特許 6998211 腫瘍抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１のＭＨＣ ＩおよびＭＨＣ ＩＩ拘束性エピトープに対する、癌の併用Ｔ細胞受容体遺伝子療法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2021-12-22

(45)【発行日】2022-02-04

(54)【発明の名称】腫瘍抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１のＭＨＣ ＩおよびＭＨＣ ＩＩ拘束性エピトープに対する、癌の併用Ｔ細胞受容体遺伝子療法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/12 20060101AFI20220128BHJP

   C07K 14/725 20060101ALI20220128BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220128BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20220128BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220128BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20220128BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20220128BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20220128BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20220128BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20220128BHJP

   A61K 38/17 20060101ALI20220128BHJP

【ＦＩ】

C12N15/12 ZNA

C07K14/725

C12N5/10

A61P31/12

A61P43/00 105

A61K48/00

A61P37/04

A61K31/7088

A61P43/00 121

A61K35/12

A61K35/17 A

A61K38/17

【請求項の数】 15

(21)【出願番号】P 2017548167

(86)(22)【出願日】2016-03-11

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2018-04-05

(86)【国際出願番号】 EP2016055242

(87)【国際公開番号】W WO2016146505

(87)【国際公開日】2016-09-22

【審査請求日】2019-02-26

(31)【優先権主張番号】15159001.5

(32)【優先日】2015-03-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】504439274

【氏名又は名称】マックス－デルブリュック－ツェントルム フューア モレキュラーレ メディツィン イン デア ヘルムホルツ－ゲマインシャフト

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(74)【代理人】

【識別番号】100157956

【弁理士】

【氏名又は名称】稲井 史生

(74)【代理人】

【識別番号】100170520

【弁理士】

【氏名又は名称】笹倉 真奈美

(74)【代理人】

【識別番号】100221545

【弁理士】

【氏名又は名称】白江 雄介

(72)【発明者】

【氏名】トーマス・ブランケンシュタイン

(72)【発明者】

【氏名】ルツィア・ポンツェッテ

(72)【発明者】

【氏名】シャオジュン・チェン

【審査官】原 大樹

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１３／１７７２４７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１３－５４１３３２（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ

Ｃ０７Ｋ

Ａ６１Ｋ

Ａ０１Ｋ

ＣＡＰｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＥＭＢＡＳＥ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒトＭＨＣと複合体を形成しているＮＹ－ＥＳＯ－１由来のエピトープに特異的に結合することができるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）コンストラクトの少なくとも１つのＴＣＲα鎖コンストラクトおよびＴＣＲβ鎖コンストラクトをコードする核酸であって、
前記ＴＣＲα鎖コンストラクトが、配列番号２３のアミノ酸４６－５１のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ１、配列番号２３のアミノ酸６９－７４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号２３のアミノ酸１０９－１２３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み、および前記ＴＣＲβ鎖コンストラクトが、配列番号５９のアミノ酸４６－５０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号５９のアミノ酸６８－７３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号５９のアミノ酸１１１－１２５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む、
核酸。

【請求項2】

前記ＴＣＲコンストラクトが、ＨＬＡ－ＤＲ４と複合体を形成している配列番号２１のアミノ酸配列からなるエピトープに特異的に結合することができ、
前記ＴＣＲα鎖コンストラクトが、配列番号２３のアミノ酸４６－５１のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）ＣＤＲ１、配列番号２３のアミノ酸６９－７４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号２３のアミノ酸１０９－１２３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み、および前記ＴＣＲβ鎖コンストラクトが、配列番号５９のアミノ酸４６－５０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号５９のアミノ酸６８－７３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号５９のアミノ酸１１１－１２５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む、
請求項１に記載の核酸。

【請求項3】

前記ＴＣＲα鎖コンストラクトが、配列番号２３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む可変領域を含み、および、前記ＴＣＲβ鎖コンストラクトが、配列番号５９のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む可変領域を含む、請求項１または２のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項4】

前記ＴＣＲα鎖コンストラクトが、配列番号２３の配列を含む可変領域を含み、および、前記ＴＣＲβ鎖コンストラクトが、配列番号５９の配列を含む可変領域を含む、請求項３に記載の核酸。

【請求項5】

ａ）前記ＴＣＲコンストラクトが、配列番号９５の核酸配列によりコードされており;
ｂ）前記ＴＣＲα鎖コンストラクトおよび前記ＴＣＲβ鎖コンストラクトをコードする核酸が、宿主細胞における発現に適する発現ベクターである、
請求項１から４のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項6】

前記宿主細胞が、ヒトＴ細胞である、請求項５に記載の核酸。

【請求項7】

請求項１から６のいずれか一項に記載の核酸によりコードされるタンパク質。

【請求項8】

請求項１から６のいずれか一項に記載の核酸または請求項７に記載のタンパク質を含む、宿主細胞。

【請求項9】

宿主細胞がＣＤ４^＋Ｔ細胞である、請求項８に記載の宿主細胞。

【請求項10】

該宿主細胞がヒト細胞である、請求項８または９に記載の宿主細胞。

【請求項11】

ａ）ヒトＭＨＣと複合体を形成しているＮＹ－ＥＳＯ－１由来のエピトープに特異的に結合することができるＴＣＲコンストラクトをコードする、請求項１から６のいずれか一項に記載の核酸、または
ｂ）ヒトＭＨＣと複合体を形成しているＮＹ－ＥＳＯ－１由来のエピトープに特異的に結合することができるＴＣＲコンストラクトを含む、請求項７に記載のタンパク質、または
ｃ）ヒトＭＨＣと複合体を形成しているＮＹ－ＥＳＯ－１由来のエピトープに特異的に結合することができるＴＣＲコンストラクトを発現する、請求項８から１０のいずれか一項に記載の宿主細胞
を含む、医薬組成物。

【請求項12】

増殖性疾患またはウイルス性疾患の診断、予防および／または処置における使用のための請求項１１に記載の医薬組成物であって、ここで、増殖性細胞または腫瘍がＮＹ－ＥＳＯ－１を発現している、請求項１１に記載の医薬組成物。

【請求項13】

増殖性疾患またはウイルス性疾患が、良性または悪性腫瘍疾患である、請求項１２に記載の医薬組成物。

【請求項14】

免疫療法において使用するための、請求項１２または１３に記載の医薬組成物。

【請求項15】

養子Ｔ細胞療法またはＴＣＲ遺伝子治療において使用するための、請求項１４に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、免疫療法の分野、特に癌の養子Ｔ細胞療法またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子療法に関する。本発明は、ヒトＭＨＣと複合体を形成しているＮＹ－ＥＳＯ－１ (ＣＴＡＧ－１とも記載される) 由来のエピトープに特異的に結合することができるＴＣＲコンストラクトの少なくとも１つのＴ細胞受容体α鎖コンストラクトおよび／またはＴＣＲβ鎖コンストラクトをコードする核酸を提供し、ここで、該ＴＣＲα鎖コンストラクトおよび／またはＴＣＲβ鎖コンストラクトは、配列番号１～２０から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する相補性決定領域３(ＣＤＲ３)を含む。本発明は、ＭＨＣ Ｉ分子上に提示されるＮＹ－ＥＳＯ－１由来のエピトープに対して制限されるＴＣＲコンストラクト、およびＭＨＣ ＩＩ分子上に提示されるＮＹ－ＥＳＯ－１由来のエピトープに対して制限されるＴＣＲコンストラクトを提供し、従って、組換えＣＤ４^＋Ｔ細胞および組換えＣＤ８^＋Ｔ細胞の両方による併用養子Ｔ細胞療法が可能となる。本発明はまた、対応するタンパク質および宿主細胞、ならびに、特に増殖性疾患またはウイルス性疾患の診断、予防および／または処置における、かかるコンストラクトの医薬用途も提供し、ここで、好ましくは、ＭＨＣ ＩおよびＭＨＣ ＩＩ分子に対して拘束される(restricted)両ＴＣＲコンストラクトは、キットで提供される。本発明はまた、ヒトＴＣＲ遺伝子座およびヒト ＨＬＡ－ＤＲ４導入マウスであるＡＢａｂＤＲ４マウスにも関する。

【背景技術】

【0002】

癌と診断された患者に利用可能な診断および処置の選択肢における顕著な技術的進歩にもかかわらず、その予後は依然として不良であることが多く、多くの患者は治癒することができない。免疫療法は、正常組織に損傷を与えずに悪性腫瘍細胞を根絶する可能性を有する、種々の腫瘍と診断された患者に対する、強力かつ標的化された処置の可能性を有している。理論上は、免疫系のＴ細胞は、腫瘍細胞に特異的なタンパク質パターンを認識し、種々のエフェクター機序を介してそれらの破壊に介在することができる。しかしながら、実際には、患者のＴ細胞は、腫瘍抗原に対して寛容であることが多い。養子Ｔ細胞療法とは、患者自身のＴ細胞の腫瘍排除能を増幅させ、そしてこれらのＴ細胞を患者に戻して、それらが健康な組織に損傷を与えずに効果的に残存腫瘍を排除するような状態にする試みである。この方法は、腫瘍免疫学の分野では新しいものではないが、養子Ｔ細胞療法の臨床使用における多くの欠点が、未だに、癌処置におけるこの方法の十分な活用を損なっている。

【0003】

ＴＣＲは、シグナル伝達に介在するＣＤ３複合体のインバリアント（invariant）タンパク質に関連する免疫グロブリンスーパーファミリーのヘテロ二量体細胞表面タンパク質である。ＴＣＲは、構造的に類似しているが、全く異なる解剖学的位置および恐らく機能を有する、αβおよびγδ形態で存在する。天然のヘテロ二量体αβＴＣＲのα鎖およびβ鎖は、それぞれ２つの細胞外ドメイン、膜近位定常ドメイン、および膜遠位可変ドメインを含む、膜貫通タンパク質である。定常ドメインおよび可変ドメインのそれぞれは、、鎖内ジスルフィド結合を含む。可変ドメインは、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）に類似した高度多型性のループを含む。

【0004】

各ＴＣＲ鎖の可変領域は、可変（Ｖ）セグメントおよび結合（Ｊ）セグメントを含み、β鎖の場合には多様性（Ｄ）セグメントもまた含む。各可変領域は、フレームワーク配列中に埋め込まれた３つのＣＤＲ(相補性決定領域)を含み、そのうち１つは、ＣＤＲ３と呼ばれる超可変領域である。フレームワーク配列、ＣＤＲ１配列およびＣＤＲ２配列、ならびに部分的に規定されるＣＤＲ３配列により区別される数種のα鎖可変（Ｖα）領域および数種のβ鎖可変（Ｖβ）領域が存在する。独特なＴＲＡＶまたはＴＲＢＶ番号は、ＩＭＧＴ命名法によってＶαまたはＶβを規定する。Ｔ細胞受容体特異性は、主にＣＤＲ３領域によって決定される。

【0005】

ＴＣＲ遺伝子療法の使用は、現在の多くの問題を克服する。これにより、患者自身のＴ細胞に所望の特異性を与え、短期間に十分な数のＴ細胞を産生し、それらの枯渇を回避することが可能になる。ＴＣＲは、セントラルメモリーＴ細胞または幹細胞の特徴を有するＴ細胞に形質導入され得て、それは、遺伝子導入により良好な持続性および機能を確実にし得る。ＴＣＲにより改変されたＴ細胞は、化学療法または放射線照射によってリンパ球減少症を引き起こした癌患者に注射されて、効率のよい移植を可能にするが、免疫抑制を阻止することができる。

【0006】

遺伝子療法の克服すべき最大のハードルは、正常組織に有害な毒性を引き起こさずに癌を破壊するために標的化され得る抗原の同定である (Restifo et al, 2012, Nature Reviews 12, 269－281)。癌－精巣抗原は、一般的に、精巣および胎児卵巣中の生殖細胞によって発現されるが、多くのタイプの腫瘍によっても発現される。癌－精巣抗原は、多くの腫瘍タイプの間でそれらの共通の発現および正常組織におけるそれらの発現の欠如のために、最も魅力的な標的である。この抗原群に対して特異的Ｔ細胞を惹起することは、癌療法において良好な機会を提供する。

【0007】

ＮＹ－ＥＳＯタンパク質は、他で全く発現されないわけではないが、主として生殖細胞系で発現される癌－精巣抗原のサブファミリーを構成する。しかしながら、それらは、種々のヒトの癌、例えば、黒色腫、肺癌、滑膜肉腫、および頭頸部癌、食道癌および膀胱癌においても発現され、それらは悪性腫瘍と関連があり、腫瘍の悪性化をもたらし得る。正常な周辺の健康な組織では発現せず、腫瘍におけるＮＹ－ＥＳＯ－１抗原のこの特異的発現は、この抗原ファミリーを標的化養子Ｔ細胞移植にとって非常に興味深いものにする。遺伝子操作されたＴＣＲを有する自己Ｔ細胞を用いたＮＹ－ＥＳＯ－１を標的とした最近の報告は、転移性黒色腫患者の４７％および転移性滑膜肉腫患者の８０％において客観的臨床応答の証拠を示し、該患者らは全て、複数の標準療法による前治療歴を有した。正常組織に対する毒性は観察されなかった(Robbins et al., 2011, J. Clin. Oncol. 29, 917－924)。

【0008】

これまで、ヒト患者または形質転換マウスに由来するＮＹ－ＥＳＯ－１のＭＨＣ Ｉ拘束性エピトープに特異的なＴＣＲが同定されている (Robbins et al., 2011, J. Clin. Oncol. 29, 917－924；Linnemann et al., 2013, Nature Med. 19, 1534－1541)；そして、ヒト患者に由来するＮＹ－ＥＳＯ－１のＭＨＣ ＩＩ(ＨＬＡ－ＤＰ４)拘束性エピトープに特異的なＴＣＲが開示されている(Zhao et al., 2006, J Immunother. 29(4)：398－406)。

【0009】

しかしながら、治療の有効性の向上が望まれている。最先端技術の欠点は、遺伝子療法に対するＴＣＲの不十分な親和性、または宿主におけるＴ細胞の不十分な有効性に関係し得る。例えば、Schietingerらの(2010, J. Exp. Med. 207, 2469－2477)およびBosらの(2010, Cancer Res. 70(21), 8368－8377)は、マウスモデルにおいて、ＣＤ８^＋細胞単独では腫瘍を根絶するには不十分であることが多いが、ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の協力が必要とされ得ることを記載している。

【発明の概要】

【0010】

上記の欠点を考慮して、本発明者らは、ＮＹ－ＥＳＯ－１のような腫瘍抗原に特異的に結合することができる新規のＴＣＲコンストラクト、特に、それぞれヒトＭＨＣ ＩＩまたはヒトＭＨＣ Ｉと複合体を形成するそのような抗原のエピトープを認識するＴＣＲコンストラクトを提供するという課題を解決する。この問題は、特許請求の範囲の記載に記載された発明によって解決される。

【0011】

本発明者らは、驚くことに、マウス由来のＮＹ－ＥＳＯ－１のような腫瘍抗原由来のエピトープを標的とするＴＣＲコンストラクトが、それらの親和性および／または機能的特徴、例えば、それぞれのペプチド／ＭＨＣ複合体による刺激に応答するＩＦＮ－γ産生に関して、ヒト患者由来のＴＣＲコンストラクトよりも優れていることを見出した。

【0012】

特に、本発明は、ヒトＭＨＣと複合体を形成しているＮＹ－ＥＳＯ－１ (ＣＴＡＧ－１とも言う)由来のエピトープに特異的に結合することができるＴＣＲコンストラクトの少なくとも１つのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖コンストラクトおよび／またはＴＣＲβ鎖コンストラクトをコードする核酸を提供し、ここで、該ＴＣＲα鎖コンストラクトおよび／またはＴＣＲβ鎖コンストラクトは、配列番号１～２０から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または、好ましくは１００％の配列同一性を有する相補性決定領域３(ＣＤＲ３)を含む。

【0013】

本明細書の文脈上、単数形（「a」）は、他に明確にこれと異なる記載がなされない限り、“１またはそれ以上”を意味すると理解される。従って、例えば、本発明のＴＣＲコンストラクトがαおよびβ鎖コンストラクトの両方を含む場合、本発明の全体に亘って好ましくは、それは、１つまたは２つの核酸のいずれかによってコードされ得る。αおよびβ鎖コンストラクトは一体となって、ヒトＭＨＣと複合体を形成するＮＹ－ＥＳＯ－１由来のエピトープに特異的に結合することができる。中間生成物として、αおよびβ鎖コンストラクトもまた、それら自体が本発明の主題でもある。

【0014】

配列番号１～２０は、本発明で同定されたＴＣＲのＣＤＲ３領域に対応し、本明細書の表１および２に示されている。配列番号１～９は、ＨＬＡ－ＤＲＡ／ＨＬＡ－ＤＲＢ１^＊０４０１（ＨＬＡ－ＤＲ４）－エピトープ、すなわち、ＭＨＣ ＩＩ拘束性ＮＹ－ＥＳＯ－１_{１１６－１３５}エピトープ（ＬＰＶＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩ、配列番号２１）を認識することができる本発明のＴＣＲα鎖コンストラクトのＣＤＲ３領域に対応し、配列番号１０～１８は、ＨＬＡ－ＤＲ４拘束性ＮＹ－ＥＳＯ－１_{１１６－１３５}エピトープを認識することができる本発明のＴＣＲβ鎖コンストラクトのＣＤＲ３領域に対応する。これらは、ＮＹ－ＥＳＯ－１のＨＬＡ－ＤＲ４拘束性エピトープに特異的な初めて単離されたＴＣＲである。それらは、ヒトＴＣＲ遺伝子座およびヒトＨＬＡ－ＤＲ４のトランスジェニックマウス由来であった。

【0015】

従って、好ましい態様において、本発明のＴＣＲコンストラクトは、ＨＬＡ－ＤＲ４と複合体を形成しているＮＹ－ＥＳＯ－１_{１１６－１３５} エピトープ (配列番号２１)からなるエピトープに特異的に結合することができ、ここで、ＴＣＲα鎖コンストラクトは、配列番号１～９から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは１００％の配列同一性を有するＣＤＲ３を含む。ＴＣＲβ鎖コンストラクトは、配列番号１０～１８から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは１００％の配列同一性を有する相補性決定領域３(ＣＤＲ３)を含む。もちろん、ＴＣＲαおよびβ鎖コンストラクトは、特に、表１に教示されるように、ＭＨＣ分子上のエピトープの認識を可能にする方法で、本発明のＴＣＲコンストラクトにおいて対を形成する。ＴＣＲαおよび／またはβ鎖コンストラクトは、表３に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含み得る。好ましくは、ＴＣＲαおよび／またはβ鎖コンストラクトは、表１に示される通り、ＣＤＲ３領域および可変領域を含む。

【0016】

ＴＣＲα鎖コンストラクトは、要すれば、配列番号３１～３９から選択されるコドン最適化された配列を有する核酸によってコードされる、配列番号２２～３０から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％の配列同一性を有する配列を含む可変領域を含み得る。ＴＣＲα鎖コンストラクトは、好ましくは、配列番号４０～４８のいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％の配列同一性を有する配列を含み、要すれば、配列番号４９～５７のいずれかの配列を有するコドン最適化核酸によりコードされる。

【0017】

【表1】

【0018】

ＴＣＲβ鎖コンストラクトは、配列番号５８～６６から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％の配列同一性を有する配列を含む可変領域を含んでいてよく、それは、要すれば、配列番号６７～７５から選択される配列を有するコドン最適化核酸によりコードされていてよい。ＴＣＲβ鎖コンストラクトは、好ましくは、配列番号７６～８４のいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％の配列同一性を有する配列を含み、要すれば、配列番号８５～９３のいずれかの配列を有するコドン最適化核酸によりコードされていてよい。

【0019】

それらの可変領域内またはそれらの完全長に亘って、ある配列同一性によって定義されるコンストラクトは、好ましくは、例えば表１に示される通り、定義されたＣＤＲ３領域と１００％の相同性を有するそれぞれのＣＤＲ３領域を含む。

【0020】

本発明はまた、一本鎖核酸コンストラクトを提供し、ここで、例えばＴＣＲαおよびβ鎖コンストラクトは、Ｐ２Ａエレメントによって隔てられている。そのような一本鎖核酸コンストラクトにおいて、完全なＴＣＲコンストラクトは、配列番号９４～１０２のいずれかの核酸によってコードされ得る。

【0021】

本発明はまた、完全に再配列されていないヒトＴＣＲαおよびβ遺伝子座をコードする核酸を含み、該遺伝子座に由来する再配列されたＴＣＲをそのＣＤ４^＋Ｔ細胞上に発現し、さらにマウスＩ－Ｅの非抗原結合ドメインに融合したヒトＨＬＡ－ＤＲ４を発現するマウスであって、ここで、該マウスが、マウスＴＣＲおよびマウスＭＨＣクラスＩＩ分子を欠損している、マウスに関する。従って、ＡＢａｂＤＲ４マウスは、ＨＬＡ－ＤＲ４拘束性を有するＣＤ４^＋Ｔ細胞と共に多様なヒトＴＣＲレパートリーを発現する。ＨＬＡ－ＤＲ４と複合体を形成しているＮＹ－ＥＳＯ－１エピトープを認識する上記の本発明のＴＣＲコンストラクトは、全てかかるマウス由来であり、ＡＢａｂＤＲ４マウスと命名され、これも本発明の目的である。本発明はまた、ＨＬＡ－ＤＲ４、特に、本発明のＴＣＲコンストラクト上に提示されるエピトープに特異的なＴＣＲを調製するための、これらのマウスの使用にも関する。

【0022】

ヒトとは対照的に、ＡＢａｂＤＩＩマウスまたはＡＢａｂＤＲ４マウスは、ＮＹ－ＥＳＯ－１などのヒト腫瘍関連抗原 (ＴＡＡ)に対して寛容ではない。従って、ヒトＴＡＡでワクチン接種したとき、ＡＢａｂＤＩＩマウスは、高親和性（avidity）抗原特異的Ｔ細胞の増殖を含むそれらの外来抗原に対する効率的な適応した免疫応答を生じる。好適なヒトＴＡＡで免疫した後、ＡＢａｂＤＩＩマウスの高親和性ＴＣＲをコードする遺伝子情報を抽出することができる。これらのＴＣＲは、その後、レトロウイルス形質導入を介して腫瘍患者由来のＴ細胞において再発現され得る。それらの再標的化されたＴ細胞は、腫瘍と闘っている患者に移植され得る (ＷＯ2014118236の図１参照)。

【0023】

ヒトＴＣＲトランスジェニックマウスを使用することにより、マウスゲノムによってコードされていないヒトペプチド配列はいずれも免疫化に適しており、最適な親和性を有するＴＣＲが得られ得る。最適な親和性とは、Ｔ細胞がヒトの自己ＭＨＣ分子に対して拘束され、ペプチド抗原を外来物と認識すること、例えば非耐性(nontolerant)レパートリーを示すことを意味する。ペプチド／ＭＨＣ多量体を用いることにより、トランスジェニックマウスの特異的Ｔ細胞を選別することができ、例えば単細胞ＰＣＲによりヒトＴＣＲを単離することができ、該ＴＣＲは、内因性ＴＣＲとの誤対合を回避しながら、効率よく発現するために最適化され、患者のＴ細胞のウイルスベクターによる形質導入に使用される (Uckert et al., 2009, Cancer Immunol Immunother 58, 809－22；Kammertoens et al., 2009, Eur J Immunol 39, 2345－53)。

【0024】

上記の本発明のＴＣＲコンストラクトは、ヒトＴＣＲ遺伝子座およびヒトＭＨＣ、特に、ＨＬＡ－ＤＲ４のトランスジェニックマウス、すなわち、ＡＢａｂＤＲ４マウスに由来する。“～に由来する”とは、ＴＣＲコンストラクト (またはそれぞれのα／β鎖コンストラクト)の少なくともＣＤＲ３配列(複数可)、好ましくは可変領域が、以下の実施例におけるマウスＴＣＲにより提供される配列に対して同一であるか、またはそれらに対して上記の配列同一性レベルを有することを意味する。核酸が、マウスＴＣＲをコードする核酸から、例えばＰＣＲにより物理的に誘導されることが可能であるが、それが必須ではない。他に詳細に記載されるように、変更が可能である。

【0025】

ＡＢａｂＤＩＩマウスにおけるＣＤ８^＋Ｔ細胞は、ヒトＭＨＣ クラスＩ分子、ＨＬＡ－Ａ^＊０２０１（ＨＬＡ－Ａ２)によって提示される抗原を認識するヒトＴ細胞受容体(ＴＣＲ)を担持する (Li et al., 2010, Nature Medicine 16, 1029－34)。ＨＬＡ－Ａ２に対して拘束され、ＡＢａｂＤＩＩマウスに由来するＮＹ－ＥＳＯ－１ エピトープを認識するＴＣＲは、既報である(Linnemann et al., Nature Medicine 19, 1534－1541)。本発明は、ＨＬＡ－Ａ２に対して拘束されるＮＹ－ＥＳＯ－１エピトープ (配列番号１０３) を認識するＴＣＲであって、ヒト患者に由来するそれぞれのＴＣＲ、ＴＣＲ １Ｇ４よりも機能的に優れていることが示されているＡＢａｂＤＩＩマウスに由来するＴＣＲを提供する。

【0026】

【表2】

【0027】

従って、本発明はまた、ＭＨＣ Ｉ、特に、ＨＬＡ－Ａ２と結合しているＮＹ－ＥＳＯ－１エピトープを認識することができるＴＣＲコンストラクトを提供する。配列番号１９は、ＨＬＡ－Ａ２－、すなわちＭＨＣ Ｉ－拘束性ＮＹ－ＥＳＯ－１_{１５７－１６５} エピトープ (ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ、配列番号１０３)を認識することができる本発明のＴＣＲ α鎖コンストラクトのＣＤＲ３領域に対応し、配列番号２０は、ＨＬＡ－Ａ２拘束性ＮＹ－ＥＳＯ－１_{１５７－１６５} エピトープを認識することができる本発明のＴＣＲβ鎖コンストラクトのＣＤＲ３領域に対応する。驚くべきことに、本発明により提供されるこのＴＣＲは、以下に示す通り、以前にヒトから単離された他のＴＣＲよりも高い親和性を有することが発見された。

【0028】

本発明のＴＣＲコンストラクトは、ＨＬＡ－Ａ２と複合体を形成している配列番号１０３のアミノ酸配列からなるエピトープに特異的に結合することができ、ここで、ＴＣＲα鎖コンストラクトは、配列番号１９のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは、１００％の配列同一性を有する相補性決定領域３(ＣＤＲ３)を含み、および／またはＴＣＲβ鎖コンストラクトは、配列番号２０のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは、１００％の配列同一性を有する相補性決定領域３(ＣＤＲ３)を含む。

【0029】

該ＴＣＲα鎖コンストラクトは、配列番号１０５のコドン最適化核酸によりコードされていてよい配列番号１０４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む可変領域を含み得る。該ＴＣＲα鎖コンストラクトは、配列番号１０７のコドン最適化核酸によりコードされていてよい配列番号１０６のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％の配列同一性を有する配列を含み得る。

【0030】

該ＴＣＲβ鎖コンストラクトは、配列番号１０８のコドン最適化核酸によりコードされていてよい配列番号１０６のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む可変領域を含み得る。該ＴＣＲβ鎖コンストラクトは、配列番号１１０のコドン最適化核酸によりコードされていてよい配列番号１０９のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％の配列同一性を有する配列を含み得る。

【0031】

該ＴＣＲコンストラクトは、表３に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含み得る。ＴＣＲコンストラクトはまた、表２に示されるＣＤＲ３領域および可変領域を含み得る。

【0032】

【表3】

【0033】

本発明はまた、例えばＴＣＲαおよびβ鎖コンストラクトがＰ２Ａエレメントによって隔てられている、一本鎖核酸コンストラクトを提供する。図４は、例示的コンストラクトを提供する。そのようなＴＣＲコンストラクトは、配列番号１１１の核酸によってコードされていてよい。

【0034】

上記で提供される全ての核酸配列は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されている。

【0035】

本発明のＴＣＲコンストラクトのＴＣＲα鎖コンストラクトおよび／またはＴＣＲβ鎖コンストラクトは、好ましくは、ベクターである。好適なベクターには、プラスミドおよびウイルスなどの、増殖（propagation and expansion）のため、または発現のため、あるいは両方のために設計されたものが含まれる。ベクターは、ヒトＴ細胞またはヒトＴ細胞前駆体、好ましくは、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、幹細胞様Ｔ細胞などのヒトＴ細胞を含む群から選択される宿主細胞における発現に適する発現ベクターであり得る。ベクターはウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクター、特にガンマ－レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターであってよい。好適な発現ベクターの例としては、図４に示すレトロウイルスベクターＭＰ７１が含まれる。組換え発現ベクターは、転写および翻訳の開始および終止コドンなどの調節配列を含み、それらは、該ベクターが導入されるべき、かつ本発明の核酸の発現が行われるべき、宿主細胞タイプ(例えば、細菌、真菌、植物または動物)に特異的である。さらに、本発明のベクターは、形質転換またはトランスフェクトされた宿主の選択を可能にする、１以上のマーカー遺伝子を含み得る。組換え発現ベクターは、本発明のコンストラクトをコードするヌクレオチド配列、または本発明のコンストラクトをコードするヌクレオチド配列に相補的であるか、もしくはそれにハイブリダイズするヌクレオチド配列に作動可能に連結された、天然の、または好ましくは、異種のプロモーターを含み得る。プロモーターの選択には、例えば、強力な、弱い、誘導性の、組織特異的な、および発生特異的なプロモーターが含まれる。プロモーターは、非ウイルスプロモーターまたはウイルスプロモーターであり得る。好ましくは、それは異種プロモーター、すなわち、ヒトＴ細胞においてＴＣＲに天然には結合していないプロモーター、例えば長い末端反復プロモーターなどであり、それは、ヒトＴ細胞における発現に適している。本発明の組換え発現ベクターは、一過性発現、安定した発現、またはその両方のために設計され得る。また、組換え発現ベクターは、構成的発現または誘導発現のために作製することができる。

【0036】

本発明はまた、タンパク質、すなわち、αもしくはβ鎖コンストラクト、または好ましくは、αおよびβ鎖コンストラクトの両方を含むＴＣＲ受容体コンストラクトを提供し、それは、ＨＬＡ－ＤＲ４と結合されたエピトープＮＹ－ＥＳＯ－１_{１１６－１３５}、またはＨＬＡ－Ａ２と結合されたエピトープＮＹ－ＥＳＯ－１_{１５７－１６５}に特異的に結合することができる。タンパク質は、好ましくは、本発明の核酸によってコードされる。

【0037】

本明細書で用いる用語、所定の抗原に“特異的に結合する”またはそれを“認識する”またはそれに“特異的な”とは、ＴＣＲコンストラクトが、該エピトープ、好ましくはＮＹ－ＥＳＯ－１に、より好ましくは高親和性で、特異的に結合し、かつ免疫学的に認識することができることを意味する。例えば、ＴＣＲは、ＴＣＲを発現するＴ細胞が、低濃度のそれぞれのエピトープ、例えば、ＨＬＡ－Ａ２ 拘束性ＮＹ－ＥＳＯ－１_{１５７－１６５} エピトープまたはＨＬＡ－ＤＲ４－拘束性ＮＹ－ＥＳＯ－１_{１１６－１３５} エピトープなどのＮＹ－ＥＳＯ－１ エピトープ(例えば、約１０^－１１ｍｏｌ／ｌ、１０^－１０ ｍｏｌ／ｌ、１０^－９ ｍｏｌ／ｌ、１０^－８ ｍｏｌ／ｌ、１０^－７ ｍｏｌ／ｌ、１０^－６ ｍｏｌ／ｌ、１０^－５ ｍｏｌ／ｌ) でパルスされた標的Ｔ細胞との共培養の際に、少なくとも約２００ｐｇ／ｍｌまたはそれ以上(例えば、２５０ｐｇ／ｍｌまたはそれ以上、３００ｐｇ／ｍｌまたはそれ以上、４００ｐｇ／ｍｌまたはそれ以上、５００ｐｇ／ｍｌまたはそれ以上、６００ｐｇ／ｍｌまたはそれ以上、７００ｐｇ／ｍｌまたはそれ以上、１，０００ｐｇ／ｍｌまたはそれ以上、２，０００ｐｇ／ｍｌまたはそれ以上、２，５００ｐｇ／ｍｌまたはそれ以上、５，０００ｐｇ／ｍｌまたはそれ以上)のインターフェロンγ(ＩＦＮ－γ)を分泌するが、エピトープなし、または対照ペプチドエピトープの場合は分泌しないとき、ＮＹ－ＥＳＯ－１に“特異的に結合することができる”とみなされ得る。あるいは、または加えて、ＴＣＲは、ＴＣＲを発現するＴ細胞が、低濃度の適当なペプチドでパルスされた標的Ｔ細胞との共培養の際に、ＩＦＮ－γの非形質導入バックグラウンドレベルよりの少なくとも２倍多いＩＦＮ－γを分泌するとき、ＮＹ－ＥＳＯ－１エピトープに対して“抗原特異性”を有すると見なされ得る。上記のようなかかる“特異性”は、例えば、ＥＬＩＳＡで分析可能である。

【0038】

親和性は、当業者によく知られた方法、例えばＢｉａＣｏｒｅにより分析することができる。１００μＭ以上、より好ましくは１０μＭ以上のＴＣＲ親和性またはＴ細胞結合活性は高親和性であると考えられる。

【0039】

本発明によって提供される定義されたＣＤＲ３配列および可変領域配列に基づき、ＴＣＲ配列の親和性成熟を行うことが可能である (Chervin et al. J Immunol Methods. 2008;339(2)：175－84)；Robbins et al. J Immunol. 2008;180：6116－31)。ＣＤＲ３配列中のアミノ酸置換を誘導する非同義（non－synonymous）のヌクレオチド置換は、標的抗原に対するＴＣＲの増強された親和性をもたらし得る。さらに、可変ＴＲＡおよびＴＲＢ領域の他の部分におけるＴＣＲ配列の変化は、ペプチド－ＭＨＣ複合体に対するＴＣＲの親和性を変化させ得る。これは、ペプチド－ＭＨＣに対するＴＣＲの全体的な親和性を増加させるが、非特異的認識および増加した交差反応性のリスクを有する(Linette ら、Blood. 2013;122(6)：863－72)。提供される特定の配列から変化するＴＣＲは、提供される標的抗原に対して排他的な特異性を保持すること、すなわち、それらは、交差反応性ではなく、最も重要なことには、ヒト自己ペプチドに対して交差反応性を有さないことが好ましい。ＴＣＲの潜在的交差反応性は、正確なＭＨＣアレルを有する細胞に負荷された既知の自己ペプチドに対して試験することができる(Morgan et al., 2013, J. Immunother. 36, 133－151)。従って、本発明のＴＣＲコンストラクトを発現するＴ細胞の養子移入は、健康な組織に対しては全くまたは重大な悪影響を及ぼさないことが好ましい。

【0040】

本発明のＴＣＲαおよび／またはβ鎖コンストラクトは、その天然対応物に対応する全ての特性またはドメインを含み得るが、これは必須ではない。好ましくは、ＴＣＲαおよび／またはβ鎖コンストラクトは、少なくとも１つの可変領域、または可変領域および定常領域、例えば、ヒト可変領域または定常ＴＣＲ領域に対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を有する可変領域および／または定常領域を含む。養子ＴＣＲ療法の場合、ＴＣＲコンストラクトは、可変領域、定常領域および膜貫通領域を含む、完全長ＴＣＲα鎖およびβ鎖を含むことが好ましい。ＴＣＲコンストラクトは、好ましくは、本質的または排他的に、免疫原性を最小にするために、ヒト起源のものである。しかしながら、内在性のＴＣＲ鎖との対合を阻止するために、本発明のコンストラクトは、好ましくは、ヒト配列と比べて、１以上、例えば、１～５個、１～１０個または１～２０個のアミノ酸置換、挿入または欠失を含み、例えば、追加のシステインを提供して付加的なジスルフィド結合の形成を可能にしている (Sommermeyer et al., 2010, J. Immunol. 184, 6223－31)。このために、ＴＣＲαおよびβ鎖コンストラクトの定常領域はまた、マウス定常領域であってもよい。

【0041】

コンストラクトはまた、キメラ抗原受容体、またはその一部であってもよく、ここで、例えばヒトＴＣＲ可変領域は、異なる免疫グロブリン定常ドメイン、例えばＩｇＧ定常ドメイン、またはＮＹ－ＥＳＯ－１などの抗原に特異的に結合することができる抗体ドメインに結合することができる。

【0042】

一本鎖コンストラクト (ｓｃＴＣＲ)が包含され、ならびにヘテロ二量体ＴＣＲコンストラクトも包含される。ｓｃＴＣＲは、第一のＴＣＲ鎖コンストラクト (例えば、α鎖)の可変領域および全長(完全長)の第二のＴＣＲ鎖(例えば、β鎖)を含んでいてよく、またはその逆であってもよい。さらに、ｓｃＴＣＲは、要すれば、２以上のポリペプチドを一緒に連結する１以上のリンカーを含み得る。リンカーは、例えば、本明細書に記載の通り、２つの一本鎖を共に結合するペプチドであり得る。サイトカイン、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７またはＩＬ－１５などのヒトサイトカインに融合された本発明のｓｃＴＣＲもまた、提供される。

【0043】

本発明のＴＣＲコンストラクトはまた、少なくとも２個のｓｃＴＣＲ分子を含む多量体複合体の形態で提供され得て、ここで、該ｓｃＴＣＲ分子は、それぞれ少なくとも１つのビオチン部分に融合され、該ｓｃＴＣＲは、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用により結合されて、該多量体複合体の形成を可能にする。また、３以上、例えば、４つの本発明のｓｃＴＣＲを含む、高次の多量体複合体も提供される。

【0044】

本発明のＴＣＲコンストラクトは、例えば、放射性同位元素、フルオロフォア (例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）)、酵素 (例えば、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ)、および粒子(例えば、金粒子または磁性粒子)などの、検出可能な標識(ラベル)を含むように修飾され得る。

【0045】

本発明はまた、本発明の核酸またはタンパク質を含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は、真核細胞、例えば、植物、動物、菌類もしくは藻類であってもよく、または原核細胞、例えば、細菌もしくは原生動物であってもよい。宿主細胞は、培養細胞または初代細胞であってもよく、すなわち、生物、例えばヒトから直接単離されてもよい。宿主細胞は、付着Ｔ細胞または懸濁細胞、すなわち、懸濁液中で増殖する細胞であってもよい。組換えＴＣＲ、ポリペプチド、またはタンパク質を産生する目的で、宿主細胞は、好ましくは、哺乳動物細胞である。最も好ましくは、宿主細胞はヒト細胞である。宿主細胞は、いずれの細胞タイプであってよく、いずれの組織タイプ由来であってよく、およびいずれの発生段階であってよいが、宿主細胞は、好ましくは、末梢血白血球（ＰＢＬ）または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。より好ましくは、宿主細胞は、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体、特に、ヒトＴ細胞である。Ｔ細胞は、培養Ｔ細胞、例えば初代Ｔ細胞などのＴ細胞、または培養Ｔ細胞株、例えばＪｕｒｋａｔ、ＳｕｐＴｌなど由来のＴ細胞、または哺乳動物から得られるＴ細胞であり得て、好ましくは、ヒト患者由来のＴ細胞またはＴ細胞前駆体である。Ｔ細胞は、血液、骨髄、リンパ節、胸腺、または他の組織もしくは体液などの多数の供給源から得ることができる。Ｔ細胞はまた、濃縮されても精製されていてもよい。好ましくは、Ｔ細胞はヒトＴ細胞である。より好ましくは、Ｔ細胞は、ヒト、例えばヒト患者から単離されたＴ細胞である。Ｔ細胞は、任意のタイプのＴ細胞であってよく、かつ任意の発生段階であってよく、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、例えば、Ｔｈ１およびＴｈ２細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞 (例えば、細胞傷害性Ｔ細胞)、腫瘍浸潤細胞 （ＴＩＬ）、エフェクター細胞、セントラルエフェクター細胞、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞など、好ましくはセントラルメモリーＴ細胞が含まれるが、これらに限定されない。

【0046】

好ましくは、宿主細胞は、ヒトＣＤ４－陽性Ｔ細胞であるか、ここで、本発明のＴＣＲコンストラクトは、ＭＨＣ ＩＩエピトープに限定され、またはヒトＣＤ８－陽性Ｔ細胞であり、ここで、本発明のＴＣＲコンストラクトは、ＭＨＣ Ｉエピトープに限定される。

【0047】

本発明はまた、
ａ)ヒトＭＨＣと複合体を形成しているＮＹ－ＥＳＯ－１由来のエピトープに特異的に結合することができる、本発明のＴＣＲコンストラクトをコードする、ヒトＴ細胞における発現に適する核酸、好ましくは発現ベクター、または
ｂ）ヒトＭＨＣと複合体を形成しているＮＹ－ＥＳＯ－１由来のエピトープに特異的に結合することができる、本発明のＴＣＲコンストラクトを含むタンパク質、または
ｃ）ヒトＭＨＣと複合体を形成しているＮＹ－ＥＳＯ－１由来のエピトープに特異的に結合することができるＴＣＲコンストラクトを発現する、本発明の宿主細胞、例えば、ヒトＴ細胞
を含む、医薬組成物を提供する。

【0048】

好ましい態様において、医薬組成物に用いられる本発明のＴＣＲコンストラクトは、本明細書に記載されるように、ＨＬＡ－ＤＲ４に限定されるエピトープを認識することができるＴＣＲコンストラクトである。

【0049】

あるいは、ＴＣＲコンストラクトは、本明細書に記載されるように、ＨＬＡ－Ａ０２に限定されるエピトープを認識することができる本発明のＴＣＲコンストラクトである。

【0050】

本発明はまた、好ましくは、医薬における使用のための、特に、ヒト患者の処置のための、第一の構成部分として、
ａ)ヒトＭＨＣ ＩＩと複合体を形成している所定の抗原由来のエピトープに特異的に結合することができるＴＣＲコンストラクトをコードする核酸、好ましくは発現ベクター、または
ｂ）ヒトＭＨＣ ＩＩと複合体を形成している所定の抗原由来のエピトープに特異的に結合することができるＴＣＲコンストラクトを含むタンパク質、または
ｃ）ヒトＭＨＣ ＩＩと複合体を形成している所定の抗原由来のエピトープに特異的に結合することができるＴＣＲコンストラクトを発現する宿主細胞、
および
ｉ）ヒトＭＨＣ Ｉと複合体を形成している該所定の抗原由来のエピトープに特異的に結合することができるＴＣＲコンストラクトをコードする核酸、好ましくは発現ベクター、または
ｉｉ）ヒトＭＨＣ Ｉと複合体を形成している該所定の抗原由来のエピトープに特異的に結合することができるＴＣＲコンストラクトを含むタンパク質、または
ｉｉｉ）ヒトＭＨＣ Ｉと複合体を形成している該所定の抗原由来のエピトープに特異的に結合することができるＴＣＲコンストラクトを発現する宿主細胞
を含む、キットを提供する。

【0051】

該所定の抗原は、好ましくは、ＮＹ－ＥＳＯ－１などの癌－精巣－抗原を含む群から選択される腫瘍関連抗原または腫瘍特異的抗原である。特に、エピトープは、それぞれ配列番号２１(ＨＬＡ－ＤＲ４－制限)および１０３(ＨＬＡ－Ａ０２－制限)のエピトープである。あるいは、抗原は、体細胞突然変異抗原、ウイルス抗原、腫瘍駆動抗原、腫瘍関連抗原、分化抗原、例えば癌－精巣抗原であり得る。好ましくは、ＴＣＲコンストラクトは、上記のようなヒトＴＣＲ、本質的にヒトＴＣＲであるか、またはヒトＴＣＲに由来する、例えば、以下に記載のヒト化マウスに由来するものである。

【0052】

これまでは、養子Ｔ細胞のヒトへの移入は、専らＣＤ８^＋またはＣＤ４^＋Ｔ細胞のいずれかの投与に焦点を当てていた。しかしながら、本発明者らは、所定の腫瘍関連抗原であるＮＹ－ＥＳＯ－１に特異的なＴＣＲコンストラクト（それは、２つの細胞型の結合を可能にする）を用いてＣＤ８^＋およびＣＤ４^＋Ｔ細胞の両方の移入を含むヒトにおける養子Ｔ細胞療法を実施する手段を提供している。あるいは、該ＴＣＲコンストラクトをコードする核酸またはそれぞれのタンパク質もまた、患者の内在性Ｔ細胞に対して必要な特異性を移送するために用いることができる。ＣＤ４＋細胞は、例えば、ＩＦＮ－γおよびＩＬ－２などのサイトカインの分泌により、ＣＤ８＋細胞の腫瘍への動員および細胞溶解機能を促進し得る。これにより、腫瘍細胞のより効率的な排除、および緩解、または、好ましくは、腫瘍の排除が可能となる。好ましくは、再発はない。

【0053】

特に、本発明は、
ａ)ヒトＨＬＡ－ＤＲ４と複合体を形成しているＮＹ－ＥＳＯ－１由来のエピトープに特異的に結合することができ、かつ、好ましくは、配列番号１～１８のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ３領域を含む、本発明のＴＣＲコンストラクトをコードする核酸、好ましくは、ヒトＴ細胞における発現に適する発現ベクター、
ｂ）ヒトＨＬＡ－ＤＲ４と複合体を形成しているＮＹ－ＥＳＯ－１由来のエピトープに特異的に結合することができ、かつ、好ましくは、配列番号１～１８のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ３領域を含む、本発明のＴＣＲコンストラクトを含むタンパク質、または
ｃ）ヒトＨＬＡ－ＤＲ４と複合体を形成しているＮＹ－ＥＳＯ－１由来のエピトープに特異的に結合することができ、かつ、好ましくは、配列番号１～１８のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ３領域を含む、本発明のＴＣＲコンストラクトを発現する宿主細胞、例えば、ヒトＴ細胞
を含む、医薬組成物を含む、上記のキットを提供する。

【0054】

該キットは、好ましくは、第二の構成部分として、
ｉ）ヒトＭＨＣ Ｉと複合体を形成している該所定の抗原由来のエピトープに特異的に結合することができるＴＣＲコンストラクトであって、例えば、好ましくは、配列番号１９または２０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ３領域を含む本発明のＴＣＲコンストラクト、をコードする核酸、好ましくは発現ベクター、または
ｉｉ）ヒトＭＨＣ Ｉと複合体を形成している該所定の抗原由来のエピトープに特異的に結合することができるＴＣＲコンストラクトであって、例えば、好ましくは、配列番号１９または２０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ３領域を含む本発明のＴＣＲコンストラクト、を含むタンパク質、または
ｉｉｉ） ヒトＭＨＣ Ｉと複合体を形成している該所定の抗原由来のエピトープに特異的に結合することができるＴＣＲコンストラクトであって、例えば、好ましくは、配列番号１９または２０のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ３領域を含む本発明のＴＣＲコンストラクト、を発現する宿主細胞
を含む、医薬組成物を含む。

【0055】

本発明のキットの構成部分(複数)は、同時投与または任意の順での投与のために製剤され得る。該構成部分はまた、反復投与用であってもよい。Tran ら(Science, 2014 May 9;344(6184)：641－5) は、可能な投与レジメンを記載している。

【0056】

本発明に有用な薬学的に許容される担体または希釈剤の例には、ＳＰＧＡなどの安定化剤、炭水化物 (例えば、ソルビトール、マンニトール、デンプン、スクロース、グルコース、デキストラン)、アルブミンもしくはカゼインなどのタンパク質、ウシ血清もしくはスキムミルクなどのタンパク質含有薬剤、および緩衝液 (例えば、リン酸緩衝生理食塩水などのリン酸緩衝液）が含まれる。

【0057】

本発明の医薬組成物または本発明のキットは、疾患、例えば増殖性疾患、感染性疾患またはウイルス性疾患の診断、予防および／または処置における使用を目的とし得る。疾患は、好ましくは、腫瘍疾患、例えば良性または悪性腫瘍疾患である。好ましい態様において、増殖細胞または腫瘍は、ＮＹ－ＥＳＯ－１を発現し、ＴＣＲコンストラクトは、ＮＹ－ＥＳＯ－１由来の少なくとも１つのエピトープを認識することができる。好ましくは、疾患は処置される。疾患に罹患するリスクの低下、好ましくは、処置対象のリスクが比較集団において正常レベル以下に低下すること、好ましくは、リスクが、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％または少なくとも７５％、または１００％低下することもまた、疾患の予防と考えられる。

【0058】

本発明はまた、本発明の核酸、タンパク質または宿主細胞を投与することを含む、上記に特記された疾患、特に腫瘍または腫瘍疾患に罹患している対象の処置法を提供する。好ましくは、対象は、かかる処置を必要とする対象、すなわち患者である。好ましい態様において、対象は、腫瘍または腫瘍疾患に罹患している哺乳動物対象、好ましくはヒト患者である。活性薬剤は、有効量で投与される。

【0059】

本明細書の文脈中用語“腫瘍”または“腫瘍疾患”としては、黒色腫、肝細胞癌、肝内および肝外の胆管細胞癌、扁平上皮癌、頭部、頸部、肺もしくは食道の腺癌ならびに未分化癌腫、結腸直腸癌、軟骨肉腫、骨肉腫、メドルロプラズマ、神経芽腫、頭頸部の非扁平上皮癌、卵巣腫瘍、リンパ腫、急性および慢性リンパ性白血病、急性および慢性骨髄性白血病、膀胱癌腫、前立腺癌腫、膵臓腺癌、乳癌および胃癌から選択される疾患が記載される。ＮＹ－ＥＳＯ－１を発現する腫瘍は、好ましくは、黒色腫、肺癌、滑膜肉腫ならびに頭頸部癌、食道癌および膀胱癌から選択される。

【0060】

本発明の１つの好ましい医薬用途は、免疫療法、好ましくは養子Ｔ細胞療法に関する。本発明の製品および方法は、特に、養子Ｔ細胞療法との関係において有用である。本発明の化合物の投与は、例えば、患者への投与、例えば、該患者への本発明のＴ細胞の注入を含み得る。好ましくは、そのようなＴ細胞は、本発明の核酸を用いてインビトロで形質導入された患者の自己Ｔ細胞である。

【0061】

あるいは、患者はまた、Ｔ細胞のインビボ形質導入のために、本発明の核酸、特に発現ベクターを投与され得る。

【0062】

本発明のタンパク質ＴＣＲコンストラクトはまた、例えば、対象がＮＹ－ＥＳＯ－１を発現するかどうか、特に、配列番号２１のエピトープを発現するかどうかを調べるための診断目的に使用することもできる。この目的のために、かかるコンストラクトは、好ましくは、検出を容易にするために標識される。好ましくは、ＨＬＡ－ＤＲ４上に該エピトープを提示する患者は、本発明の養子Ｔ細胞療法によって処置される。

【0063】

本発明はまた、ヒトＭＨＣと複合体を形成しているＮＹ－ＥＳＯ－１由来のエピトープに特異的に結合することができるＴＣＲコンストラクトをコードする発現ベクターを好適な宿主細胞、好ましくは患者から単離されたヒトＴ細胞に導入することを含む、本発明の宿主細胞の製造方法に関する。

【0064】

本発明は、添付の図面および配列表を参照して、以下の実施例においてさらに説明されるが、それらに限定されることはない。本発明の目的に関して、本明細書中に引用される全ての文献は、その内容全体が引用により本明細書中に包含される。

【図面の簡単な説明】

【0065】

【図1】図１．ＡＢａｂＤＩＩマウス由来のＮＹ－ＥＳＯ１５７－特異的ＴＣＲ－ＥＳＯと、患者由来のＴＣＲ １Ｇ４との機能比較。（ａ）ヒトドナー由来のＰＢＭＣを、ＡＢａｂＤＩＩ由来のＴＣＲ－ＥＳＯまたはヒト由来のＴＣＲ １Ｇ４で形質導入し、ＮＹ－ＥＳＯ１５７－ＨＬＡ－Ａ２特異的多量体で染色した。ＣＤ３陽性細胞でゲート(gated on CD3+cells)。（ｂ）Ｔ２細胞に、ＮＹ－ＥＳＯ１５７天然ペプチドの増加量をパルスし、ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞と共培養した。（ｃ）異なる腫瘍細胞株 (ＳＫ.Ｍｅｌ３７： ＨＬＡ－Ａ２＋／ＮＹ－ＥＳＯ＋、ＳＫ.Ｍｅｌ２９.ＭｉＧ： ＨＬＡ－Ａ２＋／ＮＹ－ＥＳＯ－、ＳＫ.Ｍｅｌ２９.ＭｉＧ.ＮＹ－ＥＳＯ： ＨＬＡ－Ａ２＋／ＮＹ－ＥＳＯ＋、Ｍｅｌ３２４： ＨＬＡ－Ａ２＋／ＮＹ－ＥＳＯ－、Ｍｅｌ２９５： ＨＬＡ－Ａ２＋／ＮＹ－ＥＳＯ＋)との共培養後のＴＣＲ形質導入Ｔ細胞によるＩＦＮγ産生。ｂおよびｃのグラフは、アッセイ内２回測定の平均 ± 標準偏差を示す。

【図2】図２．ＡＢａｂＤＲ４マウスは、マウスＩ－Ｅの非抗原結合ドメインに融合した、ＴＣＲαβ遺伝子座全体およびヒトＭＨＣ クラスＩＩ分子 ＨＬＡ－ＤＲ４のトランスジェニックである。ＡＢａｂＤＲ４マウスは、マウスＴＣＲおよびマウスＭＨＣクラスＩＩ分子を欠損している。従って、ＡＢａｂＤＲ４は、ＨＬＡ－ＤＲ４拘束性を有するＣＤ４ Ｔ細胞と共に多様なヒトＴＣＲレパートリーを発現する。

【図3】図３．ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＤＮＡで免疫化したＡＢａｂＤＲ４マウス由来の末梢血白血球を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ダイナビーズ、無関係なペプチド、またはＮＹ－ＥＳＯ_{１１６－１３５}を用いて、一晩、再刺激して、ＩＦＮγについて細胞内染色した。プロットした細胞は、リンパ球およびＣＤ３陽性細胞でゲート。

【図4】図４．レトロウイルスＴＣＲ－ベクター ＭＰ７１の概略構造(Linnemann et al., 2013, Nature Medicine 19, 1534－1541)。

【図5】図５．ＴＣＲ欠損およびＣＤ４発現Ｊｕｒｋａｔ細胞を、ＮＹ－ＥＳＯ－１反応性ＴＣＲで形質導入し、ＮＹ－ＥＳＯ－１_{１１６－１３５}／ＤＲ４－テトラマー (ＮＹ－ＥＳＯ－１ Ｔｅｔ)または対照としてのＣＬＩＰ／ＤＲ４－テトラマー （ＣＬＩＰ Ｔｅｔ) で染色した。

【図6】図６．ヒトＰＢＭＣ由来のＴＣＲ形質導入または非形質導入 (対照) ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＨＬＡ－ＤＲ４および／またはＮＹ－ＥＳＯ－１を天然に発現する異なる黒色腫細胞株と共培養し、ＩＦＮγについて細胞内染色した。表示されたパーセンテージは、形質導入されたＣＤ４＋Ｔ細胞 (ＴＣＲ形質導入サンプル)または全ＣＤ４＋Ｔ細胞 (非形質導入サンプル)を意味する。２回測定の平均値＋標準偏差を示す。全ての黒色腫細胞株を、フローサイトメトリーにより、ＨＬＡ－ＤＲ発現について分析した。

【図7】図７．ＡＢａｂＤＲ４マウス由来であるが、ヒト由来ではないＮＹ－ＥＳＯ－１_{１１６－１３５}－反応性ＴＣＲは、ＨＬＡ－ＤＲ４／ＮＹ－ＥＳＯ－１を発現する黒色腫株を認識する。ＡＢａｂＤＲ４マウス (3600、5712、3598_2) または健常ヒトドナー(NY1、NY2、NY3)由来のＮＹ－ＥＳＯ－１_{１１６－１３５}－反応性ＴＣＲで形質導入されたＣＤ４ Ｔ細胞を、ＨＬＡ－ＤＲ４および／またはＮＹ－ＥＳＯ－１を発現するＩＦＮγで予め処理した黒色腫株と共培養した。ＮＹ－ＥＳＯ－１_{１１６－１３５} ペプチド (NY116)を陽性対照として加えた。一晩インキュベーション後、ＩＦＮγを上清中で測定した。アッセイ内２回測定の平均値＋標準偏差を示す。全ての黒色腫株を、フローサイトメトリーにより、ＨＬＡ－ＤＲ発現について分析した。

【図8】図８．ＮＹ－ＥＳＯ－１反応性ＴＣＲで形質導入されたＣＤ８およびＣＤ４ Ｔ細胞は、腫瘍細胞死に協同的(cooperative)効果を示す。ＴＣＲ－ＥＳＯ－形質導入ＣＤ８ Ｔ細胞および／またはＴＣＲ３５９８＿２－形質導入 ＣＤ４ Ｔ細胞を、ＮＹ－ＥＳＯ－１_{１１６－１３５}およびＮＹ－ＥＳＯ－１_{１５７－１６５} ペプチドを付加したＣＦＳＥ標識した黒色腫系統ＦＭ－３(低ＣＦＳＥ蛍光)および負荷していないＣＦＳＥ標識した黒色腫系統ＦＭ－３(高ＣＦＳＥ蛍光)と共に培養した。ＣＦＳＥ標識した標的および対照細胞を１：１の比で、各８ｘ１０^４細胞を培養した。ＴＣＲ形質導入ＣＤ８およびＣＤ４ Ｔ細胞数はそれぞれ、６ｘ１０^４であった。一晩インキュベーション後、ＦＭ－３の細胞数をフローサイトメトリーにより測定した。（Ａ）ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞と共にインキュベート後のＦＭ－３細胞の代表的なヒストグラムを示す。数値は、ＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチドを負荷した ＦＭ－３細胞の割合を示す(小矢印)。（Ｂ）棒グラフは、Ａに示す通り、標的細胞を死滅させることによって測定したＴＣＲ形質導入ＣＤ４および／またはＣＤ８ Ｔ細胞の細胞傷害性を示す。アッセイ内２回測定の平均値＋標準偏差を示す。

【実施例】

【0066】

実施例
実施例１－ＡＢａｂＤＩＩマウスにおけるＮＹ－ＥＳＯ－１ _{１５７－１６５} に特異的なＨＬＡ－Ａ０２拘束性ヒトＴＣＲの作製
ＡＢａｂＤＩＩマウスを、Ｌｉら(2010、Nature Medicine 16、1029－1034)に記載の方法により作製した。ＮＹ－ＥＳＯ－１_{１５７－１６５}に特異的なバルクＣＤ８^＋集団を、Linnemannら(2013、Nature Medicine 19、1534－1541)に記載のプロトコールに従って、ワクチン接種したマウスから単離し、ＴＣＲ遺伝子捕捉により分析した。
例えば表２に示され、配列番号１８および１９に記載のＣＤＲ３配列による特徴付けられるＴＣＲ－ＥＳＯを作製した。
完全長コンストラクトのために最適化された配列を、配列番号１０６／１０７および配列番号１１０／１１１に提供する。配列番号１１２は、以下に使用される一本鎖核酸コンストラクトに対応する。

【0067】

実施例２－ＨＬＡ－Ａ０２拘束性ヒトＴＣＲの機能分析
実施例１で作製されたＡＢａｂＤＩＩマウス由来のＮＹ－ＥＳＯ_{１５７－１６５}特異的ＴＣＲ－ＥＳＯを、黒色腫患者由来のＴＣＲ １Ｇ４と比較した (Chen, et al., 2005, J. Exp. Med. 201, 1243－55)。両方のＴＣＲは、エピトープ１５７－１６５(配列番号１０３)を認識する。ＴＣＲは、ヒトドナーのＰＢＭＣ由来のヒトＴ細胞で発現された(図１ａ)。ＡＢａｂＤＩＩ由来のＴＣＲ－ＥＳＯで形質転換されたＴ細胞は、ヒト由来のＴＣＲ １Ｇ４で形質転換されたＴ細胞よりもペプチド負荷Ｔ２細胞の認識により抗原感受性の増加を示し、かつより高い最大ＩＦＮγレベルを誘導した(図１ｂ)。加えて、ＴＣＲ－ＥＳＯ形質導入ヒトＴ細胞は、１Ｇ４形質導入Ｔ細胞よりもＮＹ－ＥＳＯ発現ＨＬＡ－Ａ２^＋ 癌細胞との共培養後により多くのＩＦＮγを産生した(図１ｃ)。
ＡＢａｂＤＩＩ マウスから得られたＴＣＲは、驚くことに、ヒトドナーから単離されたＴＣＲと比較して優れた機能的活性を示した。

【0068】

実施例３－ＡＢａｂＤＲ４マウスにおける、ＨＬＡ－ＤＲ４拘束性のＮＹ－ＥＳＯ－１ _{１１６－１３５} に特異的なヒトＴＣＲの作製
ＮＹ－ＥＳＯ－１に対するＨＬＡ－ＤＲ４拘束性ＴＣＲを、ヒトＴＣＲ遺伝子座／ＨＬＡ－ＤＲＡ－ＩＥ／ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０１－ＩＥトランスジェニック(ＡＢａｂＤＲ４)マウスにおいて惹起した(図２)。これらのマウスは、ＨＬＡ－ＤＲＡ－ＩＥ／ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０４０１－ＩＥトランスジェニックマウス (Ito et al., 1996, J Exp Med 183(6)： 2635－2644)とヒトＴＣＲ遺伝子座トランスジェニックマウス (Li et al., 2010, Nat. Medicine 16(9)：1029－1034)とを交雑して作製された。このモデルの利点は、ＡＢａｂＤＲ４マウスにおけるＴ細胞が、多様なヒトＴＣＲレパートリーを発現するが、ヒトおよびマウス配列が互いに異なる領域においてヒト腫瘍抗原に対する免疫寛容機構の影響を受けないことである。本発明者らは、ＡＢａｂＤＲ４マウスをＮＹ－ＥＳＯ－１で免疫化すると、ヒトには見いだされない高親和性ＴＣＲが産生されることを見出した。ＨＬＡ－ＤＲ４－ＩＥが排他的なＭＨＣクラスＩＩ拘束性分子であるため、ＡＢａｂＤＲ４マウスの免疫化は、ＨＬＡ－ＤＲ４拘束性を有する免疫抗原を認識するＣＤ４＋Ｔ細胞を産生する。

【0069】

ＨＬＡ－ＤＲ４と結合したＮＹ－ＥＳＯ－１_{１１６－１３５} ペプチドに特異的なＴＣＲを、ＮＹ－ＥＳＯ－１_{１１６－１３５}ペプチドまたは完全長ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＤＮＡを用いてワクチン接種したＡＢａｂＤＲ４マウスから作製した。ＮＹ－ＥＳＯ－１_{１１６－１３５} に特異的なバルクＣＤ４＋集団を単離し、ＴＣＲ鎖を５’ＲＡＣＥ（5’ rapid amplification of cDNA；ｃＤＮＡ増幅法）により抽出した。図３は、ＩＦＮγの産生によって証明されるように、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ダイナビーズ、無関係のペプチドまたはＮＹ－ＥＳＯ_{１１６－１３５}を用いて一晩再刺激されたＡＢａｂＤＲ４マウス由来の末梢血白血球の比活性を示す。

【0070】

例えば、表１に示すように、配列番号１および１０、２および１１、３および１２、４および１３、５および１４、６および１５、７および１６、８および１７ならびに９および１８のＣＤＲ３配列により特徴づけられるＴＣＲを作製した。従って、本発明は、ＮＹ－ＥＳＯ－１に対するＨＬＡ－ＤＲ４拘束性ヒトＴＣＲを初めて提供する。

【0071】

完全長コンストラクトの最適化配列は、配列番号４０～４８／４９～５７および配列番号７６～８４／８５～９３に提供される。配列番号９４～１０２は、以下の実験において用いる一本鎖核酸コンストラクトに対応する。

【0072】

実施例４－ＨＬＡ－ＤＲ４拘束性ヒトＴＣＲの機能分析
単離したＴＣＲが、関連ペプチド／ＭＨＣ複合体への特異的結合を与えることを実証するために、ＴＣＲ欠損およびＣＤ４発現Ｊｕｒｋａｔ細胞に実施例３で調製したＮＹ－ＥＳＯ－１反応性ＴＣＲを導入し、ＮＹ－ＥＳＯ－１_{１１６－１３５}／ＤＲ４－テトラマー (ＮＹ－ＥＳＯ－１ Ｔｅｔ)または対照としてＣＬＩＰ／ＤＲ４－テトラマー (ＣＬＩＰ Ｔｅｔ)で染色した(図５に、ＴＣＲ３５９８、ＴＣＲ３６００およびＴＣＲ５４１２についてデータを示す)。特異性が確認された。

【0073】

単離されたＴＣＲはまた、ＮＹ－ＥＳＯ－１発現細胞に対する機能的活性を付与した。このことは、ＨＬＡ－ＤＲ４および／またはＮＹ－ＥＳＯ－１を天然に発現する種々の黒色腫細胞株と共培養したヒトＰＢＭＣ由来のＴＣＲ形質導入または非導入(対照) ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＩＦＮγの細胞内染色により示される (図６に、ＴＣＲ３５９８、ＴＣＲ３６００およびＴＣＲ５４１２についてのデータを示す)。

【0074】

ＴＣＲ５４１２導入により、ＩＦＮγ ＣＤ４＋細胞のより高い割合がもたらされた。従って、配列番号３および１２のＣＤＲ３配列を含むＴＣＲコンストラクトは、本発明において、とりわけ好ましい。

【0075】

実施例５－ＮＹ－ＥＳＯ－１エピトープに特異的なＣＤ４ ^＋ およびＣＤ８ ^＋ Ｔ細胞の組合せの養子Ｔ細胞移植
ＮＹ－ＥＳＯ－１に特異的なＭＨＣ ＩおよびＭＨＣ ＩＩ拘束性ＴＣＲの併用を、癌の養子Ｔ細胞療法のマウスモデルにおいて試験する。ＮＹ－ＥＳＯ－１およびＨＬＡ－Ａ２陽性腫瘍細胞株を、ＨＬＡ－ＤＲ４－ＩＥｘＲａｇ－／－マウスに移植し、ＭＨＣ Ｉ拘束性ＴＣＲを形質導入したマウスＣＤ８ Ｔ細胞またはＭＨＣ ＩＩ拘束性ＴＣＲもしくは両方の混合物を形質導入したマウスＣＤ４ Ｔ細胞のいずれかで処置する。レシピエントマウスを、腫瘍拒絶および再発について経時的に観察する。ＭＨＣ ＩおよびＭＨＣ ＩＩ拘束性ＴＣＲの両方を用いた処置の場合、再発しないと見込まれる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【配列表】

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