(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2021-12-21
(45)【発行日】2022-02-04
(54)【発明の名称】炎症性障害の治療療法
(51)【国際特許分類】
A61K 39/395 20060101AFI20220128BHJP
A61K 47/42 20170101ALI20220128BHJP
A61K 47/02 20060101ALI20220128BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20220128BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220128BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20220128BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20220128BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20220128BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20220128BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20220128BHJP
A61P 25/32 20060101ALI20220128BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20220128BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20220128BHJP
A61K 47/46 20060101ALI20220128BHJP
A23L 33/18 20160101ALI20220128BHJP
C07K 16/24 20060101ALN20220128BHJP
【ＦＩ】
A61K39/395 D ZNA
A61K47/42
A61K47/02
A61K9/08
A61P43/00 111
A61P29/00
A61P31/04
A61P1/04
A61P31/00
A61P37/06
A61P25/32
A61P9/10
A61P37/08
A61K47/46
A23L33/18
C07K16/24
【請求項の数】
26
(21)【出願番号】P 2019533211
(86)(22)【出願日】2018-01-29
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-03-05
(86)【国際出願番号】 GB2018050244
(87)【国際公開番号】W WO2018138524
(87)【国際公開日】2018-08-02
【審査請求日】2019-09-11
(31)【優先権主張番号】1701404.4
(32)【優先日】2017-01-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(73)【特許権者】
【識別番号】511203226
【氏名又は名称】マイクロファーム・リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＭＩＣＲＯＰＨＡＲＭ ＬＩＭＩＴＥＤ
(74)【代理人】
【識別番号】100079108
【弁理士】
【氏名又は名称】稲葉 良幸
(74)【代理人】
【識別番号】100109346
【弁理士】
【氏名又は名称】大貫 敏史
(74)【代理人】
【識別番号】100117189
【弁理士】
【氏名又は名称】江口 昭彦
(74)【代理人】
【識別番号】100134120
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 和彦
(72)【発明者】
【氏名】ランドン，ジョン
(72)【発明者】
【氏名】コクソン，ルース エリザベス
【審査官】佐々木 大輔
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１４－５２７９５７（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２００１／０３０３７３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表平０８－５１１０１５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１１－０２４５８１（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２００７／００７１７９５（ＵＳ，Ａ１）
【文献】Expert Opin. Investig. Drug, 2011, Vol.20, No.11, pp.1555-1564
【文献】Journal of Chromatography B, 2007, Vol.848, pp.2-7
【文献】Veterinary Immunology and Immunopathology, 2016, Vol.174, pp.50-63
【文献】Nutrition Journal, 2015, Vol.14, Article No.22, pp.1-8
【文献】American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, 1995, Vol.152, No.2, pp.480-488
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３９／００－３９／４４
Ａ６１Ｋ ３８／００－３８／５８
Ａ６１Ｋ ９／００－ ９／７２
Ａ６１Ｋ ４７／００－４７／６９
Ａ２３Ｌ ３３／００－３３／２９
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）に結合するインタクトな血液由来ポリクローナル抗体と、胃腸通過時の前記抗体の保護手段と、を含み、前記インタクトな血液由来ポリクローナル抗体がヒツジのインタクトな血液由来ポリクローナル抗体であり、前記抗体の保護手段が少なくともプロテアーゼ阻害剤及び／又は１もしくは複数の制酸剤を含む、経口投与用抗体組成物。
【請求項2】
前記プロテアーゼ阻害剤がタンパク質のボーマン・バーク阻害剤ファミリーから選択される１種以上である、請求項１に記載の抗体組成物。
【請求項3】
前記組成物が液体剤として製剤化される、請求項１又は２に記載の抗体組成物。
【請求項4】
前記抗体の前記保護手段が、卵白から取得可能な手段を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体組成物。
【請求項5】
前記抗体の前記保護手段が、卵白、好ましくは粉末卵白を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体組成物。
【請求項6】
前記抗体の前記保護手段が、ａ．トリプシン及び／又はキモトリプシンに特異的に結合し、それらのタンパク質分解活性を抑制又は不活性化するポリペプチド、及び／又は
ｂ．トリプシン及び／又はキモトリプシンに結合し、前記トリプシン及び／又はキモトリプシンのプロテアーゼ活性を抑制又は不活性化する抗体、及び／又は
ｃ．制酸剤
の１つ以上を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体組成物。
【請求項7】
前記組成物が、制酸剤及び、ａ．トリプシン及び／又はキモトリプシンに特異的に結合し、それらのタンパク質分解活性を抑制又は不活性化するポリペプチド、及び／又は
ｂ．トリプシン及び／又はキモトリプシンに結合し、前記トリプシン及び／又はキモトリプシンのプロテアーゼ活性を不活性化する抗体
を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体組成物。
【請求項8】
前記手段が、オボムコイド、オボスタチン、オボマクログロブリン、又はそれらの組合せの１つ以上を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体組成物。
【請求項9】
前記組成物に存在する全抗体の少なくとも５％がＴＮＦαに結合する、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体組成物。
【請求項10】
前記組成物に存在する全抗体の少なくとも１０％がＴＮＦαに結合する、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体組成物。
【請求項11】
経口投与用抗体組成物の製造方法であって、ａ．ヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）又はその断片を含む免疫原が投与されたヒツジの非ヒト哺乳動物から得られた血液サンプルであって、ヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）に結合するインタクトな血液由来ポリクローナル抗体を含む血液サンプルを提供すること；
ｂ．前記血液サンプルをさらに処理して血清を得ること；
ｃ．インタクトな血液由来ポリクローナル抗体を前記血清から得ること；及び
ｄ．血液由来ポリクローナル抗体と、胃腸通過時の前記抗体の保護手段であって、少なくともプロテアーゼ阻害剤及び／又は１もしくは複数の制酸剤を含む保護手段とを混和すること、
を含む、方法。
【請求項12】
硫酸ナトリウム沈殿又はカプリル酸沈殿を用いて抗体を精製することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記抗体組成物が被験体に経口投与される、炎症性障害の治療に使用するための請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体組成物。
【請求項14】
前記抗体及び前記抗体の前記保護手段が同時に投与される、請求項１３に記載の使用のための抗体組成物。
【請求項15】
前記抗体及び前記抗体の前記保護手段が個別に投与される、請求項１３又は１４に記載の使用のための抗体組成物。
【請求項16】
前記炎症性障害が敗血症性ショックである、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の使用のための抗体組成物。
【請求項17】
前記炎症性障害が胃腸障害、好ましくは腸障害である、請求項１３～１６のいずれか一項に記載の使用のための抗体組成物。
【請求項18】
前記炎症性障害が、炎症性腸疾患、腸感染症、移植片対宿主障害、次の原因：非ステロイド系抗炎症薬剤、ストレス、アルコール、腸手術、虚血・再灌流、食物アレルギー、又はそれらの組合せに起因する障害である、請求項１３～１７のいずれか一項に記載の使用のための抗体組成物。
【請求項19】
前記炎症性障害が、潰瘍性結腸炎、クローン病、又はそれらの組合せから選択される炎症性腸疾患である、請求項１３～１８のいずれか一項に記載の使用のための抗体組成物。
【請求項20】
前記抗体組成物が１日２ｇ以下の用量で被験体に投与される、請求項１３～１９のいずれか一項に記載の使用のための抗体組成物。
【請求項21】
前記抗体組成物が１日１ｇ以下の用量で被験体に投与される、請求項１３～２０のいずれか一項に記載の使用のための抗体組成物。
【請求項22】
炎症性障害を治療するための医薬の製造における請求項１～１０に記載の抗体組成物の使用であって、前記抗体組成物が被験体に経口投与される、使用。
【請求項23】
請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体組成物とその使用説明書とを含むキット。
【請求項24】
請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体組成物を含む食材。
【請求項25】
前記食材が、酪農産物、好ましくはヨーグルト、チーズ、又はミルクから選択される酪農産物である、請求項２４に記載の食材。
【請求項26】
プロバイオティック及び任意選択的にプレバイオティックをさらに含む、請求項２４又は２５に記載の食材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、炎症性障害の治療に使用するのに好適な抗体療法剤に関する。
【背景技術】
【0002】
腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）は、全身性炎症を媒介する主なサイトカインであり、敗血症性ショックをはじめとするいくつかの疾患及び障害さらには炎症性腸疾患などの胃腸障害に関与する。
【0003】
慢性炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の２つの主要な形態は、潰瘍性結腸炎（ＵＣ）及びクローン病（ＣＤ）である。ＵＣ及びＣＤは、欧州及び北米で５００万を超える人々に罹患し、それらの発生率は地球規模で増加しつつある。両方とも、腸壁における可溶性ＴＮＦα及び膜結合ＴＮＦαの両方のレベルの著しい上昇により特徴付けられる腸免疫恒常性の調節不全の結果である。これらの疾患の慢性性が理由で、長期療法が必要となる。このことを考慮して、現在の抗体療法剤は、ＴＮＦαに対するモノクローナル抗体の全身投与に依拠する。かかるモノクローナル抗体は、患者の体液性免疫反応の誘導を回避するという視点から、典型的にはキメラであるか又はヒト化される。動物由来のポリクローナル抗体の使用は、かかる反応をトリガーするリスクがあるため回避されてきた。現在広範に使用されている３種のモノクローナル抗体は、キメラのネズミインフリキシマブ並びに完全ヒト化されたアダリムマブ及びエタネルセプトである。インフリキシマブは静脈内に注入されるが、他の２種は静脈内に注入される。
【0004】
抗体の全身使用は注入反応を伴うものあり、静脈内注入は、通常、病院での短期滞在を必要とするので、かかる治療は外来患者にとって不便である。そのほか、全身投与されたＭｃＡｂ（分子量約１５０，０００Ｄａ）が血液から組織液に移ってから胃腸管の層を横切って上皮の炎症内層に達する効率にも問題がある。さらに、ＴＮＦαは、感染から患者を保護するうえで全身的に重要な炎症誘発の役割を果たすサイトカインであるので、抗ＴＮＦα抗体の長期全身投与は、結核、日和見感染、脱髄疾患の再活性化、及びリンパ腫の長期リスクをはじめとする重篤な副作用の発生率の増加を伴う。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、上述した問題の少なくとも１つを解決する。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明者らは、驚くべきことに、ＴＮＦαに結合するインタクトな血液由来抗体が、経口投与に供すべく好適に製剤化された場合、ＩＢＤなどの炎症性障害に対する改善された療法剤になることを見いだした。
【0007】
本発明の組成物で製剤化された血液由来のポリクローナルＴＮＦα抗体は、驚くべきことに、経口投与された場合、従来法で製造された抗体（たとえば、乳由来の抗体）と比較して改善された有効性を呈するとともに改善された特異的力価を呈する。
【0008】
特定的には、ヒツジ宿主又はウマ宿主（好ましくはヒツジ宿主）で製造された且つ本発明の組成物で製剤化されたポリクローナルＴＮＦα抗体は、驚くべきことに、経口投与された場合、従来法で製造された抗体と比較して改善された有効性及び改善された特異的力価を呈する。
【0009】
追加的又は代替的に、本発明のポリクローナル抗体は、被験体に経口投与された場合、全身投与された従来の抗体（たとえばモノクローナル抗体）と比較して副作用（たとえば体液性免疫反応副作用）をまったく引き起こさないか又は大幅に低減する。そのため、本発明の組成物は、全身投与される抗体組成物とは異なり、長期の治療的使用に好適である。
【0010】
さらなる利点として、前記ポリクローナル抗体の製造は、従来のモノクローナル抗体よりもはるかに経費がかからない。そのため、本発明は、スケーラブルな及び／又は費用効率の高い療法剤を提供する。
【0011】
次に、添付の図面を参照しながら、単なる例として、本発明の実施形態を説明する。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】カプリル酸（▲）又は硫酸ナトリウム（■）のいずれかで精製されたインタクトな抗ＴＮＦαによるウシトリプシンの阻害を示す。ＴＮＦα抗血清（●）は対照として使用した。
【図2】抗血清（●）中の抗ＴＮＦαＩｇＧ及びカプリル酸沈殿（▲）により精製されたＩｇＧを検出する直接ＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図3】Ｌ９２９細胞を用いて抗ＴＮＦα断片（■）、インタクトな抗ＴＮＦα（▲）、及びＴＮＦα抗血清（●）の中和活性を試験する免疫細胞傷害性アッセイ（ＩＣＴＡ）の結果を示す。開始濃度：抗ＴＮＦα断片－５０ｍｇ／ｍｌ、インタクトな抗ＴＮＦα－２１０ｍｇ／ｍｌ、ＴＮＦα抗血清タンパク質濃度－８６ｍｇ／ｍｌ。
【図4】インタクトなヒツジ血液由来ＰｃＡｂ（抗ヒトＴＮＦαＩｇＧ）及びモノクローナル抗体インフリキシマブによるネズミＴＮＦαへの結合を比較したＥＬＩＳＡの結果を示す。抗ヒトＴＮＦαＩｇＧ（●）、インフリキシマブ（■）、及び陰性対照（ＰＣＢ）（▲）。
【発明を実施するための形態】
【0013】
一態様では、本発明は、ヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）に結合するインタクトな血液由来ポリクローナル抗体を含む経口投与用抗体組成物及び胃腸通過時の抗体の保護手段を提供する。
【0014】
有利には、ＴＮＦαに対する血液由来ポリクローナル抗体は、同一の宿主の血液から前記宿主を屠殺することなく複数回得ることが可能である。このことは、限られた期間（たとえばある一時期）にのみ抗体を産生するにすぎないウシ初乳などの供給源を用いた従来の方法とは対照的である。
【0015】
血液由来抗体は、非ヒト哺乳動物から取得可能でありうる。
【0016】
本明細書で用いられる「取得可能」という用語は、「得られる」という用語も包含する。一実施形態では、「取得可能」という用語は、得られることを意味する。
【0017】
好ましくは、抗体は、ヒツジ又はウマのポリクローナル抗体である。
【0018】
より好ましくは、抗体は、ヒツジポリクローナル抗体である（たとえば、ヒツジから取得可能である）。
【0019】
そのため、一態様では、ヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）に結合するインタクトなヒツジポリクローナル抗体を含む経口投与用抗体組成物及び胃腸通過時の抗体の保護手段が提供される。
【0020】
本発明の抗体は、ヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）に結合して中和する。抗体は、非ヒトＴＮＦα又は代替抗原に対するよりも高い結合親和性でヒトＴＮＦαに結合する。一実施形態では、本発明の抗体は、少なくとも１０－４Ｍ又は少なくとも１０－５Ｍの親和性（解離定数：Ｋｄにより測定される）でヒトＴＮＦαに結合する。一実施形態では、本発明の抗体、少なくとも１０－６Ｍ又は１０－７Ｍの親和性（Ｋｄ）でヒトＴＮＦαに結合しうる。好適には、本発明の抗体、少なくとも１０－８Ｍ又は１０－９Ｍの親和性（Ｋｄ）でヒトＴＮＦαに結合しうる。
【0021】
代替的又は追加的に、抗体結合親和性は、会合定数（Ｋａ）を介して測定しうる。一実施形態では、本発明の抗体は、少なくとも１０６Ｍの親和性（会合定数：Ｋａにより測定される）でヒトＴＮＦαに結合する。好適には、本発明の抗体は、少なくとも少なくとも１０７Ｍ（たとえば、少なくとも１０８Ｍ）の親和性（会合定数：Ｋａにより測定される）でヒトＴＮＦαに結合する。
【0022】
抗体結合は、実施例３に記載のアッセイを用いて試験可能である。中和は、実施例４に記載のアッセイを用いて試験可能である。より詳細には、抗体組成物は、Ｌ９２９マウス線維肉腫細胞系に及ぼすＴＮＦαの細胞傷害作用の中和を試験するためにアッセイ可能である。
【0023】
驚くべきことに、ヒトＴＮＦα（又はその精製画分）で免疫された非ヒト哺乳動物（好ましくは、ヒツジ及び／又はウマ非ヒト哺乳動物）から取得可能な血液由来抗体は、他の非血液由来源（たとえば、トリ源［たとえば卵黄由来］又はウシ源、たとえば乳）と比較してヒトＴＮＦαに特異的な抗体をはるかに高濃度で含有する。いくつかの場合には、前記血液（たとえば、血清若しくは血漿）中又はそれらの精製画分中の特異的抗体の濃度は１００倍高い。
【0024】
一実施形態では、ヒトＴＮＦα（又はその精製画分）で免疫された宿主（たとえば非ヒト哺乳動物）から取得可能な血液サンプルに含まれる全抗体の少なくとも５％（好適には少なくとも１０％）は、ヒトＴＮＦαに結合する。他の一実施形態では、ヒトＴＮＦα（又はその精製画分）で免疫された宿主（たとえば非ヒト哺乳動物）から取得可能な血液サンプルに含まれる全抗体の少なくとも１５％又は２０％（好適には少なくとも２５％又は少なくとも３０％）は、ヒトＴＮＦαに結合する。
【0025】
一実施形態では、ヒトＴＮＦα（又はその精製画分）で免疫されたヒツジから取得可能な抗血清に含まれる全抗体の少なくとも５％（好適には少なくとも１０％）は、ヒトＴＮＦαに結合する。他の一実施形態では、ヒトＴＮＦα（又はその精製画分）で免疫されたヒツジから取得可能な抗血清に含まれる全抗体の少なくとも１５％又は２０％（好適には少なくとも２５％又は少なくとも３０％）は、ヒトＴＮＦαに結合する。
【0026】
一実施形態では、ヒトＴＮＦα（又はその精製画分）で免疫されたウマから取得可能な血漿に含まれる全抗体の少なくとも５％（好適には少なくとも１０％）は、ヒトＴＮＦαに結合する。他の一実施形態では、ヒトＴＮＦα（又はその精製画分）で免疫されたウマから取得可能な血漿に含まれる全抗体の少なくとも１５％又は２０％（好適には少なくとも２５％又は少なくとも３０％）は、ヒトＴＮＦαに結合する。
【0027】
一実施形態では、抗体組成物は、５～１００ｇ／Ｌ又は１０～７５ｇ／Ｌの濃度でインタクトなポリクローナル抗体を含む。一実施形態では、抗体組成物は、２０～７５ｇ／Ｌ又は３５～６０ｇ／Ｌの濃度でインタクトなポリクローナル抗体を含む。好適には、抗体組成物は、少なくとも約２０又は５０ｇ／Ｌのインタクトなポリクローナル抗体を含みうる。参照される濃度は、インタクトな全ポリクローナル抗体、好適にはインタクトな全ポリクローナルＩｇＧ（すなわち、ＴＮＦαに結合する抗体さらには結合しない抗体を含む）の濃度でありうる。一実施形態では、以上の実施形態は、ＴＮＦαに結合するインタクトなポリクローナル抗体に関する。好ましくは、参照される抗体はヒツジポリクローナル抗体である。
【0028】
「抗体」とは、少なくとも１つ又は２つの重（Ｈ）鎖可変領域（本明細書ではＶＨＣと略記される）と、少なくとも１つ又は２つの軽（Ｌ）鎖可変領域（本明細書ではＶＬＣと略記される）と、を含むタンパク質のことである。ＶＨＣ及びＶＬＣの領域は、「フレームワーク領域」（ＦＲ）と称されるより保存された領域が介在する「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）と称される超可変性領域にさらに細分可能である。フレームワーク領域及びＣＤＲの範囲は、正確に定義されている（Kabat, E.A., et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, 1991、及びChothia, C. et al, J. MoI. Biol. 196:901-917, 1987（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。好ましくは、各ＶＨＣ及びＶＬＣは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成され、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に次の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置される。
【0029】
抗体のＶＨＣ又はＶＬＣの鎖は、重鎖又は軽鎖の定常領域の全部又は一部をさらに含みうる。一実施形態では、抗体は、２つの免疫グロブリン重鎖及び２つ免疫グロブリン軽鎖のテトラマーであり、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖は、たとえばジスルフィド結合により相互接続される。重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬで構成される。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、典型的には、免疫系の各種細胞（たとえばエフェクター細胞）及び古典補体系の第１成分（ＣＩｑ）をはじめとする宿主組織又は因子への抗体の結合を媒介する。「抗体」という用語は、タイプＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ（さらにはそれらのサブタイプ）のインタクトな免疫グロブリンを含み、免疫グロブリンの軽鎖は、タイプκ又はλでありうる。好ましくは、本発明の抗体はインタクトなＩｇＧである。
【0030】
「インタクトな抗体」という用語は、本明細書では、本発明の抗体と抗体フラグメント（たとえば、抗体Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、又はＦｃ）とを識別するために用いられる。したがって、「インタクトな抗体」は、完全長抗体（たとえば、ヒツジから取得可能なもの）に存在する抗体領域／ドメインの各々を含む（又はそれらからなる）。「インタクトな抗体」のモノマーは、２つの重鎖及び２つの軽鎖を含む（又はそれらからなる）。重鎖は各々、ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む（又はそれらからなる）。軽鎖は各々、ＣＬドメイン及びＶＬドメインを含む（又はそれらからなる）。
【0031】
そのため、本発明の抗体組成物は、抗体フラグメント（たとえば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、又はＦｃフラグメント）をまったく又は実質的にまったく含まない。これに関連して用いられる「実質的にまったく～ない」という用語は、本発明の組成物に含まれる抗体の全濃度の５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、又は０．０１％未満が抗体フラグメントであることを意味する。逆に言えば、一実施形態では、組成物に含まれる抗体の全濃度の少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、９９．９９％、又は１００％（好適には１００％）は、インタクトな抗体である。一実施形態では、ポリクローナル抗体は、汚染抗体フラグメントから精製及び／又は単離しうる。
【0032】
有利には、本発明のインタクトな抗体は、改善されたＴＮＦα結合能（実施例３）及び／又は中和能（実施例４）により実証されるように、抗体フラグメントと比較して改善されたＴＮＦα結合及び／又は中和を実証する。さらに、本発明のインタクトな抗体は、追加の処理工程及び／又は精製工程を必要とする抗体フラグメントよりもはるかに製造経費がかからない。
【0033】
一態様では、本発明は、ヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）に結合するインタクトな血液由来ポリクローナル抗体の製造方法を提供し、前記方法は、ヒトＴＮＦα又はその断片を含む免疫原が投与された非ヒト哺乳動物から血液サンプルを得ることを含む。血液サンプルは、ヒトＴＮＦαに結合するインタクトなポリクローナル抗体を含む。発明はまた、前記方法により取得可能な抗体に関する。
【0034】
血液サンプルは、たとえば、血清又は血漿を得るためにさらに処理しうる。したがって、抗体は、血清又は血漿から取得可能でありうる。非ヒト哺乳動物がヒツジである実施形態では、抗体は、血清から取得可能でありうる。非ヒト哺乳動物がウマである実施形態では、抗体は、血漿から取得可能でありうる。
【0035】
本明細書で用いられる「血液由来」という用語は、抗体が前記抗体の産生に使用される宿主（たとえば非ヒト哺乳動物）の血液から得られることを意味する。典型的には、血液由来抗体は、ヒトＴＮＦα又はその断片を前記宿主（たとえば非ヒト哺乳動物）の皮下、筋肉内、腹腔内、及び／又は静脈内に投与することにより得られうる。
【0036】
一実施形態では、血液サンプル（たとえば血清）は、ヒトＴＮＦαに結合する抗体を少なくとも１、２、３、４、５、６、７、又は８ｇ／Ｌ、好ましくはヒトＴＮＦαに結合する抗体を少なくとも３又は少なくとも５ｇ／Ｌ含む。
【0037】
一実施形態では、血液サンプル（たとえば血清）は、ヒトＴＮＦαに結合する抗体を約１～約１２ｇ／Ｌ、たとえばヒトＴＮＦαに結合する抗体を約３～約９ｇ／Ｌ含む。
【0038】
本方法は、血液由来ポリクローナル抗体と胃腸通過時に前記抗体の保護手段とを混和することをさらに含みうる。
【0039】
一実施形態では、血液サンプルは、少なくとも１×１０９Ｌ／ｍｏｌ、好ましくは少なくとも１×１０１０Ｌ／ｍｏｌの結合活性でヒトＴＮＦαに結合する抗体を含む。
【0040】
好ましくは、非ヒト哺乳動物はヒツジ非ヒト哺乳動物である。
【0041】
ヒツジ抗体とは、ヒツジで産生された抗体のことである。ヒトＴＮＦαに結合する血液由来抗体の産生宿主としてヒツジを使用すると、いくつかの利点がもたらされる。ヒツジ血液（たとえば血清）に存在するヒトＴＮＦαに結合する抗体の濃度は、時間が経っても実質的に一定の状態を維持し、特異的抗体の最大濃度を得てから濃度が半分になるまでに典型的には約６ヶ月かかることを、本発明者らは見いだした。そのため、ヒトＴＮＦαで頻繁に再免疫する必要性は回避／最小化される。そのほか、特異的抗体の濃度が実質的に一定であるので、高収率の血液由来抗体が毎年得られるようになる。これとは対照的に、乳（たとえばウシ乳）、卵、又は初乳を使用すると、毎年の抗体収率がかなり低くなることを、本発明者らは見いだした。さらに、免疫化スケジュールの実質的に任意の時点で（最大抗体濃度に達した後）、高濃度の特異的抗体を毎年得ることが可能である。このことは、血中の特異的抗体の濃度が変動する他の非ヒト哺乳動物とは対照的であり、その場合には、抗体濃度を測定して、特異的抗体濃度が高いときにのみ血液サンプルが得られることを確認することが必要である。したがって、産生宿主としてヒツジを使用することにより、この追加の工程の除去及び／又は製造方法の予測不能性の除去がなされる。
【0042】
そのほか、本発明者らは、ヒツジ間の特異的血液由来抗体の濃度に一貫性があることを示した。
【0043】
さらに、ヒツジは、先進世界では豊富であり、他の非ヒト哺乳動物と比較して作業が容易である。
【0044】
そのため、一実施形態では、非ヒト哺乳動物は、前記非ヒト哺乳動物にヒトＴＮＦα又はその断片を含む免疫原が投与された後、ヒトＴＮＦαに結合するポリクローナル抗体の血中濃度が実質的に一定である非ヒト哺乳動物（たとえばヒツジ）である。
【0045】
これに関連して用いられる「実質的に一定」という用語は、ヒトＴＮＦαに結合するポリクローナル抗体の血中濃度が、前記抗体の最高血中濃度に達した後、６ヶ月以内に及び／又はそれまでに（好ましくは６ヶ月以内に及びそれまでに）、前記抗体の最高血中濃度（１００％）の７５％以下（好ましくは７０％、６５％、又は６０％以下、より好ましくは５５％以下（たとえば５０％以下））の減少を示すことを意味する。
【0046】
代替的又は追加的に、これに関連して用いられる「実質的に一定」という用語は、ヒトＴＮＦαに結合するポリクローナル抗体の最高血中濃度（１００％）に達した後、６ヶ月以内に及び／又はそれまでに（好ましくは６ヶ月以内に及びそれまでに）、前記ポリクローナル抗体の血中濃度は、最高値の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも２５％、３０％、３５％、又は４０％、より好ましくは少なくとも４５％（たとえば約５０％）であることを意味しうる。
【0047】
一実施形態では、ヒトＴＮＦαに結合するポリクローナル抗体の最高血中濃度は、免疫化の少なくとも１０週間後、たとえば、免疫化の少なくとも１１週間後に生じる。好ましくは、ヒトＴＮＦαに結合するポリクローナル抗体の最高血中濃度は、免疫化の約１２週間後に生じる。
【0048】
そのため、本発明は、本発明の組成物に使用されるヒツジ抗体の産生方法を含む。前記方法は、典型的には、
ｉ． ヒトＴＮＦα又はその断片を含む免疫原をヒツジに投与することと、
ｉｉ． 十分な時間をかけてヒツジで抗体を発生させることと、
ｉｉｉ． ヒツジから抗体を得ることと、
を含む。
ｉ． ヒトＴＮＦα又はその断片を含む免疫原をヒツジに投与することと、
ｉｉ． 十分な時間をかけてヒツジで抗体を発生させることと、
ｉｉｉ． ヒツジから抗体を得ることと、
を含む。
【0049】
本明細書で用いられる「ヒツジ（sheep）」という用語は、「ヒツジ（ovine）」という用語と同義である。本明細書で用いられる場合、ヒツジは、オビス（Ovis）属（たとえば、オビス・アンモン（Ovis ammon）、オビス・オリエンタリス・アリエス（Ovis orientalis aries）、オビス・オリエンタリス・オリエンタリス（Ovis orientalis orientalis）、オビス・オリエンタリス・ビグネイ（Ovis orientalis vignei）、オビス・カナデンシス（Ovis Canadensis）、オビス・ダリ（Ovis dalli）、オビス・ニビコラ（Ovis nivicola））に含まれる任意の種を含む。
【0050】
本明細書で用いられる「ヒツジ抗体」という用語は、ヒツジで産生された抗体に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有する抗体である。好ましくは、本明細書で用いられる「ヒツジ抗体」は、ヒツジで産生された抗体に対して１００％のアミノ酸配列同一性を有する抗体である。
【0051】
一実施形態では、本発明の組成物は、ヒツジ抗体のみを含むので、非ヒツジ源からの抗体を除外する。
【0052】
抗体は、典型的には、ヒツジ血清から取得可能である。そのため、本明細書に記載のヒツジ抗体の産生方法は、ヒトＴＮＦαへの結合及び／又はその中和が可能な抗体を含むヒツジ抗血清を生成する。一実施形態では、抗体は、単離及び／又は精製され、たとえば、ヒツジ抗血清から単離及び／又は精製される。
【0053】
好ましくは、非ヒト哺乳動物はウマ非ヒト哺乳動物である。
【0054】
ウマ抗体とは、ウマで産生された抗体のことである。有利には、ヒトＴＮＦαに結合する血液由来抗体は、産生宿主としてウマを用いることにより、高収率で毎年得ることが可能である。さらに、ウマ血液細胞は、サンプル採取時に迅速に沈降するので、血漿を得るときに時間のかかる遠心分離工程を必要としないことが判明した。
【0055】
非ヒト哺乳動物がウマ非ヒト哺乳動物である実施形態では、製造方法は、血液サンプルから血漿を得ることと、前記サンプルからの血液細胞を前記ウマ非ヒト哺乳動物に戻すことと、を含みうる。好適には、血液細胞は、血液サンプルを得た後、２４時間未満、１２時間未満、６時間未満、１時間、又は３０分間未満で戻しうる。
【0056】
そのため、本発明は、本発明の組成物に使用されるウマ抗体の産生方法を含む。前記方法は、典型的には、
ｉ． ヒトＴＮＦα又はその断片を含む免疫原をウマに投与することと、
ｉｉ． 十分な時間をかけてウマで抗体を発生させることと、
ｉｉｉ． ウマから抗体を得ることと、
を含む。
ｉ． ヒトＴＮＦα又はその断片を含む免疫原をウマに投与することと、
ｉｉ． 十分な時間をかけてウマで抗体を発生させることと、
ｉｉｉ． ウマから抗体を得ることと、
を含む。
【0057】
本明細書で用いられる「ウマ（horse）」という用語は、「ウマ（equine）」という用語と同義である。本明細書で用いられる場合、ウマは、エクウス（Equus）属に含まれる任意の種を含む。好ましくは、ウマは、エクウス・フェルス（Equus ferus）種の１つ以上の亜種、たとえば、エクウス・フェルス・カバルス（Equus ferus caballus）である。
【0058】
本明細書で用いられる「ウマ抗体」という用語は、ウマで産生された抗体に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有する抗体である。
【0059】
好ましくは、本明細書で用いられる「ウマ抗体」は、ウマで産生された抗体に対して１００％のアミノ酸配列同一性を有する抗体である。
【0060】
一実施形態では、本発明の組成物は、ウマ抗体のみを含むので、非ウマ源からの抗体を除外する。
【0061】
抗体は、典型的には、ウマ血漿から取得可能である。そのため、本明細書に記載のウマ抗体の産生方法は、ヒトＴＮＦαへの結合及び／又はその中和が可能な抗体を含むウマ血漿を生成する。一実施形態では、抗体は、単離及び／又は精製され、たとえば、ウマ血漿から単離及び／又は精製される。
【0062】
本発明の抗体の発生に使用される免疫原は、任意選択的に精製されたヒトＴＮＦαである。本明細書で用いられる「ヒトＴＮＦα」という用語は、全長ヒトＴＮＦα、その変異体、又はそれらの断片を包含する。好ましくは、「ヒトＴＮＦα」という用語は、全長ヒトＴＮＦαを意味する。好適には、ヒトＴＮＦαは、組換えヒトＴＮＦαでありうる。
【0063】
免疫原は、配列番号１を含む（又はそれからなる）ヒトＴＮＦαでありうる。一実施形態では、免疫原は配列番号１の断片である。一実施形態では、免疫原は、配列番号１に対して少なくとも７０％（好適には少なくとも８０％）の配列同一性を有するヒトＴＮＦα変異体（又はその断片）である。好適には、免疫原は、配列番号１に対して少なくとも９０％（好適には少なくとも９５％）の配列同一性を有するヒトＴＮＦα変異体（又はその断片）である。
【0064】
免疫原は、配列番号２を含む（又はそれからなる）ヒトＴＮＦαでありうる。一実施形態では、免疫原は配列番号２の断片である。一実施形態では、免疫原は、配列番号２に対して少なくとも７０％（好適には少なくとも８０％）の配列同一性を有するヒトＴＮＦα変異体（又はその断片）である。好適には、免疫原は、配列番号２に対して少なくとも９０％（好適には少なくとも９５％）の配列同一性を有するヒトＴＮＦα変異体（又はその断片）である。
【0065】
一実施形態では、免疫原は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、若しくは配列番号１３、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性（たとえば、それらに対して少なくとも８０％の配列同一性）を有する配列を含む（又はそれらからなる）。一実施形態では、免疫原は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、又は配列番号１３に対して少なくとも９０％（たとえば、少なくとも９５％）の配列同一性を有する配列を含む（又はそれらからなる）。一実施形態では、免疫原は、１つ以上の前記配列の断片又は変異体である。
【0066】
一実施形態では、「変異体」は、ペプチド又はペプチド断片のミミックでありうるとともに、ミミックは、ペプチド又はペプチド断片のエピトープを少なくとも１つ再生する。他の一実施形態では、「変異体」は、本明細書に記載の配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸の突然変異又は改変を有するペプチド又はペプチド断片でありうる。一実施形態では、変異体は配列番号１３である。
【0067】
本明細書で参照される「断片」は、１～１５６の任意の数のアミノ酸を有する配列番号１の断片でありうる。代替的又は追加的に、本明細書で参照される「断片」は、１～２３２の任意の数のアミノ酸を有する配列番号２の断片でありうる。断片は、好ましくは、ヒトＴＮＦαのエピトープを少なくとも１つ含む。「断片」はまた、共通の抗原交差反応性及び／又はその由来源のヒトＴＮＦαと実質的に同一のｉｎ ｖｉｖｏ生物学的活性を有しうる。たとえば、断片に結合可能な抗体は、その由来源のヒトＴＮＦαにも結合可能であろう。代替的に、断片は、ヒトＴＮＦαの抗原成分にあらかじめ暴露されたＴリンパ球の「リコール反応」を誘導する共通の能力を共有しうる。
【0068】
一実施形態では、断片は、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、若しくは配列番号１２、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性（たとえば、それらに対して少なくとも８０％の配列同一性）を有する配列を含む（又はそれらからなる）。一実施形態では、断片は、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、又は配列番号１２に対して少なくとも９０％（たとえば少なくとも９５％）の配列同一性を有する配列を含む（又はそれらからなる）。
【0069】
一実施形態では、免疫原又はその断片は、ヒトＴＮＦαのＮ末端又はＮ末端断片（たとえば、配列番号１又は配列番号２）を含む（又はそれらからなる）。一実施形態では、Ｎ末端又はＮ末端断片は配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、若しくは配列番号７、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性（たとえば、それらに対して少なくとも８０％の配列同一性）を有する配列を含む（又はそれらからなる）。一実施形態では、Ｎ末端又はＮ末端断片は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、又は配列番号７に対して少なくとも９０％（たとえば少なくとも９５％）の配列同一性を有する配列を含む（又はそれらからなる）。
【0070】
いくつかの実施形態では、本発明のポリクローナル抗体は、ネズミＴＮＦαの交差反応性及び／又は中和を呈する。
【0071】
有利には、ヒトＴＮＦαのＮ末端断片に結合する抗体は、改善された中和性を呈しうる。
【0072】
理論により拘束されることを望むものではないが、ヒトＴＮＦαは、複数のエピトープを含む（又はそれらからなる）と考えられる。たとえば、ヒトＴＮＦαモノマーは、少なくとも２つ又は３つのエピトープを含みうる。ヒトＴＮＦαはまた、トリマー構造をとると考えられる。そのため、ヒトＴＮＦαトリマーは、さらなるエピトープを含みうる。理論により拘束されることを望むものではないが、組成物の少なくとも５～１５種の抗体（たとえば、１０～１５種の抗体）は、ヒトＴＮＦαトリマーに結合しうると考えられる。好適には、組成物の約１２種の抗体は、ヒトＴＮＦαトリマーに結合しうる。
【0073】
本発明の抗体組成物はポリクローナル抗体を含むので、好ましくは、前記抗体組成物は抗体の集団を含み、集団は、ヒトＴＮＦαの複数のエピトープ（好ましくは全エピトープ）に結合可能である。
【0074】
一実施形態では、本発明の抗体組成物は、ヒトＴＮＦαの第１のエピトープに結合する第１の抗体と、ヒトＴＮＦαの第２のエピトープに結合する第２の抗体と、を含む。好ましくは、本発明の抗体組成物は、ヒトＴＮＦαの第３のエピトープに結合する第３の抗体を含む。好適には、本発明の抗体組成物は、ヒトＴＮＦαの異なるさらなるエピトープに各々結合するさらなる抗体を含みうる。
【0075】
本発明の抗体組成物は、好適には、配列番号１及び／又は配列番号２に結合する抗体を含む。好適には、本発明の抗体組成物は、配列番号１３に結合する抗体を含みうる。
【0076】
一実施形態では、抗体組成物は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、若しくは配列番号１３、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性（たとえば、それらに対して少なくとも８０％の配列同一性）を有する配列の１つ以上（たとえば複数）に結合する抗体を含む。一実施形態では、抗体組成物は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、又は配列番号１３に対して少なくとも９０％（たとえば少なくとも９５％）の配列同一性を有する１つ以上（たとえば複数）の配列に結合する抗体を含む。
【0077】
一実施形態では、抗体組成物は、ヒトＴＮＦαのＮ末端に結合する抗体（たとえば、配列番号１又は配列番号２）を含む。一実施形態では、前記抗体は、１つ以上（たとえば、複数）の配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、若しくは配列番号７、又はそれらに対して少なくとも７０％の配列同一性（たとえば、それらに対して少なくとも８０％の配列同一性）を有する配列に結合する。一実施形態では、前記抗体は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、又は配列番号７に対して少なくとも９０％（たとえば少なくとも９５％）の配列同一性を有する１つ以上（たとえば複数）の配列に結合する。
【0078】
複数の配列とは、前記配列の少なくとも２種（たとえば、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２種）を意味する。好適には、複数の配列という用語は、列挙された配列のすべてを意味する。
【0079】
抗原は、アジュバントと共に製剤化しうる。好適なアジュバントとしては、ミョウバン（リン酸アルミニウム又は水酸化アルミニウム）、サポニン（及びその精製成分キルＡ）、フロイント完全及び不完全アジュバント、ＲＩＢＢＩアジュバント、並びに研究及び獣医学的用途に使用される他のアジュバントが挙げられうる。
【0080】
本発明は、多種多様な免疫化スケジュールを企図する。一実施形態では、非ヒト哺乳動物（たとえば、ヒツジ又はウマ）は、０日目に免疫原が投与され、その後、続いて、インターバルを置いて免疫原を摂取する。必要とされるインターバル範囲及び投与量範囲は、とくに、免疫原の正確な性質、投与経路、及び製剤の性質に基づいて当業者であれば決定可能である。これらの投与量レベルの変動は、標準的な経験的最適化ルーチンを用いて調整可能である。同様に、本発明は、抗体採取のためにいずれかの特定のスケジュールに限定することが意図されるものではない。採集時点は、典型的には、５６日目の後でありうる。特異的抗体のレベル、すなわち、免疫原に結合するレベルは、少なくとも２ｇ／リットル血液、血清、又は血漿（たとえば、少なくとも３ｇ／リットル血液、血清、又は血漿）で存在しうる。
【0081】
非ヒト哺乳動物（たとえば、ヒツジ又はウマ）から得られた抗体は、続いて精製しうるので、本明細書で参照される「精製画分」を提供する。一実施形態では、抗体は、沈殿、クロマトグラフィー、濾過、又はそれらの組合せにより精製しうる。選択される精製方法は、ＩｇＧの溶解状態の維持、阻害剤（たとえばα１－抗トリプシン）の共単離、アルブミンの共単離、又はそれらの組合せが可能なものでありうる。
【0082】
沈殿は、硫酸ナトリウム沈殿又はカプリル酸沈殿でありうる。好適には、沈殿は硫酸ナトリウム沈殿である。有利には、硫酸ナトリウム沈殿は、α１－抗トリプシンの共単離を可能にする。
【0083】
本発明のインタクトなポリクローナル抗体は、好適には、緩衝液を用いて製剤化される。緩衝液は、クエン酸ナトリウム及び／又はクエン酸などの生理的塩を含みうる。生理的塩は、１００～２００ｍＭ又は１２５～１７５ｍＭの濃度で緩衝液中に存在しうる。好適には、緩衝液中の生理的塩は、約１５０ｍＭ（好ましくは１５３ｍＭ）の濃度で存在しうる。
【0084】
本発明の抗体組成物は、経口投与に供すべく製剤化される。経口投与される本発明の抗体組成物は、以下の予想外の利点の１つ以上を伴うことが判明した。
・ 抗体は、経口投与した場合、抗体製剤を静脈内とりわけ皮下又は筋肉内に投与した場合と比較して、より迅速に有効濃度で胃腸管の所望の領域に達する。
・ ポリクローナル抗体は、大部分がその標的に達するので、たとえば、ほとんどの抗体が血中及び生体の細胞外液区画内に残留する全身投与と比較して、有意により低い濃度（たとえば１０％未満）の投与を可能にする。
・ 経口投与されたポリクローナル抗体は、体循環にまったく入ることなく胃腸管の管腔及び壁に限局されると考えられる。これには次の３つの主な利点がある。ｉ．経口投与は、全身性免疫反応を引き起こさないので、本発明の組成物の投与は、体液性免疫反応を引き起こすことなく制限なく継続可能である。ｉｉ．同一の理由で、急性過敏性反応のリスクも遅延過敏性反応のリスクもない。また、ｉｉｉ．本発明のポリクローナル抗体は、全身に位置するＴＮＦαを中和しないであろうから、悪性病変を含めて結核などの感染症及び他の合併症のリスクを回避する。
・ 経口製品は、精査の規制を受けることがかなり少ない。実際に、たとえば、ウマ、ヒツジ、又はウシの血漿の栄養サプリメント飲料としての消費は、経口投与時のその安全性に関するさらなる証拠を提供する。さらに、いくつかの経口抗体ベースの製品は、食品として扱われる。
・ 経口投与用抗体は、全身投与されるものほど精製及び安全性試験を必要としない。
・ 製造は、クリーンルーム設備の使用を必要としない。
・ 療法のコストは、本発明のポリクローナル抗体の比較的低い製造コスト、経口投与時に必要とされる抗体のより低い濃度、日帰り入院の必要性の回避、及び全身（たとえばＩＶ）投与に必要とされる看護師／ヘルスケア専門家の時間の必要性の回避をはじめとする理由で、有意に削減される。及び／又は
・ 経口製剤は、改善された患者利便性を提供することにより、被験体自体の家庭及び被験体に便利な時間での投与を可能にする。また、被験体の大多数（とりわけ小児グループ）は、全身投与製品よりも心地よい風味付きの経口製品を受け入れやすい。
・ 抗体は、経口投与した場合、抗体製剤を静脈内とりわけ皮下又は筋肉内に投与した場合と比較して、より迅速に有効濃度で胃腸管の所望の領域に達する。
・ ポリクローナル抗体は、大部分がその標的に達するので、たとえば、ほとんどの抗体が血中及び生体の細胞外液区画内に残留する全身投与と比較して、有意により低い濃度（たとえば１０％未満）の投与を可能にする。
・ 経口投与されたポリクローナル抗体は、体循環にまったく入ることなく胃腸管の管腔及び壁に限局されると考えられる。これには次の３つの主な利点がある。ｉ．経口投与は、全身性免疫反応を引き起こさないので、本発明の組成物の投与は、体液性免疫反応を引き起こすことなく制限なく継続可能である。ｉｉ．同一の理由で、急性過敏性反応のリスクも遅延過敏性反応のリスクもない。また、ｉｉｉ．本発明のポリクローナル抗体は、全身に位置するＴＮＦαを中和しないであろうから、悪性病変を含めて結核などの感染症及び他の合併症のリスクを回避する。
・ 経口製品は、精査の規制を受けることがかなり少ない。実際に、たとえば、ウマ、ヒツジ、又はウシの血漿の栄養サプリメント飲料としての消費は、経口投与時のその安全性に関するさらなる証拠を提供する。さらに、いくつかの経口抗体ベースの製品は、食品として扱われる。
・ 経口投与用抗体は、全身投与されるものほど精製及び安全性試験を必要としない。
・ 製造は、クリーンルーム設備の使用を必要としない。
・ 療法のコストは、本発明のポリクローナル抗体の比較的低い製造コスト、経口投与時に必要とされる抗体のより低い濃度、日帰り入院の必要性の回避、及び全身（たとえばＩＶ）投与に必要とされる看護師／ヘルスケア専門家の時間の必要性の回避をはじめとする理由で、有意に削減される。及び／又は
・ 経口製剤は、改善された患者利便性を提供することにより、被験体自体の家庭及び被験体に便利な時間での投与を可能にする。また、被験体の大多数（とりわけ小児グループ）は、全身投与製品よりも心地よい風味付きの経口製品を受け入れやすい。
【0085】
経口送達に好適な組成物は、溶液剤、懸濁液剤、又は使用前に好適な媒体に溶解若しくは懸濁される乾燥粉末剤の形態でありうる。
【0086】
医薬製剤の調製時、抗体は、媒体に溶解し、そして、たとえば、無菌技術を用いて滅菌フィルターに通して濾過することにより滅菌し、その後、好適な無菌バイアル又はアンプルに充填し、そして密閉することが可能である。有利には、緩衝剤、可溶化剤、安定化剤、保存剤又は殺菌剤又は懸濁化剤、及び／又は局所麻酔剤などの添加剤を媒体に溶解させうる。
【0087】
使用前に好適な媒体に溶解又は懸濁される乾燥粉末剤は、無菌領域で無菌技術を用いて無菌容器にあらかじめ滅菌された成分を充填することにより調製しうる。代替的に、成分は、無菌領域で無菌技術を用いて好適な容器に溶解導入しうる。容器は無菌状態で密封されている。
【0088】
とくに好ましい実施形態では、経口投与用組成物は、液体剤として製剤化される。
【0089】
経口投与に伴う問題は、十分な濃度の機能性抗体が胃腸管を介してその標的（たとえば、小腸又は結腸）に輸送されることを保証することである。最適量の機能性抗体が消化管に達するのを阻害するおそれのある因子としては、抗体分子を分解する消化分泌物に存在するタンパク質分解酵素が挙げられる。そのため、本発明の抗体組成物は、胃腸通過時の抗体の保護手段を含む。かかる手段は、抗体組成物が通過時に遭遇する望ましくない作用を相殺及び／又は低減する。望ましくない作用は、たとえば、胃腸酵素（たとえば、ペプシンなどの胃酵素）及び化学的環境（たとえば胃酸）に帰属可能でありうる。
【0090】
本明細書で用いられる「胃腸通過時の抗体の保護手段」という用語は、抗体ポリペプチド自体の保護／安定化アミノ酸修飾（たとえば、点突然変異、置換、付加、又は欠失）、又は抗体の保護／安定化翻訳後修飾（たとえばグリコシル化）を包含することを意図するものではない。しかしながら、例外として、一実施形態では、手段は、本発明の抗体に共有結合されたＰＥＧ化部分を含みうるが、代替実施形態では、ＰＥＧ化もＰＥＧ化部分も除外される。実際に、アミノ酸修飾及び翻訳後修飾を介する抗体の保護／安定化方法は、製造プロセスの複雑化及び製造コストの増加を伴うので不利である。疑問を生じないように述べておくが、以上のことは、本明細書に記載される胃腸通過時の抗体の保護手段の存在に加えて、抗体ポリペプチドの保護／安定化アミノ酸修飾又は抗体の保護／安定化翻訳後修飾の存在を除外するものではない。
【0091】
好ましくは、抗体の保護手段は、レクチンを含まない。より好ましくは、抗体の保護手段は、本発明の抗体と複合体化されない。
【0092】
限定されるものではないが、前記手段のさまざまな実施形態を続いて記載する。前記実施形態の各々は、単独で又は互いに組み合わせて利用しうる。当業者に公知の追加の手段は、本発明に包含され、また単独で又は以下の実施形態のいずれかと組み合わせて利用しうる。
【0093】
とくに好ましい実施形態では、本明細書に記載される抗体の保護手段は、少なくともプロテアーゼ阻害剤を含む。有利なことに、本発明者らは、ヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）に結合する血液由来ポリクローナル抗体とプロテアーゼ阻害剤とを含む組成物が、炎症性障害を治療する場合、予想外の相乗効果を呈することを発見した（すなわち、抗体及びプロテアーゼ阻害剤を単独で用いた被験体の治療の観察から得られる予想される相加効果を超える）。
【0094】
理論により拘束されることを望むものではないが、炎症性障害の被験者の胃腸管の上皮表面は、その保護粘液の正常層を失うと考えられる。本発明者らは、この損失がタンパク質分解酵素による前記上皮表面の攻撃を引き起こし、恒常性破壊及び／又は継続／悪化病変をもたらすことを見いだした。本発明の抗体組成物は、驚くべきことに、前記タンパク質分解酵素からの胃腸管の保護のほか、ＴＮＦα結合を介する炎症の低減及び他の症状の治療も可能にする。
【0095】
（以下に記載の通り）任意のプロテアーゼ阻害剤を本発明に使用可能であるが、一実施形態では、プロテアーゼ阻害剤はダイズ由来プロテアーゼ阻害剤である。
【0096】
タンパク質のボーマン・バーク阻害剤ファミリーから選択されるプロテアーゼ阻害剤は、とりわけ好ましい。ボーマン・バーク阻害剤は、典型的にはジスルフィド結合された短いβシート領域である露出表面ループを介してプロテアーゼと相互作用しそれを阻害するセリンプロテアーゼ阻害剤である。好適なボーマン・バーク阻害剤は、マメ（たとえば、ダイズ、ライマメ、リョクトウ、ソラマメ、アズキ）、コムギ（たとえば、トリチカム・アエスチバム（Triticum aestivum））、オオムギ（たとえば、ホルデウム・ブルガレ（Hordeum vulgare））、コメ（たとえば、オリザ・サチバ（Oryza sativa））、ナッツ（たとえば、アラキス・ヒポガエア（Arachis hypogaea））、コイクス・ラクリマ・ジョビ（Coix lachryma jobi）、セタリア・イタリカ（Setaria italica）、マクロチロマ・アキシラリス（Macrotyloma axillaris）、ロンコカルプス・カルパッサ（Lonchocarpus carpassa）、ビキア・アングスチフォリア（Vicia angustifolia）、及びアルファルファをはじめとする複数の供給源から得ることが可能である。好適には、ボーマン・バーク阻害剤は、１つ以上の前記供給源の種子から得られうる。
【0097】
一実施形態では、胃腸通過時の組成物の抗体の保護手段は、トリプシン及び／又はキモトリプシンに特異的に結合してそのタンパク質分解活性を抑制及び不活性化するポリペプチドを含む。かかる手段は、トリプシン－１及び／又はトリプシン－２の阻害剤でありうる。代替的又は追加的に、前記手段は、キモトリプシンＢの阻害剤でありうる。
【0098】
一実施形態では、前記阻害剤は、ポリペプチドベースの阻害剤などのマクロ分子阻害剤（たとえば、少なくとも５ｋＤａの分子量を有するマクロ分子阻害剤）である。例として、前記阻害剤は、ポリペプチドループを含有しうるとともに、このループは、トリプシン又はキモトリプシンのいずれかにより切断されたとき、阻害剤をプロテアーゼに非常に強く結合させることにより、トリプシン及び／又はキモトリプシンのさらなる作用を阻害する。
【0099】
一実施形態では、胃腸通過時の抗体の保護手段は、メンドリ（ニワトリ）卵などの卵から取得可能な手段を含む。より具体的には、胃腸通過時の抗体の保護手段は卵白でありうる。好適には、卵白は粉末卵白でありうる。そのため、一実施形態では、本発明は、インタクトなポリクローナル抗体と卵（好適には卵白、好ましくは粉末卵白）とを混和することを含む。
【0100】
卵（たとえば卵白）から取得可能な手段は、トリプシン阻害剤、キモトリプシン阻害剤、又はそれらの組合せでありうる。そのため、手段は、卵由来（たとえば卵白由来）トリプシン阻害剤及び／又はキモトリプシン阻害剤を含みうる。
【0101】
一実施形態では、卵（たとえば卵白）に存在する手段は、オボムコイド、オボスタチン、オボマクログロブリン、又はそれらの組合せの１つ以上である。オボムコイド（Ｍｗ２８，５００±３，５００）は、トリ卵白の糖タンパク質プロテアーゼ阻害剤である。前記阻害剤は、ウシのトリプシン及びキモトリプシンに対して試験したときに活性を有する。オボスタチン及びオボマクログロブリンは、生のトリ卵白に見いだされるプロテアーゼ阻害剤である。
【0102】
卵から取得可能な手段は、任意の好適な濃度で使用しうる。手段が乾燥卵（たとえば粉末卵白）である場合、前記乾燥卵は、少なくとも２５ｇ／Ｌ又は少なくとも３５ｇ／Ｌの濃度で組成物中に存在しうる。一実施形態では、乾燥卵は、少なくとも４５ｇ／Ｌ又は少なくとも５５ｇ／Ｌの濃度で組成物中に存在しうる。いくつかの実施形態では、乾燥卵は、４０ｇ／Ｌ～８０ｇ／Ｌ（好適には５０ｇ／Ｌ～７０ｇ／Ｌ）の濃度で組成物中に存在しうる。
【0103】
一実施形態では、胃腸通過時の抗体の保護手段はα１－抗トリプシンを含む。
【0104】
他の一実施形態では、手段はダイズトリプシン阻害剤である。
【0105】
一実施形態では、阻害剤カクテルは、便宜上、初乳（たとえばウシ）の形態で提供しうる。代替的に（又は追加的に）、その活性成分を利用しうる。初乳は、経口投与に好適な製剤を提供するために抗体と容易に組合せ可能である。
【0106】
一実施形態では、トリプシン阻害剤は、膵外分泌部で天然に合成される低分子タンパク質（たとえば、Ｍｗ５～２５ｋＤａ）であり、これは、トリプシノーゲンからトリプシンへの変換を防止することによりそれ自体をトリプシン消化から保護する。膵トリプシン阻害剤は、トリプシンの活性部位に競合的に結合し、非常に低濃度でそれを不活性化する。本発明で使用するのに好適なトリプシン阻害剤の例としては、天然に産生される分子及び組換え産生される分子の両方が挙げられる。たとえば、以下の通りである。
【0107】
【表1】
【0108】
天然膵トリプシン阻害剤は、腺房細胞により産生され、偶発的なトリプシノーゲン活性化及び派生的な抑制のきかないタンパク質分解に対する防衛手段を提供する。例として、細胞内塩基性トリプシン阻害剤（ＢＰＴＩ）は、１９３６年にKunitz及びNorthropにより最初に結晶化された。塩基性膵トリプシン阻害剤（ＢＰＴＩ）は、ｐＨ３～１０でウシトリプシンと非常に安定な１：１複合体を形成し、ヒトトリプシンに対しても同様である。キモトリプシンもまた、ＢＰＴＩにより阻害される。Kunitz（１９４５年）により最初に結晶化されたダイズトリプシン阻害剤（ＳＢＴＩ）は、ダイズに見いだされるいくつかのトリプシン阻害剤の１つである。最もよく知られている調製物は、Kunitzのもの（Ｍｗ２１，５００±８００、等電点：４．５）である。クニッツダイズ阻害剤は、２つのジスルフィド架橋により架橋された単一ポリペプチド鎖からなり、等モルでトリプシンを阻害し、より少ない程度でキモトリプシンを阻害する。ライマメトリプシン阻害剤（ＬＢＩ）は、等モルの複合体を形成することによりトリプシン及びキモトリプシンの両方に作用する。トリプシン感受性結合部位はＬｙｓ－Ｓｅｒペプチド結合であるが、キモトリプシン作用部位はＬｅｕ－Ｓｅｒ結合である（Krahn and Stevens 1970）。ライマメトリプシン阻害剤（Ｍｗ８，０００～１０，０００）は、クロマトグラフィーにより６種程度の変異体に分離しうる。それらはすべて、同一ではないが類似したアミノ酸組成を有し、６つ又は７つのジスルフィド結合を含み、且つメチオニン及びトリプトファンを欠如している。
【0109】
さらなる例として、ボーマンバークプロテアーゼ阻害剤は、ダイズ類及びある範囲内のマメ科植物により産生されるキモトリプシン阻害剤及びトリプシン阻害剤のグループである。それらは、ヒトに対して非毒性で耐容性が良好な７～１０ｋｄａの低分子のジスルフィドリッチなタンパク質である。ｐＨの極限値にきわめて安定なキモトリプシンペプチド阻害剤は、カメ卵白で生じる。これらの低分子ペプチド阻害剤（約１３ｋＤａ）は、キモトリプシンと安定な複合体を形成する（Guha et al (1984) J. Bioscience 6: 155-163）。
【0110】
一実施形態では、トリプシン阻害剤成分及び／又はキモトリプシン阻害剤成分は、トリプシン及び／又はキモトリプシンに結合し（たとえば特異的に結合し）、その酵素活性を不活性化する抗体（その断片を含む）でありうる。かかる抗体ベースの阻害剤は、以上の非抗体ベースの阻害剤の代わりに又はそれに加えて使用しうる。そのため、抗体ベースの阻害剤と非抗体阻害剤との組合せ阻害剤を利用しうる。例として、非抗体阻害剤（たとえば卵白由来阻害剤）は、抗体がキモトリプシン（及び／又はトリプシン）を阻害する抗体阻害剤と組み合わせて使用しうる。同様に、非抗体キモトリプシン阻害剤は、抗体がトリプシン（及び／又はキモトリプシン）を阻害する抗体阻害剤と組み合わせて使用しうる。かかる抗体はルーチンで調製しうる。
【0111】
一実施形態では、トリプシン阻害剤及び／又はキモトリプシン阻害剤は、少なくとも２５ｇ／Ｌ又は少なくとも３５ｇ／Ｌの濃度で組成物中に存在しうる。一実施形態では、トリプシン阻害剤及び／又はキモトリプシン阻害剤は、少なくとも４５ｇ／Ｌ又は少なくとも５５ｇ／Ｌの濃度で組成物中に存在しうる。いくつかの実施形態では、トリプシン阻害剤及び／又はキモトリプシン阻害剤は、４０ｇ／Ｌ～８０ｇ／Ｌ（好適には５０ｇ／Ｌ～７０ｇ／Ｌ）の濃度で組成物中に存在しうる。
【0112】
代替的又は追加的に（好ましくは追加的に）、胃腸通過時の抗体の保護手段は制酸剤を含む。使用時、前記制酸剤成分は、被験体内に存在する高酸性胃環境から抗体成分を保護するのに役立つ。
【0113】
制酸剤は、任意の物質、一般的には、胃酸性度を打ち消す塩基又は塩基性塩である。言い換えると、制酸剤は、限られた時間にわたり胃ｐＨを理想的にはｐＨ５．０超に上昇させる胃酸中和剤である。制酸剤は中和反応を実施する。すなわち、胃酸を緩衝してｐＨを上昇させることにより胃内の酸性度を低減する。
【0114】
本発明で使用される好適な制酸剤の例としては、水酸化アルミニウム（たとえば、Amphojel、AlternaGEL）、水酸化マグネシウム（たとえば、Phillips’ Milk of Magnesia）、水酸化マグネシウムを含む水酸化アルミニウム（たとえば、Maalox、Mylanta、Diovol）、塩基性炭酸アルミニウムゲル（たとえば、Basaljel）、炭酸カルシウム（たとえば、Alcalak、TUMS、Quick-Eze、Rennie、Titralac、Rolaids）、重炭酸ナトリウム（たとえば、重炭酸ソーダ、Alka-Seltzer）、炭酸マグネシウム、三ケイ酸マグネシウム、ヒドロタルサイト（たとえば、Ｍｇ６Ａｌ２（ＣＯ３）（ＯＨ）１６・４（Ｈ２Ｏ）、Talcid）、次サリチル酸ビスマス（たとえば、Pepto-Bismol）、アルギネート（たとえば、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸）、シメチコンを含むマガルドレート（たとえば、Pepsil）、シメチコンと組み合わされた以上のいずれか、たとえば、３つの活性成分、すなわち、酸を中和して疼痛の原因を除く水酸化アルミニウム及び酸化マグネシウムとジメチコンとを有するAsiloneが挙げられる。
【0115】
一実施形態では、制酸剤は、水酸化マグネシウム及び／又は水酸化アルミニウムである。水酸化アルミニウムは、乾燥水酸化アルミニウムゲルの形態で組成物に添加しうる。好ましくは、本発明の組成物は、水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムを含む。
【0116】
制酸剤は、任意の好適な濃度で使用しうる。一実施形態では、制酸剤は、少なくとも５ｇ／Ｌ又は少なくとも１０ｇ／Ｌの濃度で存在しうる（たとえば、使用される制酸剤に基づいて）。他の一実施形態では、制酸剤は、少なくとも１５ｇ／Ｌ又は少なくとも２０ｇ／Ｌの濃度で存在しうる（たとえば、使用される制酸剤に基づいて）。いくつかの実施形態では、５ｇ／Ｌ～４０ｇ／Ｌ（好適には１０ｇ／Ｌ～３０ｇ／Ｌ）の制酸剤を使用しうる（たとえば、使用される制酸剤に基づいて）。
【0117】
好ましい実施形態では、本発明の組成物は、５ｇ／Ｌ～４０ｇ／Ｌ（好適には１０ｇ／Ｌ～３０ｇ／Ｌ）の塩化マグネシウム及び／又は５ｇ／Ｌ～４０ｇ／Ｌ（好適には１０ｇ／Ｌ～３０ｇ／Ｌ）の水酸化アルミニウムを含む。
【0118】
一実施形態では、抗体組成物は、制酸剤分子、及びトリプシン及び／又はキモトリプシンに特異的に結合し、それらのタンパク質分解活性を抑制又は不活性化するポリペプチド、及び／又はトリプシン及び／又はキモトリプシンに結合し、前記トリプシン及び／又はキモトリプシンのプロテアーゼ活性を不活性化する抗体を含む。
【0119】
本発明の組成物は、１種以上の抗微生物剤を含みうる。一実施形態では、抗微生物剤は、メチルパラベン（Ｅ２１８）及び／又はプロピルパラベン（Ｅ２１６）である。好適には、本発明の組成物は、メチルパラベン（Ｅ２１８）とプロピルパラベン（Ｅ２１６）との組合せを含む。
【0120】
抗微生物剤（たとえば各抗微生物剤）は、少なくとも０．２ｇ／Ｌ又は少なくとも０．４ｇ／Ｌの濃度で組成物中に存在しうる。一実施形態では、抗微生物は、少なくとも０．６ｇ／Ｌ又は少なくとも１．０ｇ／Ｌの濃度で組成物に存在する。好適には、抗微生物剤は、少なくとも１．５ｇ／Ｌ又は少なくとも２．０ｇ／Ｌの濃度で存在しうる。いくつかの実施形態では、抗微生物剤は、０．２ｇ／Ｌ～１．０ｇ／Ｌの濃度で存在する。他の実施形態では、抗微生物剤は、１．０ｇ／Ｌ～３．０ｇ／Ｌ（たとえば、１．５ｇ／Ｌ～２．５ｇ／Ｌ）の濃度で存在する。
【0121】
本発明の組成物は、懸濁安定性剤、たとえばグリシンを含みうる。懸濁安定性剤（たとえば２００ｍＭグリシン）は、少なくとも５ｇ／Ｌ又は少なくとも１０ｇ／Ｌの濃度で存在しうる。他の実施形態では、懸濁安定性剤（たとえば２００ｍＭグリシン）は、１０ｇ／Ｌ～２０ｇ／Ｌの濃度で存在する。
【0122】
代替的又は追加的に、本発明の組成物は、シメチコンなどの消泡剤を含みうる。前記消泡剤は、少なくとも５ｇ／Ｌ又は少なくとも１０ｇ／Ｌの濃度で存在しうる。一実施形態では、消泡剤は、５ｇ／Ｌ～２５ｇ／Ｌ（好適には１０ｇ／Ｌ～２０ｇ／Ｌ）で存在する。
【0123】
以上のほかに、本発明の組成物は、甘味剤及び／又は風味剤、たとえば、バニラエッセンス、シュガー（たとえば、グルコース、スクロースなど）、シュガーアルコール、ハチミツ、フルーツ、シロップ（たとえば、メープルシロップ、コメシロップ、カバシロップ、パインシロップ、ヒッコリーシロップ、ポプラシロップ、パームシロップ、シュガービートシロップ、ソルガムシロップ、コーンシロップ、サトウキビシロップ、ゴールデンシロップ、オオムギモルトシロップ）、モラセス（トリークル）、ゲンマイシロップ、アガベシロップ、ヤーコンシロップ、アセスルファムカリウム（Sunettとしても知られる）、アリテーム（aclameとしても知られる）、アスパルテーム（Equal又はNutrasweetとしても知られる）、アネトール、シクラメート、グリチルリチン、ラカンカ、ネオテーム、ペリラルチン、サッカリン（Sweet ’n’ Lowとしても知られる）、ステビオシド、スクラロース（SucraPlus及びSplendaとしても知られる）又はイヌリンを含みうる。一実施形態では、甘味剤としては、サッカリンナトリウム及びマンニトールが挙げられる。一実施形態では、風味剤としてはペパーミント油が挙げられる。
【0124】
甘味剤及び／又は風味剤は、０．１ｇ／Ｌ～４０ｇ／Ｌ、たとえば０．１ｇ／Ｌ～３０ｇ／Ｌの濃度で本発明の組成物中に存在しうる。
【0125】
本発明の組成物は、キサンタンガムなどの懸濁化剤を含みうる。前記懸濁化剤は、少なくとも１ｇ／Ｌ又は２ｇ／Ｌの濃度で存在しうる。好適には、前記懸濁化剤は、１ｇ／Ｌ～１０ｇ／Ｌ、たとえば３ｇ／Ｌ～５ｇ／Ｌの濃度で存在しうる。
【0126】
一実施形態では、本発明の組成物は、以下の表に従って製剤化しうる。
【0127】
【表2】
【0128】
任意選択的に、組成物は、以下をさらに含みうる。
【0129】
【表3】
【0130】
好ましい実施形態では、本発明の組成物は、以下の表に従って製剤化しうる。
【0131】
【表4】
【0132】
好ましい実施形態では、本発明の組成物は、任意選択的に、以下をさらに含みうる。
【0133】
【表5】
【0134】
以上に記載の製剤成分に加えて（又はその代わりに）、組成物は、活性抗体が最終的に腸（たとえば結腸）作用部位に送達されるように、胃の酸性環境から抗体を保護するための物理的及び／又は化学的な手段を含みうる。
【0135】
例として、抗体は、カプセル化しうる（たとえば、ペレット、顆粒状マトリックス、ビーズ、マイクロスフェア、ナノ粒子、又はリポソーム）、及び／又は化学的に保護しうる（たとえば、ＰＥＧ化により）。
【0136】
本発明で使用するのに好適な従来のカプセル化技術としては、以下のものが挙げられる。
【0137】
【表6】
【0138】
回腸末端部及び結腸（上行結腸を除く）のｐＨは、胃腸（ＧＩ）管のいずれの他の領域よりも高い。そのため、高ｐＨレベルで優先的には崩壊する製剤は、この領域への部位特異的送達に最適である。ｐＨ依存多微粒子状結腸特異的送達系を設計する最も単純な方法の１つは、腸溶性コーティング顆粒である。腸溶性コーティングは、上部ＧＩ管での薬剤放出を防止するために伝統的に使用されてきた。腸溶性コーティングポリマーは、結合剤及び顆粒用コーティング材料の両方で使用しうる。コーティング及び／又は錠剤マトリックスへのクエン酸の取込みは、酸の存在に起因してコア系の崩壊時間を延長させるので、ｉｎ ｖｉｔｒｏ放出及びｉｎ ｖｉｖｏ吸収を遅延させるのに役立つ。経口送達に供すべく最も一般的に使用されるｐＨ依存コーティングポリマーは、メタクリル酸コポリマーのEudragit L100及びEudragit S100であり、それぞれ、ｐＨ６．０及び７．０で溶解する。これらの２種のポリマーを各種比で組み合わせることにより、６．０～７．０のｐＨ範囲内で薬剤放出を操作することが可能である。これらのポリマーを含むカプセル剤は、ポリメタクリレートの溶液でさらにコーティングしうる。
【0139】
同様に、コーティング材料としての水性ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネートやｐＨ調整剤としてのクエン酸などの添加剤を添加しうる。グリセリルパルミトステアレートは、制御放出マトリックスを製剤化するために遅延材料として使用しうる。
【0140】
コーティング製剤（たとえば、Eudragit S100）は、キトサンＨＣｌ層でさらに覆いうる。水和させると、カプセルシェルは溶解し、キトサン層はゲル（内部ｐＨ４．５）を形成するので、上行結腸で溶解しないようにEudragitフィルムの周りに酸性環境を発生させる。上行結腸では、キトサンＨＣｌゲルは結腸微生物叢により分解され、それにより、Eudragitフィルムを結腸環境に暴露する。しかし、上行結腸は、７．０未満のｐＨを有して弱酸性であるので、フィルムコートは、依然としてインタクトな状態を維持する。しかしながら、ｐＨが７超の下行結腸に到着すると、Eudragitフィルムコートは溶解し、薬剤は制御下でマトリックスから放出される。多層コートは、たとえば、内側コート（Eudragit RL/RSの組合せ）及び外側コート（Eudragit FS 30D）に基づいて利用しうる。Eudragit FS 30Dは、メチルアクリレートとメチルメタクリレートとメタクリル酸とのイオン性コポリマーでｐＨ感受性であり、６．５超のｐＨで溶解する。
【0141】
結腸微生物叢のユニーク酵素能に依拠する微生物制御送達系も利用しうる。このタイプの送達系は、ＧＩ管に沿ったｐＨ変動に依存することなく、より特異的な標的化を可能にする。コンドロイチン硫酸、ペクチン、デキストラン、グアーガムなどの多くの天然多糖を利用しうる。ヒドロゲルビーズ（キトサン及びトリポリホスフェート（ＴＰＰ））を含む多微粒子状系は、１つの選択肢であり、ＴＰＰは、正荷電キトサンに対してカウンターイオンとして作用し、ゲルビーズを形成する。ＧＩ管の上部で分解を受けやすいタンパク質のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をビーズに担持し、キトサンとＴＰＰとの架橋によりキトサンの溶解度を低下させ、それにより、上部ＧＩ通過時、より少ないタンパク質（抗体）放出をもたらす。アミロースは、とくに良好なフィルム形成性ポリマーであり（ゲル化による）、Eudragit RS/RL 30D水性ディスパージョンとも混合しうる。同様に、２価カチオン（たとえば、カルシウム又は亜鉛）により剛性ゲルを形成するアミド化低メトキシペクチンは、結腸送達用カルシウムペクチネートゲルビーズを生成するために利用しうる。ペクチンは、カルシウム塩と組み合わせうる。この場合、カルシウムペクチネート（ペクチンの不溶性塩）は、胃酵素又は腸酵素により分解されないが、結腸ペクチン分解酵素による分解可能である。不溶性塩を形成するための可溶性多糖の架橋の代わりとして、多糖ベースの系は、ｐＨ感受性ポリマーでコーティングしうる。例として、キトサンマイクロコアを調製して、Eudragit L100やEudragit S100などのアクリル系ポリマーでそれぞれコーティングしうる。Eudragit P-4135Fは、結腸送達用マイクロ粒子の調製に利用しうる好適なｐＨ感受性ポリマーのさらなる例である。
【0142】
ｐＨ感受性送達と結腸環境での生分解とを組み合わせた多微粒子状系を利用しうる。例として、スプレードライなどの技術を用いてキトサンマイクロコアの内側封入マトリックを調製し、続いて、油中油型溶媒蒸発などの技術によりEudragitポリマー内にマイクロカプセル化されたキトサンマイクロコアを適用しうる。適切なｐＨで外側Eudragitコートを溶解させると、アルカリｐＨに暴露されたキトサンマイクロコアは、腫脹してゲル状バリアを形成し、結腸領域では、キトサンは、分解を受けて放出を促進する。類似の結腸送達多微粒子状系は、Eudragit L100又はS100でコーティングされたキトサンマイクロスフェアに基づきうる。好適な調製技術としては、エマルジョン溶媒蒸発が挙げられる。キトサンは、グルタルアルデヒドで架橋しうる。
【0143】
ポリアクリレートは、本発明で使用するのに好適な送達媒体のさらなる例である。例として、二官能性アゾ化合物で架橋されたスチレンとヒドロキシエチルメタクリレートとのターポリマーを利用しうる。系は、結腸内微生物叢によるアゾ結合の切断によりポリマーの分解をもたらすことに依存する。同様に、ｐＨ応答性ポリ（メタクリル系－ｇ－エチレングリコール）ヒドロゲルを経口送達媒体として利用しうる。小腸の塩基性及び中性の環境に入ると、ゲルは迅速に腫脹して解離する。
【0144】
他の一実施形態では、マイクロカプセル製剤は、経口結腸特異的送達に利用しうる。より詳細には、エチルアクリレート／メチルメタクリレート／２－ヒドロキシルエチルメタクリレート（ポリ（ＥＡ／ＭＭＥ／ＨＥＭＡ）の水性コロイドターポリマー、たとえば、乳化重合技術により合成されたものを利用しうる。これらのポリマーは、長い遅延時間及び後続の封入部分の迅速放出により特徴付けられる遅延放出プロファイルを呈する。
【0145】
他の一実施形態では、経口投与ナノ粒子は、好適な送達媒体として機能しうる。例として、担持ナノ粒子は、取り込まれたナノ粒子を所望の結腸作用部位に送達する働きをするｐＨ感受性マイクロスフェアに封入しうる。ナノ粒子は、生物学的表面との高い相互作用能の指標となる大きな比表面積を有する。そのため、バイオ接着は、さまざまな分子をナノ粒子に結合させることにより誘導可能である。例として、コムギグルテン由来のグリアジンタンパク質単離物からナノ粒子を調製し、次いで、レクチン（特異的バイオ接着を提供する非免疫源の糖タンパク質）をコンジュゲートさせうる。したがって、腸との高い非特異的相互作用能と、結腸粘膜に対してより大きな特異性を備えたレクチンの結合と、を有するナノ粒子が提供される。
【0146】
一実施形態では、アルブミン－キトサン混合マトリックスマイクロスフェア充填コーティングカプセル製剤に基づく送達媒体を利用しうる。これに関連して、本発明の抗体調製物は、硬質ゼラチンカプセルに充填され、腸溶性コーティングが施される。
【0147】
一実施形態では、経口送達系としてアルブミンマイクロスフェアを利用しうる。
【0148】
一実施形態では、スクアラン油含有マルチプルエマルジョンを利用しうる。
【0149】
一実施形態では、経口送達媒体としてポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）マイクロスフェアを利用しうる。
【0150】
一実施形態では、単層マトリックスフィルム中にｐＨ応答性腸ポリマー（Eudragit S）と生分解性多糖（レジスタントスターチ）との混合物を含む結腸送達コーティングを利用しうる。こうした送達媒体の例は、たとえば、Encap Drug Delivery (Livingston, UK)から市販されており、特定の実施形態としては、PHLORAL（商標）及びENCODE（商標）が挙げられる。
【0151】
以上の送達媒体の実施形態に加えて（又はその代わりに）、本発明の抗体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）によるＰＥＧ化により酸侵蝕から保護しうる。各種分子量（５００～４００００Ｄａ）のＰＥＧは、たとえば、２～２０ＰＥＧ分子／抗体分子の比でＩｇＧに結合させうる。Greenwald, R.B et al (2003) “Effective drug delivery by PEGylated drug conjugates”, Advanced Drug Delivery Reviews 55, pp.217-250を参照されたい。この刊行物は、その全体が参照により組み込まれる。
【0152】
一実施形態では、リポソーム、マイクロカプセル、ナノカプセル（たとえばキトサンナノカプセル）などの送達カプセルは、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）で化学修飾しうる。典型的ＰＥＧ化度は、０．１％～５％、たとえば、０．５％～２％の範囲内、たとえば、０．５％又は１％である。ＰＥＧの存在は、単独であるかキトサンにグラフトされるかにかかわらず、胃腸液中の送達カプセルの安定性を改善する。
【0153】
一実施形態では、本発明の抗体は、シアヌル酸クロリド、スクシンイミジルスクシネート、及びトレシルクロリドにより活性化されたモノメトキシポリ（エチレン）グリコールで処理しうる。
【0154】
ＰＥＧ化送達媒体、たとえば、リポソーム、マイクロカプセル、又はナノカプセルは、疾患部位に蓄積する固有の能力を有し、標的細胞のトランスフェクションを促進する。多くのウイルスベクターとは異なり、ＰＥＧ化リポソームは、非免疫原性であると一般に考えられる。
【0155】
一実施形態では、分岐状ＰＥＧ保護基が線状ＰＥＧ分子よりも有効であるため、分岐状ＰＥＧ化試薬が利用される。
【0156】
一態様では、本発明は、炎症性障害の治療に使用される本発明の抗体組成物を提供する。抗体組成物は、被験体に経口投与される。また、炎症性障害を治療するための医薬の製造における抗体組成物の関連使用、さらには本発明の抗体組成物を被験体に経口投与することを含む炎症性障害の治療方法も提供される。
【0157】
本明細書で用いられる「障害」という用語は、「疾患」も包含する。一実施形態では、障害は疾患である。
【0158】
本明細書で用いられる「被験体」という用語は、哺乳動物、たとえば、ヒト又は他の動物を意味する。好ましくは、「被験体」とは、ヒト被験体を意味する。
【0159】
胃腸通過時の抗体の保護手段は、本発明の抗体と逐次的に（たとえば個別の成分として）又は同時に経口投与しうる。投与が逐次的である場合、好ましくは、保護手段は、本発明の抗体の前に投与される。好ましい実施形態では、保護手段は、本発明の抗体と同時に投与される。
【0160】
本発明にかかる抗体組成物は、敗血症性ショック、胃腸障害（たとえば腸障害）、炎症性腸疾患、移植片対宿主障害から選択される炎症性障害、及び／又は腸感染、非ステロイド系抗炎症薬剤、ストレス、アルコール、腸手術、虚血及び再灌流、食物アレルギー、若しくはそれらの組合せにより引き起こされる／増悪する炎症性障害を治療するために使用しうる。
【0161】
好ましい実施形態では、炎症性障害は、潰瘍性結腸炎、クローン病、又はそれらの組合せから選択される炎症性腸疾患である。
【0162】
とくに好ましい実施形態では、炎症性障害は潰瘍性結腸炎であり、且つ抗体はヒツジ又はウマのポリクローナル抗体（より好ましくはヒツジポリクローナル抗体）である。
【0163】
炎症性腸疾患は、典型的には、頻繁な下痢などの症状を伴う。腸内への療法剤の保持が低減されるため、炎症性腸疾患の治療には高濃度の抗体が必要とされる。したがって、モノクローナル抗体療法は非実用的である（たとえば、モノクローナル抗体の製造にかかるコストが高いため）。有利なことに、本発明のポリクローナル抗体組成物は、炎症性腸疾患の治療の問題に対する解決策を提供する。前記ポリクローナル抗体組成物は、製造費用が比較的安いため、実用的な療法剤を提供する。
【0164】
好適な療法剤は、ヒトＴＮＦαに対する高い特異性を呈することが必要とされる。有利なことに、（たとえばヒツジ又はウマ）血液由来ポリクローナル抗体は（製造方法に起因して）、非血液由来（及び／又は、たとえば非ヒツジ又は非ウマ）抗体及び／又はモノクローナル抗体と比較して、ヒトＴＮＦαに対する高い特異性を呈する。さらに、定義によれば、モノクローナル抗体を含む組成物は、単一エピトープに結合するにすぎないが、ポリクローナル抗体を含む組成物は、いくつかに結合することによりヒトＴＮＦαを中和する有効性を増加させるであろう。
【0165】
本明細書で用いられる「治療」という用語は、予防治療（たとえば、疾患の発症の予防）さらには矯正治療（すでに疾患に罹患している被験体の治療）を包含する。好ましくは、本明細書で用いられる「治療」とは、矯正治療を意味する。
【0166】
本明細書で用いられる「治療」という用語は、障害及び／又はその症状を対象とする。
【0167】
したがって、本発明の組成物は、治療有効量又は予防有効量で被験体に投与しうる。
【0168】
「治療有効量」とは、炎症性障害（又はその症状）を治療すべく単独又は組合せで被験体に投与した場合に障害又はその症状のかかる治療を行うのに十分な任意の抗体量のことである。
【0169】
「予防有効量」とは、単独又は組合せで被験体に投与した場合に炎症性障害（又はその症状）の発症又は再発を阻害又は遅延する任意の抗体量のことである。いくつかの実施形態では、予防有効量は、炎症性障害の発症又は再発を完全に予防する。発症の「阻害」とは、炎症性障害（又はその症状）の発症の尤度を低減するか又は発症を完全に予防するかのいずれかを意味する。
【0170】
適切な投与量範囲とは、所望の治療効果を生じる投与量範囲のことである（たとえば、抗体／組成物が治療有効量又は予防有効量で投与される場合）。典型的投与レジメンは、本発明の組成物を週１回、２回、３回、４回、５回、６回、又は７回投与することを含みうる。一実施形態では、投与レジメンは、本発明の組成物を毎日、たとえば、１日１回又は２回投与することを含む。
【0171】
一実施形態では、本発明の組成物は、治療の最初の４週間は１日２回被験体に投与される。いくつかの実施形態では、後続治療では、組成物が１日１回投与される。
【0172】
適切な１用量は、ポリクローナル抗体２ｇ以下（たとえば１ｇ以下）でありうる。一実施形態では、１用量は、ポリクローナル抗体０．５ｇ以下又は０．２５ｇ以下である。
【0173】
一実施形態では、インタクトなポリクローナル抗体は、１日２ｇ以下の用量で投与される。他の一実施形態では、用量は、１日１ｇ以下（たとえば、１日０．５ｇ又は０．２５ｇ以下）である。
【0174】
好適には、以上の用量は、本発明の組成物に含まれるインタクトなポリクローナル抗体の全量、好適には、インタクトな全ポリクローナルＩｇＧ（すなわち、ＴＮＦαに結合する抗体及びＴＮＦαに結合しない抗体を含む）を意味する。インタクトなポリクローナル抗体は、血液サンプル（たとえば抗血清）又はその精製画分から直接得られうる。好ましくは、インタクトなポリクローナル抗体は、抗血清などの血液サンプル（たとえばヒツジ血液サンプル）から精製されたものである。たとえば、サンプルは、沈殿（たとえば硫酸ナトリウム沈殿）及び濾過に付されたものである。好適には、組成物に含まれるインタクトな全ポリクローナル抗体の少なくとも５％（たとえば少なくとも１０％）は、ＴＮＦαに結合する。より好ましくは、組成物に含まれるインタクトな全ポリクローナル抗体の少なくとも１５％又は少なくとも２０％（たとえば、少なくとも２５％又は少なくとも３０％）は、ＴＮＦαに結合する。
【0175】
かかる低用量のインタクトな全血液由来ポリクローナル抗体で治療／予防効果が観測されることは、驚くべきことであり、乳などの非血液由来源と比較して高濃度の特異的抗体（すなわち、ＴＮＦαに結合するもの）が産生されることを実証する。かかる低用量のインタクトな全ヒツジ又はウマ（好ましくはヒツジ）ポリクローナル抗体で治療／予防効果が観測されることは、さらに驚くべきことであり、ヒツジ又はウマ（好ましくはヒツジ）宿主を用いて高濃度の特異的抗体（すなわち、ＴＮＦαに結合するもの）が産生されることを実証する。
【0176】
一実施形態では、典型的一日投与量は、インタクトなポリクローナル抗体５～２０ｍｇ（たとえば８～１５ｍｇ又は約１０ｍｇ）／ｋｇ体重の範囲内である。単位投与量は、１００ｍｇ未満からさまざまでありうるが、典型的には２５０～５００ｍｇ／用量の範囲内である。前記用量は毎日投与しうる（たとえば、１回、２回、３回、又は４回／日）。
【0177】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体組成物は、１種以上のさらなる療法剤との組合せで被験体に投与しうる。前記１種以上のさらなる療法剤は、本発明の抗体組成物と逐次的又は同時に投与しうる。
【0178】
一実施形態では、抗体組成物は、炎症性障害（たとえば、本明細書で参照される炎症性障害）を治療する療法剤との組合せで投与される。好適には、抗体組成物は、炎症性腸障害（たとえば炎症性腸疾患）を治療する療法剤との組合せで投与しうる。
【0179】
一実施形態では、療法剤は、アミノサリチレート（５－ＡＳＡ）、コルチコステロイド、免疫モジュレーター、抗生物質、又は生物学的療法剤（たとえば治療用抗体）でありうる。
【0180】
好適な療法剤の例は、プレドニゾン、リン酸プレドニゾロンナトリウム、ブデソニド、メサラミン、スルファサラジン、コルチコトロピン、アザチオプリン、インフリキシマブ、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、コハク酸メチルプレドニゾロンナトリウム、メルカプトプリン、デキサメタゾン、リン酸デキサメタゾンナトリウム、酢酸ベタメタゾン、リン酸ベタメタゾンナトリウム、シクロスポリン、クロモリン、ミコフェノール酸モフェチル、コハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム、酢酸ヒドロコルチゾン、トリアムシノロンアセトニド、コルチゾン、酢酸メチルプレドニゾロン、若しくはそれらの組合せ、又はそれらの薬学的に許容可能な塩が挙げられうる。
【0181】
一実施形態では、抗体組成物は、１種以上のプロバイオティックと共に投与しうる。本明細書で用いられる「プロバイオティック」という用語は、たとえば、十分な数で摂取又は局所適用された場合に宿主生物に有益な影響を及ぼす（すなわち、宿主生物に１つ以上の実証可能な健康上の有益性を付与することにより）任意の生存微生物（たとえば細菌又は酵母を含む）を意味する。プロバイオティックは、１つ以上の粘膜表面の微生物バランスを改善しうる。たとえば、粘膜表面は胃腸管（たとえば腸）でありうる。
【0182】
本発明はまた、本発明の抗体組成物とその使用説明書とを含むキットを提供する。説明書は、医療における抗体組成物の使用、好適には、炎症性障害の治療における抗体組成物の使用を対象とする。一実施形態では、説明書は、被験体への抗体組成物の経口投与について記載する。説明書は、代替的又は追加的に、適切な投与レジメン、たとえば、本明細書に記載の任意の投与レジメンについて記載する。
【0183】
一実施形態では、キットは、本発明の抗体を含む第１の容器と、胃腸通過時の前記抗体の保護手段を含む第２の容器と、説明書と、を含む。好ましくは、説明書は、抗体を製剤化する方法と、本発明の組成物を得る手段と、について記載する。
【0184】
一実施形態では、キットは、本明細書に記載の１種以上のさらなる療法剤を含む。
【0185】
他の態様では、本発明は、本発明の抗体組成物を含む食材に関する。食材は、抗体組成物に含まれる抗体が機能性を維持するか又は実質的濃度の前記抗体がヒトＴＮＦαへの結合能及びその中和能を維持する任意の食材でありうる。これに関連して用いられる「実質的濃度」という用語は、出発抗体の少なくとも９０％、たとえば、少なくとも９５％又は９８％がヒトＴＮＦαへの結合能及びその中和能を維持することを意味する。
【0186】
食材は酪農産物でありうる。一実施形態では、酪農産物は、ヨーグルト、チーズ、又はミルクから選択される。
【0187】
食材は、プロバイオティックと任意選択的に１種以上のプレバイオティックとを含みうる。本明細書で用いられる「プレバイオティック」という用語は、１種以上の有益細菌の成長及び／又は活性を選択的に刺激することにより宿主に有益な影響を及ぼす非消化性食品成分を意味する。
【0188】
配列比較
配列比較では、典型的には、１つの配列は、試験配列と比較しうる参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列をコンピューターに入力し、続いて所要により座標を指定し、そして配列アルゴリズムのプログラムパラメーターを指定する。次いで、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、配列比較アルゴリズムにより参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。
配列比較では、典型的には、１つの配列は、試験配列と比較しうる参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列をコンピューターに入力し、続いて所要により座標を指定し、そして配列アルゴリズムのプログラムパラメーターを指定する。次いで、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、配列比較アルゴリズムにより参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。
【0189】
比較に最適な配列アライメントは、たとえば、Smith and Waterman [Adv. Appl. Math. 2: 484 (1981)]の局所相同性アライメントアルゴリズムにより、Needleman & Wunsch [J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)]のアルゴリズムにより、Pearson & Lipman [Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988)]の類似性検索法により、これらのアルゴリズムのコンピューター実装（GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA - Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705）により、又は目視検査［Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausbel et al, eds, Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, In. And John Wiley & Sons, Inc. (1995 Supplement) Ausbubelを参照されたい］により行いうる。
【0190】
パーセント配列類似性の決定に好適なアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズム［Altschul (1990) J. Mol. Biol. 215: pp. 403-410、及びNational Center for Biotechnology Information の“http://www.ncbi.nlm.nih.gov/”を参照されたい］である。
【0191】
一相同性比較では、同一性は、少なくとも１０又は２０又は３０又は４０又は５０アミノ酸残基長の配列領域にわたり存在する。他の一相同性比較では、同一性は、少なくとも６０又は７０又は８０又は９０又は１００アミノ酸残基長の配列領域にわたり存在する。
【0192】
限定されるものではないが、グローバル法、ローカル法、及びハイブリッド法、たとえば、セグメントアプローチ法を含めて、さまざまな配列アライメント法のいずれかを用いて同一性パーセントを決定可能である。同一性パーセントの決定プロトコルは、当業者の範囲内のルーチン手順である。グローバル法では、分子の最初から最後まで配列をアライメントし、そして個別残基対のスコアを加算するとともにギャップペナルティーを課すことにより最良のアライメントを決定する。限定されるものではないが、方法としては、たとえば、CLUSTAL W（たとえば、Julie D. Thompson et al., CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position- Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice, 22(22) Nucleic Acids Research 4673-4680 (1994)を参照されたい）、及び繰返しリファインメント（たとえば、Osamu Gotoh, Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein. Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments, 264(4) J. MoI. Biol. 823-838 (1996)を参照されたい）が挙げられる。ローカル法では、入力配列のすべてが共有する１つ以上の保存モチーフを同定することにより配列をアライメントする。限定されるものではないが、方法としては、たとえば、Match-box（たとえば、Eric Depiereux and Ernest Feytmans, Match-Box: A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences, 8(5) CABIOS 501 -509 (1992)を参照されたい）、Gibbsサンプリング（たとえば、C. E. Lawrence et al., Detecting Subtle Sequence Signals: A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment, 262(5131 ) Science 208-214 (1993)を参照されたい）、Align-M（たとえば、Ivo Van WaIIe et al., Align-M - A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences, 20(9) Bioinformatics:1428-1435 (2004)を参照されたい）が挙げられる。
【0193】
そのため、パーセント配列同一性は従来の方法により決定される。たとえば、Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48: 603-16, 1986 and Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-19, 1992を参照されたい。簡潔に述べると、ギャップオープニングペナルティー１０、ギャップエクステンションペナルティー１、及び以下に示されるHenikoff and Henikoff (ibid.)の「ｂｌｏｓｕｍ６２」スコアリング行列（アミノ酸は標準的１文字コードにより示される）を用いてアライメントスコアを最適化するように、２つのアミノ酸配列をアライメントする。
【化1】
【0194】
次いで、同一性パーセントを次のように計算する。
【数1】
【0195】
実質的に相同なポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、又は付加を有するものとして特徴付けられる。これらの変化は、好ましくは、副次的性質、すなわち、保存的アミノ酸置換（以下を参照されたい）及びポリペプチドのフォールディング又は活性に有意な影響を及ぼさない他の置換、小さな欠失、典型的には１～約３０アミノ酸の欠失、並びに小さなアミノ末端伸長又はカルボキシル末端伸長、たとえば、アミノ末端メチオニン残基、約２０～２５残基の小さなリンカーペプチド、又はアフィニティータグである。
【0196】
保存的アミノ酸置換としては、以下のものが挙げられうる。
【0197】
【表7】
【0198】
２０種の標準アミノ酸のほか、非標準アミノ酸（たとえば、４－ヒドロキシプロリン、６－Ｎ－メチルリシン、２－アミノイソ酪酸、イソバリン、及びα－メチルセリン）で本発明のポリペプチドのアミノ酸残基を置換しうる。限られた数の非保存的アミノ酸、遺伝暗号によりコードされないアミノ酸、及び非天然アミノ酸でポリペプチドのアミノ酸残基を置換しうる。本発明のポリペプチドはまた、天然に存在しないアミノ酸残基も含みうる。
【0199】
天然に存在しないアミノ酸としては、限定されるものではないが、ｔｒａｎｓ－３－メチルプロリン、２，４－メタノ－プロリン、ｃｉｓ－４－ヒドロキシプロリン、ｔｒａｎｓ－４－ヒドロキシプロリン、Ｎ－メチルグリシン、ａｌｌｏ－トレオニン、メチル－トレオニン、ヒドロキシ－エチルシステイン、ヒドロキシエチルホモ－システイン、ニトロ－グルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、ｔｅｒｔ－ロイシン、ノルバリン、２－アザフェニルアラニン、３－アザフェニル－アラニン、４－アザフェニル－アラニン、及び４－フルオロフェニルアラニンが挙げられる。天然に存在しないアミノ酸残基をタンパク質に組み込むいくつかの方法は、当技術分野で公知である。たとえば、化学的アミノアシル化サプレッサーｔＲＮＡを用いてナンセンス突然変異を抑制するｉｎ ｖｉｔｒｏ系を利用可能である。アミノ酸の合成法及びｔＲＮＡのアミノアシル化法は、当技術分野で公知である。ナンセンス突然変異を含有するプラスミドの転写及び翻訳は、Ｅ．コリ（E. coli）Ｓ３０抽出物及び市販の酵素及び他の試薬を含む細胞フリーの系で行われる。タンパク質はクロマトグラフィーにより精製される。たとえば、Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113:2722, 1991、Ellman et al., Methods Enzymol. 202:301, 1991、Chung et al., Science 259:806-9, 1993、及びChung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10145-9, 1993)を参照されたい。第２の方法では、翻訳は、突然変異ｍＲＮＡ及び化学的アミノアシル化サプレッサーｔＲＮＡのマイクロインジェクションによりツメガエル卵母細胞で行われる（Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271:19991-8, 1996）。第３の方法内では、置き換えられる天然アミノ酸（たとえば、フェニルアラニン）の不在下且つ所望の天然に存在しないアミノ酸（たとえば、２－アザフェニルアラニン、３－アザフェニルアラニン、４－アザフェニルアラニン、又は４－フルオロフェニルアラニン）の存在下で、Ｅ．コリ（E. coli）細胞が培養される。天然に存在しないアミノ酸は、その対応する天然アミノ酸の代わりのポリペプチドに取り込まれる。Koide et al., Biochem. 33:7470-6, 1994を参照されたい。天然に存在するアミノ酸残基は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ化学修飾により天然に存在しない種に変換可能である。置換の範囲をさらに拡大するために、化学修飾と部位指向突然変異誘発とを組み合わせることが可能である（Wynn and Richards, Protein Sci. 2:395-403, 1993）。
【0200】
限られた数の非保存的アミノ酸、遺伝暗号によりコードされないアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸、及び非天然アミノ酸で本発明のポリペプチドのアミノ酸残基を置換しうる。
【0201】
本発明のポリペプチド中の不可欠なアミノ酸は、当技術分野で公知の手順、たとえば、部位指向突然変異誘発又はアラニンスキャニング突然変異誘発に従って同定可能である（Cunningham and Wells, Science 244: 1081-5, 1989）。また、推定接触部位アミノ酸の突然変異と組み合わせて、核磁気共鳴、結晶解析、電子回折、光親和性標識などの技術により決定されるように、生物学的相互作用部位は、構造の物理分析により決定可能である。たとえば、de Vos et al., Science 255:306-12, 1992、Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899-904, 1992、Wlodaver et al., FEBS Lett. 309:59-64, 1992を参照されたい。また、不可欠なアミノ酸の同一性は、本発明のポリペプチドの関連成分（たとえば、転座又はプロテアーゼの成分）との相同性分析から推測可能である。
【0202】
Reidhaar-Olson and Sauer (Science 241:53-7, 1988)又はBowie and Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-6, 1989)により開示されたような突然変異誘発及びスクリーニングの公知の方法を用いて、複数のアミノ酸置換を行って試験することが可能である。簡潔に述べると、これら著者らは、ポリペプチドの２つ以上の位置を同時にランダム化し、機能性ポリペプチドを選択し、次いで、突然変異ポリペプチドをシーケンスすることにより、各位置で許容可能な一群の置換を決定する方法を開示している。使用可能な他の方法としては、ファージディスプレイ（たとえば、Lowman et al., Biochem. 30:10832-7, 1991、Ladnerらの米国特許第５，２２３，４０９号、HuseのＷＩＰＯ国際公開第９２／０６２０４号）及び領域指向突然変異誘発（Derbyshire et al., Gene 46:145, 1986、Ner et al., DNA 7:127, 1988）が挙げられる。
【0203】
Reidhaar-Olson and Sauer (Science 241:53-7, 1988)又はBowie and Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-6, 1989)により開示されたような突然変異誘発及びスクリーニングの公知の方法を用いて、複数のアミノ酸置換を行って試験することが可能である。簡潔に述べると、これら著者らは、ポリペプチドの２つ以上の位置を同時にランダム化し、機能性ポリペプチドを選択し、次いで、突然変異ポリペプチドをシーケンスすることにより、各位置で許容可能な一群の置換を決定する方法を開示している。使用可能な他の方法としては、ファージディスプレイ（たとえば、Lowman et al., Biochem. 30:10832-7, 1991、Ladnerらの米国特許第５，２２３，４０９号、HuseのＷＩＰＯ国際公開第９２／０６２０４号）及び領域指向突然変異誘発（Derbyshire et al., Gene 46:145, 1986、Ner et al., DNA 7:127, 1988）が挙げられる。
【0204】
とくに定義がない限り、本明細書で用いられる科学技術用語はすべて、本開示が属する技術分野の当業者により一般に理解されているものと同一の意味を有する。Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 20 ED., John Wiley and Sons, New York (1994)、及びHale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991)は、本開示で用いられる用語の多くを含む一般的辞書を当業者に提供する。
【0205】
本開示は、本明細書に開示された例示的な方法及び材料により限定されるものではなく、本明細書で説明されたものと類似の又は等価な方法及び材料はいずれも、本開示の実施形態の実施又は試験に使用可能である。数値の範囲は、範囲を規定する数を包含する。とくに指定がない限り、核酸配列はいずれも、５’から３’の方向に左から右に記載され、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシの方向に左から右に、それぞれ記載されている。本明細書に提供される見出しは、本開示の各種態様や実施形態を限定するものではない。アミノ酸は、本明細書では、アミノ酸の名称、三文字略号、又は一文字略号を用いて参照される。「タンパク質」という用語は、本明細書で用いられる場合、タンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを含む。本明細書で用いられる場合、「アミノ酸配列」という用語は、「ポリペプチド」という用語及び／又は「タンパク質」という用語と同義である。いくつかの場合、「アミノ酸配列」という用語は、「ペプチド」という用語と同義である。いくつかの場合、「アミノ酸配列」という用語は、「酵素」という用語と同義である。「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は、本明細書では同義的に用いられる。本開示及び特許請求の範囲では、アミノ酸残基に対して従来の一文字コード及び三文字コードを使用しうる。アミノ酸の三文字コードは、IUPACIUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature（ＪＣＢＮ）に準拠して定義される。また、ポリペプチドは、遺伝暗号の縮重に基づいて２種以上のヌクレオチド配列によりコード可能であると理解される。
【0206】
用語の他の定義が、本明細書全体にわたり現れることもありうる。本開示は、記載の特定の実施形態に限定されるものではなく、したがって、変更を加えうることを理解すべきである。また、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ規定されるので、本明細書で用いられる用語は特定の実施形態を説明することだけを目的としたものにすぎず、限定することを意図したものではないことも理解すべきである。
【0207】
値の範囲が提供された場合、その範囲の上限と下限との間の各介在値もまた、文脈上明らかに異なる記載がない限り下限の１／１０単位まで、特定的に開示されたものと理解される。指定範囲内の任意の指定値又は介在値と、その指定範囲内の任意の他の指定値又は介在値と、の間の各より小さい範囲は、本開示に包含される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立して、その範囲内に包含可能又は除外可能であり、皆無、又は両方の限界値がより小さい範囲内に包含された各範囲もまた、指定範囲内の任意の特定的に除外された限界値に従って、本開示に包含される。指定範囲が一方又は両方の限界を含む場合、それらの含まれる一方又は両方の限界を除外した範囲もまた、本開示に含まれる。本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いられる場合、文脈上明らかに異なる場合を除いて、単数形の「a」、「an」、及び「the」には、複数形の参照語が包含されることに留意しなければならない。したがって、たとえば、「抗体（an antibody）」の参照対象は、複数のそのような候補物を包含し、「抗体（the antibody）」の参照対象は、１つ以上の抗体及び当業者に公知のその等価物の参照対象を包含し、他の場合も同様である。本明細書で考察される刊行物は、単に本出願の出願日前に開示されたものとして提供されているにすぎない。本明細書の記載内容は、そのような出版物が、本明細書に添付されている特許請求の範囲に対して先行技術を構成することを容認するとみなされるべきものではない。
【0208】
次に、以下の図面及び実施例を参照して、単なる例として、本発明を説明する。
【実施例】
【0209】
実施例１
ヒトＴＮＦαに対するヒツジ抗血清の調製
成熟ヒトＴＮＦα（ｈＴＮＦα）（UniProtKBアクセッション番号：P01375）をR&D Systems, Boehringerから入手した。アミノ酸配列は配列番号１として示される。
ヒトＴＮＦαに対するヒツジ抗血清の調製
成熟ヒトＴＮＦα（ｈＴＮＦα）（UniProtKBアクセッション番号：P01375）をR&D Systems, Boehringerから入手した。アミノ酸配列は配列番号１として示される。
【0210】
メリノ去勢ヒツジの一次免疫用免疫原は、フロイント完全アジュバント及び１００μｇのｈＴＮＦα／ヒツジを含んでいた。腋窩、鼠径部、及び前肩甲骨のドレナージリンパ腺に近接して選択された６つの注射部位に等しくタンパク質：アジュバント混合物を皮下注射した。動物保護のための厳しい州及び国の倫理ガイドラインに準拠して、Turretfield Research Centre (Rosedale, South Australia, Australia)の処理施設で、１００μｇのｈＴＮＦα及びフロイント不完全アジュバントを用いて２８日間のインターバルで各ヒツジを再免疫し、そして１４日後に約４週間のインターバルで血液サンプルを採取した。最終的に動物に出血はなかった。動物に損傷を与えることなく外頸静脈から合計１０ｍＬの血液／ｋｇ体重を採取可能である。続いて、ヒツジ抗血清を－２０℃で貯蔵した。
【0211】
実施例２
ヒトＴＮＦαに対するポリクローナルヒツジ抗体の精製（インタクトな抗ＴＮＦα）
ヒツジＰｃＡｂを精製する２つの異なる方法を用いて、どちらの方法がより多くヒトトリプシンの効率的阻害剤α１－抗トリプシンを共単離するかを決定した。アルブミンを沈殿させＩｇＧを溶液中に維持するカプリル酸沈殿又はＩｇＧを沈殿させる硫酸ナトリウム沈殿のいずれかを用いた。精製されたＩｇＧを濾過し、経口投与又はさらなる特徴付けのために提案された製剤に組み込める状態で－２０℃で貯蔵した。
ヒトＴＮＦαに対するポリクローナルヒツジ抗体の精製（インタクトな抗ＴＮＦα）
ヒツジＰｃＡｂを精製する２つの異なる方法を用いて、どちらの方法がより多くヒトトリプシンの効率的阻害剤α１－抗トリプシンを共単離するかを決定した。アルブミンを沈殿させＩｇＧを溶液中に維持するカプリル酸沈殿又はＩｇＧを沈殿させる硫酸ナトリウム沈殿のいずれかを用いた。精製されたＩｇＧを濾過し、経口投与又はさらなる特徴付けのために提案された製剤に組み込める状態で－２０℃で貯蔵した。
【0212】
抗血清中及びカプリル酸又は硫酸ナトリウムのいずれかを用いて精製された２つのＩｇＧ画分中のプロテアーゼ阻害剤の存在は、比色アッセイによりトリプシン及びキモトリプシンに対してアッセイした。アッセイは、Kakade ML et al. Determination of trypsin inhibitor activity of soy products: a collaborative analysis of an improved procedure. Cereal Chem 51: 376-381, 1974（参照により本明細書に組み込まれる）の方法に基づくものであり、トリプシンによるＮａ－ベンゾイル－ＤＬ－アルギニン－ｐ－ニトロアニリド溶液（Ｌ－ＢＡＰＮＡ）（無色）からｐ－ニトロアニリン（黄色基質）への切断を測定した。
【0213】
阻害剤サンプルの二倍希釈液は、９６ウェルプレート（Grenier UV-Star）全体にわたり２０ｍＭ ＣａＣｌ２（最終体積１００μｌ）を含有する５０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ８．２で希釈した。各ウェルに１００μｌのトリプシン（１ｍＭ ＨＣＬで０．２ｍｇ／ｍｌに希釈した）溶液又はキモトリプシン（ＷＦＩ中１ｍｇ／ｍｌ）溶液を添加し、続いて、トリプシン又はキモトリプシンに対して、それぞれ、１００μｌのＬ－ＢＡＰＮＡ又はＮＳＬＰＮ（ＤＭＳＯ中２ｍＭ）のいずれかを添加した。トリプシンアッセイでは５分後及びキモトリプシンアッセイでは６０分後に５０μｌの停止液（３０％ｖ／ｖ酢酸）を添加して反応を終了し、そしてOmega PolarStarを用いて分光測光法で４１０ｎｍの測定吸光度を測定した。基質溶液の前に停止液を添加することによりブランクサンプルを調製した。次いで、平均吸光度値を希釈度に対してプロットし、用量応答曲線を得た。代表的な曲線は図１に示される。この図から、硫酸ナトリウム精製がカプリル酸沈殿手順よりもかなり良好にα１－抗トリプシン阻害剤を維持することが実証される。
【0214】
また、これらの２つの方法を用いて、シミュレートされた胃液及び腸液におけるインキュベーション後の経口製剤中のプロテアーゼ阻害剤の残存を評価することが可能である。
【0215】
実施例３
抗体結合を特徴付けるための酵素結合免疫吸着アッセイ
産生された特異的抗体は、組換えヒトＴＮＦα（ｒｈＴＮＦα）の表面上の複数のエピトープに結合したが、組換え齧歯動物ＴＮＦαには結合しなかった。結合の結合活性はきわめて高かった。
抗体結合を特徴付けるための酵素結合免疫吸着アッセイ
産生された特異的抗体は、組換えヒトＴＮＦα（ｒｈＴＮＦα）の表面上の複数のエピトープに結合したが、組換え齧歯動物ＴＮＦαには結合しなかった。結合の結合活性はきわめて高かった。
【0216】
ヒツジ抗血清中及びこの抗血清に由来するＩｇＧの精製画分（カプリル酸沈殿により精製した）（インタクトな抗ＴＮＦα）中の抗ＴＮＦαＩｇＧの検出のために、直接ＥＬＩＳＡアッセイを開発した。Immulon 4HBxマイクロタイタープレートを１μｇ／ｍＬのｈＴＮＦαでコーティングした。０．１％Tween 20（ＰＢＳＴ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を３回交換してプレートを洗浄し、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳで希釈された２．５％ウシ胎仔血清）を用いて３７℃で１時間ブロックした。プレートを洗浄し、１：１０００の初期希釈度及び続いて１：２の段階希釈度を用いて抗血清と共に３７℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで洗浄し、そしてロバ抗ヒツジＩｇＧホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートと共に３７℃で１時間インキュベートした。さらなる洗浄の後、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）液体基質溶液を添加し、約１０分後に１．０Ｍ ＨＣＬの添加により反応を停止し、その後、４５０ｎｍで光学濃度を読み取った。
【0217】
免疫前ヒツジ血清を用いて試験した発色アッセイは、非常に低いバックグラウンドを示した（図２）。
【0218】
実施例４
抗体中和を特徴付けるための免疫細胞傷害性アッセイ
Ｌ９２９マウス線維肉腫細胞系（Sigma-Aldrich, The Old Brickyard, New Road, Gillingham, Dorset, SP8 4XT, UKから市販されている）を用いて、ＴＮＦαの細胞傷害作用さらにはＴＮＦαに対する抗体の中和能力を試験した。したがって、抗血清中のヒツジＰｃＡｂによる及び抗血清から精製されたＩｇＧ（インタクトな抗ＴＮＦα）による及びその断片（抗ＴＮＦα断片）によるｒｈＴＮＦαの細胞傷害作用の中和を試験するために、アッセイを開発した。
抗体中和を特徴付けるための免疫細胞傷害性アッセイ
Ｌ９２９マウス線維肉腫細胞系（Sigma-Aldrich, The Old Brickyard, New Road, Gillingham, Dorset, SP8 4XT, UKから市販されている）を用いて、ＴＮＦαの細胞傷害作用さらにはＴＮＦαに対する抗体の中和能力を試験した。したがって、抗血清中のヒツジＰｃＡｂによる及び抗血清から精製されたＩｇＧ（インタクトな抗ＴＮＦα）による及びその断片（抗ＴＮＦα断片）によるｒｈＴＮＦαの細胞傷害作用の中和を試験するために、アッセイを開発した。
【0219】
実施例１のヒツジ抗血清のストックの一部分をパパイン消化に付すことにより、抗ＴＮＦα断片を調製した。Ｆａｂは、１０ｇ／Ｌの濃度で存在し、全Ｆａｂの約１０％は、ＴＮＦαに特異的であった。その製造にアフィニティークロマトグラフィー工程を含めなかった。過剰のＦａｂの存在下で、約１２分子のＦａｂは、各ＴＮＦαトリマーに装着された状態になる。
【0220】
チャレンジ用量として、我々は、細胞傷害性アッセイから決定された１３ｎｇ／ｍｌのＩＣ９０ ｈＴＮＦα濃度を使用した（データは示されていない）。簡潔に述べると、ＤＭＥＭ中に必要チャレンジ用量の２倍を含有するＬ９２９細胞を、等体積の各種希釈度のｈＴＮＦα抗血清又は抗ＴＮＦα断片又はインタクトな抗ＴＮＦαと共に、２４時間共インキュベートした。陽性対照（最大死滅）として、２．５μｇ／ｍｌ ｈＴＮＦαを使用した。ニュートラルレッドによる細胞染色に基づく比色アッセイにより、抗体毒素中和力価を推定した。
【0221】
ニュートラルレッドによる細胞染色に基づく比色アッセイにより、抗体毒素中和力価を推定した（代表的な曲線は図３に示される）。
【0222】
特異的抗体濃度は、以下のように計算した。
特異的Ａｂ濃度［ｇ／Ｌ］＝［ＣＣＤ（μｇ／Ｌ）×ＬＣ５０（μｇ／Ｌ）］×［ＭＷ Ａｂ／（ＭＷ Ａｇ×ＢＳ）］×ＥＣ５０×１０－６
・ ＣＣＤ（μｇ／Ｌ）－チャレンジ用量＝１３μｇ／Ｌ（Ｌ９２９細胞に及ぼすＴＮＦα細胞傷害性から決定されたＬＣ９０）
・ ＬＣ５０（μｇ／Ｌ）＝０．３μｇ／Ｌ（Ｌ９２９細胞に及ぼすＴＮＦα細胞傷害性から決定された）
・ ＢＳ結合部位＝全ＩｇＧに対して２
・ ＭＷ Ａｂ＝１６００００Ｄａ
・ ＭＷ Ａｇ（ＴＮＦα）＝５１０００Ｄａ
特異的Ａｂ濃度［ｇ／Ｌ］＝［ＣＣＤ（μｇ／Ｌ）×ＬＣ５０（μｇ／Ｌ）］×［ＭＷ Ａｂ／（ＭＷ Ａｇ×ＢＳ）］×ＥＣ５０×１０－６
・ ＣＣＤ（μｇ／Ｌ）－チャレンジ用量＝１３μｇ／Ｌ（Ｌ９２９細胞に及ぼすＴＮＦα細胞傷害性から決定されたＬＣ９０）
・ ＬＣ５０（μｇ／Ｌ）＝０．３μｇ／Ｌ（Ｌ９２９細胞に及ぼすＴＮＦα細胞傷害性から決定された）
・ ＢＳ結合部位＝全ＩｇＧに対して２
・ ＭＷ Ａｂ＝１６００００Ｄａ
・ ＭＷ Ａｇ（ＴＮＦα）＝５１０００Ｄａ
【0223】
以上を考慮に入れて、抗血清中の特異的ＰｃＡｂ濃度は、２．９ｇ／Ｌと計算された。
【0224】
実施例５
インタクトな抗ＴＮＦαの製剤
本発明のＰｃＡｂ（インタクトな抗ＴＮＦα）を消化から保護するためのプロテアーゼ阻害剤の選択さらには胃液中及び腸液中の阻害剤の残存は、Kakade ML et al. Determination of trypsin inhibitor activity of soy products: a collaborative analysis of an improved procedure. Cereal Chem 51: 376-381, 1974の方法に基づいて、比色アッセイを用いて、トリプシン及びキモトリプシンに対して評価した。トリプシンアッセイは、以上に記載した通りである。キモトリプシンアッセイは、黄色を生じる無色ＮＳＬＰＮ基質を利用した。
インタクトな抗ＴＮＦαの製剤
本発明のＰｃＡｂ（インタクトな抗ＴＮＦα）を消化から保護するためのプロテアーゼ阻害剤の選択さらには胃液中及び腸液中の阻害剤の残存は、Kakade ML et al. Determination of trypsin inhibitor activity of soy products: a collaborative analysis of an improved procedure. Cereal Chem 51: 376-381, 1974の方法に基づいて、比色アッセイを用いて、トリプシン及びキモトリプシンに対して評価した。トリプシンアッセイは、以上に記載した通りである。キモトリプシンアッセイは、黄色を生じる無色ＮＳＬＰＮ基質を利用した。
【0225】
表１の２種の制酸剤、水酸化マグネシウム、及び水酸化アルミニウムゲルを添加して低い胃ｐＨを中和することにより、胃の中でペプシンがインタクトな抗ＴＮＦαの活性成分、すなわち、ＴＮＦαに対するヒツジＩｇＧ、並びに卵白のトリプシン阻害剤及びキモトリプシン阻害剤を分解するのを防止した。他の成分は、低い生物汚染度を維持すると考えられる抗微生物剤のメチルパラベン及びプロピルパラベンであった。使用前にサスペンジョンを混合するときにタンパク質の変性を防止するために、消泡剤のシメチコンを添加した。甘味剤は、サッカリンナトリウム及びマンニトールの形態であり、２種の制酸剤の苦味を低減する。風味剤のペパーミント油は、味を改善するために使用した。懸濁化剤のキサンタンガムは、すべての以上の成分を懸濁状態に維持するために添加した。
【0226】
製剤に２００ｍＭグリシンを添加することによりサスペンジョンの安定性が有意に改善されることを実験的に確認した。
【0227】
【表8】
【0228】
実施例６
経口送達に供すべく製剤化された組成物の物理化学的特徴付け
目視検査を注意深く実施することにより、サスペンジョンの物理的外観及びその純度を保証した。５０ｍｌの製剤を１００ｍｌのメスシリンダーに注加して、沈降体積をモニターするとともにさまざまな時間インターバルで記録することにより、サスペンジョンの沈降体積を決定した。
経口送達に供すべく製剤化された組成物の物理化学的特徴付け
目視検査を注意深く実施することにより、サスペンジョンの物理的外観及びその純度を保証した。５０ｍｌの製剤を１００ｍｌのメスシリンダーに注加して、沈降体積をモニターするとともにさまざまな時間インターバルで記録することにより、サスペンジョンの沈降体積を決定した。
【0229】
デュプリケートの結果を得て、式：
Ｆ＝Ｖｕ／Ｖｏ
に従って沈降体積を計算した。ただし、Ｆは沈降体積であり、Ｖｕは沈降物の最終高さであり、且つＶｏは全サスペンジョンの初期高さである。
Ｆ＝Ｖｕ／Ｖｏ
に従って沈降体積を計算した。ただし、Ｆは沈降体積であり、Ｖｕは沈降物の最終高さであり、且つＶｏは全サスペンジョンの初期高さである。
【0230】
沈降実験の開始から４８時間以内では、沈降は観測されなかった（Ｖｕ＝０）。したがって、医薬サスペンジョンは、なんら分離することなく４８時間以内で非常に安定な状態を維持した。さらに、４８時間後、サスペンジョンの入ったシリンダーを上下逆さまにしたところ、シリンダーの底に溜まった層はまったく観測されなかった。このことから、サスペンジョン内に層はまったく形成されないことが実証される。言い換えれば、実験の４８時間にわたり、調製されたサスペンジョン内に観測される凝集はなかった。
【0231】
実施例７
事例研究
緊急入院した２７歳の白人男性は、結腸内視鏡検査及び生検により確認される急性重症潰瘍性結腸炎に罹患していると診断される。ただちに、ヒドロコルチゾンが静脈内経路で被験体に投与されるが、その後６日間にわたり奏功しない。結腸全摘除を必要とすることが懸念されるため、本発明の製剤（たとえば、実施例５によるもの）が経口投与される。最初の２週間にわたり５０ｍｌを１日２回摂取し、その後、さらに１２週間にわたり５０ｍｌを毎日摂取する。
事例研究
緊急入院した２７歳の白人男性は、結腸内視鏡検査及び生検により確認される急性重症潰瘍性結腸炎に罹患していると診断される。ただちに、ヒドロコルチゾンが静脈内経路で被験体に投与されるが、その後６日間にわたり奏功しない。結腸全摘除を必要とすることが懸念されるため、本発明の製剤（たとえば、実施例５によるもの）が経口投与される。最初の２週間にわたり５０ｍｌを１日２回摂取し、その後、さらに１２週間にわたり５０ｍｌを毎日摂取する。
【0232】
患者は、英国腸疾患アンケート（ＵＫ－ＩＢＤＱ）への回答及び各種臨床パラメーターに基づいて迅速且つ良好に回復する。そのほか、Ｃ反応性タンパク質などの測定パラメーターは正常値に戻り、重篤な悪影響は受けない。研究終了時、２回目の結腸内視鏡検査及び生検による評価で有意な粘膜治癒が見られる。
【0233】
実施例８
経口送達に供すべく製剤化された組成物の相乗効果
以下の製剤を提供する。
・ 製剤Ａ：インタクトな抗ＴＮＦα、
・ 製剤Ｂ：卵白乾燥プロテアーゼ阻害剤、
・ 製剤Ｃ：ボーマン・バーク阻害剤（ダイズ）、
・ 製剤Ｄ：インタクトな抗ＴＮＦα＋卵白乾燥プロテアーゼ阻害剤、及び
・ 製剤Ｅ：インタクトな抗ＴＮＦα＋ボーマン・バーク阻害剤（ダイズ）。
経口送達に供すべく製剤化された組成物の相乗効果
以下の製剤を提供する。
・ 製剤Ａ：インタクトな抗ＴＮＦα、
・ 製剤Ｂ：卵白乾燥プロテアーゼ阻害剤、
・ 製剤Ｃ：ボーマン・バーク阻害剤（ダイズ）、
・ 製剤Ｄ：インタクトな抗ＴＮＦα＋卵白乾燥プロテアーゼ阻害剤、及び
・ 製剤Ｅ：インタクトな抗ＴＮＦα＋ボーマン・バーク阻害剤（ダイズ）。
【0234】
２５名の潰瘍性結腸炎患者及び２５名のクローン病患者は、製剤Ａ～Ｅの有効性を試験する研究に関与することに同意を示す。患者は５つのグループに分けられ、製剤Ａ～Ｅの１つが投与される（すなわち、５名の潰瘍性結腸炎患者は製剤Ａが投与され、５名のクローン病患者は製剤Ａが投与され、５名の潰瘍性結腸炎患者は製剤Ｂが投与され、５名のクローン病患者は製剤Ｂが投与されるなど）。投与レジームは、２０ｍｌ（１ｇのインタクトな抗ＴＮＦαと等価である）で４週間にわたり１日２回、その後、１日１回である。
【0235】
医師は、製剤Ｄ及びＥが投与された両方の疾患グループの患者が、製剤Ａ～Ｃが投与された患者と比較してより大きな改善及び症状の低減を示すことを確認する。結腸内視鏡検査は、治療後の腸管表面層の改善を示す。製剤Ｄ及びＥが投与された患者の改善は、製剤Ａ～Ｃが投与された患者の改善よりもはるかに大きく、製剤Ａ＋Ｂ及び製剤Ａ＋Ｃの予想される組み合われた改善よりもはるかに大きい（結腸内視鏡検査法により決定される）。そのため、ＰｃＡｂとプロテアーゼ阻害剤（たとえば、ＥＷＤプロテアーゼ阻害剤及び／又はボーマン・バーク阻害剤）との組合せは、予想外の相乗効果を生じる。
【0236】
比較実施例９
ヒツジ血清及び鶏卵に基づく特異的抗体力価の比較分析
ヒツジ抗血清に基づく特異的抗体濃度と比較して、鶏卵から得られる特異的ＩｇＹの濃度及び結合活性を評価する研究を行った。
ヒツジ血清及び鶏卵に基づく特異的抗体力価の比較分析
ヒツジ抗血清に基づく特異的抗体濃度と比較して、鶏卵から得られる特異的ＩｇＹの濃度及び結合活性を評価する研究を行った。
【0237】
１０匹のニワトリと５匹のヒツジとからなるグループをヒトインターロイキン－６（ＴＮＦαのような炎症誘発性サイトカインのｈＩＬ－６）で免疫し、得られた特異的ＰｃＡｂの力価及び結合活性を比較した。平均結合活性定数は、ヒツジ抗体では３．１×１０１０Ｌ／ｍｏｌであったのに対してニワトリＩｇＹでは１．３×１０１０Ｌ／ｍｏｌであった。しかしながら、ヒツジで達成された特異的ＰｃＡｂのレベル（≧１：２００，０００の平均力価を有する）は、卵黄で見いだされた力価（≦１：２０，０００）の１０倍超であった。ヒツジ及びメンドリをいくつかの他の免疫原で免疫したときにも、特異的ＰｃＡｂの濃度のこの１０倍以上の差を生じた。
【0238】
以上の実験は、血液に由来する抗体、とくにヒツジ源の抗体の利点を示す。
【0239】
実施例１０
ヒツジ血清及び牛乳に基づく特異的抗体力価の比較分析
好適に免疫されたウシに由来する初乳及び乳のＰｃＡｂ源としての潜在能力を評価する研究を行った。
ヒツジ血清及び牛乳に基づく特異的抗体力価の比較分析
好適に免疫されたウシに由来する初乳及び乳のＰｃＡｂ源としての潜在能力を評価する研究を行った。
【0240】
ウシをヒトＴＮＦαで免疫し、得られた特異的ＰｃＡｂの力価を最初に初乳で、次いで乳の逐次サンプルで決定した。初乳で得られた最大力価は１：２７５，０００であり（ヒツジ抗血清の１：８００，０００と比較される）、最初の搾乳の後、レベルは急速に約１：２７，５００に低下した。
【0241】
そのため、血液由来源は、乳／初乳由来源と比較して、ヒトＴＮＦαに結合する抗体をより高濃度で生成することが示された。
【0242】
実施例１１
経口抗体製剤の安定性
約１２ヶ月間の貯蔵後、抗体結合及び中和活性に関して実施例５の経口製剤を試験した。プロテアーゼ阻害剤活性の劣化がまったくなく且つ製剤の物理的安定性の変化がまったくないことから、抗体結合及び中和活性を維持することが示された。
経口抗体製剤の安定性
約１２ヶ月間の貯蔵後、抗体結合及び中和活性に関して実施例５の経口製剤を試験した。プロテアーゼ阻害剤活性の劣化がまったくなく且つ製剤の物理的安定性の変化がまったくないことから、抗体結合及び中和活性を維持することが示された。
【0243】
実施例１２
経口抗体製剤に含まれる抗微生物剤の有効性
実施例５の経口製剤中の抗微生物剤、すなわち、メチルパラベン（Ｅ２１８）（濃度２ｇ／Ｌ）及びプロピルパラベン（Ｅ２１６）（０．６ｇ／Ｌ）を、Ｓ．アウレウス（S. aureus）、Ｐ．アエルギノサ（P. aeruginosa）、Ｅ．コリ（E. coli）、Ｃ．アルビカンス（C. albicans）、及びＡ．ブラジリエンシス（A. brasiliensis）などの生物に対する欧州薬局方規格の外部抗微生物試験に付した。完全無菌性が示された。
経口抗体製剤に含まれる抗微生物剤の有効性
実施例５の経口製剤中の抗微生物剤、すなわち、メチルパラベン（Ｅ２１８）（濃度２ｇ／Ｌ）及びプロピルパラベン（Ｅ２１６）（０．６ｇ／Ｌ）を、Ｓ．アウレウス（S. aureus）、Ｐ．アエルギノサ（P. aeruginosa）、Ｅ．コリ（E. coli）、Ｃ．アルビカンス（C. albicans）、及びＡ．ブラジリエンシス（A. brasiliensis）などの生物に対する欧州薬局方規格の外部抗微生物試験に付した。完全無菌性が示された。
【0244】
実施例１３
血液由来ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体との比較
ヒトＴＮＦαに結合する血液由来（ヒツジ）ポリクローナル抗体と、ヒトＴＮＦαに結合するモノクローナル抗体のインフリキシマブ（Schering-Plough Ltd）と、を用いて、比較抗原結合アッセイを実施した。
血液由来ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体との比較
ヒトＴＮＦαに結合する血液由来（ヒツジ）ポリクローナル抗体と、ヒトＴＮＦαに結合するモノクローナル抗体のインフリキシマブ（Schering-Plough Ltd）と、を用いて、比較抗原結合アッセイを実施した。
【0245】
モノクローナル抗体のインフリキシマブはネズミＴＮＦαに結合しないが、ヒトＴＮＦαに対して産生されたヒツジ由来ポリクローナル抗体はそれに結合することが、図４から示される。
【0246】
本発明の血液由来ポリクローナル抗体は、ヒトＴＮＦαを中和するのに必要とされる濃度の約１００倍の濃度であるとはいえ、ネズミＴＮＦαに結合してそれを中和することが示された。ネズミＴＮＦαの中和は、インフリキシマブでは観測されなかったことから、本発明の抗体と比較して中和能が全体的に低減されることが示唆される。
【0247】
配列
配列番号１
配列番号２
配列番号３
配列番号４
配列番号５
ＶＲＳＳＳＲＴＰ
配列番号６
ＨＶＶＡＮＰＱＡＥＧＱＬＱＷＬＮＲＲ
配列番号７
ＮＧＶＥＬＲ
配列番号８
ＶＰＳＥＧ
配列番号９
ＣＰＳＴＨＶＬ
配列番号１０
ＩＳＲＩＡＶＳＹＱＴＫ
配列番号１１
ＰＣＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫ
配列番号１２
ＤＲＬＳＡＥＩＮＲＰＤＹＬＤＦＡ
配列番号１３（変異体ヒトＴＮＦαＰ８４Ｌ）
配列番号１
【化2】
【化3】
【化4】
【化5】
ＶＲＳＳＳＲＴＰ
配列番号６
ＨＶＶＡＮＰＱＡＥＧＱＬＱＷＬＮＲＲ
配列番号７
ＮＧＶＥＬＲ
配列番号８
ＶＰＳＥＧ
配列番号９
ＣＰＳＴＨＶＬ
配列番号１０
ＩＳＲＩＡＶＳＹＱＴＫ
配列番号１１
ＰＣＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫ
配列番号１２
ＤＲＬＳＡＥＩＮＲＰＤＹＬＤＦＡ
配列番号１３（変異体ヒトＴＮＦαＰ８４Ｌ）
【化6】
【0248】
以上の明細書に挙げた刊行物はすべて、参照により本明細書に組み込まれる。記載の本発明の方法及びシステムの種々の修正形態及び変更形態は、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく当業者に自明なものであろう。特定の好ましい実施形態との関連で本発明を説明してきたが、特許請求された本発明がかかる特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことを理解すべきである。実際には、バイオ化学及びバイオ技術又は関連分野の当業者に自明である記載の本発明の実施形態の各種修正形態は、以下の特許請求の範囲内にあることが意図される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】