特許 6998465 重症感染症を診断するためのデルタ様リガンド１

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2021-12-22

(45)【発行日】2022-02-10

(54)【発明の名称】重症感染症を診断するためのデルタ様リガンド１

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/68 20060101AFI20220203BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20220203BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALI20220203BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALI20220203BHJP

   C12Q 1/6837 20180101ALI20220203BHJP

   C12Q 1/6813 20180101ALI20220203BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20220203BHJP

【ＦＩ】

G01N33/68

C12N15/12 ZNA

C12Q1/6869 Z

C12Q1/686 Z

C12Q1/6837 Z

C12Q1/6813 Z

C12Q1/02

【請求項の数】 17

(21)【出願番号】P 2020536865

(86)(22)【出願日】2018-10-25

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2021-01-07

(86)【国際出願番号】 EP2018079273

(87)【国際公開番号】W WO2019081636

(87)【国際公開日】2019-05-02

【審査請求日】2020-04-24

(31)【優先権主張番号】17198330.7

(32)【優先日】2017-10-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

【早期審査対象出願】

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】520146628

【氏名又は名称】ウニヴェルジテート ハイデルベルク

【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＡＥＴ ＨＥＩＤＥＬＢＥＲＧ

(74)【代理人】

【識別番号】100139594

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 健次郎

(74)【代理人】

【識別番号】100090251

【弁理士】

【氏名又は名称】森田 憲一

(72)【発明者】

【氏名】ヒルデブラント，ダクマー

(72)【発明者】

【氏名】ヘーグ，クラウス

(72)【発明者】

【氏名】ウーレ，フロリアン

(72)【発明者】

【氏名】ウェイガンド，マルクス

【審査官】大瀧 真理

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１０－１１５１３１（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１５／０２３３９１５（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特表２００９－５２３７０９（ＪＰ，Ａ）

【文献】PENG, T. et al.，Detection of Delta-like 1 ligand for the diagnosis of tuberculous meningitis: An effective and rapid diagnostic method，Journal of International Medical Research，2014年03月20日，Vol.42, No.3，pp.728-736

【文献】PING, S. et al.，The value of measurement of serum soluble DLL1 for diagnosis of tuberculous meningitis，Chinese Journal of Modern Drug Application，2011年06月，Vol.5, No.12，pp.9-10

【文献】YASUDA, K. et al.，Clinical significance of vascular endothelial growth factor and Delta-like ligand 4 in small pulmonary adenocarcinoma，Kawasaki Medical Journal，2014年，Vol.40, No.1，pp.23-31

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ３３／６８

Ｃ１２Ｑ １／６８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

医中誌ＷＥＢ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

敗血症のインビトロ診断のためのバイオマーカーとしてのデルタ様リガンド１タンパク質の使用。

【請求項2】

前記デルタ様リガンド１タンパク質が配列番号１のポリヌクレオチドによってコードされる、請求項１に記載の使用。

【請求項3】

前記デルタ様リガンド１タンパク質が配列番号２又は３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質である、請求項１または２に記載の使用。

【請求項4】

前記デルタ様リガンド１タンパク質が前記デルタ様リガンド１タンパク質の切断産物である、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用。

【請求項5】

前記切断産物が、配列番号４、配列番号５、配列番号６および／または配列番号７のアミノ酸配列を有するタンパク質である、請求項４に記載の使用。

【請求項6】

デルタ様リガンド１タンパク質の健康な対照又は対照患者と比較して上昇した発現レベルが敗血症の診断を示している、請求項１～５のいずれか一項に記載の使用。

【請求項7】

前記発現レベルが生物学的試料において決定される、請求項６に記載の使用。

【請求項8】

前記生物学的試料が全血、バフィーコート、血漿、血清、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣＳ）、好中球、単球、Ｔ細胞、尿、髄液、リンパ液、皮膚の外分泌物、涙および／または唾液からなる群から選択される、請求項７に記載の使用。

【請求項9】

前記発現レベルが手術後の患者から採取された生物学的試料において決定される、請求項６に記載の使用。

【請求項10】

前記発現レベルが腹部手術後の患者から採取された生物学的試料において決定される、請求項９に記載の使用。

【請求項11】

前記インビトロ診断の結果が抗生物質療法の治療方針のガイダンスとして役立つ請求項１～１０のいずれか一項に記載の使用。

【請求項12】

敗血症のインビトロ診断のための方法であって、生物学的試料におけるデルタ様リガンド１タンパク質の発現レベルを決定することを含み、デルタ様リガンド１タンパク質の健康な対照又は対照患者と比較して上昇した発現レベルが敗血症を示している、敗血症のインビトロ診断のための方法。

【請求項13】

前記デルタ様リガンド１タンパク質が配列番号１のポリヌクレオチドまたは配列番号１と少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチドによってコードされる、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記デルタ様リガンド１タンパク質が配列番号２または３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、および／または配列番号４、配列番号５、配列番号６および／または配列番号７のアミノ酸配列を有する、請求項１２に記載の方法。

【請求項15】

前記生物学的試料が全血、バフィーコート、血漿、血清、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣＳ）、好中球、単球、Ｔ細胞、尿、髄液、リンパ液、皮膚の外分泌物、涙および／または唾液からなる群から選択される、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記発現レベルが手術後の患者から採取された生物学的試料において決定される、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記発現レベルが腹部手術後の患者から採取された生物学的試料において決定される、請求項１６に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【発明の技術分野】

【0001】

本発明は、重症感染症の診断におけるバイオマーカーとしてのデルタ様リガンド１の使用、および生物学的試料におけるデルタ様リガンド１レベルを制御することによる敗血症などの重症感染症の迅速なインビトロ診断のための方法に関する。

【発明の背景】

【0002】

バイオマーカーは、特定の生理学的状態を反映する生物の測定可能な特徴である。医学では、バイオマーカーは、特定の病状の存在または重症度の指標として使用され得る、または所与の介入の有効性をモニターする生物学的組織から単離された化合物であることが多い。

【0003】

バイオマーカーは、疾患の診断およびことによると予後において、ならびに疾患の進行または治療に対する応答をモニターするのに特に有用である。理想的なバイオマーカーは、簡単に取得かつ測定されるべきであり、疾患に対する高い感度および特異性の両方を示すという点で信頼できるものであるべきである。

【0004】

重症感染症、特に敗血症は、信頼性の高いバイオマーカーが存在しない、特に回避的な医学的状態である。敗血症を含む重症感染症は、感染症に対する免疫応答の調節不全によって誘起される、生命を脅かす臓器不全によって特定される、かつ／または生命を脅かす臓器不全をもたらし得る。敗血症では、微生物病原体によって引き起こされる宿主応答は、炎症の悪化およびその後の免疫抑制を特徴とする病理学的症候群においてピークに達する。

【0005】

救命医療および抗菌療法における着実な改善にもかかわらず、そのような感染症は、世界中のすべての年齢群にわたって集中治療室における主な死因のままである。転帰を改善し、同時に不必要な抗生物質治療を回避するためには、重症感染症を診断するための迅速かつ信頼できる試験が不可欠である。

【0006】

敗血症は重症であり、したがって生命を脅かす感染症である。今まで、血液培養は、敗血症の診断における基準診断法のままであるが、血液培養には時間がかかり、敗血症の徴候および症状を有する多くの患者は、陰性の血液培養を有する。したがって、重症感染症を診断するための、特に敗血症を診断するための補足的なアプローチが緊急に必要である。

【0007】

Ｃ．Ｐｉｅｒｒａｋｏｓ ａｎｄ Ｊ．－Ｌ．Ｖｉｎｃｅｎｔ（２０１０）Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｃａｒｅ、１４：Ｒ１５には、敗血症を特定するまたは排除するのに有用であることが当技術分野で知られているバイオマーカーが記載されている。これらは、サイトカイン／ケモカイン、細胞、受容体、凝固、血管内皮損傷、血管拡張、臓器不全、および急性期タンパク質に向けられたさまざまなバイオマーカーを含む。ノッチリガンド、特にデルタ様リガンド１は、言及されていない。

【0008】

Ｖａｎ Ｅｎｇｅｌｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１８）“Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ Ｓｅｐｓｉｓ”，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｃａｒｅ Ｃｌｉｎｉｃｓ，３４（１）：１２９－１５２には、敗血症を診断するためのさまざまなバイオマーカーが記載されており、特に、新規なバイオマーカーの発見のための有望なツールであるとしてシステムバイオロジーのオミクス（すなわち、ゲノミクス、エピジェネティクス、トランスクリプトミクス、プロテオミクス、およびメタボロミクス）分野に対する示唆が記載されている。

【0009】

国際公開第２０１６／１４５４２６（Ａ１）号パンフレットには、バイオマーカーとしてＣＥＡＣＡＭ１、ＺＤＨＨＣ１９、Ｃ９ｏｒｆ９５、ＧＮＡ１５、ＢＡＴＦ、Ｃ３ＡＲ１、ＫＩＡＡ１３７０、ＴＧＦＢＩ、ＭＴＣＨ１、ＲＰＧＲＩＰ１、およびＨＬＡ－ＤＰＢ１の発現レベルを使用して敗血症を診断するための方法が記載されている。

【0010】

米国特許出願公開第２００５／０５９０９３（Ａ１）号明細書には、候補モジュレーターの存在下および非存在下で免疫系の細胞におけるノッチシグナリングをモニターし、候補モジュレーターがノッチシグナリングを調節するかどうかを決定するステップを含む、ノッチシグナリングのモジュレーターを検出するための方法が記載されている。

【0011】

国際公開第２０１７／００４１５９（Ａ１）号パンフレットには、可溶性生体分子に結合し、その生物活性を阻害して、標的または病原体が他の分子または細胞と相互作用するのを阻害する組成物が記載されている。デルタ様リガンド１（ＤＬＬ１）を含むノッチリガンドは、アテローム性動脈硬化症、石灰化大動脈弁狭窄、心不全、脳卒中およびがんを治療または予防するのに特に有用であるとして言及されている。病原体によって引き起こされる感染症に関連した敗血症を治療または予防するために、国際公開第２０１７／００４１５９（Ａ１）号パンフレットは、ＴＮＦα、インターロイキン１、インターロイキン６、インターロイキン８、インターロイキン１２、インターフェロンガンマ、マクロファージ遊走阻止因子、ＧＭ－ＣＳＦおよび／または血液凝固因子選択的に結合することを提案している。

【0012】

米国特許出願公開第２００６／１４０９４３（Ａ１）号明細書には、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）ならびに臓器、組織および／または細胞移植（例えば、骨髄移植）などの移植によって引き起こされる、またはそれに関連する疾患および状態の治療のための医薬の調製のためのノッチシグナリングのモジュレーターの使用であって、モジュレーターが免疫系の細胞の反応性を低下させるために使用される使用が記載されている。

【0013】

国際公開第２０１２／０９２５３９（Ａ２）号パンフレットには、ＤＬＬ４に対する抗体、および細胞増殖性障害または血管新生に関連する病態などのＤＬＬ４関連疾患を治療するための方法が記載されている。国際公開第２０１２／０９２５３９（Ａ２）号パンフレットには、血管新生の調節不全が腫瘍性および非腫瘍性障害につながり得ることが記載されており、敗血症をそのような非腫瘍性障害の多くの１つとして挙げている。

【0014】

米国特許第９，７３１，０２４（Ｂ２）号明細書および米国特許出願公開第２０１７／０２４０５９０（Ａ１）号明細書には、水溶性ポリマーを治療用タンパク質の酸化炭水化物部分にコンジュゲートさせる材料および方法が記載されている。治療用タンパク質として列挙されている多くのタンパク質の１つは、デルタ様タンパク質１である。

【0015】

現在、敗血症などの重症感染症を診断するために、いくつかのバイオマーカーが使用されている。急性期タンパク質であるプロカルシトニン（ＰＣＴ）およびＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）は、白血球数とともに最も広く使用されている。

【0016】

それにもかかわらず、ＰＣＴおよびＣＲＰの有効性は、敗血症に対する特異性および感度の欠如により限定される。特に、敗血症を炎症の他の非感染性原因と区別することは、依然として困難である。したがって、より信頼性の高い新しい敗血症バイオマーカーが必要である。

【発明の概要】

【0017】

本発明の根底にある問題は、高レベルの信頼性で重症感染症を診断するために使用され得るバイオマーカーを提供することである。

【0018】

この問題は、重症感染症のインビトロ（エクスビボ）診断のためのバイオマーカーとしてのデルタ様リガンド１タンパク質（ＤＬＬ１）またはデルタ様リガンド１タンパク質をコードするヌクレオチド配列の使用によって解決される。したがって、患者の生物学的試料におけるデルタ様リガンド１タンパク質またはデルタ様リガンド１タンパク質をコードするヌクレオチド配列の上昇したレベルは、重症感染症の存在を示している。

【0019】

さらに、本発明は、重症感染症のインビトロ診断のための方法であって、生物学的試料におけるデルタ様リガンド１タンパク質またはデルタ様リガンド１タンパク質をコードするヌクレオチド配列を決定することを含み、デルタ様リガンド１タンパク質またはデルタ様リガンド１タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現の上昇したレベルが感染症を示している、重症感染症のインビトロ診断のための方法に関する。

【0020】

驚くべきことに、デルタ様リガンド１は、重症感染症、特に敗血症の高レベルの信頼性を有するバイオマーカーとして機能することが見出された。本発明のこの診断バイオマーカーに関連する利点は、感染症の早期診断、タイムリーな治療、および改善された疾患転帰である。また、デルタ様リガンド１よりも低い感度および選択性を示す他のバイオマーカーを試験することに関連する不要なコストを削減するだろう。

【発明の詳細な説明】

【0021】

デルタ様タンパク質は、ショウジョウバエにおいて最初に記載されたノッチデルタリガンドのホモログとしてノッチシグナリングにおける役割で知られる１回膜貫通タンパク質である。ＤＬＬ－１の同義語は、デルタ様リガンド１、デルタ様タンパク質、Ｈ－Ｄｅｌｔａ，１、ショウジョウバエデルタホモログ１、デルタ様古典的ノッチリガンド１、ＤＬ１、ノッチリガンドデルタ様１である。哺乳動物では、デルタ様リガンド１（ＤＬＬ１をコードするＤＬＬ１）、デルタ様リガンド３（ＤＬＬ３をコードするＤＬＬ３）、およびデルタ様リガンド４（ＤＬＬ４をコードするＤＬＬ４）をコードする３つのデルタ様遺伝子があり、すべてのリガンドは、ＤＳＬ（Ｄｅｌｔａ、Ｓｅｒｒａｔｅ、Ｌａｇ２）ドメインとして知られている保存されたシステインに富んだ領域、いくつかの上皮成長因子（ＥＧＦ）様反復、および膜貫通ドメインを含む。デルタ様リガンド１タンパク質のアミノ酸配列およびデルタ様リガンド１タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、既知である。例えば、ＤＬＬ１のアミノ酸配列は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５４，Ｎｏ．３，Ｍａｒｃｈ １９９９，７８５－７９４またはＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／ＮＰ＿００５６０９．３）のデータベースに記載されている。ヒトオルソログの染色体位置は、６ｑ２７である。

【0022】

本発明において使用されるデルタ様リガンド１タンパク質は、配列番号１のヌクレオチド配列または配列番号１と少なくとも８０％、好ましくは８５％または９０％同一であるヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質とすることができる。

【0023】

さらに、デルタ様リガンド１タンパク質は、配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性、特に９５％の同一性を有するタンパク質とすることができる。

【0024】

本発明の目的のために本明細書で使用されるデルタリガンド１タンパク質という用語は、ＤＬＬ１の自然発生の切断産物も含む。本発明による自然発生の切断産物は、細胞外、膜貫通、および細胞内切断産物を含む。好ましい実施形態では、自然発生の切断産物は、細胞外切断産物である。したがって、デルタリガンド１タンパク質という用語は、本質的に配列番号２によるタンパク質のＮ末端またはＣ末端断片からなり、重症感染症、特に敗血症で上昇するポリペプチドも含む。したがって、ＤＬＬ１タンパク質という用語は、翻訳後修飾、天然のタンパク質分解性およびプロセシングされたＤＬＬ１タンパク質を含む。ＤＬＬ１タンパク質という用語は、可溶性、不溶性ＤＬＬ１タンパク質および配列番号２または３（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｏ００５４８（ＤＬＬ１＿ＨＵＭＡＮ））のＤＬＬ１タンパク質の自然発生のアイソフォームも含む。ＤＬＬ１のそのような適切な天然の切断産物は、例えば、アミノ酸配列番号４、配列番号５、配列番号６および／または配列番号７によって表される。配列番号４は、可溶性ＤＬＬ１タンパク質を表す。配列番号５は、ＤＬＬ１タンパク質の細胞内ドメインに連結されたＤＬＬ１タンパク質の膜貫通ドメインを表す。配列番号６は、ＤＬＬ１タンパク質の細胞内ドメインを表す。配列番号７は、ＤＬＬ１タンパク質の膜貫通ドメインを表す。

【0025】

ＤＬＬ１タンパク質という用語にさらに含まれるのは、例えば、リン酸化、メチル化、アセチル化、およびグリコシル化により修飾されたタンパク質である。

【0026】

本発明では、ＤＬＬ１タンパク質のレベルおよび／またはＤＬＬ１ヌクレオチド配列のレベルが決定される。本明細書で使用されるヌクレオチド配列という用語は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｍＲＮＡを指し得る。ＤＬＬ１タンパク質またはＤＬＬ１のタンパク質アイソフォームをコードするヌクレオチド配列は、ＲＮＡレベルのスプライスバリアントでもあり得る。そのようなスプライスバリアントは、例えば、配列のＮ末端を有さない、またはＣ末端を有さないヌクレオチド配列である。

【0027】

本発明の一実施形態によれば、感染症を診断するためのバイオマーカーとして、または感染症をインビトロで診断するための方法においてＤＬＬ１ヌクレオチド配列を使用する場合、ＤＬＬ１の上昇した発現レベルは、重症感染症を示している。発現レベルの決定におけるＤＬＬ１の例示的なヌクレオチド配列は、配列番号１である。

【0028】

配列番号１とラベルされたヌクレオチド配列ＤＬＬ１への言及は、ホモサピエンスにおけるＤＮＡ配列を指す。しかしながら、本発明がホモサピエンスに限定されず、むしろすべての哺乳動物に及ぶことは明らかであろう。

【0029】

本明細書で使用される「上昇した」という用語は、対照と比較して増加したレベルを意味する。対照は、任意の感染していない生物学的試料または系とすることができる。典型的に、対照は、感染した生物学的試料または系と同じ種のものである。敗血症もしくは別の重症感染症の手術前および／または発症前の患者は、例えば、対照として役立ち得る。医学および医学生物学の分野の当業者は、発現レベルを比較できる適切な対照を容易に特定できよう。典型的に、ＤＬＬ１の上昇した量は、ＤＬＬ１の濃度とすることができ、これは、対照の標準偏差値を有意に超えている。好ましい実施形態によれば、ＤＬＬ１の上昇した量は濃度であり、これは、対照試料における平均の標準偏差値の２倍、または特に３倍である。対照試料における平均の標準偏差値の３倍は、特に良い結果をもたらす。

【0030】

代わりに、ＤＬＬ１の上昇した量の決定または重症感染症の診断に関して、カットオフ値を定義し、患者の試料が本発明に従って試験される場合に、敗血症の診断のためにそのようなカットオフ値を考慮することも有益である。カットオフ値により、重症感染症を有するまたは重症感染症を有さない患者群を区別することができる。重症感染症が敗血症である場合に関する妥当なカットオフ値は、ｍｌあたり約３６３３１ｐｇのＤＬＬ１タンパク質である。重症感染症が敗血症である場合に関する特に有益な診断カットオフ値は、ｍｌあたり約２９，５３８ｐｇのＤＬＬ１タンパク質である。

【0031】

ＤＬＬ１の発現レベルは、任意の生物学的試料において測定され得る。本明細書で使用される「生物学的試料」という用語は、生物の全体または生物の任意の部分を含む。典型的に、生物学的試料は、エクスビボ分析のために生物から除去される。生物学的試料は、単一細胞および／または細胞培養物および／または組織培養物を含み得る。生物学的試料は、上皮組織、筋肉組織、結合組織および神経組織などの組織も含むが、これらに限定されない。生物学的試料は、例えば、全血、バフィーコート（buffy coat）、血漿、血清、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣＳ）、好中球、単球、Ｔ細胞、尿、髄液、リンパ液、皮膚の外分泌物、涙および／または唾液を含み得る。

【0032】

本発明の一実施形態では、ＤＬＬ１の発現レベルは、単一細胞または細胞培養物から測定される。細胞または細胞培養物は、特に、免疫系の細胞を含み得る。典型的に、細胞または細胞培養物は、免疫細胞を含む。好ましくは、細胞は、白血球である。より好ましくは、細胞は、単球である。好ましくは、細胞培養物は、白血球を含む。より好ましくは、細胞培養物は、単球を含む。

【0033】

別の実施形態では、ＤＬＬ１の発現レベルは、組織から測定される。好ましくは、ＤＬＬ１の発現レベルは、血液試料から測定される。本明細書で使用される「血液」という用語は、全血、血漿、および血清を含む。好ましくは、ＤＬＬ１の発現レベルは、血漿試料から測定される。

【0034】

好ましい実施形態では、ＤＬＬ１の発現のレベルは、患者から採取された血漿試料から測定されかつ決定される。本明細書で使用される「患者」という用語は、重症感染症または敗血症のリスクがあるヒトおよび非ヒト哺乳動物の両方を含む。しばしば、患者は、手術を受けたヒトまたは動物である。

【0035】

タンパク質発現を測定する任意の適切な手段が使用され得る。典型的に、タンパク質発現は、イムノアッセイを使用して測定されかつ決定される。好ましくは、タンパク質発現は、特定のタンパク質またはポリペプチド配列に向けられた酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して測定されかつ決定される。タンパク質発現レベルは、ウエスタンブロットアッセイなどの免疫ブロットアッセイ、質量分析、エリスポットまたはフローサイトメトリー、および免疫組織化学的検査を使用しても測定し、かつ決定することができる。

【0036】

ヌクレオチド発現を測定する任意の適切な手段を使用して、ＤＬＬ１の発現レベルを測定することができる。例えば、発現は、マイクロアレイ分析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、ノーザンブロット、サザンブロット、または遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）を行うことによって測定され得る。

【0037】

重症感染症は、特に回避的な医学的状態であり、感染症に対する免疫応答の調節不全によって誘起される生命を脅かす臓器不全につながり得る。重症感染症の例は、敗血症、肺炎、髄膜炎である。

【図面の簡単な説明】

【0038】

【図1】ウエスタンブロットを示す図である。健康なドナーの血液からＣＤ１４^＋単球を分離し、インビトロで１×１０^６細菌／ｍＬ（大腸菌、緑膿菌、肺炎桿菌、大便連鎖球菌）に感染させるか、１００ｎｇ／ｍＬのリポ多糖（ＬＰＳ）で刺激した。２時間後、細菌をゲンタマイシンで殺した。対照細胞（－）は、未処理のままにした。翌日、細胞溶解物を作製した。ウエスタンブロット分析に関して、等量のタンパク質溶解物をブロットし、ＤＬＬ１またはアクチン（ローディング対照）に対する抗体でプローブした。

【図2】ＬＰＳ（ｎ＝１６）またはＮａＣｌ（ｎ＝１５、対照群）を注射（腹腔内）した１２週齢マウスからのＥＬＩＳＡ結果を示す図である。注射の２４時間後に血液試料を採取し、マウスＤＬＬ－１ ＥＬＩＳＡにより血漿濃度の定量を実施した（ｐ≦０．０００１、マン・ウィットニーＵ検定）。

【図3】敗血症症状の最初の特定直後（ｔ０）、２４時間後（ｔ２４）、４８時間後（ｔ４８）、１６８時間後（ｔ１６８）に採取した敗血症患者の血漿試料（ｎ＝５０）からの（Ａ）ＤＬＬ－１または（Ｂ）ＤＬＬ－４の発現レベルのＥＬＩＳＡ分析、ならびに健康なドナー（健康、ｎ＝２０）および腹部手術後の対照患者（手術後４８時間（「ＯＰ ｔ２」、ｎ＝２０）からの血漿試料からのＥＬＩＳＡ結果を示す図である。^＊＊＊ｐ≦０．０００１、マン・ウィットニーＵ検定。

【図4】（Ａ）ｔ０時の敗血症患者対対照患者の白血球、（Ｂ）ｔ０時の敗血症患者対対照患者のＣＲＰレベル、Ｃ）ｔ０時の敗血症患者対対照患者のＤＬＬ－１レベル、Ｄ）ｔ０時の敗血症患者対健康な志願者のＤＬＬ－１レベル、Ｅ）ｔ０時の敗血症患者対対照患者のＤＬＬ－４レベル、Ｆ）ｔ０時の敗血症患者対健康な志願者のＤＬＬ－４レベルのＲＯＣ分析を示す図である。ＡＵＣ＝曲線下面積。

【図5】３つの独立した臨床研究（コホート１（Ａ）、コホート２（Ｂ）、コホート３（Ｃ）、さらなる研究詳細に関しては、実施例４を参照されたい）からの敗血症患者（「敗血症」、コホート１：ｎ＝３０、コホート２：ｎ＝５０、コホート３：ｎ＝１００）、大規模な内臓手術後の対照患者（「手術後」、コホート１：ｎ＝３０、コホート２：ｎ＝２０）、健康な対象（「健康」、コホート１：ｎ＝３０、コホート２：ｎ＝２０）からの血漿試料からのＤＬＬ－１タンパク質レベルのＥＬＩＳＡ分析を示す図である。^＊＊＊ｐ≦０．０００１、マンホイットニーＵ検定。

【図6】（Ａ）研究包含後（臨床症状の発症後２４時間以内で最新）すぐに（「初期」）、２４時間（「２４ｈ」）、および４８時間（「４８ｈ」）で採取された重度の外傷後の患者コホート（ｎ＝３８）からの血漿試料からのＤＬＬ－１タンパク質レベルのＥＬＩＳＡ分析を示す図である。同じものを（Ｂ）体外循環下で心臓手術を受けた患者コホート（ｎ＝２５）に関して示す。タンパク質レベルを手術前（「手術前」）、体外循環の４時間後（「ＥＣＣ後４ｈ」）、および体外循環の２４時間後（「ＥＣＣ後２４ｈ」）に関して示す。これらの患者コホートは、どの時点でも感染の徴候を示さなかった。

【図7】血漿試料からのＤＬＬ－１タンパク質レベルのＲＯＣ分析を示す図である（敗血症患者：ｎ＝３２７、対照：ｎ＝３７７）。ＡＵＣ＝曲線下面積。

【図8】健康なドナーの血液から単離され、１００ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳで刺激された、または１０^８大腸菌／１０^６単球に感染させられたＣＤ１４^＋単球を示す図である。２時間後、細菌をゲンタマイシンで殺した。対照細胞（－）は、未処理のままにした。翌日、細胞溶解物を作製した。ウエスタンブロット分析に関して、等量のタンパク質溶解物をブロットし、ＤＬＬ１またはアクチン（ローディング対照）に対する抗体でプローブした。

【0039】

以下の例は、特にある実施形態および図を参照して本発明をさらに説明するのに役立つが、これらは、本開示を限定することを意図するものではない。

【0040】

実施例
実施例１－デルタ様リガンド１は、インビトロで細菌感染症を検出する
この例は、ノッチリガンドＤＬＬ１が敗血症患者において上方制御され、したがって、潜在的なバイオマーカーとして使用され得るかどうかを確認することを目的とした。敗血症関連細菌を有するインビトロ感染症モデルを使用する。実験装備において、我々は、健康なドナーからの血液由来の単球に異なるグラム陰性細菌（大腸菌、緑膿菌、肺炎桿菌）およびグラム陽性細菌（大便連鎖球菌）を２時間感染させ、その後、抗生物質で細菌を殺した。さらに、細胞を、血流中を循環するときに敗血症性ショックを引き起こし得るグラム陰性細胞壁の成分であるＴＬＲ４アゴニストリポ多糖（ＬＰＳ）で刺激した。感染細胞およびＬＰＳ刺激細胞を終夜インキュベートした後、ＤＬＬ１の検出のためのウエスタンブロット分析のために溶解物を作製した。実験詳細を以下に説明する。

【0041】

細胞単離および培養－末梢血由来単核細胞を、密度勾配遠心分離（Ｂｉｏｃｏｌｌ分離溶液、１．０７７ｇ／ｍｌ、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、健康なドナーからの新鮮血またはバフィーコートから分離した。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ＣＤ１４＋磁気標識細胞をａｕｔｏＭＡＣＳセパレーター（ａｕｔｏＭＡＣＳ、プログラム：ｐｏｓｓｅｌ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を介して陽性に選択し、５％ＣＯ_２の存在下で加湿雰囲気で３７°Ｃで１００ＩＵ／ｍＬのペニシリン、１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を含有する１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンで補充した。

【0042】

細菌培養－大腸菌、緑膿菌、肺炎桿菌および大便連鎖球菌を、加湿雰囲気中、５％ＣＯ２、３７℃で終夜別々に培養した。翌日、各培養物からの１つのクローンをトリプトンソイブイヨン培地に移し、３７℃での一定の撹拌下での２時間後、細菌懸濁液を吸収測定により１０^８／ｍＬ ＲＰＭＩの濃度に調整した。

【0043】

インビトロ感染－１×１０^６のソートされたＣＤ１４^＋単球を１ｍＬ ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳにおける２４ウェルプレート形式で蒔いた。細胞を１×１０^６細菌／ｍＬに感染させるか、またはｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストリポ多糖（１００ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳ）で刺激した。２時間後、１００ｎｇ／ｍＬのゲンタマイシン（ＰＡＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ）を細菌培養物に添加して、細菌を殺した。

【0044】

感染細胞およびＬＰＳ刺激細胞を終夜インキュベートした後、細胞溶解物を作製し、対照としてアクチンを使用してウエスタンブロット分析を行った。

【0045】

ウエスタンブロットアッセイ－２×１０^６細胞をプロテアーゼ阻害剤（ｃＯｍｐｌｅｔｅＴＭ、Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）およびホスファターゼ阻害剤（ＰｈｏｓＳＴＯＰＴＭ、Ｒｏｃｈｅ）を含有するＲＩＰＡ溶解緩衝液に溶解した。次いで、細胞溶解物を１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース膜（Ｗｈａｔｍａｎ Ｐｒｏｔｒａｎニトロセルロース膜、ｎｅｏＬａｂ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に電気泳動で転写した。ブロッキング（ＴＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０／５％ＢＳＡ）および洗浄（ＴＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ）ステップの後、ＤＬＬ－１およびベータアクチン（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に対する抗体を用いた免疫ブロット。検出を化学発光により強化した（ＥＣＬ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）。

【0046】

図１は、デルタ様リガンド１タンパク質がすべてのＬＰＳ刺激および細菌感染単球において高度に検出可能であるが、対照細胞においては検出可能ではないことを示している。したがって、デルタ様リガンド１タンパク質は、グラム陽性病因およびグラム陰性病因の両方の細胞感染症を検出するのに適している。

【0047】

実施例２－デルタ様リガンド１は、マウス敗血症モデルにおいて上方制御される
活性化されたＤＬＬ１がインビトロ細菌感染単球において高度に豊富であることが分かったため、ノッチリガンドの挙動をマウスエンドトキシン敗血症モデルにおいて試験した。ＬＰＳ（正確には、ＬＰＳの脂質部分）は、エンドトキシンとも称され、敗血症の動物モデルにおいて一般的に使用される。重篤な患者では、血清エンドトキシンの増加した濃度が敗血症の発症、疾患の重症度、および死亡率と関連している。エンドトキシンがヒト敗血症の病因における重要な役割を果たすという理論は、抗生物質療法が死んだ細菌からの大量のエンドトキシンの突然の放出、および状態の悪化につながり得るという観察によって支持されている。ここでは、１２週齢の雄マウスを実験目的のために使用した。

【0048】

１２週齢の雄マウスに、ＬＰＳの脂質部分（ｎ＝１６）またはＮａＣｌ（ｎ＝１５、対照として）を腹腔内注射した。２４時間後、血液を採取した。無細胞上清を回収し、標準プロトコルに従って市販のＥＬＩＳＡアッセイ（ａｂｃａｍ）を使用して、マウスデルタ様リガンド１タンパク質のレベルに関して分析した。

【0049】

図２は、デルタ様リガンド１タンパク質がＬＰＳ感染マウスの血液において対照マウスの血液と比較して上昇していることを示している。ＤＬＬ１は、マウス敗血症モデルにおいて上方制御されている。したがって、デルタ様リガンド１タンパク質は、敗血症のインビボ動物モデルの血液においてＬＰＳに関連する感染症を検出するのに適している。

【0050】

実施例３－デルタ様リガンド１は、敗血症患者において上方制御される
５０人の患者を研究に含め、全員が、腹部手術後に重度の敗血症の徴候を示した。敗血症をＳｕｒｖｉｖｉｎｇ Ｓｅｐｓｉｓ Ｃａｍｐａｉｇｎの基準に従って定義した。最低１８歳の非妊娠患者のみを含めた。さらなる除外基準は、自己免疫疾患を含めた。包含後、血液試料を敗血症の最初の徴候の同定後（「ｔ０」）、２４時間後（「ｔ２４」）、４８時間後（「ｔ４８」）、および１６８時間後（「ｔ１６８」）に敗血症患者から直接採取した。

【0051】

腹部手術を受けたが敗血症の徴候を示さなかった２０人の対照患者（「ＯＰ ｔ２」）については、手術の４８時間後に採血した。２０人の健康な志願者（「健康」）を非手術対照として採用し、採血を１回行った。

【0052】

血漿を、標準プロトコルに従って、市販のＥＬＩＳＡアッセイ（ＤＬＬ１－ＲａｙＢｉｏ（登録商標）、ＤＬＬ４－ｂｉｏｃａｔ）を使用して、ヒトデルタ様リガンド１タンパク質および加えてヒトデルタ様リガンド４タンパク質のレベルに関して分析した。タンパク質のレベルをマン・ウィットニーＵ検定を使用して統計的に分析した。

【0053】

図３Ａは、デルタ様リガンド１タンパク質が、健康な対照および腹部手術を受けたが敗血症の徴候を示さなかった患者の両方と比較して、敗血症と診断された患者の血液において上昇していることを示している。

【0054】

図３Ｂは、デルタ様リガンド４タンパク質が、健康な対照および腹部手術を受けた非感染患者の両方と比較して、敗血症と診断された患者の血液において上昇していないか、または有意に上昇していないことを示している。

【0055】

したがって、デルタ様リガンド１タンパク質は、腹部手術後の患者の血液における敗血症の存在を検出するのに、および感染した患者を健康な対照および非感染患者の両方から区別するのに適しているが、密接に関連するデルタ様リガンド４タンパク質は、適していない。

【0056】

デルタ様リガンド１タンパク質およびデルタ様リガンド４タンパク質に関する収集されたデータを、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を使用して分析した。ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を計算し、データを白血球数およびＣＲＰの確立された臨床的に関連するマーカーと比較した。詳細には、ＲＯＣ曲線ｔＯ対Ｏｐ ｔ２の曲線下面積（ＡＵＣ）は、白血球に関して０．５１１（カットオフ２０．７３／ｎｌ）（図４Ａ）、ＣＲＰに関して０．７９５（カットオフ１７５．１ｍｇ／ｍｌ）であった（図４Ｂ）。ＤＬＬ１敗血症ｔＯ対ＯＰ ｔ２のＡＵＣは、０．９９１（カットオフ３６３３１ｐｇ／ｍｌ）および１．０（カットオフ２５２６９ｐｇ／ｍｌ）敗血症ｔＯ対健康であった。したがって、ＤＬＬ－１による感染の予測は、日常的に使用されるバイオマーカーＣＲＰおよび白血球数よりもはるかに信頼性が高い。ＤＬＬ４ ＲＯＣ分析のＡＵＣは、ＯＰ ｔ２（図４Ｅ）と比較すると０，６９６（カットオフ１０８４ｐｇ／ｍｌ）であり、健康な対照（図４Ｆ）と比較すると０，６５５（カットオフ６３９．３ｐｇ／ｍｌ）であった。

【0057】

実施例４－デルタ様リガンド１は、敗血症患者において上方制御される
さまざまな研究内で収集された血漿試料を、デルタ様リガンド１（ＤＬＬ１）の濃度に関してＥＬＩＳＡによって二次的に分析した。全体として、敗血症を有する成人患者１８０人（図５における「敗血症」を参照されたい）を、スキーム：「［Ｇｅｒｍａｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ Ｒｅｇｉｓｔｅｒ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｎｕｍｂｅｒ］／［ｅｔｈｉｃｓ ｖｏｔｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｎｕｍｂｅｒ］（ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）」を使用して以下に概説する３つの独立したコホートから分析した。
－コホート１：［ＤＲＫＳ０００１２４４６］／［Ｓ－２００／２０１７］（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ｎ＝３０（図５Ａを参照されたい）
－コホート２：［ＤＲＫＳ００００５４６３］／［Ｓ－０９７／２０１３］（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ｎ＝５０（図５Ｂを参照されたい）。
－コホート３：［ＤＲＫＳ００００８０９０］／［Ｓ－２４７／２０１４］（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ｎ＝１００（図５Ｃを参照されたい）。

【0058】

試料を、３つのコホートすべて関して研究包含時（「初期」）に、ならびにコホート１および２に関して研究包含後２４時間（「２４ｈ」）および４８時間（「４８ｈ」）に採取した。すべての患者を、敗血症－２（臨床的に感染症が疑われるまたは明らかになった感染症と組み合わせた２≧ＳＩＲＳ基準、コホート１および２）または敗血症－３（２≧ポイントのＳＯＦＡスコアの変化および臨床的に感染症が疑われるまたは明らかになった感染症、コホート３）コンセンサス基準のいずれかに従って採用した。

【0059】

さらに、コホート１および２は、研究中のどの時点でも感染症の徴候を示さなかった広範な内臓手術後の患者（図５における「手術後」を参照されたい、コホート１：ｎ＝３０、コホート２：ｎ＝２０）および健康な志願者（「健康」、コホート１：ｎ＝３０、コホート２：ｎ＝２０）を登録した。

【0060】

コホート２は、実施例３で記載したものと同じコホートに相当する。したがって、図５Ｂにおけるデータ値は、図３Ａにおけるデータ値と同一である。

【0061】

さらなる対照は、重度の外傷後の３８人の患者のコホート（［ＤＲＫＳ０００１０９９１］／［１６４／１４］（Ｇｉｅｓｓｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、図６Ａを参照されたい）および体外循環下で心臓手術に供された２５人の患者のコホート（［Ｓ－１１２／２０１８］（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、図６Ｂを参照されたい）を含んだ。

【0062】

ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン６．０、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）を用いてデータ分析を行った。視覚化には散布図を使用した。群比較のために、ノンパラメトリック・マン・ウィットニー・Ｕ検定を使用し、ｐ値＜０．０５を有意であると想定した。＊＊＊＊は、ｐ値＜０．０００１を示す。

【0063】

ＤＬＬ１の診断値の評価のために、敗血症を有する患者からのすべての試料（すべての時点、１８０人の患者からのｎ＝３２７試料）を組み合わせ、ＲＯＣ分析を使用して、対照群のすべての試料（すべての時点、ｎ＝３７７試料、１１３人の対照患者からの３２７の試料および５０人の健康な志願者からの５０の試料）と比較した。最適なカットオフをＹｏｕｄｅｎインデックス手順（（感度＋特異度）－１００）によって計算した。

【0064】

上述の組み合わせたＲＯＣ分析において使用したそれぞれ３２７（敗血症）試料および３７７（対照）試料の数は、観察期間にわたる患者の喪失の結果である（主に、敗血症を有する患者の死亡および手術または重度の外傷後の患者の退院による）。試料番号の詳細は、次のとおりである。
コホート１
敗血症：３０／３０／２７（初期／２４ｈ／４８ｈ）
手術後：３０／２９／２８（初期／２４ｈ／４８ｈ）
健康：３０
コホート２
敗血症：５０／４６／４４（初期／２４ｈ／４８ｈ）
手術後：２０／２０／２０（初期／２４ｈ／４８ｈ）
健康：２０
コホート３
敗血症：１００（初期）
重度の外傷
３８／３６／３１（初期／２４ｈ／４８ｈ）
心臓手術
２５／２５／２５（手術前／ＥＣＣ後６ｈ／２４ｈ）

【0065】

採用後、初期には、コホート１、２、および３における敗血症を有する患者の平均血漿濃度は、それぞれ６０，２９２ｐｇ／ｍｌ（９５％ＣＩ：４７，８２０－７２，７６５、ｎ＝３０）、１０６，１２６ｐｇ／ｍｌ（９５％ＣＩ：９０，１０２－１２２，１４９、ｎ＝５０）および５６，０６４ｐｇ／ｍｌ（９５％ＣＩ：４９，４９４－６２，６３４、ｎ＝１００）であった（図５ＡからＣを参照されたい）。コホート１および２におけるｔ＝２４ｈでの敗血症を有する患者の平均血漿濃度は、それぞれ、５３，０２７ｐｇ／ｍｌ（９５％ＣＩ：４１，８２４－６４，２２９、ｎ＝３０）および１０４，９４４ｐｇ／ｍｌ（９５％ＣＩ：８９，７８６－１２０，１０１、ｎ＝４６）であった。コホート１および２におけるｔ＝４８ｈでの敗血症を有する患者の平均血漿濃度は、それぞれ、４９，４８５ｐｇ／ｍｌ（９５％ＣＩ：３９，７６６－５９，２０５、ｎ＝２７）および８８，９９９ｐｇ／ｍｌ（９５％ＣＩ：７５，４９０－１０２，５０８、ｎ＝４４）であった。レベルは、手術後の相当する時点で敗血症患者と対照（すなわち、対照患者および健康な対象）間で高度に有意に異なった。

【0066】

対照外傷患者（図５Ａおよび５Ｂにおける「手術後」および図６Ａにおけるすべてのデータを参照されたい）、および心臓手術前後の患者（図６Ｂを参照されたい）のコホートのＤＬＬ１濃度は、測定したすべての時点で敗血症を有する患者と比較して著しく低かった。

【0067】

ｔ＝初期、ｔ＝２４ｈ、ｔ＝４８ｈでのコホート１における対照外科患者（「手術後」）の平均血漿濃度は、それぞれ、１４，１９３ｐｇ／ｍｌ（９５％ＣＩ：１２，３８５－１６，００１、ｎ＝３０）、１９，５５０ｐｇ／ｍｌ（９５％ＣＩ：１４，５３６－２４，５６５、ｎ＝２９）、および１７，７２１ｐｇ／ｍｌ（９５％ＣＩ：１５，４９８－１９，９４４、ｎ＝２８）であった。

【0068】

ｔ＝初期、ｔ＝２４ｈ、ｔ＝４８ｈでのコホート２における対照外科患者（「手術後」）の平均血漿濃度は、それぞれ、１３，５４８ｐｇ／ｍｌ（９５％ＣＩ：１１，２７５－１５，８２１、ｎ＝２０）、１６，１８７ｐｇ／ｍｌ（９５％ＣＩ：１３，４０９－１８，９６４、ｎ＝２０）、および１９，２８７ｐｇ／ｍｌ（９５％ＣＩ：１３，６１８－２４，９５５、ｎ＝２０）であった。

【0069】

ｔ＝初期、ｔ＝２４ｈ、ｔ＝４８ｈでの図６Ａにおける対照重度の外傷患者の平均血漿濃度は、それぞれ、１９，１１９ｐｇ／ｍｌ（９５％ＣＩ：１６，８９２－２１，３４５、ｎ＝３８）、１９，２２４ｐｇ／ｍｌ（９５％ＣＩ：１７，１８４－２１，２６３、ｎ＝３６）、および２０，４０９ｐｇ／ｍｌ（９５％ＣＩ：１６，３５１－２４，４６８、ｎ＝３１）であった。

【0070】

ｔ＝初期、ｔ＝２４ｈ、ｔ＝４８ｈでの図６Ｂにおける対照心臓手術患者の平均血漿濃度は、それぞれ、１３，８４６ｐｇ／ｍｌ（９５％ＣＩ：１０，６３３－１７，０５９、ｎ＝２５）、１４，６０３ｐｇ／ｍｌ（９５％ＣＩ：１１，３５６－１７，８５０、ｎ＝２５）、および２２，１９４ｐｇ／ｍｌ（９５％ＣＩ：１８，４９７－２５，８９１、ｎ＝２５）であった。

【0071】

健康な対照のＤＬＬ１濃度（図５Ａおよび５Ｂにおける「健康」を参照されたい）は、測定したすべての時点で敗血症を有する患者と比較して著しく低かった。健康な対照と対照患者間に有意差はなかった。コホート１および２において測定された健康な対照の平均血漿濃度は、それぞれ、１１．９２８ｐｇ／ｍｌ（９５％ＣＩ：１０，６４５－１３，２１１、ｎ＝３０）、および１６，７３７ｐｇ／ｍｌ（９５％ＣＩ：１４，５４２－１８，９３２、ｎ＝２０）であった。

【0072】

敗血症（ｎ＝３２７）または対照（ｎ＝３７７）に群分けされたすべての利用可能な試料の受信者動作者曲線（ＲＯＣ）分析により、０．９５５５の曲線下面積（ＡＵＣ）が得られた（９５％ＣＩ：０．９４０１－０．９７１０、図７を参照されたい）。２９，５３８ｐｇ／ｍｌの最適な診断カットオフが見出され、８８．７％の感度、９３．４％の特異性であった。

【0073】

実施例５－デルタ様リガンド１切断産物は、インビトロで細菌感染症を検出する
その受容体への結合時に、膜貫通タンパク質ＤＬＬ１が切断される。細胞外ドメインは、周囲に放出される。膜貫通（ＴＭ）ドメインおよび細胞内（ＩＣ）ドメイン（ＴＭＩＣ－ＤＬＬ１）は、細胞内で連結されたままである。さらなる切断イベントは、核に移動することになるＩＣ－ＤＬＬ１を放出し得る。ＴＭＩＣ－ＤＬＬ１を使用して感染症を明らかにできるかどうかを調査するために、切断産物を、ウエスタンブロット分析によりインビトロで感染した初代単球において検出した。

【0074】

健康なドナーの血液から単離された初代単球を、グラム陰性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に感染させるか、またはＴＬＲ４シグナリングを活性化するグラムグラム陰性外膜の主成分であるＬＰＳで刺激した。細菌を、感染後２時間でゲンタマイシンによって殺した。翌日、感染／ＬＰＳ処理細胞を溶解し、分析した。

【0075】

初代ヒト単球の単離－ＰＢＭＣを、密度勾配遠心分離（Ｂｉｏｃｏｌｌ分離溶液、１．０７７ｇ／ｍｌ、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、健康なドナーからの新鮮血またはバフィーコートから単離した。ＣＤ１４^＋細胞をビーズ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）で磁気標識し、ａｕｔｏＭＡＣＳセパレーター（ａｕｔｏＭＡＣＳ、プログラム：ｐｏｓｓｅｌ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって２回選択した。精製単球（１×１０^６細胞／ｍｌ）を、３７°Ｃ、５％ＣＯ２の存在下、加湿雰囲気で、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および１０％の熱不活化ウシ胎仔血清（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を補充したＲＰＭＩ １６４０（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中で培養した。

【0076】

細菌培養物－大腸菌（ＡＴＣＣ２５９２２）を加湿雰囲気で５％ＣＯ_２、３７°Ｃのコロンビア血液ヒツジ寒天上で終夜培養した。翌日、各培養物の１つのコロニーをＴＳＢ（トリプトンソイブイヨン）培地に移し、対数期の中間部まで２００ｒｐｍ／３７°Ｃで絶えず振盪培養した。

【0077】

インビトロ感染－１×１０^６のソートされたＣＤ１４^＋単球を、１ｍｌ ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳに２４ウェルプレート形式で蒔いた。細胞を１０^８大腸菌／１０^６単球に感染させた。２時間後、ゲンタマイシンを１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度まで添加して、細菌を殺した。翌日、細胞を溶解し、分析した。

【0078】

ウエスタンブロットアッセイ－２×１０^６細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄した。全細胞溶解物については、単球を５０μｌ ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１％Ｉｇｅｐａｌ、０．２５％デオキシコール酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍｇ／ｍｌ各アプロチニン、ロイペプチン、およびペプスタチン、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、ならびに１ｍＭ ＮａＦ）中で溶解した。試料をボルテックスし、氷上で３０分間インキュベートした。次いで、溶解物を１４，０００×ｇで２０分間の遠心分離により清澄化した。等量の溶解物をＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分離に使用した（１２．５％）。ニトロセルロース膜上への半乾燥移行後（Ｗｈａｔｍａｎ Ｐｒｏｔｒａｎニトロセルロース膜、ｎｅｏＬａｂ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、後者を、ＴＢＳ／０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０中の５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡでＲＴで２時間ブロックした。探索を、抗体：抗ＤＬＬ１、抗βアクチン（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ、ＵＳＡ）で行った。検出は、強化された化学発光に基づいた（ＥＣＬ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）。

【0079】

図８は、デルタ様リガンド１タンパク質のＴＭＩＣ（細胞内ドメインに連結した膜貫通ドメイン）切断産物が、ＬＰＳ刺激および大腸菌感染単球において高度に検出可能であるが、対照細胞においては検出可能ではないことを示している。したがって、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインＤＬＬ１切断産物は、感染症、特にグラム陰性病因のものを検出するのに適している。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【配列表】

0006998465000001.app