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特許6998895LAG-3抗体、その抗原結合フラグメント、およびそれらの医薬的用途
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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2021-12-23
(45)【発行日】2022-01-18
(54)【発明の名称】LAG-3抗体、その抗原結合フラグメント、およびそれらの医薬的用途
(51)【国際特許分類】
   C12N 15/13 20060101AFI20220111BHJP
   A61K 39/395 20060101ALI20220111BHJP
   A61K 48/00 20060101ALI20220111BHJP
   A61P 35/00 20060101ALI20220111BHJP
   A61P 35/02 20060101ALI20220111BHJP
   C12N 15/85 20060101ALI20220111BHJP
   C12N 5/10 20060101ALI20220111BHJP
   C07K 16/28 20060101ALI20220111BHJP
   C07K 16/46 20060101ALI20220111BHJP
   C12P 21/08 20060101ALI20220111BHJP
【FI】
C12N15/13 ZNA
A61K39/395 T
A61K48/00
A61P35/00
A61P35/02
C12N15/85 Z
C12N5/10
C07K16/28
C07K16/46
C12P21/08
【請求項の数】 32
(21)【出願番号】P 2018564887
(86)(22)【出願日】2017-06-22
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2019-07-04
(86)【国際出願番号】 CN2017089492
(87)【国際公開番号】W WO2017219995
(87)【国際公開日】2017-12-28
【審査請求日】2020-05-28
(31)【優先権主張番号】201610465386.2
(32)【優先日】2016-06-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】516174219
【氏名又は名称】江蘇恒瑞医薬股▲ふん▼有限公司
(73)【特許権者】
【識別番号】516174208
【氏名又は名称】上海恒瑞医薬有限公司
【氏名又は名称原語表記】SHANGHAI HENGRUI PHARMACEUTICAL CO., LTD
【住所又は居所原語表記】NO. 279 WENJING ROAD, MINHANG DISTRICT, SHANGHAI 200245, CHINA
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100106518
【弁理士】
【氏名又は名称】松谷 道子
(74)【代理人】
【識別番号】100138911
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻井 陽子
(74)【代理人】
【識別番号】100165892
【弁理士】
【氏名又は名称】坂田 啓司
(72)【発明者】
【氏名】曹 卓暁
(72)【発明者】
【氏名】付 雅媛
(72)【発明者】
【氏名】胡 斉悦
(72)【発明者】
【氏名】ウェイカン・タオ
(72)【発明者】
【氏名】リエンシャン・ジャン
(72)【発明者】
【氏名】孫 飄揚
【審査官】馬場 亮人
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第2016/028672(WO,A1)
(58)【調査した分野】(Int.Cl.,DB名)
C12N 15/13
A61K 39/395
A61K 48/00
A61P 35/00
A61P 35/02
C12N 15/85
C12N 5/10
C07K 16/28
C07K 16/46
C12P 21/08
CAplus/REGISTRY/MEDLINE/EMBASE/BIOSIS(STN)
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、LAG-3抗体またはその抗原結合フラグメント:
(i)ここで、重鎖可変領域は配列番号9、配列番号10、および配列番号11にそれぞれ示すHCDR1、HCDR2およびHCDR3を含み、軽鎖可変領域は配列番号15、配列番号16および配列番号17にそれぞれ示すLCDR1、LCDR2およびLCDR3を含むか、または
(ii)重鎖可変領域は配列番号12、配列番号13および配列番号14にそれぞれ示すHCDR1、HCDR2およびHCDR3を含み、軽鎖可変領域は配列番号18、配列番号19および配列番号20にそれぞれ示すLCDR1、LCDR2およびLCDR3を含む
【請求項2】
マウス抗体またはそのフラグメントである、請求項1に記載のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項3】
抗体の軽鎖可変領域が、さらに、マウスκ鎖またはその変異体由来の軽鎖FR領域を含むか、マウスλ鎖またはその変異体由来の軽鎖FR領域を含み;抗体の重鎖可変領域が、さらに、マウスIgG1またはその変異体由来の重鎖FR領域を含むか、マウスIgG2またはその変異体由来の重鎖FR領域を含むか、マウスIgG3またはその変異体由来の重鎖FR領域を含む、請求項1に記載のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項4】
マウス抗体が、配列番号5に示す重鎖可変領域と、配列番号6に示す軽鎖可変領域とを含む、または、配列番号7に示す重鎖可変領域と、配列番号8に示す軽鎖可変領域とを含む、請求項2に記載のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項5】
抗体軽鎖が、さらに、マウスκ鎖またはその変異体由来の軽鎖定常領域を含むか、マウスλ鎖またはその変異体由来の軽鎖定常領域を含み;抗体重鎖が、さらに、マウスIgG1またはその変異体由来の重鎖定常領域を含むか、マウスIgG2またはその変異体由来の重鎖定常領域を含むか、マウスIgG3またはその変異体由来の重鎖定常領域を含む、請求項1に記載のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項6】
キメラ抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項1に記載のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項7】
ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項1に記載のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項8】
ヒト化抗体重鎖可変領域の重鎖FR配列が、IGHV7-4-1*02由来のFR1、FR2、FR3およびhjh6.1由来のFR4、または、その変異配列を含み;あるいは、ヒト化抗体重鎖可変領域の重鎖FR配列が、IGHV1-3*01由来のFR1、FR2、FR3およびhjh6.1由来のFR4、または、その変異配列を含む、請求項7に記載のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項9】
ヒト化抗体の重鎖可変領域配列が、配列番号21または配列番号29に示す配列であるか、これらのアミノ酸配列に少なくとも85%の同一性を有する請求項8に記載のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項10】
ヒト化抗体の重鎖FR配列が0~10個のアミノ酸逆突然変異を有する請求項8に記載のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項11】
逆突然変異が、E46K、R38K、V93TおよびY95Fからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸逆突然変異であるか、または逆突然変異が、F29L、A97T、M48I、V68A、I70L、R72VおよびT74Kからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸逆突然変異である、請求項10に記載のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項12】
ヒト化抗体の重鎖可変領域配列が、配列番号21、配列番号23、配列番号24および配列番号25からなる群から選択されるか、これらの配列に少なくとも85%の同一性を有する配列である;または、配列番号29、配列番号31、配列番号32および配列番号33からなる群から選択されるか、これらの配列に少なくとも85%の同一性を有する配列である、請求項8に記載のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項13】
ヒト化抗体軽鎖可変領域の軽鎖FR配列が、ヒト生殖系列軽鎖IGKV1-39*01由来のFR1、FR2、FR3およびhjk4.1由来のFR4、または、その変異配列を含む、請求項7に記載のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項14】
ヒト化抗体の軽鎖可変領域配列が、配列番号22または配列番号30に示す配列であるか、これらのアミノ酸配列に少なくとも85%の同一性を有する配列である請求項13に記載のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項15】
ヒト化抗体の軽鎖FR配列が、0~10個のアミノ酸逆突然変異を有する請求項13に記載のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項16】
逆突然変異が、D70Q、F71Y、I48VおよびA43Sからなる群から選択される1つ以上の逆突然変異であるか、または逆突然変異が、L46R、G66R、S60K、P44F、Y36L、K42G、I21LおよびT85Dからなる群から選択される1つ以上の逆突然変異である、請求項15に記載のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項17】
ヒト化抗体の軽鎖可変領域配列が、配列番号22、配列番号26、配列番号27および配列番号28からなる群から選択されるか、これらの配列に少なくとも85%の同一性を有する配列である;または、配列番号30、配列番号34、配列番号35、配列番号36および配列番号37からなる群から選択されるか、これらの配列に少なくとも85%の同一性を有する配列である、請求項13に記載のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項18】
ヒト化抗体が、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、
(a)重鎖可変領域配列が、配列番号21、配列番号23、配列番号24および配列番号25からなる群から選択されるか、これらの配列に少なくとも85%の同一性を有する配列であり、軽鎖可変領域配列が、配列番号22、配列番号26、配列番号27および配列番号28からなる群から選択されるか、これらの配列に少なくとも85%の同一性を有する配列である;または
(b)重鎖可変領域配列が、配列番号29、配列番号31、配列番号32および配列番号33からなる群から選択されるか、これらの配列に少なくとも85%の同一性を有する配列であり、軽鎖可変領域配列が、配列番号30、配列番号34、配列番号35、配列番号36および配列番号37の配列からなる群から選択されるか、これらの配列に少なくとも85%の同一性を有する配列である、請求項7に記載のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項19】
抗体が、以下からなる群から選択される、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の組み合わせを含む、請求項7に記載のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメント:
1)配列番号21の重鎖可変領域および配列番号22の軽鎖可変領域;
2)配列番号21の重鎖可変領域および配列番号26の軽鎖可変領域;
3)配列番号21の重鎖可変領域および配列番号27の軽鎖可変領域;
4)配列番号21の重鎖可変領域および配列番号28の軽鎖可変領域;
5)配列番号23の重鎖可変領域および配列番号22の軽鎖可変領域;
6)配列番号23の重鎖可変領域および配列番号26の軽鎖可変領域;
7)配列番号23の重鎖可変領域および配列番号27の軽鎖可変領域;
8)配列番号23の重鎖可変領域および配列番号28の軽鎖可変領域;
9)配列番号24の重鎖可変領域および配列番号22の軽鎖可変領域;
10)配列番号24の重鎖可変領域および配列番号26の軽鎖可変領域;
11)配列番号24の重鎖可変領域および配列番号27の軽鎖可変領域;
12)配列番号24の重鎖可変領域および配列番号28の軽鎖可変領域;
13)配列番号25の重鎖可変領域および配列番号22の軽鎖可変領域;
14)配列番号25の重鎖可変領域および配列番号26の軽鎖可変領域;
15)配列番号25の重鎖可変領域および配列番号27の軽鎖可変領域;
16)配列番号25の重鎖可変領域および配列番号28の軽鎖可変領域;
17)配列番号29の重鎖可変領域および配列番号30の軽鎖可変領域;
18)配列番号29の重鎖可変領域および配列番号34の軽鎖可変領域;
19)配列番号29の重鎖可変領域および配列番号35の軽鎖可変領域;
20)配列番号29の重鎖可変領域および配列番号36の軽鎖可変領域;
21)配列番号29の重鎖可変領域および配列番号37の軽鎖可変領域;
22)配列番号31の重鎖可変領域および配列番号30の軽鎖可変領域;
23)配列番号31の重鎖可変領域および配列番号34の軽鎖可変領域;
24)配列番号31の重鎖可変領域および配列番号35の軽鎖可変領域;
25)配列番号31の重鎖可変領域および配列番号36の軽鎖可変領域;
26)配列番号31の重鎖可変領域および配列番号37の軽鎖可変領域;
27)配列番号32の重鎖可変領域および配列番号30の軽鎖可変領域;
28)配列番号32の重鎖可変領域および配列番号34の軽鎖可変領域;
29)配列番号32の重鎖可変領域および配列番号35の軽鎖可変領域;
30)配列番号32の重鎖可変領域および配列番号36の軽鎖可変領域;
31)配列番号32の重鎖可変領域および配列番号37の軽鎖可変領域;
32)配列番号33の重鎖可変領域および配列番号30の軽鎖可変領域;
33)配列番号33の重鎖可変領域および配列番号34の軽鎖可変領域;
34)配列番号33の重鎖可変領域および配列番号35の軽鎖可変領域;
35)配列番号33の重鎖可変領域および配列番号36の軽鎖可変領域;および
36)配列番号33の重鎖可変領域および配列番号37の軽鎖可変領域。
【請求項20】
キメラ抗体またはヒト化抗体の重鎖が、さらに、ヒトIgG1、IgG2、IgG3もしくはIgG4またはその変異体に由来する重鎖定常領域を含み;
キメラ抗体またはヒト化抗体の軽鎖が、さらに、ヒトκ鎖、ヒトλ鎖、またはその変異体に由来する軽鎖定常領域を含む、請求項6~19のいずれか一項に記載のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項21】
キメラ抗体またはヒト化抗体の重鎖が、さらに、ヒトIgG4またはその変異体に由来する重鎖定常領域を含む、請求項20に記載のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項22】
キメラ抗体またはヒト化抗体の重鎖が、さらに、配列番号38に示す重鎖定常領域を含み;
キメラ抗体またはヒト化抗体の軽鎖が、さらに、配列番号39に示す軽鎖定常領域を含む、請求項20に記載のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項23】
請求項1~22のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと、LAG-3との結合について競合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項24】
治療上有効量の請求項1~22のいずれか一項に記載のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメントと、1つ以上の医薬的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項25】
請求項1~22のいずれか一項に記載のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする、単離核酸。
【請求項26】
請求項25に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項27】
請求項26に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞であって、原核細胞および真核細胞からなる群から選択される、宿主細胞。
【請求項28】
LAG-3抗体またはその抗原結合フラグメントを調製する方法であって、請求項27に記載の宿主細胞において抗体またはその抗原結合フラグメントを発現させること、および、該宿主細胞から抗体またはその抗原結合フラグメントを単離することを含む、方法。
【請求項29】
請求項1~22のいずれか一項に記載のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメント、または請求項25に記載の核酸を含む、対象における腫瘍の成長を阻害するための医薬組成物
【請求項30】
請求項1~22のいずれか一項に記載のLAG-3抗体または抗原結合フラグメント、または請求項25に記載の核酸を含む、病原性T細胞の関与に関連する疾病または症状の処置のための医薬組成物
【請求項31】
該疾病または症状が癌である、請求項30に記載の医薬組成物。
【請求項32】
癌が、卵巣癌、メラノーマ、前立腺癌、腸癌、胃癌、食道癌、乳癌、肺癌、腎臓癌、膵臓癌、子宮癌、肝臓癌、膀胱癌、子宮頸癌、口腔癌、脳癌、精巣癌、皮膚癌、甲状腺癌、および血液系悪性腫瘍(骨髄腫、並びに、慢性および急性白血病を含む)から選択される、請求項31に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明の分野
本発明は、LAG-3抗体、その抗原結合フラグメント、LAG-3抗体のCDR領域を含むキメラ抗体またはヒト化抗体、並びに、LAG-3抗体およびその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物、並びに、抗がん剤としてのその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
本発明の背景
LAG-3またはCD223としても知られるリンパ球活性化遺伝子3は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、免疫細胞の様々な機能および生存サイクルを負に調節することができる。研究により、LAG-3が、ウイルス感染、自己免疫疾患、および、腫瘍誘導性免疫系機能不全において重要な役割を果たすことが示されている。LAG-3の機能に影響を及ぼすことにより、これらの疾病の発症中の免疫機能不全の状態を改善し、疾患の予後を改善することができる。
【0003】
免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーとして、LAG-3は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインの、3つの領域から構成される。成熟LAG-3分子は、Triebel et al. in 1990 (J Exp Med, 1990, 171 (5): 1393-405)により最初に発見され、70kDaの相対分子量である470個のアミノ酸から成る。LAG-3は、CDLA-4およびPD-1と同様に、負の共刺激分子であり、その活性化により、リンパ球の機能を負に調節し得ることが見出されている。構造的に、LAG-3は、CD4と密接に関連しているが、CD4とは逆の機能を有する。例えば、LAG-3分子はCD4分子と高い類似性を有し、共に、MHC-II(主要組織適合抗原)クラス分子に結合し得る。しかしながら、LAG-3のMHC-II分子に対する結合活性は、CD-4よりも高い。したがって、CD4+Tリンパ球細胞によって誘導されるTCR活性化に介入し、Tリンパ球の活性化を阻害する(Curr Opin Immunol, 2009, 21(2):179-86; Eur J Immunol, 2003, 33 (4): 970-9)。インビトロの研究において、LAG-3は、抗原によって誘導されるTリンパ球の増殖を阻害し得ることが示されている。LAG-3の遮断は、Tリンパ球の活性化および増殖を改善し、1型ヘルパーT細胞(Th1)により分泌されるサイトカインを改善するであろう。Huang et al.は、活性化されたCD4+Treg細胞上のLAG-3のレベルが有意に増加したこと、および、LAG-3が、CD4+Tregが最大の免疫抑制効果を発揮するのに必要な条件であることを示した(Immunity, 2004, 21 (4): 503-13)。さらに、抗LAG-3抗体はまた、CD4+およびCD8+Tリンパ球の恒常性を維持し、LAG-3の遮断は、CD8+Tリンパ球が腫瘍細胞を殺す能力を有意に増強するであろう(J Clin Invest, 2007, 117 (11): 3383-92)。疾病についてのいくつかの研究はまた、LAG-3が疾病の発症および進行の調節において重要な役割を果たすことを示している。Gandhi et al.は、ヒトリンパ腫組織のTリンパ球におけるLAG-3の発現レベルがTリンパ球機能不全と関連しており、LAG-3+Tリンパ球の排除が、Tリンパ球による腫瘍細胞の除去能を有意に増強し得ることを立証した(Blood, 2006, 108(7):2280-9)。本結果は、LAG-3が免疫細胞表面における重要な抑制分子であり、Tリンパ球に対して有意な負の調節効果を有することを示している。
【0004】
LAG-3は主に、Tリンパ球、Bリンパ球、NK細胞、Treg細胞、およびDC細胞上に発現している(Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94 (11): 5744-9. Eur J Immunol, 2005, 35 (7): 2081-8; J Immunol, 2009, 182 (4): 1885-91)。LAG-3は、免疫抑制分子のクラスであり、TCRの共受容体を構成する構成成分の1つである。LAG-3は、Tリンパ球により誘導されるTCR活性化に介入して、Tリンパ球の活性化において負の調節性の役割を果たす。いくつかの疾病において、LAG-3の発現が増加し、それに付随する免疫抑制が観察された。Gandhi et al. は、ホジキンリンパ腫(Hoggkin’s lymphoma)を有する患者由来の血液および腫瘍組織のリンパ球が、LAG-3を高発現すること;また、LAG-3陽性T細胞を除去し、抗腫瘍機能を回復させ、サイトカイン分泌を増加させると、腫瘍組織において特異的CD8+T細胞の機能が明らかに損なわれることを見出した。LAG-3の発現は、特定のT細胞の免疫機能の負の調節と関連しており、LAG-3分子の機能を阻害することにより、T細胞の抗腫瘍効果が増強することができ、よってLAG-3分子は、腫瘍免疫療法の潜在的標的であり得ることが推測された(Blood, 2006, 108 (7): 2280-9)。
【0005】
現在、BMSやノバルティスなどのいくつかの多国籍製薬会社が、抗原特異的T細胞応答を刺激することによって、T細胞の抗腫瘍効果を増強し、腫瘍に対する患者自身の免疫応答を最大化し、続いて腫瘍細胞を殺す目的を達成する、LAG-3に対するモノクローナル抗体の研究に従事している。現在関連する特許は、WO2010019570、WO2014008218、WO9530750、WO2004078928、WO2008132601、WO2014140180およびWO2015138920などである。
【0006】
本発明は、高い親和性、高い選択性、および高い生物学的活性を有する、LAG-3抗体を提供する。
【発明の概要】
【0007】
本発明の概要
本発明は、以下の(i)もしくは(ii)、または以下の(i)もしくは(ii)に少なくとも85%の同一性を有する配列から選択される1つ以上のCDR領域を含む、LAG-3抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する:
(i)配列番号9、配列番号10および配列番号11に示すHCDR領域;並びに、配列番号15、配列番号16および配列番号17に示すLCDR領域;または
(ii)配列番号12、配列番号13および配列番号14に示すHCDR領域;並びに、配列番号18、配列番号19および配列番号20に示すLCDR領域。
【0008】
本発明の別の好ましい実施形態において、重鎖可変領域が、配列番号9、配列番号10および配列番号11にそれぞれ示すHCDR1、HCDR2およびHCDR3を含むか、これらの配列に少なくとも85%(好ましくは95%)の同一性を有する配列を含む、本発明のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【0009】
本発明の別の好ましい実施形態において、重鎖可変領域が、配列番号12、配列番号13、および配列番号14にそれぞれ示すHCDR1、HCDR2およびHCDR3を含むか、これらの配列に少なくとも85%(好ましくは95%)の同一性を有する配列を含む、本発明のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【0010】
本発明の別の好ましい実施形態において、軽鎖可変領域が、配列番号15、配列番号16および配列番号17にそれぞれ示すLCDR1、LCDR2およびLCDR3を含むか、これらの配列に少なくとも85%(好ましくは95%)の同一性を有する配列を含む、本発明のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【0011】
本発明の別の好ましい実施形態において軽鎖可変領域が、配列番号18、配列番号19および配列番号20にそれぞれ示すLCDR1、LCDR2およびLCDR3を含むか、これらの配列に少なくとも85%(好ましくは95%)の同一性を有する配列を含む、本発明のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【0012】
本発明の別の好ましい実施形態において、マウス抗体またはそのフラグメントである、本発明のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【0013】
本発明の別の好ましい実施形態において、抗体の軽鎖可変領域が、さらに、マウスκ鎖またはその変異体由来の軽鎖FR領域を含むか、マウスλ鎖またはその変異体由来の軽鎖FR領域を含み、抗体の重鎖可変領域が、さらに、マウスIgG1またはその変異体由来の重鎖FR領域を含むか、マウスIgG2またはその変異体由来の重鎖FR領域を含むか、マウスIgG3またはその変異体由来の重鎖FR領域を含む、本発明のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【0014】
本発明の別の好ましい実施形態において、配列番号5に示す重鎖可変領域と、配列番号6に示す軽鎖可変領域とを含む、本発明のマウスLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【0015】
本発明の別の好ましい実施形態において、配列番号7に示す重鎖可変領域と、配列番号8に示す軽鎖可変領域とを含む、本発明のマウスLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【0016】
本発明の別の好ましい実施形態において、抗体軽鎖が、さらに、マウスκ鎖またはその変異体由来の軽鎖定常領域を含むか、マウスλ鎖またはその変異体由来の軽鎖定常領域を含み;抗体の重鎖可変領域が、さらに、マウスIgG1またはその変異体由来の重鎖FR領域を含むか、マウスIgG2またはその変異体由来の重鎖FR領域を含むか、マウスIgG23またはその変異体由来の重鎖FR領域を含む、本発明のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【0017】
本発明の別の好ましい実施形態において、キメラ抗体またはそのフラグメントである、本発明のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【0018】
本発明の別の好ましい実施形態において、ヒト化抗体またはそのフラグメントである、本発明のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【0019】
本発明の別の好ましい実施形態において、ヒト化抗体重鎖可変領域の重鎖FR領域が、ヒト生殖系列重鎖IGHV7-4-1*02およびhjh6.1の組み合わせ配列、または、その変異配列に由来し;ヒト生殖系列重鎖IGHV7-4-1*02由来のFR1、FR2、FR3およびhjh6.1由来のFR4、または、その変異配列を含み;好ましくは、ヒト化抗体の重鎖FR配列が0~10個のアミノ酸逆突然変異を有し、より好ましくは、E46K、R38K、V93TおよびY95Fからなる群から選択される1つ以上の逆突然変異を有する、本発明のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【0020】
本発明の別の好ましい実施形態において、ヒト化抗体の重鎖可変領域配列が、配列番号21に示す配列であるか、当該配列に少なくとも85%(好ましくは95%)の同一性を有する配列であり、好ましくは、重鎖可変領域に1~10個のアミノ酸変化が存在する、本発明のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。これらのアミノ酸変化は、当業界における親和性成熟の技術に基づいて作製されてよい。
【0021】
本発明の別の好ましい実施形態において、ヒト化抗体の重鎖可変領域配列が、配列番号21、配列番号23、配列番号24または配列番号25の配列を含むか、これらの配列に少なくとも85%(好ましくは95%)の同一性を有する配列である、本発明のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【0022】
本発明の別の好ましい実施形態において、ヒト化抗体重鎖可変領域の重鎖FR領域が、ヒト生殖系列重鎖IGHV1-3*01およびhjh6.1の組み合わせ配列、または、その変異配列に由来し;好ましくは、ヒト生殖系列重鎖IGHV1-3*01由来のFR1、FR2、FR3およびhjh6.1由来のFR4、または、その変異配列を含み;ヒト化抗体の重鎖FR配列が0~10個のアミノ酸逆突然変異を有し、より好ましくは、F29L、A97T、M48I、V68A、I70L、R72VおよびT74Kからなる群から選択される1つ以上の逆突然変異を有する、本発明のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【0023】
本発明の別の好ましい実施形態において、ヒト化抗体の重鎖可変領域配列が、配列番号29に示す配列であるか、または、上述の配列に少なくとも85%(好ましくは95%)の同一性を有する配列であり;好ましくは、重鎖可変領域に1~10個のアミノ酸変化が存在する、本発明のヒト化LAG-3抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。これらのアミノ酸変化は、当業界における親和性成熟の技術に基づいて作製されてよい。
【0024】
本発明の別の好ましい実施形態において、ヒト化抗体の重鎖可変領域配列が、配列番号29、配列番号31、配列番号32または配列番号33の配列から選択されるか、これらの配列に少なくとも85%(好ましくは95%)の同一性を有する配列である、本発明のヒト化LAG-3抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【0025】
本発明の別の好ましい実施形態において、ヒト化抗体軽鎖可変領域の軽鎖FR配列が、ヒト生殖系列軽鎖IGKV1-39*01およびhjk4.1の組み合わせ配列、並びに、その変異配列に由来し、かつ、ヒト生殖系列軽鎖IGKV1-39*01由来のFR1、FR2、FR3およびhjk4.1由来のFR4、並びに、その変異配列を含む、本発明のヒト化LAG-3抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【0026】
本発明の別の好ましい実施形態において、ヒト化抗体の軽鎖可変領域配列が、配列番号22に示す配列であるか、当該配列に少なくとも85%の同一性を有する配列であり;好ましくは、軽鎖可変領域に1~10個のアミノ酸変化が存在する、本発明のヒト化LAG-3抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。これらのアミノ酸変化は、当業界における親和性成熟の技術に基づいて作製されてよい。
【0027】
本発明の別の好ましい実施形態において、ヒト化抗体の軽鎖FR配列が0~10個のアミノ酸逆突然変異を有し、好ましくは、D70Q、F71Y、I48VおよびA43Sからなる群から選択される1つ以上の逆突然変異を有する、本発明のヒト化LAG-3抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【0028】
本発明の別の好ましい実施形態において、ヒト化抗体の軽鎖可変領域配列が、配列番号22、配列番号26、配列番号27または配列番号28の配列から選択されるか、これらの配列に少なくとも85%(好ましくは95%)の同一性を有する配列である、本発明のヒト化LAG-3抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【0029】
本発明の別の好ましい実施形態において、ヒト化抗体の軽鎖可変領域配列が、配列番号30に示す配列であるか、当該配列に少なくとも85%の同一性を有する配列であり;好ましくは、軽鎖可変領域に0~10個のアミノ酸配列が存在する、本発明のヒト化LAG-3抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。これらのアミノ酸変化は、当業界における親和性成熟の技術に基づいて作製されてよい。
【0030】
本発明の別の好ましい実施形態において、ヒト化抗体の軽鎖FR配列が、0~10個のアミノ酸逆突然変異を有し、好ましくは、L46R、G66R、S60K、P44F、Y36L、K42G、I21LおよびT85Dからなる群から選択される1つ以上の逆突然変異を有する、本発明のヒト化LAG-3抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【0031】
本発明の別の好ましい実施形態において、ヒト化抗体の軽鎖可変領域配列が、配列番号30、配列番号34、配列番号35、配列番号36または配列番号37の配列から選択されるか、これらの配列に少なくとも85%(好ましくは95%)の同一性を有する配列である、本発明のヒト化LAG-3抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【0032】
本発明の別の好ましい実施形態において、ヒト化抗体が、
(a)配列番号21、配列番号23、配列番号24および配列番号25からなる群から選択される配列に、少なくとも85%(好ましくは95%)の同一性を有する、重鎖可変領域配列;および
(b)配列番号22、配列番号26、配列番号27および配列番号28からなる群から選択される配列に、少なくとも85%の同一性を有する、軽鎖可変領域配列
を含む、本発明のヒト化LAG-3抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【0033】
本発明の別の好ましい実施形態において、ヒト化抗体が、
(a)配列番号29、配列番号31、配列番号32および配列番号33からなる群から選択される配列に、少なくとも85%(好ましくは95%)の同一性を有する、重鎖可変領域配列;および
(b)配列番号30、配列番号34、配列番号35、配列番号36および配列番号37からなる群から選択される配列に、少なくとも85%(好ましくは95%)の同一性を有する、軽鎖可変領域配列
を含む、本発明のヒト化LAG-3抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【0034】
本発明の別の好ましい実施形態において、抗体が、以下からなる群から選択される重鎖可変領域および軽鎖可変領域の組み合わせを含む、本発明のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される:
1)配列番号21の重鎖可変領域および配列番号22の軽鎖可変領域;
2)配列番号21の重鎖可変領域および配列番号26の軽鎖可変領域;
3)配列番号21の重鎖可変領域および配列番号27の軽鎖可変領域;
4)配列番号21の重鎖可変領域および配列番号28の軽鎖可変領域;
5)配列番号23の重鎖可変領域および配列番号22の軽鎖可変領域;
6)配列番号23の重鎖可変領域および配列番号26の軽鎖可変領域;
7)配列番号23の重鎖可変領域および配列番号27の軽鎖可変領域;
8)配列番号23の重鎖可変領域および配列番号28の軽鎖可変領域;
9)配列番号24の重鎖可変領域および配列番号22の軽鎖可変領域;
10)配列番号24の重鎖可変領域および配列番号26の軽鎖可変領域;
11)配列番号24の重鎖可変領域および配列番号27の軽鎖可変領域;
12)配列番号24の重鎖可変領域および配列番号28の軽鎖可変領域;
13)配列番号25の重鎖可変領域および配列番号22の軽鎖可変領域;
14)配列番号25の重鎖可変領域および配列番号26の軽鎖可変領域;
15)配列番号25の重鎖可変領域および配列番号27の軽鎖可変領域;および
16)配列番号25の重鎖可変領域および配列番号28の軽鎖可変領域。
【0035】
本発明の別の好ましい実施形態において、抗体が、以下からなる群から選択される重鎖可変領域および軽鎖可変領域の組み合わせを含む、本発明のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される:
1)配列番号29の重鎖可変領域および配列番号30の軽鎖可変領域;
2)配列番号29の重鎖可変領域および配列番号34の軽鎖可変領域;
3)配列番号29の重鎖可変領域および配列番号35の軽鎖可変領域;
4)配列番号29の重鎖可変領域および配列番号36の軽鎖可変領域;
5)配列番号29の重鎖可変領域および配列番号37の軽鎖可変領域;
6)配列番号31の重鎖可変領域および配列番号30の軽鎖可変領域;
7)配列番号31の重鎖可変領域および配列番号34の軽鎖可変領域;
8)配列番号31の重鎖可変領域および配列番号35の軽鎖可変領域;
9)配列番号31の重鎖可変領域および配列番号36の軽鎖可変領域;
10)配列番号31の重鎖可変領域および配列番号37の軽鎖可変領域;
11)配列番号32の重鎖可変領域および配列番号30の軽鎖可変領域;
12)配列番号32の重鎖可変領域および配列番号34の軽鎖可変領域;
13)配列番号32の重鎖可変領域および配列番号35の軽鎖可変領域;
14)配列番号32の重鎖可変領域および配列番号36の軽鎖可変領域;
15)配列番号32の重鎖可変領域および配列番号37の軽鎖可変領域;
16)配列番号33の重鎖可変領域および配列番号30の軽鎖可変領域;
17)配列番号33の重鎖可変領域および配列番号34の軽鎖可変領域;
18)配列番号33の重鎖可変領域および配列番号35の軽鎖可変領域;
19)配列番号33の重鎖可変領域および配列番号36の軽鎖可変領域;および
20)配列番号33の重鎖可変領域および配列番号37の軽鎖可変領域。
【0036】
本発明の別の好ましい実施形態において、キメラ抗体またはヒト化抗体の重鎖が、さらに、ヒトIgG1、IgG2、IgG3もしくはIgG4、またはその変異体に由来する重鎖定常領域を含み、好ましくは、ヒトIgG4またはその変異体に由来する重鎖定常領域を含み、最も好ましくは、配列番号38に示す重鎖定常領域を含む、本明細書に記載されるキメラまたはヒト化LAG-3抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【0037】
当該キメラ抗体または当該ヒト化抗体の軽鎖は、さらに、ヒトκ鎖、ヒトλ鎖またはその変異体に由来する軽鎖定常領域を含み、最も好ましくは、配列番号39に示す軽鎖定常領域を含む。
【0038】
本発明はさらに、治療上有効量の本明細書に記載されるLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメントと、1つ以上の医薬的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
【0039】
本発明はさらに、上記に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと、LAG-3との結合について競合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【0040】
本発明はさらに、上述のLAG-3抗体または抗原結合フラグメントをコードする単離核酸を提供する。
【0041】
本発明はさらに、上述の単離核酸を含む発現ベクターを提供する。
【0042】
本発明はさらに、上記に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞であって、宿主細胞が、原核細胞および真核細胞からなる群から選択され、好ましくは真核細胞であり、より好ましくは哺乳類細胞である、宿主細胞を提供する。
【0043】
本発明はさらに、LAG-3抗体またはその抗原結合フラグメントを調製するための方法であって、上記に記載の宿主細胞において、抗体またはその抗原結合フラグメントを発現させること、および、該宿主細胞から抗体またはその抗原フラグメントを単離することを含む、方法を提供する。
【0044】
本発明はさらに、対象において腫瘍細胞の成長を阻害するための方法であって、治療上有効量の本発明のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメント、または、これを含む医薬組成物を対象に投与し、それによって、対象における腫瘍の成長を阻害することを含む、方法を提供する。
【0045】
本発明はさらに、対象において腫瘍細胞の成長を阻害することにおける、上述のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメント、またはこれを含有する医薬組成物の使用を提供する。
【0046】
本発明はさらに、対象において腫瘍細胞の成長を阻害するための医薬の調製における、当該LAG-3抗体またはその抗原結合フラグメント、またはこれを含有する医薬組成物の使用を提供する。
【0047】
本発明はさらに、免疫細胞の関与に関連する疾病または症状の処置のための医薬の調製における、本発明のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメントの使用を提供し、該疾病または症状が、好ましくは癌である。本明細書に記載される癌には、卵巣癌、メラノーマ(例えば、転移性悪性黒色腫)、前立腺癌、腸癌(例えば、結腸および小腸癌)、胃癌、食道癌、乳癌、肺癌、腎臓癌(例えば、腎明細胞癌(clear cell carcinoma))、膵臓癌、子宮癌、肝臓癌、膀胱癌、子宮頸癌、口腔癌、脳癌、精巣癌、皮膚癌、甲状腺癌、および血液系悪性腫瘍(骨髄腫および慢性/急性白血病を含む)が含まれるが、これらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【0048】
図1】ヒト化抗LAG-3抗体は、SEBにより活性化されたTリンパ球からのIL-2サイトカインの分泌を増強する。結果は、ヒト化LAG-3抗体候補、Hu229-013およびHu303-005が、活性化したリンパ球からのサイトカインIL-2の分泌を増強し得ること、および薬剤濃度の投与量効果により増強し得ることを示す。
図2】U-87MG腫瘍を有するマウスの腫瘍体積におけるヒト化抗LAG-3抗体の効果。結果は、LAG-3抗体Hu229-013 6mpkおよびHu303-005 6mpkはいずれも、ある種の抗腫瘍効果を有し、腫瘍抑制率は、それぞれ27.25%(p<0.05)および34.94%(p<0.01)であり、コントロールグループと比較して有意な違い(hIGgに対して、p<0.001)があったことを示す。
【発明を実施するための形態】
【0049】
本発明の詳細な説明
1.用語
本発明をより容易に理解するために、特定の技術的および科学的用語を以下に具体的に定義する。本明細書中の他の箇所で具体的に定義されていない限り、本明細書で使用される他のすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。
【0050】
本明細書で用いられる場合、アミノ酸の一文字コードおよび三文字コードは、J. Biol. Chem, 243, (1968) p3558で記載されるとおりである。
【0051】
用語「LAG-3」は、リンパ球活性化遺伝子3を指す。用語「LAG-3」には、変異体、アイソフォーム、ホモログ、オルソログ、およびパラログが含まれる。用語「ヒトLAG-3」は、Uniprot番号P18627によるヒトLAG-3の完全なアミノ酸配列などの、ヒトLAG-3の配列を指す。LAG-3はまた、当業界では、例えばCD223として知られる。ヒトLAG-3配列は、例えば、保存された変異、または、非保存領域における変異を有するという点で、Uniprot番号P18627のヒトLAG-3とは異なり得、Uniprot番号P18627のヒトLAG-3と実質的に同一の生物学的機能を有する。例えば、ヒトLAG-3の生物学的機能は、本明細書中に開示される抗体が特異的に結合するLAG-3の細胞外ドメインにおけるエピトープであるか、またはヒトLAG-3の生物学的機能はMHCクラスII分子に結合することである。
【0052】
特定のヒトLAG-3配列は、一般的に、Uniprot番号P18627のヒトLAG-3とアミノ酸配列において少なくとも90%の同一性を有するであろうし、他の種(例えば、マウス)由来のLAG-3アミノ酸配列と比較してヒトアミノ酸配列であると同定されるアミノ酸残基を含有する。いくつかの場合において、ヒトLAG-3は、Uniprot番号P18627のLAG-3に対して、アミノ酸配列において、少なくとも85%、または、さらには少なくとも95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有することができる。いくつかの実施形態において、ヒトLAG-3配列は、Uniprot番号P18627のLAG-3配列と、10個以下のアミノ酸の違いを提示するであろう。いくつかの実施形態において、ヒトLAG-3は、Uniprot番号P18627のLAG-3配列と、5個以下、または、さらには4、3、2、または1個以下のアミノ酸の違いを提示することができる。同一性%は、本明細書に記載したとおりに決定することができる。
【0053】
本明細書で用いられる場合、「配列同一性」は、適切な置換、挿入または欠失などの変異を有する場合に、最適にアライメントされて比較される際の、2つの核酸または2つのアミノ酸配列の間の同一性の程度を示す。本発明に記載される配列と、対応する配列との間の配列同一性は、少なくとも85%、90%、または95%であり、好ましくは少なくとも95%である。代表的な例には、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%が含まれるが、これらに限定されない。
【0054】
2つの配列の間の同一性%は、2つの配列の最適なアライメントのために導入する必要がある、ギャップの数、および、各ギャップの長さを考慮に入れた、2つの配列が共に有する同一の位置の数の関数である(すなわち、同一性%=同一の位置の数/位置の総数×100)。2つの配列の間の、配列の比較および同一性%の決定は、米国立バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Institute)のウェブサイトで利用できる、BLASTN/BLASTPアルゴリズムのデフォルト設定を使用して、達成することができる。
【0055】
本明細書で用いられる場合、「抗体」は、2つの同一の重鎖と2つの同一の軽鎖との間のジスルフィド結合によって共に連結された4つのペプチド鎖構造の免疫グロブリンを指す。異なる免疫グロブリン重鎖定常領域は、異なるアミノ酸組成および順番を示し、したがって異なる抗原性を示す。従って、免疫グロブリンは、免疫グロブリンアイソタイプと呼ばれる、5つのカテゴリー、すなわち、IgM、IgD、IgG、IgAおよびIgEに分類することができ、これらの重鎖は、それぞれ、μ鎖、δ鎖、γ鎖、α鎖およびε鎖である。ヒンジ領域のアミノ酸組成と、重鎖ジスルフィド結合の位置によって、同じタイプのIgを、異なるサブカテゴリーに分けることができ、例えば、IgGは、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4に分類することができる。軽鎖は、異なる定常領域を考慮して、κまたはλ鎖に分類することができる。5つのタイプのIgGはそれぞれ、κまたはλ鎖を有し得る。
【0056】
本発明において、本明細書で述べられる抗体軽鎖は、ヒトまたはマウスのκ、λ鎖、またはその変異体を含む、軽鎖定常領域をさらに含む。
【0057】
本発明において、本明細書で述べられる抗体重鎖は、ヒトまたはマウスのIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、またはその変異体を含む、重鎖定常領域をさらに含む。
【0058】
抗体の重鎖および軽鎖のN末端配列の近傍では、約100個アミノ酸が大きく変化し、可変領域(Fv領域)として知られる;C末端の近傍の残りのアミノ酸配列は、比較的安定であり、定常領域として知られる。可変領域は、3つの超可変領域(HVR)と、4つの比較的保存された配列であるフレームワーク領域(FR)を含む。3つの超可変領域が、抗体の特異性を決定し、相補性決定領域(CDR)としても知られる。各軽鎖可変領域(LCVR)および各重鎖可変領域(HCVR)は、3つのCDR領域および4つのFR領域から構成され、アミノ末端からカルボキシル末端への順番は、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、およびFR4である。3つの軽鎖CDRは、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3を指し、3つの重鎖CDRは、HCDR1、HCDR2およびHCDR3を指す。本明細書の抗体または抗原結合フラグメントのLCVRおよびHCVR領域におけるCDR領域のアミノ酸残基の数および位置は、既知のKabat番号付け基準(LCDR1-3、HCDE2-3)に従うか、またはKabatおよびChothia番号付け基準(HCDR1)に従う。
【0059】
本発明の抗体は、マウス抗体、キメラ抗体、およびヒト化抗体を含み、好ましくはヒト化抗体を含む。
【0060】
本発明の用語「マウス抗体」は、当分野の知識やスキルに基づいて調製された抗ヒトLAG-3モノクローナル抗体を指す。調製の際に、試験対象にLAG-3抗原を注入し、所望の配列または機能特性を有する抗体を発現するハイブリドーマを分離した。本発明の好ましい実施形態において、マウスLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメントは、さらに、マウスκ鎖、λ鎖、またはその変異体の軽鎖定常領域を含むか、マウスIgG1、IgG2、IgG3、またはその変異体の、重鎖定常領域を含む。
【0061】
用語「キメラ抗体」は、マウス抗体の可変領域と、ヒト抗体の定常領域を融合させることによって形成される抗体であり、該キメラ抗体は、マウス抗体が誘導する免疫応答を緩和させることができる。キメラ抗体を構築するには、まず、特定のマウスモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを構築し、マウスハイブリドーマ細胞から可変領域遺伝子をクローニングした後、ヒト抗体の定常領域遺伝子を所望に応じてクローニングし、マウス可変領域遺伝子を、ヒト定常領域遺伝子に連結させてヒトベクターに挿入することができるキメラ遺伝子を形成し、最後に、キメラ抗体分子を真核または原核系で発現させる。本発明の好ましい実施形態において、LAG-3キメラ抗体の軽鎖は、さらに、ヒトκ鎖、λ鎖、またはその変異体の軽鎖定常領域を含む。LAG-3キメラ抗体の重鎖は、さらに、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、またはその変異体の重鎖定常領域を含み、好ましくは、ヒトIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4の重鎖定常領域を含み、あるいは、好ましくは、ヒトIgG1、IgG2、または、IgG4、または、アミノ酸変異(例えば、YTE変異)を有するその変異体の重鎖定常領域を含む。
【0062】
用語「ヒト化抗体」は、CDR移植抗体としても知られ、マウスCDR配列をヒト抗体の可変領域フレームワークに移植することによって作製される抗体、すなわち、異なるタイプのヒト生殖系列抗体フレームワーク配列の間で生成される抗体を指し、ヒト化抗体は、大量のマウスタンパク質構成成分を有するキメラ抗体によって誘導される異種応答を克服している。これらのフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列を網羅する公的なDNAデータベース、または、公開された文献から、取得することができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖系列DNA配列は、ヒト生殖系列配列データベース「VBase」(ウェブwww.mrccpe.com.ac.uk/vbaseで入手可能)において、並びに、Kabat, EA, et al, 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edにおいて、見つけることができる。免疫原性低下の間の活性の低下を回避するために、ヒト抗体の可変領域フレーム配列は最小限の逆突然変異を受けて活性を維持する。本発明のヒト化抗体はまた、ファージディスプレイによるCDR親和性成熟をさらに受けたヒト化抗体を含む。本発明の好ましい実施形態において、ヒト化LAG-3抗体のマウスCDR配列は、配列番号9~20から選択される;ヒト抗体の可変領域フレームは、選択されるように設計されており、抗体の重鎖可変領域の重鎖FR配列は、ヒト生殖系列重鎖IGKV1-39*01およびhjk4.1の組み合わせ配列に由来し、抗体の軽鎖可変領域の軽鎖FR配列は、ヒト生殖系列重鎖IGHV3-23*04およびhjh6.1の組み合わせ配列に由来している。免疫原性の低下により引き起こされる活性の低下を回避するために、本明細書に記載されるヒト抗体の可変領域は、最小限の逆突然変異を受けて、抗体の活性を維持し得る。
【0063】
CDRの移植は、抗原と接触するフレームワーク残基の変化に起因して、抗原に対するLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメントの親和性の低下をもたらし得る。これらの相互作用は、高度な体細胞変異の結果であり得る。従って、これらのドナーフレームワークアミノ酸を、ヒト化抗体のフレームワークに移植する必要があるかもしれない。非ヒトLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメント由来の、抗原結合に関与するアミノ酸残基は、マウスモノクローナル抗体の可変領域配列および構造を調べることによって特定することができる。生殖系列とは異なるCDRドナーフレームワークにおける残基はそれぞれ、関連性があると考えられる。最も近い近縁種を決定することができない場合、配列は、サブタイプのコンセンサス配列または高い類似性パーセントを有するマウス配列と比較することができる。希少なフレーム残基は、高度な体細胞変異の結果であると考えられており、結合において重要な役割を果たす。
【0064】
用語、抗体の「抗原結合フラグメント」(または、略して「抗体フラグメント」)は、抗原(例えば、LAG-3タンパク質)に特異的に結合する能力を保持する、抗体の1つ以上のフラグメントを指す。抗体の抗原結合機能は、完全長の抗体フラグメントによって実施され得ることが示されている。用語、抗体の「抗原結合フラグメント」に包含される結合フラグメントの例には、(i)VL、VH、CLおよびCH1ドメインからなる一価フラグメントである、Fabフラグメント;(ii)ヒンジ領域にてジスルフィド架橋で連結した2つのFabフラグメントを含む、二価フラグメントである、F(ab’)フラグメント;(iii)VHおよびCH1ドメインからなるFdフラグメント;(iV)抗体のシングルアームのVLおよびVHドメインからなるFvフラグメント;(v)VHドメインからなる、シングルドメインまたはdAbフラグメント(Ward et al., (1989) Nature10 341:544-546);および、(vi)分離したCDR、または(vii)場合により、合成リンカーにより連結された2つ以上の分離したCDRの組み合わせが含まれる。さらに、Fvフラグメントの2つのドメイン、VLおよびVHは、別々の遺伝子によってコードされているが、それらは、組み換え法を用いて合成リンカーにより連結され得、VLおよびVH領域が対になって一価の分子を形成する単一タンパク質鎖として作製され得る(一本鎖Fv(scFv)として知られる;例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426 および Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照されたい)。これらの一本鎖抗体はまた、用語、抗体の「抗原結合フラグメント」に包含されることが意図されている。これらの抗体フラグメントは、当業者に知られている従来技術を用いて得られ、インタクトな抗体と同じ方法で、有用性についてスクリーニングされる。抗原結合部分は、組換えDNA技術によって、または、インタクトな免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的分解によって、生成され得る。抗体は、異なるアイソフォームの抗体であってよく、例えば、IgG(例えば、IgGl、IgG2、IgG3またはIgG4サブタイプ)、IgA1、IgA2、IgD、IgEまたはIgM抗体であってよい。
【0065】
用語「一本鎖抗体」、「一本鎖Fv」または「scFv」は、リンカーで結合した抗体重鎖可変ドメイン(または、領域;VH)と、抗体軽鎖可変ドメイン(または、領域;VL)とを含む分子を指すことを意図している。これらのscFv分子は、一般構造:NH-VL-リンカー-VH-COOHまたはNH-VH-リンカー-VL-COOHを有し得る。先行技術における好適なリンカーは、反復性GGGGSアミノ酸配列またはその変異体、例えば1~4個の反復を有する変異体からなる(Holliger et al.(1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA90: 6444-6448)。本発明で用いられ得る他のリンカーは、Alfthan et al., Protein Eng.8:725-731、Choi et al (2001), Eur. J. Immuno l.31:94-106、Hu et al. (1996), Cancer Res.56:3055-3061、Kipriyanov et al. (1999)、J.Mol.Biol.293:41-56 および Roovers et al (2001), Cancer Immunolにより記載されている。
【0066】
用語「CDR」は、抗原結合に主に寄与する抗体の可変ドメイン内の、6個の超可変領域の1個を指す。6個のCDRに最も一般的に用いられる定義の1つが、Kabat E.A. et al, (1991) Sequences of proteins of immunological interest. NIH Publication 91-3242により提供された。本明細書で用いられる場合、KabatのCDRの定義は、軽鎖可変ドメインのCDR1、CDR2、およびCDR3(LCDRl、LCDR2、LCDR3、またはLl、L2、L3)、並びに、重鎖可変ドメインのCDR2およびCDR3(HCDR2、HCDR3、またはH2、H3)のみに適用される
【0067】
本明細書で用いられる、用語「抗体フレームワーク」は、VLまたはVHのいずれかの可変ドメインの一部を指し、可変ドメインの抗原結合ループ(CDR)の足場として働く。本質的には、CDRを有さない可変ドメインである。
【0068】
用語「エピトープ」または「抗原決定基」は、免疫グロブリンまたは抗体が特異的に結合する抗原上の部位(例えば、LAG3分子上の特定の部位)を指す。エピトープには、通常、独特の空間的コンフォメーションで、少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15個の、連続の、または、非連続のアミノ酸が含まれる。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)を、参照されたい。
【0069】
用語「特異的結合」、「選択的結合」、「選択的に結合する」および「特異的に結合する」は、所定の抗原上のエピトープへの、抗体の結合を指す。通常、抗体は、10-8M未満、10-9M未満または10-10M未満、またはさらにそれ以下などの、およそ10-7M未満の親和性(KD)で結合している。
【0070】
用語「競合的結合」は、ヒトLAG-3の細胞外領域上の、本発明のモノクローナル抗体と同一のエピトープ(抗原決定基とも呼ばれる)または同一のエピトープの一部を認識し、抗原に結合する抗体を指す。本発明のモノクローナル抗体と同一のエピトープに結合する抗体は、本発明のモノクローナル抗体により認識されるヒトLAG-3のアミノ酸配列を認識して、それに結合する抗体を指す。
【0071】
用語「Kd」または「KD」は、特定の抗体-抗原相互作用の解離平衡定数を指す。通常、本発明の抗体は、例えば、BIACORE装置における表面プラズモン共鳴(SPR)技術を用いて決定された、10-8M未満、10-9M未満または10-10M未満、またはさらにそれ以下などの、およそ10-7M未満の解離平衡定数(KD)で、LAG-3に結合している。
【0072】
本明細書で用いられる用語「核酸分子」は、DNA分子およびRNA分子を指す。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であってよいが、好ましくは二本鎖DNAである。核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれた場合に、「効果的に連結」される。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合に、コード配列に効果的に連結される。
【0073】
用語「ベクター」は、連結されている別の核酸を輸送できる核酸分子を指す。ある実施形態において、ベクターは、追加のDNAセグメントが連結され得る、環状二本鎖DNAループを指す「プラスミド」である。別の実施形態において、ベクターはウイルスベクターであり、追加のDNAセグメントはウイルスゲノムに連結され得る。本発明において、ベクターは、導入される宿主細胞において、自律複製可能であるか(例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよび哺乳類エピソーマルベクター)、または、宿主細胞への導入の際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ得、それにより、宿主ゲノムと共に複製される(例えば、哺乳類非エピソーマルベクター)。
【0074】
抗体および抗原結合フラグメントを生成および精製する方法は、当業界でよく知られており、例えば、Antibody Experimental Technology Guide of Cold Spring Harbor, Chapters 5-8 and 15に見出すことができる。例えば、マウスを、ヒトLAG-3またはそのフラグメントで免疫化し、得られた抗体を、当業界でよく知られる従来の方法を用いて、再生し、精製して、配列決定することができる。抗原結合フラグメントもまた、従来の方法により調製することができる。本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、1つ以上のヒトフレームワーク領域(FR)を、非ヒト由来のCDRに導入するように、遺伝子操作される。ヒトFR生殖系列配列は、ImMunoGeneTics(IMGT)から、そのウェブサイトhttp://imgt.cines.frを経由して、または、The Immunoglobulin FactsBook,2001ISBN012441351から、入手することができる。
【0075】
用語「宿主細胞」は、発現ベクターが導入された細胞を指す。宿主細胞は、細菌、微生物、植物または動物の細胞を含み得る。形質転換されやすい細菌には、大腸菌(Escherichia coli)またはサルモネラ菌(Salmonella)の菌株などの腸内細菌科(enterobacteriaceae)、枯草菌(Bacillus subtilis)などのバチルス科(Bacillaceae)、肺炎球菌(Pneumococcus)、連鎖球菌(Streptococcus)、およびインフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)のメンバーが含まれる。好適な微生物には、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)およびピキア・パストリス(Pichia pastoris)が含まれる。好適な動物宿主細胞株には、CHO(チャイニーズハムスター卵巣株)細胞およびNSO細胞が含まれる。
【0076】
本発明の操作された抗体または抗原結合フラグメントは、従来の方法を用いて調製および精製されてよい。例えば、重鎖および軽鎖をコードするcDNA配列をクローニングして、GS発現ベクターに組換えてもよい。組換え免疫グロブリン発現ベクターは、その後、安定してCHO細胞にトランスフェクトされ得る。当技術分野でよく知られるより推奨される方法として、哺乳動物発現系は、通常、FC領域の高度に保存されたN末端に、グリコシル化をもたらすであろう。安定なクローンは、ヒトLAG-3に特異的に結合する抗体の発現を通して得られる。陽性クローンは、バイオリアクターでの抗体生成のために、無血清培養培地で、増殖させることができる。抗体が分泌される培養培地は、従来技術により精製されてよい。例えば、該培地は、互換性のあるバファーで平衡化されたタンパク質AまたはGセファロースFFカラムに、好都合にも適用され得る。該カラムは、非特異的結合構成成分を除去するために洗浄する。結合抗体をPHグラジエントにより溶出し、抗体フラグメントを、SDS-PAGEにより検出して、その後保管する。抗体は、一般的な技術を用いて、濾過および濃縮され得る。可溶性混合物および凝集物は、サイズ排除またはイオン交換を含む一般的な技術によって効果的に除去され得る。得られた生成物は、例えば-70℃で直ちに凍結され得るか、あるいは、凍結乾燥され得る。
【0077】
「投与」および「処置」は、動物、ヒト、実験対象、細胞、組織、臓器、または体液に適用される場合、外来性の医薬用、治療用、診断用の薬剤または組成物を、動物、ヒト、対象、細胞、組織、臓器、または体液と接触させることを指す。「投与」および「処置」は、例えば、治療的用、薬物動態学用、診断用、研究用、および実験用の方法を指すことができる。細胞の処置には、試薬を、細胞と接触させること、並びに、試薬を、細胞と接触している液体と接触さることが包含される。「投与」および「処置」はまた、例えば、細胞に対する、または、試薬、診断薬、結合化合物による、または別の細胞による、インビトロおよびエクスビボの処置を意味する。「処置」は、ヒト、家畜(veterinary)、または研究対象に適用される場合、研究および診断用途のための、治療処置、予防的(prophylactic)方法、または予防性(preventative)の方法を指す。
【0078】
「処置する」とは、本発明の結合化合物のいずれかを含む組成物などの治療薬を、「処置する」とは、本発明の結合性化合物のいずれかを含む組成物などの治療薬を、その治療薬が既知の治療活性を有する、1つ以上の疾病の症状を有する患者に対して、内的または外的に投与することを意味する。通常、これらの症状の臨床的に測定可能な程度に、退行を誘導することによるか、または進行を抑制することによるかにかかわらず、該治療薬は、処置された患者または集団において1つ以上の疾病の症状を緩和するのに有効な量で投与される。任意の特定の疾病の症状を緩和するのに有効な治療薬の量(「治療上有効量」とも呼ばれる)は、患者の疾病のステージ、年齢、および体重、並びに、薬剤が患者において所望の応答を誘発する能力などのファクターに応じて変化し得る。疾病の症状が緩和されているかどうかは、医師または他の熟練した医療提供者がその症状の重症度または進行状況を評価するために通常使用する臨床測定によって評価することができる。本発明の実施形態(例えば、処置方法または製品)は全ての患者において目的の疾病の症状を緩和することに効果的でないかもしれないが、当業界で知られる任意の統計検定(例えば、スチューデントt検定、カイ二乗検定、マン・ホイットニーのU検定、クラスカル・ワリス検定(H-test)、ヨンクヒール・タプストラ検定(Jonckheere-Terpstra-test)およびウィルコクソン検定など)により決定される、統計的に有意な患者の数において、目的の標的とする疾病の症状を緩和するはずである。
【0079】
「保存的修飾」または「保存的交換または置換」は、類似の特性(例えば、電荷、側鎖の大きさ、疎水性/親水性、骨格のコンフォメーションおよび剛直性(rigidity)など)を有する他のアミノ酸による、タンパク質中のアミノ酸の置換を指し、これらの変更は、しばしば、タンパク質の生物学的活性を変えることなく行われ得る。当業者であれば、一般に、ポリペプチドの非必須領域における単一のアミノ酸置換は、生物学的活性を実質的に変更しないことを認識している(例えば、Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4.sup.th Ed.)を参照されたい)。さらに、構造的または機能的に類似したアミノ酸による置換は、生物学的活性を妨害する可能性はより低い。
【0080】
「有効量」は、病状の症状または兆候を、寛解または予防するのに十分な量を包含する。有効量はまた、診断を可能にするか、促進するのに十分な量を意味する。特定の患者または獣医学的対象に対する有効量は、処置される症状、患者の一般的な健康状態、投与の経路および投与量、および副作用の重症度などの因子に応じて変化し得る。有効量は、顕著な副作用または毒性作用を回避する最大投与量または投薬プロトコールであり得る。
【0081】
「外来性の」は、文脈に応じて、生物、細胞、または人体の外部で生成された物質を指す。「内在性の」は、文脈に応じて、細胞、生物、または人体の内部で生成された物質を指す。
【0082】
「相同性」は、2つのポリヌクレオチド配列、または、2つのポリペプチド間の、配列類似性を指す。例えば、2つのDNA分子のそれぞれの位置がアデニンによって占められている場合など、比較されるべき2つの配列の両方の位置が同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットによって占有されている場合、該分子はその位置で相同である。2つの配列間の相同性のパーセントは、2つの配列が共有する、一致するか、または相同な位置の数を、比較された位置の数で割って、100を掛けた値の関数である。例えば、二つの配列において、配列が最適にアライメントされた場合に、10個のうち6個の位置が一致するか、相同であれば、2つの配列は60%相同である。例えば、二つの配列において、配列が最適にアライメントされた場合に、100個のうち95個の位置が一致するか、相同であれば、2つの配列は95%相同である。一般的に、2つの配列が最大の相同性%を与えるようにアライメントされる場合に、比較がなされる。
【0083】
本明細書で用いられる場合、「細胞」、「細胞株」、および「細胞培養物」という言い回しは、互換的に用いられ、これらの表示には全て、子孫が含まれる。それゆえ、「形質転換体」および「形質転換細胞」という単語は、継代(transfer)の数を考慮せずに、対象の一次細胞およびそれに由来する培養物を含む。意図的な、または偶発性の変異のために、すべての子孫がDNAの内容において正確に同一でない可能性があることも理解される。最初に形質転換された細胞でスクリーニングされたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異子孫が含まれる。異なるものを指すことが意図されている場合は、文脈から明らかであろう。
【0084】
本明細書で用いられる場合、「ポリメラーゼ連鎖反応」または「PCR」は、微量の核酸、RNAおよび/またはDNAの特異的部分を、例えば米国特許第4,683,195号に記載される通りに、増幅させる手順または技術を指す。一般的に、目的の領域の末端からの、または、目的の領域を超えた配列情報は、オリゴヌクレオチドプライマーを設計できるように、利用可能である必要がある。これらのプライマーは、増幅されるべき鋳型に対応する鎖と、配列において同一または類似しているであろう。2つのプライマーの5’末端ヌクレオチドは、増幅されるべき物質の末端に同一であることができる。PCRは、特定のRNA配列、全ゲノムDNAからの特定のDNA配列、および全細胞RNA、バクテリオファージまたはプラスミド配列などから転写されたcDNAを増幅するために使用され得る。一般的に、Mullis et al. (1987) Cold Spring Harbor Symp. Ouant. Biol. 51:263; Erlich, ed., (1989) PCR TECHNOLOGY (Stockton Press, N.Y.)を参照されたい。本明細書で用いられる場合、PCRは、核酸の特定部分を増幅または作製するための、プライマーとしての既知の核酸と、核酸ポリメラーゼとの使用を含む、核酸試験サンプルを増幅させるための核酸ポリメラーゼ反応方法の一例として考えられているが、唯一の例ではない。
【0085】
「場合による」または「場合により」は、それに続く事象または状況が必ずしも起こらない場合があることを意味し、その表現は、事象または状況が起こる場合、または、起こらない場合を含む。例えば、「場合により、1~3個の抗体重鎖可変領域を含む」は、特定の配列を有する抗体の重鎖可変領域が存在し得るが、必ずしも存在するわけではないことを意味する。
【0086】
「医薬組成物」は、本発明の1つ以上の化合物、または、その生理学的/医薬的に許容される塩もしくはプロドラッグと、生理学的/医薬的に許容される担体および賦形剤などの他の化学的構成成分とを含有する混合物を指す。医用組成物は、生物への投薬を促進し、有効成分の吸収を推進し、それによって生物学的効果を発揮することを目的とする。
本開示は、例えば、以下に関する。
[1]
以下の(i)もしくは(ii)、または以下の(i)もしくは(ii)に少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列から選択される1つ以上のCDR領域配列を含む、LAG-3抗体またはその抗原結合フラグメント:
(i)配列番号9、配列番号10、および配列番号11に示すHCDR領域;および配列番号15、配列番号16および配列番号17に示すLCDR領域;または
(ii)配列番号12、配列番号13および配列番号14に示すHCDR領域;および配列番号18、配列番号19および配列番号20に示すLCDR領域。
[2]
抗体の重鎖可変領域が、配列番号9、配列番号10、および配列番号11にそれぞれ示すHCDR1、HCDR2およびHCDR3を含むか、これらの配列に少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含む;または、抗体の重鎖可変領域が、配列番号12、配列番号13および配列番号14にそれぞれ示すHCDR1、HCDR2およびHCDR3を含むか、これらの配列に少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記[1]に記載のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメント。
[3]
抗体の軽鎖可変領域が、配列番号15、配列番号16および配列番号17にそれぞれ示すLCDR1、LCDR2およびLCDR3を含むか、これらの配列に少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含む;または、抗体の軽鎖可変領域が、配列番号18、配列番号19および配列番号20にそれぞれ示すLCDR1、LCDR2およびLCDR3を含むか、これらの配列に少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記[1]に記載のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメント。
[4]
マウス抗体またはその抗原結合フラグメントである、前記[1]に記載のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメント。
[5]
抗体の軽鎖可変領域が、さらに、マウスκ鎖またはその変異体由来の軽鎖FR領域を含むか、マウスλ鎖またはその変異体由来の軽鎖FR領域を含み;抗体の重鎖可変領域が、さらに、マウスIgG1またはその変異体由来の重鎖FR領域を含むか、マウスIgG2またはその変異体由来の重鎖FR領域を含むか、マウスIgG3またはその変異体由来の重鎖FR領域を含む、前記[1]に記載のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメント。
[6]
マウス抗体が、配列番号5に示す重鎖可変領域と、配列番号6に示す軽鎖可変領域とを含む、または、配列番号7に示す重鎖可変領域と、配列番号8に示す軽鎖可変領域とを含む、前記[4]に記載のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメント。
[7]
抗体軽鎖が、さらに、マウスκ鎖またはその変異体由来の軽鎖定常領域を含むか、マウスλ鎖またはその変異体由来の軽鎖定常領域を含み;抗体重鎖が、さらに、マウスIgG1またはその変異体由来の重鎖定常領域を含むか、マウスIgG2またはその変異体由来の重鎖定常領域を含むか、マウスIgG3またはその変異体由来の重鎖定常領域を含む、前記[1]に記載のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメント。
[8]
キメラ抗体またはその抗原結合フラグメントである、前記[1]に記載のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメント。
[9]
ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントである、前記[1]に記載のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメント。
[10]
ヒト化抗体重鎖可変領域の重鎖FR領域が、ヒト生殖系列重鎖IGHV7-4-1*02およびhjh6.1の組み合わせ配列、または、その変異配列に由来し、好ましくは、IGHV7-4-1*02由来のFR1、FR2、FR3およびhjh6.1由来のFR4、または、その変異配列を含み;あるいは、ヒト化抗体重鎖可変領域の重鎖FR領域が、ヒト生殖系列重鎖IGHV1-3*01およびhjh6.1の組み合わせ配列、または、その変異配列に由来し、好ましくは、IGHV1-3*01由来のFR1、FR2、FR3およびhjh6.1由来のFR4、または、その変異配列を含む、前記[9]に記載のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメント。
[11]
ヒト化抗体の重鎖可変領域配列が、配列番号21または配列番号29に示す配列であるか、これらのアミノ酸配列に少なくとも85%の同一性を有し、好ましくは、重鎖可変領域に1~10個のアミノ酸変化を有する、前記[10]に記載のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメント。
[12]
ヒト化抗体の重鎖FR配列が0~10個のアミノ酸逆突然変異を有し;好ましくは、逆突然変異が、ヒト生殖系列重鎖IGHV7-4-1*02およびhjh6.1の組み合わせ配列の重鎖FR領域に存在し、かつ、E46K、R38K、V93TおよびY95Fからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸逆突然変異である;または、好ましくは、逆突然変異が、ヒト生殖系列重鎖IGHV1-3*01およびhjh6.1の組み合わせ配列の重鎖FR領域に存在し、かつ、F29L、A97T、M48I、V68A、I70L、R72VおよびT74Kからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸逆突然変異である、前記[10]に記載のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメント。
[13]
ヒト化抗体の重鎖可変領域配列が、配列番号21、配列番号23、配列番号24および配列番号25からなる群から選択されるか、これらの配列に少なくとも85%の同一性を有する配列である;または、配列番号29、配列番号31、配列番号32および配列番号33からなる群から選択されるか、これらの配列に少なくとも85%の同一性を有する配列である、前記[10]に記載のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメント。
[14]
ヒト化抗体軽鎖可変領域の軽鎖FR配列が、ヒト生殖系列軽鎖IGKV1-39*01およびhjk4.1の組み合わせ配列、または、その変異配列に由来し;かつ、ヒト生殖系列軽鎖IGHV1-39*01由来のFR1、FR2、FR3およびhjh4.1由来のFR4、または、その変異配列を含む、前記[9]に記載のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメント。
[15]
ヒト化抗体の軽鎖可変領域配列が、配列番号22または配列番号30に示す配列であるか、これらのアミノ酸配列に少なくとも85%の同一性を有する配列であり、好ましくは、軽鎖可変領域に1~10個のアミノ酸変化を有する、前記[14]に記載のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメント。
[16]
ヒト化抗体の軽鎖FR配列が、0~10個のアミノ酸逆突然変異を有し、好ましくは、D70Q、F71Y、I48VおよびA43Sからなる群から選択される1つ以上の逆突然変異を有し、または、好ましくは、L46R、G66R、S60K、P44F、Y36L、K42G、I21LおよびT85Dからなる群から選択される1つ以上の逆突然変異を有する、前記[14]に記載のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメント。
[17]
ヒト化抗体の軽鎖可変領域配列が、配列番号22、配列番号26、配列番号27および配列番号28からなる群から選択されるか、これらの配列に少なくとも85%の同一性を有する配列である;または、配列番号30、配列番号34、配列番号35、配列番号36および配列番号37からなる群から選択されるか、これらの配列に少なくとも85%の同一性を有する配列である、前記[14]に記載のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメント。
[18]
ヒト化抗体が、
(a)重鎖可変領域配列が、配列番号21、配列番号23、配列番号24および配列番号25からなる群から選択されるか、これらの配列に少なくとも85%の同一性を有する配列である;
あるいは、重鎖可変領域配列が、配列番号29、配列番号31、配列番号32および配列番号33からなる群から選択されるか、これらの配列に少なくとも85%の同一性を有する配列である、
重鎖可変領域、および/または
(b)軽鎖可変領域配列が、配列番号22、配列番号26、配列番号27および配列番号28からなる群から選択されるか、これらの配列に少なくとも85%の同一性を有する配列である;
あるいは、軽鎖可変領域配列が、配列番号30、配列番号34、配列番号35、配列番号36および配列番号37の配列からなる群から選択されるか、これらの配列に少なくとも85%の同一性を有する配列である、
軽鎖可変領域
を含む、前記[9]に記載のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメント。
[19]
抗体が、以下からなる群から選択される、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の組み合わせを含む、前記[9]に記載のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメント:
1)配列番号21の重鎖可変領域および配列番号22の軽鎖可変領域;
2)配列番号21の重鎖可変領域および配列番号26の軽鎖可変領域;
3)配列番号21の重鎖可変領域および配列番号27の軽鎖可変領域;
4)配列番号21の重鎖可変領域および配列番号28の軽鎖可変領域;
5)配列番号23の重鎖可変領域および配列番号22の軽鎖可変領域;
6)配列番号23の重鎖可変領域および配列番号26の軽鎖可変領域;
7)配列番号23の重鎖可変領域および配列番号27の軽鎖可変領域;
8)配列番号23の重鎖可変領域および配列番号28の軽鎖可変領域;
9)配列番号24の重鎖可変領域および配列番号22の軽鎖可変領域;
10)配列番号24の重鎖可変領域および配列番号26の軽鎖可変領域;
11)配列番号24の重鎖可変領域および配列番号27の軽鎖可変領域;
12)配列番号24の重鎖可変領域および配列番号28の軽鎖可変領域;
13)配列番号25の重鎖可変領域および配列番号22の軽鎖可変領域;
14)配列番号25の重鎖可変領域および配列番号26の軽鎖可変領域;
15)配列番号25の重鎖可変領域および配列番号27の軽鎖可変領域;
16)配列番号25の重鎖可変領域および配列番号28の軽鎖可変領域;
17)配列番号29の重鎖可変領域および配列番号30の軽鎖可変領域;
18)配列番号29の重鎖可変領域および配列番号34の軽鎖可変領域;
19)配列番号29の重鎖可変領域および配列番号35の軽鎖可変領域;
20)配列番号29の重鎖可変領域および配列番号36の軽鎖可変領域;
21)配列番号29の重鎖可変領域および配列番号37の軽鎖可変領域;
22)配列番号31の重鎖可変領域および配列番号30の軽鎖可変領域;
23)配列番号31の重鎖可変領域および配列番号34の軽鎖可変領域;
24)配列番号31の重鎖可変領域および配列番号35の軽鎖可変領域;
25)配列番号31の重鎖可変領域および配列番号36の軽鎖可変領域;
26)配列番号31の重鎖可変領域および配列番号37の軽鎖可変領域;
27)配列番号32の重鎖可変領域および配列番号30の軽鎖可変領域;
28)配列番号32の重鎖可変領域および配列番号34の軽鎖可変領域;
29)配列番号32の重鎖可変領域および配列番号35の軽鎖可変領域;
30)配列番号32の重鎖可変領域および配列番号36の軽鎖可変領域;
31)配列番号32の重鎖可変領域および配列番号37の軽鎖可変領域;
32)配列番号33の重鎖可変領域および配列番号30の軽鎖可変領域;
33)配列番号33の重鎖可変領域および配列番号34の軽鎖可変領域;
34)配列番号33の重鎖可変領域および配列番号35の軽鎖可変領域;
35)配列番号33の重鎖可変領域および配列番号36の軽鎖可変領域;および
36)配列番号33の重鎖可変領域および配列番号37の軽鎖可変領域。
[20]
キメラ抗体またはヒト化抗体の重鎖が、さらに、ヒトIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4に由来する重鎖定常領域を含み、好ましくはヒトIgG4またはその変異体に由来する重鎖定常領域を含み、最も好ましくは配列番号38に示す重鎖定常領域を含み;
キメラ抗体またはヒト化抗体の軽鎖が、さらに、ヒトκ鎖、ヒトλ鎖、またはその変異体に由来する軽鎖定常領域を含み、最も好ましくは配列番号39に示す軽鎖定常領域を含む、前記[7]~[15]のいずれか一項に記載のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメント。
[21]
前記[1]~[20]のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと、LAG-3との結合について競合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
[22]
治療上有効量の前記[1]~[21]のいずれか一項に記載のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメントと、1つ以上の医薬的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤とを含む、医薬組成物。
[23]
前記[1]~[21]のいずれか一項に記載のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする、単離核酸。
[24]
前記[23]に記載の核酸を含む発現ベクター。
[25]
前記[24]に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞であって、原核細胞および真核細胞からなる群から選択され、好ましくは真核細胞であり、より好ましくは哺乳類細胞である、宿主細胞。
[26]
LAG-3抗体またはその抗原結合フラグメントを調製する方法であって、前記[25]に記載の宿主細胞において抗体またはその抗原結合フラグメントを発現させること、および、該宿主細胞から抗体またはその抗原結合フラグメントを単離することを含む、方法。
[27]
対象において腫瘍細胞の成長を阻害する方法であって、治療上有効量の前記[1]~[21]のいずれか一項に記載のLAG-3抗体またはその抗原結合フラグメントを対象に投与し、または、前記[22]に記載の医薬組成物または前記[23]に記載の核酸を対象に投与し、それによって、対象における腫瘍の成長を阻害することを含む、方法。
[28]
病原性T細胞の関与に関連する疾病または症状の処置のための医薬の調製における、前記[1]~[21]のいずれか一項に記載のLAG-3抗体または抗原結合フラグメント、または前記[22]に記載の医薬組成物、または前記[23]に記載の核酸の使用であって、該疾病または症状が、好ましくは癌であり、癌が、卵巣癌、メラノーマ、前立腺癌、腸癌、胃癌、食道癌、乳癌、肺癌、腎臓癌、膵臓癌、子宮癌、肝臓癌、膀胱癌、子宮頸癌、口腔癌、脳癌、精巣癌、皮膚癌、甲状腺癌、および血液系悪性腫瘍(骨髄腫、並びに、慢性および急性白血病を含む)を含むがこれらに限定されない、使用。
【実施例
【0087】
実施例および試験
以下、実施例により、本発明をさらに説明する。しかしながら、本発明の範囲は、これに限定されるものではない。特定の条件が記載されていない本発明の実施例において、実験は、一般的に、Antibody Technology Laboratory Manual and Molecular Cloning Manual of Cold Spring Harborに記載されている従来の条件下で、または、材料もしくは製品の製造業者によって提案された条件下で行われる。試薬の供給源が特に示されていない場合、試薬は、市販されている従来の試薬である。
【0088】
実施例1.LAG-3抗原および抗体の調製
1.タンパク質設計および発現
UniProtのリンパ球活性化遺伝子3タンパク質(ヒトLAG-3、Uniprot:P18627)を、LAG-3の鋳型として用いて、該抗原および検出に用いられるタンパク質のアミノ酸配列を設計し、場合により、異なるラベルをLAG-3タンパク質に融合させ、その後、pHrベクター(自社製造)またはpTT5ベクター(Biovector、カタログ番号102762)またはpTargeTベクター(Promega、A1410)にクローニングした。本発明の抗原タンパク質および検出タンパク質を、293細胞において一過性に発現させ、または、CHO-Sにおいて安定的に発現させ、精製して得た。
【0089】
以下のLAG-3抗原は、特に記載されない場合、ヒトLAG-3を指す。
【0090】
【化1】
【0091】
【化2】
【0092】
【化3】
【0093】
【化4】
【0094】
2.LAG-3関連組換えタンパク質、並びに、ハイブリドーマ抗体および組換え抗体の精製
1.FLAGタグを有するLAG-3-Flag組換えタンパク質の精製ステップ
サンプルを高速で遠心分離して、不純物を除去し、適切な容量に濃縮した。その後、FLAG親和性カラムを0.5×PBSで平衡化して、2~5カラム容量で洗浄した。不純物を除去した後に、上清サンプルを、カラムに負荷した。A280の読み値がベースラインまで減少するまで、0.5×PBSでカラムを洗浄した。その後、カラムをPBSで洗浄して、不純物タンパク質を洗い流し、回収した。標的タンパク質を100mMグリシン、pH3.0で溶出して、インビトロでのさらなる活性化および精製のために、回収した。
【0095】
2.ハイブリドーマ抗体、組換え抗体およびFc融合タンパク質の精製ステップ
細胞発現上清を高速で遠心分離して、不純物を除去し、ハイブリドーマ発現上清を、プロテインGカラムにより精製し、組換え抗体およびFc融合タンパク質を、プロテインAカラムにより精製した。A280の読み値がベースラインまで減少するまで、0.5×PBSでカラムを洗浄したその後、標的タンパク質を、100mM酢酸(pH3.0)で溶出し、1MTris-HCl、pH8.0で中和した。溶出したサンプルを適切に濃縮し、PBSで平衡化したゲルクロマトグラフィーSuperdex200(GE)を用いてさらに精製し、ミスマッチピークを除き、正しいサンプルを分取して使用した。
【0096】
実施例2.抗ヒトLAG-3モノクローナル抗体の調製
1.免疫化
抗ヒトLAG-3モノクローナル抗体を、マウスを免疫化することにより生成した。実験用SJL白色マウス、雌、6週齢(Beijing Weitong Lihua Experimental Animal Technology Co., Ltd., 動物生産ラインセンス番号(animal production license number): SCXK (Beijing) 2012-0001)。飼育環境:SPFレベル。マウスを購入した後、12/12時間の明/暗サイクルで、20~25℃の温度で、40~60%の湿度で、マウスを実験室に1週間保管した。該環境に適応したマウスを、以下のスキームに従い免疫化した。免疫抗原は、FLAGタグを有するLAG-3の細胞外ドメインであった(配列番号1)。
【0097】
スキームA:TiterMax(登録商標)Gold Adjuvant(sigma Lot Num:T2684)およびThermo Imject(登録商標)Alum(Thremo Lot Num:77161)で、マウスを交差免疫化した。抗原とアジュバント(TiterMax(登録商標)Gold Adjuvant)の割合は1:1であり、かつ、抗原とアジュバント(Thermo Imject(登録商標)Alum)の割合は1:3であり、投与量は50μg/マウス(初回免疫化)および25μg/マウス(ブースター免疫化)であった。抗原を乳化させた後、マウスに、0、7、14、21、28、35、および42日目に接種した。0日目に、マウスに対し、いくつかの部位で、皮下に(s.c.)乳化抗原を50μg/マウスで注射した。7日目に、マウスに対し、腹腔内に(i.p.)25μg/マウスで注射した。14、28、35および42日目に、背面または腹腔内のいずれかへの抗原注射を、背面の塊(lump)および腹部の腫脹状態に従って選択した。21、35、49日目に、血液サンプルを回収し、マウス血清における抗体力価をELISAにより決定した。7回の免疫化の後、より高い抗体力価を有するマウス、およびそれらの血清中でプラットホームになる力価を有するマウスを、脾細胞融合のために選択し、生理食塩水で製剤化した抗原溶液を、50μg/マウスで、脾細胞融合の3日前に、腹腔内注射することにより、ブースター免疫化を実施した。
【0098】
スキームB:マウスを、QuickAntibody-Mouse5W(KX0210041)で免疫化した。抗原とアジュバントの割合は、1:1であり、25μg/マウス(初回免疫化/ブースター免疫化)であった。抗原とアジュバントを迅速に混合して、接種に使用した。マウスに、0、21、および35日目に接種した。0日目に、マウスに、後腓腹筋(posterior calf muscle)を介して(筋肉内注射で)25μg/マウスで抗原を注射し、21および35日目に、同じ方法の注射を、25μg/マウスで繰り返した(三回目の免疫化を実施したかどうかは、抗体力価による)。28日目および42日目に、血液サンプルを回収した。マウス血清における抗体力価を、ELISAにより決定した。より高い抗体力価を有するマウス、およびそれらの血清中でプラットホームになる力価を有するマウスを、脾細胞融合のために選択し、生理食塩水で製剤化した抗原溶液を、50μg/マウスで、脾細胞融合の3日前に、腹腔内注射することにより、ブースター免疫化を実施した。
【0099】
2.脾細胞融合
最適化されたPEG媒介融合手順を用いて、脾臓リンパ球を骨髄腫Sp2/0細胞(ATCC(登録商標)CRL-8287TM)と融合させることによって、ハイブリドーマ細胞を得た。得られたハイブリドーマ細胞を、0.5~1×10/mlの密度で、完全培地(20%FBS、1×HATおよび1×OPIを含有するDMEM培地)に再懸濁し、100μ/ウェルで、96ウェル細胞培養物プレートにてインキュベートした。37℃、5%COで3~4日間インキュベートした後、100μl/ウェルのHAT完全培地を補充し、培養を3~4日間続けて針状クローンを形成した。上清を除去して、200μl/ウェルのHT完全培地(20%FBS、1×HAT、1×OPIを含有するRPMI-1640培地)を添加して、5%CO、37°Cで3日間培養した後に、ELISAアッセイで検出した。
【0100】
3.ハイブリドーマ細胞のスクリーニング
ハイブリドーマ培養上清を、ハイブリドーマ細胞の増殖密度に従い、結合ELISA(試験例1参照)によって、検出した。また、ELISAの陽性ウェルを用いて、細胞遮断実験を行った(試験例3参照)。結合および遮断実験の両方について陽性であった細胞を増殖させ、適時に凍結保存し、細胞を単細胞クローンが得られるまで2~3回サブクローニングした。
【0101】
各サブクローニング手順の後、細胞を、LAG-3結合ELISAおよび細胞遮断アッセイに供した(試験例1および試験例3を参照)。上記のスクリーニング実験によりハイブリドーマクローンを得、無血清細胞培養法でさらに抗体を調製し、抗体を試験例に用いられる精製例に従い精製した。
【0102】
4.陽性ハイブリドーマクローンのシーケンシング
陽性ハイブリドーマから配列をクローニングするプロセスは、以下の通りであった:対数増殖期のハイブリドーマ細胞を回収し、キットの指示書に従いTrizol(Invitrogen、カタログ番号15596-018)でRNAを抽出し、その後PrimeScript(商標)Reverse Transcriptaseキット(Takara、カタログ番号 2680A)で逆転写を実施した。逆転写により得られたcDNAを、マウスIg-Primer Set(Novagen、TB326 Rev.B 0503)を用いてPCRにより増幅し、シーケンシングを、シーケンシング会社で実施した。ハイブリドーマクローンmAb229およびmAb303のDNA配列に対応する、重鎖および軽鎖アミノ酸配列を、配列番号5、6および配列番号7、8にそれぞれ示す。
【0103】
【化5】


【表1】
【0104】
得られた陽性クローンを、ヒトLAG-3への結合のELISAアッセイ(試験例1、タンパク質結合活性についてのEC50値の結果は表2に示す)、ヒトLAG-3過剰発現CHO-s細胞への結合のELISAアッセイ(試験例2、細胞結合活性についてのEC50値の結果は表2に示す)、Daudi細胞へのLAG-3抗原の結合を遮断するアッセイ(試験例3、遮断活性についてのEC50値の結果は表2に示す)、および、ヒトLAG-3タンパク質との親和性についてのアッセイ(試験例4参照、結果は表3に示す)に供した。
【表2】

【表3】
【0105】
表2に示す結果は、LAG-3抗体mAb229およびmAb303が共に、ヒトLAG-3タンパク質に対して、優れた結合活性を示したこと、および、ヒトLAG-3タンパク質全長を過剰発現するCHO-S細胞に対しても、優れた結合活性を示したことを立証している。LAG-3抗体mAb229およびmAb303は共に、ヒトLAG-3抗体の、Daudi細胞との結合を、有意に遮断した。
【0106】
表3に示す結果は、本発明のLAG-3抗体mAb229およびmAb303が、ヒトLAG-3タンパク質により強い結合活性および親和性を示したことを立証している。
【0107】
実施例3.マウス抗ヒトLAG-3ハイブリドーマモノクローナル抗体mAb229のヒト化
IMGTヒト抗体重鎖および軽鎖可変領域遺伝子データベースと、MOEソフトウェアとにおける比較を介して、mAb229と高い相同性を有する重鎖および軽鎖可変領域生殖系列遺伝子を鋳型として選択し、マウス抗体に由来するCDRを、対応するヒト起源の鋳型に移植して、FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4の順序で可変領域配列を形成した。ここで、アミノ酸残基は、Kabat番号付けシステムに従い、特定および注釈付けした。
【0108】
1.ハイブリドーマクローンmAb229をヒト化するための、フレームワークの選択
マウス抗体mAb229をヒト化するための軽鎖鋳型は、IGKV1-39*01およびhjk4.1であり、ヒト化するための重鎖鋳型は、IGHV7-4-1*01およびhjh6.1であり、ヒト化可変領域の配列は、以下の通りである。
【化6】
【0109】
2.ハイブリドーマクローンmAb229のための鋳型選択および逆突然変異設計、以下の表4参照:
【表4】

【表5】

【化7】
【0110】
実施例4.マウス抗ヒトLAG-3ハイブリドーマモノクローナル抗体mAb303のヒト化
IMGTヒト抗体重鎖および軽鎖可変領域遺伝子データベースと、MOEソフトウェアとにおける比較を介して、mAb303と高い相同性を有する重鎖および軽鎖可変領域生殖系列遺伝子を鋳型として選択し、マウス抗体に由来するCDRを、対応するヒト起源の鋳型に移植して、FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4の順序で可変領域配列を形成した。ここで、アミノ酸残基は、Kabat番号付けシステムに従い、特定および注釈付けした。
【0111】
1.ハイブリドーマクローンmAb303をヒト化するためのフレームワークの選択
マウス抗体mAb303をヒト化するための軽鎖鋳型は、IGKV1-39*01およびhjk4.1であり、ヒト化するための重鎖鋳型は、IGHV1-3*01およびhjh6.1であり、ヒト化可変領域の配列は、以下のとおりである:
【化8】
【0112】
2.ハイブリドーマクローンmAb303の鋳型選択および逆突然変異、以下の表6参照
【表6】
【0113】
異なる変異の配列組み合わせは、以下の通りである:
【表7】
【0114】
ヒト化抗体mAb303の配列は以下の通りである:
【化9】
【0115】
実施例5.組換えおよびヒト化抗体の調製
抗体を、ヒト重鎖IgG4/軽鎖κ由来の定常領域を、各可変領域と組み合わせて構築し、IgG4抗体の安定性を高めるために、FcにおいてS228P変異を作製した。当業界で知られる他の変異もまた、抗体の性能を高めるために用いることができる。
【化10】
【0116】
1.組換え抗体の分子クローニング
可変領域コード配列を、ハイブリドーマスクリーニングから得られる陽性抗体分子をシーケンシングすることによって得た。得られた配列に従いプライマーを設計し、シーケンシング遺伝子を鋳型として用いて、様々な抗体VH/VK遺伝子フラグメントをPCRで構築し、その後、発現ベクターpHr(シグナルペプチドおよびhIgG4/hkappa定常領域(CH1-FC/CL)フラグメントを有する)で再構成して、全長組換え抗体についての発現プラスミドVH-CH1-FC-pHr/VL-CL-pHrを構築した。
【0117】
2.ヒト化抗体の分子クローニング
設計したヒト化抗体配列をコドン最適化に供して、ヒトコドン優先性を有するコード配列を作製した。プライマーを設計し、該抗体の様々なVH/VK遺伝子フラグメントをPCRにより構築して、発現ベクターpHr(シグナルペプチドおよびhIgG4/hkappa定常領域(CH1-FC/CL)フラグメントを有する)で再構成し、全長ヒト化抗体についての発現プラスミドVH-CH1-FC-pHr/VL-CL-pHrを構築した。
【0118】
3.組換えおよびヒト化抗体の発現および精製
抗体軽鎖および重鎖を別々に発現するためのプラスミドを、1:1.2の割合で、HEK293E細胞にトランスフェクトした。6日後に発現上清を回収し、不純物を高速遠心分離で除去して、その後プロテインAカラムで精製した。カラムを、A280の読み値がベースラインまで減少するまで、PBSで洗浄した。標的タンパク質を、酸性溶出バッファー、pH3.0~pH3.5で溶出し、1M Tris-HCl、pH8.0-9.0で中和した。溶出液を適切に濃縮し、PBSで平衡化したゲルクロマトグラフィーSuperdex200(GE)を用いてさらに精製した。ミスマッチピークを除き、溶出ピークを回収した。その後、正しいサンプルを分取して使用した。
【0119】
本発明の抗体の性能および利点は、以下の生化学的試験方法によって確認される。
【0120】
試験例1.LAG-3抗体の、ヒトLAG-3タンパク質への結合についてのELISAアッセイ
抗LAG-3抗体の、ヒトLAG-3タンパク質への結合能を、ELISAアッセイで検出した。FcまたはmFcタグを有するLAG-3融合タンパク質を、マイクロタイター中の抗FcまたはmFc抗体に結合させることにより、96ウェルマイクロタイタープレートに固定化し、抗体の負荷後のシグナルの強さを用いて、抗体のLAG-3への結合活性を決定した。具体的な実験方法は以下の通りである。
【0121】
ヤギ抗ヒトFc抗体(Jackson Immuno Research、 カタログ番号109-005-008)またはヤギ抗マウスFc抗体(Sigma、カタログ番号M3534-1ML)を、pH7.4のPBSバッファーで、2μg/mlの濃度に希釈して、50μl/ウェルの容量で96ウェルプレートに添加し、その後、プレートを37℃で2時間、インキュベーターでインキュベートした。液体を捨てた後、プレートを、PBS中の5%スキムミルク(Guangmingスキムミルク)を含有する200μl/ウェルの遮断溶液で遮断し、37℃で2.5時間、または、4℃で一晩(16~18時間)、インキュベーターでインキュベートした。遮断した後、遮断溶液を捨て、プレートを、PBSTバッファー(0.05%のtweeen-20を含有する、PH7.4のPBS)で5回洗浄した。LAG-3-Fc融合タンパク質(配列番号3、自社製造)またはLAG-3-mFc融合タンパク質(配列番号4、自社製造)を、サンプル希釈液(1%BSAを含有するPH7.4のPBS)で1μg/mlまで希釈して、各ウェルに50μl/ウェルで添加した。その後、プレートを37℃で1時間、または4℃で一晩、インキュベーターでインキュベートした。インキュベーション後、プレート中の反応液を捨て、プレートをPBSTで6回洗浄し、その後、サンプル希釈液で希釈した様々な濃度の試験抗体(ハイブリドーマ精製抗体またはヒト化抗体)を50μl添加して、プレートを37℃で1時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートをPBSTで5回洗浄し、100μl/ウェルの、サンプル希釈液で希釈した、HRPで標識したヤギ抗マウス二次抗体(Jackson Immuno Research、カタログ番号115-035-003)またはヤギ抗ヒト二次抗体(Jackson Immuno Research、カタログ番号109-035-003)を添加し、プレートを37℃で1時間インキュベートした。プレートをPBSTで6回洗浄後、50μl/ウェルのTMB発色基質(Jackson Immuno Research、カタログ番号109-035-003)を各ウェルに添加し、室温で5~15分間インキュベートし、各ウェルに、50μl/ウェルの1M HSOを添加することにより、反応を停止させた。450nmの波長でのOD値をNOVOStarマイクロプレートリーダーで読み取った後、LAG-3抗体のヒトLAG-3への結合のEC50値を計算した。結果を表8に示す。本データは、本発明のスクリーニング方法で得られた全てのヒト化抗体が、ヒトLAG-3タンパク質に優れた結合活性を示すことを示した。
【表8】
【0122】
試験例2.LAG-3抗体の、ヒトLAG-3を過剰発現するCHO-s細胞との結合アッセイ
抗LAG-3抗体の、LAG-3タンパク質を過剰発現するCHO-S細胞への結合能を、結合アッセイにより検出した。全長LAG-3プラスミド(自社製造、配列番号2)を、エレクトロポレーションでCHO-S細胞にトランスフェクトし、LAG-3の発現レベルを、電圧をかけた後の(post-pressure)スクリーニングの2週間後に検出した。LAG-3を過剰発現する細胞を、96ウェルプレートの底に固定し、抗体の添加後のシグナルの強さを用いて、抗体のヒトLAG-3を過剰発現するCHO-s細胞への結合能を決定した。具体的な実験方法は以下の通りである。
【0123】
100μl/ウェルの細胞を、96ウェルプレートに、4×10/mlの密度で播種し、一晩インキュベートした。上清を捨て、プレートをPBSで3回洗浄し、4%PFAを100μl/ウェルで添加して室温で30分間固定し、その後プレートをPBSで3回洗浄した。液体を捨てた後、プレートを、PBSで希釈した5%スキムミルク(Guangmingスキムミルク)を含有する200μl/ウェルの遮断溶液で遮断し、37℃で2.5時間インキュベートした。遮断した後、遮断溶液を捨て、プレートを、PBSTバッファー(0.05%のtweeen-20を含有する、PH7.4のPBS)で5回洗浄し、サンプル希釈液で希釈した異なる濃度の試験抗体(ハイブリドーマ精製抗体またはヒト化抗体)を50μ/ウェルで添加し、その後37℃で1時間、インキュベーターでインキュベートした。インキュベーション後、プレートをPBSTで5回洗浄し、100μl/ウェルの、サンプル希釈液で希釈した、HRPで標識した、ヤギ抗マウス二次抗体(Jackson Immuno Research、カタログ番号115-035-003)またはヤギ抗ヒト二次抗体(Jackson Immuno Research、カタログ番号109-035-003)を添加し、プレートを37℃で1時間インキュベートした。プレートをPBSTで6回洗浄した後、50μlのTMB発色基質(KPL、カタログ番号52-00-03)を各ウェルに添加し、室温で5~15分間インキュベートし、各ウェルに50μlの1M HSOを添加することにより、反応を停止させた。450nmの波長でのOD値をNOVOStarマイクロプレートリーダーで読み取った後、LAG-3抗体のLAG-3を過剰発現するCHO細胞への結合のEC50値を計算した。
【0124】
試験例3.LAG-3抗原のDaudi細胞への結合の遮断における、抗LAG-3抗体についてのアッセイ
Daudi細胞(ヒト白血病細胞、Chinese Academy of Sciences細胞バンクから購入)を96ウェルプレートに3×10/ウェルの密度で播種した。1000rpmでの遠心分離の後、上清を捨て、プレートに4%PFAを添加して室温で30分間固定した。固定溶液を捨てた後、プレートをPBSで4回洗浄し、プレートを、PBSで希釈した5%スキムミルク(Guangmingスキムミルク)を含有する200μl/ウェルの遮断溶液で遮断し、37℃で2.5時間インキュベートした。遮断後、遮断溶液を捨て、プレートをPBSTバッファー(0.05%のtweeen-20を含有する、PH7.4のPBS)で5回洗浄し、ビオチン標識LAG-3-Fc融合タンパク質(自社製造、配列番号3)の混合物を50μl/ウェルで添加し、最終濃度が0.4μg/mlとなるように希釈液(1%BSAを含有するPH7.4のPBS)で希釈し(ここで、ビオチン(Biotin labeling kit、 Dojindo Chemical、カタログ番号LK03)は予め1時間混合されている)、試験すべき抗体をグラジエント濃度で添加した後、プレートを37℃で1時間インキュベートした。インキュベーション後に、反応液を捨て、プレートをPBSTで5回洗浄し、サンプル希釈液で希釈されたHRP標識ストレプトアビジン(Sigma、カタログ番号S2438)を50μl/ウェルで添加し、プレートを37℃で1時間インキュベートした。プレートをPBSTで5回洗浄した後、50μl/ウェルのTMB発色基質(KPL、カタログ番号52-00-03)を各ウェルに添加して、室温で5~15分間インキュベートし、各ウェルに50μlの1M HSOを添加することにより反応を停止させた。450nmの波長でのOD値をNOVOStarマイクロプレートリーダーで読み取った後、抗原のDaudi細胞への結合の遮断におけるLAG-3抗体の活性を計算した。結果を表9に示す。本データは、本発明のスクリーニング方法により得られた全てのヒト化抗体が、ヒトLAG-3抗体のDaudi細胞への結合を有意に阻害したことを示すものである。
【表9】
【0125】
試験例4.LAG-3抗体の親和性についてのBIAcoreアッセイ
1.マウス抗捕捉抗体を、マウス抗捕捉キット(カタログ番号BR-1008-38、GE)に記載の方法に従って、CM5バイオチップ(カタログ番号BR-1000-12、GE)と共有結合させ、試験抗体が親和性を介して捕捉されるようにした。その後、LAG-3-Flag抗原(自社製造、配列番号1)を、バイオチップ表面に流し、Biacore装置を用いてリアルタイムで反応シグナルを検出して結合・解離曲線を得、親和性の値をフィッティングにより得た(上記の表2参照)。実験において各解離サイクルが終了した後に、バイオチップを洗浄して、マウス抗捕捉キットが提供する再生溶液で再生した。本結果は、LAG-3抗体mAb229およびmAb303が、ヒトLAG-3タンパク質への優れた結合活性および親和性を示したことを立証するものである。
【0126】
2.ヒト抗捕捉抗体を、ヒト抗捕捉キット(カタログ番号BR-1008-39、GE)に記載の方法に従って、CM5バイオチップ(カタログ番号BR-1000-12、GE)と共有結合させ、試験抗体が親和性を介して捕捉されるようにした。その後、LAG-3-Flag抗原(自社製造、配列番号1)を、バイオチップ表面に流し、Biacore装置を用いてリアルタイムで反応シグナルを検出して結合・解離曲線を得、親和性の値をフィッティングにより得た(下記の表10参照)。実験において各解離サイクルが終了した後に、バイオチップを洗浄して、ヒト抗捕捉キットが提供する再生溶液で再生した。本結果は、本発明のスクリーニング方法で得られた抗体が、ヒトLAG-3タンパク質に優れた結合活性および親和性を示したことを立証するものである。
【表10】
【0127】
試験例5.PBMC-Tリンパ球の活性化
Tリンパ球の活性化に対するLAG-3抗体の効果を研究するために、ヒト末梢血単核球(PBMC)を回収し、精製した。IL-2サイトカインの分泌レベルを、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)エンテロトキシンB(SEB)のスーパー抗原により、インビトロで72時間刺激した後に、測定した。実験プロセスを簡単に以下に記載する。
【0128】
新たに単離および精製されたPMBCを、96ウェル細胞培養プレートに、約1×10/ウェルの細胞密度で播種し、100ng/mlのSEBスーパー抗原刺激を加え、グラジエントに希釈した抗体サンプル(培地で希釈)またはブランクコントロールとしての培地を同時に添加した。その後、プレートを、37℃、5%COで72時間インキュベートし、細胞培養物上清を回収した。培養上清中の分泌されたIL-2のレベルを、ELISA(BD、カタログ番号550611)で測定した。詳細な手順は、製造元のマニュアルに示されている。結果は図1に示した。ヒト化LAG-3抗体Hu229-013およびHu303-005はいずれも、活性化されたTリンパ球によって分泌されるサイトカインIL-2のレベルを異なる程度に高めることができ、薬物濃度についての投与量依存効果を有する。
【0129】
試験例6.皮下接種したU-87MG腫瘍のLAG-3抗体による抑制
本研究では、U-87MG腫瘍を有するマウスの腫瘍体積に対する、ヒト化抗LAG-3抗体の効果を測定した。
【0130】
100μlのヒトグリオーマU87 MG細胞(3.5×10細胞)を、NOD-SCIDマウス(Changzhou Cavion Experimental Animal Co.,Ltd.より購入)の右肋骨に皮下接種した。10~14日後に、腫瘍が40mmまで成長した際に、マウスを、体重または腫瘍体積が大きすぎるものと、小さすぎるものを除いて、ランダムに3つのグループに分けた:アイソタイプが一致したhIgGのためのコントロールグループ、LAG-3候補抗体Hu229-013のためのグループ、およびLAG-3候補抗体Hu303-005のためのグループであり、腫瘍体積に従っており(グループ分けおよび投与量は表1参照)、各グループ8匹のマウス(D0)である。CD3抗体により刺激したPBMCを、5×10細胞/60μlで腫瘍組織に注射し、試験抗体の注射は、腹腔内注射により開始し、週に3回、計6回実施した。マウスは、週に2回、腫瘍体積を測定し、データを記録した。
腫瘍体積(V)は以下の通り計算した:
腫瘍体積(TV)=1/2×a×b
aおよびbはそれぞれ、長さと幅を表す。
【0131】
各グループの腫瘍体積を、平均±標準誤差(Mean±SEM)として表し、Graphpad Prism 5ソフトウェアでプロットして、二元配置ANOVA統計解析で解析し、腫瘍抑制率を以下の式に従い計算した:
腫瘍増殖率(T/C%)=(T-T/C-C)×100%
腫瘍抑制率%TGI=1-T/C%
【0132】
結果を表11および図2に示しており、投与の14日後に、LAG-3抗体Hu229-013 6mpkおよびHu303-005 6mpkはいずれも一定の抗腫瘍効果を有し、腫瘍抑制率はそれぞれ、27.25%(p<0.05)、34.94%(p<0.01)であることを示した。コントロールグループと比較して有意な違いがあった(hIGgに対してp<0.001)。
【表11】
【0133】
試験例7.マウスにおける、ヒト化抗LAG-3抗体Hu229-013およびHu303-005の薬物動態(PK)アッセイ
18匹のICRマウス(体重18~22gの雄)を、West Poole-Bikai Experimental Animal Co.,Ltdから購入した。給餌期間中、マウスに水および食餌を自由に与え、実験室環境での適応期間は3日以上で、12/12時間の明/暗サイクル調節、16~26℃の温度、40~70%の相対湿度であった。実験開始3日前に、ICRマウスに番号付けを行い、別々のグループ(各グループ3匹)にランダムに分けた。実験当日に、2つのマウスのグループに、ヒト化候補抗体(Hu229-013)を、それぞれ3mg/kgおよび10mg/kgの投与量で、静脈内に注射した;他の2つのマウスのグループに、ヒト化候補抗体(Hu303-005)を、それぞれ3mg/kgおよび10mg/kgの投与量で、静脈内に注射した。静脈内注射の容量は、20ml/kgである。
【0134】
血液サンプルを、投与後15分、8時間、1日、2日、7日、10日、14日、21日、28日および35日の時点で回収した。毎回約0.1mlの全血を、抗凝血剤を含まない遠心管に採取し、4℃で30分間静置した後、1000gで15分間遠心分離した。その後、上清をEPその後、上清をピペットでEPチューブに入れ、-80℃で保存した。
【0135】
血清中の薬剤の濃度をELISAで測定して、T1/2および他の主なパラメーターをWinnolinソフトウェアで計算した。主な薬物動態パラメーターは表12に示す。
【表12】
【0136】
マウスにおけるヒト化LAG-3抗体Hu229-013およびHu303-005のAUCは類似しており、3および10mg/kgの投与量におけるこれら2つの抗体のAUCおよびピーク濃度は、投与量の増加と直線的に相関し、線形の薬物動態特性を示した。
【0137】
試験例8.抗体の物理的安定性
本試験例を用いて、ヒト化抗LAG-3抗体Hu229-013およびHu303-005の物理的安定性を検出した。
【0138】
異なる抗体の熱安定性をDSC(示差走査熱量測定)により検出して、異なる緩衝系および異なるpH条件における抗体の安定性を比較した。異なるpH値に対応する緩衝系は、例えば、PBS(pH7.4)、10mM His/135mM NaCl(pH6.0)、10mM酢酸/135mM NaCl(pH5.2)である。
【0139】
各サンプルを、対応するバッファーに溶解し、サンプルの濃度を約1mg/mlに調節し、MicroCal VP-Capillary DSC(Malvern)を用いて検出した。試験の前に、各サンプルおよびブランクバッファーを、真空脱気装置で1~2分脱気した。400μlのサンプルまたはブランクバッファーを、各ウェルに添加した(負荷量は300μl)。最後に、ウェルの2つのペアに、14%のDecon90およびddHOそれぞれ添加して、洗浄した。プレートにサンプルを負荷した後、プレートをプラスチックカバーでシールした。スキャンは、温度25℃で開始して100℃まで行い、スキャン速度は60℃/hである。結果は表13に示しており、抗体Hu229-013およびHu303-005の両方が、いくつかの試験系において優れた熱安定性を示したことを示している。
【表13】
【0140】
サンプルの純度を、SEC-HPLCでモニターし、特定の条件下での周期的安定性を調べた。例示的な条件は、例えば、サンプルの濃度を約50mg/mlに調節し、PBS(pH7.4)系にて、-80℃で5回繰り返し凍結融解し、4℃および40℃で1ヵ月間保管した、異なる抗体の安定性を比較することである。Xbridge protein BEH SEC 200A(Waters)HPLCカラムを用いて、検出した。結果を表14に示しており、いずれの抗体もより高い安定性を示したことを示している。
【表14】
【0141】
試験例9.抗体の化学的安定性
脱アミドは、後の段階での安定性に影響を及ぼすことがある、抗体の一般的な化学的修飾であり、特に、CDR領域でのアミノ酸残基の高レベルの脱アミド修飾を避けるか、または変異を減らそうとするのが一般的に望ましい。500μgの試験抗体を、500μlのpH4.0のPBSに溶解した後、40℃のウォーターバスに置いた。酵素的アッセイのために、サンプルを0、3、6日目に採取した。異なる時点で採取した各サンプル100μgを、100μlの0.2M His-HCl、8M Gμa-HCl溶液、pH6.0に溶解し、0.1g/mlのDTT3μlを添加した後に、サンプルを1時間、50℃のウォーターバスに置いた。0.02M His-HCl、pH6.0で2回限外濾過した後、3μlの0.25mg/mLトリプシンを、37℃で一晩、酵素分解するために添加した。脱アミド修飾をLC-MS(Agilent 6530 Q-TOF)を用いて調べ、その結果を表15に示す。
【表15】
【0142】
マススペクトロメトリーの結果によると、検出した抗体では、明らかに高い、脱アミド修飾部位の割合は見られず、抗体の化学的安定性が後の段階において良好であることが示唆された。
図1
図2
【配列表】
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