知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2021-12-24
(45)【発行日】2022-02-10
(54)【発明の名称】ニドゲン－１フラグメントアッセイ
(51)【国際特許分類】
G01N 33/574 20060101AFI20220203BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20220203BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20220203BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20220203BHJP
G01N 33/536 20060101ALI20220203BHJP
C07K 14/78 20060101ALN20220203BHJP
【ＦＩ】
G01N33/574 A
G01N33/50 Z
G01N33/15 Z
G01N33/53 U
G01N33/536 C
G01N33/536 B
C07K14/78 ZNA
【請求項の数】
13
(21)【出願番号】P 2019514319
(86)(22)【出願日】2017-09-13
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2019-10-17
(86)【国際出願番号】 EP2017072973
(87)【国際公開番号】W WO2018050671
(87)【国際公開日】2018-03-22
【審査請求日】2020-09-09
(31)【優先権主張番号】1615746.3
(32)【優先日】2016-09-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(73)【特許権者】
【識別番号】503259129
【氏名又は名称】ノルディック・ビオサイエンス・エー／エス
【氏名又は名称原語表記】ＮＯＲＤＩＣ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ Ａ／Ｓ
(74)【代理人】
【識別番号】100099623
【弁理士】
【氏名又は名称】奥山 尚一
(74)【代理人】
【識別番号】100107319
【弁理士】
【氏名又は名称】松島 鉄男
(74)【代理人】
【識別番号】100125380
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 綾子
(74)【代理人】
【識別番号】100142996
【弁理士】
【氏名又は名称】森本 聡二
(74)【代理人】
【識別番号】100166268
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 祐
(74)【代理人】
【識別番号】100170379
【弁理士】
【氏名又は名称】徳本 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100180231
【弁理士】
【氏名又は名称】水島 亜希子
(74)【代理人】
【識別番号】100096769
【弁理士】
【氏名又は名称】有原 幸一
(72)【発明者】
【氏名】ヴィロムセン，ニコラス
(72)【発明者】
【氏名】ベーヤ，セシリエ・リーヴ
(72)【発明者】
【氏名】バイ・イェンセン，アネ‐セシリエ
(72)【発明者】
【氏名】キレス‐アルバレス，アントニオ
(72)【発明者】
【氏名】カースダル，モルテン
(72)【発明者】
【氏名】ウアスネス‐レーミング，ディエーナ
(72)【発明者】
【氏名】マノン‐イェンセン，ティーナ
【審査官】海野 佳子
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１４－５２１０９８（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１０／０２６７５７４（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１２／０２７０２５４（ＵＳ，Ａ１）
【文献】Lin Li et al，Nidogen-1: a candidate biomarker for ovarian serous cancer，Japanese Journal of Clinical Oncology，2014年11月06日，Volume 45, Issue 2，176-182
【文献】Sage J et al，Cleavage of Nidogen-1 by Cathepsin S Impairs Its Binding to Basement Membrane Partners，PLoS ONE，2012年08月28日，7(8):，e43494
【文献】Kalluri, R，Basement membranes: structure, assembly and role in tumour angiogenesis，Nature Reviews Cancer，2003年06月01日，3，422-433
【文献】Loser Reik, Pietzsch Jens，Cysteine cathepsins: their role in tumor progression and recent trends in the development of imaging probes，Frontiers in Chemistry，2015年06月23日，3，37
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ３３／４８－３３／９８
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
がんを診断または定量化するためのデータを提供するための方法であって、患者の生体液試料を得るステップと、
前記前記試料中に天然に存在する、カテプシン－Ｓによるニドゲン－１の切断によって形成されるＮ末端またはＣ末端ネオエピトープを有するニドゲン－１のフラグメントを測定するイムノアッセイを実施するステップと、
前記患者における前記測定値の、正常レベルを超える上昇をがんの存在または程度と関連させるステップと
を含み、ここで、前記イムノアッセイが、
前記試料中に天然に存在する前記Ｎ末端またはＣ末端ネオエピトープを有するニドゲン－１の前記フラグメントを、前記Ｎ末端またはＣ末端ネオエピトープと特異的に反応するが未切断のニドゲン１とは反応しない免疫学的結合パートナーと接触させるステップと、 前記試料中の前記ネオエピトープを含むフラグメントを測定するために、前記Ｎ末端またはＣ末端ネオエピトープと前記免疫学的結合パートナーとの結合の程度を測定するステップと
を含む方法によって実施される、方法。
【請求項2】
前記がんが、乳がんまたは非小細胞肺がんである、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記免疫学的結合パートナーが、…ＣＱＨＥＲＥ（配列番号１）
…ＹＳＬＬＰＬ（配列番号２）
…ＩＩＲＱＤＬ（配列番号３）
からなる群から選択されるＣ末端ネオエピトープと特異的に反応し、または
ＡＰＶＧＧＩ…（配列番号４）
ＨＩＬＧＡＡ…（配列番号５）
ＧＳＰＥＧＩ…（配列番号６）
からなる群から選択されるＮ末端ネオエピトープと特異的に反応する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記免疫学的結合パートナーが、Ｃ末端ネオエピトープＶＥＫＴＲＣＱＨＥＲＥ－ＣＯＯＨ（配列番号７）と特異的に反応する、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
前記免疫学的結合パートナーが、短縮されたＣ末端配列ＶＥＫＴＲＣＱＨＥＲ－ＣＯＯＨ（配列番号８）と反応せず、かつ／または、前記免疫学的結合パートナーが、伸長されたＣ末端配列ＶＥＫＴＲＣＱＨＥＲＥＨ－ＣＯＯＨ（配列番号９）と反応しない、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記免疫学的結合パートナーが、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
抗がん薬の効能を評価するためのデータを提供するための方法であって、少なくとも２つの生物学的試料について、カテプシン－Ｓによるニドゲン－１の切断によって形成されるＮ末端またはＣ末端ネオエピトープを有するニドゲン－１のフラグメントの量を定量化するイムノアッセイを実施するステップを含み、ここで、前記生物学的試料が、対象への前記抗がん薬の投与期間中の第１の時点および後続する少なくとも１つの時点において前記対象から得られたものであり、前記抗がん薬の前記投与期間中の前記第１の時点から前記後続する少なくとも１つの時点にかけての、カテプシン－Ｓによるニドゲン－１の切断によって形成されるＮ末端またはＣ末端ネオエピトープを有するニドゲン－１の前記フラグメントの量の減少が、効果的な抗がん薬であることを示しており、
前記イムノアッセイが、前記試料中に天然に存在する前記Ｎ末端またはＣ末端ネオエピトープを有するニドゲン－１の前記フラグメントを、前記Ｎ末端またはＣ末端ネオエピトープと特異的に反応するが未切断のニドゲン１とは反応しない免疫学的結合パートナーと接触させるステップと、前記試料中の前記ネオエピトープを含むフラグメントを測定するために、前記Ｎ末端またはＣ末端ネオエピトープと前記免疫学的結合パートナーとの結合程度を測定するステップとを含む方法によって実施される、方法。
【請求項8】
前記免疫学的結合パートナーが、…ＣＱＨＥＲＥ（配列番号１）
…ＹＳＬＬＰＬ（配列番号２）
…ＩＩＲＱＤＬ（配列番号３）
からなる群から選択されるＣ末端ネオエピトープと特異的に反応し、または
ＡＰＶＧＧＩ…（配列番号４）
ＨＩＬＧＡＡ…（配列番号５）
ＧＳＰＥＧＩ…（配列番号６）
からなる群から選択されるＮ末端ネオエピトープと特異的に反応する、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記免疫学的結合パートナーが、Ｃ末端ネオエピトープＶＥＫＴＲＣＱＨＥＲＥ－ＣＯＯＨ（配列番号７）と特異的に反応する、請求項７または８に記載の方法。
【請求項10】
前記免疫学的結合パートナーが、短縮されたＣ末端配列ＶＥＫＴＲＣＱＨＥＲ－ＣＯＯＨ（配列番号８）と反応せず、かつ／または、前記免疫学的結合パートナーが、伸長されたＣ末端配列ＶＥＫＴＲＣＱＨＥＲＥＨ－ＣＯＯＨ（配列番号９）と反応しない、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記免疫学的結合パートナーが、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である、請求項７～１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法において使用するための診断キットであって、カテプシン－Ｓによるニドゲン－１の切断によって形成されるＮ末端またはＣ末端ネオエピトープと特異的に反応するが未切断のニドゲン１とは反応しない免疫学的結合パートナーと、以下：－ ストレプトアビジン被覆９６ウェルプレート
－ 任意選択的にリンカーがビオチン残基とペプチドとの間に位置している、前記Ｎ末端またはＣ末端ネオエピトープのアミノ酸配列に対応するビオチン化ペプチド
－ サンドイッチイムノアッセイで使用されるビオチン化二次抗体
－ 前記Ｎ末端またはＣ末端ネオエピトープのアミノ酸配列に対応する較正ペプチド
－ 抗体ＨＲＰ標識キット
－ 抗体放射能標識キット
－ アッセイ視覚化キット
の少なくとも１つと
を含む、診断キット。
【請求項13】
ビオチン化ペプチドであるビオチン－Ｌ－ＶＥＫＴＲＣＱＨＥＲＥ－ＣＯＯＨ（配列番号１０）（式中、Ｌは任意選択のリンカーである）、および、Ｃ末端配列ＶＥＫＴＲＣＱＨＥＲＥ－ＣＯＯＨ（配列番号１１）を含む較正ペプチドを含む、請求項１２に記載の診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、カテプシン－Ｓによるニドゲン－１の切断によって形成されるＮ末端またはＣ末端ネオエピトープを有するニドゲン－１のフラグメントを測定するアッセイ、ならびにがんの診断および抗がん薬の評価のための前記アッセイの使用に関する。
【背景技術】
【0002】
腫瘍微小環境の主成分は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）である。健常な組織恒常性の崩壊およびＥＣＭの代謝回転の変化は、疾患の進行をもたらすかもしれないがんの特徴である（１）。基底膜（ＢＭ）は、上皮細胞、内皮細胞および間葉細胞を裏打ちし、かつそれらを包囲する特殊なＥＣＭ層であり、組織構造および細胞極性化の維持や、胚の発生に必須である（２）。ＢＭはまた、細胞浸潤およびＢＭの破損に対する障壁としても働き、ＢＭの完全性の喪失は、がんにおける浸潤性表現型に関連している（３）。
【0003】
ニドゲンは、ほぼすべてのＢＭに見られる高度に保存されたタンパク質である（４）。２つの異なるニドゲンとして、ニドゲン－１（エンタクチン）およびニドゲン－２が存在する。ニドゲン－１は、最も広く発現し、２つの棒状ドメインによって接続された３つの球状ドメイン（Ｇ１、Ｇ２、およびＧ３）を含む。ニドゲン－１は、他のＢＭタンパク質、すなわち、ＩＶ型コラーゲン、パールカン、ラミニンの間のリンカーとして働く（５）。ニドゲン－１はまた、ＢＭ変化の直接の結果として、ニドゲン欠損マウスで観察された肺および心臓の異常ならびに周産期死亡（７）から明らかなように、ＢＭの構築および安定化において重要な役割を果たす（６）。
【0004】
ニドゲン－１が乳腺上皮細胞における特異的遺伝子発現を調節できることも示されている（８）。β－カゼインの発現をニドゲンの質／組成の関数として調査したとき、ラミニン－１結合ドメインを含有するがＩＶ型コラーゲン結合ドメインを欠くニドゲンのフラグメントは、β－カゼインの発現を減少させることができた。対照的に、ＩＶ型コラーゲン結合ドメインを含有するがラミニン－１結合ドメインを欠くニドゲンのフラグメントではそうならなかった。これは、ニドゲンが、ＢＭ完全性の維持に加えて、ＢＭ誘導性遺伝子発現において生理的役割を有し、それがニドゲンの質／組成に影響されることを示している。
【0005】
Ｓａｇｅら（９）は、ニドゲン－１がカテプシン－Ｓ（ＣａｔＳ）の基質であり、ＣａｔＳが正常組織および腫瘍組織の両方で見られることを示した。しかし、正常組織および腫瘍組織におけるＣａｔＳによるニドゲン切断の生理的関連は未知のままであった。
【0006】
カテプシンはがんにおいて重要な役割を果たす可能性があると考えられている（１０）。Ｓａｇｅらが述べるように、ＣａｔＳは正常組織および腫瘍組織で産生され、ＣａｔＳが腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）によって産生されることも明らかにされている（１１）。ＣａｔＳは、様々ながんタイプにおける増殖、血管新生、遊走、浸潤、および転移に関連する（１１～１４）。しかし、Ｋｏｓら（２１）は、がんの進行におけるＣａｔＳの役割が、細胞外マトリックスの再構築ではなく免疫応答に強く関連していることを示した。
【発明の概要】
【0007】
出願人は、ＣａｔＳによって分解されたニドゲン－１が、がんにおけるバイオマーカーとしての潜在能力を有することを見出した。理論に拘泥するものではないが、これは、ＢＭ完全性の喪失、前がん事象と関連していることが公知である現象、および浸潤性表現型を反映していると仮定される。したがって、本発明の目的は、ニドゲン－１のＣａｔＳ分解によって産生されたバイオマーカーを使用して、がんの非侵襲的評価を可能にすることであった。
【0008】
第１の態様では、本発明は、がんを診断または定量化する方法であって、患者の生体液試料を得るステップと、前記試料中に天然に存在する、カテプシン－Ｓによるニドゲン－１の切断によって形成されるＮ末端またはＣ末端ネオエピトープを有するニドゲン－１のフラグメントを測定するイムノアッセイを実施するステップと、前記患者における前記測定値の、正常レベルを超える上昇をがんの存在または程度と関連させるステップとを含み、前記イムノアッセイが、
前記試料中に天然に存在する前記Ｎ末端またはＣ末端ネオエピトープを有するニドゲン－１のフラグメントを、そのＮ末端またはＣ末端ネオエピトープと特異的に反応するが未切断の（インタクトな）ニドゲン－１とは反応しない免疫学的結合パートナーと接触させるステップと、前記試料中の前記ネオエピトープを含むフラグメントを測定するために、前記Ｎ末端またはＣ末端ネオエピトープと前記免疫学的結合パートナーとの結合の程度を測定するステップとを含む方法によって実施される、方法に関する。
前記試料中に天然に存在する前記Ｎ末端またはＣ末端ネオエピトープを有するニドゲン－１のフラグメントを、そのＮ末端またはＣ末端ネオエピトープと特異的に反応するが未切断の（インタクトな）ニドゲン－１とは反応しない免疫学的結合パートナーと接触させるステップと、前記試料中の前記ネオエピトープを含むフラグメントを測定するために、前記Ｎ末端またはＣ末端ネオエピトープと前記免疫学的結合パートナーとの結合の程度を測定するステップとを含む方法によって実施される、方法に関する。
【0009】
がんは、乳がんであっても非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）であってもよい。
【0010】
好ましくは、免疫学的結合パートナーは、
…ＣＱＨＥＲＥ（配列番号１）
…ＹＳＬＬＰＬ（配列番号２）
…ＩＩＲＱＤＬ（配列番号３）
からなる群から選択されるＣ末端ネオエピトープと特異的に反応し、または
ＡＰＶＧＧＩ…（配列番号４）
ＨＩＬＧＡＡ…（配列番号５）
ＧＳＰＥＧＩ…（配列番号６）
からなる群から選択されるＮ末端ネオエピトープと特異的に反応する。
…ＣＱＨＥＲＥ（配列番号１）
…ＹＳＬＬＰＬ（配列番号２）
…ＩＩＲＱＤＬ（配列番号３）
からなる群から選択されるＣ末端ネオエピトープと特異的に反応し、または
ＡＰＶＧＧＩ…（配列番号４）
ＨＩＬＧＡＡ…（配列番号５）
ＧＳＰＥＧＩ…（配列番号６）
からなる群から選択されるＮ末端ネオエピトープと特異的に反応する。
【0011】
好ましくは、Ｃ末端ネオエピトープと特異的に反応する免疫学的結合パートナーは、前記Ｃ末端において短縮されたおよび／または伸長された配列とは反応しない。同様に、Ｎ末端ネオエピトープと特異的に反応する免疫学的結合パートナーは、好ましくは、前記Ｎ末端において短縮されたおよび／または伸長された配列とは反応しない。「伸長された（ｅｌｏｎｇａｔｅｄ）」は、本明細書で使用する場合、配列が１または複数のアミノ酸によって伸長されていることを意味する。「短縮された（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）」は、本明細書で使用する場合、配列から１または複数のアミノ酸が削られていることを意味する。好ましい一実施形態では、免疫学的結合パートナーは、Ｃ末端ネオエピトープＶＥＫＴＲＣＱＨＥＲＥ－ＣＯＯＨ（配列番号７）と特異的に反応する。好ましくは、免疫学的結合パートナーは、短縮されたＣ末端配列ＶＥＫＴＲＣＱＨＥＲ－ＣＯＯＨ（配列番号８）と反応せず、かつ／または、伸長されたＣ末端配列ＶＥＫＴＲＣＱＨＥＲＥＨ－ＣＯＯＨ（配列番号９）と反応しない。
【0012】
免疫学的結合パートナーは、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。
【0013】
前述の診断方法は、ＮＳＣＬＣの患者と他のがんタイプの患者とを区別するのに使用することができる。これに関して、本方法は、好ましくは、前述の方法を実施するステップと、正常レベルを少なくとも３０％を超えて上回る前記患者における前記測定値の上昇をＮＳＣＬＣの存在と関連付けるステップとを含む。
【0014】
別の一態様では、本発明は、抗がん薬の効能を評価する方法であって、
少なくとも２つの生物学的試料について、カテプシン－Ｓによるニドゲン－１の切断によって形成されるＮ末端またはＣ末端ネオエピトープを有するニドゲン－１のフラグメントの量を定量化するイムノアッセイを実施するステップを含み、ここで、前記生物学的試料が、対象への前記抗がん薬の投与期間中の第１の時点および後続する少なくとも１つの時点において前記対象から得られたものであり、前記抗がん薬の前記投与期間中の前記第１の時点から前記後続する少なくとも１つの時点にかけての、カテプシン－Ｓによるニドゲン－１の切断によって形成されるＮ末端またはＣ末端ネオエピトープを有するニドゲン－１の前記フラグメントの量の減少が、効果的な抗がん薬であることを示しており、
前記イムノアッセイが、前記試料中に天然に存在する前記Ｎ末端またはＣ末端ネオエピトープを有するニドゲン－１の前記フラグメントを、前記Ｎ末端またはＣ末端ネオエピトープと特異的に反応するが未切断のニドゲン１とは反応しない免疫学的結合パートナーと接触させるステップと、前記試料中の前記ネオエピトープを含むフラグメントを測定するために、前記Ｎ末端またはＣ末端ネオエピトープと前記免疫学的結合パートナーとの結合程度を測定するステップとを含む方法によって実施される、方法に関する。
少なくとも２つの生物学的試料について、カテプシン－Ｓによるニドゲン－１の切断によって形成されるＮ末端またはＣ末端ネオエピトープを有するニドゲン－１のフラグメントの量を定量化するイムノアッセイを実施するステップを含み、ここで、前記生物学的試料が、対象への前記抗がん薬の投与期間中の第１の時点および後続する少なくとも１つの時点において前記対象から得られたものであり、前記抗がん薬の前記投与期間中の前記第１の時点から前記後続する少なくとも１つの時点にかけての、カテプシン－Ｓによるニドゲン－１の切断によって形成されるＮ末端またはＣ末端ネオエピトープを有するニドゲン－１の前記フラグメントの量の減少が、効果的な抗がん薬であることを示しており、
前記イムノアッセイが、前記試料中に天然に存在する前記Ｎ末端またはＣ末端ネオエピトープを有するニドゲン－１の前記フラグメントを、前記Ｎ末端またはＣ末端ネオエピトープと特異的に反応するが未切断のニドゲン１とは反応しない免疫学的結合パートナーと接触させるステップと、前記試料中の前記ネオエピトープを含むフラグメントを測定するために、前記Ｎ末端またはＣ末端ネオエピトープと前記免疫学的結合パートナーとの結合程度を測定するステップとを含む方法によって実施される、方法に関する。
【0015】
好ましくは、免疫学的結合パートナーは前述の通りである。
【0016】
さらなる一態様では、本発明は、前述の方法において使用する診断キットであって、カテプシン－Ｓによるニドゲン－１の切断によって形成されるＮ末端またはＣ末端ネオエピトープと特異的に反応するが未切断の（インタクトな）ニドゲン１とは反応しない免疫学的結合パートナー、および、以下：
－ ストレプトアビジン被覆９６ウェルプレート
－ 任意選択的にリンカーがビオチン残基とペプチドとの間に位置している、Ｎ末端またはＣ末端ネオエピトープのアミノ酸配列に対応するビオチン化ペプチド
－ サンドイッチイムノアッセイで使用されるビオチン化二次抗体
－ Ｎ末端またはＣ末端ネオエピトープのアミノ酸配列に対応する較正ペプチド
－ 抗体ＨＲＰ標識キット
－ 抗体放射能標識キット
－ アッセイ視覚化キット
のうちの少なくとも１つを含む、診断キットに関する。
－ ストレプトアビジン被覆９６ウェルプレート
－ 任意選択的にリンカーがビオチン残基とペプチドとの間に位置している、Ｎ末端またはＣ末端ネオエピトープのアミノ酸配列に対応するビオチン化ペプチド
－ サンドイッチイムノアッセイで使用されるビオチン化二次抗体
－ Ｎ末端またはＣ末端ネオエピトープのアミノ酸配列に対応する較正ペプチド
－ 抗体ＨＲＰ標識キット
－ 抗体放射能標識キット
－ アッセイ視覚化キット
のうちの少なくとも１つを含む、診断キットに関する。
【0017】
好ましくは、アッセイキットは、ビオチン化ペプチドであるビオチン－Ｌ－ＶＥＫＴＲＣＱＨＥＲＥ－ＣＯＯＨ（配列番号１０）（式中、Ｌは任意選択のリンカーである）、および、Ｃ末端配列ＶＥＫＴＲＣＱＨＥＲＥ－ＣＯＯＨ（配列番号１１）を含む較正ペプチドを含む。
【0018】
［定義］
用語「抗体」は、本発明に従って最も広い意味で使用され、特に、インタクトなモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、およびそれらが所望の生物活性を示す限り抗体フラグメントに及ぶ。
用語「抗体」は、本発明に従って最も広い意味で使用され、特に、インタクトなモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、およびそれらが所望の生物活性を示す限り抗体フラグメントに及ぶ。
【0019】
本発明による「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体の一部を含み、好ましくはその抗原結合または可変領域を含む。抗体フラグメントの例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、およびＦｃフラグメントが挙げられる。
【0020】
本発明による「ニドゲン－１のフラグメント」は、ニドゲン－１のＣａｔＳ切断によって産生されるペプチドフラグメントを意味する。
【0021】
本発明による「Ｎ末端またはＣ末端ネオエピトープ」は、ニドゲン－１のＣａｔＳ切断部位で形成されたＮ末端またはＣ末端エピトープを意味する。例えば、以下のニドゲン－１の配列は、
…ＣＱＨＥＲＥ↓ＨＩＬＧＡＡ…
記号「↓」で示すようにＣａｔＳによってＥ６９３－Ｈ６９４ペプチド結合間の部位で切断された場合、Ｎ末端ネオエピトープＨ２Ｎ－ＨＩＬＧＡＡ…（配列番号５）およびＣ末端ネオエピトープ…ＣＱＨＥＲＥ－ＣＯＯＨ（配列番号１）を産生する。
…ＣＱＨＥＲＥ↓ＨＩＬＧＡＡ…
記号「↓」で示すようにＣａｔＳによってＥ６９３－Ｈ６９４ペプチド結合間の部位で切断された場合、Ｎ末端ネオエピトープＨ２Ｎ－ＨＩＬＧＡＡ…（配列番号５）およびＣ末端ネオエピトープ…ＣＱＨＥＲＥ－ＣＯＯＨ（配列番号１）を産生する。
【0022】
用語「正常レベル」は、本明細書では、集団中の健常な個体と一致するレベル／量を意味するのに使用される。これは通常、対照試料の中央値±標準偏差に相当する。
【0023】
「ＮＩＣ」は、本明細書で使用する場合、Ｃ末端ネオエピトープＶＥＫＴＲＣＱＨＥＲＥ－ＣＯＯＨ（配列番号７）を含むニドゲン－１のフラグメントを指す。
【図面の簡単な説明】
【0024】
【図1】ＮＩＣアッセイの特異性に関しする図である。Ａ）選択ペプチド（ＶＥＫＴＲＣＱＨＥＲＥ；配列番号１１）、伸長された選択ペプチド（ＶＥＫＴＲＣＱＨＥＲＥＨ；配列番号１６）、短縮された選択ペプチド（ＥＶＥＫＴＲＣＱＨＥＲ；配列番号１５）、ナンセンス選択ペプチド（ＡＰＶＧＧＩＩＧＷＭ；配列番号１２）、およびナンセンススクリーニングペプチド（ビオチン－ＡＰＶＧＧＩＩＧＷＭ；配列番号１３）を用いて試験した競合ＮＩＣ－２ ＥＬＩＳＡにおける所与の濃度での阻害率。％Ｂ／Ｂ０、ＢはｘｎＭのペプチドのＯＤに匹敵し、Ｂ０は０ｎＭのペプチドのＯＤに匹敵する。Ｂ）ヒト組換えニドゲン－１（Ｎｉｄ－１）を、カテプシンＳ（ＣａｔＳ）ならびにマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）－１、－７、および－９を用いて切断した後に測定したＮＩＣレベル。検出下限レベル（ＬＬＯＤ）より低い値にはＬＬＯＤを割り当てた。＊ＭＭＰ－１、－７、および－９のすべてを表す。
【図2】２つの研究コホートからの血清中のＮＩＣの評価を示す図である。Ａ）Ｐｒｏｔｅｏｇｅｎｅｘ試料；Ｂ）Ａｓｔｅｒａｎｄ試料。箱およびひげは、最小から最大までのデータを示す。データは、多重比較用に調整した一元配置ＡＮＯＶＡによって比較した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。ＮＳＣＬＣ：非小細胞肺がん；ＳＣＬＣ：小細胞肺がん。
【図3】腫瘍ステージに応じた血清中のＮＩＣの評価を示す図である。試料を腫瘍ステージに応じてプールした。データを各がんタイプが識別できる散布図として表示する。データは、多重比較用に調整した一元配置ＡＮＯＶＡによって健常対照と比較した。＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。ＮＳＣＬＣ：非小細胞肺がん；ＳＣＬＣ：小細胞肺がん。
【図4】ＮＳＣＬＣと、この研究に包含される他のすべてを合わせた試料（乳がん、ＳＣＬＣ、および健常対照）とを分けるＮＩＣの能力を評価する受信者動作特性（ＲＯＣ）分析を示す図である。ＡＵＣ：ＲＯＣ曲線下面積；ＮＳＣＬＣ：非小細胞肺がん；ＳＣＬＣ：小細胞肺がん
【発明を実施するための形態】
【0025】
［材料および方法］
＜ペプチドの選択＞
ニドゲン－１の以下の３つの主なＣａｔＳ切断部位（↓）を、Ｎ末端配列決定により事前に同定した（９）。
１）ＮＨ３－…ＬＬＰＬ４５９↓ＡＰＶＧ…、Ｇ２ドメインの中央部に位置する；
２）ＮＨ３－…ＨＥＲＥ６９３↓ＨＩＬＧ…、Ｇ３ドメインに隣接するサイログロブリン様（Ｔｇ）ドメインに位置する；および
３）ＮＨ３－…ＲＱＤＬ８５９↓ＧＳＰＥ…、Ｇ３ドメインのＮ末端部に位置する。
＜ペプチドの選択＞
ニドゲン－１の以下の３つの主なＣａｔＳ切断部位（↓）を、Ｎ末端配列決定により事前に同定した（９）。
１）ＮＨ３－…ＬＬＰＬ４５９↓ＡＰＶＧ…、Ｇ２ドメインの中央部に位置する；
２）ＮＨ３－…ＨＥＲＥ６９３↓ＨＩＬＧ…、Ｇ３ドメインに隣接するサイログロブリン様（Ｔｇ）ドメインに位置する；および
３）ＮＨ３－…ＲＱＤＬ８５９↓ＧＳＰＥ…、Ｇ３ドメインのＮ末端部に位置する。
【0026】
抗体の産生およびイムノアッセイの開発のために、球状ドメインの外側からＮ末端方向に向けて生じるＣ末端ネオエピトープ…ＨＥＲＥ６９３に対応するタンパク質分解切断を選択した。
【0027】
ニドゲン－１の選択されたＣａｔＳ切断部位に特異的な抗体を作製するために、切断部位に隣接する１１個のアミノ酸の配列を標的として選択した：ＶＥＫＴＲＣＱＨＥＲＥ↓（配列番号７）。このアミノ酸配列を選択ペプチドの設計に使用した。配列を、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－ｐｒｏｔデータベース（１５）と共にＮＰＳ＠：Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ネットワークタンパク質配列分析）を使用して、他のヒトタンパク質との相同性に関してブラスト解析し、ヒトニドゲン－１に特有のものであることが分かった。
【0028】
ストレプトアビジン被覆プレートを被覆するために、ビオチン化スクリーニングペプチド（ビオチン－ＶＥＫＴＲＣＱＨＥＲＥ；配列番号１０）を含めた。抗体の特異性に関して試験するために、切断部位に最も近い１個のアミノ酸を欠く短縮された選択ペプチド（ＥＶＥＫＴＲＣＱＨＥＲ；配列番号１５）および切断部位のＣ末端に追加アミノ酸を付加して伸長された選択ペプチド（ＶＥＫＴＲＣＱＨＥＲＥＨ；配列番号１６）に加え、ナンセンス選択ペプチド（ＡＰＶＧＧＩＩＧＷＭ；配列番号１２）およびナンセンスビオチン化スクリーニングペプチド（ビオチン－ＡＰＶＧＧＩＩＧＷＭ；配列番号１３）をアッセイ開発に含めた。後者の２つは、Ｇ２ドメインの中央部に位置する切断部位に対応する（↓ＡＰＶＧ…）。スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート、すなわち、ＳＭＣＣ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ、カタログ番号２２３３６）を使用して、選択ペプチドをキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）担体タンパク質に共有結合的に架橋することにより、免疫原性ペプチド（ＫＬＨ－ＶＥＫＴＲＣＱＨＥＲＥ；配列番号１４）を作製した。ＮＩＣに使用した合成ペプチドを表１に示す。
【0029】
【表1】
【0030】
合成ペプチドはすべてＡｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｖｉｓｔａ、ＣＡ、ＵＳＡから購入した。
【0031】
＜抗体の開発＞
６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝６）を、フロイント不完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を使用して乳化された抗原２００μＬおよび免疫原性ペプチド（ＫＬＨ－ＶＥＫＴＲＣＱＨＥＲＥ；配列番号１４）５０μｇにより皮下免疫した。安定した血清抗体力価レベルに達するまで、免疫を２週間毎に繰り返し、２回目の免疫から血液試料を収集した。最も高い抗体力価を有するマウスを１カ月間休息させ、次いで、免疫原性ペプチド５０μｇを含む０．９％塩化ナトリウム溶液１００μＬを、静脈内投与により追加免疫した。３日後、脾臓を細胞融合のために単離した。融合手順は別記の通りに実施した（１６）。簡単に説明すると、マウス脾臓細胞をＳＰ２／０骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を生成した。ハイブリドーマ細胞を培養皿でクローニングし、限界希釈法を使用して、モノクローナル増殖を生じさせた。１０ｎｇ／ｍＬのスクリーニングペプチドおよび増殖させたモノクローナルハイブリドーマ細胞からの上澄み（抗体を含有）を用い、ストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレート（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、カタログ番号１１９４０２７９）上での予備ＥＬＩＳＡにおいて、ヒト血清試料および選択ペプチド（ＶＥＫＴＲＣＱＨＥＲＥ；配列番号１１）を用いた置換法により、モノクローナル抗体の天然の反応性およびペプチド結合を評価した。反応性が最も高いクローンを、Ｇタンパク質カラムを使用して、製造業者の使用説明書（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ、ＵＫ、カタログ番号１７－０４０４－０１）に従って精製した。選択ペプチド（ＶＥＫＴＲＣＱＨＥＲＥ；配列番号１１）とのみ競合的に反応し、かつ切断された選択ペプチド（ＥＶＥＫＴＲＣＱＨＥＲ；配列番号１５）、伸長された選択ペプチド（ＶＥＫＴＲＣＱＨＥＲＥＨ；配列番号１６）、およびナンセンス選択ペプチド（ＡＰＶＧＧＩＩＧＷＭ；配列番号１２）とは反応しない能力に関するスクリーニングには、２つのハイブリドーマクローンが適合した。さらなるアッセイ開発のために１つのハイブリドーマクローン（ＮＢ６１３－１２）を選択した。最適なインキュベーション緩衝液、インキュベーション時間、およびインキュベーション温度、ならびに抗体およびスクリーニングペプチドの最適濃度をチェッカーボード分析から決定した。
６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝６）を、フロイント不完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を使用して乳化された抗原２００μＬおよび免疫原性ペプチド（ＫＬＨ－ＶＥＫＴＲＣＱＨＥＲＥ；配列番号１４）５０μｇにより皮下免疫した。安定した血清抗体力価レベルに達するまで、免疫を２週間毎に繰り返し、２回目の免疫から血液試料を収集した。最も高い抗体力価を有するマウスを１カ月間休息させ、次いで、免疫原性ペプチド５０μｇを含む０．９％塩化ナトリウム溶液１００μＬを、静脈内投与により追加免疫した。３日後、脾臓を細胞融合のために単離した。融合手順は別記の通りに実施した（１６）。簡単に説明すると、マウス脾臓細胞をＳＰ２／０骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を生成した。ハイブリドーマ細胞を培養皿でクローニングし、限界希釈法を使用して、モノクローナル増殖を生じさせた。１０ｎｇ／ｍＬのスクリーニングペプチドおよび増殖させたモノクローナルハイブリドーマ細胞からの上澄み（抗体を含有）を用い、ストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレート（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、カタログ番号１１９４０２７９）上での予備ＥＬＩＳＡにおいて、ヒト血清試料および選択ペプチド（ＶＥＫＴＲＣＱＨＥＲＥ；配列番号１１）を用いた置換法により、モノクローナル抗体の天然の反応性およびペプチド結合を評価した。反応性が最も高いクローンを、Ｇタンパク質カラムを使用して、製造業者の使用説明書（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ、ＵＫ、カタログ番号１７－０４０４－０１）に従って精製した。選択ペプチド（ＶＥＫＴＲＣＱＨＥＲＥ；配列番号１１）とのみ競合的に反応し、かつ切断された選択ペプチド（ＥＶＥＫＴＲＣＱＨＥＲ；配列番号１５）、伸長された選択ペプチド（ＶＥＫＴＲＣＱＨＥＲＥＨ；配列番号１６）、およびナンセンス選択ペプチド（ＡＰＶＧＧＩＩＧＷＭ；配列番号１２）とは反応しない能力に関するスクリーニングには、２つのハイブリドーマクローンが適合した。さらなるアッセイ開発のために１つのハイブリドーマクローン（ＮＢ６１３－１２）を選択した。最適なインキュベーション緩衝液、インキュベーション時間、およびインキュベーション温度、ならびに抗体およびスクリーニングペプチドの最適濃度をチェッカーボード分析から決定した。
【0032】
＜インビトロでのニドゲン－１のタンパク質分解＞
ヒト組換え（ｈｒ－）ニドゲン－１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ、カタログ番号２５７０－ＮＤ）を、ＣａｔＳ－緩衝液（１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４（Ｈ２Ｏ）２、２ｍＭのＤＴＴ、０．０１％のＢｒｉｊ－３５、ｐＨ７．４）またはＭＭＰ－緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２、１０μＭのＺｎＣｌ、ｐＨ７．５）に溶解させて、１２５μｇ／ｍｌの最終濃度にした。最終濃度１．２５μｇ／ｍｌとしたｈｒ－カテプシンＳ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ Ｓｔａｔｉｏｎ、ＮＪ、ＵＳＡ、カタログ番号２１９３４３）、ｈｒ－ＭＭＰ－１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号９０１－ＭＰ）、ｈｒ－ＭＭＰ－７（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号９０７－ＭＰ）、またはｈｒ－ＭＭＰ－９（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号９１１－ＭＰ）を添加して、酵素とタンパク質の比を１：１００としたニドゲン－１溶液、または上記酵素を添加していないニドゲン－１溶液を、３７℃で１時間および２４時間インキュベートした。選択されたＭＭＰは、ニドゲン－１を分解することが以前示されている（１７、１８）。酵素活性試験を、ニドゲン－１の実際の切断と同時に行った。ＣａｔＳ－溶液およびＭＭＰ－溶液それぞれにＥ－６４またはＥＤＴＡ（最終濃度１μＭ）を添加することによって反応を停止させた。関連するプロテアーゼを含むＣａｔＳ－緩衝液およびＭＭＰ－緩衝液を対照として含めた。実験を２回繰り返した。分析まで試料を－８０℃で保存した。ニドゲン－１の切断を、製造業者の使用説明書（ＳｉｌｖｅｒＸｐｒｅｓｓ（登録商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＬＣ６１００）に従って銀染色することで確認した（データは示さず）。
ヒト組換え（ｈｒ－）ニドゲン－１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ、カタログ番号２５７０－ＮＤ）を、ＣａｔＳ－緩衝液（１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４（Ｈ２Ｏ）２、２ｍＭのＤＴＴ、０．０１％のＢｒｉｊ－３５、ｐＨ７．４）またはＭＭＰ－緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２、１０μＭのＺｎＣｌ、ｐＨ７．５）に溶解させて、１２５μｇ／ｍｌの最終濃度にした。最終濃度１．２５μｇ／ｍｌとしたｈｒ－カテプシンＳ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ Ｓｔａｔｉｏｎ、ＮＪ、ＵＳＡ、カタログ番号２１９３４３）、ｈｒ－ＭＭＰ－１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号９０１－ＭＰ）、ｈｒ－ＭＭＰ－７（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号９０７－ＭＰ）、またはｈｒ－ＭＭＰ－９（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号９１１－ＭＰ）を添加して、酵素とタンパク質の比を１：１００としたニドゲン－１溶液、または上記酵素を添加していないニドゲン－１溶液を、３７℃で１時間および２４時間インキュベートした。選択されたＭＭＰは、ニドゲン－１を分解することが以前示されている（１７、１８）。酵素活性試験を、ニドゲン－１の実際の切断と同時に行った。ＣａｔＳ－溶液およびＭＭＰ－溶液それぞれにＥ－６４またはＥＤＴＡ（最終濃度１μＭ）を添加することによって反応を停止させた。関連するプロテアーゼを含むＣａｔＳ－緩衝液およびＭＭＰ－緩衝液を対照として含めた。実験を２回繰り返した。分析まで試料を－８０℃で保存した。ニドゲン－１の切断を、製造業者の使用説明書（ＳｉｌｖｅｒＸｐｒｅｓｓ（登録商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＬＣ６１００）に従って銀染色することで確認した（データは示さず）。
【0033】
＜ＮＩＣアッセイプロトコル＞
競合ＥＬＩＳＡの手順は以下の通りであった。９６ウェルのストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレートを、アッセイ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＢＴＢ、８ｇ／ＬのＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に溶解させた２．５ｎｇ／ｍｌのスクリーニングペプチド（ビオチン－ＶＥＫＴＲＣＱＨＥＲＥ；配列番号１０）で被覆した。プレートを暗所にて２０℃で３０分間インキュベートし、その後、洗浄緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２）で５回洗浄した。２０μｌの選択ペプチド（ＶＥＫＴＲＣＱＨＥＲＥ；配列番号１１）または試料（例えば血清）を適切なウェルに添加した。これに続いて、アッセイ緩衝液に溶解させたモノクローナル抗体１００μｌを直ちに添加して、濃度を２０ｎｇ／ｍｌにした。プレートを２０℃で３時間インキュベートし、続いて、洗浄緩衝液で５回洗浄した。次いで、アッセイ緩衝液で１：６０００希釈したヤギ抗マウスＰＯＤ共役ＩｇＧ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ、カタログ番号３１４３７）１００μｌ（最終濃度１３０ｎｇ／ｍｌ）を各ウェルに添加した。プレートを２０℃で１時間インキュベートし、続いて、洗浄緩衝液で５回洗浄した。次に、１００μＬのテトラ－メチル－ベンジニジン（ｂｅｎｚｉｎｉｄｉｎｅ）（Ｋｅｍ－Ｅｎ－Ｔｅｃ、Ｔａａｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ、カタログ番号４３８ＯＨ）を添加し、プレートを２０℃で１５分間インキュベートし、次いで、１００μｌの停止溶液（１％のＨ２ＳＯ４）を添加した。すべてのインキュベーション工程は、プレートを３００ｒｐｍで振とうさせながら行った。最後に、光学濃度をＶｅｒｓａＭａｘ ＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダーにおいて４５０ｎｍで測定し、参照は６５０ｎｍとした。較正曲線のプロットには４パラメータ数学的フィットモデルを使用した。データは、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ｖ．６．３ソフトウェアを使用して分析した。
競合ＥＬＩＳＡの手順は以下の通りであった。９６ウェルのストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレートを、アッセイ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＢＴＢ、８ｇ／ＬのＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に溶解させた２．５ｎｇ／ｍｌのスクリーニングペプチド（ビオチン－ＶＥＫＴＲＣＱＨＥＲＥ；配列番号１０）で被覆した。プレートを暗所にて２０℃で３０分間インキュベートし、その後、洗浄緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２）で５回洗浄した。２０μｌの選択ペプチド（ＶＥＫＴＲＣＱＨＥＲＥ；配列番号１１）または試料（例えば血清）を適切なウェルに添加した。これに続いて、アッセイ緩衝液に溶解させたモノクローナル抗体１００μｌを直ちに添加して、濃度を２０ｎｇ／ｍｌにした。プレートを２０℃で３時間インキュベートし、続いて、洗浄緩衝液で５回洗浄した。次いで、アッセイ緩衝液で１：６０００希釈したヤギ抗マウスＰＯＤ共役ＩｇＧ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ、カタログ番号３１４３７）１００μｌ（最終濃度１３０ｎｇ／ｍｌ）を各ウェルに添加した。プレートを２０℃で１時間インキュベートし、続いて、洗浄緩衝液で５回洗浄した。次に、１００μＬのテトラ－メチル－ベンジニジン（ｂｅｎｚｉｎｉｄｉｎｅ）（Ｋｅｍ－Ｅｎ－Ｔｅｃ、Ｔａａｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ、カタログ番号４３８ＯＨ）を添加し、プレートを２０℃で１５分間インキュベートし、次いで、１００μｌの停止溶液（１％のＨ２ＳＯ４）を添加した。すべてのインキュベーション工程は、プレートを３００ｒｐｍで振とうさせながら行った。最後に、光学濃度をＶｅｒｓａＭａｘ ＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダーにおいて４５０ｎｍで測定し、参照は６５０ｎｍとした。較正曲線のプロットには４パラメータ数学的フィットモデルを使用した。データは、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ｖ．６．３ソフトウェアを使用して分析した。
【0034】
＜ＮＩＣ ＥＬＩＳＡの技術的評価＞
検出下限（ＬＬＯＤ）は、ゼロ試料（アッセイ緩衝液）の２１回の測定から決定し、平均＋３標準偏差（ＳＤ）として計算した。検出上限（ＵＬＯＤ）は、標準曲線で用いた最大選択ペプチド濃度の１０回の独立実行から決定し、平均逆較正濃度＋３ＳＤとして計算した。定量下限（ＬＬＯＱ）は、血清中の定量可能な最大ＮＩＣ２－レベルとして計算し、３０％未満の変動係数が段階希釈した血清試料の３回の独立実行から再現された。アッセイ内変動は、プレート内の平均変動係数（ＣＶ％）として計算し、アッセイ間変動は、プレート間の平均ＣＶ％として計算した。アッセイ間およびアッセイ内変動は、８つの品質対照試料の１０回の独立実行、および検出範囲（ＬＬＯＤ～ＵＬＯＤ）にわたる２つの内部対照によって決定し、各実行は試料の二重決定からなる。８つの試料には、２つのヒト血清試料、選択ペプチドでスパイクした２つの動物血清試料、および選択ペプチドでスパイクした４つのヒト血清試料プールがあった。ヒト血清および血漿－ＥＤＴＡ試料の２倍希釈物を使用して、未希釈試料の希釈回収率として直線性を計算した。ヒト血清および血漿－ＥＤＴＡ試料を選択ペプチドの２倍希釈物でスパイクし、予想濃度（血清およびペプチドを合わせたもの）を参照として使用してスパイク回収率を計算することによって精度を決定した。試料の繰り返し凍結融解の効果を、４回の凍結／融解サイクルにおいて３つのヒト血清試料および血漿－ＥＤＴＡ試料に関して決定した。凍結融解回収率を参照として第１サイクルを用いて計算した。４℃または２０℃のいずれかで２４時間保存した後、３つのヒト血清試料および血漿－ＥＤＴＡ試料の分析物安定性を判定した。回収率を参照として－２０℃で保存した試料を用いて計算した。低／高含量のヘモグロビン（０．１５５／０．３１０ｍＭ）、脂肪血症／脂質（４．８３／１０．９８ｍＭ）、およびビオチン（３０／９０ｎｇ／ｍｌ）を既知濃度の血清試料に添加することによって干渉を決定した。回収率を参照として正常血清試料を用いて計算した。
検出下限（ＬＬＯＤ）は、ゼロ試料（アッセイ緩衝液）の２１回の測定から決定し、平均＋３標準偏差（ＳＤ）として計算した。検出上限（ＵＬＯＤ）は、標準曲線で用いた最大選択ペプチド濃度の１０回の独立実行から決定し、平均逆較正濃度＋３ＳＤとして計算した。定量下限（ＬＬＯＱ）は、血清中の定量可能な最大ＮＩＣ２－レベルとして計算し、３０％未満の変動係数が段階希釈した血清試料の３回の独立実行から再現された。アッセイ内変動は、プレート内の平均変動係数（ＣＶ％）として計算し、アッセイ間変動は、プレート間の平均ＣＶ％として計算した。アッセイ間およびアッセイ内変動は、８つの品質対照試料の１０回の独立実行、および検出範囲（ＬＬＯＤ～ＵＬＯＤ）にわたる２つの内部対照によって決定し、各実行は試料の二重決定からなる。８つの試料には、２つのヒト血清試料、選択ペプチドでスパイクした２つの動物血清試料、および選択ペプチドでスパイクした４つのヒト血清試料プールがあった。ヒト血清および血漿－ＥＤＴＡ試料の２倍希釈物を使用して、未希釈試料の希釈回収率として直線性を計算した。ヒト血清および血漿－ＥＤＴＡ試料を選択ペプチドの２倍希釈物でスパイクし、予想濃度（血清およびペプチドを合わせたもの）を参照として使用してスパイク回収率を計算することによって精度を決定した。試料の繰り返し凍結融解の効果を、４回の凍結／融解サイクルにおいて３つのヒト血清試料および血漿－ＥＤＴＡ試料に関して決定した。凍結融解回収率を参照として第１サイクルを用いて計算した。４℃または２０℃のいずれかで２４時間保存した後、３つのヒト血清試料および血漿－ＥＤＴＡ試料の分析物安定性を判定した。回収率を参照として－２０℃で保存した試料を用いて計算した。低／高含量のヘモグロビン（０．１５５／０．３１０ｍＭ）、脂肪血症／脂質（４．８３／１０．９８ｍＭ）、およびビオチン（３０／９０ｎｇ／ｍｌ）を既知濃度の血清試料に添加することによって干渉を決定した。回収率を参照として正常血清試料を用いて計算した。
【0035】
＜患者試料＞
血清試料は２つのコホートからなるものであった。概要を表２に示す。
血清試料は２つのコホートからなるものであった。概要を表２に示す。
【0036】
【表2】
【0037】
適切な施設内審査委員会／独立倫理委員会が試料収集を承認し、全患者がインフォームドコンセントを提出した。第１コホートは、市販ベンダーＰｒｏｔｅｏｇｅｎｅｘ（Ｃｕｌｖｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）から入手した。第２コホートは、市販ベンダーＡｓｔｅｒａｎｄ（Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ、ＵＳＡ）から取得したがん患者試料と、別の研究集団（登録番号ＫＡ９９０７０ｇｍ）から得られた健常対照試料との組合せであった。デンマークの法律によれば、以前収集した試料のバイオマーカーを測定する際に追加の倫理審査による承認を得る必要はない。全調査をヘルシンキ宣言に従って行なった。
【0038】
＜統計分析＞
ＮＩＣの血清レベルを、Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ検定による多重比較用に調整した一元配置ＡＮＯＶＡによって比較した。受信者動作特性（ＡＵＲＯＣ）曲線下の面積を、ＮＩＣの診断能力の評価に使用した。ｐ＜０．０５の場合、データを統計的に有意とみなした。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ６．０５およびＭｅｄＣａｌｃ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ１４．８．１を使用して、統計分析を実施した。
ＮＩＣの血清レベルを、Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ検定による多重比較用に調整した一元配置ＡＮＯＶＡによって比較した。受信者動作特性（ＡＵＲＯＣ）曲線下の面積を、ＮＩＣの診断能力の評価に使用した。ｐ＜０．０５の場合、データを統計的に有意とみなした。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ６．０５およびＭｅｄＣａｌｃ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ１４．８．１を使用して、統計分析を実施した。
【0039】
［結果］
＜ＮＩＣアッセイの特異性＞
競合ＮＩＣ ＥＬＩＳＡの特異性は、選択ペプチド（ＶＥＫＴＲＣＱＨＥＲＥ；配列番号１１）によって誘発された阻害率を、伸長された選択ペプチド（ＶＥＫＴＲＣＱＨＥＲＥＨ；配列番号１６）、短縮された選択ペプチド（ＥＶＥＫＴＲＣＱＨＥＲ；配列番号１５）、ナンセンス選択ペプチド（ＡＰＶＧＧＩＩＧＷＭ；配列番号１２）およびナンセンススクリーニングペプチド（ビオチン－ＡＰＶＧＧＩＩＧＷＭ；配列番号１３）の場合と比較して評価することにより判断した（後者の２つは、ニドゲン－１のＧ２ドメインの中央部に位置する切断部位に対応する）。結果を図１Ａに示す。選択ペプチドは明らかにシグナルを用量依存的に阻害したが、一方、シグナルは、最高濃度の短縮されたペプチド、伸長されたペプチドおよびナンセンスペプチドによってわずかに阻害されただけであった。ナンセンススクリーニングペプチドに対する反応性は検出されなかった。さらに、ニドゲン－１をＣａｔＳおよび様々なＭＭＰと共にインキュベートすることによって生成したＮＩＣのレベルを調査した。図１Ｂに示すように、ＣａｔＳはＮＩＣを時間依存的に生成したが、プロテアーゼなしの場合も、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－７、またはＭＭＰ－９と共にインキュベートした場合も、ＮＩＣを生成しなかった。ニドゲン－１をＣａｔＳと共に２４時間インキュベートした後、約５倍高いレベルのＮＩＣが検出された。概して、これは、抗体が特異的であり、アッセイがＣａｔＳによってアミノ酸位置６９３で切断されたニドゲン－１を正確に測定していることを示している。
＜ＮＩＣアッセイの特異性＞
競合ＮＩＣ ＥＬＩＳＡの特異性は、選択ペプチド（ＶＥＫＴＲＣＱＨＥＲＥ；配列番号１１）によって誘発された阻害率を、伸長された選択ペプチド（ＶＥＫＴＲＣＱＨＥＲＥＨ；配列番号１６）、短縮された選択ペプチド（ＥＶＥＫＴＲＣＱＨＥＲ；配列番号１５）、ナンセンス選択ペプチド（ＡＰＶＧＧＩＩＧＷＭ；配列番号１２）およびナンセンススクリーニングペプチド（ビオチン－ＡＰＶＧＧＩＩＧＷＭ；配列番号１３）の場合と比較して評価することにより判断した（後者の２つは、ニドゲン－１のＧ２ドメインの中央部に位置する切断部位に対応する）。結果を図１Ａに示す。選択ペプチドは明らかにシグナルを用量依存的に阻害したが、一方、シグナルは、最高濃度の短縮されたペプチド、伸長されたペプチドおよびナンセンスペプチドによってわずかに阻害されただけであった。ナンセンススクリーニングペプチドに対する反応性は検出されなかった。さらに、ニドゲン－１をＣａｔＳおよび様々なＭＭＰと共にインキュベートすることによって生成したＮＩＣのレベルを調査した。図１Ｂに示すように、ＣａｔＳはＮＩＣを時間依存的に生成したが、プロテアーゼなしの場合も、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－７、またはＭＭＰ－９と共にインキュベートした場合も、ＮＩＣを生成しなかった。ニドゲン－１をＣａｔＳと共に２４時間インキュベートした後、約５倍高いレベルのＮＩＣが検出された。概して、これは、抗体が特異的であり、アッセイがＣａｔＳによってアミノ酸位置６９３で切断されたニドゲン－１を正確に測定していることを示している。
【0040】
＜ＮＩＣアッセイの技術的評価＞
ＮＩＣアッセイの全体的な技術的性能を表３に列挙する。
ＮＩＣアッセイの全体的な技術的性能を表３に列挙する。
【0041】
【表3】
【0042】
アッセイは、３．１ｎＭのＬＬＯＤおよび２６０ｎＭのＵＬＯＤを有した。ＬＬＯＱは３．２ｎＭであった。アッセイ内変動は９％、アッセイ間変動は１４％であり、それぞれ許容レベルの１０％および１５％未満であった。１００±２０％以内の場合、全分析物回収率を許容した。希釈回収率は、血清および血漿－ＥＤＴＡに関してそれぞれ１０４％および９２％であり、試料の希釈時に良好な直線性を示した。また、標準ペプチドのスパイク回収率が血清（９１％）および血漿－ＥＤＴＡ（９４％）において許容され、これらの試料マトリックスがアッセイ応答に影響を及ぼさないことが示された。分析物は、血清および血漿－ＥＤＴＡの両方について、４回の凍結融解サイクルの後にそれぞれ９５％および８５％の回収率で回収された。また、分析物を４℃および２０℃で２４時間保存した後に回収したところ、４℃および２０℃それぞれにおいて血清では８８％および８２％の回収率、ならびに血漿－ＥＤＴＡでは９０％および９８％の回収率が得られた。概して、これは、分析物が比較的安定であることを示している。低または高含量のビオチン、脂質（脂肪血症）、またはヘモグロビンのいずれからも干渉は検出されず、回収率は８１％～１０５％の範囲であった。
【0043】
＜肺がん、乳がん、および健常対照の患者からの血清におけるＮＩＣレベルの評価＞
ＮＩＣレベルを、２つの異なる患者コホートからの血清において測定した。図２Ａに示すように、ＮＩＣは、健常対照および乳がん患者と比較してＮＳＣＬＣ患者からの血清において有意に上昇した（ｐ＞０．０５）。ＮＳＣＬＣ患者のＮＩＣ中央値は、１３．１～５１．１ｎＭの範囲にある２０ｎＭであった。乳がん患者のＮＩＣ中央値は６．９～１７．３ｎＭの範囲にある１３．３ｎＭであり、健常対照のＮＩＣ中央値は８．９～１４．４ｎＭの範囲にある１２．４ｎＭであった。図２Ｂに示すように、ＮＩＣは、健常対照（ｐ＜０．００１）、乳がん患者（ｐ＜０．０１）およびＳＣＬＣ患者（ｐ＜０．０５）と比較して、ＮＳＣＬＣ患者からの血清において有意に上昇した。このコホートでは、ＮＳＣＬＣ患者のＮＩＣ中央値は、７．６～２２．１ｎＭの範囲にある１３．４ｎＭであった。ＳＣＬＣ患者のＮＩＣ中央値は７．６～１３．７ｎＭの範囲にある１０．４ｎＭであり、乳がん患者のＮＩＣ中央値は３．３～１６．２ｎＭの範囲にある９．８ｎＭであり、健常対照のＮＩＣ中央値は４．０～１５．１ｎＭの範囲にある９．７ｎＭであった。ＮＩＣレベルはまた、がんにおける重要な臨床パラメータである腫瘍ステージに従って評価した。すべてのがんを合わせた結果を図３に示す。詳細には、健常対照と比較して、疾患のすべてのステージでＮＩＣレベルが上昇したが、ステージ間で差は検出されなかった。これは、ＮＩＣが腫瘍ステージと関係なく生成されることを示している。
ＮＩＣレベルを、２つの異なる患者コホートからの血清において測定した。図２Ａに示すように、ＮＩＣは、健常対照および乳がん患者と比較してＮＳＣＬＣ患者からの血清において有意に上昇した（ｐ＞０．０５）。ＮＳＣＬＣ患者のＮＩＣ中央値は、１３．１～５１．１ｎＭの範囲にある２０ｎＭであった。乳がん患者のＮＩＣ中央値は６．９～１７．３ｎＭの範囲にある１３．３ｎＭであり、健常対照のＮＩＣ中央値は８．９～１４．４ｎＭの範囲にある１２．４ｎＭであった。図２Ｂに示すように、ＮＩＣは、健常対照（ｐ＜０．００１）、乳がん患者（ｐ＜０．０１）およびＳＣＬＣ患者（ｐ＜０．０５）と比較して、ＮＳＣＬＣ患者からの血清において有意に上昇した。このコホートでは、ＮＳＣＬＣ患者のＮＩＣ中央値は、７．６～２２．１ｎＭの範囲にある１３．４ｎＭであった。ＳＣＬＣ患者のＮＩＣ中央値は７．６～１３．７ｎＭの範囲にある１０．４ｎＭであり、乳がん患者のＮＩＣ中央値は３．３～１６．２ｎＭの範囲にある９．８ｎＭであり、健常対照のＮＩＣ中央値は４．０～１５．１ｎＭの範囲にある９．７ｎＭであった。ＮＩＣレベルはまた、がんにおける重要な臨床パラメータである腫瘍ステージに従って評価した。すべてのがんを合わせた結果を図３に示す。詳細には、健常対照と比較して、疾患のすべてのステージでＮＩＣレベルが上昇したが、ステージ間で差は検出されなかった。これは、ＮＩＣが腫瘍ステージと関係なく生成されることを示している。
【0044】
ＮＳＣＬＣについてのＮＩＣの診断能力を分析するために、両方のコホートをプールし、「ＮＳＣＬＣ」対「その他すべて」にグループ分けし、ＡＵＲＯＣを計算した。ＡＵＲＯＣは、０．８３（９５％信頼区間：０．７１～０．９５）、ｐ＜０．０００１であった。ＲＯＣ曲線ならびに推定最適カットオフ値における感受性および特異性を図４に示す。これらの知見は、ＮＩＣがＮＳＣＬＣ患者と他の合わせた対象とを区別できることを示している。概して、本発明の知見は、ＮＩＣがＮＳＣＬＣと非常に関連している可能性があることを示唆している。
【0045】
［考察］
本明細書では、ＣａｔＳによって特異的に分解されたニドゲン－１のフラグメント（ＮＩＣ）の非侵襲的測定を可能にするロバスト競合ＮＩＣ ＥＬＩＳＡの開発および検証を記載している。さらに、これは、ＣａｔＳによって特異的に分解されたニドゲン－１が、がん、特にＮＳＣＬＣのためのバイオマーカーとしての潜在能力を有することを初めて示すものである。
本明細書では、ＣａｔＳによって特異的に分解されたニドゲン－１のフラグメント（ＮＩＣ）の非侵襲的測定を可能にするロバスト競合ＮＩＣ ＥＬＩＳＡの開発および検証を記載している。さらに、これは、ＣａｔＳによって特異的に分解されたニドゲン－１が、がん、特にＮＳＣＬＣのためのバイオマーカーとしての潜在能力を有することを初めて示すものである。
【0046】
ニドゲン－１のＣａｔＳ切断は、Ｃ末端配列ＶＥＫＴＲＣＱＨＥＲＥ（配列番号７）を有するネオエピトープを含有する特異的フラグメント（ＮＩＣ）の放出をもたらした。
【0047】
本明細書に記載のＮＩＣアッセイによって測定されるようなＮＩＣレベルの上昇は、乳がん、ＳＣＬＣ、および健常対照の患者と比較して、ＮＳＣＬＣの患者からの血清において検出された。これは、ＮＳＣＬＣ患者がニドゲン－１のＣａｔＳ介在分解を増大させたことを示唆しており、他のすべての対象と比較した場合のＮＳＣＬＣにおけるＮＩＣの診断精度（ＡＵＲＯＣ ０．８３）によりさらに裏付けられた。さらに、ＮＩＣレベルは、患者の腫瘍における特定の病理学的事象の指標となり得、この病理学的事象は、分析した他のがんタイプと比較してＮＳＣＬＣとより関連しているように思われる。
【0048】
ＮＩＣレベルが疾患、特にＮＳＣＬＣのすべてのステージにおいて上昇したことから、これは、ニドゲン－１のＣａｔＳ分解が腫瘍ステージとは無関係に疾患の初期および後期の両方で進行しており、ＮＩＣが疾患の早期発症において適用され得ることを示している。
【0049】
抗がん薬の効能に関して、腫瘍微小環境をモジュレートするため、ならびに腫瘍収縮または化学療法薬および標的療法のより効率的な送達を得るための可能な介入としてＥＣＭ修飾薬が現在研究されている。興味深いことに、ＣａｔＳの抗体媒介性遮断が化学療法の効能を高めることが示されている（１９）。さらに、この抗体は固形腫瘍の治療のための直接的戦略として示唆されている（２０）。したがって、ＮＩＣアッセイは、どの患者がそのような治療から利益を得る可能性が最も高いかを予測するため、または治療の初期効能を監視するために使用できるであろう。
【0050】
ＮＩＣアッセイの重要なパラメータは、ロバスト性、すなわち、技術的および分析的評価と関係がある。ＮＩＣの技術的評価には、検出範囲、感受性、アッセイ間およびアッセイ内変動、直線性／精度（希釈回収率）、分析物安定性、および干渉の確立が包含され、これらはすべて許容範囲内であった。ＮＩＣアッセイの分析的評価は、アッセイの特異性、およびアッセイが血清／血漿－ＥＤＴＡにおいて検出するように設計された分析物を検出するかどうかを指す。特異性は、置換分析（図１Ａ）、ならびに、インタクトなニドゲン－１および切断されたニドゲン－１に対する反応性の試験（図１Ｂ）によって評価した。精度は、分析物を関連するマトリックス（血清および血漿－ＥＤＴＡ）にスパイクし、回収率を（許容範囲内で）計算することによって評価した。したがって、ＮＩＣアッセイは、技術的および分析的にロバスト性を示した。
【0051】
結論として、ＣａｔＳ分解ニドゲン－１は、技術的にロバストなＮＩＣアッセイにより血清において定量化することができる。乳がん患者、ＳＣＬＣ患者、および健常対照と比較して、ＮＳＣＬＣ患者においてＮＩＣレベルは上昇した。したがって、ＮＩＣアッセイは、がんのための非侵襲的バイオマーカーとして役立ち得、腫瘍生物学への重要な洞察を提供し得る。
【0052】
本明細書では、明確に別段の指示がない限り、用語「または（ｏｒ）」は、条件のうちの一方のみを満たすことが必要とされる「排除的または」とは対照的に、規定の条件のいずれか一方または両方を満たす場合に真値を返す演算子の意味で使用される。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」の意味ではなく、「包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の意味で使用される。上記で認められた従来技術はすべて、参照により本明細書の一部をなすものとする。本明細書におけるいかなる先行公開文書の認識も、その教示がその日時における技術常識であったことの承認または表明であると解釈されるべきではない。
【0053】
参照文献
【表4A】
【表4B】
【表4C】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】