特許 6996825 修飾ＣκおよびＣＨ１ドメイン

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2021-12-20

(45)【発行日】2022-01-17

(54)【発明の名称】修飾ＣκおよびＣＨ１ドメイン

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/00 20060101AFI20220107BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20220107BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20220107BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20220107BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20220107BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220107BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20220107BHJP

【ＦＩ】

C07K16/00

C12N15/13

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A61K39/395 N

【請求項の数】 12

(21)【出願番号】P 2020524871

(86)(22)【出願日】2019-01-15

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2021-02-22

(86)【国際出願番号】 CN2019071740

(87)【国際公開番号】W WO2019137552

(87)【国際公開日】2019-07-18

【審査請求日】2020-07-07

(31)【優先権主張番号】PCT/CN2018/072564

(32)【優先日】2018-01-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】519441109

【氏名又は名称】アイ－エムエービー バイオファーマ ユーエス リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000877

【氏名又は名称】龍華国際特許業務法人

(72)【発明者】

【氏名】ワン、ヨンチアン

(72)【発明者】

【氏名】ファン、レイ

(72)【発明者】

【氏名】ワン、ゼンイ

(72)【発明者】

【氏名】グオ、ビンシ

(72)【発明者】

【氏名】ザン、ジンウ

【審査官】白井 美香保

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１４－５２２６４４（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１７／０５５５３７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２００９－５４１２７５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１７－５２１３６１（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１７／１６２８９０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】Molecular Immunology，1986年，Vol.23, No.9，p.951-960

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｋ１／００－１９／００

Ｃ１２Ｎ１５／００－１５／９０

ＣＡＰＬＵＳ／ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

抗体またはその抗原結合断片であって、
置換体Ｌ１１Ｗを含む第１のヒトＣＨ１断片と、
置換体Ｖ２６Ｗを含む第１のヒトＣκ断片と
置換体Ｌ１１Ｗを含まない第２のヒトＣＨ１断片と、
置換体Ｖ２６Ｗを含まない第２のヒトＣκ断片と
を備え、
前記抗体またはその抗原結合断片は、クラスＩｇＧである、
抗体またはその抗原結合断片。

【請求項2】

前記第１のヒトＣＨ１断片が置換体Ｌ１１Ｗおよび置換体Ｋ１０１Ｅを含み、
前記第１のヒトＣκ断片が置換体Ｖ２６Ｗおよび置換体Ｄ１５Ｋ／Ｈを含む、
請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項3】

前記第１のヒトＣＨ１断片が置換体Ｌ１１Ｗおよび置換体Ｋ９６Ｄを含み、
前記第１のヒトＣκ断片が置換体Ｖ２６Ｗおよび置換体Ｅ１６Ｒを含む、
請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項4】

前記第１のヒトＣＨ１断片が置換体Ｌ１１Ｗおよび置換体Ｋ９６Ｅを含み、
前記第１のヒトＣκ断片が置換体Ｖ２６Ｗおよび置換体Ｅ１６Ｋを含む、
請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項5】

前記第１のヒトＣＨ１断片が置換体Ｌ１１Ｗおよび置換体Ｋ９６Ｅを含み、
前記第１のヒトＣκ断片が置換体Ｖ２６Ｗおよび置換体Ｅ１６Ｒを含む、
請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項6】

前記第２のヒトＣＨ１断片および前記第２のヒトＣκ断片が野生型である、
請求項１から５のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項7】

重鎖可変領域、軽鎖可変領域、Ｆｃ領域、またはそれらの組み合わせをさらに備える、
請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項8】

アイソタイプがＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である、
請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項9】

第１のＣＨ１／Ｃκ対と第２のＣＨ１／Ｃκ対とを備える二重特異性抗体であって、
前記第１のＣＨ１／Ｃκ対のＣＨ１断片およびＣκ断片は、ＣＨ１におけるアミノ酸置換体Ｌ１１ＷおよびＣκにおけるアミノ酸置換体Ｖ２６Ｗを含み、
前記第２のＣＨ１／Ｃκ対のＣＨ１断片およびＣκ断片は、アミノ酸置換体Ｌ１１Ｗおよびアミノ酸置換体Ｖ２６Ｗを含まない、
二重特異性抗体。

【請求項10】

前記第１のＣＨ１／Ｃκ対の前記ＣＨ１断片およびＣκ断片が、
（ａ）ＣＨ１におけるＫ１０１ＥおよびＣκにおけるＤ１５Ｋ／Ｈ、
（ｂ）ＣＨ１におけるＫ９６ＤおよびＣκにおけるＥ１６Ｒ、ならびに
（ｃ）ＣＨ１におけるＫ９６ＥおよびＣκにおけるＥ１６Ｋ
からなる群から選択される置換体をさらに含み、
前記第２のＣＨ１／Ｃκ対の前記ＣＨ１断片およびＣκ断片は、（ａ）から（ｃ）の前記置換体を含まない、
請求項９に記載の二重特異性抗体。

【請求項11】

請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片、および
医薬上許容し得る担体
を備える、
組成物。

【請求項12】

請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする１または複数のポリヌクレオチドを備える、
単離された細胞。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

二重特異性モノクローナル抗体（ＢｓＭＡｂ、ＢｓＡｂ）は、２つの異なるタイプの抗原または同じ抗原の２つの異なるエピトープに同時に結合できる人工タンパク質である。ＢｓＡｂはいくつかの構造形式で製造され得、癌免疫療法と薬剤送達において現在の応用が探究されてきた。

【0002】

ＢｓＡｂには多くの形式がある。ＩｇＧのようなＢｓＡｂは、２つのＦａｂ部位が異なる抗原に結合する以外は、２つのＦａｂアームと１つのＦｃ領域の従来のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）構造を保持する。最も一般的なタイプは、抗体に３つの固有の結合部位：２つのＦａｂ領域とＦｃ領域とを有するため、三官能性抗体と称される。重鎖と軽鎖の各対は、固有のｍＡｂからのものである。２つの重鎖からできたＦｃ領域は、第３の結合部位を形成する。これらのＢｓＡｂは、多くの場合、クアドローマまたはハイブリッドハイブリドーマ法で製造される。

【0003】

ただし、クアドローマ法は、使用可能なＢｓＡｂを形成するのに偶然に依存するため、効率が悪い場合がある。ＩｇＧのようなＢｓＡｂを製造する別の方法は「ｋｎｏｂｓ ｉｎｔｏ ｈｏｌｅｓ」と称され、１つのｍＡｂから重鎖の大きいアミノ酸の変異を導入し、他のｍＡｂの重鎖の小さいアミノ酸の変異を導入することに依存する。これにより、ターゲットの重鎖（およびそれらの対応する軽鎖）がより適切に適合し、ＢｓＡｂ生成の信頼性が向上する。

【0004】

このｋｎｏｂ ｉｎｔｏ ｈｏｌｅｓ法により、重鎖ホモ二量体化の問題は解決するが、２つの異なる抗体の軽鎖と重鎖との間の誤対合に関する問題の対処にはならなかった。より簡単に調製でき、より優れた臨床的安定性および有効性を有する、より優れたＢｓＡｂを提供する必要がある。

【発明の概要】

【0005】

本開示は、ＣκドメインとＣＨ１ドメインとの対合はまだ可能であるが、非修飾野生型ＣＨ１ドメインとＣκドメインとの対合が減少した、修飾ＣκおよびＣＨ１ドメインを持つ抗体および抗原結合断片を提供する。このような修飾は、ＣκドメインとＣＨ１ドメインとの２つの異なる対を持つ二重特異性抗体の調製に特に有用であり得る。

【0006】

実験例に示すように、重要な界面残基として２つのアミノ酸基が特定された。これらの界面残基は、変更すると、適切な修飾を行ってこのような界面を再建しない限り、ＣκドメインとＣＨ１ドメインとの対合を減少させ得る、または破壊さえさせ得る。

【0007】

そのような基の１つには、ＣκドメインのＶａｌ２６（Ｋａｂａｔ番号：Ｖａｌ１３３）およびＰｈｅ１１（Ｋａｂａｔ番号：Ｐｈｅ１１８）、ならびにＣＨ１ドメインのＬｅｕ１１（Ｋａｂａｔ番号：Ｌｅｕ１２４）が含まれる。例えば、これらのアミノ酸の１つがＡｌａで置換されると、Ｃκ／ＣＨ１対合が破壊され得る。別の例の基には、ＣκのＧｌｎ１７（Ｋａｂａｔ番号：１２４）とＣＨ１のＰｈｅ９（Ｋａｂａｔ番号：１２２）が含まれる。

【0008】

ただし、これらの界面残基での特定の変異により対合が復元され得、これは、例においても示されている。そのような例の１つは、Ｖａｌ２６Ｔｒｐ（Ｃκ）とＬｅｕ１１Ｔｒｐ（ＣＨ１）である。さらなる例を、表１および表２に示す。

【0009】

一実施形態では、Ｌ１１Ｗ置換体を含むヒトＣＨ１断片と、Ｖ２６Ｗ置換体を含むヒトＣκ断片とを備える抗体またはその抗原結合断片が提供される。そのような抗体または断片は、野生型パートナへの結合をさらに低減する、および／または置換された断片間の結合を増強する追加の置換体を任意に含み得る。

【0010】

例えば、置換体の追加の対は、ＣＨ１のＫ１０１ＥとＣκのＤ１５ＫまたはＤ１５Ｈ（Ｄ１５Ｋ／Ｈ）であり得る。置換体の別の対は、ＣＨ１のＫ９６ＤとＣκのＥ１６Ｒである。さらに別の対の例は、ＣＨ１のＫ９６ＥとＣκのＥ１６Ｋである。したがって、いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片が提供され、ここで、ＣＨ１断片が置換体Ｌ１１ＷおよびＫ１０１Ｅを含み、Ｃκ断片が置換体Ｖ２６ＷおよびＤ１５Ｋ／Ｈを含む；ＣＨ１断片が置換体Ｌ１１ＷおよびＫ９６Ｄを含み、Ｃκ断片が置換体Ｖ２６ＷおよびＥ１６Ｒを含む；ＣＨ１断片が置換体Ｌ１１ＷおよびＫ９６Ｅを含み、Ｃκ断片が置換体Ｖ２６ＷおよびＥ１６Ｋを含む；または、ＣＨ１断片が置換体Ｌ１１ＷおよびＫ９６Ｅを含み、Ｃκ断片が置換体Ｖ２６ＷおよびＥ１６Ｒを含む。

【0011】

一実施形態では、Ｃκ／ＣＨ１対を備える抗体またはその抗原結合断片が提供され、ＣκおよびＣＨ１断片は、（ａ）Ｃκの２６ＷとＣＨ１の１１Ｋおよび２８Ｎ；（ｂ）Ｃκの１１Ｗおよび２６ＧとＣＨ１の１１Ｗ；（ｃ）Ｃκの２６ＷとＣＨ１の１１Ｗ；（ｄ）Ｃκの１７ＲとＣＨ１の９Ｄ；（ｅ）Ｃκの１７ＫとＣＨ１の９Ｄ；ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸残基を含む。

【0012】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、第２のＣκ／ＣＨ１対をさらに備える。第２のＣκ／ＣＨ１対は、野生型であり得るまたは変異基を有し得る。変異基は、第１のＣκ／ＣＨ１対と同じであってよいが、対の間で不整合が発生しないように異なっていることが好ましい。

【0013】

本開示の別の実施形態は、Ｖ２６位および／またはＦ１１位にアミノ酸修飾を含むＣκドメインと、Ｌｅｕ１１位にアミノ酸修飾を含むＣＨ１ドメインとを備える抗体またはその抗原結合断片を提供するものであり、ＣκドメインがＣＨ１ドメインと対合すると、修飾アミノ酸が相互作用する。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片が提供され、Ｃκドメインは野生型ＣＨ１ドメインと相互作用せず、ＣＨ１ドメインは野生型Ｃκドメインと相互作用しない。いくつかの実施形態では、修飾アミノ酸は表１から選択される。

【0014】

別の実施形態は、Ｑ１７位にアミノ酸修飾を含むＣκドメインと、Ｆ９位にアミノ酸修飾を含むＣＨ１ドメインとを備える抗体またはその抗原結合断片を提供するものであり、ＣκドメインがＣＨ１ドメインと対合すると、修飾アミノ酸が相互作用する。いくつかの実施形態では、Ｃκドメインは野生型ＣＨ１ドメインと相互作用せず、ＣＨ１ドメインは野生型Ｃκドメインと相互作用しない。いくつかの実施形態では、修飾アミノ酸は、表２から選択される。

【0015】

また、いくつかの実施形態では、第１のＣκ／ＣＨ１対および第２のＣκ／ＣＨ１対を備える二重特異性抗体が提供され、第１の対のＣκおよびＣＨ１断片は、（ａ）Ｃκの２６ＷとＣＨ１の１１Ｋおよび２８Ｎ；（ｂ）Ｃκの１１Ｗおよび２６ＧとＣＨ１の１１Ｗ；（ｃ）Ｃκの２６ＷとＣＨ１の１１Ｗ；（ｄ）Ｃκの１７ＲとＣＨ１の９Ｄ；（ｅ）Ｃκの１７ＫとＣＨ１の９Ｄ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸残基を含み、第２の対のＣκおよびＣＨ１断片は野生型であるか、または（ａ）から（ｅ）から選択されるアミノ酸残基の異なるセットを備える。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】ＣκドメインとＣＨ１ドメインとの対（１ＣＺ８から）の結晶構造を示し、それらの相互作用を示す図である（水素結合に関与する残基はピンク色、塩橋は黄色に着色されており、疎水性相互作用残基は青色または緑色に着色された棒状のものである）。

【0017】

【図2】ドメイン間の相互作用を維持するのに重要であり得るＣκおよびＣＨ１ドメイン内のいくつかの残基を示す図である。

【0018】

【図3】異なる相互作用のアミノ酸対におけるａｌａ／ｔｒｐ変異の還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す写真である。

【0019】

【図4A】実施例３で解析した様々な変異対の還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す写真である。

【図4B】実施例３で解析した様々な変異対の還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す写真である。

【図4C】実施例３で解析した様々な変異対の還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す写真である。

【図4D】実施例３で解析した様々な変異対の還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す写真である。

【0020】

【図5A】ＣκドメインとＣＨ１ドメイン間の結合を示す、還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す写真である。

【図5B】ＣκドメインとＣＨ１ドメイン間の結合を示す、非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す写真である。

【0021】

【図6A】一部が変異を含んでいた、抗体の重鎖と軽鎖との間の結合を示すゲル画像である。

【図6B】一部が変異を含んでいた、抗体の重鎖と軽鎖との間の結合を示すゲル画像である。

【図6C】一部が変異を含んでいた、抗体の重鎖と軽鎖との間の結合を示すゲル画像である。

【0022】

【図7A】様々な二重特異性抗体の構造を示す図である。

【図7B】様々な二重特異性抗体の構造を示す図である。

【図7C】様々な二重特異性抗体の構造を示す図である。

【図7D】様々な二重特異性抗体の構造を示す図である。

【0023】

【図8A】試験された二重特異性抗体の、それぞれの結合標的に対する結合および機能的能力を示すデータを提示する図である。

【図8B】試験された二重特異性抗体の、それぞれの結合標的に対する結合および機能的能力を示すデータを提示する図である。

【発明を実施するための形態】

【0024】

定義
「１つの（「ａ」または「ａｎ」）」のエンティティという用語は、そのエンティティの１または複数を指すことに留意されたい。例えば「１つの（「ａｎ」）抗体」は、１または複数の抗体を表すと理解される。したがって、１つ（「ａ」（または「ａｎ」））、「１または複数」および「少なくとも１つ」という用語は、本明細書では互換的に使用され得る。

【0025】

本明細書で使用する「ポリペプチド」という用語は、単数の「ポリペプチド」および複数の「ポリペプチド」を包含することを意図しており、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）によって直線的に連結されたモノマー（アミノ酸）から構成される分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、２つ以上のアミノ酸のいずれかの１または複数の鎖を指すものであり、生成物の特定の長さを指すのではない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または２つ以上のアミノ酸の１または複数の鎖を指すのに使用されるその他いずれかの用語は「ポリペプチド」の定義に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらのいずれかの用語の代わりに、またはこれらのいずれかの用語と互換的に使用され得る。用語「ポリペプチド」はまた、限定されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解的切断、または非自然発生アミノ酸による修飾を含む、ポリペプチドの発現後修飾の生成物を指すことを意図している。ポリペプチドは、天然の生物源に由来し得るか、または組換え技術によって生成され得るが、指定された核酸配列から必ずしも翻訳されるとは限らない。ポリペプチドは、化学合成を含む任意の方法で生成され得る。

【0026】

細胞、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸に関して本明細書で使用する「単離された」という用語は、高分子の天然源に存在する、それぞれ他のＤＮＡまたはＲＮＡから分離された分子を指す。本明細書で使用される「単離された」という用語はまた、組換えＤＮＡ技術により生成される場合、細胞物質、ウイルス物質、または培地を実質的に含まない核酸またはペプチド、または化学合成される場合、化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない核酸またはペプチドを指す。さらに、「単離された核酸」は、断片として自然発生せず、天然の状態では見られないであろう核酸断片を含むことを意味する。「単離された」という用語はまた、本明細書において、他の細胞タンパク質または組織から単離された細胞またはポリペプチドを指すのに使用される。単離されたポリペプチドは、精製されたポリペプチドと組換えポリペプチドの両方を包含することを意味する。

【0027】

本明細書で使用する場合、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに関連する「組換え」という用語は、天然には存在しないポリペプチドまたはポリヌクレオチドの形態を意図しており、その非限定的な例は、通常は一緒に発生しないポリヌクレオチドまたはポリペプチドを組み合わせることによって作成され得る。

【0028】

「相同性」または「同一性」または「類似性」は、２つのペプチド間または２つの核酸分子間の配列類似性を指す。相同性は、比較のために整列され得る各配列中の位置を比較することによって決定され得る。比較された配列内の位置が同じ塩基またはアミノ酸で占められている場合、分子はその位置で相同である。配列間の相同性の程度は、配列によって共有される一致する位置または相同の位置の数の関数である。「非関連」または「非相同」配列は、本開示の配列の１つと、４０％未満の同一性を共有するが、好ましくは２５％未満の同一性を共有する。

【0029】

ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドまたはポリペプチド領域）が、別の配列に対して一定割合（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％）の「配列同一性」を有することは、整列した場合に、２つの配列の比較において塩基（またはアミノ酸）の割合が同じであることを意味する。この整列および割合の相同性または配列同一性は、当技術分野で周知のソフトウェアプログラム、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ． （２００７） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙに記載されているものを使用して決定され得る。好ましくは、デフォルトのパラメータが整列に使用される。デフォルトのパラメータを使用する１つの整列プログラムはＢＬＡＳＴである。具体的には、プログラムはＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰであり、以下のデフォルトのパラメータ：遺伝暗号＝標準；フィルタ＝なし；ストランド＝両方；カットオフ＝６０；期待＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記述＝５０配列；並べ替え＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ；データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ翻訳＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲを使用する。生物学的に同等なポリヌクレオチドは、上記の一定割合の相同性を有し、同じまたは類似の生物学的活性を有するポリペプチドをコードするものである。

【0030】

「同等の核酸またはポリヌクレオチド」という用語は、核酸またはその補体のヌクレオチド配列とある程度の相同性または配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する核酸を指す。二本鎖核酸の相同体は、その補体とまたはその補体とある程度の相同性を有するヌクレオチド配列を有する核酸を含むことを意図する。一態様では、核酸の相同体は、核酸またはその補体にハイブリダイズすることができる。同様に、「同等のポリペプチド」は、参照ポリペプチドのアミノ酸配列と、ある程度の相同性または配列同一性を有するポリペプチドを指す。いくつかの態様では、配列同一性は、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％である。いくつかの態様では、同等のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと比較して、１、２、３、４または５つの追加、欠失、置換およびそれらの組み合わせを有する。いくつかの態様では、同等の配列は、参照配列の活性（例えば、エピトープ結合）または構造（例えば、塩橋）を保持する。

【0031】

ハイブリダイゼーション反応は、異なる「ストリンジェンシ」の条件下で行われ得る。一般に、低ストリンジェンシのハイブリダイゼーション反応は、約４０℃において約１０×ＳＳＣまたは同等のイオン強度／温度の溶液中で行われる。中程度のストリンジェンシのハイブリダイゼーションは、典型的には約５０℃において約６×ＳＳＣで行われ、高ストリンジェンシのハイブリダイゼーション反応は、一般に約６０℃において約１×ＳＳＣで行われる。ハイブリダイゼーション反応はまた、当業者に周知の「生理的条件下」でも行われ得る。生理的条件の非限定的な例は、細胞で通常見られるＭｇ^２＋の温度、イオン強度、ｐＨ、および濃度である。

【0032】

ポリヌクレオチドは、４つのヌクレオチド塩基：アデニン（Ａ）；シトシン（Ｃ）；グアニン（Ｇ）；チミン（Ｔ）；および、ポリヌクレオチドがＲＮＡの場合、チミンのウラシル（Ｕ）の特定の配列で構成されている。したがって、「ポリヌクレオチド配列」という用語は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表記である。このアルファベット表記は、中央処理装置を有するコンピュータのデータベースに入力され、ゲノム機能解析や相同性検索などのバイオインフォマティクスアプリケーションに使用され得る。「多型」という用語は、遺伝子またはその一部の複数の形態の共存を指す。少なくとも２つの異なる形態、すなわち２つの異なるヌクレオチド配列が存在する遺伝子の一部は、「遺伝子の多型領域」と称される。多型領域は単一のヌクレオチドであり得、その同一性は異なる対立遺伝子で異なる。

【0033】

「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドまたはそれらの類似体のいずれかである、任意の長さのヌクレオチドのポリマ形態を指す。ポリヌクレオチドは任意の３次元構造を有し得、既知または未知の任意の機能を実行し得る。ポリヌクレオチドの非限定的な例は以下の通りである：遺伝子または遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマ、ＥＳＴまたはＳＡＧＥタグ）、エクソン、イントロン、メッセンジャＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクタ、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマ。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などの修飾ヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリヌクレオチドの組み立ての前または後に付与することができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。ポリヌクレオチドはさらに、標識成分を用いた抱合によるなど、重合の後で修飾することができる。この用語はまた、二本鎖および一本鎖分子の両方を指す。特に指定がないまたは必要でない限り、ポリヌクレオチドである本開示の任意の実施形態は、二本鎖形態と、二本鎖形態を構成することが既知であるまたは予測される２つの相補的な一本鎖形態の各々との両方を包含する。

【0034】

ポリヌクレオチドに適用される場合の「コードする」という用語は、その本来の状態で、または当業者に周知の方法によって操作された場合に、ポリペプチドを「コードする」と言われるポリヌクレオチドを指し、それを転写および／または翻訳して、ポリペプチドおよび／またはその断片のｍＲＮＡを生成することができる。アンチセンス鎖はそのような核酸の相補物であり、コード配列はそこから推定することができる。

【0035】

本明細書で使用される場合、「抗体」または「抗原結合ポリペプチド」は、抗原を特異的に認識して結合するポリペプチドまたはポリペプチド複合体を指す。抗体は、全抗体および任意の抗原結合断片またはその単鎖であり得る。したがって、「抗体」という用語は、抗原に結合する生物学的活性を有する免疫グロブリン分子の少なくとも一部を含む任意のタンパク質またはペプチド含有分子を含む。そのような例には、重鎖または軽鎖またはそのリガンド結合部分の相補性決定領域（ＣＤＲ）、重鎖または軽鎖可変領域、重鎖または軽鎖定常領域、フレームワーク（ＦＲ）領域、またはその任意の部分、または結合タンパク質の少なくとも一部が含まれるが、これらに限定されない。

【0036】

本明細書で使用する「抗体断片」または「抗原結合断片」という用語は、Ｆ（ａｂ'）_２、Ｆ（ａｂ）_２、Ｆａｂ'、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどの抗体の一部である。構造に関係なく、抗体断片は無傷の抗体によって認識される同じ抗原と結合する。「抗体断片」という用語は、アプタマ、シュピーゲルマ、および二重特異性抗体を含む。「抗体断片」という用語はまた、特定の抗原に結合して複合体を形成することにより抗体のように作用する、任意の合成または遺伝子操作されたタンパク質を含む。

【0037】

「単鎖可変断片」または「ｓｃＦｖ」は、免疫グロブリンの重鎖（Ｖ_Ｈ）および軽鎖（Ｖ_Ｌ）の可変領域の融合タンパク質を指す。いくつかの態様では、領域は、１０から約２５アミノ酸の短いリンカーペプチドで接続されている。リンカーは、柔軟性のためにグリシン、溶解性のためにセリンまたはスレオニンを豊富に含むことができ、Ｖ_ＨのＮ末端をＶ_ＬのＣ末端に接続することも、その逆も可能である。このタンパク質は、定常領域の除去とリンカーの導入にもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持している。ＳｃＦｖ分子は当技術分野で周知であり、例えば米国特許第５，８９２，０１９号に記載されている。

【0038】

抗体という用語は、生化学的に区別することができるポリペプチドの様々な広範なクラスを包含する。当業者は、重鎖がガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）として分類され、その中にいくつかのサブクラスがある（例えば、γ１からγ４）ことを理解するであろう。この鎖の性質により、抗体の「クラス」はそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ ＩｇＧ、またはＩｇＥとして決定される。免疫グロブリンのサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＧ_５などは、十分に特徴付けられており、職能分化をもたらすことが知られている。これらのクラスおよびアイソタイプのそれぞれの修飾バージョンは、本開示を考慮して当業者に容易に識別可能であり、したがって、本開示の範囲内である。すべての免疫グロブリンクラスは明らかに本開示の範囲内にあり、以下の記述は一般に免疫グロブリン分子のＩｇＧクラスを対象とする。ＩｇＧに関して、標準的な免疫グロブリン分子は、分子量が約２３，０００ダルトンの２つの同一の軽鎖ポリペプチド、および分子量が５３，０００から７０，０００の２つの同一の重鎖ポリペプチドを含む。４本の鎖は、典型的には、「Ｙ」構成のジスルフィド結合によって接合され、軽鎖は、「Ｙ」の口から始まり、可変領域を通って続く重鎖を囲んでいる。

【0039】

本開示の抗体、抗原結合ポリペプチド、変異体、またはその誘導体には、ポリクローナル、モノクローナル、多重特異性、ヒト、ヒト化、霊長類化、またはキメラ抗体、単鎖抗体、エピトープ結合断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ'およびＦ（ａｂ'）_２、Ｆｄ、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＫまたはＶＨドメインのいずれかを含む断片、Ｆａｂ発現ライブラリによって生成された断片、および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本明細書に開示されるＬＩＧＨＴ抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）が含まれるが、これらに限定されない。本開示の免疫グロブリンまたは抗体分子は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）または免疫グロブリン分子のサブクラスであり得る。

【0040】

軽鎖は、カッパまたはラムダ（κ、λ）のいずれかに分類される。各重鎖クラスは、カッパまたはラムダ軽鎖のいずれかと結合することができる。一般に、軽鎖と重鎖は互いに共有結合し、ハイブリドーマ、Ｂ細胞または遺伝子操作された宿主細胞によって免疫グロブリンが生成されると、２つの重鎖の「テール」部分が共有ジスルフィド結合または非共有結合によって互いに結合する。重鎖では、アミノ酸配列は、Ｙ構成の分岐した端のＮ末端から各鎖の最下部のＣ末端まで続く。

【0041】

軽鎖と重鎖は両方とも、構造的および機能的相同性の領域に分けられる。「定常」および「可変」という用語は、機能的に使用される。これに関して、軽鎖（ＶＫ）および重鎖（ＶＨ）部分の両方の可変ドメインが、抗原の認識および特異性を決定することが理解されるだろう。逆に、軽鎖（ＣＫ）と重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３）の定常ドメインは、分泌、経胎盤移動性、Ｆｃ受容体結合、補体結合などの重要な生物学的特性を付与する。従来、定常領域ドメインの番号付けは、それらが抗体の抗原結合部位またはアミノ末端からより遠位になるにつれて増加する。Ｎ末端部分は可変領域、Ｃ末端部分は定常領域であり、ＣＨ３およびＣＫドメインは実際にそれぞれ重鎖および軽鎖のカルボキシ末端を含む。

【0042】

上記のように、可変領域により、抗体は抗原上のエピトープを選択的に認識し、特異的に結合することができる。つまり、抗体のＶＫドメインとＶＨドメイン、または相補性決定領域（ＣＤＲ）のサブセットが組み合わさって、３次元の抗原結合部位を画定する可変領域を形成する。この４基からなる抗体構造は、Ｙの各アームの端に存在する抗原結合部位を形成する。より具体的には、抗原結合部位は、ＶＨ鎖とＶＫ鎖のそれぞれの３つのＣＤＲ（つまり、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３）によって画定される。いくつかの例では、例えばラクダ科の種に由来するか、またはラクダ科の免疫グロブリンに基づいて操作された特定の免疫グロブリン分子では、完全な免疫グロブリン分子は重鎖のみで構成され、軽鎖は含まれない場合がある。例えば、Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３６３：４４６－４４８ （１９９３）を参照。

【0043】

自然発生の抗体では、抗体が水性環境において三次元形状を呈するため、各抗原結合ドメインに存在する６つの「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、抗原結合ドメインを形成するように特異的に配置されたアミノ酸の短い非連続配列である。「フレームワーク」領域と称される、抗原結合ドメイン内の残りのアミノ酸は、分子間変動が少ないことを示す。フレームワーク領域は主にβシート構造を採用し、ＣＤＲはループを形成して、βシート構造を接続し、場合によってはその一部を形成する。したがって、フレームワーク領域は、鎖間、非共有相互作用により、ＣＤＲを正しい方向に配置するための足場を形成するように機能する。配置されたＣＤＲによって形成される抗原結合ドメインは、免疫反応性抗原上のエピトープに相補的な表面を画定する。この相補的な表面は、その同族のエピトープへの抗体の非共有結合を促進する。ＣＤＲおよびフレームワーク領域をそれぞれ含むアミノ酸は、それらが正確に定義されているので、当業者により、任意の所与の重鎖または軽鎖可変領域について容易に特定することができる（"Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，" Ｋａｂａｔ， Ｅ．， ｅｔ ａｌ．， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， （１９８３）； ａｎｄ Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ， Ｊ． ＭｏＩ． Ｂｉｏｌ．， １９６：９０１－９１７ （１９８７）を参照）。

【0044】

当該技術分野で使用および／または許容される用語の定義が２つ以上ある場合、本明細書で使用される用語の定義は、そうでないと明確に述べられていない限り、そのような意味をすべて含むものとする。特定の例は、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）という用語の使用であり、重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内にある非隣接抗原結合部位を説明する。この特定の領域は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐｔ． ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， "Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ" （１９８３） ａｎｄ ｂｙ Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． ＭｏＩ． Ｂｉｏｌ． １９６：９０１－９１７ （１９８７）に記載されており、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａによるＣＤＲの定義には、互いに比較した場合、アミノ酸残基の重複またはサブセットが含まれる。それにもかかわらず、抗体またはその変異体のＣＤＲを指すいずれかの定義の適用は、本明細書で定義および使用される用語の範囲内であることが意図されている。上記で引用した参考文献のそれぞれによって定義されるＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基を、比較として以下の表に示す。特定のＣＤＲを包含する正確な残基数は、ＣＤＲの配列とサイズによって異なる。当業者は、抗体の可変領域アミノ酸配列が与えられれば、どの残基が特定のＣＤＲを含むかを常に決定することができる。

【表1】

【0045】

Ｋａｂａｔ等はまた、任意の抗体に適用可能な可変ドメイン配列の番号付けシステムを定義した。当業者は、配列自体を超えるいかなる実験データにも依存することなく、この「Ｋａｂａｔ番号付け」のシステムを任意の可変ドメイン配列に明確に割り当てることができる。本明細書で使用する「Ｋａｂａｔ番号付け」は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐｔ． ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， "Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ"（１９８３）に記載される番号付けシステムを指す。

【0046】

上記の表に加えて、Ｋａｂａｔ番号付けシステムでは、ＣＤＲ領域は次のように記載される。ＣＤＲ－Ｈ１は、およそアミノ酸３１（すなわち、最初のシステイン残基の後の約９の残基）で開始し、約５から７のアミノ酸を含み、次のトリプトファン残基で終了する。ＣＤＲ－Ｈ２は、ＣＤＲ－Ｈ１の終了後の１５番目の残基から開始し、約１６から１９のアミノ酸を含み、次のアルギニンまたはリジン残基で終了する。ＣＤＲ－Ｈ３は、ＣＤＲ－Ｈ２の終了後の約３３番目のアミノ酸残基から開始し、３から２５のアミノ酸を含み、配列Ｗ－Ｇ－Ｘ－Ｇで終了し、ここでＸは任意のアミノ酸である。ＣＤＲ－Ｌ１は、およそ残基２４（すなわち、システイン残基に続く）から開始し、約１０から１７の残基を含み、次のトリプトファン残基で終了する。ＣＤＲ－Ｌ２は、ＣＤＲ－Ｌ１の終了後の約１６番目の残基から開始し、約７の残基を含む。ＣＤＲ－Ｌ３は、ＣＤＲ－Ｌ２の終了後（すなわち、システイン残基に続く）約３３番目の残基から開始し、約７から１１の残基を含み、配列ＦまたはＷ－Ｇ－Ｘ－Ｇで終了し、ここでＸは任意のアミノ酸である。

【0047】

他のいくつかの番号付けシステムには、「ＩＭＧＴ番号付け」と「ＩＭＧＴエクソン番号付け」が含まれる。例えば、定数ドメインＣＨ１とＣκの場合、次の表に、ＩＭＧＴエクソン番号付けシステムとＫａｂａｔ番号付けシステムの相関関係を示す。
ＣＨ１のＩＭＧＴエクソン番号付けおよびＫａｂａｔ番号付け

【表2】

ＣκのＩＭＧＴエクソン番号付けおよびＫａｂａｔ番号付け

【表3】

【0048】

本明細書に開示の抗体は、鳥および哺乳動物を含む任意の動物起源に由来し得る。好ましくは、抗体は、ヒト、マウス、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ウマ、またはニワトリの抗体である。別の実施形態では、可変領域は、起源が（例えば、サメ由来の）コンドリクトイド（ｃｏｎｄｒｉｃｔｈｏｉｄ）であり得る。

【0049】

本明細書で使用する「重鎖定常領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖に由来するアミノ酸配列を含む。重鎖定常領域を含むポリペプチドは、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ（例えば、上部、中間、および／または下部ヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはそれらの変異体または断片の少なくとも１つを含む。例えば、本開示で使用するための抗原結合ポリペプチドは、ＣＨ１ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、およびＣＨ２ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、およびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖、またはＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含み得る。別の実施形態では、本開示のポリペプチドは、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含む。さらに、本開示で使用するための抗体は、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部（例えば、ＣＨ２ドメインの全部または一部）を欠く場合がある。上記のように、重鎖定常領域は、自然発生の免疫グロブリン分子とはアミノ酸配列が異なるように修飾され得ることが当業者によって理解されるであろう。

【0050】

本明細書に開示される抗体の重鎖定常領域は、異なる免疫グロブリン分子に由来し得る。例えば、ポリペプチドの重鎖定常領域は、ＩｇＧ_１分子に由来するＣＨ１ドメインおよびＩｇＧ_３分子に由来するヒンジ領域を含み得る。別の例では、重鎖定常領域は、一部はＩｇＧ_１分子に由来し、一部はＩｇＧ_３分子に由来するヒンジ領域を含み得る。別の例では、重鎖部分は、一部はＩｇＧ_１分子に由来し、一部はＩｇＧ_４分子に由来するキメラヒンジを含み得る。

【0051】

本明細書で使用する「軽鎖定常領域」という用語は、抗体軽鎖に由来するアミノ酸配列を含む。好ましくは、軽鎖定常領域は、定常カッパドメインまたは定常ラムダドメインのうちの少なくとも１つを含む。

【0052】

「軽鎖－重鎖対」は、軽鎖のＣＬドメインと重鎖のＣＨ１ドメインとの間のジスルフィド結合を介して二量体を形成し得る軽鎖および重鎖の集合を指す。

【0053】

前述のように、様々な免疫グロブリンのクラスの定常領域のサブユニット構造と３次元構造が周知である。本明細書中で使用する用語「ＶＨドメイン」は、免疫グロブリン重鎖のアミノ末端可変ドメインを含み、用語「ＣＨ１ドメイン」は、免疫グロブリン重鎖の最初の（最もアミノ末端）定常領域ドメインを含む。ＣＨ１ドメインはＶＨドメインに隣接し、免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域のアミノ末端である。

【0054】

本明細書で使用する「ＣＨ２ドメイン」という用語は、例えば、従来の番号付けスキーム（残基２４４から３６０、Ｋａｂａｔ番号付けシステム；および残基２３１から３４０、ＥＵ番号付けシステム）を使用して、抗体の約残基２４４から残基３６０まで延びる重鎖分子の一部を含む（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐｔ． ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， "Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ" （１９８３）を参照）。ＣＨ２ドメインは、他のドメインと密接に対合されていないという点で独特のものである。どちらかといえば、無傷の天然ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメインの間に２つのＮ結合分岐炭水化物鎖が挿入されている。また、ＣＨ３ドメインがＣＨ２ドメインからＩｇＧ分子のＣ末端まで延びており、約１０８の残基を含むことも十分に立証されている。

【0055】

本明細書で使用する「ヒンジ領域」という用語は、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインに接合する重鎖分子の一部を含む。このヒンジ領域は約２５の残基で構成されており、柔軟性があるため、２つのＮ末端抗原結合領域は独立して移動可能である。ヒンジ領域は、上部、中間、下部のヒンジドメインの３つの個別のドメインに分割され得る（Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ １６１：４０８３ （１９９８））。

【0056】

本明細書で使用する「ジスルフィド結合」という用語は、２つの硫黄原子間に形成される共有結合を含む。アミノ酸システインは、第２のチオール基とジスルフィド結合を形成できるかまたは架橋できるチオール基を含む。自然発生のほとんどのＩｇＧ分子では、ＣＨ１領域とＣＫ領域はジスルフィド結合によって連結され、２つの重鎖は、Ｋａｂａｔ番号付けシステム（位置２２６または２２９、ＥＵ番号付けシステム）を使用して２３９および２４２に対応する位置で２つのジスルフィド結合によって連結される。

【0057】

本明細書で使用する「キメラ抗体」という用語は、免疫反応性領域または部位が第１の種から取得されるまたは由来し、定常領域（本開示に従って無傷、部分的または修飾され得る）が第２の種から取得される任意の抗体を意味すると考えられる。特定の実施形態では、標的結合領域または部位は非ヒト供給源（例えば、マウスまたは霊長類）に由来し、定常領域はヒトである。

【0058】

本明細書で使用する「ヒト化の割合」は、ヒト化ドメインと生殖系列ドメインとの間のフレームワークのアミノ酸の差（すなわち、非ＣＤＲの差）の数を決定し、アミノ酸の総数からその数を引いてから、次にそれをアミノ酸の総数で割って、１００を掛けることによって計算されたものである。

【0059】

「特異的に結合する」または「特異性を有する」とは一般に、抗体がその抗原結合ドメインを介してエピトープに結合すること、および結合が抗原結合ドメインとエピトープとの間にある程度の相補性を伴うことを意味する。この定義によれば、抗体は、ランダムな無関係のエピトープに結合するよりも容易に、その抗原結合ドメインを介してそのエピトープに結合する場合、そのエピトープに「特異的に結合する」と言われる。本明細書で使用する「特異性」という用語は、特定の抗体が特定のエピトープに結合する相対親和性を限定するために使用される。例えば、抗体「Ａ」は、抗体「Ｂ」よりも所与のエピトープに対してより高い特異性を有すると見なされ得、または抗体「Ａ」は、関連するエピトープ「Ｄ」に対してよりも高い特異性でエピトープ「Ｃ」に結合すると言われ得る。修飾ＣκおよびＣＨ１ドメイン

【0060】

２つの抗原またはエピトープを標的とする二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）は、２つの個別のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の特異性と特性を単一の分子に組み込む。対合されたＶＨ－Ｃｈ１：ＶＬ－ＣＬ断片が２セット存在する場合、誤対合が発生し得る。２つの個別の抗体に由来するＶＨ－ＣＨ１：ＶＬ－ＣＬ断片の誤対合を回避するために、クロスマブ（Ｃｒｏｓｓ－Ｍａｂ）、一般的な軽鎖、ＦＩＴＩｇなどの多くの方法が使用されている。

【0061】

実験例の目的は、誤対合を減らすために、Ｃκおよび／またはＣＨ１ドメイン、特にヒトのドメインに変異を導入することだった。好ましくは、変異Ｃκは変異ＣＨ１への良好な結合を示し得るが、変異Ｃκは非変異ＣＨ１ドメインに結合しない、または弱い結合を有し、変異ＣＨ１は非変異Ｃκへの弱い結合を示す、または全く示さない。

【0062】

最初に、ヒトのＣκとＣＨ１の重要な界面残留物を解析して、５つのホットスポットを発見した。これらの残基の重要性を確認するために、各残基のアラニンまたはトリプトファンへの変異を調製した。ＣκのＧｌｎ１７（Ｃκ＿Ｑ１７）、またはＣＨ１のＰｈｅ９（ＣＨ１＿Ｆ９）での変異、およびＣκのＶａｌ２６もしくはＰｈｅ１１（Ｃκ＿Ｖ２６＿Ｆ１１）またはＣＨ１のＬｅｕ１１（ＣＨ１＿Ｌ１１）での変異では、軽鎖と重鎖との対合が大幅に減少した。これらの結果により、Ｃκ＿Ｑ１７／ＣＨ１＿Ｆ９基（実施例において対１と称される）およびＣκ＿Ｖ２６＿Ｆ１１／ＣＨ１＿Ｌ１１基（実施例において対２と呼ばれる）がＣκとＣＨ１との相互作用に重要であることが確認された。その後、対合を潜在的に復元する可能性のある変異を発現させて解析した。そのような修飾は、ＣκおよびＣＨ１ドメインの２つの異なる対を有する二重特異性抗体を調製するのに特に有用であり得る。

【0063】

界面残基Ｃκ＿Ｖ２６＿Ｆ１１／ＣＨ１＿Ｌ１１（および任意にＬ２８）の場合、以下の変異がＣκドメインとＣＨ１ドメインとの対合を復元できることが示されるか、または考えられる。
［表１］２６位および任意に１１位におけるＣκの変異基、１１位および任意に２８位におけるＣＨ１の変異基

【表4】

【0064】

同様に、界面残基Ｃκ＿Ｑ１７／ＣＨ１＿Ｆ９の場合、以下の変異がＣκドメインとＣＨ１ドメインとの対合を復元できることが示される、または考えられる。
［表２］Ｃκ１７／ＣＨ１ ９の変異基

【表5】

【0065】

実施例７に示すように、野生型ＣκおよびＣＨ１ドメインの１または複数の既存の塩橋を破壊し、新しいものを再建する追加のアミノ酸置換により、所望の対合特異性をさらに改善することができる。野生型Ｃκ／ＣＨ１対は、ＣＨ１＿Ｋ９６とＣκ＿Ｅ１６との間、ＣＨ１＿Ｋ１０１とＣκ＿Ｄ１５との間、およびＣＨ１＿Ｈ５１とＣκ＿Ｄ６０との間に塩橋を有する。これらの塩橋はそれぞれ、置換に適した部位になり得る。

【0066】

例えば、各塩橋において、正に荷電したアミノ酸（例えば、Ｋ、ＲまたはＨ）は負に荷電したアミノ酸（例えば、ＥまたはＤ）に置換でき、負に荷電したアミノ酸（例えば、ＥまたはＤ）は正に帯電したアミノ酸（Ｋ、Ｒ、またはＨ）に置換できる。そのような例の１つは、ＣＨ１＿Ｋ１０１Ｅ／Ｃκ＿Ｄ１５ＫまたはＣκ＿Ｄ１５Ｈである。別の例はＣＨ１＿Ｋ９６Ｄ／Ｃκ＿Ｅ１６Ｒである。別の例はＣＨ１＿９６Ｅ／Ｃκ＿Ｅ１６Ｋである。別の例は、ＣＨ１＿Ｈ５１Ｄ／Ｃκ＿Ｄ６０Ｋである。これらおよびその他の例を表３に示す。そのような置換された塩橋のそれぞれは、新たなＣＨ１／Ｃκ対合を調製するために独立して、または本開示に記載されている他の置換体のいずれかに加えて、使用することができる。
［表３］破壊され再建された塩橋

【表6】

【0067】

一実施形態では、開示の抗体またはその抗原結合断片は、置換体Ｌ１１ＷおよびＫ１０１Ｅを有するＣＨ１断片ならびに置換体Ｖ２６ＷおよびＤ１５Ｋ／Ｈを有するＣκ断片を含む。一実施形態では、開示の抗体またはその抗原結合断片は、置換体Ｌ１１ＷおよびＫ９６Ｄを有するＣＨ１断片ならびに置換体Ｖ２６ＷおよびＥ１６Ｒを有するＣκ断片を含む。一実施形態では、開示の抗体またはその抗原結合断片は、置換体Ｌ１１ＷおよびＫ９６Ｅを有するＣＨ１断片ならびに置換体Ｖ２６ＷおよびＥ１６Ｋを有するＣκ断片を含む。

【0068】

これらの変異基は、相互に結合できる変異ＣκドメインとＣＨ１ドメインを作製するのに有用であり得る。これらのドメインは、野生型の対応するＣＨ１またはＣκドメインに結合できない、または結合が減少している。上記ＣκおよびＣＨ１ドメインは、抗体または抗原結合断片、特に二重特異性のものに組み込まれ得る。

【0069】

１つのシナリオでは、二重特異性抗体は２つの軽鎖－重鎖対を含む通常のＩｇＧ構造を有する。各重鎖はＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含み、各軽鎖はＶＬおよびＣＬ（例えば、Ｃκ）ドメインを含む。本開示の一実施形態によれば、Ｃκ／ＣＨ１対のうちの一方は本開示の変異基を含み、他方の対は本開示の変異基を含まない。別の実施形態では、Ｃκ／ＣＨ１対の一方は本開示の変異基を含み、他方の対は異なる変異基を含む。いくつかの実施形態では、対のいずれかまたは両方が２つ以上の変異基（例えば、表１の１つの基および表２の別の基）を含む。

【0070】

別のシナリオでは、二重特異性抗体は、Ｆｃ断片のＣ末端で第２のＦａｂ断片のＶＨのＮ末端にさらに融合した、通常のＩｇＧ構造を有する。上記抗体を、図７Ａに示す。本開示の一実施形態によれば、Ｆｃ断片のＮ末端側のＣκ／ＣＨ１対またはＦｃ断片のＣ末端側のＣκ／ＣＨ１対のいずれかが本開示の変異基を含み、他方の対は本開示の変異基を含まない。さらに、変異基は、Ｆｃ断片のＮまたはＣ末端側のＣκ／ＣＨ１対の両方に含まれ得る。

【0071】

さらに別の実施形態では、二重特異性抗体は、図７Ｂに示すような構造を有する。この構造では、重鎖と軽鎖のそれぞれに２セットの連鎖状のＣκ／ＣＨ１対が含まれる。変異基は、所望の対合が優先される限り、この抗体のどこに配置されてもよい。ＣＨ３ドメインに周知のｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅを有する別の二重特異性抗体を図７Ｃに示す。ここで、本開示の変異基は、ＡおよびＢのＣκ／ＣＨ１対のいずれかまたは両方に挿入され得る。さらに、ＣＨ２またはＣＨ３ドメインを有さない他の例を図７Ｄに示す。

【0072】

一実施形態では、本開示は、Ｃκドメインのアミノ酸残基２６がＴｒｐであり、ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１１がＴｒｐである、ヒトＣκ／ＣＨ１対を含む抗体またはその抗原結合断片を提供する。いくつかの態様では、抗体またはその抗原結合断片はさらに、第２のＣκドメインのアミノ酸残基２６がＴｒｐではなく、第２のＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１１がＴｒｐではない、第２のヒトＣκ／ＣＨ１対を含む。いくつかの態様では、抗体またはその抗原結合断片はさらに、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、Ｆｃ領域、またはそれらの組み合わせを含む。

【0073】

別の実施形態では、本開示は、Ｖａｌ２６位および／またはＰｈｅ１１位にアミノ酸修飾を含むヒトＣκドメイン、ならびにＬｅｕ１１位にアミノ酸修飾を含むヒトＣＨ１ドメインを含む、抗体またはその抗原結合断片を提供し、ＣκドメインがＣＨ１ドメインと対合すると修飾アミノ酸が相互作用する。いくつかの実施形態では、アミノ修飾は、ヒトＩｇＧのＣκおよびＣＨ１ドメインと比較したものである。いくつかの実施形態では、修飾アミノ酸は表１から選択される。

【0074】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片はさらに、第２のＣκドメインのアミノ酸残基２６がＶａｌであり、第２のＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１１がＬｅｕである、第２のＣκ／ＣＨ１対を含む。いくつかの態様では、第２のＣκドメインのアミノ酸残基１１はＰｈｅである。

【0075】

別の実施形態において、本開示は、Ｇｌｎ１７位にアミノ酸修飾を含むＣκドメイン、およびＰｈｅ９位にアミノ酸修飾を含むＣＨ１ドメインを含む、抗体またはその抗原結合断片を提供し、ＣκドメインがＣＨ１ドメインと対合すると修飾アミノ酸が相互作用する。いくつかの実施形態では、アミノ修飾は、ヒトＩｇＧのＣκおよびＣＨ１ドメインと比較したものである。いくつかの実施形態では、修飾アミノ酸は、表２から選択される。

【0076】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片はさらに、第２のＣκドメインのアミノ酸残基１７がＧｌｎであり、第２のＣＨ１ドメインのアミノ酸残基９がＰｈｅである、第２のＣκ／ＣＨ１対を含む。

【0077】

いくつかの実施形態では、本開示は、表１の変異基または表２の変異基を含む抗体またはその抗原結合断片を提供する。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、表１の変異基および表２の変異基を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片はさらに、表３の変異基を含む。

【0078】

抗体またはその抗原結合断片は、任意の周知のクラスの抗体であり得るが、アイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含むクラスＩｇＧであることが好ましい。抗体またはその断片は、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体であり得る。二重特異性／二官能性分子

【0079】

いくつかの実施形態では、二重特異性抗体が提供される。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、腫瘍抗原または微生物に対して第１の特異性を有する。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、免疫細胞に対して第２の特異性を有する。

【0080】

いくつかの実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、食細胞、ナチュラルキラー細胞、好酸球、好塩基球、およびマスト細胞からなる群から選択される。標的となり得る免疫細胞上の分子には、例えば、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２８、およびＣＤ６４が含まれる。その他の例には、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３（ＣＤ２２３とも称される）、ＣＤ２８、ＣＤ１２２、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７とも称される）、ＴＩＭ３、ＯＸ－４０またはＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌ、ＬＩＧＨＴ、ＩＣＯＳ／ＩＣＯＳＬ、ＧＩＴＲ／ＧＩＴＲＬ、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ２７、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＨＥＶＭまたはＢＴＬＡ（ＣＤ２７２とも称される）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、およびＣＤ４７が含まれる。二重特異性の具体例には、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ３、ＰＤ－Ｌ１／ＴＩＧＩＴ、およびＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４７が含まれるが、これらに限定されない。

【0081】

「腫瘍抗原」は、腫瘍細胞で産生される抗原性物質であり、すなわち、それは宿主において免疫応答を誘発する。腫瘍抗原は腫瘍細胞の特定に有用であり、癌治療の使用における潜在的な候補である。体内の正常なタンパク質は抗原性ではない。しかし、特定のタンパク質は腫瘍形成中に産生または過剰発現されるため、体からは「外来」のように見なされる。これには、免疫系から隔離された正常なタンパク質、通常は非常に少量で産生されるタンパク質、通常は発生の特定の段階でのみ産生されるタンパク質、または変異により構造が修飾されるタンパク質が含まれ得る。

【0082】

豊富な腫瘍抗原が当技術分野で周知であり、スクリーニングによって新しい腫瘍抗原を容易に特定することができる。腫瘍抗原の非限定的な例には、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ１３３、ＣＤ７３、ＣＥＡ、ｇｐＡ３３、ムチン、ＴＡＧ－７２、ＣＩＸ、ＰＳＭＡ、葉酸結合タンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、インテグリン、αＶβ３、α５β１、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＰＨＡ３、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＲＡＮＫＬ、ＦＡＰ、およびテネイシンが含まれる。

【0083】

抗体または抗原結合断片だけを含むわけではない二官能性分子も提供される。腫瘍抗原標的分子として、本書に記載したような、ＰＤ－Ｌ１に特異的な抗体または抗原結合断片は、任意でペプチドリンカを介して免疫サイトカインまたはリガンドと組み合わされ得る。連結された免疫サイトカインまたはリガンドには、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＮＦ－α、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、４－１ＢＢＬ、ＬＩＧＨＴおよびＧＩＴＲＬが含まれるが、これらに限定されない。このような二官能性分子は、免疫チェックポイントブロッキング効果と腫瘍部位の局所免疫調節を組み合わせることができる。抗体をコードするポリヌクレオチドおよび抗体を調製する方法

【0084】

本開示はまた、本開示の抗体、その変異体または誘導体をコードする単離されたポリヌクレオチドまたは核酸分子を提供する。本開示のポリヌクレオチドは、同じポリヌクレオチド分子上または別個のポリヌクレオチド分子上の抗原結合ポリペプチド、その変異体または誘導体の重鎖および軽鎖可変領域の全体をコードし得る。さらに、本開示のポリヌクレオチドは、同じポリヌクレオチド分子または別個のポリヌクレオチド分子上の抗原結合ポリペプチド、その変異体または誘導体の重鎖および軽鎖可変領域の一部をコードし得る。

【0085】

抗体を作製する方法は、当技術分野で周知であり、本明細書に記載されている。特定の実施形態では、本開示の抗原結合ポリペプチドの可変領域と定常領域の両方が完全にヒトのものである。完全なヒト抗体は、当技術分野で記載され、かつ本書に記載されている技法を使用して作製され得る。例えば、特定の抗原に対する完全なヒト抗体は、抗原投与に応答して上記抗体を産生するように修飾されているが、内因性の遺伝子座を欠損しているトランスジェニック動物に抗原を投与することにより調製され得る。上記抗体を作製するのに使用され得る例示的な技法は、その全体が参照により組み込まれる、米国特許第６，１５０，５８４号、同第６，４５８，５９２号、同第６，４２０，１４０号に記載されている。

【0086】

特定の実施形態では、調製された抗体は、治療される動物、例えばヒトにおいて有害な免疫応答を誘発しない。一実施形態では、本開示の抗原結合ポリペプチド、その変異体、または誘導体は、当技術分野で認識されている技法を使用してそれらの免疫原性を低下させるように修飾される。例えば、抗体は、ヒト化、霊長類化、脱免疫化され得るか、またはキメラ抗体が作製され得る。この種の抗体は、親抗体の抗原結合特性を保持または実質的に保持するが、ヒトにおいては免疫原性が低い非ヒト抗体、典型的にはマウスまたは霊長類抗体に由来する。これは、（ａ）キメラ抗体を生成するために非ヒト可変ドメイン全体をヒト定常領域に移植すること、（ｂ）１または複数の非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも一部を、重要なフレームワーク残基の保持の有無にかかわらず、ヒトフレームワークおよび定常領域に移植すること、または（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基を置換することにより、ヒト様部分で「クローキング（ｃｌｏａｋｉｎｇ）」することを含む、様々な方法によって達成され得る。上記方法は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ５７：６８５１－６８５５ （１９８４）； Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４４：６５－９２ （１９８８）； Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４－１５３６ （１９８８）； Ｐａｄｌａｎ， Ｍｏｌｅｃ． Ｉｍｍｕｎ． ２５：４８９－４９８ （１９９１）； Ｐａｄｌａｎ， Ｍｏｌｅｃ． Ｉｍｍｕｎ． ３１：１６９－２１７ （１９９４）、ならびに米国特許第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、同第５，６９３，７６２号、および同第６，１９０，３７０号に開示され、これらはすべて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0087】

抗体の免疫原性を低下させるために、脱免疫化も使用され得る。本明細書中で使用する用語「脱免疫化」は、Ｔ細胞エピトープを修飾するための抗体の改変を含む（例えば、国際出願公開第ＷＯ／９８５２９７６ Ａ１号および同第ＷＯ／００３４３１７ Ａ２号参照）。例えば、開始抗体の可変重鎖配列および可変軽鎖配列が解析され、相補性決定領域（ＣＤＲ）および他の主要な残基に対する配列内でのエピトープの位置を示す各Ｖ領域のヒトＴ細胞エピトープ「マップ」が作成される。Ｔ細胞エピトープマップの個々のＴ細胞エピトープは、最終的な抗体の活性を改変させるリスクが低い代替的なアミノ酸置換を特定するために解析される。アミノ酸置換の組み合わせを含む一連の代替的な可変重配列および可変軽配列が設計され、これらの配列はその後、様々な結合ポリペプチドに組み込まれる。典型的には、１２から２４の変異抗体が生成され、結合および／または機能について試験される。次に、修飾可変領域およびヒト定常領域を含む完全な重鎖および軽鎖遺伝子が発現ベクタにクローン化され、その後のプラスミドが全抗体の産生のために細胞株に導入される。次に、抗体は適切な生化学的および生物学的アッセイで比較され、最適な変異体が特定される。

【0088】

本開示の抗原結合ポリペプチドの結合特異性は、免疫沈降、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などのインビトロアッセイによって決定され得る。

【0089】

あるいは、単鎖ユニットの製造について記載された技法（米国特許第４，６９４，７７８号； Ｂｉｒｄ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４４２ （１９８８）； Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ５５：５８７９－ ５８８３ （１９８８）； ａｎｄ Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４－５５４ （１９８９））を、本開示の単鎖ユニットを製造するのに適合させることができる。単鎖ユニットは、アミノ酸架橋を介してＦｖ領域の重鎖断片と軽鎖断片と連結することによって形成され、単鎖融合ペプチドが生成される。Ｅ． ｃｏｌｉ （Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２： １０３８－１０４１ （１９８８））の官能Ｆｖ断片を組み立てるための技法も使用可能である。

【0090】

単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）および抗体を製造するために使用することができる技法の例には、米国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号； Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０３：４６－８８ （１９９１）； Ｓｈｕ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：１９９５－１９９９ （１９９３）； ならびにＳｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８－１０４０ （１９８８）に記載されているものが含まれる。ヒトにおける抗体のインビボ使用およびインビトロ検出アッセイを含むいくつかの用途については、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体を使用することが好ましい場合がある。キメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体に由来する可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体など、抗体の異なる部分が異なる動物種に由来する分子である。キメラ抗体を製造する方法は、当技術分野で周知である。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２ （１９８５）； Ｏｉ ｅｔ ａｌ．， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４ （１９８６）； Ｇｉｌｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１－２０２ （１９８９）；米国特許第５，８０７，７１５号、同第４，８１６，５６７号、および同第４，８１６，３９７号を参照。

【0091】

ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１または複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する所望の抗原に結合する非ヒト種抗体に由来する抗体分子である。多くの場合、ヒトフレームワーク領域のフレームワーク残基は、ＣＤＲドナー抗体の対応する残基で置換されて、抗原結合を改変させ、好ましくは改善する。これらのフレームワーク置換は、当技術分野で周知の方法によって、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を特定するためのＣＤＲとフレームワーク残基との相互作用のモデリング、および特定の位置の異常なフレームワーク残基を特定するための配列比較によって特定される。 （例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，５８５，０８９号； Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３ （１９８８）を参照）。抗体は、例えば、ＣＤＲ移植 （欧州特許第２３９，４００号；ＰＣＴ公開第ＷＯ ９１／０９９６７号；米国特許第５，２２５，５３９号、同第５，５３０，１０１号、および同第５，５８５，０８９号）、練付け（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）または表面再生（欧州特許第５９２，１０６号；欧州特許第５１９，５９６号； Ｐａｄｌａｎ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２８（４／５）：４８９－４９８ （１９９１）； Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７（６）：８０５－８１４ （１９９４）； Ｒｏｇｕｓｋａ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：９６９－９７３ （１９９４））、および鎖シャッフリング（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５６５，３３２号）を含む、当該分野で公知の種々の技術を使用してヒト化され得る。

【0092】

完全なヒト抗体は、ヒト患者の治療的処置に特に望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリを使用するファージディスプレイ法を含む、当技術分野で周知の様々な方法によって製造され得る。その全体がそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，４４４，８８７号および同第４，７１６，１１１号；ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ９８／４６６４５号、同第ＷＯ９８／５０４３３号、同第ＷＯ９８／２４８９３号、同第ＷＯ９８／１６６５４号、同第ＷＯ９６／３４０９６号、同第ＷＯ９６／３３７３５号、および同第ＷＯ９１／１０７４１号も参照。

【0093】

ヒト抗体はまた、機能的内因性免疫グロブリンを発現することはできないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを使用しても製造され得る。例えば、ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体は、ランダムに、または相同組換えによってマウス胚性幹細胞に導入され得る。あるいは、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子に加えて、ヒト可変領域、定常領域、および多様性領域がマウス胚性幹細胞に導入され得る。マウス重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入とは別に、または同時に非機能性にすることができる。特に、ＪＨ領域のホモ接合性欠失は、内因性の抗体産生を防ぐ。修飾された胚性幹細胞を増殖させ、胚盤胞にマイクロインジェクトしてキメラマウスが製造される。次に、キメラマウスを飼育して、ヒト抗体を発現するホモ接合型子孫を生じさせる。トランスジェニックマウスは、選択された抗原、例えば、所望の標的ポリペプチドの全部または一部を用いて通常の方法で免疫化される。抗原に対するモノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技術を使用して、免疫化されたトランスジェニックマウスから得ることができる。トランスジェニックマウスに宿るヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞分化中に再配置され、その後クラススイッチと体細胞変異を経る。したがって、上記技法を使用して、治療的に有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ抗体を製造することが可能である。ヒト抗体を製造するためのこの技術の概要については、Ｌｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ Ｉｎｔ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ７３：６５－９３ （１９９５）を参照のこと。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を製造するためのこの技術および上記抗体を製造するためのプロトコルの詳細な説明については、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開第ＷＯ９８／２４８９３号；同第ＷＯ９６／３４０９６号；同第ＷＯ９６／３３７３５号；米国特許第５，４１３，９２３号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６６１，０１６号；同第５，５４５，８０６号；同第５，８１４，３１８号；および同第５，９３９，５９８号を参照のこと。さらに、Ａｂｇｅｎｉｘ社（カリフォルニア州フリーモント）やＧｅｎＰｈａｒｍ社（カリフォルニア州サンホゼ）などの企業が、上記と同様の技術を使用して、選択された抗原に対するヒト抗体を提供することに従事し得る。

【0094】

選択されたエピトープを認識する完全なヒト抗体は、「ガイド選択（ｇｕｉｄｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」と称される技法を使用しても生成され得る。この方法では、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えばマウス抗体を使用して、同じエピトープを認識する完全なヒト抗体の選択を誘導する。（Ｊｅｓｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７２：８９９－９０３ （１９８８）。また、参照により全体が組み込まれる米国特許第５，５６５，３３２号も参照のこと）。

【0095】

別の実施形態において、所望のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）容易に単離および配列決定され得る。単離およびサブクローニングされたハイブリドーマ細胞は、上記ＤＮＡの好ましい供給源として機能する。単離したら、ＤＮＡを発現ベクタに配置し、その後、その発現ベクタを、免疫グロブリンを産生しない大腸菌細胞などの原核もしくは真核宿主細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞にトランスフェクトする。より具体的には、単離したＤＮＡ（本明細書に記載されるように合成であり得る）を使用して、参照により本明細書に組み込まれる、Ｎｅｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，６５８，５７０号（１９９５年１月２５日出願）に記載されるように、抗体製造用の定常および可変領域配列をクローン化することができる。基本的に、これには選択した細胞からのＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡへの変換、およびＩｇ特異的プライマを使用したＰＣＲによる増幅が伴う。この目的において適切なプライマはまた、米国特許第５，６５８，５７０号にも記載されている。以下により詳細に説明するように、所望の抗体を発現する形質転換細胞は、免疫グロブリンの臨床的および商業的供給を提供するために、比較的大量に増殖され得る。

【0096】

さらに、通常の組換えＤＮＡ技法を使用して、本開示の抗原結合ポリペプチドの１または複数のＣＤＲを、フレームワーク領域内、例えば、ヒトフレームワーク領域に挿入して、非ヒト抗体をヒト化することができる。フレームワーク領域は、自然発生またはコンセンサスフレームワーク領域、好ましくはヒトフレームワーク領域であり得る（例えば、ヒトフレームワーク領域のリストについては、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２７８：４５７－４７９ （１９９８）を参照）。好ましくは、フレームワーク領域とＣＤＲの組み合わせによって生成されるポリヌクレオチドは、所望のポリペプチド、例えばＬＩＧＨＴの少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する抗体をコードする。好ましくは、１または複数のアミノ酸置換がフレームワーク領域内で起こり得、好ましくは、アミノ酸置換により、抗体のその抗原への結合が改善される。さらに、上記方法を使用して、鎖内ジスルフィド結合に関与する１または複数の可変領域システイン残基のアミノ酸置換または欠失を起こさせて、１または複数の鎖内ジスルフィド結合を欠く抗体分子を生成することができる。ポリヌクレオチドに対する他の改変は、本開示に包含され、当技術分野の範囲内である。

【0097】

さらに、適切な抗原特異性のマウス抗体分子の遺伝子を、適切な生物活性のヒト抗体分子の遺伝子と共にスプライシングすることによって、「キメラ抗体」の製造のために開発された技法（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ：８５１－８５５ （１９８４）； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３７２：６０４－６０８ （１９８４）； Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２－４５４ （１９８５））が使用可能である。本明細書で使用するキメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体に由来する可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有するものなど、異なる部分が異なる動物種に由来する分子である。

【0098】

組換え抗体を生成するためのさらに別の非常に効率的な手段が、Ｎｅｗｍａｎ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１４５５－１４６０（１９９２）によって開示されている。具体的には、この技法により、サルの可変ドメインとヒトの定常配列を含む霊長類化抗体が生成される。この参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。さらに、この技法はまた、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる、本発明の譲渡人に譲渡された米国特許第５，６５８，５７０号、同第５，６９３，７８０号および同第５，７５６，０９６号にも記載されている。

【0099】

あるいは、抗体産生細胞株は、当業者に周知の技法を使用して選択および培養され得る。上記技法は、様々な実験室マニュアルや主要な公開物に記載されている。これに関し、以下に説明する本開示での使用に適した技法は、補足を含め、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｅｄｓ．， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９１）に記載されている。

【0100】

さらに、限定されないが、アミノ酸置換を起こさせる部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発を含む、当業者に周知の標準的な技法を使用して、本開示の抗体をコードするヌクレオチド配列に変異を導入することができる。好ましくは、変異体（誘導体を含む）が、参照可変重鎖領域、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、可変軽鎖領域、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、またはＣＤＲ－Ｌ３と比較して、５０未満のアミノ酸置換、４０未満のアミノ酸置換、３０未満のアミノ酸置換、２５未満のアミノ酸置換、２０未満のアミノ酸置換、１５未満のアミノ酸置換、１０未満のアミノ酸置換、５未満のアミノ酸置換、４未満のアミノ酸置換、３未満のアミノ酸置換、または２未満のアミノ酸置換をコードする。あるいは、飽和突然変異誘発などにより、変異をコード配列の全部または一部に沿ってランダムに導入することができ、得られた変異体を生物活性についてスクリーニングして、活性を保持する変異体を特定することができる。

【0101】

本開示はまた、医薬組成物を提供する。上記組成物は、有効量の抗体、および許容し得る担体を含む。いくつかの実施形態では、組成物はさらに、第２の抗癌剤（例えば、免疫チェックポイント阻害剤）を含む。

【0102】

特定の実施形態では、「医薬上許容し得る」という用語は、連邦政府または州政府の規制機関によって承認されたか、または動物、より具体的にはヒトでの使用のために米国薬局方または他の一般に認められた薬局方に列挙されていることを意味する。さらに、「医薬上許容し得る担体」は、一般に、無毒性の固体、半固体、または液体の充填剤、希釈剤、封入材料、または任意の種類の製剤補助剤である。

【0103】

「担体」という用語は、治療薬と共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。上記医薬担体は、水、および落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの石油、動物、植物または合成起源のものを含む油などの無菌液体であり得る。医薬組成物が静脈内投与される場合、水は好ましい担体である。生理食塩水および水性デキストロースとグリセロール溶液も、特に注射剤のための液体担体として使用することができる。適切な医薬賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが含まれる。組成物は、必要に応じて、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、または酢酸塩、クエン酸塩もしくはリン酸塩などのｐＨ緩衝剤も含み得る。ベンジルアルコールやメチルパラベンなどの抗菌剤、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤、エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張性を調整するための薬剤も想定される。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放性製剤などの形態をとり得る。組成物は、トリグリセリドなどの従来の結合剤および担体を用いて、坐剤として製剤化され得る。経口製剤は、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体を含み得る。適切な医薬担体の例は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｅ．Ｗ． ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。上記組成物は、患者への適切な投与のための形態を提供するために、適切な量の担体と共に、好ましくは精製された形態の治療有効量の抗原結合ポリペプチドを含む。製剤は、投与方法に適合すべきである。親製剤は、ガラス製またはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器または複数回投与用バイアルに封入され得る。

【0104】

一実施形態では、組成物は、ヒトへの静脈内投与に適合した医薬組成物として、通常の手順に従って製剤化される。典型的には、静脈内投与用の組成物は、無菌等張水性緩衝液中の溶液である。必要な場合に、組成物はまた、可溶化剤および注射部位の痛みを和らげるためのリグノカインなどの局所麻酔薬を含み得る。一般に、成分は、例えば、活性剤の量を示すアンプルまたはサシェなどの密閉容器中の乾燥凍結乾燥粉末または無水濃縮物として、別々にまたは混合して単位剤形で供給される。組成物が点滴により投与される場合、無菌の医薬品グレードの水または生理食塩水を含む点滴ボトルで行われ得る。組成物が注射により投与される場合、投与前に成分が混合され得るように、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供され得る。

【0105】

本開示の化合物は、中性または塩の形態として製剤化され得る。医薬上許容し得る塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するものなどのアニオンで形成されるもの、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２－エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものなどのカチオンで形成されるものが含まれる。実施例実施例１：４つのＦａｂ断片のＣκ／ＣＨ１界面相互作用の解析

【0106】

この実施例では、Ｃκ／ＣＨ１界面相互作用に関していくつかの抗体のＦａｂ断片を解析した。構造１：Ｆａｂ １Ｆ８のＣκおよびＣＨ１の界面相互作用の解析

【0107】

１Ｆ８は、ヒトＣＤ４７に特異的な抗体から調製されたＦａｂ分子である。２０１７年に、抗ＣＤ４７ Ｆａｂ １Ｆ８を有するＣＤ４７の複合結晶構造を３．１Ａの分解能で実施した（軽鎖は２１９のアミノ酸を有し、Ｃκは１１４から２１９のアミノ酸を含み、重鎖は２２０のアミノ酸を有し、ＣＨは１１９から２２０のアミノ酸を含む）。

【0108】

このＦａｂ断片のＣκドメインとＣＨ１ドメインとの間の界面には、ＣＨドメインの合計３２の残基およびＣκドメインの３５の残基がある。１Ｆ８には、ＣＨドメインのＳｅｒ１４とＧｌｙ２０との間に連続した残基がある。４ＮＹＬと比較して、ＣＨ断片のＬｙｓ１６主鎖酸素原子とＣκ断片の残基Ｌｙｓ１００との間に水素結合がもう１つ形成されている（以下の構造４を参照）。疎水性相互作用は、以下に示す他の構造と同様である。
水素結合（カットオフ距離：３．５Å）

【表7】

注：１．Ｌｙｓ３０のＮＺが回転している限り、ＣＨ－Ｌｙｓ３０とＳｅｒ２４との間のＨＤは他の３つの構造で形成され得る。２．他の３つのｐｄｂとは配列が異なるため、ＣＨ－Ｌｙｓ１６／ＣＫ－Ｌｙｓ１００とＣＨ－Ｓｅｒ１０２／ＣＫ－Ｇｌｕ１０６との間に余分なＨＤが形成される。
１Ｆ８のＣκとＣＨ１との間の塩橋

【表8】

疎水性界面

【表9】

＊水素結合と塩結合に伴う疎水性接触もこの表では除外されている。

【0109】

自由エネルギー偏差解析で、１Ｆ８ ＣＨ１の一部の残基の、Ｃκ残基との相互作用が強いことが特定された（以下の表の最初の太字の１０の残基を参照）。
１Ｆ８ ＣＨ１の界面残基：

【表10】

結合：水素結合または塩橋が形成された場合の結合種類、Ｈ：水素結合、Ｓ：塩橋ＡＳＡ：アクセス可能な表面積ＢＳＡ：埋没表面積ＤｅｌｔａＧ：エネルギーの変化、正の場合はより多くの疎水性相互作用、負の場合はより多くの親水性相互作用を含む。ＤｅｌｔａＧのＡｂｓ：ＤｅｌｔａＧの絶対値。表はこのキーで分類される。ＤｅｌｔａＧの変化が０．５を上回る残基（太字）は、タンパク質の安定化により寄与する残基と見なされ得る。

【0110】

Ｃκドメインでは、７の残基が相互作用に関与している可能性がある。
１Ｆ８ Ｃκの界面残基：

【表11】

結合：水素結合または塩橋が形成された場合の結合種類、Ｈ：水素結合、Ｓ：塩橋ＡＳＡ：アクセス可能な表面積ＢＳＡ：埋没表面積ＤｅｌｔａＧ：エネルギーの変化、正の場合はより多くの疎水性相互作用、負の場合はより多くの親水性相互作用を含む。ＤｅｌｔａＧのＡｂｓ：ＤｅｌｔａＧの絶対値。表はこのキーで分類される。ＤｅｌｔａＧの変化が０．５を上回る残基（太字）は、タンパク質の安定化により寄与する残基と見なされ得る。構造２：１ＣＺ８のＣκおよびＣＨ１の界面相互作用の解析

【0111】

１ＣＺ８（ＰＤＢ ＩＤ １ＣＺ８）は、ＶＥＧＦに特異的な抗体から調製されたＦａｂ分子である。ＶＥＧＦとＦａｂの複合結晶構造を、２０００年に２．４Ａの分解能で実施した。

【0112】

アミノ酸残基は、ＣＨドメインにおいて３つの逆平行βシートを形成し、Ｃκドメインにおいて４つの逆平行βシートを形成した。これらのβシートは、界面において向かい合わせの形態を形成した。このＦａｂ断片のＣκドメインとＣＨ１ドメインとの間の界面には、ＣＨドメインの合計２８の残基、Ｃκドメインの３０の残基がある。ＣκドメインとＣＨ１ドメインとの間に３つの水素結合がある。例えば、１ＣＺ８では、ＣＨの残基Ｈｉｓ５１と、Ｐｒｏ５４およびＬｅｕ５７の主鎖酸素原子が、Ｃκの残基のＡｓｎ３１、Ｓｅｒ５５、およびＧｌｎ５３とそれぞれ、これらの３つの水素結合を形成した。これらの水素結合は、界面の片側に位置する。

【0113】

疎水性相互作用は主に、ＣＨの残基Ｐｈｅ９、Ｌｅｕ１１、Ｐｈｅ５３、Ｖａｌ６８とＣκの残基Ｇｌｎ１７、Ｐｈｅ１１、Ｖａｌ２６、Ｐｈｅ６９、Ｖａｌ２８との間の界面の中心と反対側に位置する。ＣＨの残基Ｌｙｓ９６およびＬｙｓ１０１のＣ末端とＣκの残基Ａｓｐ１５およびＧｌｕ１６との間に２つの塩橋が形成され、界面の反対側のＣＨとＣκの複合構造が安定化した（図１、水素結合に関与する残基はピンク色、塩橋は黄色、疎水性相互作用残基は青色または緑色に着色された棒状のものである）。
水素結合（カットオフ距離：３．５Å）

【表12】

ＣＨとＣκとの間の塩橋

【表13】

疎水性界面（カットオフ距離：４Å）

【表14】

ＣκとＣＨ１との相互作用に最も重要な５の界面残基

【表15】

注：塩橋の残基は除外される。

【0114】

自由エネルギー偏差解析で、１ｃｚ８ ＣＨ１の一部の残基の、Ｃκの残基との相互作用が強いことが特定された（以下の表の最初の９の残基を参照（太字））。
界面残基：１ｃｚ８ ＣＨ１

【表16】

結合：水素結合または塩橋が形成された場合の結合種類、Ｈ：水素結合、Ｓ：塩橋ＡＳＡ：アクセス可能な表面積ＢＳＡ：埋没表面積ＤｅｌｔａＧ：エネルギーの変化、正の場合はより多くの疎水性相互作用、負の場合はより多くの親水性相互作用を含む。ＤｅｌｔａＧのＡｂｓ：ＤｅｌｔａＧの絶対値。表はこのキーで分類される。ＤｅｌｔａＧの変化が０．５を上回る残基（太字）は、タンパク質の安定化により寄与する残基と見なされ得る。

【0115】

Ｃκドメインでは、５の残基が相互作用に関与している可能性がある。
界面残基：１ｃｚ８ Ｃκ

【表17】

結合：水素結合または塩橋が形成された場合の結合種類、Ｈ：水素結合、Ｓ：塩橋ＡＳＡ：アクセス可能な表面積ＢＳＡ：埋没表面積ＤｅｌｔａＧ：エネルギーの変化、正の場合はより多くの疎水性相互作用、負の場合はより多くの親水性相互作用を含む。ＤｅｌｔａＧのＡｂｓ：ＤｅｌｔａＧの絶対値。表はこのキーで分類される。ＤｅｌｔａＧの変化が０．５を上回る残基（太字）は、タンパク質の安定化により寄与する残基と見なされ得る。構造３：１Ｌ７ＩのＣκおよびＣＨ１の界面相互作用の解析

【0116】

１Ｌ７Ｉは、ＥｒｂＢ２を標的とする周知のＦａｂ分子（ＰＤＢ ＩＤ：１Ｌ７Ｉ）である。この抗ＥｒｂＢ２ Ｆａｂ２Ｃ４の結晶構造を、２００２年に１．８Ａの分解能で実施した。

【0117】

このＦａｂ断片（ＰＤＢ ＩＤ １Ｌ７ｉ）のＣκドメインとＣＨ１ドメインとの間の界面には、ＣＨドメインの合計３３の残基、Ｃκドメインの３５の残基がある。

【0118】

１Ｌ７ｉの水素結合（カットオフ距離：３．５Å）

【表18】

１Ｌ７ｉのＣＫとＣＨとの間の塩橋

【表19】

注：ＣＨのＣ末端残基Ｃｙｓ１０３とＣｙｓ１０７ＣＫは、ジスルフィド架橋を形成し、他の構造で見られたＣＨの残基Ｌｙｓ１０１とＣｋの残基Ａｓｐ１５との間の塩橋を破壊した。
１Ｌ７ｉの疎水性界面

【表20】

【0119】

自由エネルギー偏差解析で、１Ｌ７ｉ ＣＨ１の一部の残基の、Ｃκの残基との相互作用が強いことが特定された（以下の表の最初の１２の残基を参照（太字））。
界面残基：１Ｌ７ｉ ＣＨ１

【表21】

結合：水素結合または塩橋が形成された場合の結合種類、Ｈ：水素結合、Ｓ：塩橋ＡＳＡ：アクセス可能な表面積ＢＳＡ：埋没表面積ＤｅｌｔａＧ：エネルギーの変化、正の場合はより多くの疎水性相互作用、負の場合はより多くの親水性相互作用を含む。ＤｅｌｔａＧのＡｂｓ：ＤｅｌｔａＧの絶対値。表はこのキーで分類される。ＤｅｌｔａＧの変化が０．５を上回る残基（太字）は、タンパク質の安定化により寄与する残基と見なされ得る。

【0120】

Ｃκドメインでは、９の残基が相互作用に関与している可能性がある。
界面残基：１Ｌ７ｉ Ｃκ

【表22】

【表61】

結合：水素結合または塩橋が形成された場合の結合種類、Ｈ：水素結合、Ｓ：塩橋ＡＳＡ：アクセス可能な表面積ＢＳＡ：埋没表面積ＤｅｌｔａＧ：エネルギーの変化、正の場合はより多くの疎水性相互作用、負の場合はより多くの親水性相互作用を含む。ＤｅｌｔａＧのＡｂｓ：ＤｅｌｔａＧの絶対値。表はこのキーで分類される。ＤｅｌｔａＧの変化が０．５を上回る残基（太字）は、タンパク質の安定化により寄与する残基と見なされ得る。
構造４：４ＮＹＬのＣκおよびＣＨ１の界面相互作用の解析

【0121】

研究対象の第４の構造は、ＴＮＦαを標的とする周知のＦａｂ分子（ＰＤＢ ＩＤ：４ＮＹＬ）である４ＮＹＬだった。アダリムマブのＦＡＢ断片の結晶構造は、２０１４年に２．８Ａの分解能で実施した（比較的高いＲｆｒｅｅ（Ｒｆｒｅｅ＝３５．８％／Ｒ＝２７．５）で解いた。これは、構造が詳細な解析に適していないことを意味する）。アダリムマブは、ＴＮＦａに対する抗体であり、関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎の患者、および若年性特発性関節炎の小児の治療に使用される。アダリムマブのＦａｂ断片（ＰＤＢ ＩＤ ４ＮＹＬ）のＣκドメインとＣＨ１ドメインとの間の界面には、ＣＨ１ドメインの合計２４の残基とＣκドメインの合計２８の残基がある。

【0122】

４ＮＹＬは１ＣＺ８と同じ水素結合と疎水性相互作用を有する。Ｃ末端のＣｈ残基の欠如により、ＣＨの残基Ｌｙｓ９６のＣ末端とＣＫの残基Ｇｌｕ１５との間に塩橋が１つのみ形成された。
４ＮＹＬの水素結合（カットオフ距離：３．５Å）

【表23】

注：解像度の限界により、水媒介水素結合は見つからない。
４ＮＹＬのＣＫとＣＨとの間の塩橋

【表24】

注：４ＮＹＬにはＣ末端の残基が１００から１０３ないため、ＣＨ－Ｌｙｓ１０１とＣＫ－Ａｓｐ１５との間の塩橋がない。
４ＮＹＬの疎水性界面

【表25】

【0123】

自由エネルギー偏差解析で、４ＮＹＬ ＣＨ１の一部の残基の、Ｃκの残基との相互作用が強いことが特定された（以下の表の最初の９の残基を参照（太字））。
界面残基：４ＮＹＬ ＣＨ１

【表26】

結合：水素結合または塩橋が形成された場合の結合種類、Ｈ：水素結合、Ｓ：塩橋ＡＳＡ：アクセス可能な表面積ＢＳＡ：埋没表面積ＤｅｌｔａＧ：エネルギーの変化、正の場合はより多くの疎水性相互作用、負の場合はより多くの親水性相互作用を含む。ＤｅｌｔａＧのＡｂｓ：ＤｅｌｔａＧの絶対値。表はこのキーで分類される。ＤｅｌｔａＧの変化が０．５を上回る残基（太字）は、タンパク質の安定化により寄与する残基と見なされ得る。

【0124】

Ｃκドメインでは、７の残基が相互作用に関与している可能性がある。
界面残基：４ＮＹＬ Ｃκ

【表27】

結合：水素結合または塩橋が形成された場合の結合種類、Ｈ：水素結合、Ｓ：塩橋ＡＳＡ：アクセス可能な表面積ＢＳＡ：埋没表面積ＤｅｌｔａＧ：エネルギーの変化、正の場合はより多くの疎水性相互作用、負の場合はより多くの親水性相互作用を含む。ＤｅｌｔａＧのＡｂｓ：ＤｅｌｔａＧの絶対値。表はこのキーで分類される。ＤｅｌｔａＧの変化が０．５を上回る残基（太字）は、タンパク質の安定化により寄与する残基と見なされ得る。１ｃｚ８、４ｎｙｌ、１ｌ７ｉ、ｈＣＤ４７－１＿１Ｆ８のＣＨ１＿Ｃκの界面解析

【0125】

上記４つの構造の界面解析には、塩橋、水素結合、疎水性相互作用が含まれる。ＤｅｌｔａＧをすべて計算し、アミノ酸をＤｅｌｔａＧによってランク付けした。各構造について、さらに解析するために上位１０個の対を選択した。解析は、他の相互作用に関係なく、疎水性相互作用に注目した。次に、上位５つの対をリード候補として選択した。
ＣＨ１の配列再コード化

【表28】

【表62】

【表63】

Ｃκの配列再コード化

【表29】

【表64】

【表65】

【表66】

１ｃｚ８，４ｎｙｌ、１ｌ７ｉおよび１Ｆ８の上位の自由エネルギー残基の要約表

【表30】

最も安定化作用のある残基

【表31】

Ｃ_κとＣＨ１との相互作用のための５の重要な界面残基（構造と自由エネルギーに基づく）

【表32】

注：塩橋の残基は除外される実施例２：ＣκとＣＨ１との相互作用のための重要な界面残基の発見

【0126】

ＣκとＣＨ１の界面分析に基づいて、この実施例では、ＣκとＣＨ１との相互作用のための最も重要な界面残基をまとめた（図２と以下の表４を参照）。
［表４］Ｃκ／ＣＨ１相互作用に影響を与える残基対

【表33】

注：塩橋の残基は除外される

【0127】

上記表から、アラニンまたはトリプトファンの単一変異を使用して、各界面残基の試験を行った。ＶＨおよびＶＬを含まないＩｇＧ（－Ｆｖ）を構築し、ＡｌａおよびＴｒｐスクリーニング用に発現させた。変異リストを以下に列挙する。
アラニンのスクリーニング

【表34】

【表67】

トリプトファンのスクリーニング

【表35】

【0128】

図３のＳＤＳ－ＰＡＧＥ画像に示すように、対２（Ｃκ＿Ｆ１１＿Ｖ２６とＣＨ１＿Ｌ１１）において、２つの変異体Ｃκ＿Ｆ１１Ａ／ＣＨ１とＣκ＿Ｖ２６Ａ／ＣＨ１がＣκとＣＨ１との相互作用を大幅に中断し、２つの変異体Ｃκ＿Ｖ２６Ｗ／ＣＨ１およびＣκ／ＣＨ１＿Ｌ１１Ｗも相互作用を破壊した（図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、図４Ｄ）。変異Ｃκ／ＣＨ１＿Ｌ１１ＡおよびＣκ／ＣＨ１＿Ｆ９Ａ（対１から）も相互作用を破壊した。逆に、変異体Ｃκ＿Ｆ９Ａ／ＣＨ１、Ｃκ／ＣＨ１＿Ａ２４ＦおよびＣκ／ＣＨ１＿Ａ２４Ｌは、ＣκとＣＨ１との相互作用に影響を与えなかった。これは、対３（Ｃκ＿Ｆ９とＣＨ１＿Ａ２４）がＣκとＣＨ１の結合に重要ではないことを示唆している。

【表36】

実施例３：Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏによる対１の変異対の開発

【0129】

ＣκとＣＨ１との間の相互作用を維持するのに重要な残基対が特定されたところで、この実施例では、新たな相互作用を確立する変異対の試験を行った。この開発の理論的根拠は、変異体Ｃκが変異体ＣＨ１への良好な結合を示し得ることである。しかし、変異体Ｃκは野生型ＣＨ１には結合しない、または弱く結合し、変異体ＣＨ１は野生型Ｃκへの弱い結合を示す、またはまったく結合しない。対１の変異開発

【0130】

対１の残基はＣκ＿Ｑ１７とＣＨ１＿Ｆ９である（表４）。Ｃκ／ＣＨ１＿０３３から０５０のこれらの変異は、発明者によって設計され、解析された。Ｃκ／ＣＨ１＿０５１－０６６変異対は、この部位のランダムな変異を設計するために、ソフトウェアプログラムＤｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ（ＤＳ）によって開発された。以下に示すように、Ｃκ＿Ｑ１７とＣＨ１＿Ｆ９の８つの対が生成された。

【表37】

注：変異エネルギー：変異後のエネルギー差。低い値はより安定していることを意味する。ＶＤＷ：ファンデルワールス

【表38】

【表68】

【0131】

２つの良好な変異対を以下に示す。

【表39】

実施例４：Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏによる対２の変異対の開発

【0132】

対２において、アラニン／トリプトファンの単一変異の試験を各界面残基について行った。ＶＨおよびＶＬを含まないＩｇＧ（－Ｆｖ）を構築し、ＡｌａおよびＴｒｐスクリーニング用に発現させた。この実施例では、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏを使用して、この部位のランダムな変異を設計した。

【0133】

３つの良好な変異対は、以下に示すＣκ／ＣＨ１＿０７２、Ｃκ／ＣＨ１＿０７９、およびＣκ／ＣＨ１＿１０７である。

【表40】

対２の変異開発

【0134】

対２の重要な残基は、Ｃκ＿Ｆ１１＿Ｖ２６とＣＨ１＿Ｌ１１＿Ｌ２８である（表４を参照）。このホットスポットの変異開発の戦略は、変異Ｖ２６ＷまたはＬ１１Ｗを修正することである。この実施例では、Ｃκ＿Ｆ１１＿Ｖ２６およびＣＨ１＿Ｌ１１＿Ｌ２８の飽和点変異の導入の試験も行った。次に、ＤＳを適用してすべての有力な変異を計算した。

【0135】

戦略Ｉ：固定変異Ｖ２６Ｗを使用して、ランダムな点変異をＣＨ１＿Ｌ１１＿Ｌ２８に導入した。次に、ＤＳソフトウェアを使用して、この部位にいくつかの変異対を生成した。いくつかの好ましい変異対は以下に示す通りである。

【表41】

【表42】

【表43】

【0136】

戦略２：固定変異Ｌ１１Ｗを使用して、ランダムな点変異をＣκ＿Ｆ１１＿Ｖ２６に導入した。次に、ＤＳソフトウェアを使用して、この部位にいくつかの変異対を生成した。いくつかの好ましい変異対は以下に示す通りである。

【表44】

【表45】

【表46】

【0137】

戦略３：Ｃκ＿Ｆ１１＿Ｖ２６およびＣＨ１＿Ｌ１１＿Ｌ２８に飽和点変異を導入した。次に、ＤＳを使用してすべての有力な変異を計算した。以下に示す２３の好ましい変異対が生成された。

【表47】

【表69】

【0138】

上記の変異対に基づき、対１において、すべての変異対をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって解析した（還元および非還元、図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、図４Ｄ）。対２では、自由エネルギーが最も低いいくつかの有力な変異対を解析用に選択した。すべての変異対のうちで、３つの変異対Ｃκ／ＣＨ１＿１０７がより有力である。結果は、公開された変異対に匹敵し得る。ＶＨおよびＶＬを含まないＩｇＧ（－Ｆｖ）を構築し、各変異対において発現させた。変異リストは以下に示す通りである。

【0139】

３つの良好な変異対は、以下に示すＣκ／ＣＨ１＿０７２、Ｃκ／ＣＨ１＿０７９、Ｃκ／ＣＨ１＿１０７である。

【表48】

【0140】

図５Ａ～図５ＢのＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル写真に示すように、変異対Ｃκ＿Ｖ２６Ｗ／ＣＨ１＿Ｌ１１Ｗにより、ＣκとＣＨ１との間の結合が再確立された（Ｃκ＿Ｌ２８Ｙ＿Ｓ６９Ｗ／ＣＨ１＿Ｈ５１Ａ＿Ｆ５３Ｇを対照として使用した）。

【表49】

【表70】

【表71】

実施例５：Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏによる変異対Ｃκ＿Ｖ２６Ｗ／ＣＨ１＿Ｌ１１Ｗの改善

【0141】

戦略４：固定変異Ｃκ＿Ｖ２６ＷおよびＣＨ１＿Ｌ１１Ｗを使用して、飽和点変異をＣκ＿Ｆ１１およびＣＨ１＿Ｌ２８に導入した。次に、ＤＳを使用してすべての有力な変異を計算した。以下に示す２３の好ましい変異対が生成された。

【表50】

実施例６：変異対の開発

【0142】

対２において、アラニン／トリプトファンの単一変異の試験を、各界面残基について行った。ＶＨおよびＶＬを含まないＩｇＧ（－Ｆｖ）を構築し、ＡｌａおよびＴｒｐスクリーニング用に発現させた。変異リストは以下に示す通りである。

【表51】

【表72】

実施例７：塩橋の改変

【0143】

実施例１のＣｋとＣＨ１の界面相互作用の解析では、１Ｆ８、１ＣＺ８、１Ｌ７Ｉ、および４ＮＹＬのＣＨ１とＣｋとの間の一般的な塩橋が次の通りであることを示す。

【表52】

【0144】

１Ｆ８と１ＣＺ８にはもう１つの塩橋がある。

【表53】

【0145】

したがって、この実施例では、２つの塩橋を有する１Ｆ８のＣＨ１とＣｋに焦点を当て、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏを使用して、変異したＣＨ１またはＣｋと、それらのＷＴ相対物との結合を無効にし、変異したＣＨとＣｋと新たな塩橋との結合を再建する新たな塩橋対をＣＨ１とＣｋ内に設計した。

【0146】

塩橋ＣＨ１＿ＬＹＳ９６およびＣｋ＿ＧＬＵ１６の設計以下の表に示すように、２つの対は新たな塩橋でＣＨ１^ｍｕｔとＣｋ^ｍｕｔを安定化させることを示した。
ＣＨ１：ＬＹＳ９６＞ＡＳＰ変異およびＣｋ：ＧＬＵ１６＞ＡＲＧ変異
ＣＨ１：ＬＹＳ９６＞ＧＬＵ変異およびＣｋ：ＧＬＵ１６＞ＡＲＧ変異

【表54】

【0147】

Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏをさらに使用して、新たなＣκ＿Ｖ２６ＷおよびＣＨ１＿Ｌ１１Ｗと相乗作用を呈し、変異したＣＨ１またはＣｋとそれらのＷＴ相対物との結合を無効にし、変異したＣＨとＣκとの間の結合を再構築し得る新たな塩橋を発見した。以下の表に示すように、３つの対がＣκ＿Ｖ２６ＷおよびＣＨ１＿Ｌ１１Ｗと相乗的にＣＨ１^ｍｕｔおよびＣｋ^ｍｕｔを安定化させることが示された。ＣＨ１：ＬＥＵ１１＞ＴＲＰ；ＬＹＳ９６＞ＧＬＵ変異とＣｋ：ＧＬＵ１６＞ＬＹＳ；ＶＡＬ２６＞ＴＲＰ変異ＣＨ１：ＬＥＵ１１＞ＴＲＰ；ＬＹＳ９６＞ＧＬＵ変異とＣｋ：ＧＬＵ１６＞ＡＲＧ；ＶＡＬ２６＞ＴＲＰ変異ＣＨ１：ＬＥＵ１１＞ＴＲＰ；ＬＹＳ１０１＞ＧＬＵ変異とＣｋ：ＡＳＰ１５＞ＬＹＳ；ＶＡＬ２６＞ＴＲＰ変異
［表５］ＣＨ１＿Ｋ９６／Ｃκ＿Ｅ１６の変異

【表55】

［表６］ＣＨ１＿Ｋ１０１／Ｃκ＿Ｄ１５の変異

【表56】

実施例８：改変された塩橋の試験

【0148】

ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３またはＣκをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドを構築した。以下に示すように、一部のドメインに変異を導入した。

【0149】

プラスミドは、タンパク質発現のために２９３Ｆ細胞に一時的にトランスフェクトした。タンパク質は、タンパク質Ａカラムと抗ＦＬＡＧアフィニティゲルで精製し、精製したタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ（レーンあたり５μｇ）で解析した。タンパク質Ａは重鎖のみに結合するため、軽鎖の密度は重鎖と軽鎖との間の結合の強さを示している。

【0150】

最初のバッチにおいて、１３の抗体の試験を行った。これらの抗体に含まれる変異を表７に示す。
［表７］変異を含む試験抗体

【表57】

【0151】

結果を図６Ａに示す。Ｃκ／ＣＨ１＿００１（野生型）とＣκ／ＣＨ１＿１０７（ＣＨ１のＬ１１ＷおよびＣκのＶ２６Ｗ）において、良好な結合が観察された。Ｃκ／ＣＨ１＿２０３には、野生型塩橋（Ｋ９６－Ｅ１６）を破壊する陽性から陰性および陰性から陽性の変異対が含まれていた。Ｃκ／ＣＨ１＿２１０（ＣＨ１のＬ１１ＷおよびＫ９６Ｄ、ならびにＣκのＶ２６ＷおよびＥ１６Ｒ）の結合は、Ｋ９６ＤとＥ１６Ｒとの結合よりも著しく強かった。逆に、各変異鎖はより明らかに野生型相対物に結合することができなかった（Ｃκ／ＣＨ１＿２０８およびＣκ／ＣＨ１＿２０９を参照）。

【0152】

Ｃκ／ＣＨ１＿２０７、Ｌ１１ＷとＫ９６Ｅを有するＣＨ１、およびＥ１６ＫとＶ２６Ｗを有するＣκの変異鎖も、変異体内でそれらの野生型相対物よりも多くの結合を示した（Ｃκ／ＣＨ１＿２０５およびＣκ／ＣＨ１＿２０６を参照）。

【0153】

第２のバッチでは、７の抗体の試験を行った。これらの抗体に含まれる変異を、表８に示す。
［表８］変異を有する試験抗体

【表58】

【0154】

結果を図６Ｂに示す。Ｃκ／ＣＨ１＿２１３、Ｌ１１ＷとＫ９６Ｅとを有するＣＨ１、およびＥ１６ＲとＶ２６Ｗとを有するＣκの変異鎖は、変異体内でそれらの野生型相対物よりも多くの結合を示した（Ｃκ／ＣＨ１＿２０５およびＣκ／ＣＨ１＿２０６を参照）。

【0155】

第３のバッチでは、１５の抗体の試験を行った。これらの抗体に含まれる変異を、表９に示す。
［表９］変異を有する試験抗体

【表59】

【0156】

図６Ｃに示すように、Ｃκ／ＣＨ１＿２２３（Ｋ１０１Ｅ－Ｄ１５Ｋ）とＣκ／ＣＨ１＿２２４（Ｋ１０１Ｅ－Ｄ１５Ｈ）において再建された塩橋は、変異した重鎖と軽鎖との間に強い相互作用をもたらし、それらはそれぞれ個別に、Ｃκ／ＣＨ１＿１０７（ＣＨ１のＬ１１ＷおよびＣκのＶ２６Ｗ）と比較して、明らかに野生型相対物と結合できなかった。図に示すように、変異体間の強い結合は、Ｌ１１ＷとＶ２６Ｗとの間の疎水性相互作用にも基づく。つまり、疎水性相互作用と新たな塩橋との間の相乗作用により、強い結合と高い特異性がもたらされ、これは多重特異性抗体の設計に役立つ。実施例９：二重特異性抗体の構築

【0157】

軽鎖の不一致に対するＣＨ１／Ｃｋ変異の影響をさらに評価するために、ＣＨ３ドメインにおけるＤＥ／ＥＥ変異を使用することにより、ＩｇＧのようなヘテロダイマ二重特異性形式を使用した（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． （２０１７） ２９２（３５） １４７０６－１４７１７）。ＰＤＬ１／ＣＤ７３対を使用して、二重特異性抗体を構築した。

【0158】

ＰＤＬ１／ＣＤ７３対の設計を、次の表に示す。

【表60】

【0159】

図８Ａに示すように、設計されたすべての対はＥＬＩＳＡによるＰＤＬ１部分の結合に影響を与えなかったが、ＣＤ４７の結合能力は損なわれた。Ｂ５０２４Ｃκ／ＣＨ１＿２０７変異（ＣＨ１：Ｌ１１Ｗ／Ｋ９６Ｅ；Ｃκ：Ｅ１６Ｋ／Ｖ２６Ｗ）およびＢ５０２３Ｃκ／ＣＨ１＿２１０変異（ＣＨ１：Ｌ１１Ｗ／Ｋ９６Ｄ；Ｃκ：Ｅ１６Ｒ／Ｖ２６Ｗ）は、ＥＬＩＳＡによってＣＤ７３部分の抗原結合を復元できる。さらに、ＰＤＬ１シグナリングアッセイおよびＣＤ７３酵素活性アッセイは、ＥＬＩＳＡ結合で同様のパターンを示した（図８Ｂ）。これに関して、すべてのＰＤＬ１部分は同様のＰＤＬ１拮抗作用を示し、Ｂ５０２４およびＢ５０２３のみが有力なＣＤ７３拮抗作用を示した。この対では、ＰＤＬ１の軽鎖によりＣＤ７３アームの機能が著しく損なわれたが、ＣＤ７３軽鎖はＰＤＬ１アームにほとんど影響しなかった。Ｃκ／ＣＨ１＿２０７とＣκ／ＣＨ１＿２１０の変異はどちらもＣＤ７３の機能を復元することができ、ＰＤＬ１アームには影響を与えなかった。これは、ＣＨ１／Ｃｋ変異が、軽鎖の不一致を防ぎ得ることを示唆している。

【0160】

本開示は、本開示の個々の態様の単一の例示として意図される、記載された特定の実施形態によって範囲が限定されるべきではなく、機能的に同等である任意の組成物または方法は、本開示の範囲内である。本開示の精神または範囲から逸脱することなく、本開示の方法および組成物において様々な修正および変更を行うことができることは、当業者には明らかであろう。したがって、本開示は、添付の特許請求の範囲およびそれらの等価物の範囲内に入るという条件で、本開示の修正および変更をカバーすることが意図されている。

【0161】

この明細書で言及されたすべての出版物および特許出願は、個々の出版物または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されている場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図8A】

【図8B】