方法では、（１）培養工程を経るため、結果が得られるまでに時間がかかる点、（２）検出感度が低い点、及び（３）コロニーの観察結果に基づいて客観的な判定を下すのは難しいため、検出結果の客観性を担保するのが難しい点等の問題点があった。
【0006】
そこで、塗沫培養法の問題点を解決するためにＰＣＲ法を用いた検出方法が開発されてきた（非特許文献１）。ＰＣＲ法では、（１）培養工程を経ないため迅速に検出できる、（２）検出感度が高い、（３）検出対象の細菌類の有無を、目的のＤＮＡが増幅したか否かで判定するので、客観性をもって細菌類を検出できる等の利点がある。
【0007】
食中毒原因菌の検便検査は、初めにＰＣＲ法にてスクリーニングを行い、陰性検体を除いた後、塗沫培養法により陽性検体の確定検査がされるのが一般的である（非特許文献２）。また、健常人の検便検査では、食中毒原因菌の保菌率は非常に低く、検体の大部分が陰性となる。迅速な判定のため、ＰＣＲ法によるスクリーニングには、一般的に１０検体から５０検体程度を１プールとしたプール糞便が用いられる（特許文献１）。プール糞便からＰＣＲ法によりスクリーニングを実施後、陽性プールに含まれる各検体を個別に塗抹培養することによって陽性検体を確定する。
【0008】
ＰＣＲ法によるスクリーニングは、糞便試料中からのＤＮＡの抽出作業を省略し、検体懸濁液の熱処理したサンプルをＰＣＲに供することによって、食中毒原因菌の有無を検出する手法がとられている。この際、ＤＮＡの抽出を省略することで、糞便試料中には含まれる、多糖類などのＰＣＲ反応阻害物質が持ち込まれる。そこで、これらの影響を低減するような種々の工夫がなされている。
【0009】
サルモネラ菌、腸管出血性大腸菌、赤痢菌を対象にしたＰＣＲ法による検便検査のための試薬は、島津製作所製「長剣系病原菌遺伝子検出試薬キット」、タカラバイオ製「ＴａＫａＲａ腸管系病原細菌遺伝子検出キット」、東洋紡製「腸内細菌遺伝子検出キット―高速蛍光検出―」などが市販されている。
【0010】
これらすべての市販の食中毒原因菌検査試薬は、ＰＣＲ反応後、融解曲線解析により検出を行い、ＰＣＲ増幅産物のＴｍ値の違いによって菌種を識別する。しかしながら、融解曲線解析では複数の食中毒原因菌が混在する場合に、コピー数の多い菌種の影響によって、コピー数が少ない菌種が検出されないという問題がある。また、腸内細菌由来のＤＮＡや検体に含まれるＰＣＲ反応阻害物質の影響が完全に解消されておらず、非特異的な遺伝子増幅による偽陽性が発生し、検査効率が低下することが問題となっていた。また、効率よく多数の資料を検査するために、さらに短時間で食中毒原因菌の有無を検出する方法が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0011】
【文献】特開２０１６－０４２８０２号公報
【非特許文献】
【0012】
【文献】ＴａＫａＲａ ＢＩＯ ＶＩＥＷ 第５５号、第４８頁（２００８年）
【文献】感染症誌 第８６巻：第７４１－７４８頁（２０１２年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0013】
本発明の目的は、蛍光プローブを用いたＰＣＲ法により、非特異的な遺伝子増幅による偽陽性の発生を避け検査の効率を改善すること、サルモネラ菌、腸管出血性大腸菌、赤痢菌の３菌種を４０分以内に検出すること、複数の食中毒原因菌が存在する場合でも全菌種を明確に検出することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0014】
本発明者らは、上記事情に鑑み、鋭意研究を行った結果、本発明のＰＣＲ用プライマーセット及び蛍光プローブを用いることで、試料からサルモネラ菌、腸管出血性大腸菌、赤痢菌の三菌種を、非特異的な遺伝子増幅による偽陽性の発生がなく、且つ４０分以内に検出できることを見出した。さらには、複数の食中毒原因菌が存在する場合でも全菌種を同時に、且つ明確に区別して検出できることを見出した。
特に、１ｍｇ／ｍｌ以上のウシ血清アルブミン、グリセロール、グリコールおよびゼラチンの少なくとも１つをＰＣＲ反応液中に用いることにより、検体由来の阻害物質に対する耐性が上がり、より効率よく検出可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
特に、１ｍｇ／ｍｌ以上のウシ血清アルブミン、グリセロール、グリコールおよびゼラチンの少なくとも１つをＰＣＲ反応液中に用いることにより、検体由来の阻害物質に対する耐性が上がり、より効率よく検出可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0015】
すなわち、本発明は以下の構成からなる。
項１．試料中のサルモネラ菌、腸管出血性大腸菌、赤痢菌の３菌種を同時にＰＣＲ反応により検出する食中毒原因菌の検出方法であって、蛍光プローブの蛍光波長の違いによって、菌種の違いを識別することが可能であることを特徴とする食中毒原因菌の検出方法。
項２．内部標準遺伝子をさらに含み、試料中のサルモネラ菌、腸管出血性大腸菌、赤痢菌の３菌種と内部標準遺伝子を、蛍光プローブの蛍光波長の違いによって識別することが可能であることを特徴とする項１に記載の食中毒原因菌の検出方法。
項３．検出対象が、１０種以上の便から採取した便検体からなるプール検体である項１または２に記載の食中毒原因菌の検出方法。
項４．４０分以内にＰＣＲ反応が終了することを特徴とする項１から３のいずれかに記載の食中毒原因菌の検出方法。
項５．試料が８５℃以上で加熱処理されたサンプルである、項１から４のいずれかに記載の食中毒原因菌の検出方法。
項６．サルモネラ菌のｉｎｖＡ遺伝子を検出するためのプライマーセットであり、配列番号１から３より選択されるいずれかの塩基配列の少なくとも１５塩基を含む、任意の２つのプライマーからなる第一のプライマーセットと、
腸管出血性大腸菌のｖｔｘ１遺伝子を検出するためのプライマーセットであり、配列番号４から７より選択されるいずれかの塩基配列の少なくとも１５塩基を含む、任意の２つのプライマーからなる第二のプライマーセットと、
腸管出血性大腸菌のｖｔｘ２遺伝子を検出するためのプライマーセットであり、配列番号８から１１より選択されるいずれかの塩基配列の少なくとも１５塩基を含む、任意の２つのプライマーからなる第三のプライマーセット、および、
赤痢菌のｉｐａＨ遺伝子を検出するためのプライマーセットであり、配列番号１２から１４より選択されるいずれかの塩基配列の少なくとも１５塩基を含む、任意の２つのプライマーからなる第四のプライマーセットと、のうちから選択される少なくともいずれか一つのプライマーセットを含むことを特徴とする食中毒原因菌の検出用試薬。
項７．第一のプライマーセット、第二のプライマーセット、第三のプライマーセットおよび第四のプライマーセットのうち、いずれか２つを含むことを特徴とする項６に記載の食中毒原因菌の検出用試薬。
項８．第一のプライマーセット、第二のプライマーセット、第三のプライマーセットおよび第四のプライマーセットのうち、いずれか３つを含むことを特徴とする項６に記載の食中毒原因菌の検出用試薬。
項９．第一のプライマーセット、第二のプライマーセット、第三のプライマーセットおよび第四のプライマーセットのすべてを含むことを特徴とする項６に記載の食中毒原因菌の検出用試薬。
項１０．サルモネラ菌のｉｎｖＡ遺伝子を検出するための蛍光プローブであり、配列番号１５の塩基配列の少なくとも１５塩基を含む第一の蛍光プローブと、
腸管出血性大腸菌のｖｔｘ１遺伝子を検出するための蛍光プローブであり、配列番号１６の塩基配列の少なくとも１５塩基を含む第一の蛍光プローブと、
腸管出血性大腸菌のｖｔｘ２遺伝子を検出するための蛍光プローブであり、配列番号１７の塩基配列の少なくとも１５塩基を含む第一の蛍光プローブ、および、
赤痢菌のｉｐａＨ遺伝子を検出するための蛍光プローブであり、配列番号１８の塩基配列の少なくとも１５塩基を含む第一の蛍光プローブとを含むことを特徴とする項６から９のいずれかに記載の食中毒原因菌の検出用試薬。
項１１．ＰＣＲ反応液に、ＤＮＡポリメラーゼを含み、ＤＮＡポリメラーゼがＴａｑ、Ｔｔｈ、またはそれらの変異体から選択されることを特徴とする項６から１０のいずれかに記載の食中毒原因菌の検出用試薬。
項１２．ＰＣＲ反応液に、ウシ血清アルブミン、グリセロール、グリコールおよびゼラチンよりなる群から選択された少なくとも１つを含むことを特徴とする項６から１１のいずれかに記載の食中毒原因菌用試薬。
項１．試料中のサルモネラ菌、腸管出血性大腸菌、赤痢菌の３菌種を同時にＰＣＲ反応により検出する食中毒原因菌の検出方法であって、蛍光プローブの蛍光波長の違いによって、菌種の違いを識別することが可能であることを特徴とする食中毒原因菌の検出方法。
項２．内部標準遺伝子をさらに含み、試料中のサルモネラ菌、腸管出血性大腸菌、赤痢菌の３菌種と内部標準遺伝子を、蛍光プローブの蛍光波長の違いによって識別することが可能であることを特徴とする項１に記載の食中毒原因菌の検出方法。
項３．検出対象が、１０種以上の便から採取した便検体からなるプール検体である項１または２に記載の食中毒原因菌の検出方法。
項４．４０分以内にＰＣＲ反応が終了することを特徴とする項１から３のいずれかに記載の食中毒原因菌の検出方法。
項５．試料が８５℃以上で加熱処理されたサンプルである、項１から４のいずれかに記載の食中毒原因菌の検出方法。
項６．サルモネラ菌のｉｎｖＡ遺伝子を検出するためのプライマーセットであり、配列番号１から３より選択されるいずれかの塩基配列の少なくとも１５塩基を含む、任意の２つのプライマーからなる第一のプライマーセットと、
腸管出血性大腸菌のｖｔｘ１遺伝子を検出するためのプライマーセットであり、配列番号４から７より選択されるいずれかの塩基配列の少なくとも１５塩基を含む、任意の２つのプライマーからなる第二のプライマーセットと、
腸管出血性大腸菌のｖｔｘ２遺伝子を検出するためのプライマーセットであり、配列番号８から１１より選択されるいずれかの塩基配列の少なくとも１５塩基を含む、任意の２つのプライマーからなる第三のプライマーセット、および、
赤痢菌のｉｐａＨ遺伝子を検出するためのプライマーセットであり、配列番号１２から１４より選択されるいずれかの塩基配列の少なくとも１５塩基を含む、任意の２つのプライマーからなる第四のプライマーセットと、のうちから選択される少なくともいずれか一つのプライマーセットを含むことを特徴とする食中毒原因菌の検出用試薬。
項７．第一のプライマーセット、第二のプライマーセット、第三のプライマーセットおよび第四のプライマーセットのうち、いずれか２つを含むことを特徴とする項６に記載の食中毒原因菌の検出用試薬。
項８．第一のプライマーセット、第二のプライマーセット、第三のプライマーセットおよび第四のプライマーセットのうち、いずれか３つを含むことを特徴とする項６に記載の食中毒原因菌の検出用試薬。
項９．第一のプライマーセット、第二のプライマーセット、第三のプライマーセットおよび第四のプライマーセットのすべてを含むことを特徴とする項６に記載の食中毒原因菌の検出用試薬。
項１０．サルモネラ菌のｉｎｖＡ遺伝子を検出するための蛍光プローブであり、配列番号１５の塩基配列の少なくとも１５塩基を含む第一の蛍光プローブと、
腸管出血性大腸菌のｖｔｘ１遺伝子を検出するための蛍光プローブであり、配列番号１６の塩基配列の少なくとも１５塩基を含む第一の蛍光プローブと、
腸管出血性大腸菌のｖｔｘ２遺伝子を検出するための蛍光プローブであり、配列番号１７の塩基配列の少なくとも１５塩基を含む第一の蛍光プローブ、および、
赤痢菌のｉｐａＨ遺伝子を検出するための蛍光プローブであり、配列番号１８の塩基配列の少なくとも１５塩基を含む第一の蛍光プローブとを含むことを特徴とする項６から９のいずれかに記載の食中毒原因菌の検出用試薬。
項１１．ＰＣＲ反応液に、ＤＮＡポリメラーゼを含み、ＤＮＡポリメラーゼがＴａｑ、Ｔｔｈ、またはそれらの変異体から選択されることを特徴とする項６から１０のいずれかに記載の食中毒原因菌の検出用試薬。
項１２．ＰＣＲ反応液に、ウシ血清アルブミン、グリセロール、グリコールおよびゼラチンよりなる群から選択された少なくとも１つを含むことを特徴とする項６から１１のいずれかに記載の食中毒原因菌用試薬。
【発明の効果】
【0016】
本発明によって、従来の食中毒原因菌の検査試薬で問題となっていた非特異的な遺伝子増幅による偽陽性の発生がなく、検査の効率を改善することが可能となる。複数菌種を区別可能であることから塗抹培養工程の培地の使用枚数の削減することができる。また、従来よりも反応時間を短縮し、４０分以内で食中毒原因菌の有無を検査することができる。この結果、検査業務がさらに効率化することから、食中毒原因菌に感染しても症状のない被験者の検査量を増やすことができ、また、より早く健康保因者の就業を中止させることが可能となり、感染拡大予防にも寄与する。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】実施例１における、増幅曲線の図である。
【図2】実施例２における、増幅曲線の図である。
【図3】実施例３における、増幅曲線の図である。
【図4】実施例３における、増幅曲線の図である。
【図5】実施例４における、増幅曲線の図である。
【発明を実施するための形態】
【0018】
以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明についてさらに詳説する。
【0019】
本発明の一態様は、試料中のサルモネラ菌、腸管出血性大腸菌、赤痢菌の同時検出方法であって、検便検査等の糞便試料から、７５℃から１００℃、より好ましくは８５℃から９５℃で３０秒から２０分、さらに好ましくは３分から１０分の熱処理を行い、食中毒原因菌を不活化させた検体をＰＣＲ反応液に供する。
【0020】
さらに、多検体の検査が必要な場合は、検便検体としてプール検体を用いることがより好ましい。ＰＣＲに用いる検便検体の添加割合は、適切にＰＣＲが行われればよく、特に限定されないが、例えば、１～２０ｖ／ｖ％の範囲内で適宜調整することができる。本発明において、プール検体とは、Ｘ種（Ｘは２以上の整数を示す。）の便から採取された検便検体からなるものである。
【0021】
ここでＸ種の便とは、Ｘ種の個体が排泄したそれぞれの便であってもよいし、同一個体が排泄したＸ種の便であってもよい。Ｘについては、特に限定されないが、Ｘが１０以上、好ましくはＸが２０以上、より好ましくは３０以上である。
【0022】
本発明では偽陰性発生を防止させるためにインターナルコントロール（内部標準）を含むことがより好ましい。陰性の場合、インターナルコントロール（内部標準）の増幅のみが認められ、ＰＣＲが成功したことを確認することができる。一方、ＰＣＲの阻害や試薬の添加忘れが発生した場合は、インターナルコントロール（内部標準）の増幅が認められないため、ＰＣＲが失敗したことが確認できる。
【0023】
インターナルコントロール（内部標準）として、検査対象に含まれないターゲットとそのターゲットを増幅するためのプライマーセットを用いればよい。また、インターナルコントロール用にプライマーを別に添加せず、サルモネラ菌、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌増幅用プライマーを用いて増幅した場合に３菌種とは異なる増幅領域を持つテンプレートのみを添加し、インターナルコントロール（内部標準）としてもよい。
【0024】
本発明における好ましいＰＣＲ反応時間は、１時間以内、好ましくは５０分以内、さらに好ましくは４０分以内である。
【0025】
本発明に用いられるＰＣＲ反応液には、緩衝剤、適当な塩、マグネシウム塩又はマンガン塩、デオキシヌクレオチド三リン酸、検出対象の食中毒細菌の検出対象領域および内部標準遺伝子に対応するプライマーセット及び蛍光プローブ、さらに必要に応じて添加剤を含んでいてもよい。
【0026】
本発明に用いられるプライマーとして、配列番号１から１４に示す塩基配列を含むプライマーが挙げられるが、特に限定されない。本発明には１５塩基から３０塩基、好ましくは１８塩基から２５塩基のプライマーが用いられる。必要であれば、配列表記載の塩基配列の相補鎖を用いてもよい。また、変異に対応するために、配列番号１から１４に示す配列に数塩基の置換が含まれていてもよい。ここでいう数塩基とは、５塩基以下であることが好ましい。さらに、ターゲットとする核酸が亜型からなる場合、縮重プライマーを含んでもよい。
【0027】
本発明に用いるプライマー濃度は限定されず、適宜調整すればよい。本発明の各プライマーは、０．０５μＭから２μＭ、好ましくは０．１μＭから１μＭの濃度で用いられる。全プライマーの合計濃度は特に限定されないが、０．１μＭから２０μＭ、好ましくは０．２μＭから１０μＭである。
【0028】
本発明に用いられるプライマーセットとしては、配列番号１から１４に示す塩基配列を含むプライマーから、各検出遺伝子に応じた２つ以上のプライマーを用いたプライマーセットを用いることができるが、特に限定されない。一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である２種一対のプライマーが使用できる。また、一方のプライマーと対となる他方のプライマーが２つ以上含まれていてもよい。
【0029】
本発明に用いられる蛍光プローブとしては、配列番号１５から１８に示す塩基配列を含む蛍光プローブが挙げられるが特に限定されない。本発明には１５塩基から３０塩基、好ましくは１８塩基から２５塩基の蛍光プローブが用いられる。変異に対応するために、配列番号１５から１８に示す塩基配列に数塩基の置換が含まれていてもよい。ここでいう数塩基とは、５塩基以下であることが好ましい。さらに、ターゲットとする核酸が亜型からなる場合、縮重プローブを含んでもよい。
【0030】
本発明の蛍光プローブに用いられる蛍光色素としては、特に限定されないが、例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）加水分解プローブ（米国特許第５，２１０，０１５号公報、米国特許第５，５３８，８４８号公報、米国特許第５，４８７，９７２号公報、米国特許第５，８０４，３７５号公報）が挙げられる。好ましい様態として、内部標準遺伝子検出用蛍光プローブの蛍光波長と、食中毒原因菌検出用蛍光プローブの蛍光波長が重ならず、別なチャンネルで検出できることである。さらに好ましくは、内部標準遺伝子検出用蛍光プローブの蛍光波長と、サルモネラ菌、腸管出血性大腸菌、赤痢菌の各検出用蛍光プローブの蛍光波長が重ならないよう蛍光色素を選択する。
【0031】
本発明に用いる蛍光プローブ濃度は限定されず、適宜調整すればよいが、蛍光強度が高い蛍光波長のプローブ比を下げ、蛍光強度が低い蛍光波長のプローブ比を上げることで、ピークのバランスを揃えることが好ましい。好ましい各蛍光プローブ濃度は０．０３μＭから０．５μＭであり、さらに好ましくは０．０５μＭから０．３μＭである。
【0032】
前記ＰＣＲ反応液に含まれるウシ血清アルブミンとしては、好ましくは少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌ以上、より好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｍｌ以上である。夾雑物の多い試料では、ウシ血清アルブミンの濃度が好ましくは２ｍｇ／ｍｌ以上、さらに好ましくは３ｍｇ／ｍｇ以上で、良好な検出が可能となる。
【0033】
本発明で使用される緩衝剤としては、特に限定されないが、トリス（Ｔｒｉｓ），トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ），ビスートリシン（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｃｉｎｅ），ビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）などが挙げられる。硫酸、塩酸、酢酸、リン酸などでｐＨを６～１０、より好ましくはｐＨ８～９に調整されたものである。また、添加する緩衝剤の濃度としては、１０～２００ｍＭ，より好ましくは２０～１５０ｍＭで使用される。この際、反応に適当なイオン条件とするために、塩溶液が加えられる。塩溶液としては、塩化カリウム、酢酸カリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウムなどが加えられる。
【0034】
この反応液には、さらにｄＮＴＰ、マグネシウム塩またはマンガン塩、プライマーなどが含まれる。ｄＮＴＰとしては、ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰがそれぞれ０．１～０．５ｍＭ、最も一般的には０．２ｍＭ程度加えられる。ｄＴＴＰの代わり及び／又は一部としてｄＵＴＰを使用することによって、クロスコンタミネーションの予防処置をとってもよい。マグネシウム塩としては、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウム、マンガン塩としては、塩化マンガン、硫酸マンガン、酢酸マンガンなどが例示され、１～１０ｍＭ程度加えられることが好ましい。
【0035】
ＰＣＲ反応液に含まれるＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔａｑ、Ｔｔｈ，Ｂｓｔ，ＫＯＤ，Ｐｆｕ，Ｐｗｏ、Ｔｂｒ，Ｔｆｉ，Ｔｆｌ，Ｔｍａ，Ｔｎｅ、Ｖｅｎｔ，ＤＥＥＰＶＥＮＴや、これらの変異体が挙げられるが、特に限定されない。より好ましくは、Ｔａｑ、Ｔｔｈ又はこれらの変異体の使用である。さらに、非特異的反応抑制の効果を高めるため、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体との併用、あるいは化学修飾により熱不安定ブロック基のＤＮＡポリメラーゼへ導入することで、逆転写反応の間、ＤＮＡポリメラーゼの酵素活性を抑制され、ホットスタートＰＣＲへの適用ができることが好ましい。
【実施例】
【0036】
以下、実施例をもって本発明を具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【0037】
実施例１ プール糞便からのサルモネラ菌、腸管出血性大腸菌、赤痢菌の迅速検出（１）
・ 糞便懸濁処理液の調製
ヒト糞便検体を１０％（重量％）となるように懸濁した検体を、等量ずつ５０検体混合し、プール糞便を作製した。このプール糞便を９５℃で１０分間熱処理し、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心した。この上清に各食中毒原因菌ＤＮＡを添加し、試料として使用した。
・ 糞便懸濁処理液の調製
ヒト糞便検体を１０％（重量％）となるように懸濁した検体を、等量ずつ５０検体混合し、プール糞便を作製した。このプール糞便を９５℃で１０分間熱処理し、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心した。この上清に各食中毒原因菌ＤＮＡを添加し、試料として使用した。
【0038】
（２） 反応液の調製
以下に示す組成のＰＣＲ反応液を作製し、試料からの食中毒原因菌の検出を行った。
１ｘＢｕｆｆｅｒ （Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑ（登録商標）添付バッファー（東洋紡））
３ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ
各０．２ｍＭ ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ
１％ゼラチン
０．１ｕｎｉｔ／μｌ ｒＴｔｈ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．０２μｇ／μｌ 抗Ｔｔｈ抗体
プライマー液 （表１）
プローブ液 （表１）
以下に示す組成のＰＣＲ反応液を作製し、試料からの食中毒原因菌の検出を行った。
１ｘＢｕｆｆｅｒ （Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑ（登録商標）添付バッファー（東洋紡））
３ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ
各０．２ｍＭ ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ
１％ゼラチン
０．１ｕｎｉｔ／μｌ ｒＴｔｈ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．０２μｇ／μｌ 抗Ｔｔｈ抗体
プライマー液 （表１）
プローブ液 （表１）
【0039】
【表1】
【0040】
（３）反応
前記反応液１８μｌを、（１）で調製した各試料２μｌに添加した。これを以下の温度サイクルで反応した。６３℃の伸長ステップで蛍光値の読取を行った。
９４℃ ２０秒、
９４℃ ２秒－６３℃ ５秒 １０サイクル
９４℃ ２秒－６３℃ ５秒 ３５サイクル（蛍光値の読み取り）
サルモネラ菌をＣｙ５チャンネル、腸管出血性大腸菌をＲＯＸチャンネル、赤痢菌をＨＥＸチャンネル、内部標準遺伝子をＦＡＭチャンネルでそれぞれ検出した。
前記反応液１８μｌを、（１）で調製した各試料２μｌに添加した。これを以下の温度サイクルで反応した。６３℃の伸長ステップで蛍光値の読取を行った。
９４℃ ２０秒、
９４℃ ２秒－６３℃ ５秒 １０サイクル
９４℃ ２秒－６３℃ ５秒 ３５サイクル（蛍光値の読み取り）
サルモネラ菌をＣｙ５チャンネル、腸管出血性大腸菌をＲＯＸチャンネル、赤痢菌をＨＥＸチャンネル、内部標準遺伝子をＦＡＭチャンネルでそれぞれ検出した。
【0041】
（４）結果
上記ＰＣＲ反応時間は３８分であった。増幅曲線を図１に示す。サルモネラ菌、腸管出血性大腸菌、赤痢菌の各遺伝子を同時に検出することができた。
上記ＰＣＲ反応時間は３８分であった。増幅曲線を図１に示す。サルモネラ菌、腸管出血性大腸菌、赤痢菌の各遺伝子を同時に検出することができた。
【0042】
実施例２ プール糞便からのサルモネラ菌、腸管出血性大腸菌、赤痢菌の迅速検出（２）
（１）反応液の調製
ヒト糞便検体を１０％（重量％）となるように懸濁した検体を、等量ずつ５０検体混合し、プール糞便を作製した。このプール糞便を９５℃で１０分間熱処理し、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心した。この上清に各食中毒原因菌ＤＮＡを添加し、試料として使用した。
（１）反応液の調製
ヒト糞便検体を１０％（重量％）となるように懸濁した検体を、等量ずつ５０検体混合し、プール糞便を作製した。このプール糞便を９５℃で１０分間熱処理し、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心した。この上清に各食中毒原因菌ＤＮＡを添加し、試料として使用した。
【0043】
（２） 反応液の調製
以下に示す組成のＰＣＲ反応液を作製し、試料からの食中毒原因菌の検出を行った。
１ｘＢｕｆｆｅｒ （Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑ（登録商標）添付バッファー（東洋紡））
３ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ
各０．２ｍＭ ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ
１％ゼラチン
０．１ｕｎｉｔ／μｌ ｒＴｔｈ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．０２μｇ／μｌ 抗Ｔｔｈ抗体
プライマー液 （表２）
プローブ液 （表２）
以下に示す組成のＰＣＲ反応液を作製し、試料からの食中毒原因菌の検出を行った。
１ｘＢｕｆｆｅｒ （Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑ（登録商標）添付バッファー（東洋紡））
３ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ
各０．２ｍＭ ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ
１％ゼラチン
０．１ｕｎｉｔ／μｌ ｒＴｔｈ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．０２μｇ／μｌ 抗Ｔｔｈ抗体
プライマー液 （表２）
プローブ液 （表２）
【0044】
【表2】
【0045】
（３）反応
前記反応液１８μｌを、（１）で調製した各試料２μｌに添加した。これを以下の温度サイクルで反応した。
９４℃ ２０秒、
９４℃ ２秒－６３℃ ５秒 １０サイクル
９４℃ ２秒－６３℃ ５秒 ３５サイクル（蛍光値の読み取り）
サルモネラ菌をＣｙ５チャネンル、腸管出血性大腸菌をＦＡＭチャンネル、赤痢菌をＨＥＸチャンネル、内部標準遺伝子をＲＯＸチャンネルでそれぞれ検出した。
前記反応液１８μｌを、（１）で調製した各試料２μｌに添加した。これを以下の温度サイクルで反応した。
９４℃ ２０秒、
９４℃ ２秒－６３℃ ５秒 １０サイクル
９４℃ ２秒－６３℃ ５秒 ３５サイクル（蛍光値の読み取り）
サルモネラ菌をＣｙ５チャネンル、腸管出血性大腸菌をＦＡＭチャンネル、赤痢菌をＨＥＸチャンネル、内部標準遺伝子をＲＯＸチャンネルでそれぞれ検出した。
【0046】
（４）結果
上記ＰＣＲ反応時間は３８分であった。増幅曲線を図２に示す。この結果、サルモネラ菌、腸管出血性大腸菌、赤痢菌の各遺伝子を同時に検出できた。
上記ＰＣＲ反応時間は３８分であった。増幅曲線を図２に示す。この結果、サルモネラ菌、腸管出血性大腸菌、赤痢菌の各遺伝子を同時に検出できた。
【0047】
実施例３ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の効果の検討
（１）反応液の調製
ヒト糞便検体を１０％（重量％）となるように懸濁した検体を、等量ずつ５０検体混合し、プール糞便を作製した。このプール糞便を９５℃で１０分間熱処理し、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心した。この上清にサルモネラ菌ＤＮＡを添加し、試料として使用した。
（１）反応液の調製
ヒト糞便検体を１０％（重量％）となるように懸濁した検体を、等量ずつ５０検体混合し、プール糞便を作製した。このプール糞便を９５℃で１０分間熱処理し、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心した。この上清にサルモネラ菌ＤＮＡを添加し、試料として使用した。
【0048】
（２） 反応液の調製
（２－１）反応液
以下に示す組成のＰＣＲ反応液を作製し、試料からのサルモネラ菌の検出を行った。
１ｘＢｕｆｆｅｒ （Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑ（登録商標）添付バッファー（東洋紡））
各０．２ｍＭ ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ
１％ゼラチン
０．１ｕｎｉｔ／μｌ ｒＴｔｈ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．０２μｇ／μｌ 抗Ｔｔｈ抗体
プライマー液 （表１）
プローブ液 （表１）
（２－２）添加剤の条件
条件１ ＢＳＡなし
条件２ １ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ
条件３ ３ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ
（３）反応
前記反応液１８μｌを、（１）で調製した各試料２μｌに添加した。これを以下の温度サイクルで反応した。
９４℃ ２０秒、
９４℃ ２秒－６３℃ ５秒 １０サイクル
９４℃ ２秒－６３℃ ５秒 ３５サイクル（蛍光値の読み取り）
（２－１）反応液
以下に示す組成のＰＣＲ反応液を作製し、試料からのサルモネラ菌の検出を行った。
１ｘＢｕｆｆｅｒ （Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑ（登録商標）添付バッファー（東洋紡））
各０．２ｍＭ ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ
１％ゼラチン
０．１ｕｎｉｔ／μｌ ｒＴｔｈ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．０２μｇ／μｌ 抗Ｔｔｈ抗体
プライマー液 （表１）
プローブ液 （表１）
（２－２）添加剤の条件
条件１ ＢＳＡなし
条件２ １ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ
条件３ ３ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ
（３）反応
前記反応液１８μｌを、（１）で調製した各試料２μｌに添加した。これを以下の温度サイクルで反応した。
９４℃ ２０秒、
９４℃ ２秒－６３℃ ５秒 １０サイクル
９４℃ ２秒－６３℃ ５秒 ３５サイクル（蛍光値の読み取り）
【0049】
（４）結果
増幅曲線を図３及び図４に示す。図３ではＢＳＡを添加していない条件１と比較して、条件２及び条件３とＢＳＡの添加量に従ってＣｑ値が改善している様子がわかる。また、図４ではＢＳＡの添加量に従って蛍光強度が改善していることがわかる。
増幅曲線を図３及び図４に示す。図３ではＢＳＡを添加していない条件１と比較して、条件２及び条件３とＢＳＡの添加量に従ってＣｑ値が改善している様子がわかる。また、図４ではＢＳＡの添加量に従って蛍光強度が改善していることがわかる。
【0050】
実施例４ 複数菌種の同時検出
（１） 反応液の調製
以下に示す組成のＰＣＲ反応液を作成し、試料からの食中毒原因菌の検出を行った。
１ｘＢｕｆｆｅｒ （Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑ（登録商標）添付バッファー（東洋紡））
３ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ
各０．２ｍＭ ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ
１％ゼラチン
０．１ｕｎｉｔ／μｌ ｒＴｔｈ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．０２μｇ／μｌ 抗Ｔｔｈ抗体
プライマー液 （表１）
プローブ液 （表１）
（１） 反応液の調製
以下に示す組成のＰＣＲ反応液を作成し、試料からの食中毒原因菌の検出を行った。
１ｘＢｕｆｆｅｒ （Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑ（登録商標）添付バッファー（東洋紡））
３ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ
各０．２ｍＭ ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ
１％ゼラチン
０．１ｕｎｉｔ／μｌ ｒＴｔｈ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）
０．０２μｇ／μｌ 抗Ｔｔｈ抗体
プライマー液 （表１）
プローブ液 （表１）
【0051】
（２）反応
前記反応液１６μｌに、サルモネラ菌、腸管出血性大腸菌、赤痢菌から選ばれる２種の菌のＤＮＡを、それぞれを１０００コピー、１０コピー、各２μｌずつ添加した。これを以下の温度サイクルで反応した。６３℃の伸長ステップで蛍光値の読取を行った。
９４℃ ２０秒、
９４℃ ２秒－６３℃ ５秒 １０サイクル
９４℃ ２秒－６３℃ ５秒 ３５サイクル（蛍光値の読み取り）
サルモネラ菌をＣｙ５チャンネル、腸管出血性大腸菌をＲＯＸチャンネル、赤痢菌をＨＥＸチャンネル、内部標準遺伝子をＦＡＭチャンネルでそれぞれ検出した。
前記反応液１６μｌに、サルモネラ菌、腸管出血性大腸菌、赤痢菌から選ばれる２種の菌のＤＮＡを、それぞれを１０００コピー、１０コピー、各２μｌずつ添加した。これを以下の温度サイクルで反応した。６３℃の伸長ステップで蛍光値の読取を行った。
９４℃ ２０秒、
９４℃ ２秒－６３℃ ５秒 １０サイクル
９４℃ ２秒－６３℃ ５秒 ３５サイクル（蛍光値の読み取り）
サルモネラ菌をＣｙ５チャンネル、腸管出血性大腸菌をＲＯＸチャンネル、赤痢菌をＨＥＸチャンネル、内部標準遺伝子をＦＡＭチャンネルでそれぞれ検出した。
【0052】
（３）結果
増幅曲線を図５に示す。この結果、すべての組み合わせにおいて１０００コピーと１０コピーを同時に、且つ蛍光波長の違いによって分離して検出することが確認できた。
増幅曲線を図５に示す。この結果、すべての組み合わせにおいて１０００コピーと１０コピーを同時に、且つ蛍光波長の違いによって分離して検出することが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【0053】
本発明は、遺伝子診断、臨床診断といった法医学分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等において、特に多数のサンプルを迅速に検査することが求められている分野において非常に有用である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】