特許 6998404 標的ヌクレオチド配列の富化及び決定方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2021-12-22

(45)【発行日】2022-02-04

(54)【発明の名称】標的ヌクレオチド配列の富化及び決定方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/686 20180101AFI20220128BHJP

   C12Q 1/6876 20180101ALI20220128BHJP

   C12Q 1/6883 20180101ALI20220128BHJP

   C12Q 1/6886 20180101ALI20220128BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALI20220128BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20220128BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/686 Z ZNA

C12Q1/6876 Z

C12Q1/6883 Z

C12Q1/6886 Z

C12Q1/6869 Z

C12N15/12

【請求項の数】 59

(21)【出願番号】P 2019567770

(86)(22)【出願日】2017-08-01

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2020-03-19

(86)【国際出願番号】 CN2017095404

(87)【国際公開番号】W WO2019023924

(87)【国際公開日】2019-02-07

【審査請求日】2019-08-23

(73)【特許権者】

【識別番号】519307805

【氏名又は名称】深▲セン▼恒特基因有限公司

【氏名又は名称原語表記】ＨＥＬＩＴＥＣ ＬＩＭＩＴＥＤ

【住所又は居所原語表記】Ｒｏｏｍ ６Ａ，Ｂｕｉｌｄｉｎｇ Ｆ３，ＴＣＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅ－Ｃｉｔｙ，１００１ Ｚｈｏｎｇｓｈａｎｙｕａｎ Ｒｏａｄ，Ｘｉｌｉ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｎａｎｓｈａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ Ｓｈｅｎｚｈｅｎ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ ５１８０００ （ＣＮ）

(74)【代理人】

【識別番号】110001139

【氏名又は名称】ＳＫ特許業務法人

(74)【代理人】

【識別番号】100130328

【弁理士】

【氏名又は名称】奥野 彰彦

(74)【代理人】

【識別番号】100130672

【弁理士】

【氏名又は名称】伊藤 寛之

(72)【発明者】

【氏名】ジョン、ジュンリ

【審査官】佐久 敬

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１５－５１７３０７（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１６／１７６０９１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】NATURE MEDICINE，2014年11月10日，Vol. 20，pp. 1479-1484，ONLINE METHODS, Supplementary figures and tables

【文献】Nature Protocols,2011,Vol.6,No.7,p.1026-1036，Supplementary figures and table

【文献】Julia Sandberg，Massively parallel analysis of cells and nucleic acids，Doctoral Thesis in Biotechnology, Stockholm, Sweden 2011, p.1-71

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｑ

Ｃ１２Ｎ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

標的ヌクレオチド配列を含有する核酸テンプレートを含む核酸試料から、関心対象の遺伝子座を有する前記標的ヌクレオチド配列を富化する方法であって、
（ａ）第１の末端に二本鎖部分を有し、第２の末端に非二本鎖部分を有するオリゴヌクレオチドであるユニバーサルアダプターを、前記第１の末端によって前記核酸テンプレートにライゲートすることにより、ライゲートされた核酸を提供するステップと、
（ｂ）前記ライゲートされた核酸を、前記標的ヌクレオチド配列を含む第１の鎖、及び第２の鎖に解離させるステップと、
（ｃ）外部プライマーは、前記ライゲートされた核酸の第１の鎖中の前記標的ヌクレオチド配列の近傍にアニールするステップと、
（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼを用いて、前記外部プライマーを、前記ライゲートされた核酸の第１鎖の全長にわたって伸長させることにより、新生ＤＮＡ線形的増幅二本鎖を提供するステップと、
（ｅ）十分に高い温度で前記新生ＤＮＡ線形的増幅二本鎖を、前記ライゲートされた核酸の第１の鎖と一本鎖ＤＮＡ線形的増幅生成物に解離させるステップと、
（ｆ）ステップ（ｃ）～（ｅ）を繰り返して１つないしそれ以上のＤＮＡ線形的増幅サイクルを行うステップと、
（ｇ）前記標的ヌクレオチド配列のＰＣＲ増幅に十分な条件下で、前記一本鎖ＤＮＡ線形的増幅生成物をＤＮＡポリメラーゼ、ユニバーサルアダプタープライマー及び内部プライマーに接触させるステップであって、前記ユニバーサルアダプタープライマーは、前記一本鎖ＤＮＡ線形的増幅生成物における前記ユニバーサルアダプターの前記非二本鎖部分の相補的配列にアニールし、前記内部プライマーは、３'末端において、前記標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする配列を含み、かつ、前記関心対象の遺伝子座について、前記内部プライマーは前記外部プライマーに対してネストされたものであるステップと、
（ｈ）ステップ（ｇ）を繰り返して１つないしそれ以上のＰＣＲ増幅サイクルを行って、前記標的ヌクレオチド配列のアンプリコンを提供することにより、前記標的ヌクレオチド配列を富化するステップと、
を含む方法。

【請求項2】

前記標的ヌクレオチド配列の前記アンプリコンは、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）に使用される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記方法は、前記ライゲートされた核酸の第１の鎖に特異的にアニール可能な第１組の外部プライマー及び第１組の内部プライマーと、前記ライゲートされた核酸の第２の鎖に特異的にアニール可能な第２組の外部プライマー及び第２組の内部プライマーとを用いて、前記関心対象の遺伝子座を有する標的ヌクレオチド配列を富化することを含む、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記第１組の外部プライマー及び前記第２組の外部プライマーは、少なくとも１３ヌクレオチド長の第１の５'タグ配列を含み、かつ、前記第１組の内部プライマー及び前記第２組の内部プライマーは、少なくとも１３ヌクレオチド長の第２の５'タグ配列を含む、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記第１の５'タグ配列のＧＣ含有量は、前記核酸テンプレートのＧＣ含有量と実質的に同一である、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記方法は、複数組の外部プライマー及び内部プライマーを用いて、異なる関心対象の遺伝子座を有する複数の標的ヌクレオチド配列を富化することを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記複数の標的ヌクレオチド配列中の少なくとも２つは、前記核酸テンプレートの異なる鎖中に存在している、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記方法は、異なる関心対象の遺伝子座を２～５０００個有する複数の標的ヌクレオチド配列を富化することを含む、請求項６または７に記載の方法。

【請求項9】

ステップ（ｃ）～（ｅ）を２～１００サイクル繰り返す、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記外部プライマーは、前記内部プライマーよりも前記関心対象の遺伝子座から１～１００ヌクレオチド離れた領域にアニールする、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記外部プライマー及び／又は前記内部プライマーの少なくとも最後の１２のヌクレオチドは、前記核酸試料中に異なるアニーリング遺伝子座を２０個未満有する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記核酸テンプレートはゲノムＤＮＡである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記ゲノムＤＮＡは染色体ＤＮＡである、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記ゲノムＤＮＡはミトコンドリアＤＮＡ又はその他の染色体外ＤＮＡである、請求項１２に記載の方法。

【請求項15】

前記核酸テンプレートはエクソームＤＮＡである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記核酸テンプレートはｃＤＮＡである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記ｃＤＮＡは全ＲＮＡの逆転写によって得られるものである、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記ｃＤＮＡは、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はその他の非コードＲＮＡの逆転写によって得られるものである、請求項１６に記載の方法。

【請求項19】

前記核酸試料はゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡの両方を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記核酸テンプレートは無細胞ＤＮＡである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

前記核酸試料は血液試料に由来する、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記核酸試料は細胞又は組織試料に由来する、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

前記核酸試料は腫瘍生検試料に由来する、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記核酸試料はホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料に由来する、請求項２２または２３に記載の方法。

【請求項25】

前記関心対象の遺伝子座は染色体再編成に関連する、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記染色体再編成は染色体転座である、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記関心対象の遺伝子座は単一ヌクレオチド変異（ＳＮＶ）に関連する、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前記関心対象の遺伝子座は挿入欠失に関連する、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

前記関心対象の遺伝子座はスプライス変異に関連する、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記関心対象の遺伝子座はがんに関わる遺伝子中にある、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

前記関心対象の遺伝子座は免疫細胞受容体をコードする遺伝子中にある、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

前記関心対象の遺伝子座は遺伝性疾患に関わる遺伝子中にある、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

前記関心対象の遺伝子座はＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集のオフターゲット部位にある、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記核酸テンプレートは前記次世代シークエンシングに適したサイズに断片化される、請求項２～３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

前記方法は、ステップ（ａ）の前に前記核酸テンプレートに対して末端修復およびＡ－テーリングを行うことをさらに含む、請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

前記ユニバーサルアダプターの前記非二本鎖部分は、ブロッキング部分を有する３'末端を含む、請求項１～３５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項37】

前記ブロッキング部分はリバースヌクレオチドである、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

前記ブロッキング部分は、１つ又は複数のホスホロチオエート修飾を有するフラッピング状のヌクレオチドフラグメントである、請求項３６に記載の方法。

【請求項39】

前記ユニバーサルアダプターの前記非二本鎖部分は、縮重設計された核酸塩基を含有する分子バーコードを含む、請求項１～３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項40】

前記ユニバーサルアダプターの前記二本鎖部分は試料バーコードを含む、請求項１～３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

前記試料バーコードは前記ユニバーサルアダプターの第１の末端にある、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

前記試料バーコードは４～１３のヌクレオチドからなる、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

前記ユニバーサルアダプターの第１の末端には、ステップ（ｂ）～（ｆ）の間に残存ユニバーサルアダプターによる無差別プライミングを防止するために、十分に短い長さの一定の核酸塩基を含む、請求項１～４２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項44】

前記十分に高い温度は少なくとも９０℃である、請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

前記ライゲートされた核酸はステップ（ｂ）の前にクリーンアップ工程に供される、請求項１～４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項46】

前記ＤＮＡ線形的増幅生成物はステップ（ｇ）の前にクリーンアップ工程に供される、請求項１～４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項47】

前記ステップ（ｇ）を２～１００サイクル繰り返す、請求項１～４６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項48】

前記ユニバーサルアダプタープライマーの５'末端又は前記ユニバーサルアダプターは、前記ＮＧＳに用いられる第１のシークエンシングプライマーの配列と同一の又は相補的な配列を含む、請求項２に記載の方法。

【請求項49】

前記ステップ（ｇ）は、前記標的ヌクレオチド配列のＰＣＲ増幅に十分な条件下で、前記一本鎖ＤＮＡ線形的増幅生成物をＤＮＡポリメラーゼ、ユニバーサルアダプタープライマー、内部プライマー及びシークエンシングアダプタープライマーに接触させることを含み、前記シークエンシングアダプタープライマーは、３'末端において、前記標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする配列を含み、かつ、５'末端において、前記ＮＧＳに用いられる第２のシークエンシングプライマーの配列と同一の又は相補的な配列を含む、請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

核酸試料中に関心対象の遺伝子座を有する標的ヌクレオチド配列を決定する方法であって、前記核酸試料は核酸テンプレートを含み、前記核酸テンプレートは前記標的ヌクレオチド配列を含み、前記方法は、
（ｉ）請求項１～４９のいずれか一項に記載の方法により前記関心対象の遺伝子座を有する前記標的ヌクレオチド配列を富化するステップと、
（ｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列の前記アンプリコンに対して次世代シークエンシングを行うことにより、前記標的ヌクレオチド配列を提供するステップと、を含む方法。

【請求項51】

２～５０００個の異なる関心対象の遺伝子座を有する標的ヌクレオチド配列が同時に決定される、請求項５０に記載の方法。

【請求項52】

前記方法は、ステップ（ｉｉ）の前記次世代シークエンシングの前に、前記標的ヌクレオチド配列の前記アンプリコンを用いてシークエンシングライブラリーを作製することをさらに含む、請求項５０又は５１に記載の方法。

【請求項53】

核酸試料中の関心対象の遺伝子座における配列変異体を検出する方法であって、前記核酸試料は核酸テンプレートを含み、前記核酸テンプレートは前記関心対象の遺伝子座を有する標的ヌクレオチド配列を含み、前記方法は、
（１）請求項５０～５２のいずれか一項に記載の方法により前記関心対象の遺伝子座を有する前記標的配列を決定するステップと、
（２）前記標的ヌクレオチド配列中の前記配列変異体を検出するステップと、を含む方法。

【請求項54】

前記配列変異体は１：１００を超えない対立遺伝子頻度で存在している、請求項５３に記載の方法。

【請求項55】

前記配列変異体は生殖細胞系ＤＮＡに遺伝している、請求項５３または５４に記載の方法。

【請求項56】

前記配列変異体は体細胞突然変異又は染色体再編成である、請求項５４または５５に記載の方法。

【請求項57】

複数種の配列変異体が検出される、請求項５３～５５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項58】

前記複数種の配列変異体は、染色体再編成、スプライス変異、ＳＮＰ、欠失、挿入、コピー数多型（ＣＮＶ）、およびそれらの組み合わせから選択される、請求項５７に記載の方法。

【請求項59】

前記方法は、ｃＤＮＡ配列に基づく染色体再編成又はＣＮＶと、ｇＤＮＡ配列に基づく突然変異とを同時に検出する、請求項５３～５８のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ゲノミクス分野に属し、具体的には、ヌクレオチド配列の富化及び決定方法に関するものである。

【0002】

ＡＳＣＩＩフォーマットによる配列表の提出
以下、ＡＳＣＩＩフォーマットで提出する内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる：コンピュータ読み込み可能な形式（ＣＲＦ）の配列表（名称：７７６２５２０００１４０ＳＥＱＬＩＳＴ.ｔｘｔ、記録日：２０１７年７月２６日、サイズ：１７ＫＢ）。

【背景技術】

【0003】

次世代シークエンシング（ＮＧＳ）技術は、過去の１０年間にゲノミクス分野に変革をもたらした。各ＮＧＳランは、通常、シークエンシング実行毎に、数十万～数十億のＤＮＡテンプレートに関する数ギガバイトの配列情報を並行に生成する。現在、ヒトゲノム配列決定のコストは１０００ドルの基準になっている。ＮＧＳ技術の低コスト及び高スループットによって、核酸配列決定を臨床ツールとして使用することが可能になる。

【0004】

しかしながら、ＮＧＳ臨床適用に要求される所望のコスト、速度、分析感度及び精度を達成するには、未だ多くの課題が残っている。従来、主要なＮＧＳプラットフォームは、比較的短いリード（３５－７００ｂｐ）、比較的高い誤り率（~０.１－１５％）及びプラットフォーム依存のバイアスを有する。臨床試料、例えば生検試料やホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料では、少量の出発材料だけが提供される。まれな遺伝子変異を検出するには、１０００００×までのカバレッジ（coverage）が必要である場合がある。例えばＳ. Ｇｏｏｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ., Ｎａｔ. Ｒｅｖ. Ｇｅｎｅｔｉｃｓ （２０１６）, １７:３３３を参照されたい。

【0005】

標的化シークエンシングは、適切な幅及び深さのシークエンシングデータを提供することにより、臨床に関連する遺伝子変異の検出を可能にする。当該方法の肝心なステップは、シークエンシングの前に核酸試料（例えばゲノムＤＮＡ試料）中から選択的に標的領域を捕捉する標的富化（target enrichment）ということである。様々な既知の標的富化方法、例えば、ミクロドロップレットに基づくＰＣＲ、分子反転プローブ及びハイブリッド捕捉法では、いずれも数多くのインプットテンプレート、専門的な機器又はエサの設計、及び偏った配列カバレッジが必要である。Ｍａｍａｎｏｖａ ｅｔ ａｌ., Ｎａｔ. Ｍｅｔｈｏｄｓ （２０１０）, ７（２）: １１１を参照されたい。

【0006】

本明細書に記載のすべての刊行物、特許、特許出願及び公開された特許出願の開示内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、ヌクレオチド配列を富化して決定するための方法、組合物、キット及び分析システムを提供する。

【0008】

本願の１つの局面において、標的ヌクレオチド配列を含有する核酸テンプレートを含む核酸試料から、関心対象の遺伝子座を有する標的ヌクレオチド配列を富化する方法であって、（ａ）第１の末端に二本鎖部分を有し、第２の末端に非二本鎖部分を有するオリゴヌクレオチドであるユニバーサルアダプターを、第１の末端によって核酸テンプレートにライゲートすることにより、ライゲートされた核酸を提供するステップと、（ｂ）ライゲートされた核酸を、標的ヌクレオチド配列を含む第１の鎖、及び第２の鎖に解離させるステップと、（ｃ）外部プライマーをライゲートされた核酸の第１の鎖中の標的ヌクレオチド配列の近傍にアニールするステップと、（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼを用いて、外部プライマーを、ライゲートされた核酸の第１鎖の全長にわたって伸長させることにより、新生のプライマー伸長二本鎖を提供するステップと、（ｅ）十分に高い温度で新生のプライマー伸長二本鎖を、ライゲートされた核酸の第１の鎖と、一本鎖プライマー伸長生成物に解離させるステップと、（ｆ）ステップ（ｃ）～（ｅ）を繰り返して１つないしそれ以上のプライマー伸長サイクルを行うステップと、（ｇ）標的ヌクレオチド配列のＰＣＲ増幅に十分な条件下で、一本鎖プライマー伸長生成物をＤＮＡポリメラーゼ、ユニバーサルアダプタープライマー及び内部プライマーに接触させるステップであって、前記ユニバーサルアダプタープライマーは、一本鎖プライマー伸長生成物におけるユニバーサルアダプターの非二本鎖部分の相補的な配列にアニールし、前記内部プライマーは、３'末端において標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする配列を含み、かつ関心対象の遺伝子座について、前記内部プライマーは外部プライマーに対してネストされた（nested）ものであるステップと、（ｈ）ステップ（ｇ）を繰り返して１つないしそれ以上のサイクルのＰＣＲ増幅を行って、標的ヌクレオチド配列のアンプリコンを提供することにより、標的ヌクレオチド配列を富化するステップと、を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、標的ヌクレオチド配列のアンプリコンは次世代シークエンシング（ＮＧＳ）に使用される。

【0009】

上記いずれかの方法のいくつかの実施形態では、当該方法は、ライゲートされた核酸の第１の鎖に特異的にアニール可能な第１組の外部プライマー及び内部プライマーと、ライゲートされた核酸の第２の鎖に特異的にアニール可能な第２組の外部プライマー及び内部プライマーとを用いて、関心対象の遺伝子座を有する標的ヌクレオチド配列を富化することを含む。いくつかの実施形態では、第１組の外部プライマー及び第２組の外部プライマーは、少なくとも約１３ヌクレオチド長の第１の５'タグ配列を含み、かつ第１組の内部プライマー及び第２組の内部プライマーは、少なくとも約１３ヌクレオチド長の第２の５'タグ配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の５'タグ配列のＧＣ含有量は、核酸テンプレートのＧＣ含有量と実質的に類似している。

【0010】

上記いずれかの方法のいくつかの実施形態では、当該方法は、複数組の外部プライマー及び内部プライマーを用いて、異なる関心対象の遺伝子座を有する複数の標的ヌクレオチド配列を富化することを含む。いくつかの実施形態では、複数の標的ヌクレオチド配列中の少なくとも２つは、核酸テンプレートの異なる鎖中に存在している。いくつかの実施形態では、当該方法は、異なる関心対象の遺伝子座を約２～５０００個有する複数の標的ヌクレオチド配列を富化することを含む。

【0011】

上記いずれかの方法のいくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）～（ｅ）を約２～１００サイクル繰り返す。いくつかの実施形態では、外部プライマーは、内部プライマーよりも関心対象の遺伝子座から約１～１００ヌクレオチド離れた領域にアニールする。いくつかの実施形態では、外部プライマー及び／又は内部プライマーの少なくとも最後の１２のヌクレオチドは、核酸試料中に異なるアニーリング遺伝子座を約２０個未満有する。

【0012】

上記いずれかの方法のいくつかの実施形態では、核酸テンプレートはゲノムＤＮＡである。いくつかの実施形態では、ゲノムＤＮＡは染色体ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、ゲノムＤＮＡはミトコンドリアＤＮＡ又はその他の染色体外ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、核酸テンプレートはエクソームＤＮＡである。いくつかの実施形態では、核酸テンプレートはｃＤＮＡである。いくつかの実施形態では、全ＲＮＡの逆転写によってｃＤＮＡを得る。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はその他の非コードＲＮＡの逆転写によってｃＤＮＡを得る。いくつかの実施形態では、核酸試料はゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡの両方を含む。いくつかの実施形態では、核酸テンプレートは無細胞ＤＮＡである。

【0013】

上記いずれかの方法のいくつかの実施形態では、核酸試料は血液試料に由来する。いくつかの実施形態では、核酸試料は細胞又は組織試料に由来する。いくつかの実施形態では、核酸試料は腫瘍生検試料に由来する。いくつかの実施形態では、核酸試料はホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料に由来する。

【0014】

上記いずれかの方法のいくつかの実施形態では、関心対象の遺伝子座は染色体再編成に関連する。いくつかの実施形態では、染色体再編成は染色体転座である。いくつかの実施形態では、関心対象の遺伝子座は単一ヌクレオチド変異（ＳＮＶ）に関連する。いくつかの実施形態では、関心対象の遺伝子座は挿入または欠失に関連する。いくつかの実施形態では、関心対象の遺伝子座はスプライス変異に関連する。

【0015】

上記いずれかの方法のいくつかの実施形態では、関心対象の遺伝子座はがんに関わる遺伝子中にある。いくつかの実施形態では、関心対象の遺伝子座は免疫細胞受容体をコードする遺伝子中にある。いくつかの実施形態では、関心対象の遺伝子座は遺伝性疾患に関わる遺伝子中にある。いくつかの実施形態では、関心対象の遺伝子座はＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集のオフターゲット部位（例えば従来既知又は未知のオフターゲット部位）にある。

【0016】

上記いずれかの方法のいくつかの実施形態では、核酸テンプレートは次世代シークエンシングに適したサイズに断片化される。いくつかの実施形態では、当該方法は、ステップ（ａ）の前に核酸テンプレートに対して末端修復およびＡ－テーリングを行うことをさらに含む。

【0017】

上記いずれかの方法のいくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプターの非二本鎖部分は、ブロッキング部分を有する３'末端を含む。いくつかの実施形態では、ブロッキング部分は逆位ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ブロッキング部分は、１つ又は複数のホスホロチオエート修飾を有するフラッピング状のヌクレオチド（flapping nucleotides）フラグメントである。

【0018】

上記いずれかの方法のいくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプターの非二本鎖部分は、縮重設計（degenerately designed）された核酸塩基を含有する分子バーコードを含む。いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプターの二本鎖部分は試料バーコードを含む。いくつかの実施形態では、試料バーコードはユニバーサルアダプターの第１の末端にある。いくつかの実施形態では、試料バーコードは約４～１３のヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプターの第１の末端には、ステップ（ｂ）～（ｆ）の間に残存ユニバーサルアダプターによる無差別プライミング（promiscuous priming）を防止するために、十分に短い長さの一定の核酸塩基を含む。

【0019】

上記いずれかの方法のいくつかの実施形態では、十分に高い温度は少なくとも約９０℃である。いくつかの実施形態では、ライゲートされた核酸はステップ（ｂ）の前にクリーンアップ工程に供される。いくつかの実施形態では、プライマー伸長生成物はステップ（ｇ）の前にクリーンアップ工程に供される。いくつかの実施形態では、ステップ（ｇ）を約２～１００サイクル繰り返す。

【0020】

上記いずれかの方法のいくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプタープライマーの５'末端又はユニバーサルアダプターは、ＮＧＳに用いられる第１のシークエンシングプライマーの配列と同一の又は相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｇ）は、標的ヌクレオチド配列のＰＣＲ増幅に十分な条件下で、一本鎖プライマー伸長生成物をＤＮＡポリメラーゼ、ユニバーサルアダプタープライマー、内部プライマー及びシークエンシングアダプタープライマーに接触させることを含み、当該シークエンシングアダプタープライマーは、３'末端において、内部プライマーの配列と同一の配列を含み、かつ５'末端において、ＮＧＳに用いられる第２のシークエンシングプライマーの配列と同一の又は相補的な配列を含む。

【0021】

本願の１つの局面において、核酸試料中に関心対象の遺伝子座を有する標的ヌクレオチド配列を決定する方法であって、前記核酸試料は核酸テンプレートを含有する核酸試料を含み、前記核酸テンプレートは標的ヌクレオチド配列を含み、当該方法は、（ｉ）上記いずれかの方法により関心対象の遺伝子座を有する標的ヌクレオチド配列を富化するステップと、（ｉｉ）標的ヌクレオチド配列のアンプリコンに対して次世代シークエンシングを行うことにより、標的ヌクレオチド配列を提供するステップと、を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、約２～５０００個の異なる関心対象の遺伝子座を有する標的ヌクレオチド配列を同時に決定する。いくつかの実施形態では、当該方法は、ステップ（ｉｉ）の次世代シークエンシングの前に、標的ヌクレオチド配列のアンプリコンを用いてシークエンシングライブラリーを作製することをさらに含む。

【0022】

本願の別の局面において、核酸試料中の関心対象の遺伝子座での配列変異体を検出する方法であって、前記核酸試料は核酸テンプレートを含有する核酸試料を含み、前記核酸テンプレートは関心対象の遺伝子座を有する標的ヌクレオチド配列を含み、当該方法は、（１）上述の標的ヌクレオチド配列を決定するいずれかの方法により関心対象の遺伝子座を有する標的配列を決定するステップと、（２）標的ヌクレオチド配列中の配列変異体を検出するステップと、を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、配列変異体は約１：１００を超えない（例えば約１：１０００以下、１：１００００以下のいずれか又はより低い）対立遺伝子頻度で存在している。いくつかの実施形態では、配列変異体は生殖細胞系ＤＮＡの中で遺伝している。いくつかの実施形態では、配列変異体は体細胞突然変異又は染色体再編成である。いくつかの実施形態では、複数種の配列変異体を検出する。いくつかの実施形態では、複数種の配列変異体は、染色体再編成、スプライス変異、ＳＮＰ、欠失、挿入、コピー数多型（ＣＮＶ）、およびそれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、当該方法は、ｃＤＮＡ配列に基づく染色体再編成又はＣＮＶと、ｇＤＮＡ配列に基づく突然変異とを同時に検出する。

【0023】

本願の別の局面において、上述のいずれかの配列変異体検出方法を用いて、個体由来の核酸試料中の関心対象の遺伝子座における疾患に関連する配列変異体を検出することにより、疾患の診断を提供することを含む、個体の疾患を診断する方法を提供する。

【0024】

本願は、（ａ）第１の末端においてライゲート可能な二本鎖部分を含みかつ第２の末端において非二本鎖部分を含むオリゴヌクレオチドであるユニバーサルアダプターと、（ｂ）ユニバーサルアダプターの非二本鎖部分の相補的配列にアニール可能なユニバーサルアダプタープライマーと、（ｃ）外部プライマーと、（ｄ）関心対象の遺伝子座について、外部プライマーに対してネストされた内部プライマーと、を含む、キットをさらに提供する。いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプタープライマーの５'末端又はユニバーサルアダプターは、ＮＧＳプラットフォームと適合する第１のシークエンシングプライマーの配列と同一の又は相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、内部プライマーは、ＮＧＳプラットフォームと適合する第２のシークエンシングプライマーの配列と同一の又は相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、当該キットはさらに、３'末端に内部プライマーの配列と同一の配列を含みかつ５'末端にＮＧＳプラットフォームと適合する第２のシークエンシングプライマーの配列と同一の又は相補的な配列を含むシークエンシングアダプタープライマーを含む。いくつかの実施形態では、当該キットは複数組の外部プライマー及び内部プライマーを含む。

【0025】

上記いずれかのキットのいくつかの実施形態では、当該キットはがんの診断に用いられる。いくつかの実施形態では、がんは肺がん、乳がん又は大腸がんである。いくつかの実施形態では、関心対象の遺伝子座は、ＡＬＫ、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＨＲＡＳ、ＫＤＲ、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＭＥＴ、ＮＲＡＳ、ＮＴＲＫ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＥＮ、ＲＥＴ、ＲＯＳ１及びＴＰ５３から選ばれる遺伝子のうちのいずれか１つ又は複数にある。

【0026】

後述する具体的な実施形態及び特許請求の範囲によれば、本発明のこれらの局面及びその他の局面並びにメリットは明らかになる。本明細書に記載の各実施形態の特徴の１つ、いくつか又は全ては、各組み合わせが個々にかつ明確的に開示されるのと同様に、本発明のさらなる実施形態を形成するために組み合わせることができると理解されよう。

【図面の簡単な説明】

【0027】

【図1】標的ヌクレオチド配列の富化によってシークエンシングライブラリーを作製する例示的な方法の模式図である。

【図2】ターゲット遺伝子座を有する核酸テンプレートの二本鎖において標的ヌクレオチド配列を富化するために用いられる２組の例示的な外部プライマー及び内部プライマーを示す図である。

【図3】プライマー伸長サイクルにおける残存ユニバーサルアダプターによる潜在的な副産物を示す図である。

【図4】（ａ）は、従来で公開された標的富化のためのＡＭＰ方法を用いて得られたＥＧＦＲ遺伝子座を有するマッピングされたリードを示す図であり、（ｂ）は、本願の実施例１に記載の方法を用いて得られたＥＧＦＲ遺伝子座を有するマッピングされたリードを示す図である。

【図5】（ａ）は、実施例１に記載の方法及び５０ｎｇのインプットＤＮＡを用いて得られたＥＧＦＲ遺伝子座の全長における配列カバレッジ及び配列深度を示す図であり、（ｂ）は、実施例１に記載の方法及び５ｎｇのインプットＤＮＡを用いて得られたＥＧＦＲ遺伝子座の全長における配列カバレッジ及び配列深度を示す図である。

【図6】（ａ）～（ｂ）は、ＫＩＦ５Ｂエクソン１５ ｃ.１７２３とＲＥＴエクソン１２ ｃ. ２１３８の間のインフレーム遺伝子融合のＲＮＡに基づく検出を示す図であり、（ｃ）～（ｄ）は、ＥＭＬ４エクソン４ ｃ. ４６８とＡＬＫエクソン２０ ｃ. ３１７３の間の遺伝子融合のＲＮＡに基づく検出を示す図であり、（ｅ）～（ｆ）は、ＥＭＬ４エクソン１７ ｃ. １８８０とＡＬＫエクソン ２０ ｃ. ３１７３の間のインフレーム遺伝子融合のＲＮＡに基づく検出を示す図である。

【図7】（ａ）は、Ｘ３２－Ｐ７３２試料中のＥＭＬ４－ＡＬＫ遺伝子融合のＲＮＡに基づく検出を示す図であり、（ｂ）は、Ｘ３２－Ｐ７３２試料中のＫＲＡＳにおける突然変異のｇＤＮＡに基づく検出を示す図である。

【図8】（ａ）は、シークエンシングライブラリーＬ１７－００１５４～Ｌ１７－００１５９の全パネルカバレッジの統計を示す図であり、（ｂ）は、シークエンシングライブラリーＬ１７－００１６０～Ｌ１７－００１６５の全パネルカバレッジの統計を示す図であり、（ｃ）は、シークエンシングライブラリーＬ１７－００１６６～Ｌ１７－００１７１の全パネルカバレッジの統計を示す図であり、（ｄ）は、シークエンシングライブラリーＬ１７－００１７２～Ｌ１７－００１７７の全パネルカバレッジの統計を示す図である。

【図9】（ａ）は、シークエンシングライブラリーＬ１７－００１５４～Ｌ１７－００１５９由来のマッピングされたリードによるＫＲＡＳエクソン２へのカバレッジを示す図であり、（ｂ）は、シークエンシングライブラリーＬ１７－００１６０～Ｌ１７－００１６５由来のマッピングされたリードによるＫＲＡＳエクソン２へのカバレッジを示す図であり、（ｃ）は、シークエンシングライブラリーＬ１７－００１６６～Ｌ１７－００１７１由来のマッピングされたリードによるＫＲＡＳエクソン２へのカバレッジを示す図であり、（ｄ）は、シークエンシングライブラリーＬ１７－００１７２～Ｌ１７－００１７７由来のマッピングされたリードによるＫＲＡＳエクソン２へのカバレッジを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0028】

本願は、核酸テンプレートをユニバーサルアダプターにライゲートすること、プライマー伸長ステップ（又は線形的増幅（linear amplification）ステップ）を行い、次にネストされた標的特異的なプライマーを用いてＰＣＲ増幅ステップ（又は指数的増幅ステップ）を行うことを含む、１つないしそれ以上の関心対象の遺伝子座を有する標的ヌクレオチド配列の富化及び決定のための方法を提供する。本明細書に記載の方法は、インプット核酸試料を非常に少ない量で用いる場合でも、配列多様性が高められたシークエンシングライブラリーを効率よく構築することができる、改良された標的富化方法を提供する。本明細書に記載の方法のプライマー伸長ステップでは、標的ヌクレオチド配列を線形的に増幅することが可能であり、かつＰＣＲ増幅ステップでは、プライマー伸長生成物由来の標的ヌクレオチド配列を指数的で特異的に増幅することが可能である。従来、ネストされた標的特異的プライマーを用いて２段階のＰＣＲ増幅により標的核酸を富化するアンカード・マルチプレックスＰＣＲ（ＡＭＰ）が開発されている。例えば、国際ＰＣＴ出願の公開公報Ｎｏ.ＷＯ２０１５１１２９４８を参照されたい。しかしながら、ＡＭＰ法の２つの増幅ステップにおいてアンプリコンはいずれも指数的に増加しているので、増幅のバイアス及び誤差が広がり、富化効率及び正確度が損なわれる。本願は、本明細書に記載の方法により得られたデータを提供し、これらのデータによって、当該方法はＡＭＰ法よりも優れた効率、特異性及び感度を有することが証明されている。また、その他の標的富化方法に比べて、本明細書に記載の方法では、ＲＮＡに基づく配列変異体の検出とｇＤＮＡに基づく配列変異体の検出を同時に行うことが可能であり、かつより大きい数の目的遺伝子座に対して多重探索することが可能である。このような特性は、低品質の核酸を含む希少な臨床試料から疾患に関わる一般にはまれな遺伝子変異を費用効果よく、迅速かつ正確的に検出することが求められる本明細書に記載の方法の臨床への適用において特に望ましい。

【0029】

したがって、本願の１つの局面において、標的ヌクレオチド配列を含有する核酸テンプレートを含む核酸試料から、関心対象の遺伝子座を有する標的ヌクレオチド配列を富化する方法（例えば次世代シークエンシングに用いられる）であって、（ａ）第１の末端に二本鎖部分を有し、第２の末端に非二本鎖部分を有するオリゴヌクレオチドであるユニバーサルアダプターを、第１の末端によって核酸テンプレートにライゲートすることにより、ライゲートされた核酸を提供するステップと、（ｂ）ライゲートされた核酸を、標的ヌクレオチド配列を含む第１の鎖、及び第２の鎖に解離させるステップと、（ｃ）外部プライマーをライゲートされた核酸の第１の鎖中の標的ヌクレオチド配列の近傍にアニールするステップと、（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼを用いて、外部プライマーを、ライゲートされた核酸の第１鎖の全長にわたって伸長させることにより、新生のプライマー伸長二本鎖を提供するステップと、（ｅ）十分に高い温度で新生のプライマー伸長二本鎖を、ライゲートされた核酸の第１の鎖と、一本鎖プライマー伸長生成物に解離させるステップと、（ｆ）ステップ（ｃ）～（ｅ）を繰り返して１つないしそれ以上のプライマー伸長サイクルを行うステップと、（ｇ）標的ヌクレオチド配列のＰＣＲ増幅に十分な条件下で、一本鎖プライマー伸長生成物をＤＮＡポリメラーゼ、ユニバーサルアダプタープライマー及び内部プライマーに接触させるステップであって、前記ユニバーサルアダプタープライマーは、一本鎖プライマー伸長生成物におけるユニバーサルアダプターの非二本鎖部分の相補的な配列にアニールし、前記内部プライマーは、３'末端において標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする配列を含み、かつ、関心対象の遺伝子座について、前記内部プライマーは外部プライマーに対してネストされたものであるステップと、（ｈ）ステップ（ｇ）を繰り返して１つないしそれ以上のサイクルのＰＣＲ増幅を行って、標的ヌクレオチド配列のアンプリコンを提供することにより、標的ヌクレオチド配列を富化するステップと、を含む方法を提供する。

【0030】

本願の別の局面において、標的ヌクレオチド配列を含有する核酸テンプレートを含む核酸試料中に関心対象の遺伝子座を有する標的ヌクレオチド配列を決定する方法であって、（ａ）第１の末端に二本鎖部分を有し、第２の末端に非二本鎖部分を有するオリゴヌクレオチドであるユニバーサルアダプターを、第１の末端によって核酸テンプレートにライゲートすることにより、ライゲートされた核酸を提供するステップと、（ｂ）遺伝子座を含む各ライゲートされた核酸を標的ヌクレオチド配列を含む第１の鎖、及び第２の鎖に解離させるステップと、（ｃ）外部プライマーを、ライゲートされた核酸の第１の鎖中の標的ヌクレオチド配列の近傍にアニールするステップと、（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼを用いて、外部プライマーを、ライゲートされた核酸の第１鎖の全長にわたって伸長させることにより、新生のプライマー伸長二本鎖を提供するステップと、（ｅ）十分に高い温度で新生のプライマー伸長二本鎖を、ライゲートされた核酸の第１の鎖と、一本鎖プライマー伸長生成物に解離させるステップと、（ｆ）ステップ（ｃ）～（ｅ）を繰り返して１つないしそれ以上のプライマー伸長サイクルを行うステップと、（ｇ）標的ヌクレオチド配列のＰＣＲ増幅に十分な条件下で、一本鎖プライマー伸長生成物をＤＮＡポリメラーゼ、ユニバーサルアダプタープライマー及び内部プライマーに接触させるステップであって、前記ユニバーサルアダプタープライマーは、一本鎖プライマー伸長生成物におけるユニバーサルアダプターの非二本鎖部分の相補的な配列にアニールし、前記内部プライマーは、３'末端において標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする配列を含み、かつ、関心対象の遺伝子座について、前記内部プライマーは外部プライマーに対してネストされたものであるステップと、（ｈ）ステップ（ｇ）を繰り返して１つないしそれ以上のサイクルのＰＣＲ増幅を行って、標的ヌクレオチド配列のアンプリコンを提供するステップと、（ｉ）標的ヌクレオチド配列のアンプリコンの次世代シークエンシングを行うことにより、標的ヌクレオチド配列を提供するステップと、を含む方法を提供する。

【0031】

本願はさらに、シークエンシングライブラリーの作製方法、配列変異体の検出方法、および疾患の診断及び治療方法、並びにこれらの方法に用いられる組成物、キット、製品及び分析ソフトウェアを提供する。

【0032】

Ｉ．定義
本明細書において互換的に用いられる「ポリヌクレオチド」又は「核酸」とは、任意の長さのヌクレオチドポリマーを指し、かつＤＮＡとＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド又は塩基、及び／又はそれらの類似体であってもよく、ＤＮＡやＲＮＡポリメラーゼによってポリマーに組み込まれることができる任意の基質であってもよい。ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体を含んでもよい。

【0033】

本明細書に用いられる「オリゴヌクレオチド」とは、通常、短く、一般に一本鎖の、一般に合成されたポリヌクレオチドを指し、その長さが一般的に約２００ヌクレオチドを超えないが、必ずしもそうではない。技術用語「オリゴヌクレオチド」と「ポリヌクレオチド」は互いに排他的ではない。以上のポリヌクレオチドに関する説明は、オリゴヌクレオチドにおいても同様かつ完全に適用することができる。

【0034】

技術用語「３'」とは、一般にポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドにおいて、同一のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドにおける別の領域又は位置よりも下流の領域又は位置を指す。

【0035】

技術用語「５'」とは、一般にポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドにおいて、同一のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドにおける別の領域又は位置よりも上流の領域又は位置を指す。

【0036】

本明細書に用いられる「核酸テンプレート」とは、標的富化及び配列決定のための出発材料として用いられる核酸試料中に存在するポリヌクレオチドを指す。

【0037】

「鋳型核酸」とは、プライマー伸長反応又はＰＣＲ増幅反応においてテンプレートとして用いられるポリヌクレオチドを指す。鋳型核酸は、二本鎖又は一本鎖であってもよい。

【0038】

「関心対象の遺伝子座」とは、研究者が関心を持つポリヌクレオチド、例えば遺伝子又は遺伝子融合産物の断片、を指す。遺伝子座は、単一ヌクレオチドを含む任意の数のヌクレオチドを有してもよい。遺伝子座は１つないしそれ以上の異なる配列と関連することができる。

【0039】

「関心対象の遺伝子座を有する標的ヌクレオチド配列」とは、関心対象の遺伝子座を含むか、又は関心対象の遺伝子座に含まれるポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を指す。標的ヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチドのプラス鎖又はマイナス鎖における配列であってもい。ポリヌクレオチドは、関心対象の遺伝子座よりも長いものであっても短いものであってもよい。

【0040】

例えば、第１の核酸又はプライマーの少なくとも２つの連続的な塩基が逆平行で結合できるか、又は第２の核酸の少なくとも１つのサブ配列とハイブリダイズして二本鎖を形成する場合、核酸又はプライマーは別の核酸と「相補的」であるといえる。いくつかの実施形態では、相補的とは、２つの所定のポリヌクレオチド又はヌクレオチド配列が互いにアニールする場合に、ＤＮＡにおいてＡがＴと対を形成してＧがＣと対を形成し、そしてＲＮＡにおいてＧがＣと対を形成してＡがＵと対を形成するように、ヌクレオチド塩基Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ、及びＵの間の水素結合による塩基対形成選択性（preferences）を意味する。本明細書において用いられる「実質的に相補的」とは、核酸分子またはその一部（例えばプライマー）が、第２のヌクレオチド配列に対して、当該分子の全長又はその一部にわたって少なくとも９０％の相補性を有する（例えば９０％相補的、９５％相補的、９８％相補的、９９％相補的又は１００％相補的である）ことを意味する。本明細書において用いられる「実質的に同一」とは、核酸分子又はその一部が、第２のヌクレオチド配列に対して、当該分子の全長又はその一部にわたって少なくとも９０％のアイデンティティ（例えば９０％のアイデンティティ、９５％のアイデンティティ、９８％のアイデンティティ、９９％のアイデンティティ又は１００％のアイデンティティ）を有することを意味する。

【0041】

「プライマー」とは、通常、一般に遊離３'－ＯＨ基を有する短い一本鎖ポリヌクレオチドを指し、当該プライマーは、標的配列とハイブリダイズすることによって目的のターゲットに結合してターゲットと相補的であるポリヌクレオチドの重合を促進する。

【0042】

本明細書において互換的に用いられる「ハイブリダイズ」と「アニール」とは、１つないしそれ以上のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド基の塩基同士の水素結合によって安定化される複合体を形成するという反応を指す。水素結合はＷａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対形成、Ｈｏｏｇｓｔｅｉｎ結合又はその他のいかなる配列特異的態様によって生じ得る。

【0043】

本明細書において用いられる技術用語「特異的にハイブリダイズ」又は「特異的にアニール」とは、核酸と、相補的配列の核酸とをハイブリダイズすることを指す。本明細書において用いられる、核酸分子の一部は、別の核酸分子における相補的配列と特異的にハイブリダイズすることができる。すなわち、別の分子に「特異的にハイブリダイズする」ために、核酸配列の全長は必ずしもそのような配列の一部にハイブリダイズする必要がなく、例えば分子の５'末端にはハイブリダイズしていないヌクレオチドの配列が存在しながら、同一の分子の３'末端の配列が別の分子に特異的にハイブリダイズすることができる。

【0044】

本明細書において互換的に用いられるポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの「一部」又は「領域」とは、２つないそれ以上の塩基の連続的な配列である。その他のいくつかの実施形態では、１つの領域又は一部は、少なくとも約３、５、１０、１５、２０、２５のうちのいずれかの連続的なヌクレオチドである。

【0045】

本明細書において用いられる、標的核酸に対して特異的なプライマーのコンテキストにおいて用いられる「特異的」とは、プライマーが標的核酸にアニールして、標的核酸の増幅を媒介するが、試料中に存在する非標的配列にはアニールせず、非標的配列の増幅を媒介しないアニーリング温度が存在するような、プライマーとターゲットの間の相補性のレベルを意味する。

【0046】

「内部プライマー」及び対応する「外部プライマー」とは、ネストされた増幅反応（例えば第１のプライマー伸長反応、次いで関心対象の遺伝子座を含む標的ポリヌクレオチドで行われるポリメラーゼ連鎖反応）を行うために設計された２つのネストされた標的特異的プライマーを指す。関心対象の遺伝子座については、「内部プライマー」が「外部プライマー」に対して「ネスト」化されたものであるとは、内部プライマー及び外部プライマーが標的ポリヌクレオチドの同じ鎖に特異的にハイブリダイズして、かつ外部プライマーのハイブリダイズ部位が内部プライマーのハイブリダイズ部位よりも関心対象の遺伝子座から遠く離れていることを意味する。「１組の外部プライマー及び内部プライマー」とは、関心対象の遺伝子座のための、外部プライマーに対してネストされた１つないしそれ以上の内部プライマーを指す。例えば図１又は図２を参照されたい。

【0047】

本明細書において用いられる「アダプター」とは、ポリヌクレオチド断片にライゲート可能なオリゴヌクレオチドを指す。

【0048】

本明細書において用いられる「ライゲート」は２つのポリヌクレオチド（例えばアダプターとポリヌクレオチド断片）に関し、連続的な主鎖を有する比較的大きなポリヌクレオチドを形成するように、個々の２つのポリヌクレオチドが共有結合によってライゲートすることを意味する。

【0049】

本明細書において互換的に用いられる技術用語「変性」又は「解離」とは、核酸二本鎖を２つの一本鎖に単離させることを指す。

【0050】

「プライマー伸長」とは、核酸ポリメラーゼが、テンプレート特異的な形式（つまりプライマー伸長反応から生じる娘鎖が標的ヌクレオチド配列と相補的である）で標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするプライマーの３'末端に１つないしそれ以上のヌクレオチドを付加る分子反応を意味する。伸長は、プライマー３'末端に付加される１番目のヌクレオチドに関するのみならず、伸長されたプライマーからなるポリヌクレオチドの任意のさらなる伸長をも含んでいる。複数のプライマー伸長サイクルは、標的ヌクレオチド配列の線形的増幅につながる。「プライマー伸長二本鎖」とは、テンプレート鎖及び娘鎖を含むプライマー伸長反応の二本鎖産物を指す。「一本鎖プライマー伸長生成物」は具体的に、プライマー伸長反応から生じる娘鎖を指す。

【0051】

本明細書において用いられる「増幅」とは、一般に所望の配列を生成する２つ又はより多くのコピーのプロセスを指す。増幅反応の成分は、例えばプライマー、ポリヌクレオチドテンプレート、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、ｄＮＴＰなどを含むが、これらに制限されない。

【0052】

「ポリメラーゼ連鎖反応増幅」又は「ＰＣＲ増幅」とは、目的二本鎖ＤＮＡの特定の断片又はサブ配列を等比級数的に増幅する方法を指す。ＰＣＲは当業者によく知られている。例えば米国特許Ｎｏ. ４,６８３,１９５及び４,６８３,２０２、並びに、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ: Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ, Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ., ｅｄｓ, １９９０を参照されたい。ＰＣＲ増幅によって、標的ヌクレオチド配列の数は指数的に増加する。

【0053】

「増幅された産物」、「増幅産物」又は「アンプリコン」とは、ヌクレオチド配列において鋳型ヌクレオチド配列及び／又はその相補的配列に対応する特定の標的核酸鋳型鎖及び／又はその相補的配列の一部のコピーであるＰＣＲ増幅反応から得られたオリゴヌクレオチドを意味する。増幅産物はさらに、プライマーに対して特異的で、標的核酸及び／又はその相補体の一部である配列に隣接する配列を含みうる。本明細書に記載のアンプリコンは、その個々の鎖について言及することができるものの、一般的に二本鎖ＤＮＡであろう。

【0054】

「反応混合物」は成分（例えば１種又は複数種のポリペプチド、核酸及び／又はプライマー）の組み合わせであり、適切な条件下で、例えばプライマー伸長反応又はＰＣＲ増幅反応のような特定の反応を進めるように反応する。

【0055】

技術用語「富化」とは、処理前に前記試料中に最初に存在する核酸配列全体のレベルに対して、試料中の特定の核酸配列の相対的な量を増加させるプロセスを指す。したがって、富化ステップでは、例えば目的核酸配列の絶対コピー数などの量を直接増加させるのではなく、相対的割合や分率の増加量を提供する。富化ステップの後に、分析される試料は、富化されたまたは選択されたポリヌクレオチドと呼ぶことができる。

【0056】

本明細書において用いられる技術用語「ライブラリー」とは、核酸配列の集団を指す。

【0057】

技術用語「決定」、「検出」、「測定」、「評価」、「評定」、「アッセイ」及び「分析」は、本明細書において互換的に用いられて任意の形の測定を指すことができ、かつある元素の有無を確認することを含む。これらの用語は、定量的及び／又は定性的に決定することを含む。

【0058】

本明細書において互換的に用いられる「配列変異体」とは、参照配列と比較して目的配列における任意の配列変化を指す。参照配列は、野生型配列、又は目的配列との比較が意図される配列でありうる。配列変異体は、染色体再編成、コピー数多型（ＣＮＶ）、挿入または欠失、スプライス変異及び単一ヌクレオチド突然変異を含むが、これらに制限されない。配列変異体は、例えば置換、欠失、挿入、構造的再編成及び遺伝子操作による単一ヌクレオチドの変化、又は配列中の２以上のヌクレオチドの変化を含む。

【0059】

本明細書において用いられる技術用語「単一ヌクレオチド変異」又はその略「ＳＮＶ」とは、ゲノム配列中に特定の位置における単一ヌクレオチドが変化することを意味する。選択し得る対立遺伝子が集団にある頻度（例えば集団において少なくとも１％）で存在する場合、ＳＮＶは「一塩基多型」又は「ＳＮＰ」とも呼ばれる

【0060】

本明細書に記載の本発明の局面及び実施形態は、「...からなる」及び／又は「実質的に...からなる」局面及び実施形態を含むことが理解されよう。

【0061】

特に説明がない限り、本明細書において用いられる単数形「１つの」、「１種の」、及び「当該」は複数形を含む。

【0062】

当業者に理解されるように、本明細書に記載の「約」の値又はパラメータは、当該値又はパラメータ自体に関する実施形態を含む（かつ記述する）。例えば、「約Ｘ」は、「Ｘ」に関する記述を含む。

【0063】

数値範囲を記述する場合、当該範囲の上限と下限の間の各中間値、および当該範囲内の任意の特定の値又は中間値は、本明細書の開示範囲に含まれることが理解されよう。所定の範囲が上限又は下限を含む場合、含まれる限界のいずれかを除く範囲も本明細書の開示に含まれる。

【0064】

特に説明がない限り、本発明は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ., Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ: Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （３ ｅｄ.）, Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ, Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ, Ｎ.Ｙ., ＵＳＡ （２００１）; 及び、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ., Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ, Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ, Ｉｎｃ., Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ, ＵＳＡ （１９９５）という参考文献において記述される標準的な技法を用いて行われる。これらの参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。

【0065】

ＩＩ．標的の富化方法
本願の一局面は、次世代シークエンシングに用いられる標的の富化方法に関し、つまり次世代シークエンシング技術により標的ヌクレオチド配列を決定する前に、１つないしそれ以上の関心対象の遺伝子座を有する標的ヌクレオチド配列を富化する方法である。

【0066】

いくつかの実施形態では、標的ヌクレオチド配列を含有する核酸テンプレートを含む核酸試料から、関心対象の遺伝子座を有する標的ヌクレオチド配列を富化する方法（例えば次世代シークエンシングに用いられる）であって、（ａ）第１の末端に二本鎖部分を有し、第２の末端に非二本鎖部分を有するオリゴヌクレオチドであるユニバーサルアダプターを、第１の末端によって核酸テンプレートにライゲートすることにより、ライゲートされた核酸を提供するステップと、（ｂ）ライゲートされた核酸を、標的ヌクレオチド配列（例えばプラス鎖配列又はマイナス鎖配列）を含む第１の鎖、及び第２の鎖に解離させるステップと、（ｃ）外部プライマーをライゲートされた核酸の第１の鎖中の標的ヌクレオチド配列の近傍にアニールするステップと、（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼを用いて、外部プライマーを、ライゲートされた核酸の第１鎖の全長にわたって伸長させることにより、新生のプライマー伸長二本鎖を提供するステップと、（ｅ）十分に高い温度で新生のプライマー伸長二本鎖を、ライゲートされた核酸の第１の鎖と、一本鎖プライマー伸長生成物に解離させるステップと、（ｆ）必要に応じてステップ（ｃ）～（ｅ）を繰り返して１つないしそれ以上のプライマー伸長サイクルを行うステップと、（ｇ）標的ヌクレオチド配列のＰＣＲ増幅に十分な条件下で、一本鎖プライマー伸長生成物をＤＮＡポリメラーゼ、ユニバーサルアダプタープライマー及び内部プライマーに接触させるステップであって、前記ユニバーサルアダプタープライマーは、一本鎖プライマー伸長生成物におけるユニバーサルアダプターの非二本鎖部分の相補的な配列にアニールし、前記内部プライマーは、３'末端において標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする配列を含み、かつ、関心対象の遺伝子座について、前記内部プライマーは外部プライマーに対してネストされたものであるステップと、（ｈ）ステップ（ｇ）を繰り返して１つないしそれ以上のサイクルのＰＣＲ増幅を行って、標的ヌクレオチド配列のアンプリコンを提供することにより、標的ヌクレオチド配列を富化するステップと、を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）～（ｅ）を繰り返して１つないしそれ以上のサイクルを行う。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）～（ｅ）を繰り返さない。

【0067】

いくつかの実施形態では、複数組の外部プライマー及び内部プライマーを用いて、関心対象の遺伝子座を有する標的ヌクレオチド配列を富化する。本明細書において用いられる「標的ヌクレオチド配列」とは、一般に二本鎖標的ポリヌクレオチドの配列を指し、プラス鎖配列又はマイナス鎖配列であってもよい。いくつかの実施形態では、当該方法は、ライゲートされた核酸の第１の鎖に特異的にアニールした第１組の外部プライマー及び内部プライマーと、ライゲートされた核酸の第２の鎖に特異的にアニールした第２組の外部プライマー及び内部プライマーとを用いて、関心対象の遺伝子座を有する標的ヌクレオチド配列を富化することを含む。いくつかの実施形態では、第１組の外部プライマー及び第２組の外部プライマーは、少なくとも約１３ヌクレオチド長（例えば少なくとも約１５、２０、２５のうちのいずれか又はより多くのヌクレオチド長）の第１の５'タグ配列を含み、かつ第１組の内部プライマー及び第２組の内部プライマーは、少なくとも約１３ヌクレオチド長（例えば少なくとも約１５、２０、２５のうちのいずれか又はより多くのヌクレオチド長）の第２の５'タグ配列を含む。外部プライマー中の５'タグ配列は、ＰＣＲ増幅産物及びプライマー二量体の形成を抑制でき、これにより線形的増幅（又はプライマー伸長）になる。いくつかの実施形態では、標的ヌクレオチド配列に対する一方向又は両方向に複数組の外部プライマー及び内部プライマーを用いることで、関心対象の遺伝子座にタイリングするアンプリコンを提供する。

【0068】

したがって、いくつかの実施形態では、標的ヌクレオチド配列を含有する核酸テンプレートを含む核酸試料から、関心対象の遺伝子座を有する標的ヌクレオチド配列を富化する方法（例えば次世代シークエンシングに用いられる）であって、（ａ）第１の末端に二本鎖部分を有し、第２の末端に非二本鎖部分を有するオリゴヌクレオチドであるユニバーサルアダプターを、第１の末端によって核酸テンプレートにライゲートすることにより、ライゲートされた核酸を提供するステップと、（ｂ）ライゲートされた核酸を標的ヌクレオチド配列のプラス鎖配列を含む第１の鎖、および標的ヌクレオチド配列のマイナス鎖配列を含む第２の鎖に解離させるステップと、（ｃ）第１の外部プライマーは、ライゲートされた核酸の第１の鎖中の標的ヌクレオチド配列のプラス鎖配列の近傍にアニールし、かつ第２の外部プライマーは、ライゲートされた核酸の第２の鎖中の標的ヌクレオチド配列のマイナス鎖配列の近傍にアニールするステップと、（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼを用いて、第１の外部プライマーを、ライゲートされた核酸の第１の鎖の全長に伸長させ、かつ第２の外部プライマーを、ライゲートされた核酸の第２の鎖の全長にわたって伸長させることにより、新生プライマー伸長二本鎖を提供するステップと、（ｅ）十分に高い温度で新生プライマー伸長二本鎖を、ライゲートされた核酸の第１の鎖及び第１の一本鎖プライマー伸長生成物と、当該核酸の第２の鎖及び第２の一本鎖プライマー伸長生成物に解離させるステップと、（ｆ）ステップ（ｃ）～（ｅ）を繰り返して１つないしそれ以上のプライマー伸長サイクルを行うステップと、（ｇ）標的ヌクレオチド配列及び相補的な標的ヌクレオチド配列のＰＣＲ増幅に十分な条件下で、第１の一本鎖プライマー伸長生成物及び第２の一本鎖プライマー伸長生成物を、ＤＮＡポリメラーゼ、ユニバーサルアダプタープライマー、第１の内部プライマー及び第２の内部プライマーに接触させるステップであって、ユニバーサルアダプタープライマーは第１の一本鎖プライマー伸長生成物及び第２の一本鎖プライマー伸長生成物におけるユニバーサルアダプターの非二本鎖部分の相補的配列にアニールし、第１の内部プライマーは３'末端において標的ヌクレオチド配列のプラス鎖配列に特異的にアニールする配列を含み、第２の内部プライマーは３'末端において標的ヌクレオチド配列のマイナス鎖配列に特異的にアニールする配列を含み、関心対象の遺伝子座について、第１の内部プライマーは第１の外部プライマーに対してネストされたものであり、かつ関心対象の遺伝子座について、第２の内部プライマーは第２の外部プライマーに対してネストされたものであるステップと、（ｈ）ステップ（ｇ）を繰り返して１つないしそれ以上のＰＣＲ増幅サイクルを行って、標的ヌクレオチド配列のプラス鎖配列及びマイナス鎖配列のアンプリコンを提供することにより、標的ヌクレオチド配列を富化するステップと、を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、第１組の外部プライマー及び第２組の外部プライマーは、少なくとも約１３ヌクレオチド長の第１の５'タグ配列を含み、かつ第１組の内部プライマー及び第２組の内部プライマーは、少なくとも約１３ヌクレオチド長の第２の５'タグ配列を含む。

【0069】

いくつかの実施形態では、当該方法は標的富化ステップの間に、ＮＧＳプラットフォームに対して特異的なシークエンシングプライマーと適合する配列を組み込む。いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプターの非二本鎖部分は、ＮＧＳプラットフォームの第１のシークエンシングプライマーの配列と同一の又は相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプタープライマーは５'末端に、ＮＧＳプラットフォームの第１のシークエンシングプライマーの配列と同一の又は相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、内部プライマーは５'末端において、ＮＧＳプラットフォームの第２のシークエンシングプライマーの配列と同一の又は相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｇ）つまりＰＣＲ増幅ステップは、標的ヌクレオチド配列のＰＣＲ増幅に十分な条件下で、一本鎖プライマー伸長生成物をＤＮＡポリメラーゼ、ユニバーサルアダプタープライマー、内部プライマー及びシークエンシングアダプタープライマーに接触させることを含み、当該シークエンシングアダプタープライマーは、３'末端において、内部プライマーの配列と同一の配列を含み、かつ５'末端において、第２のシークエンシングプライマーの配列と同一の又は相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、シークエンシングアダプタープライマーは試料バーコードを含む。いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプタープライマーは、シークエンシングアダプタープライマーの試料バーコードと同一の又は相補的な配列を有する試料バーコードを含む。

【0070】

したがって、いくつかの実施形態では、標的ヌクレオチド配列を含有する核酸テンプレートを含む核酸試料から、関心対象の遺伝子座を有する標的ヌクレオチド配列を富化する方法（例えば次世代シークエンシングに用いられる）方法であって、（ａ）第１の末端に二本鎖部分を有し、第２の末端に非二本鎖部分を有するオリゴヌクレオチドであるユニバーサルアダプターを、第１の末端によって核酸テンプレートにライゲートすることにより、ライゲートされた核酸を提供するステップと、（ｂ）ライゲートされた核酸を、標的ヌクレオチド配列（例えばプラス鎖配列又はマイナス鎖配列）を含む第１の鎖、及び第２の鎖に解離させるステップと、（ｃ）外部プライマーは、第１の鎖中の標的ヌクレオチド配列の近傍にアニールするステップと、（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼを用いて、外部プライマーを、ライゲートされた核酸の第１の鎖の全長にわたって伸長させることにより、新生プライマー伸長二本鎖を提供するステップと、（ｅ）十分に高い温度で新生プライマー伸長二本鎖を、ライゲートされた核酸の第１の鎖と一本鎖プライマー伸長生成物に解離させるステップと、（ｆ）ステップ（ｃ）～（ｅ）を繰り返して１つないしそれ以上（例えば約２～１００、約５～５０又は約１０～３０）のプライマー伸長サイクルを行うステップと、（ｇ）標的ヌクレオチド配列のＰＣＲ増幅に十分な条件下で、一本鎖プライマー伸長生成物をＤＮＡポリメラーゼ、ユニバーサルアダプタープライマー、内部プライマー及びシークエンシングアダプタープライマーに接触させるステップであって、当該ユニバーサルアダプタープライマーは、一本鎖プライマー伸長生成物におけるユニバーサルアダプターの非二本鎖部分の相補的配列にアニールし、内部プライマーは、３'末端において標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする配列を含み、且つ、関心対象の遺伝子座について、内部プライマーは外部プライマーに対してネストされたものであり、ユニバーサルアダプター（例えば非二本鎖部分又は二本鎖部分）及び／又はユニバーサルアダプタープライマーの５'末端には、ＮＧＳプラットフォームの第１のシークエンシングプライマーの配列と同一の又は相補的な配列を含み、当該シークエンシングアダプタープライマーは、３'末端において内部プライマーの配列と同一の配列を含み、かつ、５'末端においてＮＧＳプラットフォームの第２のシークエンシングプライマーの配列と同一の又は相補的な配列を含むステップと、（ｈ）ステップ（ｇ）を繰り返して１つないしそれ以上の（例えば約２～１００、約５～５０又は約１０～３０の）ＰＣＲ増幅サイクルを行って、標的ヌクレオチド配列のアンプリコンを提供することにより、標的ヌクレオチド配列を富化するステップと、を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、当該方法は、ライゲートされた核酸の第１の鎖に特異的にアニールした第１組の外部プライマー及び内部プライマーと、ライゲートされた核酸の第２の鎖に特異的にアニールした第２組の外部プライマー及び内部プライマーとを用いて、関心対象の遺伝子座を有する標的ヌクレオチド配列を富化することを含む。いくつかの実施形態では、第１組の外部プライマー及び第２組の外部プライマーは、少なくとも１３ヌクレオチド長の第１の５'タグ配列を含み、かつ第１組の内部プライマー及び第２組の内部プライマーは、少なくとも１３ヌクレオチド長の第２の５'タグ配列を含む。

【0071】

本明細書に記載の方法は、核酸試料から関心対象の遺伝子座を有する標的ヌクレオチド配列を富化するために利用でき、当該核酸試料は、標的ヌクレオチド配列を含有する任意の数の核酸テンプレートを含み、例えば標的ヌクレオチド配列を含有する核酸テンプレートを少なくとも約２、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、１０００、２０００、５０００、１００００のうちのいずれか又はより多く含む。本明細書に記載の方法は多重のものであってもよい。本明細書に記載の方法に適用される技術用語「多重」とは、複数組の外部及び内部プライマーを用いて、同じ反応において異なる関心対象の遺伝子座を少なくとも２つ有する標的ヌクレオチド配列を特異的に富化することを意味する。いくつかの実施形態では、複数組の外部及び内部プライマーはすべて１つの反応混合物中に存在し、例えば同じ反応混合物において複数の異なるアンプリコンを産生し得る。いくつかの実施形態では、複数の標的ヌクレオチド配列中の少なくとも２つは核酸テンプレートの異なる鎖中に存在している。

【0072】

いくつかの実施形態では、複数の異なる関心対象の遺伝子座（例えば少なくとも約２、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、１０００、１５００、２０００、５０００のうちのいずれか又はより多くの関心対象の遺伝子座）を有する標的ヌクレオチド配列は富化される。いくつかの実施形態では、約２～５０００個（例えば約２～１００個、５～２００個、１００～２０００個、２～２０００個、１０１～５０００個又は１５００～５０００個のうちのいずれか）の異なる関心対象の遺伝子座を有する標的配列は１つの反応において富化される。

【0073】

したがって、いくつかの実施形態では、標的ヌクレオチド配列を含有する核酸テンプレートを含む核酸試料から、異なる関心対象の遺伝子座を複数（例えば少なくとも約１０００、１５００、２０００又はより多く）有する標的ヌクレオチド配列を富化する方法（例えば次世代シークエンシングに用いられる）であって、（ａ）第１の末端に二本鎖部分を含みかつ第２の末端に非二本鎖部分を含むオリゴヌクレオチドであるユニバーサルアダプターを核酸テンプレートにライゲートすることにより、ライゲートされた核酸を提供するステップであって、各核酸テンプレートは、第１の末端によってユニバーサルアダプターにライゲートされているステップと、（ｂ）各ライゲートされた核酸を標的ヌクレオチド配列（例えばプラス鎖配列又はマイナス鎖配列）を含む第１の鎖、及び第２の鎖に解離させるステップと、（ｃ）外部プライマーは、第１の鎖中の各標的ヌクレオチド配列の近傍にアニールするステップと、（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼを用いて、外部プライマーを第１の鎖の全長にわたって伸長させることにより、新生プライマー伸長二本鎖を提供するステップと、（ｅ）十分に高い温度で新生プライマー伸長二本鎖を、第１の鎖と一本鎖プライマー伸長生成物に解離させるステップと、（ｆ）ステップ（ｃ）～（ｅ）を繰り返して１つないしそれ以上の（例えば約２～１００、約５～５０、又は約１０～３０の）プライマー伸長サイクルを行うステップと、（ｇ）標的ヌクレオチド配列のＰＣＲ増幅に十分な条件下で、一本鎖プライマー伸長生成物をＤＮＡポリメラーゼ、ユニバーサルアダプタープライマー及び内部プライマーに接触させるステップであって、前記ユニバーサルアダプタープライマーは、一本鎖プライマー伸長生成物におけるユニバーサルアダプターの非二本鎖部分の相補的配列にアニールし、各内部プライマーは、３'末端において標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする配列を含み、かつ、各関心対象の遺伝子座について、内部プライマーは外部プライマーに対してネストされたものであるステップと、（ｈ）ステップ（ｇ）を繰り返して１つないしそれ以上の（例えば約２～１００、約５～５０又は約１０～３０の）ＰＣＲ増幅サイクルを行って、標的ヌクレオチド配列のアンプリコンを提供することにより、標的ヌクレオチド配列を富化するステップと、を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、当該方法は、ライゲートされた核酸の第１の鎖に特異的にアニール可能な第１組の外部プライマー及び内部プライマーと、ライゲートされた核酸の第２の鎖に特異的にアニール可能な第２組の外部プライマー及び内部プライマーとを用いて、関心対象の遺伝子座を有する標的ヌクレオチド配列を富化することを含む。いくつかの実施形態では、第１組の外部プライマー及び第２組の外部プライマーは、少なくとも１３ヌクレオチド長の第１の５'タグ配列を含み、かつ第１組の内部プライマー及び第２組の内部プライマーは、少なくとも１３ヌクレオチド長の第２の５'タグ配列を含む。いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプタープライマーの５'末端又はユニバーサルアダプターは、ＮＧＳプラットフォームの第１のシークエンシングプライマーの配列と同一の又は相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、内部プライマーは、３'末端において標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールした配列を含み、かつ５'末端においてＮＧＳプラットフォームの第２のシークエンシングプライマーの配列と同一の又は相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｇ）は、標的ヌクレオチド配列のＰＣＲ増幅に十分な条件下で、一本鎖プライマー伸長生成物をＤＮＡポリメラーゼ、ユニバーサルアダプタープライマー、内部プライマー及びシークエンシングアダプタープライマーに接触させることを含む。

【0074】

いくつかの実施形態では、当該方法は高感度であり、例えば少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％のうちのいずれか又はより多くの標的ヌクレオチド配列が１つないしそれ以上の配列リードによって表される。いくつかの実施形態では、当該方法は高い特異性を有し、例えば少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％のうちのいずれか又はより多くのリード配列が所望の標的ヌクレオチド配列にマッピングされる。いくつかの実施形態では、当該方法は高い均一性を有する。いくつかの実施形態では、当該方法は高い再現性を有する。いくつかの実施形態では、当該方法は少量のインプット核酸試料を必要とし、例えば約５０ｎｇ以下、２５ｎｇ以下、１０ｎｇ以下、５ｎｇ以下、１ｎｇ以下のうちのいずれか又はより少ない核酸を必要とする。

【0075】

図１は、関心対象の遺伝子座を有する標的ヌクレオチド配列を富化する例示的な方法を示す模式図である。当該非制限的な例において、まず標的ヌクレオチド配列を含む核酸テンプレートをユニバーサルアダプターにライゲートし、核酸テンプレートの末端毎に１つのコピーをライゲートした。第１のプライマー伸長サイクルにおいて、外部プライマーはライゲートされた核酸の第１の鎖に特異的にアニールした。外部プライマーの設計方向に応じて、プラス鎖及び／又はマイナス鎖におけるアニーリング部位の上流又は下流にある配列が合成された。外部プライマープールもタイリングされるプライマー伸長生成物の提供のために使用可能である。新生一本鎖プライマー伸長生成物は３'末端に、ユニバーサルアダプターの一本鎖と相補的な全長配列を有する。次の各プライマー伸長サイクルにおいて、元のライゲートされた核酸鎖は、プライマー伸長のテンプレートとして働き続き、一本鎖プライマー伸長生成物の線形的増幅を可能にする。反対方向の各外部プライマーは、ＰＣＲ増幅産物の発生を抑制しかつライゲートされた核酸の線形的増幅を促進する同じ５'タグ配列を含む。次のＰＣＲ増幅サイクルにおいて、ユニバーサルアダプタープライマー及び内部プライマーは、プライマー伸長生成物又はそのＰＣＲ増幅産物の適切な鎖に特異的にアニールすることで、標的ヌクレオチド配列の指数的増幅を可能にする。反対方向の各内部プライマーは、プライマー二量体及び望ましくない副産物の発生を抑制する同じ５'タグ配列を含む。ＰＣＲ増幅サイクルは、シークエンシングプライマーと同一の又は相補的な配列を有するシークエンシングアダプタープライマーをさらに含み得る。ペアエンドシークエンシングについて、ユニバーサルアダプター又はユニバーサルアダプタープライマーは、リバースシークエンシングプライマーと同一の又は相補的な配列を有する５'部分を含みうる。これにより、ＮＧＳシークエンシングのために用意する標的ヌクレオチド配列のアンプリコンを含むシークエンシングライブラリーが得られる。

【0076】

本明細書に記載の方法によって製造された標的ヌクレオチド配列のアンプリコンを、様々方法により分析することができ、その方法は、核酸シークエンシング（例えばＳａｎｇｅｒシークエンシング又は次世代シークエンシング、本明細書において「ＮＧＳ」とも呼ばれる）、マイクロアレイ分析、定量的ＰＣＲ及びデジタルＰＣＲを含むが、これらに限定されない。

【0077】

ライゲーション
第１のステップとして、本明細書に記載の方法は、ユニバーサルアダプターを核酸試料中の１つないしそれ以上の核酸テンプレートにライゲートすることを含む。いくつかの実施形態では、核酸試料は、標的ヌクレオチド配列及び非標的ヌクレオチド配列の両方を含有する核酸テンプレートを含む。いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプターは核酸試料中の実質的にすべての核酸テンプレートにライゲートされている。いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプターは、標的ヌクレオチド配列を含む標的核酸テンプレート、及び標的ヌクレオチド配列を含まない非標的核酸テンプレートの両方にライゲートされている。

【0078】

ユニバーサルアダプターと核酸テンプレートとのライゲーションは、当技術分野において既知の任意の方法、例えば平滑末端ライゲーション又はＴＡライゲーションによって行うことができる。いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプターのライゲーションの前に、核酸テンプレートの末端を平滑にするために、試料中の核酸テンプレートを核酸末端修復に供する。末端修復は当技術分野において周知であり、関連キット及び／又は酵素は市販されている（例えば、ＮＥＢＮＥＸＴ（TM） Ｅｎｄ Ｒｅｐａｉｒ Ｍｏｄｕｌｅ, Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ; Ｉｐｓｗｉｃｈ, Ｍａｓｓ.）。

【0079】

いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプターのライゲーションの前に、試料中の核酸テンプレートは、リン酸化及び／又はアデニル化されうる。アデニル化は、核酸テンプレートの３'末端上でアデノシンオーバーハングを提供しうる。次に、３'チミジン（Ｔ）オーバーハングを有する第２の核酸を、ＴＡライゲーションによって第１の核酸にライゲートすることができる。ＴＡライゲーションの方法は当技術分野において周知であり、関連キット及び／又は酵素が市販されており、例えば、ＮＥＢＮＥＸＴ(TM) ｄＡ－Ｔａｉｌｉｎｇ ｍｏｄｕｌｅ, Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ; Ｉｐｓｗｉｃｈ, Ｍａｓｓ.を用いて、核酸の平滑末端をアデニル化することができる。いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプターは３'Ｔオーバーハングを含む。

【0080】

プライマー伸長
外部プライマーを用いて、ライゲートされた核酸に対して１つないしそれ以上のプライマー伸長サイクル又は線形的増幅サイクルを行う。標的ヌクレオチド配列を含む核酸テンプレートは各プライマー伸長サイクルにおいてテンプレートとして働くので、プライマー伸長サイクルは標的ヌクレオチド配列の量を線形的に増加させることができる。いくつかの実施形態では、プライマー伸長サイクルを１回又は複数回繰り返す。いくつかの実施形態では、プライマー伸長サイクルを繰り返さない。いくつかの実施形態では、当該方法は少なくとも２又はより多くのプライマー伸長サイクルを含み、例えば少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０のうちのいずれか又はより多くの反復プライマー伸長サイクルを含む。いくつかの実施形態では、当該方法は約２～１００のプライマー伸長サイクルを含み、例えば約５～５０、約５～３０、約５～２０、約１０～２０、約１０～１５、約１５～３０、約３０～５０又は約１０～３０のうちのいずれかのプライマー伸長サイクルを含む。各プライマー伸長サイクルは、１）鎖の分離（例えば熱変性）、２）標的ヌクレオチド配列を含むライゲートされた核酸の第１の鎖への外部プライマーのアニーリング、及び、３）アニールしたプライマーの核酸ポリメラーゼによる伸長のステップ、を含む。これらのステップの各々にとって必要な条件及び時間は、当業者によって考案されうる。プライマー伸長サイクルはサーマルサイクラーにおいて行うことができ、その多くは市販されている。

【0081】

各プライマー伸長サイクルは、一般に反応混合物の加熱を含む鎖の解離又は分離ステップを含む。本明細書において用いられる「鎖の分離」、「鎖の解離」又は「融解」とは、相補的二本鎖分子を、オリゴヌクレオチドプライマーにアニールするために利用することができる２つの一本鎖へと分離する核酸試料の処置を意味する。いくつかの実施形態では、二本鎖プライマー伸長生成物の解離は、十分に高い温度でプライマー伸長反応混合物を加熱することにより行われる。いくつかの実施形態では、十分に高い温度は、プライマー伸長鎖の融解温度（Ｔｍ）よりも高い。いくつかの実施形態では、十分に高い温度は少なくとも約９０℃であり、例えば少なくとも約９１℃、９２℃、９３℃、９４℃、９５℃、９６℃又は９７℃のうちのいずれかであってもよい。いくつかの実施形態では、十分に高い温度は約９０℃～９７℃である。いくつかの実施形態では、二本鎖プライマー伸長生成物は、当該二本鎖プライマー伸長生成物の変性温度を上昇または低下させることができる試薬の存在下で解離される。二本鎖プライマー伸長生成物の変性温度を上昇または低下させることができる代表的な試薬は、塩及びＤＭＳＯを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、外部プライマーとライゲートされた核酸の第１の鎖との間のアニーリングのための条件は、プライマーの長さ及び配列と共に変化し得る。いくつかの実施形態では、アニーリングのための条件は外部プライマーのＴｍ（例えば計算されるＴｍ）に基づく。いくつかの実施形態では、プライマー伸長サイクルのアニーリングステップは、そのようなアニーリングを可能にするために十分な期間、鎖分離ステップ後の温度を外部プライマーのＴｍ（例えば計算されるＴｍ）に基づく温度までに低下させる段階を伴う。

【0082】

いくつかの実施形態では、プライマー伸長サイクルの間にプライマーアニーリングを行うことができる時間は、反応の体積に依存し、体積がより大きければより長い時間を必要とするが、プライマー及びテンプレートの濃度にも依存して、テンプレートに対するプライマーの相対的濃度がより高ければ、相対的濃度が低い場合より必要な時間は短くなる。いくつかの実施形態では、プライマー伸長サイクルは、二本鎖核酸を解離するために十分に高い温度（例えば９０℃～９５℃）までに徐々に加熱して、続いてプライマー伸長の前に、プライマー伸長のための温度（例えば６０℃）までに徐々に冷却することを含む。いくつかの実施形態では、約１℃／秒以下、０.８℃／秒以下、０.７℃／秒以下、０.６℃／秒以下、０.５℃／秒以下、０.４℃／秒以下、０.３℃／秒以下、０.２℃／秒以下、０.１℃／秒以下のうちのいずれか又はより低い連続的な温度差でプライマー伸長反応を徐々に加熱又は冷却する。

【0083】

ポリメラーゼ伸長ステップでは、鋳型核酸配列と相補的であるプライマー伸長生成物を形成するためにヌクレオチド三リン酸の鋳型依存的重合化を触媒する核酸ポリメラーゼの使用が必要である。核酸ポリメラーゼはアニールしたプライマーの３'末端で合成を開始して、鋳型の５'末端に向かう方向に合成を行う。いくつかの実施形態では、核酸ポリメラーゼは熱安定性であり、つまり相補的核酸のアニールした鎖を変性させるために十分な温度（例えば９４℃又はより高い温度）に供された後でも機能を維持することができる。いくつかの実施形態では、前記核酸ポリメラーゼはＤＮＡポリメラーゼである。

【0084】

多くの核酸ポリメラーゼは当技術分野で既知であり、かつ市販されている。いくつかの実施形態では、核酸ポリメラーゼはＤＮＡポリメラーゼ Ｉ、Ｔａｑ ポリメラーゼ、Ｐｈｅｏｎｉｘ Ｔａｑ ポリメラーゼ、ＰＨＵＳＩＯＮ(R)ポリメラーゼ、Ｔ４ ポリメラーゼ、Ｔ７ ポリメラーゼ、ｋｌｅｎｏｗ断片、Ｋｌｅｎｏｗ ｅｘｏ－、ｐｈｉ２９ ポリメラーゼ、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｍ－ＭｕＬＶ 逆転写酵素、ＨＩＶ－１ 逆転写酵素、ＶＥＲＡＳＥＱ(TM) ＵＬｔｒａ ポリメラーゼ、ＶＥＲＡＳＥＱ(TM) ＨＦ２.０ ポリメラーゼ、ＥＮＺＳＣＲＩＰＴ(TM)又は別の適切なポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、核酸ポリメラーゼは逆転写酵素ではない。いくつかの実施形態では、核酸ポリメラーゼはＤＮＡテンプレートに作用する。いくつかの実施形態では、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＰＬＡＴＩＮＵＭ(TM) Ｔａｑ）はプライマー伸長サイクルに用いられる。

【0085】

いくつかの実施形態では、核酸テンプレートはＲＮＡテンプレートであり、かつＤＮＡポリメラーゼ又はＤＮＡポリメラーゼ以外のＲＮＡテンプレートに作用する核酸ポリメラーゼを代替してプライマー伸長サイクルに用いられる。いくつかの実施形態では、伸長反応はＲＮＡに逆転写を行って相補的なＤＮＡ分子を生成することを含む（「ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性」）。いくつかの実施形態では、逆転写酵素はマウスモロニーマウス白血病ウイルスポリメラーゼ、ＡＭＶ逆転写酵素、ＲＳＶ逆転写酵素、ＨＩＶ－１逆転写酵素、ＨＩＶ－２逆転写酵素又は別の適切な逆転写酵素である。

【0086】

いくつかの実施形態では、ポリメラーゼ伸長は、アニールしたオリゴヌクレオチドプライマーの伸長を可能にする条件で行われる。本明細書において用いられる技術用語「ポリメラーゼ伸長」とは、核酸ポリメラーゼによる、アニールしたプライマーの３'末端への少なくとも１つの相補的ヌクレオチドの鋳型依存的組み込みを意味する。ポリメラーゼ伸長は好ましくは、１つ以上のヌクレオチド、好ましくは鋳型の完全長に対応するヌクレオチドまでおよび完全長を含むヌクレオチドを付加する。これらの条件は、例えば適切な温度、塩及び補因子濃度、ｐＨ及び酵素濃度を含む。いくつかの実施形態では、このような条件は少なくとも部分的に用いられる核酸ポリメラーゼに基づく。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは適切な反応調製物中でプライマー伸長反応を行うことができる。いくつかの実施形態では、適切な反応調製物は、１種又は複数種の塩（例えば１ｍＭ～１００ｍＭのＫＣｌ、０.１ｍＭ～１０ｍＭのＭｇＣｌ_２）、少なくとも１種の緩衝剤（例えば１ｍＭ～２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣＬ）、及びキャリア（例えば０.０１％～０.５％のＢＳＡ）、並びに１種又は複数種のヌクレオチド三リン酸（例えば１０μＭ～２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰのうちのいずれか１つ）を含有する。ポリメラーゼ伸長のために用いられる温度は、一般的に、酵素の公知の活性特性に基づく。アニーリング温度が例えば酵素の至適温度より下である必要がある場合、より低い伸長温度を用いることが容認可能である。一般には、酵素は、その至適伸長温度より下でも少なくとも部分的に活性を保持するが、最も一般的に用いられる熱安定性ポリメラーゼ（例えばＴａｑポリメラーゼ及びその変種）によるポリメラーゼ伸長は６０℃～７５℃で行われる。１つの非制限的な条件セットは、６０℃（当該温度で、ポリメラーゼ、例えばＰＬＡＴＩＮＵＭ(TM) Ｔａｑ ポリメラーゼはプライマー伸長を触媒する）で５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（２５℃ｄｅｐＨ ８.８）、０.５ｍＭ～３ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭ各ｄＮＴＰ、及び ０.１％ＢＳＡである。

【0087】

プライマー伸長サイクルのポリメラーゼ伸長ステップは、ライゲートされた核酸の第１の鎖の全長にわたるプライマー伸長を可能にするように、例えばユニバーサルアダプターの第１の鎖の５'末端までに伸長するように、十分な時間にわたって継続することができる。ポリメラーゼ伸長ステップの十分な時間は、ライゲートされた核酸の平均長さ及びポリメラーゼ速度によって決定できる。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼ伸長ステップの時間は少なくとも約２分間、４分間、６分間、８分間、１０分間、１５分間のうちのいずれか又はより長い時間である。

【0088】

Ｔａｑポリメラーゼ（例えばＰＬＡＴＩＮＵＭ(TM) Ｔａｑ）を用いてプライマー伸長を行う態様の１つの非制限的例示は、９５℃で５分間保持し、次に、+０.２℃／秒の速度で温度を９５℃までに上昇させ、９５℃で１０秒間融解し、－０.２℃／秒の速度で温度を６０℃までに下げてアニールし、かつ６０℃で１０分間伸長させることを１０～３０サイクル行い、次に、４℃で反応を停止させるという条件で行われる。すなわち。一方、その他の適切な反応条件を利用することもできる。いくつかの実施形態では、塩濃度の差を解消するようにアニーリング／伸長温度を調整することができる（例えば高い塩濃度では温度を３℃高くする）。

【0089】

ＰＣＲ増幅
ユニバーサルアダプタープライマーと内部プライマーと必要に応じてシークエンシングアダプタープライマーを用いて、一本鎖プライマー伸長生成物に対して１つないしそれ以上のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅サイクルを行う。前のポリメラーゼ伸長生成物は連続的サイクル伸長のテンプレートとして使用されているので、ＰＣＲ増幅サイクルは標的ヌクレオチド配列の量を指数的に増加させることができる。いくつかの実施形態では、当該方法は少なくとも２以上のＰＣＲ増幅サイクルを含み，例えば少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０のうちのいずれか又はより多くの反復ＰＣＲ増幅サイクルを含む。いくつかの実施形態では、当該方法は約２～１００のＰＣＲ増幅サイクルを含み、例えば約５～５０、約５～３０、約５～２０、約１０～２０、約１０～１５、約１５～３０、約３０～５０又は約１０～３０のうちのいずれかのＰＣＲ増幅サイクルを含む。各ＰＣＲ増幅サイクルは、１）鎖の分離（例えば熱変性）、２）鋳型分子へのユニバーサルアダプタープライマー及び内部プライマーのアニーリング、および、３）アニールしたプライマーの核酸ポリメラーゼによる伸長の段階を含む。これらの段階の各々にとって必要な条件および時間は、当業者によって考案されうる。ＰＣＲ増幅サイクルはサーマルサイクラーにおいて行うことができ、その多くは市販されている。

【0090】

ＰＣＲ増幅サイクルのための各段階の条件（例えば酵素、塩、緩衝液、温度等）は、プライマー伸長サイクル中の対応する段階の条件と同じ又は実質的に同じであってもよい。「プライマー伸長」節に記載のいずれかの核酸ポリメラーゼ、緩衝条件、鎖の解離温度及びポリメラーゼ伸長時間はすべて、ＰＣＲ増幅サイクルに適用し得る。いくつかの実施形態では、ＰＣＲ増幅サイクルに使用される核酸ポリメラーゼは、プライマー伸長サイクルに使用される核酸ポリメラーゼと同じである。いくつかの実施形態では、ＰＣＲ増幅サイクルに使用される核酸ポリメラーゼは、プライマー伸長サイクルに使用される核酸ポリメラーゼと異なる。いくつかの実施形態では、核酸ポリメラーゼはＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、Ｔａｑポリメラーゼ（例えばＰＬＡＴＩＮＵＭ(TM) Ｔａｑ）をＰＣＲ増幅サイクルに用いる。いくつかの実施形態では、ＰＣＲ増幅サイクルの伸長時間は、プライマー伸長サイクルの伸長時間と同じである。いくつかの実施形態では、ＰＣＲ増幅サイクルの伸長時間は、プライマー伸長サイクルの伸長時間と異なる。

【0091】

増幅態様の１つの非制限的な例は、９５℃で５分間保持し、次に、９５℃で３０秒間融解することを１０～２５サイクル行い、次に、６０℃でアニールして５分間伸長させ、次に反応を４℃で保持するという条件でポリメラーゼ（例えば、ＰＬＡＴＩＮＵＭ(TM) Ｔａｑ ポリメラーゼ）を用いる。一方、その他の適切な反応条件を利用することもできる。いくつかの実施形態では、塩濃度の差を解消するようにアニーリング／伸長温度を調整することができる（例えば高い塩濃度では温度を３℃高くする）。

【0092】

その他のステップ
本明細書に記載の方法はその他のステップを含んでもよく、断片化、酵素消化及び／又はクリーンアップステップを含むが、これらに限定されない。

【0093】

本明細書に記載の方法に適するＮＧＳシークエンシング方法の多くは、何十個から何百個ものヌクレオチド塩基の最適なリード長でのシークエンシング実行を提供する（例えばＩＯＮ ＴＯＲＲＥＮＴ(TM)技術は、２００ｂｐ～４００ｂｐのリード長を生じ得る）。例えば、所定のシークエンシング技術の最適なリード長が２００ｂｐである場合に、本明細書に記載の方法による標的ヌクレオチド配列のアンプリコンは、約８００ｂｐ以下、７００ｂｐ以下、６００ｂｐ以下、５００ｂｐ以下、４００ｂｐ以下、３００ｂｐ以下、約２００ｂｐ以下のうちのいずれか又はより短い平均長さを有することができる。いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプター、外部及び内部プライマー及び／又はユニバーサルアダプタープライマーは、特定のシークエンシング技術に用いられる適切な長さのアンプリコンを提供するために設計される。いくつかの実施形態では、当該方法は、ライゲーションステップの前に核酸テンプレートを断片化するか、又はプライマー伸長生成物或いは標的ヌクレオチド配列のアンプリコンを断片化する。本明細書において用いられるポリヌクレオチドの「断片化」とは、ポリヌクレオチドを異なるポリヌクレオチド断片に分解することを意味する。断片化は、例えば剪断または酵素反応によって行われる。いくつかの実施形態では、核酸テンプレートは、次世代シークエンシングに適するサイズに断片化される。

【0094】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法中のステップ（例えば、プライマー伸長、ＰＣＲ増幅、又はシークエンシングの前）に由来する核酸テンプレート又は核酸産物は、任意の所望のサイズの断片を生成するように剪断、例えば機械的又は酵素的に剪断されうる。いくつかの実施形態では、核酸テンプレートは超音波処理によって機械的に剪断される。いくつかの実施形態では、核酸テンプレートは剪断又は酵素消化されていない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法中のステップ（例えばプライマー伸長、ＰＣＲ増幅、又はシークエンシングの前）に由来する核酸産物は、剪断又は酵素消化されていない。いくつかの実施形態では、核酸テンプレートは、約１ｋｂ以下、８００ｂｐ以下、７００ｂｐ以下、６００ｂｐ以下、５００ｂｐ以下、４００ｂｐ以下、３００ｂｐ以下、約２００ｂｐ以下のうちのいずれか又はより小さい平均サイズに断片化される。

【0095】

ゲノムＤＮＡ（例えば染色体）、ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡの全長又は長い断片は、ライゲーションステップの前に任意の所望の断片を生成するように剪断、例えば機械的又は酵素的に剪断されうる。機械的剪断方法の非制限的な例には、超音波処理、噴霧化、及びＣｏｖａｒｉｓ, Ｗｏｂｕｒｎ, Ｍａｓｓ.から入手できるＡＦＡ(TM)剪断技術が挙げられる。いくつかの実施形態では、超音波処理によってゲノムＤＮＡを機械的に剪断して適切な長さの核酸テンプレートにする。いくつかの実施形態では、核酸テンプレートがＲＮＡ由来のｃＤＮＡである場合に、当該ＲＮＡ試料を逆転写に供してｃＤＮＡを生成することができ、その後ｃＤＮＡテンプレートを剪断に供することができる。いくつかの実施形態では、逆転写の前にＲＮＡを剪断することができる。

【0096】

いくつかの実施形態では、当該方法は、ライゲーションステップ、プライマー伸長サイクル及び／又はＰＣＲ増幅サイクルの後に未反応のアダプター及びプライマー、ポリメラーゼ及びヌクレオチドを除去するために、１つないしそれ以上のクリーンアップステップを含む。いくつかの実施形態では、ライゲートされた核酸はプライマー伸長サイクル（例えばステップ（ｂ））の前にクリーンアップ工程に供される。いくつかの実施形態では、プライマー伸長生成物は、ＰＣＲ増幅サイクル（例えばステップ（ｇ））の前にクリーンアップ工程に供される。核酸クリーンアップ工程は当技術分野で既知であり、プライマー伸長生成物及びＰＣＲ増幅産物をクリーンアップするためのキットは市販されており、例えばＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ製のＡＭＰＵＲＥ(R)ビーズが挙げられる。

【0097】

いくつかの実施形態では、当該方法はさらに、「核酸試料」節に記載の生体試料及び／又は核酸試料を獲得、加工又は調製するためのいずれか１つ又は複数のステップを含む。

【0098】

プライマー及びアダプター
本明細書に記載の方法ではオリゴヌクレオチドアダプター及びプライマーが用いられており、ユニバーサルアダプター、ネストされた標的特異的プライマー（つまり外部プライマー及び内部プライマー）、ユニバーサルアダプタープライマー及びシークエンシングアダプタープライマー、並びに特定のＮＧＳプラットフォームに適するシークエンシングプライマーを含む。本明細書に記載のプライマー及びアダプターは、高い特異性、感度、効率（例えばライゲーション、プライマー伸長、ＰＣＲ増幅又はＮＧＳシークエンシング）、及び／又はあるタイプの配列（例えば高いＧＣ含有量の配列）に対して少ないバイアスを実現するために、特別に設計及び最適化することができる。

【0099】

本明細書に記載のプライマーは、鋳型核酸中の既知のヌクレオチド配列に特異的にアニールするように設計される。いくつかの実施形態では、プライマーは鋳型核酸中の鎖と相補的又は実質的に相補的な配列を含み、前記プライマーは前記鋳型核酸に特異的にアニールする。いくつかの実施形態では、プライマー中の鋳型核酸にハイブリダイズする配列は配列の３'末端にある。

【0100】

本明細書に使用されるプライマーは一般に一本鎖であり、かつプライマー及びその相補体はアニールして二本鎖ポリヌクレオチドを形成することができる。いくつかの実施形態では、プライマーの長さは約３００ヌクレオチドを超えず、例えば長さは約３００以下、２５０以下、２００以下、１５０以下、１００以下、９０以下、８０以下、７０以下、６０以下、５０以下、４０以下、３０以下、２０以下、１５以下のうちのいずれか又はより少ないヌクレオチドであり、ただし、長さは少なくとも約１０ヌクレオチドである。

【0101】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のプライマー（例えば外部プライマー及び内部プライマー、ユニバーサルアダプタープライマー及び／又はシークエンシングアダプタープライマー）は、約５５～７２℃、６０～７２℃、約６０～７０℃、約６２～６９℃、約６３～６７℃又は約６４～６６℃のうちのいずれかのアニーリング温度でその相補的配列に特異的にアニールすることができるように設計される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のプライマーは、約７２℃未満、７０℃未満、６８℃未満、６５℃未満又は６０℃未満のいずれかのアニーリング温度でその相補的配列に特異的にアニールすることができるように設計される。プライマーのアニーリング温度（融解温度又はＴｍとも呼ばれる）は、様々なアルゴリズム（例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ Ｉｎｃ. Ｃｏｌｏｒａｄｏ社のＯＬＩＧＯ(TM)プライマー設計ソフトウェア、及び、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ, Ｉｎｃ. Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ社のＶＥＮＴＲＯ ＮＴＩ(TM)プライマー設計ソフトウェア、並びに、Ｐｒｉｍｅｒ３、Ｏｌｉｇｏ Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ及びＰｒｅｍｉｅｒ Ｂｉｏｓｏｆｔ; Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ, ＣＡ社のＮｅｔＰｒｉｍｅｒを含むインターネットから入手可能なプログラム）のいずれかによって決定されうる。いくつかの実施形態では、プライマーのＴｍは、式：Ｔｍ = ＡＨ/（ＡＳ + Ｒ * ｌｎ（Ｃ/４））+ １６.６ ｌｏｇ （[Ｋ+]/（ｌ + ０.７ [Ｋ+]））－２７３.１５を用いて計算することができ、ここで、ΔＨはヘリックス形成のためのエンタルピーであり、ＡＳは、ヘリックス形成のためのエントロピーであり、Ｒはモル気体定数（１.９８７ｃａｌ／℃×ｍｏｌ）であり、Ｃは核酸濃度であり、かつ[Ｋ+]は塩濃度である。Ｆｒｉｅｉｒ ｅｔ ａｌ. ＰＮＡＳ １９８６ ８３:９３７３－９３７７を参照されたい。

【0102】

以下の設計原理のいずれか１つ以上を利用してプライマーの設計を最適化することができる。例えば、低カバレッジのために、高いＧＣ含有量の配列を含む標的ヌクレオチド配列を富化することが困難である場合、プライマーは隣接の配列をカバーするように設計されうる。プライマーの二次構造を減少させてかつそのハイブリダイゼーション効率を高めるために、プライマー配列を修飾することもできる。同じカテゴリー中の異なるプライマーの融解ハイブリダイズキネティクスをバランスするために、プライマー長又はプライマー中の鋳型特異的にハイブリダイズする部分の長さを修飾することができる。異なる結合効率を得るために、同じ標的領域のフォワード鎖及びリバース鎖に用いられる異なる配向プライマーを修飾することができる。

【0103】

アダプター及びプライマーは、当該方法の各ステップ中においていずれも適切な濃度で使用される。いくつかの実施形態では、本願は、ユニバーサルアダプター、外部プライマー、内部プライマー、ユニバーサルアダプタープライマー及び必要に応じてシークエンシングアダプタープライマーのうちのいずれか２つ又はより多くのものの濃度比を最適化している。例えばいくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプターと外部プライマーの濃度比は、約５０００:１以下、１０００:１以下、１００:１以下、５０:１以下、２０:１以下、１０:１以下、５:１以下、４:１以下、３:１以下、２:１以下、１:１以下のうちのいずれか又はより小さい濃度比である。いくつかの実施形態では、２つの異なる外部プライマーの濃度比は約１:４～約４:１、約１:３～約３:１、約１:２～約２:１、約２:３～約３:２、又は約１:１のうちのいずれかである。いくつかの実施形態では、２つの異なる内部プライマーの濃度比は約１:４～約４:１、約１:３～約３:１、約１:２～約２:１、約２:３～約３:２、又は約１:１のうちのいずれかである。例えば、比較的高濃度の内部及び／又は外部プライマーは、比較的富化し難い標的ヌクレオチド配列に使用しうる。いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプタープライマーと内部プライマーの濃度比は、約５０００:１以下、１０００:１以下、１００:１以下、５０:１以下、２０:１以下、１０:１以下、５:１以下、４:１以下、３:１以下、２:１以下、１:１以下のうちのいずれか又はより小さい濃度比である。いくつかの実施形態では、個々の外部プライマーと対応する内部プライマーの濃度比は約１:４～約４:１、約１:３～約３:１、約１:２～約２:１、約２:３～約３:２、又は約１:１のうちのいずれかである。例えば、ある関心対象の遺伝子座を有する標的ヌクレオチドのカバレッジを増加又は減少させるために、異なる外部プライマー組と内部プライマー組の相対的濃度を調整することができる。

【0104】

いくつかの実施形態では、富化される標的ヌクレオチド配列はＮＧＳのために用意される。標的ヌクレオチド配列の決定、配列変異体の検出及び下記ＩＩＩ節、ＩＶ節に記載の診断方法のいくつかの実施形態では、当該方法は、第１のシークエンシングプライマー及び第２のシークエンシングプライマーの使用に依存するシークエンシングステップを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の次世代シークエンシング方法に適合するように、第１及び第２のシークエンシングプライマーを選択する。いくつかの実施形態では、第１のシークエンシングプライマーは、ＩＬＬＵＭＩＮＡ(R)に基づくシークエンシング技術に用いられるＰ５配列を含み、かつ第２のシークエンシングプライマーは、ＩＬＬＵＭＩＮＡ(R)に基づくシークエンシング技術に用いられるＰ７配列を含むか、又は、第２のシークエンシングプライマーは、ＩＬＬＵＭＩＮＡ(R) に基づくシークエンシング技術に用いられるＰ５配列を含み、かつ第１のシークエンシングプライマーは、ＩＬＬＵＭＩＮＡ(R)に基づくシークエンシング技術に用いられるＰ７配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のシークエンシングプライマーは、ＩＯＮ ＴＯＲＲＥＮＴ(TM)シークエンシング技術に適合するＰＩ配列を含み、かつ第２のシークエンシングプライマーは、ＩＯＮ ＴＯＲＲＥＮＴ(TM)シークエンシング技術に適合するＡ配列を含むか、又は、第２のシークエンシングプライマーは、ＩＯＮ ＴＯＲＲＥＮＴ(TM) シークエンシング技術に適合するＡ 配列を含み、かつ第１のシークエンシングプライマーは、ＩＯＮ ＴＯＲＲＥＮＴ(TM)シークエンシング技術に適合するＰＩ配列を含む。ユニバーサルアダプター及び／又はユニバーサルアダプタープライマーは、第１のシークエンシングプライマーの配列と同一の又は相補的な配列を含みうる。内部プライマー及び／又はシークエンシングアダプタープライマーは、第２のシークエンシングプライマーの配列と同一の又は相補的な配列を含みうる。当業者は、ユニバーサルアダプター、ユニバーサルアダプタープライマー、内部プライマー及び／又はシークエンシングアダプタープライマー中の配列の、第１又は第２のシークエンシングプライマーに対する方向を選択して、適切な方向にそのような配列を有するアンプリコンをペアエンドシークエンシングのために提供することができる。

【0105】

いくつかの実施形態では、プライマー及び／又はアダプターは、修飾されたヌクレオチド又は非天然型ヌクレオチドを含まない。いくつかの実施形態では、プライマー及び／又はアダプターは、修飾された塩基又は非天然型塩基を含む。いくつかの実施形態では、プライマー及び／又はアダプターは、検出可能なシグナルを直接又は間接的に提供できる標識物質で修飾される。このような標識物質の非制限的な例としては、放射性同位体、蛍光分子、ビオチンなどが挙げられる。いくつかの実施形態では、プライマー及び／又はアダプターは、ビオチンリンカー又は他の適切なリンカーを含む（例えば、プライマーを支持体に結合させるために用いられる）。いくつかの実施形態では、プライマー及び／又はアダプターは、適切な酵素による切断を可能にするために、ヌクレアーゼ切断部位を含む。他の実施形態では、プライマーの５'末端には、ビーズ又は他の支持体（例えばフローセル基質）に結合された核酸と相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、プライマー及び／又はアダプターは、修飾されたヌクレオチド間結合、例えばホスホロチオエートを含む。

【0106】

任意の適切な方法によってアダプター及びプライマーを合成することができる。いくつかの実施形態では、多数の企業が、本明細書に記載の方法及び組成物に従うプライマーを提供するために適したオリゴヌクレオチド合成サービス、例えばＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ, Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ, ＮＹ社のＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ(TM) Ｃｕｓｔｏｍ ＤＮＡ Ｏｌｉｇｏｓ、又はＩＤＴ, Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ, ＩＡ社のカスタムＤＮＡ Ｏｌｉｇｏｓを提供する。いくつかの実施形態では、アダプター及びプライマーのうちのいずれかは、２つ以上のアダプター及びプライマー部分をライゲートすることにより調製することができる。

【0107】

ユニバーサルアダプター及びユニバーサルアダプタープライマー
本明細書に用いられるユニバーサルアダプターは、第１の末端にライゲート可能な二本鎖部分を含み、かつ第２の末端に非二本鎖部分を含むオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプターは、２つの別々の鎖、つまり第１の鎖及び第２の鎖を有する。いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプターは第１の鎖及び第２の鎖を含む。ユニバーサルアダプターの第１の鎖とは、３'末端がユニバーサルアダプターの第１の末端（つまりライゲート可能な末端）にある鎖を指す。ユニバーサルアダプターの第２の鎖とは、５'末端がユニバーサルアダプターの第１の末端（つまりライゲート可能な末端）にある鎖を指す。

【0108】

いくつかの実施形態では、第１の鎖は、５'非対合部分、３'対合部分及び３'Ｔオーバーハングを含む。いくつかの実施形態では、第２の鎖は、３'非対合部分及び５'対合部分を含む。いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプターの非二本鎖部分は一本鎖であり、例えば第１の鎖の５'非対合部分が挙げられる。いくつかの実施形態では、第２の鎖の全体は対合している。第１の鎖及び第２の鎖の対合部分は実質的に相補的であり、かつライゲート可能な二本鎖部分及び３'Ｔオーバーハングを含む第１の末端を形成し、かつ二本鎖部分はライゲーション温度で二本鎖型を保つのに十分な長さである。

【0109】

いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプターは「Ｙ」形状を有し、つまり非対合部分は第１の鎖及び第２の鎖の一部を含む。第２の鎖の非対合部分の長さは、第１の鎖の非対合部分より短いか、長いか、或いは同じであってもよい。いくつかの実施形態では、第２の鎖の非対合部分は、第１の鎖の非対合部分より短いものであってもよい。Ｙ形状のユニバーサルアダプターは、第２の鎖の非対合部分がＰＣＲ増幅ステップにおいて増幅されないというメリットを有する。

【0110】

いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプターの第２の鎖は、第１の鎖の５'非対合部分と実質的に相補的でない３'非対合部分を含み、かつ第２の鎖の３'非対合部分は、他の任意のプライマーと実質的に相補的でないか、又は実質的に同一ではない。いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプターの第２の鎖は、アニーリング温度で第１の鎖の５'非対合部分に特異的にアニールしない３'非対合部分を含み、かつ第２の鎖の３'非対合部分は、アニーリング温度で他の任意のプライマー又はその相補的配列に特異的にアニールしない。

【0111】

いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプターはヘアピン構造であり、その非二本鎖部分はループ構造である。いくつかの実施形態では、増幅鎖の非対合５'部分とブロック鎖の非対合３'部分は互いに連結している。いくつかの実施形態では、ループ構造ははまず酵素によって切断され、次にライゲートされた核酸はプライマー伸長ステップの前に２つの別々の鎖に解離される。

【0112】

いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプターの二本鎖部分（例えばいずれか１つ又は２つの鎖の対合部分）の長さは、少なくとも約７塩基対であり、例えば長さが少なくとも約７ｂｐ、８ｂｐ、９ｂｐ、１０ｂｐ、１１ｂｐ、１２ｂｐ、１３ｂｐ、１４ｂｐのうちのいずれか又はよい長い。いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプターの二本鎖部分の長さは約１８ｂｐを超えず、例えば長さが約１７ｂｐ以下、１６ｂｐ以下、１５ｂｐ以下、１４ｂｐ以下、１３ｂｐ以下、１２ｂｐ以下のうちのいずれか又はより短い。いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプターの二本鎖部分の長さは約１４ｂｐを超えない。ユニバーサルアダプターの二本鎖部分は、所望のアンプリコンのプライマー伸長及び／又はＰＣＲ増幅を阻害しないように、長すぎてはならない。また、図３に示すようなインフレーションＵＭＩ複雑さの問題を軽減するように、ユニバーサルアダプターの二本鎖部分の長さを制限することができる。

【0113】

いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプターの非二本鎖部分は、ＮＧＳプラットフォームの第１のシークエンシングプライマーの配列と同一の又は相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプターの第１の鎖の非対合５'部分は、ＮＧＳプラットフォームの第１のシークエンシングプライマーの配列と同一の又は相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプターの二本鎖部分の第１の鎖は、ＮＧＳプラットフォームの第１のシークエンシングプライマーの配列と同一の又は相補的な配列を含む。

【0114】

いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプターはバーコードを含む。いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプターの二本鎖部分はバーコードを含む。次世代シークエンシング応用におけるバーコードの使用は当技術分野で周知であり、かつ例えばＭａｒｇｕｌｉｅｓ, Ｍ. ｅｔ ａｌ. 「Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ. Ｈｉｇｈ－Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｐｉｃｏｌｉｔｅｒ Ｒｅａｃｔｏｒｓ」, Ｎａｔｕｒｅ, ４３７, ３７６－８０ （２００５）; Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ, Ｔ. ｅｔ ａｌ. 「Ｇｅｎｏｍｅ－Ｗｉｄｅ Ｍａｐｓ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｓｔａｔｅ ｉｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ Ｌｉｎｅａｇｅ－Ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ. Ｃｅｌｌｓ」, Ｎａｔｕｒｅ, ４４８, ５５３－６０ （２００）; ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ, Ｓ. ｅｔ ａｌ, 「Ｗｈｏｌｅ－Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｗｉｔｈ Ｓｈｏｒｔ Ｒｅａｄｓ; Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｗｉｔｈ Ｍａｔｅ Ｐａｉｒｓ ａｎｄ Ｑｕａｌｉｔｙ Ｖａｌｕｅｓ」, ＡＳＨＧ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ （２００７）; Ｓｈｅｎｄｕｒｅ Ｉ. ｅｔ ａｌ. 「Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｐｏｌｏｎｙ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ａｎ Ｅｖｏｌｖｅｄ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｏｍｅ」, Ｓｃｉｅｎｃｅ, ３０９, １７２８－３２ （２００５）; Ｈａｒｒｉｓ, Ｔ. ｅｔ ａｌ. 「Ｓｉｎｇｌｅ－Ｍｏｌｅｃｕｌｅ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ａ Ｖｉｒａｌ Ｇｅｎｏｍｅ」 Ｓｃｉｅｎｃｅ, ３２０, １０６－９ （２００８）; Ｓｉｍｅｎ, Ｂ. ｅｔ ａｌ, 「Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ＬＯＷ Ａｂｕｎｄａｎｃｅ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｖａｒｉａｎｔｓ ｂｙ Ｕｌｔｒａ Ｄｅｅｐ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｉｎ Ｃｈｒｏｎｉｃａｌｌｙ ＨＩＶ－ｉｎｆｅｃｔｅｄ Ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ （ＡＲＶ） Ｎａｉｖｅ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｍｐａｃｔ ｏｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃ Ｏｕｔｃｏｍｅｓ」, １６ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＨＩＶ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ, Ｂａｒｂａｄｏｓ （２００７）; Ｔｈｏｍａｓ, Ｒ. ｅｔ ａｌ. 「Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ ｂｙ Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｐｉｃｏｌｉｔｅｒ Ｒｅａｃｔｏｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」, Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ., １２, ８５２－８５５ （２００６）; Ｍｉｔｓｕｙａ, Ｙ ｅｔ ａｌ. 「Ｍｉｎｏｒｉｔｙ Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ Ｉ Ｖａｒｉａｎｔｓ ｉｎ Ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ－Ｎａｉｖｅ Ｐｅｒｓｏｎｓ Ｗｉｔｈ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｃｏｄｏｎ ２１５ Ｒｅｖｅｒｔａｎｔ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ」, Ｉ. Ｖｉｒ., ８２, １０７４７－１０７５５ （２００８）; Ｂｉｎｌａｄｅｎ, Ｊ. ｅｔ ａｌ. 「Ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ｃｏｄｅｄ ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒｓ Ｅｎａｂｌｅｓ Ｈｉｇｈ－Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ＨｏｍｏｌｏｇＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｂｙ ４５４ Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」, ＰＬｏＳ ＯＮＥ, ２, ｅ１９７ （２００７）; および、Ｈｏｆｆｍａｎｎ, Ｃ. ｅｔ ａｌ. 「ＤＮＡ Ｂａｒ Ｃｏｄｉｎｇ ａｎｄ Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｏ Ｉｄｅｎｔｉｆｙ Ｒａｒｅ ＨＩＶ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ」, Ｎｕｃ. Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ., ３５, ｅ９１ （２００７）などの文献に報告されている。これらの文献はすべて参照により本明細書に組み入れられる。

【0115】

いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプターは、ランダム及び／又は縮重設計された核酸塩基を含有する分子バーコードを含む。分子バーコードは、「ユニーク分子インデックス」又は「ＵＭＩ」とも呼ばれる。分子バーコードを含有する複数のユニバーサルアダプターを含む組成物において、各ユニバーサルアダプター中の分子バーコードは異なっていてもよく、なぜなら、ランダムに設計（つまり４つの核酸塩基Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｇのうちのいずれか１つ）又は縮重設計（つまり少なくとも２つのタイプの核酸塩基のうちの１つを１セット含み、例えばＢ=Ｃ/Ｇ/Ｔ、Ｄ=Ａ/Ｇ/Ｔ、Ｈ=Ａ/Ｃ/Ｔ、Ｖ=Ａ/Ｃ/Ｇ、Ｗ=Ａ/Ｔ、Ｓ=Ｃ/Ｇ、Ｒ=Ａ/Ｇ、Ｙ=Ｃ/Ｔ）されたヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含有するからである。したがって、分子バーコードを用いて、同じ核酸テンプレート由来のアンプリコンのシークエンシングリードを整列させることによって、プライマー伸長及び／又はＰＣＲ増幅サイクルによる誤差の補正を可能にする。分子バーコードはさらに、組成物中のすべてのユニバーサルアダプターと同じアイデンティティを有するヌクレオチド（つまり「一定」又は特異的に設計されたヌクレオチド）を含みうる。一定の核酸塩基を、ランダム又は縮重設計された配列の任意の側に位置させるか、又は、ランダム又は縮重設計されたヌクレオチドの間に散在させることができる。いくつかの実施形態では、分子バーコードは、ランダム及び／又は縮重設計された核酸塩基を少なくとも約５個（例えば少なくとも約１０個、１５個、２０個又は２５個のうちのいずれか）有する。いくつかの実施形態では、分子バーコードは、一定の（つまり特異的に設計された）核酸塩基を少なくとも約１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個のうちのいずれか又はより多く有する。いくつかの実施形態では、分子バーコードはランダムに設計、縮重設計又は一定の核酸塩基の混合物である。分子バーコードにおいて、ランダム及び／又は縮重設計された核酸塩基の数は、核酸試料の複雑さによる。いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプターの非二本鎖部分は分子バーコードを含む。いくつかの実施形態では、分子バーコードは一本鎖である。いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプターの第１の鎖は、非対合部分の３'末端に分子バーコードを含む。いくつかの実施形態では、分子バーコードは二本鎖である。いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプターの二本鎖部分は分子バーコードを含む。

【0116】

いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプターの二本鎖部分は試料バーコードを含む。試料バーコードは、各核酸試料から１つないしそれ以上の関心対象の遺伝子座を標的富化するために使用し得る。いくつかの実施形態では、前記方法は、複数の核酸試料から標的ヌクレオチド配列を富化することを含み、核酸試料の各々はステップ（ａ）～（ｈ）に供され、かつ核酸試料の各々は異なる試料バーコードを含む１つのユニバーサルアダプターを使用する。いくつかの実施形態では、試料バーコードを含むユニバーサルアダプターを各核酸試料中の核酸テンプレートにライゲートし、かつ異なるバーコード試料由来のライゲートされた産物をプールしながら、プライマー伸長サイクル及びＰＣＲ増幅試料に供し、これにより得られたアンプリコンの各々は、アンプリコンがどの核酸試料に由来するかを標識する試料バーコードを含む。いくつかの実施形態では、試料バーコードは、少なくとも約３、４、５、６、８、１０、１２、１５のうちのいずれか又はより多くの一定のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、試料バーコードは、約４～１５、４～１３、５～１２、５～１０又は６～１０のうちのいずれかの一定したヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプターの非二本鎖部分は試料バーコードを含む。いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプターの二本鎖部分は試料バーコードを含む。いくつかの実施形態では、試料バーコードは、ユニバーサルアダプターの二本鎖部分のライゲート可能な末端（つまり第１の鎖において対合部分の３'末端を含む二本鎖末端）にある。いくつかの実施形態では、試料バーコードは、ユニバーサルアダプターの第１の末端にある。

【0117】

試料バーコードは、同じＮＧＳシークエンシング反応中に複数の試料に対する多重配列決定のために使用し得る。異なる試料バーコードは、異なるシークエンシングプラットフォームに使用し得る。例えば、ＩＯＮ ＴＯＲＲＥＮＴ(TM)は各アンプリコンの１つの末端に、試料バーコードを有するライブラリーに対して配列決定を行うことができる。しかし、二重バーコードは、例えばＩＬＬＵＭＩＮＡ(R)のプラットフォームにおいてＮＧＳシークエンシングのための二重インデックスシークエンシングライブラリーを構築するために使用し得る。二重試料バーコードを有するアンプリコンを提供するために、例えばＰＣＲ増幅ステップにおいてユニバーサルアダプター中の試料バーコードと同一の又は相補的な配列を含むシークエンシングアダプタープライマーを使用することができる。

【0118】

いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプターは、試料バーコード及び分子バーコードの両方を含む。いくつかの実施形態では、試料バーコードは、ユニバーサルアダプターの第１の末端、例えば二本鎖部分のライゲート可能な末端にある。いくつかの実施形態では、分子バーコードは非二本鎖部分中にあり、例えばユニバーサルアダプターの第１の鎖における非対合部分の３'末端にある。いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプターは、第１の鎖において５'から３'までに分子バーコード及び試料バーコードを含み、かつ第２の鎖において５'から３'までに試料バーコードを含む。いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプターは、第１の鎖において５'から３'までに第１のシークエンシングプライマーの配列と同一の又は相補的な配列、分子バーコード及び試料バーコードを含み、かつ第２の鎖において５'から３'までに試料バーコードを含む。いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプターは第１の鎖において５'から３'までに分子バーコード、第１のシークエンシングプライマーの配列と同一の又は相補的な配列、分子バーコード及び試料バーコードを含み、かつ第２の鎖において５'から３'までに第１のシークエンシングプライマーの配列と相補的又は同一の配列、及び試料バーコードを含む。いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプターは、第１の鎖において５'から３'までに分子バーコード、試料バーコード及び第１のシークエンシングプライマーの配列と同一の又は相補的な配列、分子バーコードを含み、かつ第２の鎖において５'から３'までに第１のシークエンシングプライマーの配列と相補的又は同一の配列、及び試料バーコードを含む。

【0119】

プライマー伸長サイクル由来の非特異的副産物を減少させるために、ユニバーサルアダプターの配列を最適化することができる。非特異的副産物の潜在的な由来としては、図３に示すように生成することが可能でありる。例えば、プライマー伸長の第１のサイクルにおいて、ユニバーサルアダプターの第１の鎖の相補的配列を含む一本鎖プライマー伸長生成物が生成し、その３'部分は、ユニバーサルアダプターの５'非対合部分のリバース相補的配列を含む。次のプライマー伸長サイクルにおいて、残存ユニバーサルアダプターは、ユニバーサルアダプターの５'非対合部分の相補的配列を有する一本鎖プライマー伸長生成物の３'部分にアニールすることができる。しかし、残存ユニバーサルアダプターは一般には、異なる分子バーコード又はユニーク分子インデックス（ＵＭＩ）を有する。したがって、ＵＭＩインフレーション産物は、プライマー伸長のような非特異的副産物によって増幅されることが可能である。この問題の深刻性は、ユニバーサルアダプター中の一定の塩基（縮重設計されたヌクレオチドを含む分子バーコードではなく）を有する３'二本鎖部分の長さに依存する。いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプターの第１の末端には、ステップ（ｂ）～（ｆ）間に残存ユニバーサルアダプターによる無差別プライミングを防止するために、十分に短い長さの一定の核酸塩基を含む。いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプターの第１の末端は鎖の各々に、約５～１５個、例えば約５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個又は１５個のいずれかの一定の核酸塩基を有する。いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプターの第１の末端は鎖の各々に、一定の核酸塩基を約６～１２個有する。いくつかの実施形態では、第１の（つまりライゲートし得る）末端（十分に短い長さの一定の核酸塩基）を含むユニバーサルアダプターを用いることによって、ＵＭＩインフレーション問題を軽減又は回避することができる。いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプターの第１の末端は、約２５以下、２０以下、１５以下、１２以下、１０以下のうちのいずれか又はより少ないｂｐを含む。

【0120】

いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプターの非二本鎖部分は、ブロッキング部分を有する３'末端を含む。ブロッキング部分は、プライマー伸長サイクルの間に、核酸ポリメラーゼによる３'末端の伸長を防止する。いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプターの第２の鎖の３'末端はブロッキング部分を有し、かつプライマー伸長サイクルの間に伸長がブロックされる。いくつかの実施形態では、ブロッキング部分は逆位ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプターの第２の鎖の３'末端は逆位ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ブロッキング部分は、１つないしそれ以上の（例えば約１、２、３、４のうちのいずれか又はより多くの）ホスホロチオエート修飾を有するフラッピング状のヌクレオチド（ｆｌａｐｐｉｎｇ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）フラグメントである。いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプターの第２の鎖の３'末端は、１つないしそれ以上の（例えば約１、２、３、４のうちのいずれか又はより多くの）ホスホロチオエート修飾を有するフラッピング状のヌクレオチドフラグメントを含む。フラッピング状のヌクレオチドは、核酸ポリメラーゼによるプライマー伸長をブロックすることができる。１つないしそれ以上のホスホロチオエート修飾は、ヌクレアーゼ（例えば核酸ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ機能）がフラッピング状のヌクレオチドを除去することを防止するのに十分である。いくつかの実施形態では、フラッピング状のヌクレオチドフラグメントは、約１、２、３、４のうちのいずれか又はより多くのヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプターの３'末端のブロッキング部分は、ライゲートされた核酸には相補的な末端（例えばブロッキング部分が存在しない場合、一方がライゲートし、他方がプライマー伸長する）が存在することで鋳型ＤＮＡにヘアピン構造を形成することを防止することができる。鋳型ＤＮＡにヘアピン構造を形成すると、プライマーアニーリングが低くなり、これにより鋳型ＤＮＡが「閉」じてプライマー伸長効率が低くなる。

【0121】

ユニバーサルアダプタープライマーは、ＰＣＲ増幅サイクルにおいて一本鎖プライマー伸長生成物におけるユニバーサルアダプターの非二本鎖部分の相補的配列にアニールするように設計される。いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプタープライマーの３'部分は、ユニバーサルアダプターの非二本鎖部分の第１の鎖と相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプタープライマーは３'末端に、ユニバーサルアダプターの第１の鎖における少なくとも約１２の（例えば少なくとも約１５、２０、２５、３０のうちのいずれか又はより多くの）最も５'側のと相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプタープライマーの５'部分は、ＮＧＳプラットフォームの第１のシークエンシングプライマーの配列と同一の又は相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプタープライマーは５'から３'までに、ＮＧＳプラットフォームの第１のシークエンシングプライマーの配列と同一の又は相補的な配列、及び、ユニバーサルアダプターの非二本鎖部分の第１の鎖と相補的な配列を含む。

【0122】

ネストされた標的特異的プライマー
本明細書に記載の方法は、１組又は複数組の外部プライマー及び内部プライマーを用いて、関心対象の遺伝子座を有する標的ヌクレオチド配列を富化する。関心対象の遺伝子座について、内部プライマーは外部プライマーに対してネストされたものである。いくつかの実施形態では、１つの外部プライマー及び１つの内部プライマーを用いて、関心対象の遺伝子座を有する標的ヌクレオチド配列を増幅する。いくつかの実施形態では、複数の（例えば２、３、４、５、６、１０、１２、１５のうちのいずれか又はより多くの）外部プライマー及び複数の（例えば２、３、４、５、６、１０、１２、１５のうちのいずれか又はより多くの）内部プライマーを用いて、関心対象の遺伝子座を有する標的ヌクレオチド配列を増幅する。いくつかの実施形態では、１つの関心対象の遺伝子座の外部プライマー及び内部プライマーは、鋳型核酸の同一の鎖に特異的にアニールする。いくつかの実施形態では、複数の外部プライマー及び対応する内部プライマーは、鋳型核酸の１つの鎖に特異的にアニールし、かつ複数の外部プライマー及び対応する内部プライマーは、鋳型核酸の相補的鎖に特異的にアニールする。

【0123】

いくつかの実施形態では、複数組の外部及び内部プライマーが１つの関心対象の遺伝子座に用いられる時、複数の区別可能なアンプリコンが得られる。いくつかの実施形態では、各標的配列よりも長い関心対象の遺伝子座への標的配列のタイリングを可能にするために、互いに重複するアンプリコンを生成する。いくつかの実施形態では、これらの複数のアンプリコンをシークエンシングすることができ、かつ、プライマー伸長及びＰＣＲ増幅サイクル或いはシークエンシングの間に導入される配列エラーを検出するために、重複配列リードを互いに整列させることができる。いくつかの実施形態では、アンプリコンの各々を整列させることができ、かつ、特定の塩基において配列が異なる場合に、標的富化ステップ及び／又はシークエンシング由来のアーチファクト又はエラーが存在し得る。

【0124】

いくつかの実施形態では、標的ヌクレオチド配列を含むライゲートされた核酸の第１の鎖に特異的にアニールした第１組の外部プライマー及び内部プライマーと、相補的な標的ヌクレオチド配列を含むライゲートされた核酸の第２の鎖に特異的にアニールした第２組の外部プライマー及び内部プライマーとを用いて、各関心対象の遺伝子座を富化する。図２を加味すれば、２組の例示的な外部及び内部プライマーを理解でき、この２組のプライマーは、関心対象の遺伝子座を有する核酸テンプレートの２つの鎖における標的ヌクレオチド配列（つまり標的ヌクレオチド配列及び相補的な標的ヌクレオチド配列）を富化するために使用しうる。

【0125】

いくつかの実施形態では、反対方向の外部プライマー又は内部プライマーからのＰＣＲ増幅産物を有意に減少又は除去するために、反対方向を有する外部プライマーの各々は、同一の５'ヌクレオチド配列（本明細書には「５'タグ配列」と呼ばれる）を含む。いくつかの実施形態では、反対方向を有する内部プライマーの各々も、外部プライマーの５'タグ配列と同一の又は異なる５'タグ配列を含む。いくつかの実施形態では、５'タグ配列は、外部プライマーを用いたＰＣＲ増幅を抑制するのに十分な長さである。例えば、反対方向を有する２つの外部プライマーから生成する二本鎖ＰＣＲ増幅産物は、末端に相補的な配列（つまり５'タグ配列及びその相補的な配列）をもつため、「フライパンの柄」のような構造を形成する。いくつかの実施形態では、５'タグ配列は、少なくとも約１３、１５、２０、２５、３０のうちのいずれか又はより多くのヌクレオチドを含む。外部及び内部プライマー中の５'タグ配列は、プライマー二量体の形成を減少させることができ、これによりプライマー伸長及び／又はＰＣＲ増幅サイクルの効率が向上する。

【0126】

いくつかの実施形態では、（ｉ）５'タグ配列自体は既知のゲノム標的を有しないか、又は少ないゲノム標的を有することと、（ｉｉ）５'タグ配列は高いＴｍ（例えば少なくとも約６５℃、７０℃、７５℃のうちのいずれか又はより高い）を有することと、（ｉｉｉ）５'タグ配列自体又は反応混合物中のその他のプライマーとはプライマー二量体を形成し難いことと、（ｉｖ）５'タグ配列は安定した二次構造を有しないことという設計原理のうちのいずれか又は複数のものに従って外部プライマー及び／又は内部プライマーの５'タグ配列を最適化する。例えばＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｚ. ｅｔ ａｌ. 「Ｔｈｅ ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒ－ｄｉｍｅｒ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ＰＣＲ」、Ｎｕｃ. Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ., １９９７, ２５（１６）: ３２３５－３２４１を参照されたい。いくつかの実施形態では、プライマー伸長サイクル中のプライマー二量体の形成又は非特異的プライミングを回避するために、５'タグ配列のＧＣ含有量を最適化する。いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプターのＧＣ含有量は核酸テンプレートのＧＣ含有量と実質的に類似している。いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプターのＧＣ含有量は、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％のうちのいずれか又はより高い。

【0127】

いくつかの実施形態では、各組の外部及び内部プライマーは、関心対象の遺伝子座の近傍の既知のヌクレオチド配列に特異的にアニールすることができる。関心対象の遺伝子座を有する標的ヌクレオチド配列は、外部及び内部プライマーの設計を可能にするために、１つの末端に１つないしそれ以上の既知のヌクレオチド配列を有しなければならない，従来のＰＣＲ富化技術に比べて、本明細書に記載の方法の１つの強力な利点は、ネストされた標的特異的プライマーを、標的ヌクレオチド配列を含む核酸テンプレートの一方側に固定しながら、他方の末端をユニバーサルアダプターにランダムにライゲートすることにある。他の従来のＰＣＲ技術とは違って、本明細書に記載の方法は、目的領域末端の１つの末端しか知らないまま当該目的領域を富化することができる。いくつかの実施形態では、異なる組の外部及び内部プライマーは、遺伝子の異なる断片、例えばエクソンを富化するように設計される。公的に利用可能なデータベースからの参照ゲノム配列に基づいて、既知の遺伝子配列を得ることができる。配列の新規決定のための他の手段を用いて、例えばゲノム又はエクソームＤＮＡ配列決定を含む、関心対象の遺伝子座の近傍の既知の配列を提供することもできる，既知のヌクレオチド配列の長さは少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００のうちのいずれか又はより多くのヌクレオチドであってもよい。いくつかの実施形態では、既知のヌクレオチド配列は約１０～１００ヌクレオチド、約１０～５００ヌクレオチド、約１０～１０００ヌクレオチド、約１００～５００ヌクレオチド、約１００～１０００ヌクレオチド、約５００～１０００ヌクレオチド又は約５００～５０００ヌクレオチドのうちのいずれかの長さである。既知のヌクレオチド配列は、関心対象の遺伝子座の上流又は下流であってもよく、かつセンス鎖又はアンチセンス鎖に位置していてもよい。

【0128】

既知のヌクレオチド配列と関心対象の遺伝子座との間の距離は、プライマー伸長及びＰＣＲ増幅に適する任意の長さであってもよい。いくつかの実施形態では、既知のヌクレオチド配列の関心対象の遺伝子座からの距離は、約１０００以下、９００以下、８００以下、７００以下、６００以下、５００以下、４００以下、３００以下、２００以下、１００以下、５０以下、３０以下、２０以下のいずれか又はより少ないｂｐである。いくつかの実施形態では、外部及び内部プライマーは、特定のシークエンシング技術に用いられる適切な長さのアンプリコンを提供するために設計される。例えば、所定のシークエンシング技術の最適なリード長が２００ｂｐである場合、本明細書に記載の方法由来の標的ヌクレオチド配列のアンプリコンは約４００ｂｐ又はより少ない平均長を有することができる。

【0129】

本明細書に記載の方法は、既知のヌクレオチド配列の任意側又は両側における既知のヌクレオチド配列に隣接する標的ヌクレオチド配列を富化することが可能である。核酸テンプレートが一般には一本鎖核酸であろうと、二本鎖核酸であろうと、配列情報は通常、５'から３'までの一本鎖型（鎖Ａ）で発現される。鎖Ａの既知の標的ヌクレオチド配列の配列５'が決定される場合、遺伝子特異的プライマーは鎖Ａと相補的であってもよい（つまり鎖Ａにアニールする）。鎖Ａの既知の標的ヌクレオチド配列の配列３'が決定される場合、遺伝子特異的プライマーは鎖Ａと同一であってもよく、これらが二本鎖核酸の相補的鎖にアニールする。このようなプライマー設計の配慮は、当業者に周知されている。

【0130】

関心対象の遺伝子座を有する標的ヌクレオチド配列は、関心対象の遺伝子座の配列（センス鎖及び／又はアンチセンス鎖にある）、関心対象の遺伝子座の近傍の既知のヌクレオチド配列、及び決定される隣接するヌクレオチド配列（未知配列とも呼ばれる）を含みうる。標的ヌクレオチド配列は任意の適切な長さであってもよい。いくつかの実施形態では、標的ヌクレオチド配列の集団は、本明細書に記載の方法によって富化され、かつその標的ヌクレオチド配列の集団は、内部プライマーの配列と一致する同一の５'又は３'末端配列を有する。

【0131】

いくつかの実施形態では、外部プライマーは３'部分を含む一本鎖オリゴヌクレオチドであり、当該３'部分は、関心対象の遺伝子座の近傍の既知のヌクレオチド配列の一部に特異的にアニール可能な配列を含む。いくつかの実施形態では、外部プライマーは３'末端に、関心対象の遺伝子座の近傍の第１の既知のヌクレオチド配列（つまり第１のアニーリング部位）に特異的にアニール可能な配列を含む。いくつかの実施形態では、内部プライマーは３'末端に、関心対象の遺伝子座の近傍の第２の既知のヌクレオチド配列（つまり第２のアニーリング部位）に特異的にアニール可能な配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の既知のヌクレオチド配列は、第２の既知のヌクレオチド配列よりも関心対象の遺伝子座から約１～１００ヌクレオチド（例えば約２～５０、１～２０又は１～１０ヌクレオチドのうちのいずれか）離れている。いくつかの実施形態では、外部プライマーは、内部プライマーよりも関心対象の遺伝子座から約１～１００ヌクレオチド離れた領域にアニールする。いくつかの実施形態では、外部プライマーは、内部プライマーよりも関心対象の遺伝子座から約１００以下、８０以下、６０以下、５０以下、４０以下、３０以下、２０以下、１０以下、５以下のうちのいずれか又はより少ないヌクレオチド離れた領域にアニールする。

【0132】

いくつかの実施形態では、内部プライマーは外部プライマーに対してネストされたものである。いくつかの実施形態では、内部プライマーは外部プライマーに対して少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０のうちのいずれか又はより多くのヌクレオチドがネストされたものである。

【0133】

外部及び内部プライマーは、オフターゲットプライミングを減少又は回避するために、高い特異性の既知の配列にアニールするものに設計される。いくつかの実施形態では、外部プライマー及び／又は内部プライマーの３'部分は、関心対象の遺伝子座の近傍の既知のヌクレオチド配列に特異的にアニールした少なくとも１０（例えば少なくとも約１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５のうちのいずれか又はより多くの）ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、外部プライマー及び内部プライマーの３'部分は核酸テンプレートにおいて、約２０以下、１５以下、１０以下、５以下、４以下、３以下又は２以下のうちのいずれかの異なるアニーリング遺伝子座を有する。「異なるアニーリング遺伝子座」とは、核酸テンプレートにおいて異なる既知のゲノム位置を有するか及び／又は異なる遺伝子或いは遺伝子融合産物に属する配列を有し、かつ前記配列が外部又は内部プライマーの３'部分と相補的又は実質的に相補的であることを意味する。

【0134】

いくつかの実施形態では、既知の標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする外部及び内部プライマーの一部は、約５５～７２℃、約６０～７２℃、約６０～７０℃、約６２～６９℃、約６３～６７℃又は約６４～６６℃のうちのいずれかの温度で特異的にアニールすることができる。いくつかの実施形態では、既知の標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする外部及び内部プライマーの一部は、プライマー伸長又はＰＣＲ緩衝液中で約６５℃の温度で特異的にアニールすることができる。

【0135】

外部プライマー、内部プライマー又はそれらの３'標的特異的部分は、遺伝子のエクソン、遺伝子のイントロン、遺伝子のイントロン－エクソン連結領域又はゲノムの非コード領域に特異的にアニールすることができる。関心対象の遺伝子座の特性及び核酸試料中の核酸テンプレートの種類に応じて、外部及び内部プライマーのアニーリング部位の位置を設計することができる。例えば、ゲノムＤＮＡ試料から遺伝子のエクソン領域中の遺伝子座を富化するために、外部及び内部プライマーは、エクソン領域に入る方向に遺伝子座の近傍のイントロンにおける既知の配列に特異的にアニールするように設計される。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡ試料から融合遺伝子中の遺伝子座を富化するために、第１組の外部及び内部プライマーは、融合点に入る方向に第１の融合遺伝子のエクソンにおける既知の配列に特異的にアニールするように設計され、かつ第２組の外部及び内部プライマーは、融合点に入る方向に第２の融合遺伝子のエクソンにおける既知の配列に特異的にアニールするように設計される。

【0136】

いくつかの実施形態では、外部プライマー及び内部プライマーは、プライマー二量体の形成を抑制できる同一の５'部分を含む。いくつかの実施形態では、内部プライマーは５'末端に、ＮＧＳプラットフォームの第２のシークエンシングプライマーの配列と同一の又は相補的な配列を含む。

【0137】

核酸試料
本明細書に記載の方法は各種の核酸試料に使用可能である。いくつかの実施形態では、核酸試料はゲノムＤＮＡ又はその断片を含む。いくつかの実施形態では、核酸試料はＲＮＡを含み、例えばｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｉｎｃＲＮＡ、ｒＲＮＡなど又はそれらの断片を含む。いくつかの実施形態では、核酸試料はｃＤＮＡ又はその断片を含む。いくつかの実施形態では、核酸試料はゲノムＤＮＡとＲＮＡとの混合物を含む。いくつかの実施形態では、核酸試料はゲノムＤＮＡとｃＤＮＡとの混合物を含む。

【0138】

いくつかの実施形態では、核酸試料はＤＮＡテンプレートを含む。いくつかの実施形態では、核酸試料はＲＮＡテンプレートを含む。いくつかの実施形態では、核酸試料はＤＮＡテンプレートとＲＮＡテンプレートの両方を含む。いくつかの実施形態では、核酸テンプレートはゲノムＤＮＡである。いくつかの実施形態では、核酸テンプレートは染色体ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、核酸テンプレートはミトコンドリアＤＮＡである。いくつかの実施形態では、核酸テンプレートはエクソームＤＮＡである。いくつかの実施形態では、核酸テンプレートはｃＤＮＡである。いくつかの実施形態では、核酸テンプレートはＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｌｉｎｃＲＮＡ、ｒＲＮなどである。いくつかの実施形態では、核酸テンプレート（例えば断片化）は、長さがＮＧＳ方法又はプラットフォームの最適なリード長を超える核酸、例えば完全長染色体ＤＮＡ又は完全長ｍＲＮＡに由来する。

【0139】

いくつかの実施形態では、核酸試料はｃＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、全ＲＮＡ又はその一部（例えばｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はその他の非コードＲＮＡ）を逆転写することによってｃＤＮＡを得る。いくつかの実施形態では、ｃＤＮは一本鎖であり、例えばｃＤＮＡの少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％のうちのいずれか又はより多くのは一本鎖である。いくつかの実施形態では、核酸試料は二本鎖ｃＤＮＡを含む。

【0140】

いくつかの実施形態では、核酸試料はｇＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ｇＤＮＡは一本鎖であり、例えばｇＤＮＡの少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％のうちのいずれか又はより多くは一本鎖である。いくつかの実施形態では、核酸試料は二本鎖ｇＤＮＡを含む。

【0141】

いくつかの実施形態では、核酸試料はｃＤＮＡとｇＤＮＡとの混合物を含む。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡとｇＤＮＡの重量比は約１:５超、１:３超、１:２超、１:１超、２:１超、３:１超、５:１超、１０:１超のいずれか又はより大きい。

【0142】

いくつかの実施形態では、核酸試料は少量の核酸テンプレートを含む。いくつかの実施形態では、核酸試料は約１０００ｎｇ以下、５００ｎｇ以下、２００ｎｇ以下、１００ｎｇ以下、５０ｎｇ以下、４０ｎｇ以下、３０ｎｇ以下、２５ｎｇ以下、２０ｎｇ以下、１５ｎｇ以下、１０ｎｇ以下、５ｎｇ以下、４ｎｇ以下、３ｎｇ以下、２ｎｇ以下、１ｎｇ以下のうちのいずれか又はより少ない核酸テンプレート（例えば，ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡ、ＲＮＡ、それらの集団又は全核酸）を含む。

【0143】

いくつかの実施形態では、核酸試料は細胞又は組織試料に由来する。いくつかの実施形態では、核酸試料は細胞系試料又は培養細胞に由来する。いくつかの実施形態では、核酸試料は遺伝子操作された細胞株に由来する。いくつかの実施形態では、核酸試料はＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集技術によって操作された細胞に由来する。いくつかの実施形態では、核酸試料は免疫細胞、例えばＴ細胞、Ｂ細胞又はＰＭＢＣに由来する。いくつかの実施形態では、核酸試料は腫瘍細胞に由来する。

【0144】

いくつかの実施形態では、核酸試料は食品試料、環境試料又は生体試料から得られる。いくつかの実施形態では、核酸試料は個体由来の生体試料に由来する。いくつかの実施形態では、核酸試料は疾患（例えばがん）の治療を必要とする生体試料に由来する。いくつかの実施形態では、核酸試料は個体から得られる診断試料である。いくつかの実施形態では、核酸試料は健康な個体由来の生体試料に由来する。いくつかの実施形態では、核酸試料は遺伝子操作された動物（例えばマウス、ラット又は非ヒト霊長類）に由来する。いくつかの実施形態では、核酸試料はＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集技術によって操作された動物に由来する。

【0145】

いくつかの実施形態では、生体試料は、タンパク質、細胞、液体、生体液、保存剤及び／又は他の物質をさらに含む。非制限的な例として、試料は、口腔内スワブ、血液、血清、血漿、喀痰、脳脊髄液、尿、涙液、肺胞単離液、胸水、心膜液、嚢液、腫瘍組織、組織、生検、唾液、吸引液、またはその組み合わせでありうる。いくつかの実施形態では、生体試料は切除または生検によって得られうる。いくつかの実施形態では、核酸試料は個体の血液試料に由来する。いくつかの実施形態では、核酸試料は個体の末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）試料に由来する。いくつかの実施形態では、核酸試料は個体の血液試料における免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞又はＢ細胞）の一部に由来する。いくつかの実施形態では、核酸テンプレートは無細胞ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、核酸テンプレートは個体の血液試料に由来する無細胞ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、核酸テンプレートは循環腫瘍ＤＮＡ（つまりｃｔＤＮＡ）である。いくつかの実施形態では、核酸テンプレートは個体の血液試料由来の循環腫瘍細胞に由来する。

【0146】

いくつかの実施形態では、核酸試料は個体の生検試料に由来する。いくつかの実施形態では、核酸試料は腫瘍生検、例えば未処置の生検組織又は処置後の生検組織に由来する。いくつかの実施形態では、核酸試料は個体のホルマリン固定及び／又はパラフィン包埋生検組織に由来する。

【0147】

いくつかの実施形態では、生体試料は、遺伝子変化に関連する疾患（例えばがん又は遺伝性疾患）の治療を必要とする個体から得られる。いくつかの実施形態では、既知の標的配列は疾患に関連する遺伝子にある。いくつかの実施形態では、生体試料は、がんの治療を必要とする個体から得られる。いくつかの実施形態では、生体試料は個体中の１つないしそれ以上の腫瘍部位の腫瘍細胞を含む。

【0148】

いくつかの実施形態では、生体試料は個体から新たに採取される。いくつかの実施形態では、生体試料は本明細書に記載の方法に用いられる前に一時保存され、例えば少なくとも約１日、１週、１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、１年のうちのいずれか又はより長く保存される。いくつかの実施形態では、生体試料はホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料である。いくつかの実施形態では、生体試料は本明細書に記載の方法中の核酸試料として直接使用される。いくつかの実施形態では、生体試料は溶液中に希釈及び／又は懸濁させることによって前処理される。いくつかの実施形態では、生体試料は被検者から得て、かつ本明細書に記載の方法に用いられる前に保存又は加工される。例えば、生体試料はパラフィンロウに包埋、冷蔵又は凍結されうる。凍結された生体試料は使用前に解凍することができる。生体試料の他の例示的な処理又は加工は、遠心分離、濾過、超音波処理、ホモジナイゼーション、加熱、凍結融解、保存剤（例えば、抗凝固剤又はヌクレアーゼ阻害剤）との接触、及びこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、生体試料は、化学試薬及び／又は生物試薬によって処理される。化学試薬及び／又は生物試薬は、処理及び／又は保存期間において、生体試料又は生体試料煮含まれる核酸テンプレートの安定性を保護及び／又は維持するために用いられうる。いくつかの実施形態では、化学試薬及び／又は生物試薬は、生体試料の他の成分から核酸テンプレートを放出させるために用いられうる。非制限的な例として、血液試料は、本明細書に記載の方法に用いられる核酸試料を得るために使用する前に、抗凝固剤によって処理することができる。当業者は、生体試料を加工、保存、又は処理するための方法及びプロセス、並びに核酸分析のために生体試料又は細胞試料から核酸を分離する方法を十分に承知している。いくつかの実施形態では、生体試料は、例えば遠心分離によって透明にされた液体試料でありうる。いくつかの実施形態では、試料を、低速遠心分離（例えば３０００×ｇ又はそれ未満）によって透明にして、透明な液体試料を含む上清を回収することができる。

【0149】

いくつかの実施形態では、生体試料又は核酸試料中の核酸テンプレートは、本明細書に記載の方法に用いられる前に単離、富化又は精製することができる。試料から核酸を単離、富化又は精製する適切な方法を利用することができる。例えば、各種の試料の種類からゲノムＤＮＡ及びＲＮＡを単離するためのキットは市販されている（例えばＱｉａｇｅｎ, Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ, ＭＤ）。本明細書に記載の標的富化方法は単独で使用するか、又は当技術分野で既知の他の標的富化方法と組み合わせて使用することができる。いくつかの実施形態では、前記方法はハイブリダイゼーション富化を含まない。

【0150】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡテンプレートを含む核酸試料は本明細書に記載の方法に使用しうる。核酸試料は、ｃＤＮＡシークエンシングのためにゲノムＤＮＡを除去する必要がなく、新しい又は分解した標本から抽出した総核酸を含みうる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡを含む核酸試料は、ｃＤＮＡシークエンシングのためには、リボソームＲＮＡを枯渇させるように処理されない。いくつかの実施形態では、ＲＮＡを含む核酸試料は、いずれのステップにおいても機械的又は酵素的に切断されていない。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、ランダムヘキサマーを用いた二本鎖ｃＤＮＡの合成に供されることなく、本明細書に記載の方法に使用される。

【0151】

関心対象の遺伝子座
本明細書に記載の方法により様々な関心対象の遺伝子座を研究することができる。いくつかの実施形態では、関心対象の遺伝子座は、配列変異体（染色体再編成、単一ヌクレオチド変異（ＳＮＶ）、挿入または欠失、スプライス変異、コピー数多型（ＣＮＶ）及びそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない）に関連する。いくつかの実施形態では、関心対象の遺伝子座は、染色体再編成（例えば染色体融合又は遺伝子融合）に関連する。いくつかの実施形態では、関心対象の遺伝子座は染色体転座に関連する。いくつかの実施形態では、関心対象の遺伝子座は単一ヌクレオチド変異（ＳＮＶ）に関連する。いくつかの実施形態では、関心対象の遺伝子座は挿入変異又は欠失変異（総称して「挿入または欠失」変異と呼ばれる）に関連する。いくつかの実施形態では、関心対象の遺伝子座は置換変異に関連する。いくつかの実施形態では、関心対象の遺伝子座はコピー数多型に関連する。いくつかの実施形態では、関心対象の遺伝子座はスプライス変異に関連している。関心対象の遺伝子座は任意の長さであってもよく、例えば少なくとも１、２、５、１０、２０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、１０００、２０００のうちのいずれか又はより少ないｂｐであってもよい。

【0152】

いくつかの実施形態では、関心対象の遺伝子座は天然に存在する遺伝子中にある。いくつかの実施形態では、関心対象の遺伝子座は、目的遺伝子のいずれか１つ又は複数の連続的なエクソン、イントロン、イントロン－エクソン連結領域、５'ＵＴＲ、３'ＵＴＲ又はその他の非コード領域、及びそれらの断片であってもよい。いくつかの実施形態では、関心対象の遺伝子座は操作された遺伝子又はゲノム部位にある。いくつかの実施形態では、関心対象の遺伝子座は、遺伝性疾患に関わる遺伝子にある。いくつかの実施形態では、関心対象の遺伝子座はがんに関わる遺伝子（例えばがん遺伝子）にある。いくつかの実施形態では、関心対象の遺伝子座は免疫細胞受容体、例えば組換えＴ細胞受容体を含むＴ細胞受容体に関連する。いくつかの実施形態では、関心対象の遺伝子座は遺伝子操作された部位（例えば以前に既知又は未知のオフターゲット部位のようなＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集のオフターゲット部位、）に関連する。

【0153】

疾患又は状態に「関連」する遺伝子又は遺伝子座とは、健康な個体における野生型配列に比べて、例えば欠失、挿入、ＳＮＶ、染色体再編成（例えば遺伝子融合）などの変化によって少なくとも部分的に疾患又は状態を引き起こすか、又は、疾患又は状態に関連する遺伝子又は遺伝子座を指す。例えば、疾患は、その変化が、個体が疾患を発症するリスクを増加させる場合、疾患（感染疾患、又は感染成分を有する疾患を含む）に対する被検者の感受性を増加させる場合、疾患関連分子の産生を引き起こす場合、又は細胞を疾患にするもしくは異常にする場合（例えばがん細胞における細胞周期調節の喪失）、少なくとも部分的に、個体の遺伝子又は遺伝子座の変化によって引き起こされうる。疾患は、複数の遺伝子変化に関連しうる。

【0154】

いくつかの実施形態では、関心対象の遺伝子座は、染色体又は遺伝子再編成による融合配列に関連する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は遺伝子再編成の存在及び／又はアイデンティティーを確認するのに適する。いくつかの実施形態では、遺伝子再編成の一部のアイデンティティーは従来既知であり（例えば外部及び内部プライマーによって標的化される遺伝子再編成の一部）、かつ本明細書に記載の方法によってその他の部分の配列を決定することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子再編成はがん遺伝子に関連する。いくつかの実施形態では、遺伝子再編成は融合がん遺伝子を含む。

【0155】

ＩＩＩ.標的ヌクレオチド配列の決定方法及びその応用
本願はさらに、上述のいずれかの１つの標的富化方法によって標的ヌクレオチド配列のアンプリコンをシークエンシングすることにより、核酸試料中の１つないしそれ以上の関心対象の遺伝子座を有する標的ヌクレオチド配列を決定する方法を提供する。

【0156】

したがって、いくつかの実施形態では、標的ヌクレオチド配列を含有する核酸テンプレートを含む核酸試料から、関心対象の遺伝子座を有する標的ヌクレオチド配列を決定する方法であって、（ａ）第１の末端に二本鎖部分を有し、第２の末端に非二本鎖部分を有するオリゴヌクレオチドであるユニバーサルアダプターを、第１の末端によって当該核酸テンプレートにライゲートすることにより、ライゲートされた核酸を提供するステップと、（ｂ）ライゲートされた核酸を、標的ヌクレオチド配列を含む第１の鎖、及び第２の鎖に解離させるステップと、（ｃ）外部プライマーは、ライゲートされた核酸の第１の鎖中の標的ヌクレオチド配列の近傍にアニールするステップと、（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼを用いて、外部プライマーを、ライゲートされた核酸の第１鎖の全長にわたって伸長させることにより、新生プライマー伸長二本鎖を提供するステップと、（ｅ）十分に高い温度で新生プライマー伸長二本鎖を、ライゲートされた核酸の第１の鎖と一本鎖プライマー伸長生成物に解離させるステップと、（ｆ）ステップ（ｃ）～（ｅ）を繰り返して１つないしそれ以上のプライマー伸長サイクルを行うステップと、（ｇ）標的ヌクレオチド配列のＰＣＲ増幅に十分な条件下で、一本鎖プライマー伸長生成物をＤＮＡポリメラーゼ、ユニバーサルアダプタープライマー及び内部プライマーに接触させるステップであって、当該ユニバーサルアダプタープライマーは、一本鎖プライマー伸長生成物におけるユニバーサルアダプターの非二本鎖部分の相補的配列にアニールし、当該内部プライマーは、３'末端において、標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールした配列を含み、かつ、関心対象の遺伝子座について、当該内部プライマーは外部プライマーに対してネストされたものであるステップと、（ｈ）ステップ（ｇ）を繰り返して１つないしそれ以上の（例えば約２～１００（例えば約５～５０又は約１０～３０）の）ＰＣＲ増幅サイクルを行うことにより、標的ヌクレオチド配列のアンプリコンを提供するステップと、（ｉ）標的ヌクレオチド配列のアンプリコンに対して次世代シークエンシングを行うことにより、標的ヌクレオチド配列を提供するステップと、を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）～（ｈ）は、ライゲートされた核酸の第１の鎖に特異的にアニールした第１組の外部プライマー及び内部プライマーと、ライゲートされた核酸の第２の鎖に特異的にアニールした第２組の外部プライマー及び内部プライマーとを用いる。いくつかの実施形態では、第１組の外部プライマー及び第２組の外部プライマーは、少なくとも１３ヌクレオチド長の第１の５'タグ配列を含み、かつ第１組の内部プライマー及び第２組の内部プライマーは、少なくとも１３ヌクレオチド長の第２の５'タグ配列を含む。

【0157】

本明細書に記載の方法は多重フォーマットで用いうる。いくつかの実施形態では、前記方法は、複数の異なる関心対象の遺伝子座を有する標的ヌクレオチド配列の決定及び／又は配列変異体の検出のために使用しうる。いくつかの実施形態では、少なくとも約１５００の（例えば、少なくとも約２０００、２５００、３０００、４０００、５０００又はより多くの）異なる関心対象の遺伝子座を有する標的ヌクレオチド配列を同時に決定する。いくつかの実施形態では、約２～５０００個の（例えば約２～１００個、５～２００個、１００～２０００個、２～２０００個、１０１～５０００個、１５００～５０００個のうちのいずれか）関心対象の遺伝子座を有する標的ヌクレオチド配列を同時に決定する。いくつかの実施形態では、各標的ヌクレオチド配列のリード平均カバレッジは少なくとも約２×、１０×、２０×、５０×、１００×、２００×、５００×、１０００×、１００００×のうちのいずれか又はより高い。

【0158】

いくつかの実施形態では、関心対象の遺伝子座を有する標的ヌクレオチド配列は１つの核酸試料に由来する。いくつかの実施形態では、関心対象の遺伝子座を有する標的ヌクレオチド配列は複数の（例えば少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、１０のうちのいずれか又はより多くの）核酸試料に由来する。異なる核酸試料は、試料バーコードを含むユニバーサルアダプターを用いてバーコード化することができ、かつプライマー伸長サイクルの前にそれらをプールするか、或いは標的富化ステップの終了時にその増幅産物をプールすることで、複数の核酸試料に由来する標的ヌクレオチド配列を同時にシークエンシングすることを可能にする。

【0159】

いくつかの実施形態では、標的富化ステップの間に、特定のＮＧＳプラットフォームへの使用に適するシークエンシングプライマーの配列を標的ヌクレオチド配列のアンプリコン中に導入する。いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプター（例えば非二本鎖部分又は二本鎖部分）は、ステップ（ｉ）に用いられる第１のシークエンシングプライマーの配列と同一の又は相補的な配列を含むか、又は、ユニバーサルアダプタープライマーは５'末端に、第１のシークエンシングプライマーの配列と同一の又は相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｇ）は、標的ヌクレオチド配列のＰＣＲ増幅に十分な条件下で、一本鎖プライマー伸長生成物をＤＮＡポリメラーゼ、ユニバーサルアダプタープライマー、内部プライマー及びシークエンシングアダプタープライマーに接触させ、前記シークエンシングアダプタープライマーは３'末端に、内部プライマーの配列と同一の配列を含み、かつ５'末端に、ステップ（ｉｉ）に用いられる第２のシークエンシングプライマーの配列と同一の又は相補的な配列を含む。

【0160】

いくつかの実施形態では、前記方法はさらに、ステップ（ｉｉ）の次世代シークエンシングの前に標的ヌクレオチド配列のアンプリコンを用いて、シークエンシングライブラリーを作製することを含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、ＰＣＲ増幅サイクルの後に標的ヌクレオチド配列のアンプリコンをクリーンアップすることを含む。いくつかの実施形態では、前記方法はアンプリコンを断片化することを含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、複数の試料に由来する標的ヌクレオチド配列のアンプリコンを定量化し、かつ標的ヌクレオチド配列のアンプリコンをプールして１つのシークエンシングライブラリーにすることを含む。いくつかの実施形態では、シークエンシングステップ用のシークエンシングライブラリーを構築するために、標的ヌクレオチド配列のアンプリコンを別のプロセスに供して、アダプターを添加するか及び／又はプライマー配列をシークエンシングする。

【0161】

本明細書に記載の「次世代シークエンシング」又は「ＮＧＳ」とは、何千から何百万ものシークエンシング反応を行って読み取ることにより、通常のシークエンシング法（例えばＳａｎｇｅｒシークエンシング）で可能であった速度を超える速度でオリゴヌクレオチドをシークエンシングする能力を有するオリゴヌクレオチドシークエンシング技術を意味する。次世代シークエンシング法／プラットフォームの非制限的な例には、Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ （Ｌｙｎｘ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、４５４ピロシークエンシング（４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ/Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、固相可逆的ダイターミネーターシークエンシング（ Ｓｏｌｅｘａ/Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、ＳＯＬｉＤ 技術（ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、イオン半導体シークエンシング（ＩＯＮ ＴＯＲＲＥＮＴ^ＴＭ）、ＤＮＡ ナノボールシークエンシング（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、並びにＰａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎ Ｂｉｏ－ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、及び Ｈｅｌｉｃｏｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能な技術が挙げられる。

【0162】

いくつかの実施形態では、シークエンシングプライマーは、選択された次世代シークエンシング法と適合性の部分を含みうる。次世代シークエンシング技術及び関連するシークエンシングプライマーの制約及び設計パラメータは、当技術分野において周知である（例えばＳｈｅｎｄｕｒｅ, ｅｔ ａｌ., 「Ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ,」 Ｎａｔｕｒｅ, ２００８, ｖｏｌ. ２６, Ｎｏ. １０, １ １３５－１ １４５； Ｍａｒｄｉｓ,「Ｔｈｅ ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃｓ,」 Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ, ２００７, ｖｏｌ. ２４, Ｎｏ. ３, ｐｐ. １３３－１４１ ； Ｓｕ, ｅｔ ａｌ., 「Ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ」 Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ, ２０１ １ , １ １（３）:３３３－４３； Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ., 「Ｔｈｅ ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｎ ｇｅｎｏｍｉｃｓ」, Ｊ Ｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ, ２０１ １ , ３８（３）:９５－１０９；Ｎｙｒｅｎ, Ｐ. ｅｔ ａｌ. Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２０８: １７１７５ （１９９３）；Ｂｅｎｔｌｅｙ, Ｄ. Ｒ. Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇｅｎｅｔ Ｄｅｖ １６:５４５－５２ （２００６）； Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇ, Ｒ. Ｌ., ｅｔ ａｌ. Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ Ｔｏｄａｙ １３:５６９－７７ （２００８）；米国特許Ｎｏ. ７,２８２,３３７；米国特許 Ｎｏ. ７,２７９,５６３；米国特許 Ｎｏ. ７,２２６,７２０ ；米国特許Ｎｏ. ７,２２０,５４９；米国特許 Ｎｏ. ７,１６９,５６０；米国特許 Ｎｏ. ６,８１８,３９５；米国特許 Ｎｏ. ６,９１ １ ,３４５；米国特許出願公開 Ｎｏ. ２００６/０２５２０７７、Ｎｏ. ２００７/００７０３４９ 及び Ｎｏ. ２００７００７０３４９を参照されたい。これらの参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）。

【0163】

いくつかの実施形態では、ピロシークエンシング技術を含む。ピロシークエンシングは、特定のヌクレオチドが新生鎖中に組み込まれる時の無機ピロリン酸（ＰＰｉ）の放出を検出する（Ｒｏｎａｇｈｉ, Ｍ.、Ｋａｒａｍｏｈａｍｅｄ, Ｓ.、Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ, Ｂ.、Ｕｈｌｅｎ, Ｍ. 及びＮｙｒｅｎ, Ｐ. （１９９６）「Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｒｅｌｅａｓｅ.」、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４２（１）, ８４－９；Ｒｏｎａｇｈｉ, Ｍ. （２００１）「Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｓｈｅｄｓ ｌｉｇｈｔ ｏｎ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ.」Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ. １１（１）, ３－１１；Ｒｏｎａｇｈｉ, Ｍ.、Ｕｈｌｅｎ, Ｍ. 及び Ｎｙｒｅｎ, Ｐ. （１９９８）「Ａ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ.」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１（５３７５）, ３６３、米国特許Ｎｏ. ６,２１０,８９１、米国特許Ｎｏ. ６,２５８,５６８ 及び米国特許Ｎｏ. ６,２７４,３２０が挙げられ、これらの参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）。ピロシークエンシングでは、放出されたＰＰｉは、ＡＴＰスルフリラーゼによってアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）に直ちに変換されることによって検出することができ、生じたＡＴＰのレベルは、ルシフェラーゼによって製造される光子を介して検出することができる。

【0164】

合成しながらシークエンシングする（ＳＢＳ）別の例示的な技術において、例えば米国特許Ｎｏ. ７,４２７,６７３、米国特許Ｎｏ. ７,４１４,１１６ 及び米国特許Ｎｏ. ７,０５７,０２６（これらの特許文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）に記載の開裂可能又は光脱色可能な顔料標識を含有する可逆的ターミネーターヌクレオチドを段階的に添加することにより、サイクルシークエンシングを行う。このアプローチは、Ｓｏｌｅｘａ社（現Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）により市販されており、また、ＷＯ ９１/０６６７８及びＷＯ ０７/１２３,７４４（米国特許局及び商標局へ米国出願Ｎｏ.１２/２９５,３３７として提出された）にも記載されており、これらの特許文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。蛍光標識されたターミネーター（ターミネーションを反転可能で、かつ蛍光標識を開裂しうる）を利用可能なため、効率的な周期的可逆的ターミネーション（ＣＲＴ）シークエンシングが容易になる。また、ポリメラーゼも共に設計（ｃｏ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）して、これらの修飾ヌクレオチドを効率的に組み込み、修飾ヌクレオチドから伸長させることもできる。

【0165】

本明細書に記載の方法及びシステムとともに利用可能な別の例示的なＳＢＳシステム及び方法は、米国特許出願公開Ｎｏ. ２００７/０１６６７０５ 、米国特許出願公開Ｎｏ. ２００６/０１８８９０１ 、米国特許Ｎｏ. ７,０５７,０２６、米国特許出願公開Ｎｏ. ２００６/０２４０４３９、米国特許出願公開Ｎｏ. ２００６/０２８１１０９、ＰＣＴ公開Ｎｏ. ＷＯ ０５/０６５８１４、米国特許出願公開Ｎｏ. ２００５/０１００９００、ＰＣＴ公開Ｎｏ. ＷＯ ０６/０６４１９９及びＰＣＴ公開Ｎｏ. ＷＯ ０７/０１０,２５１に記載されており、これらの文献の内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。

【0166】

いくつかの実施形態では、ライゲート法によるシークエンシングを利用することができる。そのような手法は、ＤＮＡリガーゼを利用して短いオリゴヌクレオチドに結合し、かつその短いオリゴヌクレオチドが結合したことを識別する。本明細書に記載の方法及びシステムとともに使用し得る例示的なＳＢＳシステム及び方法は、米国特許Ｎｏ. ６,９６９,４８８、米国特許Ｎｏ. ６,１７２,２１８ 及び米国特許Ｎｏ. ６,３０６,５９７に記載されており、これらの文献の内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。

【0167】

いくつかの実施形態では、例えば次次世代技術のような手法を含みうる。その例としては、ナノポアシークエンシング技術が挙げられる（Ｄｅａｍｅｒ, Ｄ. Ｗ. ＆Ａｋｅｓｏｎ, Ｍ. 「Ｎａｎｏｐｏｒｅｓ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ: ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ｆｏｒ ｕｌｔｒａｒａｐｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ.」、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ. １８, １４７－１５１ （２０００）； Ｄｅａｍｅｒ, Ｄ. ＆Ｄ.Ｂｒａｎｔｏｎ, 「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｂｙ ｎａｎｏｐｏｒｅ ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ａｃｃ. Ｃｈｅｍ. Ｒｅｓ. ３５:８１７－８２５ （２００２）； Ｌｉ, Ｊ.、Ｍ. Ｇｅｒｓｈｏｗ、Ｄ. Ｓｔｅｉｎ、Ｅ. Ｂｒａｎｄｉｎ ＆Ｊ. Ａ. Ｇｏｌｏｖｃｈｅｎｋｏ, 「ＤＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ａ ｓｏｌｉｄ－ｓｔａｔｅ ｎａｎｏｐｏｒｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ」、 Ｎａｔ. Ｍａｔｅｒ. ２:６１１－６１５（２００３）が挙げられ、これらの文献の内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）。このような実施形態において、標的核酸はナノポアを通過する。ナノポアは、合成ポア、又は、α‐ヘモリジン等の生体膜タンパク質とすることができる。標的核酸がナノポアを通過するため、各塩基対は当該ポアの導電率の変動を測定することにより識別することができる（米国特許Ｎｏ. ７,００１,７９２；Ｓｏｎｉ, Ｇ. Ｖ. ＆Ｍｅｌｌｅｒ, 「Ａ. Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｔｏｗａｒｄ ｕｌｔｒａｆａｓｔ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｓｏｌｉｄ－ｓｔａｔｅ ｎａｎｏｐｏｒｅｓ.」、Ｃｌｉｎ. Ｃｈｅｍ. ５３, １９９６－２００１ （２００７）；Ｈｅａｌｙ, Ｋ. 「Ｎａｎｏｐｏｒｅ－ｂａｓｅｄ ｓｉｎｇｌｅ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ＤＮＡ ａｎａｌｙｓｉｓ.」Ｎａｎｏｍｅｄ. ２, ４５９－４８１ （２００７）；Ｃｏｃｋｒｏｆｔ, Ｓ. Ｌ., Ｃｈｕ, Ｊ., Ａｍｏｒｉｎ, Ｍ. ＆Ｇｈａｄｉｒｉ, Ｍ. Ｒ. 「Ａ ｓｉｎｇｌｅ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｎａｎｏｐｏｒｅ ｄｅｖｉｃｅ ｄｅｔｅｃｔｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｉｔｈ ｓｉｎｇｌｅ－ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ.」、Ｊ. Ａｍ. Ｃｈｅｍ. Ｓｏｃ. １３０, ８１８－８２０ （２００８）が挙げられ、これらの文献の内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）。このような実施形態では、ナノポアシークエンシング技術は、本明細書に記載の方法によって生成する配列情報を確認するのに用いうる。

【0168】

いくつかの実施形態は、ＤＮＡポリメラーゼ活性のリアルタイムモニタリングを実施する方法を利用することができる。ヌクレオチド組み込みは、例えば米国特許Ｎｏ. ７,３２９,４９２及び米国特許Ｎｏ. ７,２１１,４１４（これらの特許は、その全体が参照により本明細書に組み込まれ）に記載されるように、フルオロフォア保有ポリメラーゼとγ‐リン酸標識ヌクレオチドとの間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）相互作用によって、又は、例えば米国特許Ｎｏ. ７,３１５,０１９（この特許の全体は参照により本明細書に組み入れられる）に記載されるように、及び、例えば米国特許Ｎｏ. ７,４０５,２８１及び米国特許出願公開Ｎｏ. ２００８/０１０８０８２（これらの特許は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる） に記載されるように、蛍光ヌクレオチド類似体及び操作されたポリメラーゼを用いて、ゼロモード導波管を用いて検出することができる。照明は、表面凍結ポリメラーゼ（ｓｕｒｆａｃｅ－ｔｅｔｈｅｒｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）周囲のゼプトリットルスケール（ｚｅｐｔｏｌｉｔｅｒ－ｓｃａｌｅ）体積に限定して、蛍光標識したヌクレオチドの組込を低バックグラウンドで観測できるようにする（Ｌｅｖｅｎｅ, Ｍ. Ｊ. ｅｔ ａｌ. 「Ｚｅｒｏ－ｍｏｄｅ ｗａｖｅｇｕｉｄｅｓ ｆｏｒ ｓｉｎｇｌｅ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｔ ｈｉｇｈ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ.」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９９, ６８２－６８６ （２００３）；Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔ, Ｐ. Ｍ ｅｔ ａｌ. 「Ｐａｒａｌｌｅｌ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｉｎ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ.」Ｏｐｔ. Ｌｅｔｔ. ３３, １０２６－１０２８ （２００８）；Ｋｏｒｌａｃｈ, Ｊ. ｅｔ ａｌ. 「Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｌｕｍｉｎｕｍ ｐａｓｓｉｖａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｉｎ ｚｅｒｏ－ｍｏｄｅ ｗａｖｅｇｕｉｄｅ ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ.」Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ＵＳＡ １０５, １１７６－１１８１ （２００８）が挙げられ、これらの特許の内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）。一例では、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ.社によって提供される単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）ＤＮＡシークエンシング技術は、本明細書に記載の方法とともに使用し得る。いくつかの実施形態では、ＳＭＲＴチップなどを使用することができる（米国特許Ｎｏ. ７,１８１,１２２、Ｎｏ. ７,３０２,１４６、Ｎｏ. ７,３１３,３０８が挙げられ、上記特許文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ＳＭＲＴチップは複数のゼロモード導波管（ＺＭＷ）を含む。ＺＭＷの各々は、透明基板によって支持された薄い金属膜を貫通する直径が数十ナノメートルである円筒状の孔を含む。透明基板を通ってＺＭＷを照射する時、減衰した光は、各ＺＭＷの低２０～３０ｎｍを透過し、約１×１０ －２１ Ｌの検出量を形成することができる。比較的小さい検出量は、観察され得るバックグラウンドの量を減少させることによって蛍光シグナルの検出感度を増加させる。

【0169】

ＳＭＲＴチップ及び類似技術は、ヌクレオチドの末端リン酸に蛍光標識されたヌクレオチド単量体と組み合わせて使用することができる（Ｋｏｒｌａｃｈ Ｊ. ｅｔ ａｌ.,「Ｌｏｎｇ, ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｅ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ １００％ ｄｙｅ－ｌａｂｅｌｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ.」Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ, Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ, ２７:１０７２－ １０８３, ２００８が挙げられ、当該文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）。当該ヌクレオチドをポリヌクレオチドに組み込む時、標識はヌクレオチド単量体から取り除かれる。そのため、標識はポリヌクレオチドに組み込まれることなく、シグナル：バックグラウンド比を増加させる。また、標識されたヌクレオチド単量体から標識を取り除く条件の要求が低くなる。

【0170】

Ｈｅｌｉｃｏｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社は、本明細書に記載のいくつかの実施形態と組み合わせ使用可能なシークエンシングプラットフォームの別の例示を提供する。いくつかの実施形態では、真の一分子配列決定を使用できる（Ｈａｒｒｉｓ Ｔ. Ｄ. ｅｔ ａｌ.,「Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ａ ｖｉｒａｌ Ｇｅｎｏｍｅ」 Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２０:１０６－１０９ （２００８）が挙げられ、当該文献はその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。１つの実施形態では、標的核酸のライブラリーは、各標的核酸に３'ポリ（Ａ）尾部を付加することによって作製しうる。ポリ（Ａ）尾部は、カバーガラスに固定されたポリ（Ｔ）オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。ポリ（Ｔ）オリゴヌクレオチドは、標的核酸と相補的なポリヌクレオチドを伸長させるためのプライマーとして使用しうる。１つの実施形態では、蛍光標識されたヌクレオチド単量体、つまりＡ、Ｃ、Ｇ又はＴは、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で標的核酸に１回に１つずつ送達される。標的核酸と相補的なポリヌクレオチドへの標識ヌクレオチドの組み込みを検出し、かつカバーガラス上における蛍光シグナルの位置は、伸長された分子を示す。シークエンシングサイクルを続けるために、次のヌクレオチドを加える前に蛍光標識を除去する。各ポリヌクレオチド鎖におけるヌクレオチドの組み込みを追跡することにより、個々の標的核酸についての配列情報を提供することが可能になる。

【0171】

本明細書に記載の方法はさらに、１つ又は複数のデータ分析ステップを含みうる。各種の方法によりシークエンシングリードを分析することができる。いくつかの実施形態では、コンピュータソフトウェアなどの自動化プロセスを用いてシークエンシングリードを分析することで、標的遺伝子座での対立遺伝子を検出する（例えば、野生型対立遺伝子、或いは、例えば染色体再編成、ＳＮＶ、挿入または欠失、ＣＮＶ又はスプライス変異といった突然変異）。いくつかの実施形態では、シークエンシングリード中の分子バーコードの配列に基づいて、同じ鋳型核酸由来のアンプリコンのシークエンシングリードを同定し、かつそれらを１つの配列にプールする。いくつかの実施形態では、突然変異を検出するためにＤＮＡテンプレート及びＲＮＡテンプレートに由来するヌクレオチド配列を同時に分析する。本明細書はさらに、複数の関心対象の遺伝子座のヌクレオチド配列を決定するためのコンピュータソフトウェア及びシステムを提供する。

【0172】

シークエンシングリードと、ゲノム及び／又はｃＤＮＡ配列の既知の配列データベースとを整列させる方法は当技術分野において周知であり、かつ当該プロセスに適用するソフトウェアは市販されている。いくつかの実施形態では、野生型配列データベースに全体的にマッピングされていないリード（シークエンシングプライマー及び／又はアダプターヌクレオチド配列を除く）は、ゲノム再編成又は大きな挿入または欠失変異であってもよい。

【0173】

いくつかの実施形態では、ゲノム中の複数の位置にマッピングされた配列を含むリード（シークエンシングプライマー及び／又はアダプターヌクレオチド配列を除く）は、ゲノム再編成でありうる。本明細書に記載のいくつかの実施形態は、ヌクレオチド試料中の標的ヌクレオチド配列を参照配列と対比するか、及び／又は１つの試料の標的ヌクレオチド配列を参照試料の標的ヌクレオチド配列と対比することを含む。参照配列及び参照値はデータベースから得られる。参照試料は健康な個体又は野生型個体、組織或いは細胞に由来する試料であってもよい。例えばいくつかの実施形態では、個体の腫瘍細胞に由来する標的ヌクレオチド配列を分析し、同一の個体の健康細胞に由来する標的ヌクレオチド配列と対比して診断を提供する。

【0174】

配列変異体の検出方法
本願はさらに、本明細書に記載の標的ヌクレオチド配列の決定方法のいずれかにより核酸試料中に１つないしそれ以上の関心対象の遺伝子座を有する標的ヌクレオチド配列を決定し、かつ標的ヌクレオチド配列中の配列変異体を検出することを含む、核酸テンプレートを含む核酸試料中の関心対象の遺伝子座での配列変異体を検出する方法をさらに含む。

【0175】

いくつかの実施形態では、核酸テンプレートを含む核酸試料中の関心対象の遺伝子座での配列変異体を検出する方法であって、前記核酸テンプレートは関心対象の遺伝子座を有する標的ヌクレオチド配列を含み、当該方法は、（ａ）第１の末端に二本鎖部分を有し、第２の末端に非二本鎖部分を有するオリゴヌクレオチドであるユニバーサルアダプターを、第１の末端によって当該核酸テンプレートにライゲートすることにより、ライゲートされた核酸を提供するステップと、（ｂ）ライゲートされた核酸を、標的ヌクレオチド配列を含む第１の鎖、及び第２の鎖に解離させるステップと、（ｃ）外部プライマーは、ライゲートされた核酸の第１の鎖中の標的ヌクレオチド配列の近傍にアニールするステップと、（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼを用いて、外部プライマーを、ライゲートされた核酸の第１鎖の全長にわたって伸長させることにより、新生プライマー伸長二本鎖を提供するステップと、（ｅ）十分に高い温度で新生プライマー伸長二本鎖を、ライゲートされた核酸の第１の鎖と一本鎖プライマー伸長生成物に解離させるステップと、（ｆ）ステップ（ｃ）～（ｅ）を繰り返して１つないしそれ以上のプライマー伸長サイクルを行うステップと、（ｇ）標的ヌクレオチド配列のＰＣＲ増幅に十分な条件下で、一本鎖プライマー伸長生成物をＤＮＡポリメラーゼ、ユニバーサルアダプタープライマー及び内部プライマーに接触させるステップであって、当該ユニバーサルアダプタープライマーは、一本鎖プライマー伸長生成物におけるユニバーサルアダプターの非二本鎖部分の相補的配列にアニールし、当該内部プライマーは、３'末端において、標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールした配列を含み、かつ、関心対象の遺伝子座について、当該内部プライマーは外部プライマーに対してネストされたものであるステップと、（ｈ）ステップ（ｇ）を繰り返して１つないしそれ以上の（例えば約２～１００、約５～５０又は約１０～３０の）ＰＣＲ増幅サイクルを行うことにより、標的ヌクレオチド配列のアンプリコンを提供するステップと、（ｉ）標的ヌクレオチド配列のアンプリコンに対して次世代シークエンシングを行うステップと、（ｊ）シークエンシングリード中の配列変異体を検出するステップと、を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）～（ｈ）は、ライゲートされた核酸の第１の鎖に特異的にアニールした第１組の外部プライマー及び内部プライマーと、ライゲートされた核酸の第２の鎖に特異的にアニールした第２組の外部プライマー及び内部プライマーとを使用する。いくつかの実施形態では、第１組の外部プライマー及び第２組の外部プライマーは、少なくとも１３ヌクレオチド長の第１の５'タグ配列を含み、かつ第１組の内部プライマー及び第２組の内部プライマーは、少なくとも１３ヌクレオチド長の第２の５'タグ配列を含む。

【0176】

本明細書に記載の方法により複数種の配列変異体を検出することができる。いくつかの実施形態では、配列変異体は生殖細胞系ＤＮＡの中で遺伝している。いくつかの実施形態では、配列変異体は体細胞突然変異又は染色体再編成に由来する。いくつかの実施形態では、配列変異体は、例えばＴ細胞やＢ細胞受容体などの複数種の免疫受容体を提供するために、体細胞高頻度変異に由来する。いくつかの実施形態では、配列変異体は操作された配列変異体である。いくつかの実施形態では、配列変異体は、例えばＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集といった遺伝子操作によるオフターゲット変異である。

【0177】

いくつかの実施形態では、複数種の配列変異体を検出する。本明細書に検出される配列変異体は１つの種類に限られない。いくつかの実施形態では、前記複数種の配列変異体は、染色体再編成、スプライス変異、点突然変異、欠失、挿入及びそれらの組み合わせから選ばれる。いくつかの実施形態では、前記複数種の配列変異体は遺伝子融合を含む。いくつかの実施形態では、前記複数種の配列変異体は染色体再編成を含む。いくつかの実施形態では、前記複数種の配列変異体は染色体転座を含む。いくつかの実施形態では、前記複数種の配列変異体は単一ヌクレオチド突然変異を含む。いくつかの実施形態では、前記複数種の配列変異体はＳＮＶを含む。いくつかの実施形態では、前記複数種の配列変異体は挿入または欠失、例えば挿入又は欠失を含む。いくつかの実施形態では、当該方法は、ＲＮＡ配列（又はｃＤＮＡ配列）に基づく遺伝子融合とゲノムＤＮＡ配列に基づく突然変異（例えばＳＮＶ又は挿入または欠失）を同時に検出する。いくつかの実施形態では、当該方法は、ＲＮＡ及びＤＮＡに基づく同時検出のために、ＦＦＰＥ試料由来の核酸試料を用いる。いくつかの実施形態では、当該方法はｃｔＤＮＡ試料を使用する。

【0178】

本明細書はさらに、標的核酸（例えばゲノムＤＮＡ）のメチル化状態を分析するためのビスルファイトシークエンシング方法も提供する。ＤＮＡメチル化は、様々な生物のゲノムの調節において重要な役割を果たす広汎なエピジェネティックな変化である。哺乳類動物ゲノムにおいて最も一般的で広く研究されているＤＮＡメチル化形態は、通常はＣｐＧジヌクレオチドという背景において、シトシン残基の炭素５位に発生する。５ｍＣの検出のために使用可能な全ゲノムビスルファイトシークエンシング方法が記載されている。重亜硫酸ナトリウムによるゲノムＤＮＡの処理は、５ｍＣよりも遥かに速くシトシンを化学的に脱アミノ化し、優先的にそれらをウラシルに変換する。ＮＧＳを使用すれば、これらは全ゲノム範囲において単一塩基対の分解能で検出することができる。１つないしそれ以上の関心対象の遺伝子座を有する標的ヌクレオチド配列のメチル化分析の方法を、高精度かつ高効率で提供するために、任意の既知のビスルファイトシークエンシングプロセスを、本明細書に記載の方法に適用することができる。

【0179】

いくつかの実施形態では、配列変異体は低い対立遺伝子頻度で存在する。例えば、配列変異体は、約５核酸テンプレートあたり１コピー、１０核酸テンプレートあたり１コピー、５０核酸テンプレートあたり１コピー、１００核酸テンプレートあたり１コピー、５００核酸テンプレートあたり１コピー、１０００核酸テンプレートあたり１コピー、１００００核酸テンプレートあたり１コピーのうちのいずれか又はより低い頻度で存在しうる。

【0180】

ＩＶ. 応用
上記方法は、臨床診断及び予後並びに遺伝子操作ためのツールを含む複数種の応用に利用し得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法のいずれかを用いて、個体由来の核酸試料中の関心対象の遺伝子座における疾患に関連する配列変異体を検出することにより、疾患についての診断を提供する、個体の疾患（例えば遺伝性疾患又はがん）を診断する方法を提供する。

【0181】

したがって、いくつかの実施形態では、個体の疾患（例えば遺伝性疾患又はがん）を診断する方法であって、（ａ）個体から、標的ヌクレオチド配列を含有する核酸テンプレートを含む核酸試料を得るステップと、（ｂ）第１の末端に二本鎖部分を有し、第２の末端に非二本鎖部分を有するオリゴヌクレオチドであるユニバーサルアダプターを、第１の末端によって当該核酸テンプレートにライゲートすることにより、ライゲートされた核酸を提供するステップと、（ｃ）ライゲートされた核酸を、標的ヌクレオチド配列を含む第１の鎖、及び第２の鎖に解離させるステップと、（ｄ）外部プライマーは、ライゲートされた核酸の第１の鎖中の標的ヌクレオチド配列の近傍にアニールするステップと、（ｅ）ＤＮＡポリメラーゼを用いて、外部プライマーを、ライゲートされた核酸の第１鎖の全長にわたって伸長させることにより、新生プライマー伸長二本鎖を提供するステップと、（ｆ）十分に高い温度で新生プライマー伸長二本鎖を、ライゲートされた核酸の第１の鎖と一本鎖プライマー伸長生成物に解離させるステップと、（ｇ）ステップ（ｄ）～（ｆ）を繰り返して１つないしそれ以上のプライマー伸長サイクルを行うステップと、（ｈ）標的ヌクレオチド配列のＰＣＲ増幅に十分な条件下で、一本鎖プライマー伸長生成物をＤＮＡポリメラーゼ、ユニバーサルアダプタープライマー及び内部プライマーに接触させるステップであって、当該ユニバーサルアダプタープライマーは、一本鎖プライマー伸長生成物におけるユニバーサルアダプターの非二本鎖部分の相補的配列にアニールし、当該内部プライマーは、３'末端において標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする配列を含み、かつ、関心対象の遺伝子座について、当該内部プライマーは外部プライマーに対してネストされたものであるステップと、（ｉ）ステップ（ｈ）を繰り返して１つないしそれ以上の（例えば約２～１００、約５～５０又は約１０～３０の）ＰＣＲ増幅サイクルを行うことにより、標的ヌクレオチド配列のアンプリコンを提供するステップと、（ｊ）標的ヌクレオチド配列のアンプリコンに対して次世代シークエンシングを行うステップと、（ｋ）シークエンシングリード中の疾患に関連する配列変異体を検出することにより、疾患についての診断を提供するステップと、を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）～（ｉ）は、ライゲートされた核酸の第１の鎖に特異的にアニールした第１組の外部プライマー及び内部プライマーと、ライゲートされた核酸の第２の鎖に特異的にアニールした第２組の外部プライマー及び内部プライマーとを使用する。いくつかの実施形態では、第１組の外部プライマー及び第２組の外部プライマーは、少なくとも１３ヌクレオチド長の第１の５'タグ配列を含み、かつ第１組の内部プライマー及び第２組の内部プライマーは、少なくとも１３ヌクレオチド長の第２の５'タグ配列を含む。いくつかの実施形態では、当該方法はさらに、疾患に関わる遺伝子の発現レベルを決定することを含む。

【0182】

いくつかの実施形態では、当該方法は、例えば遺伝性疾患又はがんなどの疾患の治療に関する情報を提供する。いくつかの実施形態では、当該方法は、疾患の治療を補助するために使用しうる。いくつかの実施形態では、疾患に関連する複数種の配列変異体を検出する。いくつかの実施形態では、配列変異体は、遺伝性疾患又はがんに関連する既知の配列変異体である。いくつかの実施形態では、配列変異体は、がん遺伝子又は腫瘍サプレッサーに関連する。いくつかの実施形態では、配列変異体は、融合がん遺伝子である。

【0183】

いくつかの実施形態では、当該方法はがんの診断に用いられる。いくつかの実施形態では、がんは肺がん、乳がん又は大腸がんである。いくつかの実施形態では、がんは非小細胞肺がんである。いくつかの実施形態では、当該方法は、がんに関連するＳＮＶ、挿入または欠失、ＣＮＶ、遺伝子融合及び／又は異常なＲＮＡ発現を検出する。いくつかの実施形態では、当該方法は無細胞ＤＮＡ試料を使用し、例えば循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）試料を使用する。いくつかの実施形態では、当該方法はＦＦＰＥ試料由来の核酸試料を使用する。いくつかの実施形態では、当該方法はｃＤＮＡ（又はＲＮＡ）及びｇＤＮＡ配列の両方に基づいて配列変異体を検出する。

【0184】

いくつかの実施形態では、配列変異体は肺がんに関連する。いくつかの実施形態では、配列変異体は、ＡＬＫ、ＲＯＳ１、ＲＥＴ及び／又はＲａｓにある。ＡＬＫ、ＲＯＳ１及びＲＥＴ遺伝子に関わりかつ融合がん遺伝子を生じる遺伝子再編成は当技術分野において周知である（例えばＳｏｄａ ｅｔ ａｌ. Ｎａｔｕｒｅ ２００７ ４４８５６１－６；Ｒｉｋｏｖａ ｅｔ ａｌ. Ｃｅｌｌ ２００７ １３１:１１９０－１２０３；Ｋｏｈｎｏ ｅｔ ａｌ. Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１２ １８:３７５－７；Ｔａｋｏｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ. Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１２ １８:３７８－８１を参照）。しかし、遺伝子再編成の正確な位置（例えば、ＡＬＫ、ＲＯＳ１及び／又はＲＥＴ遺伝子において再編成が発生する位置）及び再編成に関与する第２の遺伝子のアイデンティティは変化し得る。本明細書に記載の方法において、そのような再編成の存在及びアイデンティティは、再構成の位置又は遺伝子再構成に関係する第２の遺伝子のアイデンティティを知る必要なく、検出されうる。

【0185】

本明細書に記載の方法の応用の非制限的な例には、血液悪性腫瘍マーカー及びそのパネル（例えば、リンパ腫及び白血病における染色体再編成を検出するための応用を含む）の検出、肉腫関連染色体再編成及びそのパネルの検出、リンパ腫の試験のためのＩＧＨ／ＴＣＲ遺伝子再編成及びそのパネルの検出、および、肺がん、乳がん又は大腸がんに関連する遺伝子集団の検出、を含む。

【0186】

がんに対するある治療は、特定のがん遺伝子を含む腫瘍に対して特に有効であり、例えば所定の融合がん遺伝子の作用又は発現を標的とする治療剤は、当該融合がん遺伝子を含む腫瘍に対して有効でありうるが、融合がん遺伝子を欠如する腫瘍に対しては有効ではない。本明細書に記載の方法は、がん遺伝子の状態（例えば突然変異及び／又は染色体再編成）を明らかにする特異的配列を決定することができる。本明細書に記載の如き、本明細書に記載の方法は、片側の隣接配列のみが既知である特異的配列を決定することができ、例えば、本明細書に記載の方法は、正確な位置及び／又は再編成パートナーが、本明細書に記載の方法を行う前にわかっていない、既知のがん遺伝子を伴う遺伝子再再編成の存在及びアイデンティティを決定することができる。

【0187】

いくつかの実施形態では、当該方法、複数の試料及び／又は遺伝子の組み合わせ又は関心対象の遺伝子座に対する多重分析に使用される。いくつかの実施形態では、当該方法は、遺伝性疾患に関連する遺伝子の組み合わせをシークエンシングするために使用される。いくつかの実施形態では、当該方法は、がんに関連する遺伝子の組み合わせ（例えばがん遺伝子又は腫瘍抑制遺伝子）をシークエンシングするために使用される。

【0188】

下記表１には、本明細書に記載のがんの診断のための方法により検出できる配列変異体及び遺伝子の非制限的な例、及び、配列変異体を有するがんの治療に使用できる例示的な試薬が挙げられている。

【0189】

【表1】

【0190】

「個体」とはヒト又は動物を指す。いくつかの実施形態では、個体は、例えば霊長類動物、齧歯類動物、家畜動物又は狩猟動物などの脊椎動物である。霊長類動物は、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、及び、例えばアカゲザルのようなマカクを含む。齧歯動物は、マウス、ラット、グラウンドホッグ、フェレット、ウサギ、及びハムスターを含む。家畜及び狩猟動物は、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、例えばネコのようなネコ種、例えばイヌ、キツネ、オオカミのようなイヌ種、例えばニワトリ、エミュー、ダチョウのような鳥類、及び、例えばマス、ナマズ及びサケのような魚類を含む。いくつかの実施形態では、個体は、例えばヒト、非ヒト霊長類動物、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ又はウシのような哺乳類動物である。技術用語「個体」、「患者」及び「被検者」は本明細書において互換的に用いられる。個体は、治療を必要とする状態（例えばがん）、又はそのような状態に関連する１つもしくは複数の合併症に罹っている又は有すると既に診断されているか、または同定されている、及び任意で状態または状態に関連する１つもしくは複数の合併症に関する治療を既に受けている対象でありうる。または、個体は、状態（例えばがん）または状態に関連する１つもしくは複数の合併症を有するとこれまで診断されていない個体でもありうる。例えば、個体は、状態に関するまたは状態に関連する１つもしくは複数の合併症に関する１つもしくは複数の危険因子を示す個体、または危険因子を示さない個体でありうる。

【0191】

いくつかの実施形態では、がんの治療を必要とする個体から得られた腫瘍試料において、本明細書に記載の方法のいずれかによって、がんに関連する１種又は複数種の配列変異体（例えば融合がん遺伝子又は発がん性突然変異）の存在を検出すること、及び、検出されたがんに関連する任意の配列変異体を有する腫瘍に対して有効ながん治療剤を投与すること、を含むがんの治療方法を提供する。いくつかの実施形態では、被検者から得られた腫瘍試料において、本明細書に記載の方法のいずれかによって、がんに関連する配列変異体（例えば融合がん遺伝子又は発がん性突然変異）の存在を検出し、そこで、がんに関連する配列変異体の存在を検出した場合、被検者が治療レジメンに対して応答性であると確認することを含む、がんの治療を必要とする個体が治療レジメンに応答するか否かを確認する方法を提供する。

【0192】

いくつかの実施形態では、当該方法は、インプットされる核酸の量が少なく及び／又はインプットされる核酸の品質が低い応用へ使用される。いくつかの実施形態では、当該方法は臨床試料、例えばＦＦＰＥ試料のような腫瘍生検試料をシークエンシングするために使用される。いくつかの実施形態では、当該方法は、古い試料をシークエンシングするために使用される。

【0193】

いくつかの実施形態では、当該方法は、標的ヌクレオチド配列が核酸試料において非常に低いレベルで存在する応用へ使用される。例えば、当該方法は、微生物相シークエンシング、及び新しい変種ウイルス遺伝子タイピングのために使用される。

【0194】

いくつかの実施形態では、当該方法は、例えばＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集技術によって得られた遺伝子操作された細胞集団又は動物においてクローンを同定するために使用される。いくつかの実施形態では、当該方法は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集されたオフターゲット部位（例えば従来既知又は未知のオフターゲット部位）を表すために使用される。いくつかの実施形態では、当該方法用は、細胞に基づく治療法に用いられる操作された細胞を評価するために使用される。いくつかの実施形態では、当該方法は、細胞に基づく治療法の安全性を改善するために使用され、ここで、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集技術によって個体に投与される細胞が操作される。

【0195】

いくつかの実施形態では、当該方法は、免疫細胞受容体をコードする遺伝子を同定するために使用される。いくつかの実施形態では、免疫細胞受容体はＴ細胞受容体である。いくつかの実施形態では、当該方法は、操作された免疫細胞受容体、例えばキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又は組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を同定するために使用される。いくつかの実施形態では、当該方法は、例えばＴＣＲ配列（例えばＣＤＲ３配列）の多様性を決定することによって、免疫分析に使用される。いくつかの実施形態では、当該方法は、腫瘍抗原に応答するＴＣＲ配列を同定するために使用される。いくつかの実施形態では、当該方法は、腫瘍抗原に対する免疫療法についての個体の免疫応答を評価するために使用される。

【0196】

ＩＶ. キット及び製品
本願はさらに、１つないしそれ以上の関心対象の遺伝子座を有するヌクレオチド配列を補強及び決定するための組成物、キット及び製品、或いは本明細書に記載の各種の応用を提供する。前記組成物、キット及び製品は、本明細書に記載のユニバーサルアダプター、ネストされた標的特異的プライマー、ユニバーサルアダプタープライマー、シークエンシングアダプタープライマー及びシークエンシングプライマーのうちのいずれか１種又は複数種を含みうる。

【0197】

いくつかの実施形態では、（ａ）第１の末端にライゲート可能な二本鎖部分を含みかつ第２の末端に非二本鎖部分を含むオリゴヌクレオチドであるユニバーサルアダプターと、（ｂ）ユニバーサルアダプターの非二本鎖部分の相補的配列にアニール可能なユニバーサルアダプタープライマーと、（ｃ）外部プライマーと、（ｄ）内部プライマーと、を含み、関心対象の遺伝子座について、内部プライマーが外部プライマーに対してネストされたものである、キットを提供する。いくつかの実施形態では、当該キットはさらにＤＮＡポリメラーゼ及びヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、関心対象の遺伝子座は、ＡＬＫ、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＨＲＡＳ、ＫＤＲ、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＭＥＴ、ＮＲＡＳ、ＮＴＲＫ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＥＮ、ＲＥＴ、ＲＯＳ１及びＴＰ５３から選ばれる遺伝子のうちのいずれか１つ又は複数にある。

【0198】

いくつかの実施形態では、（ａ）第１の末端にライゲート可能な二本鎖部分を含みかつ第２の末端に非二本鎖部分を含むオリゴヌクレオチドであるユニバーサルアダプターと、（ｂ）ユニバーサルアダプタープライマーであって、当該ユニバーサルアダプタープライマーは３'末端に、ユニバーサルアダプターの非二本鎖部分の相補的配列に特異的にアニール可能な配列を含み、かつ５'末端又は当該ユニバーサルアダプターに、ＮＧＳプラットフォームに適合する第１のシークエンシングプライマーの配列と同一の又は相補的な配列を含むユニバーサルアダプタープライマーと、（ｃ）外部プライマーと、（ｄ）内部プライマーとを、を含み、関心対象の遺伝子座について、内部プライマーが外部プライマーに対してネストされたものである、キットを提供する。いくつかの実施形態では、内部プライマーは、ＮＧＳプラットフォームに適合する第２のシークエンシングプライマーの配列と同一の又は相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、当該キットはさらに、３'末端に内部プライマーの配列と同一の配列を含み、５'末端にＮＧＳプラットフォームに適合する第２のシークエンシングプライマーの配列と同一の又は相補的な配列を含むシークエンシングアダプタープライマーを含む。いくつかの実施形態では、キットはさらに、第１のシークエンシングプライマー及び第２のシークエンシングプライマーを含む。いくつかの実施形態では、当該キットはさらにＤＮＡポリメラーゼ及びヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、関心対象の遺伝子座は、ＡＬＫ、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＨＲＡＳ、ＫＤＲ、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＭＥＴ、ＮＲＡＳ、ＮＴＲＫ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＥＮ、ＲＥＴ、ＲＯＳ１及びＴＰ５３から選ばれる遺伝子のうちのいずれか１つ又は複数にある。

【0199】

いくつかの実施形態では、当該キットは、関心対象の遺伝子座を有する標的ヌクレオチド配列を富化するために使用される。いくつかの実施形態では、当該キットはシークエンシングライブラリーを作製するために使用される。いくつかの実施形態では、当該キットは、関心対象の遺伝子座を有する標的ヌクレオチド配列を決定するために使用される。いくつかの実施形態では、当該キットは、関心対象の遺伝子座を有する配列変異体を検出するために使用される。いくつかの実施形態では、当該キットは、疾患又は状態を診断するために使用される。いくつかの実施形態では、当該キットは、疾患又は状態を治療するために使用される。いくつかの実施形態では、当該キットは、例えば肺がん、乳がん又は大腸がんのようながんを診断するために使用される。いくつかの実施形態では、当該キットは、例えば肺がん、乳がん又は大腸がんのようながんを治療するために使用される。

【0200】

いくつかの実施形態では、当該キットは、関心対象の遺伝子座を含む核酸テンプレートの第１の鎖に特異的にアニール可能な第１組の外部プライマー及び内部プライマーと、核酸テンプレートの第１の鎖の相補的鎖に特異的にアニール可能な第２組の外部プライマー及び内部プライマーとを含む。いくつかの実施形態では、第１組の外部プライマー及び第２組の外部プライマーは、少なくとも約１３ヌクレオチド長の第１の５'タグ配列を含み、かつ第１組の内部プライマー及び第２組の内部プライマーは、少なくとも約１３ヌクレオチド長の第２の５'タグ配列を含む。いくつかの実施形態では、当該キットは、複数組の（例えば少なくとも約２、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、１０００、２０００、５０００、１００００、２００００のうちのいずれか又はより多くの）外部プライマー及び内部プライマーを含む。いくつかの実施形態では、複数の異なる関心対象の遺伝子座を有する標的配列を富化又は決定するために、複数組の外部プライマー及び内部プライマーを用いうる。いくつかの実施形態では、前記複数組の外部プライマー及び内部プライマーは、少なくとも約２、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、１０００、２０００、５０００のうちのいずれか又はより多くの異なる関心対象の遺伝子座を有する標的配列の富化又は決定のために使用しうる。いくつかの実施形態では、複数組の外部プライマー及び内部プライマーは、約２～２００、例えば約２～１００、２～５０、５～１００、１０～１００又は５０～１５０のうちのいずれかの異なる関心対象の遺伝子座を有する標的配列の富化又は決定のために使用しうる。いくつかの実施形態では、複数組の外部プライマー及び内部プライマーは、約１００～５０００、例えば約１００～５００、５００～１０００、１００～２０００、１０００～２０００、２０００～３０００又は３０００～５０００のうちのいずれかの異なる関心対象の遺伝子座を有する標的配列の富化又は決定のために使用することができる。いくつかの実施形態では、ユーザのニーズに応じてに応じて、キットは関心対象の遺伝子座について特注設計のものである。

【0201】

いくつかの実施形態では、当該キットはさらに、核酸試料を調製するための試薬及び酵素を含む。いくつかの実施形態では、当該キットは、血液試料から核酸試料を調製するための試薬を含む。いくつかの実施形態では、当該キットは、腫瘍生検試料から核酸試料を調製するための試薬を含む。いくつかの実施形態では、当該キットは、ＦＦＰＥ試料から核酸試料を調製するための試薬を含む。いくつかの実施形態では、当該キットは、例えば循環腫瘍ＤＮＡ試料のような無細胞ＤＮＡ試料から核酸試料を調製するための試薬を含む。いくつかの実施形態では、当該キットは、少なくとも１、２、４、１０、１５、２０、１００、５００、１０００のうちのいずれか又はより多くのシークエンシングライブラリーの作製に十分な試薬、プライマー及びアダプターを提供する。

【0202】

いくつかの実施形態では、当該キットはさらに、ある配列変異体の検出に基づくがんの治療に適する試薬を含む医薬組成物を含む。例えば表１を参照されたい。

【0203】

当該キットは、例えば容器、緩衝液、試薬、又は補因子などの１種又は複数種の追加要素、又は、例えば変性剤のような追加試薬を含みうる。キットの構成要素は一緒にパッケージすることができ、かつパッケージには、キットを本明細書に記載の方法のいずれかに使用する時の取扱説明書が含まれているか、又は添付されていることができる。いくつかの実施形態では、当該キットはさらに、例えばがんのような疾患又は状態を診断及び／又は治療するための取扱説明書を含む。

【0204】

本発明から逸脱することなく種々の改変、組み合わせ及び／又は補正が行われ得るということは、当業者であれば理解できる。

【0205】

実施例
以下の実施例は、本発明について例示するのみのためであり、本発明をいかなる形でも限定するものと解釈されるべきではない。以下の実施例及び詳しい記載は、本発明を限定するものではなく、説明するためのものである。

【0206】

実施例１：がん関連配列変異体の高感度検出のための効率的な標的富化及び配列決定法
当該実施例は、がん関連配列変異体を検出する例示的な方法を示している。８つのユニバーサルアダプターの各々は、多重シークエンシングライブラリーの作製のための試料バーコードを有する。各核酸試料から、遺伝子座を合計２４６個有する標的配列を富化する。開始インプットヒトＤＮＡ試料の２つの異なる量、つまり５ｎｇと５０ｎｇを使用する。ＫＡＰＡ酵素を例として説明する。図１は当該方法を示す模式図である。

【0207】

プライマーの調製
表２に示される１つの上鎖オリゴヌクレオチド（ＴＯＰ－Ｏｌｉｇｏ、第１の鎖）と１つの下鎖オリゴヌクレオチド（ＢＯＴ－Ｏｌｉｇｏ、第２の鎖）をアニールして各ユニバーサルアダプターを調製する。また、表２には、ユニバーサルアダプタープライマー、シークエンシングプライマー、及び、ＴＰ５３遺伝子における複数の関心対象の遺伝子座に対する外部プライマー及び内部プライマーの例示的なプールが示されている。

【0208】

ブロッキング部分を有するユニバーサルアダプター又はブロッキング部分を有さないユニバーサルアダプターを用いることができる。例えば、第２の鎖中にブロッキング部分を有するユニバーサルアダプター（例えば、ホスホロチオエート修飾を有するフラップ状のヌクレオチド）は、Ｙ－ＴＯＰ－０１とＹ－ＢＯＴ－０１をアニールすることによって調製することができる。第２の鎖中にブロッキング部分を有さない対応するユニバーサルアダプターは、Ｙ－ＴＯＰ－０１と、ブロックされていないＹ－ＢＯＴ－０１をアニールすることによって調製することができる。ブロックされたユニバーサルアダプターとブロックされていないユニバーサルアダプターを使用したライブラリーの構築効率を確認する。

【0209】

【表2】

【0210】

ステップ １. １本のチューブでの断片化、末端修復、Ａ－テーリング及びライゲーション
１）断片化：氷上で、断片化緩衝液（１０Ｘ）２.５μＬ、断片化酵素（Ｆｒａｇ Ｅｎｚｙｍｅ）（ＫＡＰＡ Ｂｉｏ）５.０μＬ、及びＤＮＡ試料を混合することによって断片化したマスターミックスを調製し、かつヌクレアーゼフリー水を用いてマスターミックスを１７.５μＬにした。反応物を３７℃で１５分間インキュベートした。４℃で温度保持した。
２）末端修復及びＡ－テーリング：氷上で、末端修復及びＡ－テーリング緩衝液３.５μＬ、末端修復及びＡ－テーリング酵素混合物１.５μＬを混合することによってマスターミックスを調製した。このマスターミックス５.０μＬを上記断片化した反応物中に加え、穏やかにボルテックスして短時間遠心分離した。直ちに反応物をサーマルサイクラーに戻し、３７℃で１５分間、６５℃で１５分間インキュベーションし、次に４℃で温度保持して末端修復及びＡ－テーリングを行い、直ちに次のステップに入る。
３）アダプターライゲーション：氷上で、結合緩衝液１５.０μＬと、ＤＮＡリガーゼ５.０μＬを混合することによってマスターミックスを調製した。１０μＭユニバーサルアダプター（試料バーコード付）５.０μＬを上記末端修復及びＡ－テーリング反応物に加え、ピペッティングを５回行って穏やかに混合し、次いでマスターミックス２０.０μＬを上記ステップ２）由来の各反応物に添加し、穏やかにボルテックスして短時間遠心分離し、次に１６℃で３０分間、３０℃で３０分間インキュベーションし、かつ１２℃で温度保持した。
４）ライゲーション後のクリーンアップ（ＰＣＲ前領域に行う）：１.５容量（すなわち８２.５μＬ）のＡＭＰＵＲＥ(R)ビーズを製造業者のプロトコルに従って使用してライゲーション反応をクリーンアップし、これを最終２０μＬの１Ｘ Ｔｒｉｓ－緩衝液中で溶出させた。ビーズを次のステップ（プライマー伸長）に移す。

【0211】

ステップ ２. 標的富化 １‐プライマー伸長
ヌクレアーゼフリー水４.４μＬ、Ｔａｑポリメラーゼ緩衝液（１０Ｘ、マグネシウムフリー、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）３.０μＬ、ｄＮＴＰ混合物（１０ｍＭ）０.６μＬ、Ｍｇ２+（５０ｍＭ）１.２μＬ、ＰＬＡＴＩＮＵＭ(TM) Ｔａｑポリメラーゼ（５Ｕ/μＬ）０.３μＬ、及び外部プライマープール（５０μＭ）０.５μＬを混合することによって、プライマー伸長マスターミックスを調製した。ライゲーション後のクリーンアップ試料２０.０μＬをプライマー伸長マスターミックス３０.０μＬに加えた。得られた混合物をサーマルサイクラー中でインキュベートし、９５℃で５分間保持し、[+０.２℃／秒の速度で９５℃までに昇温、９５℃で１０秒間保持、－０.２℃／秒の速度で６０℃までに降温、６０℃で１０分間保持]を２０サイクル行い、そして、４℃で温度保持するというプロセスでプライマー伸長反応を行った。

【0212】

ＰＣＲ後領域において、１.２Ｘ容量（３６.０μＬ）のＡＭＰＵＲＥ(R)ビーズを製造業者のプロトコルに従って使用してプライマー伸長生成物をクリーンアップし、かつ２０μＬの１Ｘ Ｔｒｉｓ－緩衝液中で溶出させた。

【0213】

ステップ ３. 標的富化 ２‐ＰＣＲ
ヌクレアーゼフリー水１.９μＬ、Ｔａｑポリメラーゼ緩衝液（１０Ｘ、マグネシウムフリー、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）３.０μＬ、ｄＮＴＰ混合物（１０ｍＭ）０.６μＬ、Ｍｇ２+（５０ｍＭ）１.２μＬ、ＰＬＡＴＩＮＵＭ(TM) Ｔａｑポリメラーゼ（５Ｕ/μＬ）０.３μＬ、Ｐ５プライマー（１０μＭ）１.０μＬ、及び内部プライマープール（５０μＭ）１.０μＬを混合することによって、ＰＣＲマスターミックスを調製した。プライマー伸長後のクリーンアップ試料２０.０μＬをＰＣＲマスターミックス９.０μＬ中に加え、かつ各試料中に、１.０μＬの各対応するＩ７プライマー（バーコード付、１０μＭ）を添加した。得られた混合物をサーマルサイクラー中でインキュベートし、９５℃で５分間保持し、[９５℃で３０秒、６０℃で５分間]を１５サイクル行い、そして、４℃で温度保持する、というプロセスでポリメラーゼ連鎖反応を行った。

【0214】

ＰＣＲ後領域において、１.２Ｘ容量（３６.０μＬ）のＡＭＰＵＲＥ(R)ビーズを製造業者のプロトコルに従って使用してＰＣＲ産物をクリーンアップし、かつ２０μＬの１Ｘ Ｔｒｉｓ－緩衝液で溶出させた。

【0215】

ステップ ４. シークエンシング
クリーンアップしたＰＣＲ産物をＫＡＰＡ ｑＰＣＲキットにより定量化し、かつ標準プロトコルに従って Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシングシステムによりシークエンシングを行った。

【0216】

ステップ ５. データ分析
ｂｃｌ２ｆｑパッケージを用いて、ＢＣＬフォーマットのシークエンシングデータをＦＡＳＴＱフォーマットに変換し、Ｉ７バーコードを用いて試料の逆多重化を行った。カスタムスクリプトを用いて、初期処理されたＦＡＳＴＱファイルを、リード１に統合されたアダプターバーコードに基づいてさらに逆多重化し、次いでアダプター配列を切断した。ＢＷＡ－ＭＥＭを用いて、二重逆多重化されたＦＡＳＴＱファイルをヒトゲノム（ｈｇ１９）にマッピングした。分子バーコード配列に基づいて、同じ核酸テンプレートに由来する増幅産物配列を同定してプールした。ＢＥＤｔｏｏｌｓ、ターゲットＢＥＤファイル及びカスタムスクリプトを用いてシークエンシング仕様を計算した。ユニーク分子インデックスを認識し得るスクリプトを用いてＳＮＶ及び挿入または欠失（Ｉｎｄｅｌ）を呼び出すことにより、変異体を呼び出した。

【0217】

結果
図４（ａ）～図４（ｂ）は、ＩＧＶソフトウェアに由来するマッピングされたリードを示す図であり、ＥＧＦＲ遺伝子内に関心対象の遺伝子座を有するリード集積を示している。図４（ａ）は図Ｓ５の複製であり、Ｚｈｅｎｇ Ｚ. ｅｔ ａｌ. Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０: １４７９－１４８４ （２０１４）の記載に基づいて、使用名が「固定多重ＰＣＲ」又は「ＡＭＰ」の方法の結果を示している。ＡＭＰ法においてインプットＤＮＡを５ｎｇ使用する場合、マッピングされたリードは関心対象の遺伝子座の周りにブロック状のリード集積を有することから、少量のインプットＤＮＡを使用する場合にライブラリーの複雑さが低くなり、ライブラリー構築効率が低下することが分かった。

【0218】

これに対し、図４（ｂ）は、本実施例に記載の方法を利用した結果を示している。ＡＭＰ法と同じ量のインプットＤＮＡ（例えば、図４（ａ）及び図４（ｂ）において○で強調表示された５ｎｇのパネル中のマッピングされたリード）を用いて、本発明の方法はより平滑なリード集積を生成することから、少量のインプットＤＮＡを使用することでより高いライブラリー複雑さ及びより高いライブラリー構築効率が得られることが分かった。

【0219】

図５（ａ）及び図５（ｂ）はそれぞれ、２つのシークエンシングライブラリーＹ０１－Ｐ７４９（５０ｎｇのインプットＤＮＡを使用）とＹ０２－Ｐ７５０（５ｎｇのインプットＤＮＡを使用）の全パネルカバレッジの統計を示している。原データは、標的にマッピングされた全てのシークエンシングリードを意味する。統合されたデータは、同一の核酸テンプレートに属するシークエンシングリードを同定及び併合した後のシークエンシングリードを意味する。その結果、本明細書に記載の方法において５０ｎｇと５ｎｇのインプットＤＮＡの両方を使用する場合、標的ヌクレオチド配列をバイアスなく富化することが分かった。

【0220】

実施例２：１つの反応において、ＲＮＡに基づく遺伝子融合の検出とｇＤＮＡに基づく突然変異の検出を同時に行う。
本実施例は、１つのシークエンシング反応においてＲＮＡとｇＤＮＡに由来する配列変異体を検出することを説明する。

【0221】

ステップ １. ＦＦＰＥ 試料からＲＮＡを精製する
簡単に言えば、まずＦＯＲＭＡＰＵＲＥ(R) ＦＦＰＥキットを用いてＦＦＰＥ試料からＲＮＡを抽出した。ＱＵＢＩＴ(R) ＲＮＡキットを用いてＲＮＡ濃度を測定した。合計約１５ｎｇの全核酸（１０ｎｇの抽出したＲＮＡ及び ５ｎｇのｇＤＮＡを含む）を次のステップに供する。

【0222】

ステップ ２. 二本鎖 ｃＤＮＡの合成
１）ＲＮＡ変性： ＰＣＲチューブ内に各ＲＮＡ試料が１１.０μＬになるようにＤＥＰＣ処理された水を用いて調整し、次にランダム六量体（３００ｎｇ/μＬ）１.０μＬ及びｄＮＴＰ（１０ｍＭ）１.０μＬを添加した。ピペッティングを５回行って混合物を混合し、かつ６５℃で５分間インキュベートする（１０３℃で熱蓋（ｈｅａｔ ｌｉｄ）を「ｏｎ」にする）ことによりＲＮＡ変性を行った。インキュベートした後、直ちに試料プレートを氷水上で少なくとも１分間冷却し、短時間遠心分離し、氷上に戻した。
２）逆転写（第１の鎖ｃＤＮＡの合成）：ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ(R) ＩＶ緩衝液（５Ｘ, ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）５.０μＬ、ＲＮＡＳＥＯＵＴ(R)１.０μＬ、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ(R) ＩＶ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）１.０μＬ、及びＤＴＴ（新鮮で０.１Ｍ）２.０μＬを混合することによって、マスターミックスを調製した。マスターミックス９.０μＬをＰＣＲプレートにおける反応物の各々に加え、ピペッティングを５回行って十分に混合した。ＰＣＲプレートをサーマルサイクラー中でインキュベートし、２５℃で１０分間、４２℃で３０分間、７０℃で１５分間、４℃で温度保持する（１０３℃で熱蓋を「ｏｎ」にする）というプロセスで逆転写を行った。
３）第２の鎖ｃＤＮＡの合成：ＤＥＰＣ処理された水１８.０μＬ、１０ｘ第２の鎖反応緩衝液５.０μＬ、ＤＮＡポリメラーゼＩ ４.０μＬ、及びＲＮａｓｅ Ｈ １.０μＬを混合することによって、マスターミックスを調製した。スターミックス２８μＬを以上のステップに由来する各反応物に加え、ピペッティングを５回行って穏やかに混合した。混合の反応温度を１６℃以下に制御した。反応混合物を１６℃で２時間インキュベートし、次に４℃に温度保持した（熱蓋を「ｏｆｆ」にした）。

【0223】

ＳＰＲＩ製造業者のクリーンアッププロトコールに従って、１.８Ｘ容量（つまり９０μＬ）のＡＭＰＵＲＥ(R)ビーズを用いて反応混合物をクリーンアップし、最終１５μＬの１Ｘ Ｔｒｉｓ－緩衝液で溶出させた。

【0224】

クリーンアップした反応混合物からシークエンシングライブラリーを作製し、実施例１と同じステップ（ステップ１～５）によりシークエンシング及び分析を行った。

【0225】

図６（ａ）～図６（ｆ）は、本明細書に記載の例示的な方法によって、がんに関連する各種の遺伝子融合に対してＲＮＡに基づく検出に成功したことを示している。図７（ａ）～図７Ｂは、１つのシークエンシング試料において、ＥＭＬ４－ＡＬＫ遺伝子融合のＲＮＡに基づく検出（図７（ａ））及びＫＲＡＳ突然変異のｇＤＮＡに基づく検出（図７Ｂ）を同時に行ったことを示している。ここで検出されたＥＭＬ４－ＡＬＫ突然変異及びＫＲＡＳ突然変異（例えばＧ１２Ｄ、Ｇ１３Ｃ及びＧ１３Ｄ）の両方も肺がんを意味する。

【0226】

実施例３：標的富化方法の対比
本実施例は、標的富化１（つまり実施例１のステップ２）における指数的増幅（つまりＡＭＰ法）と線形的増幅（つまり本願の例示的な方法）、プライマー伸長サイクルの間の高速温度勾配モードと低速温度勾配モード、及び、異なる開始量のＤＮＡ試料を含む種々の標的富化方法を対比する。

【0227】

表３に示されているように、合計２４個の標的富化試料を有する多重シークエンシングライブラリーを作製して、３つの異なる実験要素を評価した。各要素は異なる２つの配置があり、かつ１式３部で各実験条件の組み合わせを測定した。３つの実験要素のほか、実施例１と同じ実験ステップを行った。この３つの要素は、（１）ＤＮＡインプット量（５０ｎｇ又は５ｎｇ）、（２）標的富化１ステップ：プライマー伸長（つまり線形的増幅）又はＰＣＲ増幅（つまり指数的増幅）、及び（３）プライマー伸長温度勾配モード（一般の勾配：９５℃で３分間保持し、[９５℃で３０秒間保持、０.５℃／秒で６０℃までに降温、６０℃で１０分間温度保持、７２℃で３０秒間保持]を２０サイクル行い、４℃に温度保持すること、及び、緩やか勾配：９５℃で３分間保持し、[９５℃で３０秒間保持、０.２℃／秒で６０℃までに降温、６０℃で１０分間温度保持、０.２℃／秒で９５℃までに昇温]を２０サイクル行い、４℃で温度保持すること）である。

【0228】

【表3】

【0229】

図８（ａ）～図８（ｄ）及び表３に示されているように、標的富化１（つまり実施例１のステップ２）においてプライマー伸長サイクル（つまり線形的増幅）を用いる方法は、ＰＣＲ増幅サイクル（つまりＰＣＲ増幅）を用いる方法に比べて、そして、温度勾配モードは一般勾配モードに比べて、５０ｎｇのＤＮＡと５ｎｇのＤＮＡの両方を用いる時により高いライブラリー構築効率を得ることができる。図９（ａ）～図９（ｄ）はさらに、１２個のシークエンシングライブラリー由来のマッピングされたリードによるＫＲＡＳエクソン２へのカバレージを示している。

【0230】

【表4】

【0231】

本明細書に記載のすべての刊行物、特許、特許出願及び公開された特許出願の開示内容は、その全文が参照により本明細書に組み入れられる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4(a)】

【図4(b)】

【図5(a)】

【図5(b)】

【図6(a)】

【図6(b)】

【図6(c)】

【図6(d)】

【図6(e)】

【図6(f)】

【図7(a)】

【図7(b)】

【図8(a)】

【図8(b)】

【図8(C)】

【図8(d)】

【図9(a)】

【図9(b)】

【図9(C)】

【図9(d)】

【配列表】

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