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特許6997710ＭＹＲＳＩＮＥ ＡＦＲＩＣＡＮＡの抽出物を含む局所スキンケア組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2021-12-21
(45)【発行日】2022-01-18
(54)【発明の名称】ＭＹＲＳＩＮＥ ＡＦＲＩＣＡＮＡの抽出物を含む局所スキンケア組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 8/9789 20170101AFI20220107BHJP
A61Q 19/08 20060101ALI20220107BHJP
A61Q 19/00 20060101ALI20220107BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20220107BHJP
A61K 36/185 20060101ALI20220107BHJP
A61K 9/06 20060101ALI20220107BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20220107BHJP
A61K 9/10 20060101ALI20220107BHJP
A61K 9/107 20060101ALI20220107BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220107BHJP
A61K 47/08 20060101ALI20220107BHJP
A61K 47/14 20060101ALI20220107BHJP
【ＦＩ】
A61K8/9789
A61Q19/08
A61Q19/00
A61P17/00
A61K36/185
A61K9/06
A61K9/08
A61K9/10
A61K9/107
A61P43/00 111
A61K47/08
A61K47/14
【請求項の数】
7
(21)【出願番号】P 2018530090
(86)(22)【出願日】2016-12-08
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2018-12-13
(86)【国際出願番号】 IB2016057427
(87)【国際公開番号】W WO2017098426
(87)【国際公開日】2017-06-15
【審査請求日】2019-07-10
(31)【優先権主張番号】2015/08992
(32)【優先日】2015-12-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】ZA
(73)【特許権者】
【識別番号】501494425
【氏名又は名称】ユニバーシティ オブ プレトリア
(74)【代理人】
【識別番号】110001416
【氏名又は名称】特許業務法人 信栄特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ロール，ネイムリタ
【審査官】駒木 亮一
(56)【参考文献】
【文献】特開２００３－２０１２２６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１３－１５５１７４（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２００３／０１１５６８７（ＵＳ，Ａ１）
【文献】South African Journal of Botany，2008年，Vol.74，pp.577-582
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ８／００－８／９９
Ａ６１Ｑ １／００－９０／００
Ａ６１Ｋ ９／００－９／７２
Ａ６１Ｋ４７／００－４７／６９
Ａ６１Ｋ ３６／００－３６／０５
Ａ６１Ｋ ３６／０７－３６／９０６８
Ａ６１Ｐ１／００－４３／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｉｒｅｃｔ
Ｊａｐｉｏ－ＧＰＧ／ＦＸ
Ｍｉｎｔｅｌ ＧＮＰＤ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
皮膚のエラスターゼ活性を阻害して皺の出現を低減する美容方法における、Ｍｙｒｓｉｎｅ ａｆｒｉｃａｎａのエタノール葉抽出物と皮膚科学的に許容されるビヒクルを含む局所スキンケア組成物の使用であって、前記エタノール葉抽出物がミルシノシドＢを含む、使用（ヒトに対する医療行為を除く）。
【請求項2】
皮膚科学的に許容されるビヒクルが、水溶液、バーム、クリーム、エマルジョン、精油、ゲル、ローション、オイル、軟膏、美容液、スプレー、日焼け止め、懸濁液及び化粧水からなる群から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項3】
被験体の皺の予防又は処置の美容方法における、Ｍｙｒｓｉｎｅ ａｆｒｉｃａｎａのエタノール葉抽出物の使用であって、前記エタノール葉抽出物がミルシノシドＢを含む、使用（ヒトに対する医療行為を除く）。
【請求項4】
皺の予防又は処置が、前記ミルシノシドＢによるエラスターゼ活性の阻害の結果である、請求項３に記載の使用。
【請求項5】
Ｍｙｒｓｉｎｅ ａｆｒｉｃａｎａのエタノール葉抽出物を含む局所スキンケア組成物であって、前記エタノール葉抽出物がミルシノシドＢを含む局所スキンケア組成物を、それを必要とする被験体の皮膚に局所適用することを含む、皮膚のエラスターゼ活性を阻害して皺の出現を低減する美容方法（ヒトに対する医療行為を除く）。
【請求項6】
前記局所スキンケア組成物が皮膚科学的に許容されるビヒクルを含む、請求項５に記載の美容方法。
【請求項7】
皮膚科学的に許容されるビヒクルが、水溶液、バーム、クリーム、エマルジョン、精油、ゲル、ローション、オイル、軟膏、美容液、スプレー、日焼け止め、懸濁液及び化粧水からなる群から選択される、請求項６に記載の美容方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、Ｍｙｒｓｉｎｅ ａｆｒｉｃａｎａの植物抽出物を製造する方法、該抽出物を含む局所製剤及びそれらの使用に関する。本発明の方法に従って製造された抽出物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの研究においてエラスターゼ酵素に対する阻害活性を示す。
【背景技術】
【0002】
Ｍｙｒｓｉｎａｃｅａｅ科に属するＭｙｒｓｉｎｅ ａｆｒｉｃａｎａは、サルスベリ（Ｃａｐｅ Ｍｙｒｔｌｅ）、アフリカツゲ（Ａｆｒｉｃａｎ ｂｏｘｗｏｏｄ）又はＴｈａｋｉｓａとしても知られる小灌木である。この植物はマカロネシア、アフリカ、南アジアの原産である。それは、南アフリカの至る所で見られ、通常、夏の降雨と冬の降雨が発生する地域で見られる。それは、岩の多い峡谷や森林で自然に生育する。Ｍｙｒｓｉｎｅ ａｆｒｉｃａｎａは密生した暗緑色から赤色の葉を有し、小さな明るい紫色の果実をつける。それは２メートル以上の高さになることがあり、剪定して強い日差しで栽培した場合は群生することがある。クリーム色の花は春に咲き、雄花は赤い葯を誇示する。別々の灌木で雄花又は雌花が咲き、雌花は紫の果実をつける。
【0003】
Ｍｙｒｓｉｎｅ ａｆｒｉｃａｎａには多くの伝統的な用途があることが確認されている。南ソト族の人々は、適切な時期の前にそれを雄羊に与えて雌羊との交尾を防ぐ。ツワナとクエナの人々は、その葉から作られた煎じ薬を「血液浄化剤」として使用した。伝統的な薬物療法では、他の植物と共に、樹皮、根、果実から作られた調合薬は、人間や家畜の駆虫剤として使用されている。植物は伝統的に抗菌剤としても使用されている。中国の民間伝承では、伝統的に下痢、リウマチ、歯痛、肺結核などの病気の治療や出血の軽減に使用されている。またそれは、紅茶、香辛料、駆風剤、食欲促進薬、香味剤の香りとしても使用されている。新鮮な葉の煎じ薬は、乏尿、皮膚アレルギー、腫物の治療や、血液浄化のために、経口的に、６～７日間、１日２回服用できることが報告されている。
【0004】
皮膚の老化は２つの主な要因に起因する：遺伝的プログラム及び特に４０歳以上の人々の年齢に伴う環境ストレス（ＵＶ、界面活性剤、機械的衝撃など）に起因する恒常的な化学放射線障害の２つの主な要因に起因する。皮膚の弾力性はエラスターゼ活性によって著しく低下し、その結果としてたるみが生じる。老化した皮膚の組織学的検査は、あまり老化していない皮膚と比較すると、肥厚した表皮、肥満細胞数と肥大した嚢胞数の増加、炎症細胞の浸潤、エラスチン繊維の部分的欠如と凝集及びコラーゲン線維の減少を示す。生物学的には、エラスターゼ活性は加齢と共に有意に増加し、その結果として皮膚の弾力性が低下し、皺又は皮膚線条が現れる。皮膚の皺形成におけるエラスターゼの重要性のために、エラスターゼ阻害剤は皮膚の老化の制御において有益であり得ると示唆されている。
【0005】
本発明は、Ｍｙｒｓｉｎｅ Ａｆｒｉｃａｎａの抽出物を用いたエラスターゼ酵素やブタ膵臓エラスターゼの阻害物質及び該抽出物の抗皺活性物質としての使用に関する。
【発明の概要】
【0006】
本発明の第１の態様では、エラスターゼ阻害活性を有する植物抽出物の製造方法が提供される。該製造方法は、下記工程を含む。（ｉ）Ｍｙｒｓｉｎｅ ａｆｒｉｃａｎａ植物の葉と小枝を乾燥させる工程；（ｉｉ）乾燥した葉と小枝を粉砕する工程；（ｉｉｉ）粉砕した葉と小枝を有機溶媒と混合して溶液を形成する工程；（ｉｖ）該溶液を濾過して濾液を生成する工程；及び（ｖ）該濾液から有機溶媒を除去してエラスターゼ阻害活性を有する植物抽出物を製造する工程。
【0007】
有機溶媒は、エタノール、メタノール、ブタノール、水又はそれらの混合物からなる群の有機溶媒から選択することができる。好ましくは、有機溶媒はエタノールである。有機溶媒は、好ましくは、エバポレーションによって濾液から除去されるが、当業者に公知の他の任意の方法によって除去することができる。
【0008】
本発明の一実施形態では、植物抽出物に防腐剤を添加することができる。好ましくは、防腐剤はフェノキシエタノールとエチルヘキシルグリセリンの混合物であり、好ましくは約１％（ｗ／ｗ）の防腐剤が植物抽出物に添加される。
【0009】
本発明の別の実施形態では、本発明の方法によって製造された植物抽出物は、局所剤形に調製することができる。局所剤形は、水溶液、バーム、クリーム、エマルジョン、精油、ゲル、ローション、オイル、軟膏、スプレー、日焼け止め、懸濁液又は化粧水からなる群から選択することができる。
【0010】
本発明のさらに別の実施形態では、本発明の方法によって製造された植物抽出物は、Ｎ－スクシニル－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｌａ－ｐ－ニトロアニリドからのｐ－ニトロアニリンの放出を分光光度法により評価したときの５０％阻害濃度（ＩＣ５０）が、２６μｇ／ｍＬ～３０μｇ／ｍＬである。
【0011】
本発明の第２の態様では、本明細書に記載の方法に従って製造されたＭｙｒｓｉｎｅ ａｆｒｉｃａｎａの植物抽出物と皮膚科学的に許容されるビヒクルを含む局所スキンケア組成物が提供される。一実施形態では、本発明の局所スキンケア組成物は、好ましくはエラスターゼ活性を阻害する。さらなる実施形態では、皮膚科学的に許容されるビヒクルは、水溶液、バーム、クリーム、エマルジョン、精油、ゲル、ローション、オイル、軟膏、美容液、スプレー、日焼け止め、懸濁液又は化粧水からなる群から選択される。
【0012】
本発明の第３の態様では、該組成物をそれを必要とする被験体の皮膚に局所適用することを含む、皮膚のエラスターゼ活性を阻害する美容方法に使用する局所スキンケア組成物が提供される。
【0013】
本発明の第４の態様では、被験体の皮膚老化の予防又は治療に使用するための、本明細書に記載の方法によって製造された植物Ｍｙｒｓｉｎｅ ａｆｒｉｃａｎａの植物抽出物が提供される。皮膚老化は、皮膚の弾力性の低下、コラーゲンの減少、エラスチン繊維の減少若しくは凝集及び／又は皺の出現として示され得る。
【0014】
一実施形態では、皮膚老化の予防又は治療は、植物抽出物及び／又はその中に含まれる１つ若しくは複数の化合物によるエラスターゼ活性の阻害の結果である。
【0015】
別の実施形態では、植物抽出物は、葉又は小枝の抽出物である。好ましくは、植物抽出物は、葉及び小枝の抽出物である。一実施形態では、植物抽出物は、有機溶媒由来の植物抽出物である。好ましくは、有機溶媒は、エタノール、メタノール及びブタノールからなる群から選択されるか、又はそれらの混合物である。さらにより好ましくは、有機溶媒はエタノールである。
【0016】
本発明のさらなる態様では、本明細書に記載の局所スキンケア組成物を、それを必要とする被験体の皮膚に局所適用することを含む、皮膚のエラスターゼ活性を阻害する美容方法が提供される。
【0017】
本発明のさらに別の態様では、本明細書に記載の方法によって製造された植物抽出物を被験体の皮膚に局所適用することを含む、被験体の皮膚老化の予防又は治療方法が提供される。
【0018】
本発明の別の態様では、薬学的有効量の粗製又は精製抽出物と薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が提供される。特に、医薬組成物は、被験体、好ましくはヒト被験者に局所投与することができる。
【0019】
本発明の非限定的な実施形態を、以下の図面を参照しながら、単なる例示として記載する。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【発明を実施するための形態】
【0021】
本発明は、Ｍｙｒｓｉｎｅ ａｆｒｉｃａｎａ植物由来のエラスターゼ阻害活性を有する植物抽出物の製造方法及び該方法により製造されたＭｙｒｓｉｎｅ ａｆｒｉｃａｎａの植物抽出物を含有する局所スキンケア組成物、特に皮膚のエラスターゼ活性を阻害する美容方法に使用する植物抽出物および組成物を対象とする。本発明はさらに、被験体の皮膚老化の予防又は治療のための植物Ｍｙｒｓｉｎｅ ａｆｒｉｃａｎａの植物抽出物の使用及び使用方法に関する。
【0022】
ここで、本発明のいくつかの、しかし全てではない実施形態が示される添付の図面を参照しながら本発明をより完全に説明する。
【0023】
記載された本発明は、開示された特定の実施形態に限定されるべきではなく、改変されたもの及び他の実施形態は本発明の範囲内に含まれることが意図される。本明細書では特定の用語を使用しているが、それらは一般的かつ説明的な意味でのみ使用され、限定を目的とするものではない。
【0024】
本明細書及び添付の特許請求の範囲を通して使用される単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、明細書中に特に明示しない限り複数形を含む。
【0025】
本明細書で使用される用語や表現は、説明のためのものであり、限定的であるとみなされるべきではない。本明細書で使用される用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」及び「包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」なる用語やそれらの変形の使用は、その後に列挙される項目及びその等価物ならびに追加の項目を包含することを意味する。
【0026】
その最も広い形態では、本発明は、Ｍｙｒｓｉｎｅ Ａｆｒｉｃａｎａの葉に由来する粗抽出物又は精製抽出物に関する。該抽出物はエラスターゼ阻害活性を示す。該抽出物は、皮膚の皺及びしみの出現を予防又は軽減するために使用される。
【0027】
本発明では、阻害アッセイを設定するための酵素源としてブタ膵臓エラスターゼを使用した。膵臓エラスターゼ阻害活性は、合成基質Ｎ－スクシニル－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｌａ－ｐ－ニトロアニリドからのｐ－ニトロアニリンの放出を分光光度法で測定することによりｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した。
【0028】
また芽から単離された化合物ＭＡ－ＮＲ－０１（ミルシノシド Ｂ）も、そのエラスターゼ阻害活性についてｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した。エラスターゼ阻害活性は、合成基質Ｎ－スクシニル－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｌａ－ｐ－ニトロアニリドからのｐ－ニトロアニリンの放出に基づいている。本発明の葉抽出物は、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）が２８．０４μｇ／ｍｌという良好なエラスターゼ阻害を示した。化合物ミルシノシドＢは１２５μｇ／ｍＬの濃度で、１３．００±１．０４の阻害率を有することが判明した。
【0029】
Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの２つの菌株（ＴＡ ９８及びＴＡ １００）を用いて、コロニーの非増殖を観察して変異原性を試験し、本発明のＭｙｒｓｉｎｅ ａｆｒｉｃａｎａエタノール抽出物は非変異原であると結論した。本発明の抽出物は、ヒト被験者のパッチ試験中に非刺激性であることがさらに判明した。Ｍｙｒｓｉｎｅ ａｆｒｉｃａｎａには無視できるほどの微生物と重金属が含まれていた。本発明のＭｙｒｓｉｎｅ ａｆｒｉｃａｎａ粗抽出物を含有するゲルクリームは、３０℃未満の温度に保たれた場合、２年間安定であることが判明した。被験体に対するｉｎ ｖｉｖｏ試験において、本発明のＭ．ａｆｒｉｃａｎａのエタノール抽出物を５％含有する試験用製品は、プラセボ水性クリームと比較して、１４日間と２８日間について１日２回適用後、皺を減少させるのに有効であることが判明した。
【0030】
本発明の抽出物は、粗抽出物、精製抽出物又は医薬組成物の形態であり得ることが理解される。抽出物、医薬組成物は、皮膚癌に関連する症状に先立って患者に投与することができ、又は、被験者の皮膚癌発症の徴候後に投与することができる。
【0031】
当業者は、天然の植物材料の抽出物を総合的に扱う多くの方法が存在することを認識する。これらの方法には、特に植物抽出物を得るために、少なくとも１つの溶媒に加える天然の植物材料を切断、細断、浸漬及び／又は粉砕することが含まれる。また天然の植物材料は、新鮮な材料でもよいし、乾燥植物材料でもよいことが理解される。
【0032】
溶媒は有機溶媒であってもよい。植物抽出物の製造において典型的に使用される有機溶媒には、エタノール、メタノール、ブタノール、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトン及び／又はそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。
【0033】
本明細書中で使用される用語「粗抽出物」は、適切な溶媒を用いて天然の植物材料から二次代謝産物を除去することによって得られる植物抽出物の濃縮調製物をいう。これは、例えば、天然の植物材料を適切な溶媒に浸漬し、溶媒を除去し、その結果、溶媒の全て又はほぼ全てをエバポレートすることによって行うことができる。本明細書中で使用される用語「精製抽出物」は、粗抽出物の構成成分を互いに分離して得られる抽出物をいう。非限定的な例として、粗抽出物の構成成分は、非極性成分から極性成分を分離することによって互いに分離することができる。その際、活性極性成分及び／又は非極性成分を濃縮することができる。
【0034】
本明細書に記載される本発明の抽出物は、被験体への局所使用に適した抽出物、好ましくはエタノール抽出物である。被験体としては、生きている動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを挙げることができる。
【0035】
抽出物は、例えば、スプレー、クリーム、ローション、バーム、オイル、又は、例えば個人用のロールオン若しくは固形ストリップ等の固形物などの任意の所望の送達形態で製造することができる。例えば、スプレーは、プロパン、ブタン、イソブタン等の従来の噴射剤を、単独で又は当業者に公知の様々な混合物として使用することにより製造できる。既知の担体や添加剤を含む他の従来型の製剤は、当業者には明白であろう。
【0036】
抽出物を含有する本発明の医薬組成物は、局所使用に適した形態とすることができる。医薬組成物の適切な形態は、例えば、ゲル、ローション、クリーム、精油、化粧水、エマルジョン、石鹸、シャンプー、リンス、クレンザー、溶液、軟膏、ゼリー又は懸濁液を含む。
【0037】
医薬組成物の「適切な形態」は、一般的なスキンケア用のクリームやローションを製造するために、「薬学的に許容される担体」や当該分野で公知の他の成分と併用することができる。医薬組成物は、さらに皮膚の吸収を促進する他の成分と併用することができる。
【0038】
抽出物は、当業者に公知の方法によって医薬組成物として製剤化することができる。薬学的に許容される成分を使用することができる。用語「薬学的に許容される」とは、薬理学的又は毒物学的観点から、被験体への投与が許容される特性及び／又は物質を意味する。さらに、「薬学的に許容される」とは、物理的／化学的観点から、製剤学の化学者に公知の製剤、安定性、患者の受容及び生物学的利用能などの因子を意味する。
【0039】
「薬学的に許容される担体」とは、抽出物、医薬組成物及び／又は医薬品を被験体に投与するために安全に使用することができる固体又は液体の充填剤、希釈剤又はカプセル化物質を意味する。
【0040】
抽出物又は抽出物を含有する医薬品の使用は、疾患を予防又は治療するために、有効量の抽出物又は抽出物を含有する医薬組成物の被験体への投与を必然的に伴う。疾患の予防又は治療の文脈における「有効量」という用語は、治療を必要とする個体に、抽出物又は抽出物を含有する医薬組成物を単回用量又は複数回用量のいずれかにより、活性量の植物抽出物を投与することをいう。
【0041】
抽出物及び／又は抽出物を含有する医薬組成物の適切な投与量に関していくつかの指標が与えられているが、有効量の正確な投与量及び投与頻度はいくつかの因子に依存する。これらの因子には、使用される個々の成分、抽出物又は抽出物を含む医薬組成物の剤形、処置される疾患、疾患の重症度、処置される被験者の年齢、体重、健康状態及び一般的な身体状態、被験者が服用している可能性がある他の薬物、並びに、当業者に公知のその他の因子が含まれる。有効量は、日常的な試験によって決められる比較的広い範囲が含まれることが期待される。
【0042】
以下の実施例は、例示のために提供されるものであり、限定するものではない。
【実施例】
【0043】
材料
ブタ膵臓のエラスターゼＩＶ型［Ｅ．Ｃ．３．４．２１．３６］（Ｅ０２５８，Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ），Ｎ－スクシニル－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｌａ－ｐ－ニトロアニリド（Ｓ４７６０，Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）及び陽性対照ウルソール酸（Ｕ００１，Ｎａｔｕｒａｌ Ｒｅｍｅｄｉｅｓ Ｐｖｔ．Ｌｔｄ．，インド）。Ｔｒｉｚｍａ（商標）塩基：Ｔ１５０３（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）及び塩酸（Ｈ００９０、Ｒａｎｋｅｍ、インド）。エタノール、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、基本培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、マウスメラノサイト細胞株Ｂ１６－Ｆ１０、３－［１－（フェニルアミノカルボニル）－３，４－テトラゾリウム］－ビス（４－メトキシ－６－ニトロ）ベンゼンスルホン酸ヒドラート ナトリウム塩（ＸＴＴ）、コウジ酸、アルブチン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ－メチルジベンゾピラジンメチルスルファート（ＰＭＳ）、デキストロース、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４・Ｈ２Ｏ）、クエン酸一水和物、無水（第二）リン酸カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）、リン酸アンモニウムナトリウム（Ｎａ２ＮＨ２ＰＯ４．４Ｈ２Ｏ）、寒天（Ｄｉｆｃｏ ａｇａｒ）、ＸＶＢ塩溶液、４０％グルコース、Ｄ－ビオチン、Ｌ－ヒスチジン、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、ニュートリエントブロスナンバー２（ｏｘｏｉｄ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ ｎｕｍｂｅｒ ２）、ナトリウム一塩基酸（ＮａＨ２ＰＯ４．Ｈ２Ｏ）、ナトリウム二塩基酸（Ｎａ２ＨＰＯ４．Ｈ２Ｏ）、ニュートリエントブロス（Ｏｘｏｉｄ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ）、４－ニトロキノリン－１－酸化物（４－ＮＱＯ）及びＥｕｘｙｌ ＰＥ ９０１０
ブタ膵臓のエラスターゼＩＶ型［Ｅ．Ｃ．３．４．２１．３６］（Ｅ０２５８，Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ），Ｎ－スクシニル－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｌａ－ｐ－ニトロアニリド（Ｓ４７６０，Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）及び陽性対照ウルソール酸（Ｕ００１，Ｎａｔｕｒａｌ Ｒｅｍｅｄｉｅｓ Ｐｖｔ．Ｌｔｄ．，インド）。Ｔｒｉｚｍａ（商標）塩基：Ｔ１５０３（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）及び塩酸（Ｈ００９０、Ｒａｎｋｅｍ、インド）。エタノール、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、基本培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、マウスメラノサイト細胞株Ｂ１６－Ｆ１０、３－［１－（フェニルアミノカルボニル）－３，４－テトラゾリウム］－ビス（４－メトキシ－６－ニトロ）ベンゼンスルホン酸ヒドラート ナトリウム塩（ＸＴＴ）、コウジ酸、アルブチン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ－メチルジベンゾピラジンメチルスルファート（ＰＭＳ）、デキストロース、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４・Ｈ２Ｏ）、クエン酸一水和物、無水（第二）リン酸カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）、リン酸アンモニウムナトリウム（Ｎａ２ＮＨ２ＰＯ４．４Ｈ２Ｏ）、寒天（Ｄｉｆｃｏ ａｇａｒ）、ＸＶＢ塩溶液、４０％グルコース、Ｄ－ビオチン、Ｌ－ヒスチジン、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、ニュートリエントブロスナンバー２（ｏｘｏｉｄ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ ｎｕｍｂｅｒ ２）、ナトリウム一塩基酸（ＮａＨ２ＰＯ４．Ｈ２Ｏ）、ナトリウム二塩基酸（Ｎａ２ＨＰＯ４．Ｈ２Ｏ）、ニュートリエントブロス（Ｏｘｏｉｄ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ）、４－ニトロキノリン－１－酸化物（４－ＮＱＯ）及びＥｕｘｙｌ ＰＥ ９０１０
【0044】
実施例１
植物採集及びエタノール抽出物の調製
Ｍｙｒｓｉｎｅ ａｆｒｉｃａｎａの葉は、南アフリカのプレトリアにあるＭａｎｉｅ ｖａｎ ｄｅｒ Ｓｃｈｉｊｆｆ Ｂｏｔａｎｉｃａｌ Ｇａｒｄｅｎで、２０１１年に採集された。植物材料（葉及び小枝）を２週間陰干しし、次いで粉砕して微粉にした。乾燥粉末を蒸留エタノールに浸漬し、４８時間抽出した。ブフナー漏斗で濾過した後、植物の濾液を回収した。濾液をロータリーエバポレーターを用いて減圧下に置いた後、抽出物を回収した。抽出物は、その後の使用まで涼しい場所で保存した。この抽出物を用いて、エラスターゼ阻害、細胞毒性及び変異原性について試験した。乾燥した葉のエタノール抽出物（３００ｍｇ）を７０％エタノールに溶解し、刺激性、微生物性、金属性及び生理化学的ならびにｉｎ ｖｉｖｏ有効性試験に使用した。
植物採集及びエタノール抽出物の調製
Ｍｙｒｓｉｎｅ ａｆｒｉｃａｎａの葉は、南アフリカのプレトリアにあるＭａｎｉｅ ｖａｎ ｄｅｒ Ｓｃｈｉｊｆｆ Ｂｏｔａｎｉｃａｌ Ｇａｒｄｅｎで、２０１１年に採集された。植物材料（葉及び小枝）を２週間陰干しし、次いで粉砕して微粉にした。乾燥粉末を蒸留エタノールに浸漬し、４８時間抽出した。ブフナー漏斗で濾過した後、植物の濾液を回収した。濾液をロータリーエバポレーターを用いて減圧下に置いた後、抽出物を回収した。抽出物は、その後の使用まで涼しい場所で保存した。この抽出物を用いて、エラスターゼ阻害、細胞毒性及び変異原性について試験した。乾燥した葉のエタノール抽出物（３００ｍｇ）を７０％エタノールに溶解し、刺激性、微生物性、金属性及び生理化学的ならびにｉｎ ｖｉｖｏ有効性試験に使用した。
【0045】
ミルシノシドＢの単離
風乾し、粉末化した芽（２．３ｋｇ）をエタノールに浸漬し、ロータリーシェーカー上で３日間連続的に攪拌して抽出物を得た。芽の乾燥エタノール抽出物（８８ｇ）をエタノールに再溶解し、８００ｍｌの蒸留水に懸濁した。水懸濁液を、石油エーテル、クロロホルム、酢酸エチル及びｎ－ブタノールを用いて連続的に分配した。有機層をロータリーエバポレーターを用いてエバポレートし、４０℃で乾燥させ、別々の画分を得た。ＥｔＯＡｃ画分（１８．７ｇ）をｎ－ヘキサン－酢酸エチル－メタノール－水の溶離液を用いるシリカゲルカラムに付した。同様の画分をＴＬＣプロファイルに基づいてプールし、合計７つの主な画分（ＭＦ－１～ＭＦ－７）を得た。ＭＦ－２（１．２５ｇ）を、極性増加勾配のジクロロメタン：メタノール（０％～１００％）の溶離液を用いるシリカゲルカラムに付した。副画分２－４（０．５ｇ）を、ＤＣＭ：ＭｅＯＨ（７：１）を用いるシリカゲル上で再度クロマトグラフィーにかけた。化合物ミルシノシドＢ（ＭＡ－ＮＲ－０１；２５７ｍｇ、乾燥植物材料の０．０１１１％）を得た。
風乾し、粉末化した芽（２．３ｋｇ）をエタノールに浸漬し、ロータリーシェーカー上で３日間連続的に攪拌して抽出物を得た。芽の乾燥エタノール抽出物（８８ｇ）をエタノールに再溶解し、８００ｍｌの蒸留水に懸濁した。水懸濁液を、石油エーテル、クロロホルム、酢酸エチル及びｎ－ブタノールを用いて連続的に分配した。有機層をロータリーエバポレーターを用いてエバポレートし、４０℃で乾燥させ、別々の画分を得た。ＥｔＯＡｃ画分（１８．７ｇ）をｎ－ヘキサン－酢酸エチル－メタノール－水の溶離液を用いるシリカゲルカラムに付した。同様の画分をＴＬＣプロファイルに基づいてプールし、合計７つの主な画分（ＭＦ－１～ＭＦ－７）を得た。ＭＦ－２（１．２５ｇ）を、極性増加勾配のジクロロメタン：メタノール（０％～１００％）の溶離液を用いるシリカゲルカラムに付した。副画分２－４（０．５ｇ）を、ＤＣＭ：ＭｅＯＨ（７：１）を用いるシリカゲル上で再度クロマトグラフィーにかけた。化合物ミルシノシドＢ（ＭＡ－ＮＲ－０１；２５７ｍｇ、乾燥植物材料の０．０１１１％）を得た。
【0046】
実施例２
エラスターゼ阻害アッセイ
サンプル調製
Ｍ． ａｆｒｉｃａｎａの葉抽出物と化合物から、５００μｇ／ｍＬ及び１１２０μｇ／ｍＬのサンプル保存液をそれぞれ調製した。簡潔には、２．５ｍｇの抽出物及び２．２４ｍｇの化合物を秤量し、１００μＬのメタノールに溶解した。次に、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて、抽出物については５ｍＬの量、化合物については２ｍＬの量とした。アッセイ用に必要に応じて次の希釈を行った。化合物ＭＡ－ＮＲ－０１（ミルシノシド Ｂ）を、実施例１に記載の標準手順を用いて単離した。
エラスターゼ阻害アッセイ
サンプル調製
Ｍ． ａｆｒｉｃａｎａの葉抽出物と化合物から、５００μｇ／ｍＬ及び１１２０μｇ／ｍＬのサンプル保存液をそれぞれ調製した。簡潔には、２．５ｍｇの抽出物及び２．２４ｍｇの化合物を秤量し、１００μＬのメタノールに溶解した。次に、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて、抽出物については５ｍＬの量、化合物については２ｍＬの量とした。アッセイ用に必要に応じて次の希釈を行った。化合物ＭＡ－ＮＲ－０１（ミルシノシド Ｂ）を、実施例１に記載の標準手順を用いて単離した。
【0047】
葉のエタノール抽出物及び化合物ＭＡ－ＮＲ－０１のエラスターゼ阻害アッセイ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
エラスターゼ阻害アッセイは、変更を加えたＢｉｅｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９７４）の方法により大規模に行った。要約すると、プレインキュベーション混合物は、１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）又はビヒクル緩衝液、陽性対照又は様々な濃度の試験サンプルと共に４．９４２ｍＵのエラスターゼ酵素を含有していた。試薬を混合し、混合物を３７℃で１５分間プレインキュベートした。プレインキュベーション後、基質（Ｎ－スクシニル－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｌａ－ｐ－ニトロアニリド）を添加して０．３３８ｍＭの最終濃度とし、溶液を混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。マイクロプレートリーダー（Ｖｅｒｓａｍａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ、ＵＳＡ）において、４０５ｎｍで吸光度を測定した。試験サンプルなしで対照の反応を行った。
エラスターゼ阻害アッセイは、変更を加えたＢｉｅｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９７４）の方法により大規模に行った。要約すると、プレインキュベーション混合物は、１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）又はビヒクル緩衝液、陽性対照又は様々な濃度の試験サンプルと共に４．９４２ｍＵのエラスターゼ酵素を含有していた。試薬を混合し、混合物を３７℃で１５分間プレインキュベートした。プレインキュベーション後、基質（Ｎ－スクシニル－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｌａ－ｐ－ニトロアニリド）を添加して０．３３８ｍＭの最終濃度とし、溶液を混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。マイクロプレートリーダー（Ｖｅｒｓａｍａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ、ＵＳＡ）において、４０５ｎｍで吸光度を測定した。試験サンプルなしで対照の反応を行った。
【0048】
酵素の阻害率（％）は以下のように算出した：
【0049】
【数1】
【0050】
ＩＣ５０は、ログ・プロビット法（ｌｏｇ－ｐｒｏｂｉｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）を用いて算出した。
【0051】
そのエラスターゼ阻害活性について、エラスターゼ阻害アッセイを用いてＭ．ａｆｒｉｃａｎａの葉抽出物を評価した。該アッセイは、分光光度法により測定されるＮ－スクシニル－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｌａ－ｐ－ニトロアニリドからのｐ－ニトロアニリンの放出に基づく。Ｍｙｒｓｉｎｅ ａｆｒｉｃａｎａのエタノール抽出物は、ＩＣ５０が２８．０４μｇ／ｍＬという、期待できるエラスターゼ阻害活性を示した（表１）。
【0052】
そのエラスターゼ阻害活性について、単離した化合物ＭＡ－ＮＲ－０１（ミルシノシド Ｂ）をさらに評価した。１２５μｇ／ｍＬの濃度において、酵素の阻害パーセントは１３．００±１．０４％であることが判明した（表１）。
【0053】
【表1】
【0054】
実施例３
変異原性
グルコース溶液の調製（４０％）
１Ｌのフラスコ中で、１Ｌの蒸留水を４００ｇのデキストロースに添加した。溶液を透明になるまでマグネチックスターラー上に置いた。次いで、フラスコを１２１℃で２０分間オートクレーブ処理した。次いで、溶液を４℃で保存（冷蔵）した。
変異原性
グルコース溶液の調製（４０％）
１Ｌのフラスコ中で、１Ｌの蒸留水を４００ｇのデキストロースに添加した。溶液を透明になるまでマグネチックスターラー上に置いた。次いで、フラスコを１２１℃で２０分間オートクレーブ処理した。次いで、溶液を４℃で保存（冷蔵）した。
【0055】
ＸＶＢ塩溶液（Ｖｏｇｅｌ－Ｂｏｎｎｅｒ培地Ｅ（５０×））の調製
温蒸留水（６５０ｍＬ）を、マグネチックスターラー上の２Ｌフラスコ中の硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４．Ｈ２Ｏ）１０ｇ、クエン酸一水和物１００ｇ、無水（第二）リン酸カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）５００ｇ及びリン酸アンモニウムナトリウム（Ｎａ２ＮＨ２ＰＯ４．４Ｈ２Ｏ）１７５ｇ（各々の新しい塩の添加前に完全に前のものが溶解していることを確認した）に加えた。次に蒸留水を最終的に容量１Ｌになるまで添加した。次いで、溶液を１２１℃で３０分間オートクレーブ処理し、その後放冷し、室温で暗所に保存した。
温蒸留水（６５０ｍＬ）を、マグネチックスターラー上の２Ｌフラスコ中の硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４．Ｈ２Ｏ）１０ｇ、クエン酸一水和物１００ｇ、無水（第二）リン酸カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）５００ｇ及びリン酸アンモニウムナトリウム（Ｎａ２ＮＨ２ＰＯ４．４Ｈ２Ｏ）１７５ｇ（各々の新しい塩の添加前に完全に前のものが溶解していることを確認した）に加えた。次に蒸留水を最終的に容量１Ｌになるまで添加した。次いで、溶液を１２１℃で３０分間オートクレーブ処理し、その後放冷し、室温で暗所に保存した。
【0056】
グルコース最小寒天プレートの調製
寒天（Ｄｉｆｃｏ ａｇａｒ）（１５ｇ）を９００ｍＬの蒸留水に添加した。その後、該溶液を１２１℃で３０分間オートクレーブし、約６５℃に冷却した。その後、滅菌したＸＶＢ塩溶液２０ｍＬをフラスコに加え、確実に混合した。最後に、５０ｍＬの４０％グルコース溶液を同じフラスコに加え、確実に混合した。次いで、混合物を１００×１５ｍｍペトリ皿に分注した（各プレート中に±２５～３０ｍＬの寒天）。プレートを密封したプラスチックバッグに入れる前に固化し、４℃で一晩保存した。翌日、プレートを室温に戻した後、試験に使用した。
寒天（Ｄｉｆｃｏ ａｇａｒ）（１５ｇ）を９００ｍＬの蒸留水に添加した。その後、該溶液を１２１℃で３０分間オートクレーブし、約６５℃に冷却した。その後、滅菌したＸＶＢ塩溶液２０ｍＬをフラスコに加え、確実に混合した。最後に、５０ｍＬの４０％グルコース溶液を同じフラスコに加え、確実に混合した。次いで、混合物を１００×１５ｍｍペトリ皿に分注した（各プレート中に±２５～３０ｍＬの寒天）。プレートを密封したプラスチックバッグに入れる前に固化し、４℃で一晩保存した。翌日、プレートを室温に戻した後、試験に使用した。
【0057】
ヒスチジン／ビオチン溶液（０．５ｍＭ）の調製
蒸留水（１Ｌ）を沸騰させ、Ｄ－ビオチン１２４ｍｇとＬ－ヒスチジン９６ｍｇを水に溶解した。
蒸留水（１Ｌ）を沸騰させ、Ｄ－ビオチン１２４ｍｇとＬ－ヒスチジン９６ｍｇを水に溶解した。
【0058】
追加の上層寒天の調製
寒天６ｇと６ｇのＮａＣｌを９００ｍＬの蒸留水に加えた。混合物をオートクレーブ中で１０分間加熱して寒天を融解した。これに続き、予め調製したヒスチジン／ビオチン溶液１００ｍＬを瓶に加えた。上層寒天を標識し、さらに３０分間オートクレーブ処理し、暗所で室温で保存した。
寒天６ｇと６ｇのＮａＣｌを９００ｍＬの蒸留水に加えた。混合物をオートクレーブ中で１０分間加熱して寒天を融解した。これに続き、予め調製したヒスチジン／ビオチン溶液１００ｍＬを瓶に加えた。上層寒天を標識し、さらに３０分間オートクレーブ処理し、暗所で室温で保存した。
【0059】
試験株の増殖用のニュートリエントブロスの調製
ｏｘｏｉｄ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ ｎｕｍｂｅｒ ２（２５ｇ）を１Ｌの蒸留水に加え、ブロスが溶解するまで攪拌した。５０ｍＬのブロスをエルレンマイヤーフラスコに分注し、２０分間オートクレーブ処理した。溶液を冷却し、室温で暗所に保存した。
ｏｘｏｉｄ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ ｎｕｍｂｅｒ ２（２５ｇ）を１Ｌの蒸留水に加え、ブロスが溶解するまで攪拌した。５０ｍＬのブロスをエルレンマイヤーフラスコに分注し、２０分間オートクレーブ処理した。溶液を冷却し、室温で暗所に保存した。
【0060】
リン酸ナトリウム緩衝液０．１ｍＭ、ｐＨ７．４の調製
ＮａＨ２ＰＯ４．Ｈ２Ｏ（１３．８ｇ）を１Ｌの水に加えた（ナトリウム一塩基酸、０．１Ｍ）。その後、１４．２ｇのＮａ２ＨＰＯ４．Ｈ２Ｏを１Ｌの水に加えた（ナトリウム二塩基酸、０．１Ｍ）。次に、ナトリウム二塩基酸溶液１２０ｍＬを８８０ｍＬの一塩基酸溶液に添加し、混合した。０．１Ｍのナトリウム二塩基酸溶液を添加してｐＨを７．４に調整した。緩衝液を１２１℃で３０分間オートクレーブ処理した。ボトルを冷却し、その後、室温で暗所に保存した。
ＮａＨ２ＰＯ４．Ｈ２Ｏ（１３．８ｇ）を１Ｌの水に加えた（ナトリウム一塩基酸、０．１Ｍ）。その後、１４．２ｇのＮａ２ＨＰＯ４．Ｈ２Ｏを１Ｌの水に加えた（ナトリウム二塩基酸、０．１Ｍ）。次に、ナトリウム二塩基酸溶液１２０ｍＬを８８０ｍＬの一塩基酸溶液に添加し、混合した。０．１Ｍのナトリウム二塩基酸溶液を添加してｐＨを７．４に調整した。緩衝液を１２１℃で３０分間オートクレーブ処理した。ボトルを冷却し、その後、室温で暗所に保存した。
【0061】
試験プレートの方法
サンプルを培養し、３つの異なる濃度で試験した、各試験は三連で行った。細菌ストック１００μＬを２０ｍＬのｏｘｏｉｄ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ中で、３７℃で１６時間、回転式シェーカーでインキュベートした。該一晩培養物０．１ｍＬを、０．１ｍＬの試験溶液（試験サンプル、溶媒対照又は陽性対照）と０．５ｍＬのリン酸緩衝液と共に、２．０ｍＬの上層寒天（ビオチンとヒスチジンを僅かに含む）に添加した。上層寒天混合物を最小寒天プレートの表面上に注ぎ、３７℃で４８時間インキュベートした。インキュベーション後、復帰突然変異体コロニー（突然変異体）の個数を計数した。全ての培養は三連で行った（レプリカを５回行った溶媒対照を除く）。毒性は、細菌のバックグラウンド層（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｌａｙｅｒ）を調べることで確認できる。毒性がないことは、通常は存在するはずのバックグラウンド細菌の増殖を観察することで試験した。当該研究で用いた陽性対照は、２μｇ／ｍＬの濃度の４－ニトロキノリン－１－酸化物（４－ＮＱＯ）であった。
サンプルを培養し、３つの異なる濃度で試験した、各試験は三連で行った。細菌ストック１００μＬを２０ｍＬのｏｘｏｉｄ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ中で、３７℃で１６時間、回転式シェーカーでインキュベートした。該一晩培養物０．１ｍＬを、０．１ｍＬの試験溶液（試験サンプル、溶媒対照又は陽性対照）と０．５ｍＬのリン酸緩衝液と共に、２．０ｍＬの上層寒天（ビオチンとヒスチジンを僅かに含む）に添加した。上層寒天混合物を最小寒天プレートの表面上に注ぎ、３７℃で４８時間インキュベートした。インキュベーション後、復帰突然変異体コロニー（突然変異体）の個数を計数した。全ての培養は三連で行った（レプリカを５回行った溶媒対照を除く）。毒性は、細菌のバックグラウンド層（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｌａｙｅｒ）を調べることで確認できる。毒性がないことは、通常は存在するはずのバックグラウンド細菌の増殖を観察することで試験した。当該研究で用いた陽性対照は、２μｇ／ｍＬの濃度の４－ニトロキノリン－１－酸化物（４－ＮＱＯ）であった。
【0062】
Ｍ．ａｆｒｉｃａｎａのエタノール抽出物を、２つの異なる細菌株に、コロニーの数に従って適用した。得られた結果によると、Ｍ．ａｆｒｉｃａｎａは、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのＴＡ９８株又はＴＡ１００株のいずれにおいても突然変異原作用を示さなかった（表２）。Ｍ．ａｆｒｉｃａｎａは、復帰突然変異体に関して２以上の比を示さず、用量反応曲線は認められなかった。観察されたコロニーの数は、Ｍ．ａｆｒｉｃａｎａが抗細菌特性を有する可能性によって影響された可能性がある。
【0063】
【表2】
【0064】
実施例４
微生物数、金属分析及び刺激試験（パッチ試験）
微生物計数、金属分析及び刺激試験を行うためのＭ．ａｆｒｉｃａｎａエタノール抽出物は、前述のように調製した。
微生物数、金属分析及び刺激試験（パッチ試験）
微生物計数、金属分析及び刺激試験を行うためのＭ．ａｆｒｉｃａｎａエタノール抽出物は、前述のように調製した。
【0065】
ＴＭＡ（全微生物活性）の測定のために、細菌、酵母菌及びカビの計数測定用のＭ．ａｆｒｉｃａｎａ抽出物５０ｍＬをＳｗｉｆｔ Ｍｉｃｒｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓに送付した。結果は、コロニー形成単位／ミリリットル（ＣＦＵ／ｍＬ）で報告された。
【0066】
金属汚染物質の測定用に、５０ｍＬのＭ．ａｆｒｉｃａｎａ抽出物をＭｉｃｒｏｃｈｅｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓに送付した。ヒ素、水銀及び鉛について金属汚染物質の検出を行った（ｍｇ／１００ｇ）。
【0067】
エタノール抽出物のサンプルを、１９～６５歳の２０人のボランティアの前腕内側に、パッチディスクを用いて２４時間適用し、刺激性を判定した。その場所の視覚的評価を、２４時間後、４８時間後、７２時間後及び９６時間後に行った。いずれの反応も０，０．５，１，２，３及び４のスコアとして採点した。０は反応なし、４は発赤、丘疹、浮腫又は水疱を表す。各ボランティアの前腕には、ラウリル硫酸ナトリウム溶液（１ｇ／１００ｍＬ）の陽性対照及び脱塩水の陰性対照が含まれていた。
【0068】
薬用植物は、細菌、真菌及びウイルス等の広い範囲の微生物汚染物質で汚染されている可能性がある。このため、品質管理の目的で薬用植物の微生物負荷を評価することが重要になっている（Ｋｎｅｉｆｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００２）。微生物の増殖が見られなかったので、ＴＭＡ（全微生物活性）は活性を有さないことが認められた（表３）。Ｍ．ａｆｒｉｃａｎａエタノール抽出物についても、酵母菌又はカビの増殖は観察されなかった。
【0069】
有毒金属は、体内で知られている機能を有さず、存在した時点で有害となるものと定義される。これらの有毒金属は、病気、老化、さらに遺伝的欠陥の原因となるため、大きな懸念となっている（Ｗｉｌｓｏｎ、２０１１）。低濃度の重金属である、ヒ素、カドミウム、水銀及び鉛が、Ｍ．ａｆｒｉｃａｎａエタノール抽出物で認められた（表４）。
【0070】
Ｍ．ａｆｒｉｃａｎａの葉抽出物は、潜在的刺激性が１００％の潜在的刺激性陽性対照であるラウリル硫酸ナトリウムと比較して、潜在的刺激性が－９．００％であることが認められたため、非刺激性であると認められた（表５）。
【0071】
【表3】
【0072】
【表4】
【0073】
【表5】
【0074】
実施例５
防腐剤負荷試験
防腐剤負荷試験において、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）及びクロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）を用いて、ＵＳＰ ３１法（ＵＳＰＣ ２００８）に従ってサンプルを試験した。防腐剤Ｅｕｘｙｌ ＰＥ ９０１０を陽性対照として使用した。
防腐剤負荷試験
防腐剤負荷試験において、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）及びクロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）を用いて、ＵＳＰ ３１法（ＵＳＰＣ ２００８）に従ってサンプルを試験した。防腐剤Ｅｕｘｙｌ ＰＥ ９０１０を陽性対照として使用した。
【0075】
これらの生物にＭ．ａｆｒｉｃａｎａエタノール抽出物を標準的な防腐剤と共に暴露したとき、生物（緑膿菌、黄色ブドウ球菌、大腸菌、カンジダ・アルビカンス及びクロコウジカビ）の増殖はごく僅かであった。これは、Ｍ．ａｆｒｉｃａｎａエタノール抽出物が防腐剤負荷試験に合格したことを表す（表６）。
【0076】
【表6】
【0077】
実施例６
生理化学的分析
抽出物の臭気及び色の測定
Ｍ．ａｆｒｉｃａｎａ抽出物の臭気及び色（外観）を視覚的に記録した。
生理化学的分析
抽出物の臭気及び色の測定
Ｍ．ａｆｒｉｃａｎａ抽出物の臭気及び色（外観）を視覚的に記録した。
【0078】
ｐＨの測定
ｐＨメーターを用いてＭ．ａｆｒｉｃａｎａ抽出物のｐＨを測定した。ｐＨメーターは、ｐＨ４及びｐＨ７標準溶液を用いて較正した。次に、電極を抽出物に浸し、記録した。
ｐＨメーターを用いてＭ．ａｆｒｉｃａｎａ抽出物のｐＨを測定した。ｐＨメーターは、ｐＨ４及びｐＨ７標準溶液を用いて較正した。次に、電極を抽出物に浸し、記録した。
【0079】
抽出物の比重の測定
比重計を用いて抽出物の比重を測定した。比重計を空にして秤量した。その後、蒸留水で満たし、再度秤量した。満たす前の重量を満たした後の重量から減算し、比重計の容量（ｍＬ）で割って比重をｇ／ｍＬで得た。
比重計を用いて抽出物の比重を測定した。比重計を空にして秤量した。その後、蒸留水で満たし、再度秤量した。満たす前の重量を満たした後の重量から減算し、比重計の容量（ｍＬ）で割って比重をｇ／ｍＬで得た。
【0080】
ゲルクリーム製剤の粘度の測定
Ｍ．ａｆｒｉｃａｎａの粘度の測定は、粘度計（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ）を用いて行った。５ｒｐｍのスピードで、サイズ５のスピンドルを用いて粘度計の表示数値を得た。粘度計の表示数値に係数を積算し、ゲルクリームの粘度をｃＰｓ（センチポアズ）で記録した。
Ｍ．ａｆｒｉｃａｎａの粘度の測定は、粘度計（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ）を用いて行った。５ｒｐｍのスピードで、サイズ５のスピンドルを用いて粘度計の表示数値を得た。粘度計の表示数値に係数を積算し、ゲルクリームの粘度をｃＰｓ（センチポアズ）で記録した。
【0081】
抽出物の屈折率の測定
屈折率は、屈折計を用いて測定した。ガラス製のパスツールピペットを用いて、植物抽出物２～３ｍＬを吸い上げた。植物抽出物を屈折計のレンズ上に置き、屈折率を２５℃で測定した。
屈折率は、屈折計を用いて測定した。ガラス製のパスツールピペットを用いて、植物抽出物２～３ｍＬを吸い上げた。植物抽出物を屈折計のレンズ上に置き、屈折率を２５℃で測定した。
【0082】
物理化学的分析の結果を表７に示す。
【0083】
【表7】
【0084】
実施例７
安定性試験
Ｍ．ａｆｒｉｃａｎａのエタノール粗抽出物
２００ｍＬの抽出物を含む４個の２５０ｍＬガラス瓶をラベルし、それらの特定温度で保存した。防腐剤Ｅｕｘｙｌ ＰＥ ９０１０を各々の瓶に１％加えた。安定性試験は、５℃、２５℃、４０℃及び５０℃で行った。１，２，４，８及び１２週間後に、各温度で保存した抽出物の様々なパラメータを測定した。パラメータには、感覚的に記録した外観及び臭気が含まれた。ｐＨはｐＨメーターを用いて測定した。比重は比重計を用いて測定し、最初と最後（１２週間の間隔）のみで測定した。全てのサンプルについて、各パラメータの最初の結果を記録し、その後の全ての間隔についても記録した。
安定性試験
Ｍ．ａｆｒｉｃａｎａのエタノール粗抽出物
２００ｍＬの抽出物を含む４個の２５０ｍＬガラス瓶をラベルし、それらの特定温度で保存した。防腐剤Ｅｕｘｙｌ ＰＥ ９０１０を各々の瓶に１％加えた。安定性試験は、５℃、２５℃、４０℃及び５０℃で行った。１，２，４，８及び１２週間後に、各温度で保存した抽出物の様々なパラメータを測定した。パラメータには、感覚的に記録した外観及び臭気が含まれた。ｐＨはｐＨメーターを用いて測定した。比重は比重計を用いて測定し、最初と最後（１２週間の間隔）のみで測定した。全てのサンプルについて、各パラメータの最初の結果を記録し、その後の全ての間隔についても記録した。
【0085】
ゲルクリーム及びＭ．ａｆｒｉｃａｎａエタノール抽出物
２００ｍＬのクリームゲルを含む４個の２５０ｍＬガラス瓶をラベルし、それらの特定温度で保存した。安定性試験は、５℃、２５℃、４０℃及び５０℃で行った。１，２，４，８及び１２週間後に、各温度で保存したクリームゲルの様々なパラメータを測定した。パラメータには、感覚的方法で記録した外観及び臭気が含まれた。ｐＨはｐＨメーターを用いて測定した。比重は比重計を用いて測定し、粘度は粘度計を用いて測定した。全てのサンプルについて、各パラメータの最初の結果を記録し、その後の全ての間隔についても記録した。
２００ｍＬのクリームゲルを含む４個の２５０ｍＬガラス瓶をラベルし、それらの特定温度で保存した。安定性試験は、５℃、２５℃、４０℃及び５０℃で行った。１，２，４，８及び１２週間後に、各温度で保存したクリームゲルの様々なパラメータを測定した。パラメータには、感覚的方法で記録した外観及び臭気が含まれた。ｐＨはｐＨメーターを用いて測定した。比重は比重計を用いて測定し、粘度は粘度計を用いて測定した。全てのサンプルについて、各パラメータの最初の結果を記録し、その後の全ての間隔についても記録した。
【0086】
０週目に得られた結果と１２週間目の終了時の観察に基づく結果とを比較した。抽出物は、より低い温度ではより小さく変化し、最高の温度で保存されたサンプルではより多くの有害な影響があると予想される。Ｍ．ａｆｒｉｃａｎａエタノール抽出物の最初のｐＨ値は５．２８であり、５℃、２５℃、４０℃及び５０℃のサンプルは、それぞれ４．９９、４．９７、５．０３及び５．１２と、僅かに低下した（表８）。当該結果では、加速された温度条件で保存されたサンプルは、周囲温度や５℃で保存されたサンプルよりも緩やかな低下を示すので、ｐＨの低下は時間と温度に関連しているようである。１２週間隔の終了時にのみ実施した抽出物の比重は、最初の値は０．９８４８ｇ／ｍＬであり、５℃、２５℃、４０℃及び５０℃のサンプルは、それぞれ０．８５３、０．７８２、０．８１６及び０．８５０ｇ／ｍＬに低下した。これはサンプルの沈降による可能性が高い（表８）。
【0087】
製品の暗色化は、高温保存では第１週目から記録され、周囲条件下では１２週間後に記録された。製品の暗色化は抽出物に起因し、製品の全体的な有効性が影響される可能性がある（表８）。暗色化は、温度に起因する単なる物理的な変化又は化学変化かもしれない。しかし、抽出物を用いた製品の暗色化は通常のことである。ｐＨ及び粘度は、加速された温度条件下では値の低下を示すが、これらは製品全体の性能に影響を与えないであろう。
【0088】
上記の結果に基づいて、この製品については２年間の保存可能期間を予測できる。直射日光を避け、３０℃未満の温度で保存すべきである。
【0089】
【表8】
【0090】
実施例８
Ｍ．Ａｆｒｉｃａｎａの葉のエタノール抽出物の被験者へのｉｎ ｖｉｖｏ有効性試験
乾燥した葉のエタノール抽出物（３００ｍｇ）を７０％エタノール（４０ｍＬ）に溶解し、その後、５％希釈し、製品の濃度とした。
Ｍ．Ａｆｒｉｃａｎａの葉のエタノール抽出物の被験者へのｉｎ ｖｉｖｏ有効性試験
乾燥した葉のエタノール抽出物（３００ｍｇ）を７０％エタノール（４０ｍＬ）に溶解し、その後、５％希釈し、製品の濃度とした。
【0091】
２２名の被験者のグループを募集した。試験の手順を口頭で説明し、各被験者は同意と病歴の様式に署名した。個人の詳細と各被験者の肌の種類の評価が記録された。各時間間隔でカラー写真を撮り、実施した研究の記録として役立てた。試験を行う前に、全ての被験者に２０分間休息するよう指示した。指定された試験部位の左側と右側を標準のアイメイクアップリムーバーで洗浄し、３分間空気乾燥した。試験期間には、温度と相対湿度を記録した。ＣＳＩソフトウェアは分析用に完全な皺の長さを必要とするため、顔面では試験部位の境界を定めなかった。試験物質の順序に従って、製品の適用を無作為化した。Ｖｉｓｉｏスキャン解析の対象領域の写真についても撮影した。オペレーターは、被験物質の順序に従って試験物質を試験部位に均一に適用するように被験者を教育した。試験期間中、被験者は局所用製品又は試験の提供者によって承認されていない薬物の使用を制限された。基準の写真（ＢＬ）を試験製品の適用前に撮影し、再度１４日目（Ｄ１４）と２８日目（Ｄ２８）に撮影して試験の記録として役立てた。被験者は試験製品を与えられ、１日２回適用した。被験者は、基準の手順の後は、１４日目（Ｄ１４）と２８日目（Ｄ２８）に試験施設に戻った。水性クリームのプラセボも使用した。
【0092】
各読み取りの間、７０％エタノールとティッシュペーパーを用いて、Ｖｉｓｉｏｓｃａｎ及びＶｉｓｉｏｆａｃｅを穏やかに滅菌した。
【0093】
Ｖｉｓｉｏｆａｃｅは皺の全長で働き、Ｖｉｓｉｏｓｃａｎは皺の部分にのみ働く。
【0094】
Ｖｉｓｉｏｓｃａｎ－皺
基準時（すなわち試験製品適用前）の試験製品部位と未処理の対照部位を比較するためにｔ検定を実施した。５％の信頼性レベルで２つの試験部位の間に統計的有意差は見られなかった。基準時から１４日目（Ｄ１４－ＢＬ）の試験製品とプラセボ対照部位の間の平均差値を比較することで治療効果を判定するためにｔ検定を実施した。５％の信頼性レベルで統計的有意差はなかった。基準時から２８日目（Ｄ２８－ＢＬ）の試験製品とプラセボ対照部位の間の平均差値を比較することで治療効果を判定するためにｔ検定を実施した。５％の信頼性レベルで統計的有意差があった。試験製品ＦＣＡＨ１０６／４３２５の値は、ＦＣＡＨ１０６／ＡｑＣの値よりも有意に低かった（表９）。
基準時（すなわち試験製品適用前）の試験製品部位と未処理の対照部位を比較するためにｔ検定を実施した。５％の信頼性レベルで２つの試験部位の間に統計的有意差は見られなかった。基準時から１４日目（Ｄ１４－ＢＬ）の試験製品とプラセボ対照部位の間の平均差値を比較することで治療効果を判定するためにｔ検定を実施した。５％の信頼性レベルで統計的有意差はなかった。基準時から２８日目（Ｄ２８－ＢＬ）の試験製品とプラセボ対照部位の間の平均差値を比較することで治療効果を判定するためにｔ検定を実施した。５％の信頼性レベルで統計的有意差があった。試験製品ＦＣＡＨ１０６／４３２５の値は、ＦＣＡＨ１０６／ＡｑＣの値よりも有意に低かった（表９）。
【0095】
Ｖｉｓｉｏｆａｃｅ（ＣＳＩ）－皺
基準時（すなわち試験製品適用前）の試験製品部位と未処理の対照部位を比較するためにｔ検定を実施した。５％の信頼性レベルで２つの試験部位の間に統計的有意差は見られなかった。基準時から１４日目（Ｄ１４－ＢＬ）の試験製品とプラセボ対照部位の間の平均差値を比較することで治療効果を判定するためにｔ検定を実施した。５％の信頼性レベルで統計的有意差があった。試験製品ＦＣＡＨ１０６／４３２５の値は、ＦＣＡＨ１０６／ＡｑＣの値よりも有意に低かった。基準時から２８日目（Ｄ２８－ＢＬ）の試験製品とプラセボ対照部位の間の平均差値を比較することで治療効果を判定するためにｔ検定を実施した。５％の信頼性レベルで統計的有意差があった。試験製品ＦＣＡＨ１０６／４３２５の値はＦＣＡＨ１０６／ＡｑＣの値よりも有意に低かった（表９）。
基準時（すなわち試験製品適用前）の試験製品部位と未処理の対照部位を比較するためにｔ検定を実施した。５％の信頼性レベルで２つの試験部位の間に統計的有意差は見られなかった。基準時から１４日目（Ｄ１４－ＢＬ）の試験製品とプラセボ対照部位の間の平均差値を比較することで治療効果を判定するためにｔ検定を実施した。５％の信頼性レベルで統計的有意差があった。試験製品ＦＣＡＨ１０６／４３２５の値は、ＦＣＡＨ１０６／ＡｑＣの値よりも有意に低かった。基準時から２８日目（Ｄ２８－ＢＬ）の試験製品とプラセボ対照部位の間の平均差値を比較することで治療効果を判定するためにｔ検定を実施した。５％の信頼性レベルで統計的有意差があった。試験製品ＦＣＡＨ１０６／４３２５の値はＦＣＡＨ１０６／ＡｑＣの値よりも有意に低かった（表９）。
【0096】
【表9】
【0097】
結論
上記の実施例は、Ｍｙｒｓｉｎｅ ａｆｒｉｃａｎａの葉のエタノール抽出物が有望なエラスターゼ阻害活性を示すことを明らかにする。単離した化合物ＭＡ－ＮＲ－０１（ミルシノシド Ｂ）は、１２５μｇ／ｍＬの濃度で１３．００±１．０４％の阻害率を有することが判明した。
上記の実施例は、Ｍｙｒｓｉｎｅ ａｆｒｉｃａｎａの葉のエタノール抽出物が有望なエラスターゼ阻害活性を示すことを明らかにする。単離した化合物ＭＡ－ＮＲ－０１（ミルシノシド Ｂ）は、１２５μｇ／ｍＬの濃度で１３．００±１．０４％の阻害率を有することが判明した。
【0098】
Ｍ．ａｆｒｉｃａｎａの葉のエタノール抽出物はＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの増殖を阻害し、したがって変異原性はないと考えられることを示す。
【0099】
Ｍ．ａｆｒｉｃａｎａについては微生物の増殖は観察されず、サンプルには限界未満の量が含まれると結論付けられる。Ｍ．ａｆｒｉｃａｎａのエタノール抽出物は、許容される重金属の限界未満の量を含有することが判明した。臨床研究によれば、Ｍ．ａｆｒｉｃａｎａのエタノール抽出物はヒトの皮膚に非刺激性であることが判明した。
【0100】
防腐剤負荷試験の間、試験生物（緑膿菌、黄色ブドウ球菌、大腸菌、カンジダ・アルビカンス及びクロコウジカビ）の有意な増殖は観察されなかった。
【0101】
試験された生理化学的パラメータは、皺の治療のための薬用化粧品におけるＭ．ａｆｒｉｃａｎａの使用可能性を実証した。
【0102】
Ｍ．ａｆｒｉｃａｎａのエタノール粗抽出物を含有するクリームゲルは、３０℃未満の温度で直射日光を避けて保存した場合、保存可能期間が２年間であることが加速安定性試験によって結論付けられた。
【0103】
ヒト被験者試験では、Ｖｉｓｉｏｓｃａｎ（皺）について、試験製品ＦＣＡＨ１０６／４３２５が、プラセボ対照（ＦＣＡＨ１０６／ＡｑＣ）と比較して、連続適用（１日２回）の２８日後（Ｄ２８）、皺の低減に効果的であることが判明した。Ｖｉｓｉｏｆａｃｅ－ＣＳＩ（皺）試験では、試験製品ＦＣＡＨ１０６／４３２５は、プラセボ対照（ＦＣＡＨ１０６／ＡｑＣ）と比較して、連続適用（１日２回）の１４日後（Ｄ１４）と２８日後（Ｄ２８）、皺の低減に効果的であることが判明した。Ｖｉｓｉｏｆａｃｅは各被験者の「カラスの足跡」の範囲を全体的に観察したので、皺の深さと長さを考慮すると、Ｍ．ａｆｒｉｃａｎａは１４日目に皺試験に合格したと結論できる。
【0104】
参考文献
１） Ｂｅｉｔｈ Ｊ，Ｓｐｉｅｓｓ Ｂ，Ｗｅｒｍｕｔｈ ＣＧ（１９７４）．Ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｕｓｅ ｏｆ ａ ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｏｆ ｅｌａｓｔａｓｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｅｄ．，１１（４）：３５０－３５７．
２） Ｋｎｅｉｆｅｌ Ｗ，Ｃｚｅｃｈ Ｅ，Ｋｏｐｐ Ｂ（２００２）Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｐｌａｎｔｓ－ａ ｒｅｖｉｅｗ．Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄｉｃａ，６８（１）：５－１５．
３） Ｗｉｌｓｏｎ Ｌ（２０１１）Ｔｏｘｉｃ Ｍｅｔａｌｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｈｅａｌｔｈ．Ｔｈｅ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．［Ｏｎｌｉｎｅ］．
１） Ｂｅｉｔｈ Ｊ，Ｓｐｉｅｓｓ Ｂ，Ｗｅｒｍｕｔｈ ＣＧ（１９７４）．Ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｕｓｅ ｏｆ ａ ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｏｆ ｅｌａｓｔａｓｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｅｄ．，１１（４）：３５０－３５７．
２） Ｋｎｅｉｆｅｌ Ｗ，Ｃｚｅｃｈ Ｅ，Ｋｏｐｐ Ｂ（２００２）Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｐｌａｎｔｓ－ａ ｒｅｖｉｅｗ．Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄｉｃａ，６８（１）：５－１５．
３） Ｗｉｌｓｏｎ Ｌ（２０１１）Ｔｏｘｉｃ Ｍｅｔａｌｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｈｅａｌｔｈ．Ｔｈｅ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．［Ｏｎｌｉｎｅ］．
【図1】
【図2】
【図3】