(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2021-12-27
(45)【発行日】2022-02-10
(54)【発明の名称】病原体からの免疫原性抗原同定および臨床的有効性との相関
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/04 20060101AFI20220203BHJP
C12N 1/14 20060101ALI20220203BHJP
C12N 1/20 20060101ALI20220203BHJP
C12N 7/00 20060101ALI20220203BHJP
C12N 5/09 20100101ALI20220203BHJP
C07K 14/57 20060101ALI20220203BHJP
C12N 9/64 20060101ALI20220203BHJP
G01N 33/68 20060101ALI20220203BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20220203BHJP
A61K 39/02 20060101ALI20220203BHJP
A61K 39/12 20060101ALI20220203BHJP
A61K 39/155 20060101ALI20220203BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20220203BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20220203BHJP
A61K 35/768 20150101ALI20220203BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20220203BHJP
A61P 31/10 20060101ALI20220203BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20220203BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220203BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/04
C12N1/14 A
C12N1/20 A
C12N7/00
C12N5/09
C07K14/57
C12N9/64 Z
G01N33/68
A61K39/00 H
A61K39/02
A61K39/12
A61K39/155
A61K39/00 K
A61K39/395 R
A61K39/395 S
A61K39/395 T
A61K35/17 Z
A61K35/768
A61P31/04
A61P31/10
A61P31/12
A61P35/00
【請求項の数】
10
(21)【出願番号】P 2018514333
(86)(22)【出願日】2016-09-19
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2018-10-11
(86)【国際出願番号】 US2016052487
(87)【国際公開番号】W WO2017049291
(87)【国際公開日】2017-03-23
【審査請求日】2019-09-18
(31)【優先権主張番号】62/220,884
(32)【優先日】2015-09-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】391058060
【氏名又は名称】ベイラー カレッジ オブ メディスン
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＹＬＯＲ ＣＯＬＬＥＧＥ ＯＦ ＭＥＤＩＣＩＮＥ
(74)【代理人】
【識別番号】110000729
【氏名又は名称】特許業務法人 ユニアス国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】リーン、アン、マリー
(72)【発明者】
【氏名】アグアヨ－ヒラルド、ペールベル
(72)【発明者】
【氏名】ツァンノウ、イフィゲネイア
(72)【発明者】
【氏名】ヴェラ、ジュアン、エフ．、ヴァルデス
【審査官】白井 美香保
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１５／１１０３９７（ＷＯ，Ａ２）
【文献】特表平０９－５１０２１１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１３－５３０９４３（ＪＰ，Ａ）
【文献】Journal of Virology，2001年，Vol.75, No.18，pp.8649-8659
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ１／００－３／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下のステップを含む、病原体またはがんに対する抗原の免疫原性の階層の確立のための方法：複数の個体から得られたそれぞれの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、以下の（ａ）～（ｅ）を含むｉｎ ｖｉｔｒｏの培養条件下で培養するステップ；
（ａ）１個体に由来する前記細胞を、病原体またはがんに由来する２以上の抗原に、
１以上のＴｈ１サイトカインの存在下で、前記抗原を認識する細胞の量的な増殖を可能ならしめる条件下で曝露して、増殖した細胞を作製すること、
（ｂ）増殖した前記細胞を複数の別々の培養物に分けて、それぞれの培養物で別々の前記抗原の１つを添加すること、
（ｃ）増殖した前記細胞の別々の培養物のそれぞれから判定された生物学的活性の大きさを閾値と比較して、レスポンダーである増殖した細胞培養物とノンレスポンダーである増殖した細胞培養物とを判別すること、
（ｄ）前記生物学的活性が前記閾値を超えた場合は増殖した細胞培養物をレスポンダーと同定し、前記生物学的活性が前記閾値を超えない場合は細胞培養物をノンレスポンダーと同定すること、
（ｅ）複数の個体から得られたＰＢＭＣについて前記（ａ）～（ｄ）を行い、前記２以上の抗原のそれぞれについて、評価した個体の数に対して、前記増殖した細胞培養物がレスポンダーである頻度及び前記増殖した細胞培養物がノンレスポンダーである頻度を決定すること、及び
（ｆ）以下の数式：
【数1】
ここで、前記生物学的活性が、ＩＦＮγ及び／又はグランザイムＢの産生を含む。
【請求項2】
前記病原体が、ウイルス、真菌または細菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記閾値を決定するステップをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記ウイルスが、呼吸器ウイルスである、請求項２または３に記載の方法。
【請求項5】
前記呼吸器ウイルスが、パラインフルエンザウイルスまたはメタニューモウイルスである、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記パラインフルエンザウイルスが、ＩＩＩ型である、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記メタニューモウイルスが、ヒトメタニューモウイルスである、請求項５に記載の方法。
【請求項8】
前記階層の情報が、前記病原体に曝露された、前記病原体に曝露されるリスクがある、前記病原体に罹患しやすい、前記病原体からの疾患を有する、前記がんのリスクがある、または前記がんを有する個体に対する免疫療法の決定に用いられる、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記免疫療法が、ワクチン、免疫原性組成物、モノクローナル抗体、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、腫瘍溶解性ウイルス、養子Ｔ細胞移植、またはこれらの組み合わせを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記免疫療法が、同じ細胞上の１つより多くの抗原を標的にする、請求項８または９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、２０１５年９月１８日に出願した米国仮特許出願第６２／２２０，８８４号の優先権を主張するものであり、前記仮出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【0002】
本開示の実施形態は、少なくとも細胞生物学、分子生物学、免疫学および医学の分野に関する。
【背景技術】
【0003】
造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）は、様々な悪性および非悪性障害に対して選択される処置である。しかし、移植後の移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、原疾患再発およびウイルス感染症は、いまだ罹患率および死亡率の主原因である。ウイルス感染症は、同種移植レシピエントの大多数において検出される。抗ウイルス薬は、一部のウイルスには利用できるが、常に有効であるとは限らず、それ故、新規治療法の必要性が強調される。これらのウイルス感染症を処置するための１つの戦略は、例えば、ドナー由来のウイルス特異的Ｔ細胞（ＶＳＴ）の注入を少なくとも含む、養子Ｔ細胞移植を用いる戦略である。ＶＳＴアプローチを用いて、例えば、ドナーから細胞を抽出し、ウイルス特異的集団をｅｘ ｖｉｖｏで増殖させ、そして最後にＴ細胞産物を幹細胞移植レシピエントに注入することができる。
【0004】
Ａｄｖ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、ＢＫ、ＨＨＶ６を標的にする、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖されたドナー由来および第３者ＶＳＴは、ウイルス感染症を有する幹細胞移植患者に養子移入されたとき安全であることが示されている。Adv、EBV、CMV、BKおよびHHV6に対するVSTの再構成抗ウイルス免疫は、疾患の除去に有効であり、ｉｎ ｖｉｖｏでかなりの増殖を示した。ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖され養子移入された自家がん特異的Ｔ細胞が患者に養子移入されたとき、安全であり、臨床的利点を伴うことも証明されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
本開示の実施形態は、ある一定の病原体およびがん抗原に対する治療法を提供することにより、ならびにまたどの抗原が免疫原性であり、臨床的に効果があるのかを明らかにすることにより、当技術分野における長年にわたる切実な要求を満たすものである。
【0006】
本開示の実施形態は、ヒトまたはイヌなどの哺乳動物個体のための１つ以上の免疫療法において臨床的に効果があるであろう１つ以上の抗原を同定するためのものを含む、免疫療法を作り出すための方法、組成物および／またはシステムに関する。前記方法の実施形態は、病原体またはがん細胞由来のどの抗原が、哺乳動物における１つ以上の治療応用への利用に好適な免疫原性のものであるかを判定することに関する。ある一定の実施形態では、病原体は、例えば、ウイルス、細菌、または真菌である。
【0007】
特定の実施形態において、本開示の方法は、問題の病原体および／またはがん細胞からの複数の抗原に対する免疫原性の判定に関し、ならびに好適な生物学的判定に基づく免疫原性の順序付けに関する。それらの免疫原性に基づく抗原の階層の決定は、病原体または癌を有する、病原体および/または癌からの曝露および/または疾患に感受性があるか、またはその危険性がある個体に好適な免疫原性療法を検討する際に用いることができる。特定の実施形態において、好適な免疫原性療法は、特定の病原体またはがんに対する抗原の免疫優性に基づく最も好適な免疫原性療法を含む。
【0008】
様々な実施形態において、病原体またはがんからの少なくとも２つの抗原を同定し、それらの免疫原性レベルが定量される。次いで、それらの抗原をそれらの免疫原性レベルに基づいた順序でランク付けすることができ、その結果、どの抗原を免疫療法の標的として使用すべきであるかについての決定を下すことができる。
【0009】
抗原の階層の決定に基づいて設計される免疫原性療法は、いかなる種類のものであってもよいが、特定の実施形態における免疫原性療法は、ワクチン、養子細胞療法、モノクローナル抗体、二重特異性抗体（ＢＩＴＥＳ）、腫瘍溶解性ウイルス、またはこれらの組み合わせを含む。免疫療法は、養子Ｔ細胞療法（ネイティブＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、改変ＴＣＲ、またはＣＡＲ Ｔ細胞）を含み得るが、ＮＫ細胞、ＮＫ Ｔ細胞、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）および樹状細胞（ＤＣ）をはじめとする他の型の免疫細胞を用いてもよい。免疫療法は、免疫細胞の産生および使用に依存することがあり、ネイティブであるかまたは改変されているＴ細胞受容体に依存するもの、ならびにＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）および樹状細胞（ＤＣ）に依存するものを含む。例えば、病原体またはがんの最も免疫原性が高い抗原のうちの少なくとも２つを、それぞれの病原性細胞またはがん細胞を破壊する意図をもって攻撃する、Ｔ細胞療法を設計することができる。そのような療法は、病原体またはがんからの最も免疫展性の高い抗原標的のうちの少なくとも２つを認識することができるＴ細胞を生成する、Ｔ細胞製造プロセスを含むことがあり得る。代替実施形態において、Ｔ細胞療法は、病原体または癌由来の１つだけの抗原を標的にする。
【0010】
ある一定の実施形態では、病原体に曝露された個体（病原体により直接もしくは間接的に引き起こされる疾患に罹患した個体を含む）、または病原体に曝露される可能性がある個体、またはがんを有する、もしくはがんを発症するリスクがある個体、または病原体に曝露された結果としてがんを発症するリスクがある個体に対する治療に用いることになる１つ以上の抗原の検討に使用するために、病原体またはがんからの１つより多くの抗原の免疫原性を判定し、順序付けして階層にする。
【0011】
特定の実施形態では、評価を行って、所与の抗原の免疫原性レベルに値を割り当てるために使用することができる情報ベースを構築する。この情報ベースは、次のように確立される：ａ）病原体に曝露された個体またはがん患者から採取した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、前記病原体由来の２つ以上の抗原または前記がんからの２つ以上の抗原に、好ましくはＴｈ－１極性化サイトカインの存在下で、前記ＰＢＭＣを曝露するｉｎ ｖｉｔｒｏ培養プロセスに付すステップ；ｂ）一定の期間、前記抗原を認識するＴ細胞の量を倍増させるステップ；ｃ）その培養物を分割して、ステップａに存在した抗原の数と同数の別個の培養物にし、前記抗原の１つだけを各培養物に添加するステップであって、その結果、各培養物が、元の抗原の１つを含み、かつ各培養物が、他の培養物とは異なる抗原を含むことになる、ステップ；ｄ）生物学的活性を測定するステップ（これを生物学的測定と呼ぶこともある）；ｅ）並行して、または異なる時点で、ことによると経時的な参照により、生物学的活性の閾値を、ステップｃのものと同じ薬剤（複数可）にｉｎ ｖｉｔｒｏで逐次的に曝露も並行して曝露もされていないＰＢＭＣにおいて生じる生物学的活性のｉｎ ｖｉｔｒｏでの評定によって確立するステップ；ｆ）ステップｃの培養物の各々についての生物学的活性を前記閾値と比較し、前記閾値を超える生物学的活性を有するものをレスポンダーとして分類し、前記閾値を超える生物学的活性を有さないものをノンレスポンダーとして分類するステップ；およびｇ）ステップａ～ｆの結果として、評価した個体数に対するレスポンダーおよびノンレスポンダーの出現頻度が分かり、ならびに前記閾値に対する、およびゼロに対する、レスポンダーの生物学的活性の大きさが分かるステップ。
【0012】
特定の態様では、閾値が生物学的活性の測定プロセスにおけるノイズであることは、当業者には理解される。閾値を確立するための方法は、１つより多くある。例えば、上で説明したように、ＰＢＭＣを前記プロセスで使用した各抗原に曝露することができ、その後の生物学的活性を測定して閾値を確立することができる。あるいは、例えば、ステップｃの培養物をステップａに含まれない抗原で抗原処理することもできる。両方のアプローチによってノイズが検出されることになり、その結果、目的の抗原に曝露される培養物がレスポンダーとして分類されるために超える必要がある閾値が確立されることになる。
【0013】
ある一定の実施形態には、病原体またはがんの免疫原性抗原を特徴づける方法があり、この方法は、多様な複数のＴ細胞を用意するまたは生成するステップであって、前記複数のＴ細胞各々が、前記病原体またはがんからの１つの抗原に特異的なものであるステップ；複数各々からの細胞からの、それらのそれぞれの抗原による抗原処理に基づく、定量可能な生物学的応答をアッセイするステップであって、前記生物学的応答の定量された出力を閾値量と比較して、複数各々からの応答の有効性および大きさを決定し、前記有効性が、前記閾値量を超える生物学的応答を有する集団内の個体の百分率である、ステップ；および複数各々からの前記応答の有効性と応答の大きさの間の数学的関係に基づいて各抗原の免疫原性を順序付けるステップを含む。
【0014】
他の実施形態では、レスポンダーの百分率およびノンレスポンダーの百分率ならびに生物学的応答の大きさをはじめとする変数を使用して抗原に値を割り当てる式であって、前記値が高いほど特定の抗原に割り当てられる免疫原性レベルが高い、式を確立する。
【0015】
他の実施形態では、レスポンダーの百分率およびノンレスポンダーの百分率ならびに生物学的応答の大きさをはじめとする変数を使用して抗原に値を割り当てる式であって、前記値が高いほど特定の抗原に割り当てられる免疫原性レベルが高い、式を確立する。
【0016】
例示的なウイルスＸ、細菌Ｙ、腫瘍Ｚの、ならびにまた例示的だが具体的なウイルス、例えば、パラインフルエンザＩＩＩ型（ＰＩＶ３）およびヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）の、免疫プロファイリング方法の例を本明細書において提供する。特定の実施形態では、ＰＩＶ３およびｈＭＰＶの多数の抗原の免疫原性をそれぞれ判定し、治療に用いる。
【0017】
特定の実施形態において、本開示の方法および組成物は、感染症、例えば、ＨＳＣＴ後の感染症を予防または処置するための、養子Ｔ細胞療法に関する。特定の事例では、本開示は、例えば、ＰＩＶ（少なくともＰＩＶ３を含む）、ｈＭＰＶ、サイトメガロウイルス、ＢＫウイルス、ヒトヘルペスウイルス６、アデノウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ＢＫウイルス、ＲＳＶ、インフルエンザ、パラインフルエンザ、ボカウイルス、コロナウイルス、ＬＣＭＶ、流行性耳下腺炎、麻疹、メタニューモウイルス、パルボウイルスＢ、ロタウイルス、ウエストナイルウイルス、ＪＣ、またはＨＨＶ７による感染症を少なくとも含む、ウイルス感染症の予防または処置のための治療法を含む。以下のファミリーの１つからのもの含む、任意のウイルス感染症からのウイルスが処置され得る：アデノウイルス科（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）、ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）、ヘパドナウイルス科（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、パポーバウイルス科（Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ）、ポリオーマウイルス科（Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ）、ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、またはトガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）。
【0018】
目的の病原体を含み得る細菌には、少なくとも次のものが含まれる：例えば、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、ヘレンセラ菌（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｈｅｎｓｅｌａｅ）、塹壕熱菌（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ Ｑｕｉｎｔａｎａ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ボレリア・ガリニ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｇａｒｉｎｉｉ）、ボレリア・アフゼリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ａｆｚｅｌｉｉ）、回帰熱ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓ）、ウシ流産菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ）、イヌ流産菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｃａｎｉｓ）、ヤギ流産菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）、ブタ流産菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｕｉｓ）、ジェジュニ菌（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、肺炎クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、オウム病クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｓｉｔｔａｃｉ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、ディフィシル菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ウルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、フェシウム菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、在郷軍人病菌（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、レプトスピラ・インターロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）、レプトスピラ・サンタロサイ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｓａｎｔａｒｏｓａｉ）、レプトスピラ・ウェイリイ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｗｅｉｌｉｉ）、レプトスピラ・ノグチイ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｎｏｇｕｃｈｉｉ）、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、らい菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・ウルセランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ）、肺炎マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ロッキー山紅斑熱リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ソンネ菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、腐性ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、ウレアプラズマ・ウレアリチカム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）、腸炎エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、または偽結核菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）。
【0019】
特定の実施形態において、本開示の方法および組成物は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質癌、副腎皮質がん、ＡＩＤＳ関連がん、カポジ肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、肛門がん、虫垂がん、星細胞腫、非定型奇形腫／ラブドイド腫瘍、基底細胞癌、胆管がん、膀胱がん、骨がん（ユーイング肉腫および骨肉腫および悪性線維性組織球腫を含む）、乳がん、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、消化管カルチノイド腫瘍、カルチノイド腫瘍、心（心臓）腫瘍、胚芽腫、胚細胞腫瘍、リンパ腫、子宮頸がん、胆管細胞癌、脊索腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄増殖性腫瘍、結腸直腸がん、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）、胚芽腫、子宮内膜がん、上衣腫、食道がん、鼻腔神経芽細胞腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、卵管がん、骨線維性組織球腫、悪性のもの、および骨肉腫、胆嚢がん、胃（Ｇａｓｔｒｉｃ）（胃（Ｓｔｏｍａｃｈ））がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣がん、精巣がん、妊娠性絨毛性疾患、神経膠腫、ヘアリー細胞白血病、頭頸部がん、心臓腫瘍、肝細胞がん、ランゲルハンス細胞組織球症、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、眼球内黒色腫、膵島細胞腫瘍、膵神経内分泌腫瘍、膵がん、カポジ肉腫、喉頭がん、喉頭乳頭腫症、白血病、口唇および口腔がん、肝がん、肺がん、非ホジキンリンパ腫、骨悪性線維性組織球腫、骨肉腫、黒色腫、眼球内黒色腫、メルケル細胞癌、皮膚がん、中皮腫、悪性中皮腫、原発不明転移性扁平上皮性頸部がん、ＮＵＴ遺伝子が関与する正中線上の癌、口のがん－頭頸部がん、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、菌状息肉症、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性腫瘍、慢性骨髄増殖性腫瘍、骨髄性白血病、慢性（ＣＭＬ）、鼻腔および副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、口腔内がん、口唇および口腔がん、中咽頭がん、口腔がん、骨肉腫、膵がん、乳頭腫症、傍神経節腫、副鼻腔および鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫、腹膜がん、前立腺がん、直腸がん、結腸直腸がん、腎細胞（腎）がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、唾液腺腫瘍、肉腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、子宮肉腫、子宮がん、血管腫瘍、セザリー症候群、皮膚がん、小細胞肺がん、小腸がん、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、扁平上皮性頸部がん、胃（Ｓｔｏｍａｃｈ）（胃（Ｇａｓｔｒｉｃ））がん、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、精巣がん、喉のがん、胸腺腫、胸腺癌、甲状腺がん、甲状腺腫瘍、腎盂および尿管の移行上皮がん、尿道がん、子宮がん、子宮内膜、子宮肉腫、膣がん、血管腫瘍、外陰がん、ワルデンストレームマクログロブリン血症（非ホジキンリンパ腫）ならびにウィルムス腫瘍からなる群から選択されるがんを含む、がんを予防または処置するための養子Ｔ細胞療法にも関する。
【0020】
他のおよびさらなる目的、特徴および利点は、本明細書の続きを読むこと、およびその一部を構成する添付の図面、または本開示のために与える本発明の現在好ましい実施形態の任意の例を参照することによって明らかになり、ひいてはより容易に理解されることになる。
【図面の簡単な説明】
【0021】
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【0023】
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【0060】
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【0063】
【0064】
【0065】
【0066】
【0067】
【発明の詳細な説明】
【0068】
本願で使用される「ａ」および「ａｎ」という語は、本特許請求の範囲および／または本明細書において「含むこと」という用語とともに使用される場合、「１つ」を意味することがあるが、「１つ以上」、「少なくとも１」および「１または１を超える」の意味とも一致する。本発明の一部の実施形態は、本発明の１つ以上の要素、方法ステップ、および／もしくは方法からなることもあり、またはそれらから本質的になることもある。本明細書に記載の任意の方法または組成物を、本明細書に記載の任意の他の方法または組成物に関して実行することができると考えられる。
【0069】
本明細書で使用される用語「生物学的活性」は、例えば、ＩＦＮガンマ、グランザイムＢ、ＩＬ２、ＴＮＦアルファなどのエフェクター分子の産生、標的細胞の特異的溶解、またはＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ２７、ＣＤ２８もしくはＣＤ１０７ａ／ｂなどの細胞表面分子の発現の生物学的変化と定義される。
【0070】
Ｉ．一般的実施形態
【0071】
本開示の一部の実施形態において、個体は、本開示の方法および／または組成物を必要としている。特定の実施形態において、個体は、易感染性である（例えば、免疫系で感染性疾患と闘う能力が何らかの理由で損なわれているまたは完全に存在しない個体と定義され得る）。特定の実施形態において、易感染性個体は、幹細胞移植を受けたことがあった、臓器移植を受けたことがあった、などである。別の特定の実施形態において、個体は、がんを有するか、またはがんを発症するリスクがある。
【0072】
本開示の実施形態は、病原体またはがんの免疫優性の階層の確立に関し、代表的な事例では、病原体は、例えば、ＰＩＶ（少なくともＰＩＶ３を含む）、ｈＭＰＶ、サイトメガロウイルス、ＢＫウイルス、ヒトヘルペスウイルス６、アデノウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ＢＫウイルス、ＲＳＶ、インフルエンザ、パラインフルエンザ、ボカウイルス、コロナウイルス、ＬＣＭＶ、流行性耳下腺炎、麻疹、メタニューモウイルス、パルボウイルスＢ、ロタウイルス、ウエストナイルウイルス、ＪＣ、またはＨＨＶ７である。がん抗原は、肺、乳房、脳、結腸、皮膚、前立腺、膵臓、子宮内膜、腎臓、卵巣、精巣、骨、脾臓、肝臓、胆嚢、甲状腺、食道、腸、膀胱、直腸、肛門、胃、頭頸部、喉、下垂体のがん、または多発性骨髄腫もしくはリンパ腫からのものであり得る。特定の実施形態において、病原体がウイルスである場合、レスポンダーとノンレスポンダーを区別するための活性の閾値の例は、ＥＬＩｓｐｏｔアッセイにおける２０ＩＦＮガンマスポット形成細胞（ＳＦＣ）／（２×１０５インプット細胞）または１０グランザイムＢ ＳＦＣ／（２×１０５インプット細胞）より上の値である。これらが、活性の閾値を定義するために使用される生物学的活性の例の代表であることは、当業者には理解される。しかし、生物学的活性を定義するための数値的閾値の例は、生物学的活性を測定するために使用されるアッセイ／ツールによって変わることがある。
【0073】
特定の実施形態では、１つ以上の定量的生物学的応答が、病原体からの抗原の免疫原性のランクの決定に用いられる。特定の実施形態では、応答は、レスポンダー対ノンレスポンダーを決定するために使用することができるレベルを含む、Ｔ細胞活性の重要なレベルを同定するために用いられる。ある一定の実施形態において、定量的生物学的応答は、特定の標的の認識に基づくＴ細胞からの化合物の産生（例えば、細胞からの分泌型産生）または発現（例えば、細胞上での膜結合型発現）である。特定の実施形態において、化合物は、ＩＬ１α、ＩＬ１β、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２（ｐ３５＋ｐ４０）、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７ａ、ＩＬ－１７Ｂ、ＩＬ－１７Ｆ、ＩＬ－１８、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３（ｐ９０＋ｐ４３）、ＩＬ－２５、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７（ｐ２８＋ＥＢＩ３）、ＩＬ－２８Ａ／Ｂ／ＩＬ２９Ａ、ＩＬ－３０（ＩＬ－２７のｐ２８サブユニット）、ＩＬ－３１、ＩＬ－３２、ＩＬ－３３、ＩＬ－３５（ｐ３５＋ＥＢＩ３）、ＴＮＦα、ＬＴα、ＬＴβ、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ２５、ＣＤ４５、ＣＤ４０Ｌ、ＦＡＳＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、４－１ＢＢＬ、ＴＲＡＩＬ、ＲＡＮＫリガンド、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮγ、ＬＩＦ、ＭＩＦ、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、および／またはＴＧＦβ３である。特定の実施形態において、化合物は、ＩＬ２、ＩＦＮγ、グランザイムＢ、ＣＤ２５、パーフォリン、ＧＭ－ＣＳＦ、および／またはＴＮＦαである。一部の実施形態において、生物学的応答は、同種抗原、例えば、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４５、ＣＤ６９および／またはＣＤ１０７での刺激に基づく１つ以上のマーカーの発現増加である。
【0074】
ＳＦＣという用語が、目的の特定の化合物を発現または分泌する細胞を同定する酵素結合免疫吸着スポット（ＥＬＩｓｐｏｔ）技術に関して用いられることは、当業者には理解される。この技術は、好適な膜上に固定化された標的タンパク質特異的抗体の使用を用いる。様々な密度で播種された目的の細胞によって産生される化合物を、その化合物を認識する一次抗体によって捕捉し、次いで、同じくその化合物に対して特異的である標識された二次標識抗体によって可視化する。この反応の列記が、本明細書において開示する、ある一定の方法のバイオマーカーである。
【0075】
ＩＩ．免疫原性抗原の同定およびその有効性の順序
【0076】
本開示の特定の実施形態は、１タイプ以上の免疫療法の作出および／または該免疫療法における利用に特に好適である免疫原性抗原（複数可）の同定に関する方法および組成物を提供する。特定の実施形態では、抗原のコレクションにおいて、該収集物から１つ以上の抗原が他の抗原（複数可）より免疫原性が高いと同定される。抗原のコレクションは、同じ実体からの多数の抗原、例えば、同じ病原体からの多数の抗原、または同じがん型からの多数の抗原（腫瘍抗原を含む）であり得る。一部の事例では、抗原のコレクションは、病原体またはがんからの可能性のある抗原の一部または大部分を含み、ある一定の事例では、抗原のコレクションは、病原体またはがんからの可能性のあるすべての抗原を含む。病原体は、例えば、ウイルス、細菌または真菌であり得る。
【0077】
一般的な実施形態では、病原体またはがんからの様々な抗原についての一連の免疫原性は、Ｔ細胞に対する抗原での少なくとも初回または２回目の抗原処理後に順序付けされ、その後、Ｔ細胞の応答の有効性を表す数値が決定され、この決定は、２回目またはその後の抗原処理後に行われる。例として、個体からのＴ細胞は、抗原のコレクションを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで抗原処理され、この初回刺激は、Ｔ細胞への曝露のためにプールされた異なる抗原、またはＴ細胞への曝露のために分離された異なる抗原のいずれかを用いて行うことができる。この刺激は、ある一定の事例では、Ｔｈ１極性化サイトカインの存在下で行われることもあり、その存在下で行われないこともある。好適な時間（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２日）後、Ｔ細胞は、２回目の抗原処理に付されるが、２回目の抗原処理では、Ｔ細胞は、分離された形の（プールされたものでない）異なる抗原に曝露される。好適な時間（例えば、１５分～７２時間）の後、Ｔ細胞の１つ以上の生物学的応答が、評価される、例えば、定量的なやり方で評価される。例えば、生物学的応答として、１つ以上の特定の化合物（例えば、細胞から産生および分泌されるもの、または細胞表面発現のために産生されるものを含む）の産生を、Ｔ細胞の活性の尺度として評定することができる。この測定は、Ｔ細胞の２回目またはその後の抗原処理後、ある一定の時間（例えば、１５分～７２時間）の後に行われ得る。
【0078】
特定の抗原についての方法の定量的出力は、１、２、またはそれを超える値の関数として特徴づけることができる。特定の実施形態において、定量的出力は、１）Ｔ細胞子孫が特定の抗原を有効に認識するドナーの数、および２）Ｔ細胞応答の大きさ（例えば、ある一定のインプットＴ細胞数あたりのＳＦＣの数）を含む。
【0079】
特定の実施形態では、Ｔ細胞が抗原に応答しているか否かの定性的判定を設定する閾値。活性の閾値を定義するためのパラメータは、上記の通り定義され、無関係の標的（目的の病原体もしくは腫瘍によって発現されない抗原）に対するまたは未操作のＰＢＭＣに対する生物学的応答を測定することによる非特異的応答レベルの決定を含む。そのとき、この非特異的応答レベルによって、レスポンダーとノンレスポンダーとを判別するためのベースラインが確立される。したがって、ある一定の実施形態では、生物学的応答の定量出力を閾値量と比較して、１つの抗原に対して特異的である複数のＴ細胞各々からの応答の有効性および大きさを判定する。少なくとも一部の事例では、有効性は、閾値量を超える生物学的応答を有する集団内の個体の百分率を包含する。閾値より大きい応答の大きさを有する細胞は、レスポンダーと見なされるのに対して、閾値未満の応答値を有するものは、ノンレスポンダーと見なされる。
【0080】
特定の実施形態では、抗原に対するＴ細胞の応答の大きさの定量的判定により確立される閾値。非特異的応答は、無関係の標的（目的の病原体もしくは腫瘍によって発現されない抗原）に対するまたは未操作のＰＢＭＣに対する生物学的活性に基づいて判定され得る。これにより、レスポンダーをノンレスポンダーと区別するための閾値が確立される。応答が、確立された非特異的応答を超えた場合、レスポンダーを示す。ノンレスポンダーは、確立された非特異的応答を超えない応答で示される。したがって、ある一定の実施形態では、生物学的応答の定量アウトプットを閾値量と比較して、１つの抗原に対して特異的である複数のＴ細胞各々からの応答の有効性および大きさが判定される。少なくとも一部の事例では、有効性は、閾値量を超える生物学的応答を有する集団内の個体の百分率を包含する。閾値より大きい応答規模を有する細胞は、レスポンダーと見なされるのに対して、閾値未満の応答値を有するものは、ノンレスポンダーと見なされる。
【0081】
Ｔ細胞応答の定量は、培養下の細胞についての細胞内で、分泌されて、または細胞表面で同定される１つ以上の変化などの、任意の好適な測定基準によって測定され得る。可溶性であるか、または不溶性である、分泌されるか、または分泌されない、ある一定の化合物の産生が測定され得る。そのような化合物は、いかなる種類のものであってもよいが、特定の実施形態では、それらはサイトカインである。測定する具体的化合物の例としては、ＩＬ１α、ＩＬ１β、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２（ｐ３５＋ｐ４０）、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７ａ、ＩＬ－１７Ｂ、ＩＬ－１７Ｆ、ＩＬ－１８、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３（ｐ９０＋ｐ４３）、ＩＬ－２５、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７（ｐ２８＋ＥＢＩ３）、ＩＬ－２８Ａ／Ｂ／ＩＬ２９Ａ、ＩＬ－３０（ＩＬ－２７のｐ２８サブユニット）、ＩＬ－３１、ＩＬ－３２、ＩＬ－３３、ＩＬ－３５（ｐ３５＋ＥＢＩ３）、ＴＮＦα、ＬＴα、ＬＴβ、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＦＡＳＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、４－１ＢＢＬ、ＴＲＡＩＬ、ＲＡＮＫリガンド、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮγ、ＬＩＦ、ＭＩＦ、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、およびこれらの組み合わせが挙げられる。細胞表面表現型変化を評価する場合、例えば、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１６、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３１、ＣＤ３８、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ９５、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７および／またはＫＬＲＧ－１の発現レベルを測定することができる。一部の事例では、細胞内および細胞外変化が評定され、そのような変化は、例えば、ＩＬ－１β、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ１２、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＴＧＦβ、ＣＤ１０７および／またはＧＭ－ＣＳＦの産生／発現を含み得る。
【0082】
特定の実施形態において、レスポンダーの百分率とノンレスポンダーの百分率は、生物学的応答を惹起するためのものである所望の薬剤への曝露に応答してのものであった生物学的活性の大きさとの数学的関係に用いられ、前記生物学的活性は、特定の実施形態ではＩＦＮガンマＳＦＣの測定値を表し得る。特定の事例では、数学的関係は、レスポンダーの百分率と応答の大きさの積のノンレスポンダーの百分率に対する比として含む。特定の事例では、数学的関係は、１を加えたレスポンダーの百分率と応答の大きさを掛けたものを１を加えたノンレスポンダーの百分率で割ったものである。
【0083】
特定の実施形態において、レスポンダーの百分率およびノンレスポンダーの百分率は、生物学的活性の大きさとの数学的関係（特定の実施形態ではＩＦＮガンマの測定値を表し得る）に用いられる。特定の事例では、数学的関係は、ノンレスポンダーの百分率に対する比としての、レスポンダーの百分率と応答の大きさの積を含む。特定の事例では、数学的関係は、ノンレスポンダーの百分率＋１で割った、（レスポンダーの百分率＋１）と応答の規模の積である。
【0084】
特定の実施形態において、特定の生物学的測定値についてのレスポンダーの百分率と応答の大きさの数学的関係は、数式で表される。１つより多くの式が適用可能であり得るが、特定の実施形態における式は、次の通りである：
【0085】
【数1】
【0086】
この数学的関係からの値を各抗原について決定したら、各抗原についての値を比較し、階層、例えば、有効性が最も高い抗原から有効性が最も低い抗原への階層に順序付けることができる。この免疫原性スペクトラムは、最も好適な抗原（複数可）、例えば、免疫療法で使用されることになる最も好適な抗原（複数可）を選択する必要があるユーザーに情報を提供する。特定の実施形態では、この方法の使用に従って、免疫療法に抗原（複数可）として使用されることになる可能性のある抗原のコレクションから、最も有効な抗原のうちの１、２、３、またはそれより多くを選択することができる。特定の実施形態では、前記方法の出力に従って最も免疫原性の高い抗原のみを選択するが、他の事例では、前記方法の出力に従って２、３、４以上の最も免疫原性の高い抗原を選択することもある。特定の事例では、前記方法の出力に従って最も免疫原性の高い抗原を、前記方法の出力に従って２番目に免疫原性の高い抗原、前記方法の出力に従って３番目に免疫原性の高い抗原、および／または前記方法の出力に従って４番目に免疫原性の高い抗原などに加えて、選択することもある。本開示の方法で同定される最も有効な抗原（複数可）を用いる免疫療法は、ワクチン、免疫原性組成物、養子Ｔ細胞移植などをはじめとする、いかなる種類のものであってもよい。
【0087】
ある一定の実施形態では、病原体に関連する病状を有する個体、または病原体に対して血清反応陽性である個体、またはがんを有するもしくはがんのリスクがある個体に、本明細書に記載の免疫原性抗原を特徴づける方法に基づいて設計された免疫療法の治療有効量を与えることができる。
【0088】
例示的病原体の免疫原性抗原の同定およびそれらの免疫原性／有効性の順序付けについての具体的な例は、後段の実施例セクションで提供する。
【0089】
ＩＩＩ．免疫細胞とそれらの臨床的有効性との数学的および他の相関
【0090】
本開示の特定の実施形態には、ある一定の免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞またはＮＫ Ｔ細胞の有効性を判定するために用いられる方法および組成物がある。前記細胞は、上で説明したような抗原免疫優性の階層の判定に基づいて改変されることもあり、またはされないこともある。特定の実施形態において、細胞産物の生物学的特徴は、臨床的有効性をはじめとする有効性と相関している。
【0091】
特定の実施形態において、Ｔ細胞は、抗原、例えば、病原性またはがん（腫瘍を含む）抗原（複数可）での初回および／または２回目またはその後の刺激に基づいて産生される。Ｔ細胞の特異性および細胞傷害性を測定して、ある一定の複数の抗原特異的Ｔ細胞についての臨床的有効性の見通しを得てもよい。その際、Ｔ細胞についての１つ以上の生物学的測定値、例えば、細胞からの分泌化合物の量および／または細胞上の細胞表面マーカーの量が評定される。１つ以上の生物学的測定値は、細胞内のものであってもよく、または細胞表面でのものであってもよい。測定は、１回以上の刺激へのＴ細胞の曝露後、ある一定の時間の後、例えば、１回以上の刺激後７２時間以内だが約１５分以内に行われ得る。
【0092】
特定の実施形態において、そのようなＴ細胞の生物学的測定値は、関係のない実体、例えば、関係のないまたは無関係の標的（例えば、目的の特定の病原体またはがんに存在しない抗原）についての値と比較され得る。少なくともある一定の例において、関係のない実体は、未操作のＰＢＭＣを含む、未操作の細胞である。少なくともある一定の事例において、所与の抗原に対するレスポンダーの百分率は、問題のＴ細胞についての生物学的測定値と未操作の細胞対応物の値の比を使用して決定される。特定の事例において、所与の抗原に対するレスポンダーの百分率は、細胞についての生物学的測定値を、未操作の細胞対応物の生物学特性の値で割ることによって決定される。少なくとも一部の実施形態では、そのような計算により、結果が１以上であった場合、Ｔ細胞がその方法で検定された個体はレスポンダーと見なされ、計算結果が１未満であった場合には、Ｔ細胞がその方法で検定された個体はノンレスポンダーと見なされる。
【0093】
Ｔ細胞に対する特異性に関して、抗原への細胞の曝露後に、例えば、抗原への少なくとも２回の別々の曝露に伴ってある一定の化合物を産生する細胞の能力を検定することができる。特定の実施形態において、特異的病原体またはがんのすべての抗原に指向された化合物産生スポット形成細胞（ＳＦＣ）の合計が、測定されることになる細胞の化合物の産生によって決まる、ＳＦＣ／（２×１０５インプット細胞）のある一定の値以上である場合、細胞は特異的と見なされる。例えば、ＩＦＮγ産生については応答を測定するためのベースラインは、≧２０ＳＦＣ／（２×１０５インプット細胞）であるが、グランザイムＢについては応答を測定するためのベースラインは、≧１０ＳＦＣ／（２×１０５インプット細胞）である。
【0094】
細胞の細胞傷害性の測定に関して、細胞傷害性は、共培養アッセイ、抗原負荷／発現標的の非放射性および放射性標識を含む標準的な殺滅アッセイによって判定され得る。１つの特定の実施形態は、クロム放出アッセイを含み、このアッセイでは、Ｔ細胞がエフェクターとして利用され、標的が問題の抗原をパルスしたクロム標識自家ＰＨＡブラストである。エフェクター対標的比は、５：１、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、５５：１；６０：１、６５：１、７０：１、７５：１、８０：１、８５：１、９０：１、または９５：１などであり得る（または少なくとも前記比であってもよく、または前記比以下であってもよい）。細胞は、関連抗原をパルスしたＰＨＡブラストの特異的溶解の百分率が、無関係のＴ細胞産物または未操作ＰＢＭＣによって媒介される溶解より高い場合、特定の病原体または腫瘍抗原に対して細胞傷害性であると見なされ得る。一部の状況では、このアッセイにおける活性の閾値は、（例えば、関係のないペプチド（例えば、目的の病原体にも目的の腫瘍にも存在しないペプチド）を発現する標的細胞の非特異的殺滅の百分率を減算した後）４０：１のエフェクター対標的比で１０％特異的溶解と考えることができる。
【0095】
特定の複数の抗原特異的Ｔ細胞についての臨床的有効性は、抗原特異性および／または細胞傷害性の関数として数学的に決定され得る。特定の実施形態において、細胞の有効性の定量的値は、抗原特異的Ｔ細胞および未操作の対照細胞、例えば未操作のＰＢＭＣ、についての生物学的測定値を用い、かつ特異的殺滅についての値を用いる、数学的関係によって得られる。
【0096】
抗原特異性および細胞傷害性を考慮する具体的な数式の一例として、次のものが挙げられる：
【0097】
【数2】
【0098】
－ 式中、ＲＴＢは、［（Ｔｂｉｏ－Ｐ）＋１］／［（Ｔｂｉｏ－Ｕ）＋１］と定義され、この式が≧１の場合、ＲＴＢ値は１に相当し、＜１の場合、ＲＴＢ値は０に対応し；および
【0099】
－ ＲＴＫは、［ＴＳｐｅｃ－Ｐ／ＴＣＳｐｅｃ］と定義され、この式が≧１の場合、ＲＴＫ値は１に相当し、＜１の場合、ＲＴＫ値は０に対応する（図３８を参照されたい）。
【0100】
Ｔｂｉｏ－Ｐは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔ細胞産物の生物学的特性（複数可）と定義され、Ｔｂｉｏ－Ｕは、未操作のＰＢＭＣまたは無関係の抗原の生物学的特性（複数可）である。ＴＳｐｅｃ－Ｐ、すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔ細胞産物の特異的殺滅能力は、予め定義されたエフェクター対標的比（例えば、４０：１ エフェクター対標的比）で同種抗原を発現する溶解されたＨＬＡ適合標的細胞の百分率であって、無関係のペプチド、すなわち、予め定義されたエフェクター対標的比で目的の病原体内にも目的の腫瘍内にも存在しない抗原またはマーカー、を発現する標的細胞の未操作のＰＢＭＣによる非特異的殺滅の百分率（ＴＣＳｐｅｃ）を減算した後の百分率と定義される。
【0101】
特定の実施形態において、上で言及した式について（ＲＴＢ）＋（ＲＴＫ）の計算が１以上である場合には、検定しているＴ細胞の集団は、臨床的に効果があることになる。そのような細胞を、治療有効量で、それを必要とする個体に投与してもよい。上で言及した式について（ＲＴＢ）＋（ＲＴＫ）の計算が１未満である場合、検定しているＴ細胞の集団は、臨床的に効果がないことになる。そのような細胞を、治療有効量で、それを必要とする個体に投与しなくてもよい。
【0102】
改変免疫細胞とそれらの臨床的有効性との数学的相関の具体的な例は、後段の実施例セクションで提供する。
【0103】
最後に、多数の産物が、式（ＲＴＢ）＋（ＲＴＫ）≧１による定義に従って臨床用途に利用可能である場合には、バイナリ出力への変換前に生数値データ（ＲＴＢおよび／またはＲＴＫ）を使用して産物をランク付けすることができる。あるいは、補足式α（ＲＴＢ）＋β（ＲＴＫ）＝φを適用することもできる。この補足式中、ファイは、臨床的有効性変数と定義される（この値が高いほど「良好な」産物である）。
【0104】
【数3】
【0105】
式中、ＲＴＢは、［（Ｔｂｉｏ－Ｐ）＋１］／［（Ｔｂｉｏ－Ｕ）＋１］から得られる値と定義される
【0106】
式中、ＲＴＫは、［（％ＴＳｐｅｃ－Ｐ）／ＴＣＳｐｅｃ］から得られる値と定義される
【0107】
式中、αおよびβは、変数に依存する重み付け係数と定義され、前記変数には、治療応用、製造プロセス、ペプチド混合物、細胞株などが含まれるが、これらに限定されない
【0108】
式中、φは、治療用産物間の臨床的有効性のランキングを決定するために使用され得る臨床有効性値と定義される
【0109】
ＩＶ．抗原特異的Ｔ細胞を生成する方法
【0110】
特定の実施形態において、本開示は、病原体（ウイルス、細菌もしくは真菌を含む）からの少なくとも１つの抗原を標的にする、または腫瘍抗原を含む他の疾患関連抗原を標的にする、抗原特異的Ｔ細胞の発生に関する。本開示のある一定の態様において、本開示は、例えば、少なくとも１つのウイルスからの抗原を標的にする抗原特異的Ｔ細胞の発生に関する。
【0111】
一実施形態では、健常ドナーが試料、例えば、血液試料、またはロイコパックの白血球アフェレーシス産物を提供する。ＰＢＭＣが採取され、病原体全体または病原体の１つ以上の部分に曝露される。細胞は、１つ以上のサイトカインに曝露されることもある。培養下で少なくとも４８時間後、細胞は、多数のチューブに分割され、個々の抗原で再抗原処理される。細胞は、１つ以上のサイトカインに曝露されることもある。
【0112】
本開示の実施形態は、１つ以上の病原体またはがん抗原に対する特異性を有する抗原特異的Ｔ細胞株の生成に関する。ある一定の実施形態において、そのような特異的を有する抗原特異的Ｔ細胞の生成は、そのような株の調製には樹状細胞を用いないが、代替実施形態では、樹状細胞を標準的な方法で用いる。一部の事例では、抗原は、該抗原の一部またはすべてにわたる１つ以上のペプチドの形態で、ＰＢＭＣに提示される。抗原特異的ペプチドは、ｐｅｐｍｉｘと呼ばれることもあるペプチド混合物のライブラリーの状態でＰＢＭＣに供給されることもある。本開示の他の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞の調製において、本開示により様々なｐｅｐｍｉｘをプールすることが可能になる。
【0113】
本開示の一部の実施形態では、本明細書に含まれているような抗原選択方法に続いて、１つ、２つ、またはそれを超えるウイルスからの少なくとも１つ、２つ、またはそれを超える抗原を標的にする抗原特異的Ｔ細胞を生成する方法があり、この方法は、複数の末梢血単核細胞と、特定のウイルス抗原に対応するペプチドを各々が含む少なくとも２つのペプチドライブラリーとを接触させるステップ；および１つ以上のサイトカインの存在下で前記複数の細胞を増殖させるステップを含む。特定の実施形態において、前記方法は、抗原特異的Ｔ細胞を増殖させるステップの前に、単離されたペプチドパルス樹状細胞にライブラリーを曝露するステップが存在しない状態で行われる。ある一定の実施形態において、１つ以上のサイトカインは、ＩＬ４、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ２１、ＩＬ１５、ＩＬ６およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。一部の実施形態において、ペプチドは、ウイルス抗原の一部またはすべてにわたるような配列が重複しているペプチドとさらに定義される。例えば、ある一定の態様において、ペプチドは、少なくとも３、４、５または６つのアミノ酸が重複しており、一部の実施形態において、ペプチドは、長さが少なくとも６、７、または８アミノ酸以上である。
【0114】
本開示の少なくとも一部の方法において、該方法によって生成される抗原特異的Ｔ細胞は、個体、例えば、易感染性個体に投与される。一部の事例では、個体は、自家幹細胞移植を受けたことがある。特定の実施形態において、細胞は、例えば、静脈内、筋肉内、皮内、皮下、腹腔内注射などのような、注射によって投与される。一部の実施形態において、個体は、リンパ腫または白血病を有する。一部の実施形態において、抗原特異的Ｔ細胞は、さらに、ポリクローナルＣＤ４＋およびＣＤ８＋抗原特異的Ｔ細胞と定義される。ＰＢＭＣは、個体にとって同種異系のものであってもよく、または個体にとって自家のものであってもよい。
【0115】
個体における感染症（または感染症のリスク、または感染症に対する易罹患性）は、いかなる種類の病原体からのものであってもよいが、特定の実施形態において、感染症は、１つ以上のウイルスの結果である。病原性ウイルスは、いかなる種類のものであってもよいが、特定の実施形態では、次の科のうちの１つからのものである：アデノウイルス科、ピコルナウイルス科、ヘルペスウイルス科、ヘパドナウイルス科、フラビウイルス科、レトロウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、パポーバウイルス科、ポリオーマウイルス、ラブドウイルス科、アレナウイルス科（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）、カリシウイルス科（ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ）、コロナウイルス科（ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）、パルボウイルス科（ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）、レオウイルス科（ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）、ポックスウイルス科（ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）またはトガウイルス科。一部の実施形態において、ウイルスは、免疫優性もしくは準優性である抗原を産生するか、または両方の種類を産生する。特定の事例では、ウイルスは、ＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、ＢＫウイルス、ＨＨＶ６、ＲＳＶ、インフルエンザ、パラインフルエンザ、ボカウイルス、コロナウイルス、ＬＣＭＶ、流行性耳下腺炎、麻疹、メタニューモウイルス、パルボウイルスＢ、ロタウイルス、ウエストナイルウイルス、スペイン風邪、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【0116】
一部の態様において、感染症は、病原性細菌の結果であり、本開示は、あらゆるタイプの病原性細菌に適用可能である。例示的な病原性細菌としては、少なくとも、例えば、炭疽菌、セレウス菌、ヘレンセラ菌、塹壕熱菌、百日咳菌、ボレリア・ブルグドルフェリ、ボレリア・ガリニ、ボレリア・アフゼリ、回帰熱ボレリア、ウシ流産菌、イヌ流産菌、ヤギ流産菌、ブタ流産菌、ジェジュニ菌、肺炎クラミジア、トラコーマクラミジア、オウム病クラミジア、ボツリヌス菌、ディフィシル菌、ウルシュ菌、破傷風菌、ジフテリア菌、エンテロコッカス・フェカリス、フェシウム菌、大腸菌、野兎病菌、インフルエンザ菌、ピロリ菌、在郷軍人病菌、レプトスピラ・インターロガンス、レプトスピラ・サンタロサイ、レプトスピラ・ウェイリイ、レプトスピラ・ノグチイ、リステリア菌、らい菌、結核菌、マイコバクテリウム・ウルセランス、肺炎マイコプラズマ、淋菌、髄膜炎菌、緑膿菌、ロッキー山紅斑熱リケッチア、チフス菌、ネズミチフス菌、ソンネ菌、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、腐性ブドウ球菌、ストレプトコッカス・アガラクチア、肺炎球菌、化膿性連鎖球菌、梅毒トレポネーマ、ウレアプラズマ・ウレアリチカム、コレラ菌、ペスト菌、腸炎エルシニア、または偽結核菌が挙げられる。
【0117】
一部の態様において、感染症は、病原性真菌の結果であり、本開示は、あらゆるタイプの病原性真菌に適用可能である。例示的な病原性真菌としては、少なくとも、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、コウジカビ属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ヒストプラズマ属（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）、ニューモシスチス属（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ）、スタキボトリス属（Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ）、ブラストミセス属（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ）、コクシジオイデス属（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）、クラドスポリウム属（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）、エクスセロフィルム属（Ｅｘｓｅｒｏｈｉｌｕｍ）、ペニシリウム・マルネッフェイ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍａｒｎｅｆｆｅｉ）、ムコール真菌類（ｍｕｃｏｒｍｙｃｅｔｅｓ）、スポロトリクス属（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ）、または白癬（Ｔｉｎｅａ）が挙げられる。
【0118】
本開示の一部の実施形態において、個体は、がんのリスクがあることもあり、またはがんを有することもあり、本開示は、あらゆる型のがんに適用可能である。がんは、いかなる種または起源のものであってもよいが、特定の実施形態では、次の型のものである：癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、黒色腫、脳および脊髄腫瘍、胚細胞腫瘍、芽細胞腫、神経内分泌腫瘍、カルチノイド腫瘍および良性腫瘍。特定の事例では、がんは、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質癌、副腎皮質がん、ＡＩＤＳ関連がん、カポジ肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、肛門がん、虫垂がん、星細胞腫、非定型奇形腫／ラブドイド腫瘍、基底細胞癌、胆管がん、膀胱がん、骨がん（ユーイング肉腫および骨肉腫および悪性線維性組織球腫を含む）、乳がん、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、消化管カルチノイド腫瘍、カルチノイド腫瘍、心（心臓）腫瘍、胚芽腫、胚細胞腫瘍、リンパ腫、子宮頸がん、胆管細胞癌、脊索腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄増殖性腫瘍、結腸直腸がん、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）、胚芽腫、子宮内膜がん、上衣腫、食道のもの、感覚神経芽細胞腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、卵管がん、骨線維性組織球腫、悪性のもの、および骨肉腫、胆嚢がん、胃（Ｇａｓｔｒｉｃ）（胃（Ｓｔｏｍａｃｈ））がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣がん、精巣がん、妊娠性絨毛性疾患、神経膠腫、ヘアリー細胞白血病、頭頸部がん、心臓腫瘍、肝細胞がん、ランゲルハンス細胞組織球症、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、眼球内黒色腫、膵島細胞腫瘍、膵神経内分泌腫瘍、膵がん、カポジ肉腫、喉頭がん、喉頭乳頭腫症、白血病、口唇および口腔がん、肝がん、肺がん、非ホジキンリンパ腫、骨悪性線維性組織球腫、骨肉腫、黒色腫、眼球内黒色腫、メルケル細胞癌、皮膚がん、中皮腫、悪性中皮腫、原発不明転移性扁平上皮性頸部がん、ＮＵＴ遺伝子が関与する正中線上の癌、口のがん－頭頸部がん、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、菌状息肉症、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性腫瘍、慢性骨髄増殖性腫瘍、骨髄性白血病、慢性（ＣＭＬ）、鼻腔および副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、口腔内がん、口唇および口腔がん、中咽頭がん、口腔がん、骨肉腫、膵がん、乳頭腫症、傍神経節腫、副鼻腔および鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫、腹膜がん、前立腺がん、直腸がん、結腸直腸がん、腎細胞（腎）がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、唾液腺腫瘍、肉腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、子宮肉腫、子宮がん、血管腫瘍、セザリー症候群、皮膚がん、小細胞肺がん、小腸がん、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、扁平上皮性頸部がん、胃（Ｓｔｏｍａｃｈ）（胃（Ｇａｓｔｒｉｃ））がん、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、精巣がん、喉のがん、胸腺腫、胸腺癌、甲状腺がん、甲状腺腫瘍、腎盂および尿管の移行上皮がん、尿道がん、子宮がん、子宮内膜、子宮肉腫、膣がん、血管腫瘍、外陰がん、ワルデンストレームマクログロブリン血症（非ホジキンリンパ腫）ならびにウィルムス腫瘍からなる群から選択される。
【0119】
本開示の一部の実施形態において、ペプチドのライブラリーは、抗原特異的Ｔ細胞を最終的に生成するためにＰＢＭＣに供給される。ライブラリーは、特定の事例では、同じ抗原の一部またはすべてにわたるペプチドの混合物（「ｐｅｐｍｉｘ」）を含む。本開示において用いられるｐｅｐｍｉｘは、市販のペプチドライブラリー、例えば、ある一定の態様では、１５アミノ酸長であり、１１のアミノ酸が互いに重複している、ペプチドで構成されている市販のペプチドライブラリーからのものであり得る。場合により、それらを商業的に入手してもよく、または合成により生成してもよい。例としては、ＪＰＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｔｉｅｓ（バージニア州、スプリングフィールド）またはＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ（カリフォルニア州、オーバーン）からのものが挙げられる。特定の実施形態において、ペプチドは、例えば、長さが少なくとも７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５アミノ酸以上であり、特定の実施形態では、例えば、長さが少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３または３４アミノ酸の重複がある。異なるペプチドの混合物は、いかなる比の、異なるペプチドを含んでいてもよいが、一部の実施形態では、特定のペプチド各々が混合物中に別の特定のペプチドと実質的に同数で存在する。
【0120】
特定の実施形態において、本開示に関する任意の種類の細胞を単独の好適な培地において培養してもよく、またはサイトカインが補足された好適な培地において培養してもよく、およびガス透過性培養デバイス（例えば、Ｇ－Ｒｅｘ１０（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ミネソタ州、ニューブライトン）、他の培養装置、バイオリアクターもしくはシステムまたは組織培養プレート）で培養してもよい。培地および／またはサイトカインを補充してもよく、培養物を好適な期間の後、分割してもよい。特定の実施形態では、例えばＩＬ７、ＩＬ４、ＩＬ１５、ＩＬ１２、ＩＬ２１および／またはＩＬ２を含む、１つ以上の特定のサイトカインが用いられる。
【0121】
Ｔ細胞を調製する実施形態は、複数の末梢血単核細胞を１つ、２つ、またはそれを超えるペプチドライブラリーと接触させるステップであって、前記ペプチドライブラリー（単数または複数）の各々が、１つ以上の特定の抗原に対応するペプチドを含むものである、ステップと；前記複数の細胞を、１つ以上のサイトカイン、任意選択的にＩＬ４、ＩＬ１５、ＩＬ２１、ＩＬ１２、ＩＬ６および／またはＩＬ７の存在下で増殖させるステップとを含み得る。
【0122】
Ｖ．本開示のキット
【0123】
本明細書に記載のいずれの組成物も、キットに含まれることがある。非限定的な例では、細胞、サイトカイン、試料抽出器具、細胞培養培地、細胞培養フラスコ、ペプチド、タンパク質、ウイルスおよび／または他の試薬がキットに含まれることがある。
【0124】
キットは、本開示において用いられる適切に小分けされた組成物を含み得る。キットの組成物は、水性培地中に入っている状態または凍結乾燥形態のいずれかで包装され得る。キットの容器手段は、成分を入れること、好ましくは、適切に小分けすることができる、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、瓶、注射器または他の容器手段を一般に含むことになる。キット内に１つより多くの成分が存在する場合、キットは、追加の成分を別々に入れることができる第２の、第３のまたは他の追加の容器も一般に含むことになる。しかし、成分の様々な組み合わせがバイアルに含まれることもある。本開示のキットは、商業販売のために厳重に密封された状態で組成物を収容する手段も概して含むことになる。そのような容器としては、所望のバイアルが保持される射出またはブロー成形プラスチック容器を挙げることができる。特定の実施形態において、キットは、血液細胞および／または骨髄細胞を採取するための１つ以上の手段を含む。
【0125】
キットの成分が１つおよび／またはそれを超える溶液の状態で備えられている場合、その溶液は、水溶液であり、滅菌水溶液が特に好ましい。組成物は、注射用組成物に製剤化されることもある。その場合、容器手段自体が、注射器、ピペットおよび／または他のそのような器具であってもよく、それ（それら）から製剤を身体の患部に適用すること、動物に注射すること、ならびに／またはさらにはキットの他の成分に適用および／もしくはキットの他の成分と混合することができる。しかし、キットの成分は、乾燥粉末（複数可）として備えられていることもある。試薬および／または成分が乾燥粉末として備えられている場合、粉末を好適な溶媒の添加によって再構成することができる。前記溶媒が別の容器手段に備えられてもよいことが想定される。
【実施例】
【0126】
本明細書で提供する実施例は、本開示の特定の実施形態を実証するために含めるものである。以下の実施例において開示する技術が、本発明の実施に当たってよく機能することを本発明者が見いだした技術の代表であること、したがって、その実施の好ましい方式に相当すると考えることができることは、当業者には理解されるはずである。しかし、本開示の趣旨および範囲から逸脱することなく、開示する特定の実施形態に多くの変更を加え、なお同様のまたは類似の結果を得ることができることは、本開示にかんがみて当業者には理解されるはずである。
【実施例1】
【0127】
［免疫原性抗原同定および臨床的有効性との相関］
特定の実施形態において、本開示は、免疫原性であり、重要な治療応用形態がある、病原体（ウイルス、細菌もしくは真菌）および／またはがんに由来する抗原を同定するためのプロセスに関する。ある一定の態様において、このプロセスは、ウイルスなどの生物全体の一部またはすべてを、抗原として知られるフラグメントに区分すること、および有意な治療用抗原標的のランクを確立することを含む。次いで、この情報を使用して、ワクチン、養子細胞療法またはこれらの任意の組み合わせなどの処置の開発のために生物における特に有用なフラグメント（複数可）またはフラグメントの組み合わせを選択することができる。重要なこととして、このプロセスは、免疫原性抗原の同定を含み、したがって、エピトープ／ＨＬＡ限定レベルで機能し得る以前の方法とは異なり、単一のＨＬＡ型に限定されない。
特定の実施形態において、本開示は、免疫原性であり、重要な治療応用形態がある、病原体（ウイルス、細菌もしくは真菌）および／またはがんに由来する抗原を同定するためのプロセスに関する。ある一定の態様において、このプロセスは、ウイルスなどの生物全体の一部またはすべてを、抗原として知られるフラグメントに区分すること、および有意な治療用抗原標的のランクを確立することを含む。次いで、この情報を使用して、ワクチン、養子細胞療法またはこれらの任意の組み合わせなどの処置の開発のために生物における特に有用なフラグメント（複数可）またはフラグメントの組み合わせを選択することができる。重要なこととして、このプロセスは、免疫原性抗原の同定を含み、したがって、エピトープ／ＨＬＡ限定レベルで機能し得る以前の方法とは異なり、単一のＨＬＡ型に限定されない。
【0128】
この一例としては、ウイルスＸがＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦという名の６つのフラグメント、すなわち抗原、に区分される下記のシナリオ（図１）を挙げることができよう。その場合、ウイルスＸのこれらのフラグメント化された成分を使用して、健常個体から単離されたＰＢＭＣまたはＴ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激を行う（この刺激は、一緒にプールされたこれらのフラグメントを用いて行うこともでき、または個別にプールされたこれらのフラグメントを用いて行うこともできる）。この実施例では、ウイルスＸに対して血清反応陽性の１００名（例えば、最低限５名で上限なし）の健常個体から採取したＴ細胞を、個別のまたはプールされたフラグメント化標的とともに１０日間（例えば、６～１４日の範囲）、Ｔｈ１極性化サイトカインの存在下、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した。この初回Ｔ細胞抗原処理後、Ｔ細胞を抽出し、再び抗原処理したが、このときは個別のフラグメント（抗原）のみで抗原処理した。この２回目の抗原処理後、Ｔ細胞をそれらの応答について評定した。Ｔ細胞応答を評定するための１つの方法は、ＩＦＮγ産生を評価することであるが、Ｔ細胞応答を評価するための他の方法は公知であり、それらを使用することができる。この実施例では、ＩＦＮγ ＥＬＩｓｐｏｔを使用してＩＦＮγ産生を評定した。次いで、この情報を処理して、レスポンダー対ノンレスポンダーの閾値、および応答の大きさを決定することができる。異なる病原体（ウイルスを含む）およびがんについての活性の閾値（ベンチマークと称されることもある）は、測定した各生物学的活性について同じ値であることもあることもあり、または同じ値でないこともある。例えば、異なるウイルスは、ＩＦＮγ産生を測定するために２０ＳＦＣ／２×１０５のような閾値を用いることができる。別の例として、異なるウイルスは、グランザイムＢを測定するために１０ＳＦＣ／２×１０５のような閾値を用いることができる。
【0129】
この技術を使用して、レスポンダーの閾値を、２×１０５インプットＴ細胞あたり３０より上のＳＦＣ値であると決定した。生物学的活性についての応答の閾値は、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９５０、９７５、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、またはそれを超えるＳＦＣ／２×１０５であり得る（または少なくとも前記値であってもよく、または前記値以下であってもよい）。
【0130】
図１に示すようなこれらの結果の一例を以下に示す：
【0131】
抗原Ａは、ドナーの８０％（ｎ＝８０）によって認識され、５００ＳＦＣ／（２×１０５インプットＴ細胞）の平均値を有した。
【0132】
抗原Ｂは、ドナーの７０％（ｎ＝７０）によって認識され、２００ＳＦＣ／（２×１０５インプットＴ細胞）の平均値を有した。
【0133】
抗原Ｃは、ドナーの３０％（ｎ＝３０）によって認識され、１００ＳＦＣ／（２×１０５インプットＴ細胞）の平均値を有した。
【0134】
抗原Ｄは、ドナーの９０％（ｎ＝９０）によって認識され、４５０ＳＦＣ／（２×１０５インプットＴ細胞）の平均値を有した。
【0135】
抗原Ｅは、ドナーの８０％（ｎ＝８０）によって認識され、１０００ＳＦＣ／（２×１０５インプットＴ細胞）の平均値を有した。
【0136】
抗原Ｆは、ドナーの３０％（ｎ＝３０）によって認識され、５０ＳＦＣ／（２×１０５インプットＴ細胞）の平均値を有した。
【0137】
次に免疫優性の階層を定義するために、本発明者らは、応答するドナーの出現頻度と反応性Ｔ細胞の数の両方を考慮に入れるＴＣ（Ｔ細胞）検定を開発した。式は、次の通りである：
【0138】
【数4】
【0139】
かくて、図２に示すようにＴＣスコアを標的抗原の各々に適用される。この式を使用して、例えば、抗原Ａに１９２８．５のスコアが適用され、抗原Ｂに４５８．１のスコアが適用され、抗原Ｃに４３．６のスコアが適用され、抗原Ｄに３７２２．７のスコアが適用され、抗原Ｅに３８５７．１のスコアが適用され、抗原Ｆに２１．８のスコアが適用される。したがって、これらの抗原を次の免疫優性階層に編成することができる：
【0140】
Ｅ＞Ｄ＞Ａ＞Ｂ＞Ｃ＞Ｆ
【0141】
したがって、下記は、ウイルスＸに感染した患者に防御免疫を与えるための、所望の標的または標的の組み合わせの同定を表すものである（図３、４および５）：
【0142】
（ａ）最も免疫優性度の高い標的抗原（抗原Ｅ）
【0143】
（ｂ）２つの最も免疫優性度の高い標的の組み合わせ（Ｅ＋Ｄ）
【0144】
（ｃ）３つの最も免疫優性度の高い標的の組み合わせ（Ｅ＋Ｄ＋Ａ）
【0145】
（ｄ）４つの最も免疫優性度の高い標的の組み合わせ（Ｅ＋Ｄ＋Ａ＋Ｂ）
【0146】
（ｅ）５つの最も免疫優性度の高い標的の組み合わせ（Ｅ＋Ｄ＋Ａ＋Ｂ＋Ｃ）
【0147】
（ｆ）６つの最も免疫優性度の高い標的の組み合わせ（Ｅ＋Ｄ＋Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｆ）
【0148】
上で説明した方法を、これらに限定されるものではないが細菌、寄生虫および真菌を含む、ウイルス以外の病原体、ならびに腫瘍に応用することができることに注目することが重要である。
【0149】
したがって、上で説明したプロセスの第２の例として、細菌Ｙが、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨという名の８つのフラグメント、すなわち抗原、に区分される、下記のシナリオを挙げることができよう。上で説明したプロセスを用いたときの、図６に示すような細菌Ｙについての結果の例を、以下に示す：
【0150】
抗原Ａは、ドナーの９０％（ｎ＝９０）によって認識され、２０ＳＦＣ／（２×１０５インプットＴ細胞）の平均値を有した。
【0151】
抗原Ｂは、ドナーの５０％（ｎ＝５０）によって認識され、８００ＳＦＣ／（２×１０５インプットＴ細胞）の平均値を有した。
【0152】
抗原Ｃは、ドナーの７０％（ｎ＝７０）によって認識され、１０００ＳＦＣ／（２×１０５インプットＴ細胞）の平均値を有した。
【0153】
抗原Ｄは、ドナーの３０％（ｎ＝３０）によって認識され、３００ＳＦＣ／（２×１０５インプットＴ細胞）の平均値を有した。
【0154】
抗原Ｅは、ドナーの２０％（ｎ＝２０）によって認識され、１５０ＳＦＣ／（２×１０５インプットＴ細胞）の平均値を有した。
【0155】
抗原Ｆは、ドナーの６０％（ｎ＝６０）によって認識され、６００ＳＦＣ／（２×１０５インプットＴ細胞）の平均値を有した。
【0156】
抗原Ｇは、ドナーの４０％（ｎ＝４０）によって認識され、４５０ＳＦＣ／（２×１０５インプットＴ細胞）の平均値を有した。
【0157】
抗原Ｈは、ドナーの８０％（ｎ＝８０）によって認識され、５０ＳＦＣ／（２×１０５インプットＴ細胞）の平均値を有した。
【0158】
図７に示すように、ＴＣ検定を用い、ＴＣスコアを細菌Ｙ標的抗原の各々に適用して、免疫優性の階層を決定した。例えば、抗原Ａに１６７．４５のスコアが適用され、抗原Ｂに８００のスコアが適用され、抗原Ｃに２２９０．３２のスコアが適用され、抗原Ｄに１３０．９９のスコアが適用され、抗原Ｅに３８．８９のスコアが適用され、抗原Ｆに８９２．６８のスコアが適用され、抗原Ｇに３０２．４６のスコアが適用され、抗原Ｈに１９２．８６のスコアが適用される。したがって、これらの抗原を次の階層に編成することができる：
【0159】
Ｃ＞Ｆ＞Ｂ＞Ｇ＞Ｈ＞Ａ＞Ｄ＞Ｅ
【0160】
したがって、下記は、細菌Ｙに感染した患者に防御免疫を与えるための、所望の標的または標的の組み合わせの同定を表すものである（図８、９および１０）：
【0161】
（ａ）最も免疫優性度の高い標的抗原（抗原Ｃ）
【0162】
（ｂ）２つの最も免疫優性度の高い標的の組み合わせ（Ｃ＋Ｆ）
【0163】
（ｃ）３つの最も免疫優性度の高い標的の組み合わせ（Ｃ＋Ｆ＋Ｂ）
【0164】
（ｄ）４つの最も免疫優性度の高い標的の組み合わせ（Ｃ＋Ｆ＋Ｂ＋Ｇ）
【0165】
（ｅ）５つの最も免疫優性度の高い標的の組み合わせ（Ｃ＋Ｆ＋Ｂ＋Ｇ＋Ｈ）
【0166】
（ｆ）６つの最も免疫優性度の高い標的の組み合わせ（Ｃ＋Ｆ＋Ｂ＋Ｇ＋Ｈ＋Ａ）
【0167】
（ｇ）６つの最も免疫優性度の高い標的の組み合わせ（Ｃ＋Ｆ＋Ｂ＋Ｇ＋Ｈ＋Ａ）
【0168】
（ｈ）７つの最も免疫優性度の高い標的の組み合わせ（Ｃ＋Ｆ＋Ｂ＋Ｇ＋Ｈ＋Ａ＋Ｄ）
【0169】
（ｉ）７つの最も免疫優性度の高い標的の組み合わせ（Ｃ＋Ｆ＋Ｂ＋Ｇ＋Ｈ＋Ａ＋Ｄ＋Ｅ）
【0170】
免疫優性抗原の階層を同定する第３の例として、腫瘍Ｚを、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅという名の４つのフラグメント、すなわち抗原、に区分する、下記のシナリオ（図１１）を挙げることができよう。
【0171】
この例では、腫瘍Ｚを有する１００名の個体から採取したＴ細胞を、個別のまたはプールされたフラグメント化標的とともに１０日間、Ｔｈ１極性化サイトカインの存在下、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した。この初回Ｔ細胞抗原処理後、Ｔ細胞を抽出し、再び抗原処理したが、このときは抗原のみで抗原処理した。この２回目の抗原処理後、ＩＦＮγ ＥＬＩｓｐｏｔを使用してＩＦＮγ産生を評定した。
【0172】
レスポンダーの閾値を、２×１０５インプットＴ細胞あたり２０より上のＳＦＣ値であると決定した。しかし、生物学的活性についての応答の閾値は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９５０、９７５、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、またはそれを超えるＳＦＣ／２×１０５であり得る（または少なくとも前記値であってもよく、または前記値以下であってもよい）。
【0173】
これらの結果の一例を以下に示す：
【0174】
抗原Ａは、ドナーの９５％（ｎ＝９５）によって認識され、２２５ＳＦＣ／（２×１０５インプットＴ細胞）の平均値を有した。
【0175】
抗原Ｂは、ドナーの７０％（ｎ＝７０）によって認識され、７００ＳＦＣ／（２×１０５インプットＴ細胞）の平均値を有した。
【0176】
抗原Ｃは、ドナーの１０％（ｎ＝１０）によって認識され、５０ＳＦＣ／（２×１０５インプットＴ細胞）の平均値を有した。
【0177】
抗原Ｄは、ドナーの２０％（ｎ＝２０）によって認識され、３００ＳＦＣ／（２×１０５インプットＴ細胞）の平均値を有した。
【0178】
抗原Ｅは、ドナーの７５％（ｎ＝７５）によって認識され、６５５ＳＦＣ／（２×１０５インプットＴ細胞）の平均値を有した。
【0179】
図１１に示すように、ＴＣ検定を用い、ＴＣスコアを標的抗原の各々に当てはめて、免疫優性の階層を決定した。例えば、抗原Ａに３６００のスコアを割り当て、抗原Ｂに１６０３．２３のスコアを割り当て、抗原Ｃに６．０４のスコアを当てはめ、抗原Ｄに１３０．９９のスコアを割り当て、抗原Ｅに３８．８９のスコアを割り当てる。したがって、これらの抗原を次の階層に編成することができる（図１２）：
【0180】
Ａ＞Ｅ＞Ｂ＞Ｄ＞Ｃ
【0181】
したがって、下記は、腫瘍Ｚを有する患者に防御免疫を与えるための、望ましい標的または標的の組み合わせの同定を表すものである（図１３、１４および１５）：
【0182】
（ａ）最も免疫優性度の高い標的抗原（抗原Ａ）
【0183】
（ｂ）２つの最も免疫優性度の高い標的の組み合わせ（Ａ＋Ｅ）
【0184】
（ｃ）３つの最も免疫優性度の高い標的の組み合わせ（Ａ＋Ｅ＋Ｂ）
【0185】
（ｄ）４つの最も免疫優性度の高い標的の組み合わせ（Ａ＋Ｅ＋Ｂ＋Ｄ）
【0186】
（ｅ）５つの最も免疫優性度の高い標的の組み合わせ（Ａ＋Ｅ＋Ｂ＋Ｄ＋Ｃ）
【実施例2】
【0187】
［ｈＭＰＶの免疫優性階層の同定］
ヒトメタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）は、乳児、高齢および易感染性個体における急性呼吸器疾患最も重要な原因因子である（Ｗｅｎ ＳＣおよびＷｉｌｌｉａｍｓ ＪＶ、Ｃｌｉｎ．Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０１５）。
ヒトメタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）は、乳児、高齢および易感染性個体における急性呼吸器疾患最も重要な原因因子である（Ｗｅｎ ＳＣおよびＷｉｌｌｉａｍｓ ＪＶ、Ｃｌｉｎ．Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０１５）。
【0188】
［ウイルス学］
【0189】
ＨＭＰＶは、パラミクソウイルス科内のニューモウイルス亜科（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｎａｅ ｓｕｂｆａｍｉｌｙ）、メタニューモウイルス属のエンベロープのある１本鎖のマイナス鎖ＲＮＡウイルスである。ＨＭＰＶゲノムは、９つのタンパク質をコードする８個の遺伝子を３’－Ｎ－Ｐ－Ｍ－Ｆ－Ｍ２－ＳＨ－Ｇ－Ｌ－５’の順序で含有する（図１６）。
【0190】
ビリオンの表面には、小型疎水性（ＳＨ）タンパク質と、重度にグリコシル化された推定的付着タンパク質（Ｇ）と、ウイルス融合および侵入を媒介する融合（Ｆ）糖タンパク質という、３つの膜貫通糖タンパク質が存在する。ＳＨタンパク質の機能は不明確であるが、いくつかの研究により、自然および適応免疫応答の阻害におけるこのタンパク質の役割が示唆されている。基質タンパク質（Ｍ）は、ビリオンのウイルス膜の直下を裏打ちしており、ＲＳＶ Ｍタンパク質に類似して、ウイルスの構築および出芽に関与する。ＲＮＡゲノムが核タンパク質（Ｎ）によって完全にカプシドに内包されて、ヌクレオカプシド（リボ核タンパク質複合体と呼ばれることもある）を形成する。Ｎタンパク質、リン酸化タンパク質（Ｐ）、Ｍ２－１タンパク質、およびラージＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼタンパク質（Ｌ）がＲＮＡゲノムと会合して、ウイルスＲＮＡポリメラーゼ複合体を形成する。第２のＭ（Ｍ２）遺伝子は、ＲＳＶにおける転写処理能力を促進し、完全長ｍＲＮＡの合成に不可欠であるＭ２－１と、転写とゲノム複製のバランスを保つＭ２－２という、２つのタンパク質をコードする（Ｗｅｎ ＳＣおよびＷｉｌｌｉａｍｓ ＪＶ、Ｃｌｉｎ．Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０１５）。
【0191】
［伝播］
【0192】
ＨＭＰＶは、唾液、液滴または大粒子エアロゾルを含み得る、汚染分泌物との直接的または密接な接触によって、伝播されると考えられる。ＨＭＰＶ ＲＮＡは、症状開始の５日～２週間後に分泌物中で見つけられる。しかし、感染から回復する患者からの呼吸器試料におけるＨＭＰＶ ＲＮＡの検出、それ自体は、生存可能な伝染性ウイルス粒子を示さないので、伝染性の程度は不明である（Ｈａａｓ ＬＥら、Ｖｉｒｕｓｅｓ、２０１３）。
【0193】
［疫学および臨床的特徴］
【0194】
ＨＭＰＶは、小児集団によく見られ、２歳未満の小児における罹患率が高い（Ｐａｎｄａ Ｓら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、２０１４）。急性呼吸器疾患を呈しているが他の点では健常な小児からの２５年間にわたって採取された鼻洗浄液検体を用いて行われた後ろ向き研究において、鼻洗浄液検体の２０％が、ＨＭＰＶ ＲＮＡまたは生存ウイルス（培養で回収）を含有した。ＨＭＰＶ感染小児の平均年齢は、１１．６カ月であり、その疾患の大多数が晩冬／早春に起こった（Ｗｅｎ ＳＣおよびＷｉｌｌｉａｍｓ ＪＶ、Ｃｌｉｎ．Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０１５）。
【0195】
成人におけるＨＭＰＶ感染症の割合は、３％～７．１％の間で様々である。これは、入院している成人におけるほうが高い（４．３％～１３．２％に及ぶ）（Ｈａａｓ ＬＥら、Ｖｉｒｕｓｅｓ、２０１３）。成人におけるＨＭＰＶ感染症は、通常、軽度のインフルエンザ様症状しか示さない。しかし、一部の成人症例（特に、高齢成人）では、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）などの重症合併症が起こることがあり得る。呼吸困難は、小児と比較して成人におけるほうが起こる可能性が高い。ＨＭＰＶ感染症は、数名の易感染性患者、例えば、肺移植レシピエント、血液悪性疾患を有する患者、および造血幹細胞移植レシピエントにおいても報告されている（Ｐａｎｄａ Ｓら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、２０１４）。これらの患者の臨床経過は長く、呼吸不全を発症することもある（Ｈａａｓ ＬＥら、Ｖｉｒｕｓｅｓ、２０１３）。
【0196】
［予防および処置］
【0197】
ヒトにおける使用が認可されたＨＭＰＶワクチンは現在存在しないが、不活化ウイルス、サブユニットタンパク質、ウイルス様粒子、弱毒ウイルスおよびキメラウイルスの使用を含む様々な戦略が、動物モデルにおいて研究されている。
【0198】
ＨＭＰＶ融合タンパク質を標的にして、いくつかのモノクローナル抗体が開発されている。ＭＡｂ２３４およびＭＡｂ３３８という２つのマウスＭＡｂは、Ｆタンパク質への高い親和性結合を示し、動物モデルにおいて予防的にまたは治療的に投与したとき有効であった。同様に、ＭＰＥ８および５４Ｇ１０というヒトモノクローナル抗体は、マウスモデルにおいてＨＭＰＶに対して予防および治療有効性を示した。
【0199】
ヒトにおけるＨＭＰＶ感染症の処置は、主として対症的である。ヌクレオシド類似体であるリバビリンは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでもＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてもＨＭＰＶに対する有効性を有することが証明された。しかし、リバビリンは高価であり、溶血性貧血などの有害作用を引き起こすことができるものであり、潜在的催奇形物質である。さらに、非常に多くの逸話的報告があるが、ＨＭＰＶ感染症の処置におけるその有効性を研究するために行われた対照試験はない。リバビリンは、重症ＨＭＰＶ感染症を有する患者に、一部の症例では静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩｇ）とともに投与されている。ＩＶＩｇは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＭＰＶに対して抗ウイルス活性を有するが、大量の液量の注入を要し、先天性心疾患を有する小児では有害事象を伴う（Ｗｅｎ ＳＣおよびＷｉｌｌｉａｍｓ ＪＶ、Ｃｌｉｎ．Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０１５）。
【0200】
［防御の免疫応答および相関因子（Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）］
【0201】
適応免疫応答（液性および細胞性免疫）は、ＨＭＰＶに対する防御免疫の最も重要な態様である。実際、動物研究は、抗体の受動伝達がＨＭＰＶ複製を防ぐのに十分なものであることを示す。Ｔ細胞は、ウイルス排除にも重要である。ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞両方の枯渇は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＨＭＰＶ抗原処理後、より高いウイルス力価をもたらした（Ｗｅｎ ＳＣおよびＷｉｌｌｉａｍｓ ＪＶ、Ｃｌｉｎ．Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０１５）。加えて、ＨＭＰＶ呼吸器疾患があるヒト患者は、ＨＭＰＶタンパク質へのＣＤ８＋Ｔ細胞応答を有することが明らかになった（Ｗｅｎ ＳＣおよびＷｉｌｌｉａｍｓ ＪＶ、Ｃｌｉｎ．Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０１５）。したがって、ＨＭＰＶの免疫優性階層を評定することが、新規治療戦略を開発するために必要である。
【0202】
［ｈＭＰＶの免疫優性階層の確立］
【0203】
下記は、実施例１で説明したプロセスおよびＴＣ検定を適用することによる、ｈＭＰＶに対するＴ細胞応答の新規な特徴づけを表すものである：
【0204】
ｈＭＰＶを次のフラグメントに区分した：ＳＨ、Ｍ、Ｌ、Ｇ、Ｆ、Ｍ２－２、Ｐ、Ｍ２－１およびＮ。レスポンダーの百分率は、ＳＨについては３．４％、Ｍについては７９．３％、Ｌについては４４．８％、Ｇについては３１％、Ｆについては９６．５％、Ｍ２－２については０％、Ｐについては６８．９％、Ｍ２－１については７９．３％、およびＮについては８６．２％であり、ＳＨについては３４、Ｍについては１５４、Ｌについては１２５、Ｇについては６２、Ｆについては３００、Ｍ２－２については０、Ｐについては１３０、Ｍ２－１については１６７、およびＮについては２２０の応答規模であった。ＴＣ検定を適用することにより、本発明者らは、ＳＨについては１．５３、Ｍについては５６９．８７、Ｌについては１０１．８７、Ｇについては２８．３４、Ｆについては６５００、Ｍ２－２については０、Ｐについては２８３．０８、Ｍ２－１については６１７．９７、およびＭについては１１７８．３８のＴＣスコアを同定した（図１７～１８）。このＴＣスコアを当てはめることにより、本発明者らは、異なるｈＭＰＶ抗原（図１９）を以下のようにランク付けした：
【0205】
Ｆ＞Ｎ＞Ｍ２－１＞Ｍ＞Ｐ＞Ｌ＞Ｇ＞ＳＨ＞Ｍ２－２
【0206】
したがって、下記は、ＨＭＰＶに感染した患者に防御免疫を与えるための、望ましい標的または標的の組み合わせの同定を表すものである（図１９）：
【0207】
（ａ） 最も免疫優性度の高い標的抗原（抗原Ｆ）
【0208】
（ｂ） ２つの最も免疫優性度の高い標的の組み合わせ（Ｆ＋Ｎ）
【0209】
（ｃ） ３つの最も免疫優性度の高い標的の組み合わせ（Ｆ＋Ｎ＋Ｍ２－１）
【0210】
（ｄ） ４つの最も免疫優性度の高い標的の組み合わせ（Ｆ＋Ｎ＋Ｍ２－１＋Ｍ）
【0211】
（ｅ） ５つの最も免疫優性度の高い標的の組み合わせ（Ｆ＋Ｎ＋Ｍ２－１＋Ｍ＋Ｐ）
【0212】
（ｆ） ６つの最も免疫優性度の高い標的の組み合わせ（Ｆ＋Ｎ＋Ｍ２－１＋Ｍ＋Ｐ＋Ｌ）
【0213】
（ｇ） ７つの最も免疫優性度の高い標的の組み合わせ（Ｆ＋Ｎ＋Ｍ２－１＋Ｍ＋Ｐ＋Ｌ＋Ｇ）
【0214】
（ｈ） ８つの最も免疫優性度の高い標的の組み合わせ（Ｆ＋Ｎ＋Ｍ２－１＋Ｍ＋Ｐ＋Ｌ＋Ｇ＋ＳＨ）
【0215】
（ｉ） ９つの最も免疫優性度の高い標的の組み合わせ（Ｆ＋Ｎ＋Ｍ２－１＋Ｍ＋Ｐ＋Ｌ＋Ｇ＋ＳＨ＋Ｍ２－２）
【実施例3】
【0216】
［ＰＩＶ３の免疫優性階層の同定］
ヒトパラインフルエンザウイルス３型（ＰＩＶ３）は、気道病原体であり、乳児および幼児における細気管支炎および肺炎の主原因である（Ｚｖｉｒｂｌｉｅｎｅ Ａ．ら、Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００９）。低年齢小児に加えて、ＰＩＶ３は、高齢者および易感染性成人を脅かす。ＰＩＶ３感染症は、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）を受ける患者の死（３５％～７５％）につながる重症疾患の原因にもなる（Ｎｉｃｈｏｌｓ ＷＧら、Ｂｌｏｏｄ、２００１；Ｍａｚｉａｒｚ ＲＴら、Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、２０１０；Ｓａｓａｋｉ Ｍら、Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、２０１３）
ヒトパラインフルエンザウイルス３型（ＰＩＶ３）は、気道病原体であり、乳児および幼児における細気管支炎および肺炎の主原因である（Ｚｖｉｒｂｌｉｅｎｅ Ａ．ら、Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００９）。低年齢小児に加えて、ＰＩＶ３は、高齢者および易感染性成人を脅かす。ＰＩＶ３感染症は、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）を受ける患者の死（３５％～７５％）につながる重症疾患の原因にもなる（Ｎｉｃｈｏｌｓ ＷＧら、Ｂｌｏｏｄ、２００１；Ｍａｚｉａｒｚ ＲＴら、Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、２０１０；Ｓａｓａｋｉ Ｍら、Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、２０１３）
【0217】
［ウイルス学』
【0218】
ＰＩＶ３は、パラミクソウイルス科のレスピロウイルス属の代表である。ＰＩＶ３は、負極性の１本鎖ＲＮＡゲノムを含有する、エンベロープのあるＲＮＡウイルスである。ＰＩＶ３ゲノムは、少なくとも６つの構造タンパク質を不変順序Ｎ－Ｐ－Ｍ－Ｆ－ＨＮ－Ｌでコードするように構成された、おおよそ１５，５００のヌクレオチドを含有する（図２０）。
【0219】
ＰＩＶ３による宿主細胞の感染は、細胞膜タンパク質上のシアル酸へのビリオンエンベロープ上のヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）糖タンパク質の結合によって開始される。次いで、Ｆｕｓｉｏｎ（Ｆ）タンパク質がウイルスのエンベロープと宿主細胞の原形質膜との融合を媒介する。これにより、核タンパク質（Ｎ）によって堅く結合されているウイルスゲノムからなり、リン酸化タンパク質（Ｐ）およびラージＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ）タンパク質と会合している、ウイルヌクレオカプシドが放出される。ヌクレオカプシド結合ポリメラーゼは、ウイルス遺伝子の別個のｍＲＮＡ転写物へのコピーを指示し、ＲＮＡゲノムの複製も指示する。子孫ヌクレオカプシドが組み立てられ、ビリオンにパッケージされ、該ビリオンが原形質膜から出芽する。基質（Ｍ）タンパク質がエンベロープの内面を覆っており、スパイク様糖タンパク質ＦおよびＨＮがエンベロープの外面から突出している（Ｓｃｈｍｉｄｔ ＡＣら、Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｒｅｓｐｉｒ．Ｍｅｄ．、２０１２）
【0220】
［伝播］
【0221】
ウイルス伝播は、手からの伝染性分泌物の直接接種、または目、鼻もしくは稀に口への大粒子エアロゾルの直接接種によって起こる（Ｍａｚｉａｒｚ ＲＴら、Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、２０１０）。ＰＩＶ３の複製は、気道を裏打ちする表在性上皮細胞内で起こる。感染は、典型的には鼻および喉の粘膜で始まるが、感染性ウイルスが下気道（ＬＲＴ）に直接伝播されることもある（Ｓｃｈｍｉｄｔ ＡＣら、Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｒｅｓｐｉｒ．Ｍｅｄ．、２０１２）。
【0222】
［疫学および臨床的特徴］
【0223】
米国では毎年おおよそ１８，０００名の乳児および小児がＰＩＶ３に起因する下気道感染症（ＬＲＴＩ）のために入院する。細気管支炎および肺炎は、最もよく見られる臨床像である（Ｈｅｎｒｉｃｋｓｏｎ ＫＪ、Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖ．、２００３）。低年齢小児に加えて、移植レシピエントのような易感染性小児および成人では、ＰＩＶ３は非常に問題である。例えば、成人ＨＳＣＴレシピエントの５～７％の間がＰＩＶ３に感染することになり、彼らのおおよそ２４～５０％は肺炎のような重症ＬＲＴＩを発症し、これらの患者の２２～７５％が呼吸不全で死亡する（Ｈｅｎｒｉｃｋｓｏｎ ＫＪ、Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖ．、２００３）。後ろ向き研究により、ＰＩＶ３感染症を有する小児ＨＳＣＴ患者の２５％が肺炎を発症し、３３％がその肺炎で死亡することが判明した（Ｌｕｊａｎ－Ｚｉｌｂｅｒｍａｎｎ Ｊら、Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、２００１）。同様に、ＰＩＶ３は、肺移植レシピエントにおいて移植後５年までに重症ＬＲＴＩおよび死亡（８％）を引き起こすことが証明されている（Ｖｉｌｃｈｅｚ ＲＡ．ら、Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、２００１）。
【0224】
［予防および処置］
【0225】
ＰＩＶ３ワクチンへの現行のアプローチは、生弱毒株の鼻腔内投与、ＨＮおよびＦタンパク質を使用するサブユニット戦略、組換えウシ／ヒトウイルス、ならびに逆遺伝学を用いて人工的に作り出された株を含む。実際、低温継代によって生じさせたＰＩＶ３の減弱株であるｒｈＰＩＶ３ｃｐ４５（またはＭＥＤＩ－５６０）と、ｃＤＮＡ由来のキメラウシ／ヒトＰＩＶ３であるＢ／ｈＰＩＶ３－ＲＳＶ－Ｆ（またはＭＥＤＩ－５３４）という、２つの被験ワクチンが、現在、第Ｉ相臨床試験において試験中である。安全性および免疫原性データの分析は保留中である（Ｓｃｈｍｉｄｔ ＡＣら、Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｒｅｓｐｉｒ．Ｍｅｄ．、２０１２）。
【0226】
ＰＩＶ３をはじめとするパラミクソウイルスに対してｉｎ ｖｉｔｒｏで抗ウイルス活性を有することが判明した薬剤としては、ノイラミニダーゼ阻害剤（例えば、ザナミビル）、タンパク質合成阻害剤（ピューロマイシン）、核酸合成阻害剤、ベンゾチアゾール誘導体、１，３，４－チアジゾール－２－イルシアナミド（１，３，４－ｔｈｉａｄｉｚｏｌ－２－ｙｌｃｙａｎａｍｉｄｅ）、炭素環式３－デエエザアデノシン（３－ｄｅｅｚａａｄｅｎｏｓｉｎｅ）、アスコルビン酸、エノール酸カルシウム、およびセイヨウウマノミツバ（Ｓａｎｉｃｕｌａ ｅｕｒｏｐａｅａ）の抽出物が挙げられる。これらの化合物または薬物はいずれも、まだ臨床応用されていない（Ｈｅｎｒｉｃｋｓｏｎ ＫＪ、Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖ．、２００３）。
【0227】
リバビリンは、ウイルスＲＮＡ合成およびウイルスｍＲＮＡキャッピングを止めるために使用されるグアノシン類似体である。ＰＩＶ３排出減少および臨床的改善の事例報告が、エアロゾル化リバビリンおよび経口リバビリンで処置された易感染性患者において報告されている。しかし、Ｆｒｅｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒにおける最近の再調査により、すでに罹患しているＰＩＶ３肺炎は、エアロゾル化リバビリンにほとんど反応しないことが実証された（Ｎｉｃｈｏｌａｓ ＷＧら、Ｂｉｏｌ．Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌ．、２００１）。現在、ＰＩＶ３に対する臨床的有効性が証明されている抗ウイルス薬はない（Ｈｅｎｒｉｃｋｓｏｎ ＫＪ、Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖ．、２００３）。
【0228】
［防御の免疫応答および相関因子（Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）］
【0229】
ＰＩＶ３感染症は、感染した宿主において強力な液性および細胞性免疫を誘導することができる。血清中和抗体および粘膜の中和抗体は、両方とも、疾患に対する持続的防御をもたらすことができる（Ｓｃｈｍｉｄｔ ＡＣら、Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｒｅｓｐｉｒ．Ｍｅｄ．、２０１２）。同様に、細胞傷害性Ｔリンパ球応答は、ＰＩＶ３に感染中のＬＲＴからのウイルスの排除に重要であるようである（Ｈｅｎｒｉｃｋｓｏｎ ＫＪ、Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖ．、２００３）。したがって、ＰＩＶ３の免疫優性階層を評定することが、新規治療戦略を開発するために必要である。
【0230】
［ＰＩＶ３の免疫優性階層の確立］
【0231】
下記は、実施例１で説明したプロセスおよびＴＣ検定を適用することによる、ＰＩＶ３に対するＴ細胞応答の新規特性解析を表すものである：
【0232】
ＰＩＶ３を次のフラグメントに区分した：ＨＮ、プロテインＣ、ＰＰ、Ｌａｒｇｅ、Ｍ、ＮおよびＦｕｓｉｏｎ。レスポンダーの百分率は、ＨＮについては８８．２％、プロテインＣについては４７％、ＰＰについては４７％、Ｌａｇｅについては４７％、Ｍについては９４．１％、Ｎについては６４．７％、およびＦｕｓｉｏｎについては４７％であり、ＨＮについては１３１、プロテインＣについては２１４．６、ＰＰについては２０３．７、Ｌａｒｇｅについては１１５．８、Ｍについては２６１．２、Ｎについては１６０、およびＦｕｓｉｏｎについては１７５．７の応答規模であった。ＴＣ検定を適用することにより、本発明者らは、ＨＮについては９１２．９１、プロテインＣについては１９０．７６、ＰＰについては１８１．０７、Ｌａｒｇｅについては１０２．９３、Ｍについては３６００、Ｎについては２８９．５９、および融合については１５６．１８のＴＣスコアを同定した（図２１および２２）。このＴＣスコアを当てはめることにより、本発明者らは、異なるＰＩＶ３抗原を以下のようにランク付けした（図２３）：
【0233】
Ｍ＞ＨＮ＞Ｌａｒｇｅ＞Ｎ＞プロテインＣ＞ＰＰ＞Ｆｕｓｉｏｎ＞Ｌａｒｇｅ
【0234】
したがって、下記は、ＰＩＶ３に感染した患者に防御免疫を与えるための、所望の標的または標的の組み合わせの同定を表すものである（図１３）：
【0235】
（ａ） 最も免疫優性度の高い標的抗原（抗原Ｍ）
【0236】
（ｂ） ２つの最も免疫優性度の高い標的の組み合わせ（Ｍ＋ＨＮ）
【0237】
（ｃ） ３つの最も免疫優性度の高い標的の組み合わせ（Ｍ＋ＨＮ＋Ｎ）
【0238】
（ｄ） ４つの最も免疫優性度の高い標的の組み合わせ（Ｍ＋ＨＮ＋Ｎ＋プロテインＣ）
【0239】
（ｅ） ５つの最も免疫優性度の高い標的の組み合わせ（Ｍ＋ＨＮ＋Ｎ＋プロテインＣ＋ＰＰ）
【0240】
（ｆ） ６つの最も免疫優性度の高い標的の組み合わせ（Ｍ＋ＨＮ＋Ｎ＋プロテインＣ＋ＰＰ＋Ｆｕｓｉｏｎ）
【0241】
（ｇ） ７つの最も免疫優性度の高い標的の組み合わせ（Ｍ＋ＨＮ＋Ｌａｒｇｅ＋Ｎ＋プロテインＣ＋ＰＰ＋Ｆｕｓｉｏｎ＋Ｌａｒｇｅ）
【実施例4】
【0242】
［レスポンダーの百分率の同定］
図１８および２２に示すように、ならびに一例として、ＩＦＮγ産生の閾値を使用してＴ細胞活性の臨界レベルを同定することができ、それを使用してレスポンダー対ノンレスポンダーを決定することができる。しかし、この閾値は、ＩＦＮγ産生のみに限定されるものではなく、この閾値の代わりに、例えばＩＬ２、グランザイムＢ、ＣＤ２５、ＧＭ－ＣＳＦおよびＴＮＦαを含むがこれらに限定されない関連標的に関する認識に基づいてＴ細胞により産生される（細胞により分泌され、細胞培養物の上清から測定される場合のような）または発現される（細胞膜上に固定された不溶性マーカーの場合のような）任意の他の生物学的マーカーを用いることができることは、当業者には理解されるであろう。すべてのそのようなマーカーを使用して、非特異的応答の閾値を先ず同定することによりレスポンダー対ノンレスポンダーを決定することができる。非特異的応答のレベルは、無関係の抗原（例えば、初回Ｔ細胞刺激で使用しなかった抗原）に対して検出された生物学的活性の規模によって同定することができる。例えば、５つの抗原（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）をコードするウイルスへの免疫応答を分析する場合、無関係の抗原は、異なるウイルスに由来するまたは未操作ＰＢＭＣに対する抗原Ｆとなる。これを、特定の実施形態において、ＩＦＮγについて２×１０５あたり２０ＳＦＣ、およびグランザイムＢについて２×１０５あたり１０ＳＦＣと決定した。図２４は、病原体に対する免疫応答の特性解析のためにグランザイムＢを使用してレスポンダーのノンレスポンダーに対する百分率を決定する例を示すものである。
図１８および２２に示すように、ならびに一例として、ＩＦＮγ産生の閾値を使用してＴ細胞活性の臨界レベルを同定することができ、それを使用してレスポンダー対ノンレスポンダーを決定することができる。しかし、この閾値は、ＩＦＮγ産生のみに限定されるものではなく、この閾値の代わりに、例えばＩＬ２、グランザイムＢ、ＣＤ２５、ＧＭ－ＣＳＦおよびＴＮＦαを含むがこれらに限定されない関連標的に関する認識に基づいてＴ細胞により産生される（細胞により分泌され、細胞培養物の上清から測定される場合のような）または発現される（細胞膜上に固定された不溶性マーカーの場合のような）任意の他の生物学的マーカーを用いることができることは、当業者には理解されるであろう。すべてのそのようなマーカーを使用して、非特異的応答の閾値を先ず同定することによりレスポンダー対ノンレスポンダーを決定することができる。非特異的応答のレベルは、無関係の抗原（例えば、初回Ｔ細胞刺激で使用しなかった抗原）に対して検出された生物学的活性の規模によって同定することができる。例えば、５つの抗原（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）をコードするウイルスへの免疫応答を分析する場合、無関係の抗原は、異なるウイルスに由来するまたは未操作ＰＢＭＣに対する抗原Ｆとなる。これを、特定の実施形態において、ＩＦＮγについて２×１０５あたり２０ＳＦＣ、およびグランザイムＢについて２×１０５あたり１０ＳＦＣと決定した。図２４は、病原体に対する免疫応答の特性解析のためにグランザイムＢを使用してレスポンダーのノンレスポンダーに対する百分率を決定する例を示すものである。
【実施例5】
【0243】
［ＴＣスコアは臨床的に関連性のある標的を同定する］
ＴＣスコアによって確立された階層の臨床的関連性を確認するために、本発明者らは、活動性感染症を有する患者におけるＰＩＶ３に対する免疫Ｔ細胞応答を分析した。図２５に示すように、抗原ＭおよびＮを標的とするＰＩＶ３特異的Ｔ細胞の出現頻度は、１５５日目と１６２日目の間で特定の高まりを示し、これは、１６７日目までに治まる臨床症状のその後の改善と相関する。ウイルス感染症を抑えるようなＰＩＶ３ Ｔ細胞の臨床的関連性のもう１つの例であって、ＰＩＶ３特異的Ｔ細胞の出現頻度の増加に、骨髄移植（ＢＭＴ）後の活動性感染症を有する１人の代表患者に存在する感染症の症状およびＰＣＲによるウイルス検出との逆相関があった例を図２６に示す。
ＴＣスコアによって確立された階層の臨床的関連性を確認するために、本発明者らは、活動性感染症を有する患者におけるＰＩＶ３に対する免疫Ｔ細胞応答を分析した。図２５に示すように、抗原ＭおよびＮを標的とするＰＩＶ３特異的Ｔ細胞の出現頻度は、１５５日目と１６２日目の間で特定の高まりを示し、これは、１６７日目までに治まる臨床症状のその後の改善と相関する。ウイルス感染症を抑えるようなＰＩＶ３ Ｔ細胞の臨床的関連性のもう１つの例であって、ＰＩＶ３特異的Ｔ細胞の出現頻度の増加に、骨髄移植（ＢＭＴ）後の活動性感染症を有する１人の代表患者に存在する感染症の症状およびＰＣＲによるウイルス検出との逆相関があった例を図２６に示す。
【0244】
図２７は、異なるｈＭＰＶ抗原に対する免疫Ｔ細胞応答の臨床的関連性を示すものである。この図は、活動性ＨＭＰＶ感染症を有する１人の代表患者において検出されたタンパク質Ｆ、Ｎ、Ｍ、Ｍ２－１およびＰに対して反応性のＴ細胞の出現頻度を示すものであり、前記患者の症状は、末梢血中のこれらのＴ細胞の検出後に消散した。
【0245】
［Ｔ細胞を使用する最上位ランクの抗原の標的化］
【0246】
図２８、２９および３０は、所与の病原体またはがんの最上位の標的を抗原源として同定する、このランキングの治療応用を示すものである。これに伴う培養条件が、ひいては、所与の標的に特異的なＴ細胞のその後の富化をもたらすことになる。
【0247】
［治療目的使用のためのＰＩＶ３特異的Ｔ細胞の生成］
【0248】
健常なＰＩＶ３血清反応陽性個体から単離したＰＢＭＣを、Ｔｈ１極性化サイトカインの存在下で１０日間の間、タンパク質ＭおよびＨＮ全体との重複があるペプチドとともに培養した。図３１は、Ｔ細胞産物の表現型特性を示すものであり、図３２は、抗原ＭおよびＨＮについての細胞内サイトカイン染色によって検出されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋の抗原特異性を示すものである。
【0249】
［治療目的使用のためのｈＭＰＶ特異的Ｔ細胞の生成］
【0250】
健常なｈＭＰＶ血清反応陽性個体から単離したＰＢＭＣを、図３３に示すように、Ｔｈ１極性化サイトカインの存在下で１０日の間、Ｇ－Ｒｅｘ培養システム（または任意の他の細胞培養プラットホーム、バイオリアクターもしくは組織培養プレート）を使用してタンパク質全体との重複があるペプチドとともに培養した。このプロセスは、図３４に示すようにＴ細胞の有意な増殖をもたらした。検査に基づき、これらの増殖細胞は、ポリクローナルであり（図３５）、関連抗原についての細胞内サイトカイン染色による検出に従って抗原特異的であることが判明した（図３７）。この増殖Ｔ細胞産物の抗ウイルス特性を評価するために、ＨＬＡ適合標的細胞にＨＭＰＶペプチドをパルスし、それらをＰＫＨ染料で標識し、ＨＭＰＶ特異的Ｔ細胞とともに１：１比で培養した。図３６に示すように、ウイルス特異的Ｔ細胞との培養は、培養０、２および４日目の後、ＨＭＰＶ標的細胞の３５．５％から１８．７％へ、そこから６．４％への漸減をもたらした。したがって、時間が経つにつれて、感染細胞が殺滅されていく。
【実施例6】
【0251】
［産物についての臨床的有効性の同定］
［産物の組成］
［産物の組成］
【0252】
本発明者らは、ある一定の実施形態において、臨床的有効性と相関する最終産物の生物学的特徴の例を同定した。
【0253】
特定の実施形態において、産物が患者において臨床的有効性を有するかどうかを明らかにする方法についての以下の説明は、病原体の抗原の免疫原性の階層の決定に関する本明細書における他の実施形態とは無関係である。すなわち、ある一定の抗原を有するＴ細胞を、それらのそれぞれの抗原を免疫原性階層に基づいて選択したか否か、またはそれらのそれぞれの抗原が他の抗原選択方法に基づいたか否か、またはそれらのそれぞれの抗原がランダムであるか否かを問わず、下記の特徴づけ方法に付すことができる。
【0254】
［ウイルス特異的Ｔ細胞の特徴づけ］
【0255】
同一性：一部の事例では、細胞の同一性をＨＬＡタイピングによって決定することがある。最終産物は、少なくとも一部の事例では、ドナー由来の細胞を含む。したがって、最終産物のＨＬＡ型は、ある一定の実施形態ではドナー血のものと同一であるはずである。
【0256】
表現型分析：最適なｉｎ ｖｉｖｏ Ｔ細胞持続性および活性にはヘルパー（ＣＤ４＋）Ｔ細胞と細胞傷害性（ＣＤ８＋）Ｔ細胞の両方が必要である。したがって、表現型分析を使用して、産物がポリクローナルＴ細胞からなるかどうかを判定することができる。
【0257】
特異性：産物の抗ウイルス特異性は、増殖させた細胞を個々の合成ペプチドライブラリーの各々に曝露すること、および前記合成ペプチドライブラリーの各々を認識するそれらの細胞の能力を評定することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏで評定することができる。例えば、産物特異性を評定するための１つの方法は、ＩＦＮγ ＥＬＩｓｐｏｔ検定を使用して、合成ペプチド曝露後にサイトカインインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）を産生するこれらの細胞の能力を検定することを含む。この検定では、刺激のために使用したウイルス抗原の各々に細胞を再曝露する。標的ウイルスからのすべての抗原に指向されたＩＦＮγ産生スポット形成細胞（ＳＦＣ）の合計が、（活性の閾値の一例として）≧２０ＳＦＣ毎２×１０５インプット細胞であった場合、その産物をウイルスＸに対して特異的と見なす。
【0258】
細胞傷害性：産物の細胞傷害特性を標準的な殺滅アッセイで測定することができ、該アッセイでは、細胞をエフェクターとして使用し、標的は、例えば、関連ｐｅｐｍｉｘをパルスしたクロム標識ＰＨＡブラストである。エフェクターの標的に対する比は、５：１、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、５５：１；６０：１、６５：１、７０：１、７５：１、８０：１、８５：１、９０：１、９５：１などであり得る（または少なくとも前記比であってもよく、または前記比以下であってもよい）。単独での、または無関係のｐｅｐｍｉｘを負荷した、自家または同種異系ＰＨＡブラストを、特異性およびアロ反応性対照として使用することができる。例えば、ｐＰｒｏｄｕｃｔは、少なくとも特定の事例では、関連ｐｅｐｍｉｘをパルスしたＰＨＡブラストの特異的溶解百分率が、４０：１のエフェクター対標的比で、≧１０％である場合、ウイルスＸに対して細胞傷害特異性を示すと見なす。所与のエフェクター対標的比での標的細胞の殺滅は、ベースラインレベル（未操作のＰＢＭＣをエフェクターとして使用して、または無関係の抗原をパルスした標的細胞に対するＴ細胞産物の活性を評定して、確立したレベル）より上である場合、抗原特異的と見なす。
【0259】
下記は、当業者が産物組成を同定することを可能にする数学的表現を表すものである：
【0260】
［産物の定義］
【0261】
産物は、下記を特徴とする、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養から単離したＴ細胞と定義する：
【0262】
【数5】
【0263】
－ 式中、ＲＴＢは、［（Ｔｂｉｏ－Ｐ）＋１］／［（Ｔｂｉｏ－Ｕ）＋１］と定義し、この式が≧１の場合、１のＲＴＢ値に相当し、＜１の場合、０のＲＴＢ値に対応し；および
【0264】
－ ＲＴＫは、［（％ＴＳｐｅｃ－Ｐ）／ＴＣＳｐｅｃ］と定義し、この式が≧１の場合、１のＲＴＫ値に相当し、＜１の場合、０のＲＴＫ値に対応する（図３８を参照されたい）。
【0265】
Ｔｂｉｏ－Ｐは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔ細胞産物の生物学的活性と定義し、Ｔｂｉｏ－Ｕは、ノイズ閾値の生物学的活性と定義し、前記生物学的活性は、前に説明したように、目的の抗原の存在下の場合は未操作ＰＢＭＣの生物学的活性であることができ、または目的のものではない無関係の抗原の存在下の場合はｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔ細胞産物の生物学的活性であることができる。そのような生物学的活性としては、これらに限定されるものではないが、例えば、ＩＦＮγ、ＩＬ２、ＧＭ－ＣＳＦおよびＴＮＦα産生、ならびに例えば、ＣＤ２５、ＣＤ４５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ６９およびＣＤ１０７などのマーカーの発現増加を挙げることができよう。
【0266】
ＴＳｐｅｃ－Ｐ、すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔ細胞産物の特異的殺滅能力は、予め定義されたエフェクター対標的比（例えば、４０：１ エフェクター対標的比）で同種抗原を発現する溶解されたＨＬＡ適合標的細胞の百分率であって、無関係のペプチド、すなわち、予め定義されたエフェクター対標的比で目的の病原体内にも目的の腫瘍内にも存在しない抗原、を発現する標的細胞の未操作のＰＢＭＣによる非特異的殺滅の百分率を減算した後の百分率と定義する。
【0267】
複数の産物が、臨床的投与に利用可能である場合には、補足式［α（ＲＴＢ）＋β（ＲＴＫ）＝φ］を適用して、優先度順に産物をランク付けすることができる。
【0268】
【数6】
【0269】
式中、ＲＴＢは、［（Ｔｂｉｏ－Ｐ）＋１］／［（Ｔｂｉｏ－Ｕ）＋１］から得られる値と定義する
【0270】
式中、ＲＴＫは、［（％ＴＳｐｅｃ－Ｐ）／ＴＣＳｐｅｃ］から得られる値と定義する
【0271】
式中、αおよびβは、変数に依存する重み付け係数と定義し、前記変数には、治療応用、製造プロセス、ペプチド混合物、細胞株などが含まれるが、これらに限定されない
【0272】
式中、φは、治療用産物間の臨床的有効性のランキングを決定するために使用され得る臨床有効性値と定義する
【0273】
実施例１は、産物に存在する生物学的特性の例である。
【0274】
Ｔｂｉｏ－Ｐ＝２００ＳＦＣ（２×１０５あたり）ＩＦＮγ
【0275】
Ｔｂｉｏ－Ｕ＝５０ＳＦＣ（２×１０５あたり）ＩＦＮγ
【0276】
ＴＳｐｅｃ－Ｐ＝４０％
【0277】
ＴＣＳｐｅｃ＝１０％
【0278】
α＝１
【0279】
β＝５
【0280】
ＲＴＢ＝［（Ｔｂｉｏ－Ｐ）＋１］／［（Ｔｂｉｏ－Ｕ）＋１］
【0281】
ＲＴＢ＝［（２００）＋１］／［（５０）＋１］＝３．９４
【0282】
したがって、
【0283】
ＲＴＢ＝１
【0284】
ＲＴＫ＝［（ＴＳｐｅｃ－Ｐ）／（ＴＣＳｐｅｃ）］
【0285】
ＲＴＫ＝［（４０％）／（１０％）］＝４
【0286】
したがって、
【0287】
ＲＴＫ＝１
【0288】
したがって、この実施例は、（ＲＴＢ）＋（ＲＴＫ）≧１によって定義されるような産物に相当する。加えて、この産物の臨床的有効性は、α（ＲＴＢ）＋β（ＲＴＫ）＝φによる定義に従って２３．９４である。
【0289】
実施例２は、産物に存在する生物学的特性の例である。
【0290】
Ｔｂｉｏ－Ｐ＝１００ＳＦＣグランザイムＢ
【0291】
Ｔｂｉｏ－Ｕ＝１０ＳＦＣ（２×１０５あたり）グランザイムＢ
【0292】
ＴＳｐｅｃ－Ｐ＝５％
【0293】
ＴＣＳｐｅｃ＝１０％
【0294】
α＝１
【0295】
β＝５
【0296】
ＲＴＢ＝［（Ｔｂｉｏ－Ｐ）＋１］／［（Ｔｂｉｏ－Ｕ）＋１］
【0297】
ＲＴＢ＝［（１００）＋１］／［（１０）＋１］＝９．１８
【0298】
したがって、
【0299】
ＲＴＢ＝１
【0300】
ＲＴＫ＝［（ＴＳｐｅｃ－Ｐ）／（ＴＣＳｐｅｃ）］
【0301】
ＲＴＫ＝［（５％）／（１０％）］＝０．５
【0302】
したがって、
【0303】
ＲＴＫ＝０
【0304】
したがって、実施例２は、（ＲＴＢ）＋（ＲＴＫ）≧１によって定義されるような産物に相当する。加えて、この産物の臨床的有効性は、α（ＲＴＢ）＋β（ＲＴＫ）＝φによる定義に従って１１．６８である。
【0305】
実施例１および２は両方とも（ＲＴＢ）＋（ＲＴＫ）≧１によって定義されるような産物に相当するため、臨床的有効性値（φ）は、患者が実施例１からの産物と実施例２からの産物両方を受ける資格がある場合、産物選択の決定に役立つであろう。φ値が大きいほど、高い特異性および殺滅能力を有する産物を表し、したがって、産物をランク付けすることができる。この場合、実施例１は、そのφ臨床的有効性値に基づいて、患者への投与のための「優れた」産物に相当する。
【0306】
実施例３は、産物に存在しない生物学的特性の例である。
【0307】
Ｔｂｉｏ－Ｐ＝５０ＳＦＣ（２×１０５あたり）ＩＬ２
【0308】
Ｔｂｉｏ－Ｕ＝７０ＳＦＣ（２×１０５あたり）ＩＬ２
【0309】
ＴＳｐｅｃ－Ｐ＝９％
【0310】
ＴＣＳｐｅｃ＝１０％
【0311】
α＝１
【0312】
β＝５
【0313】
ＲＴＢ＝［（Ｔｂｉｏ－Ｐ）＋１］／［（Ｔｂｉｏ－Ｕ）＋１］
【0314】
ＲＴＢ＝［（５０）＋１］／［（７０）＋１］＝０．７
【0315】
したがって、
【0316】
ＲＴＢ＝０
【0317】
ＲＴＫ＝［（ＴＳｐｅｃ－Ｐ）／（１０％）］
【0318】
ＲＴＫ＝［（９％）／（１０％）］＝０．９
【0319】
したがって、
【0320】
ＲＴＫ＝０
【0321】
したがって、実施例３は、（ＲＴＢ）＋（ＲＴＫ）≧１によって定義されるような産物に相当しない。
【実施例7】
【0322】
［産物の製造］
（ＲＴＢ）＋（ＲＴＫ）≧１を特徴とするｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔ細胞と定義される産物は、様々な製造プロセスによって獲得することができる。後段の説明は、ある一定のＴ細胞が治療的に有用であるか否かの判定についての実施形態に関する。下記は、一部の製造実施例を表すものである：
（ＲＴＢ）＋（ＲＴＫ）≧１を特徴とするｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔ細胞と定義される産物は、様々な製造プロセスによって獲得することができる。後段の説明は、ある一定のＴ細胞が治療的に有用であるか否かの判定についての実施形態に関する。下記は、一部の製造実施例を表すものである：
【0323】
［１．ウイルス特異的Ｔ細胞の製造および凍結保存］
【0324】
健常ドナーからの末梢血または白血球アフェレーシス産物からの単核細胞を、ウイルスＸによって発現された抗原のうちの１つ以上についての配列のすべてまたは一部を包含する、１つ以上の重複合成ペプチドライブラリーと接触させる。合成ペプチド曝露後、ｉｎ ｖｉｔｒｏ製造プロセスで単核細胞の中の抗原特異的Ｔ細胞を活性化し、増殖させる。この実施例では、単核細胞を、Ｔｈ１サイトカイン、例えば、これらに限定されるものではないがＩＬ７およびＩＬ４と、ウイルスＸの１つ以上の抗原の配列全体にわたる臨床グレードのペプチド混合物（ｐｅｐｍｉｘ）とを補足したＴ細胞培地とともに、ガス透過性培養デバイス（例えば、Ｇ－Ｒｅｘ培養デバイス）または組織培養プレートに添加することにより、単核細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで９～１１日間、活性化し、増殖させることになる。臨床グレードのペプチド混合物（ｐｅｐｍｉｘ）に加えて、抗原源が、例えば、ウイルスの組換えタンパク質、ＤＮＡ、抗原（複数可）をコードするＲＮＡなども含むことができようことは、当業者には理解されるであろう。特定の事例では、産物は、（ＲＴＢ）＋（ＲＴＫ）≧１によって設定される基準を満たし、したがって、例えば、その産物をさらなる臨床使用のために凍結保存することができる。
【0325】
あるいは、追加の抗原刺激を（培養１０～１３日目に）行うことができ、該抗原刺激では、（例として）自家単核細胞（または）ＯＫＴ３ブラスト（または）ＰＨＡブラストのいずれかであることができる抗原提示細胞に、ウイルスＸの１つ以上の抗原に対して特異的なｐｅｐｍｉｘを再びパルスし、次いで照射（８０Ｇｙ）し、その後、それらを刺激因子として使用する。２回目の刺激の時点で、培養物にＴｈ１サイトカイン（例えば、これらに限定されるものではないが、ＩＬ４＋ＩＬ７、ＩＬ１５、ＩＬ２、ＩＬ２１、ＩＬ１２またはこれらの組み合わせ）を補足することになり、３日後に培養物にＩＬ２、またはＩＬ１５、ＩＬ７、ＩＬ２１、ＩＬ４もしくはこれらの組み合わせを補足する。培養下で１９～２３日後、ウイルスＸに対して特異的な細胞をＧ－Ｒｅｘ培養デバイスまたは組織培養プレートから回収し、適切なサイズの滅菌容器にプールし、計数する。細胞を遠心分離により洗浄し、次いで、患者への注入に好適なアリコートで、氷冷凍結培地に１×１０７細胞／ｍＬの濃度まで再懸濁させる。この時点で、または凍結７日以内に、適切な数の細胞、洗浄前および洗浄後の培養上清、ならびに最終細胞懸濁液のアリコートをエンドトキシン試験および微生物学的スクリーニングに付す。同時に、適切な数の細胞を、例えば、ＨＬＡタイピング、表現型、特異性および／または細胞溶解機能を含む、産物の特徴づけのためにのために採取してもよい。
【0326】
特定の実施形態において、初回抗原刺激後、２回目の抗原刺激までの時間（例として図３９～４１を参照されたい）は、いずれの好適な時間であってもよく、例えば、用いることになる抗原などの様々な理由によって変動し得る。特定の実施形態において、初回抗原刺激と２回目の抗原刺激の間の日数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２５、３０、３５、４０、４５、５０日、もしくはそれを超える日数である（または少なくとも前記日数もしくは前記日数以下である）。他の実施形態において、２回目の抗原刺激後の時間は、いずれの好適な時間であってもよく、例えば、用いることになる抗原などの様々な理由によって変動し得る。特定の実施形態において、２回目の抗原刺激とその後のステップ（例えば、培養の終点、細胞検定、細胞の治療目的使用など）との間の日数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２５、３０、３５、４０、４５、５０日、もしくはそれを超える日数である（または少なくとも前記日数もしくは前記日数以下である）。
【0327】
［２．ウイルス特異的Ｔ細胞の特徴づけ］
【0328】
同一性：細胞の同一性をＨＬＡタイピングによって決定される。最終産物は、ドナー由来の細胞からなる。したがって、最終産物のＨＬＡ型は、ドナー血のものと同一であるはずである。
【0329】
表現型分析：最適なｉｎ ｖｉｖｏ Ｔ細胞持続性および活性にはヘルパー（ＣＤ４＋）Ｔ細胞と細胞傷害性（ＣＤ８＋）Ｔ細胞の両方が必要である。したがって、表現型分析を使用して、産物がポリクローナルＴ細胞からなるかどうかを判定する。
【0330】
特異性：産物の抗ウイルス特異性は、増殖させた細胞を個々の合成ペプチドライブラリーの各々に曝露すること、および前記合成ペプチドライブラリーの各々を認識するそれらの細胞の能力を評定することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏで評定することができる。例えば、産物特異性を評定するための１つの方法は、ＩＦＮγ ＥＬＩｓｐｏｔ検定を使用して、合成ペプチド曝露後にサイトカインインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）を産生するこれらの細胞の能力を検定することを含む。この検定では、刺激のために使用したウイルス抗原の各々に細胞を再曝露する。標的ウイルスからすべての抗原に指向されたＩＦＮγ産生スポット形成細胞（ＳＦＣ）の合計が、２×１０５インプット細胞あたり≧２０ＳＦＣであった場合、産物を、ウイルスＸに対して特異的と見なす。
【0331】
細胞傷害性：産物の細胞傷害特性を標準的な殺滅アッセイで測定することができ、該アッセイでは、細胞をエフェクターとして使用し、標的は、関連ｐｅｐｍｉｘをパルスしたＰＨＡブラストである。単独での、または無関係のｐｅｐｍｉｘを負荷した、自家または同種異系ＰＨＡブラストを、特異性およびアロ反応性対照として使用することができる。関連ｐｅｐｍｉｘをパルスしたＰＨＡブラストの特異的溶解百分率が、４０：１のエフェクター対標的比で、≧１０％である場合、産物を、ウイルスＸに対して細胞傷害性を示すと見なす。
【0332】
［３．データ］
【0333】
上で説明したようなウイルスの免疫優性抗原に対して特異的なＴ細胞の製造および特徴づけを使用して、単なる例として、アデノウイルス（ＡｄＶ）、ＢＫウイルス（ＢＫＶ）およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に対して特異的なＴ細胞を生成した。
【0334】
［３．１ アデノウイルス］
【0335】
アデノウイルスは、依然として、易感染性個体における罹患率および死亡率の主原因であり、そのような個体においてアデノウイルスは、肺炎、出血性膀胱炎、腎炎、大腸炎、肝炎および脳炎を生じさせることがある。疾患処置に最も高頻度に使用される薬物はシドホビルであるが、明らかなウイルス性疾患を有する患者における臨床的有益性は限定的であり、付随する腎毒性は大きな懸念事項である。その上、前向き、無作為化、対照試験が存在しないので、薬物の有効性は不確かなままである（Ｌｅｅｎ ＡＭら、Ｂｉｏｌ．Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌ．、２００６）。ウイルス排除は循環ＡｄＶ特異的Ｔ細胞の検出と相関することが証明されていることから、養子Ｔ細胞移植は、治療の代替選択肢と見なされてきた（Ｆｅｕｃｈｔｉｎｇｅｒ Ｔ．ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、２００５）
【0336】
アデノウイルス特異的Ｔ細胞を生成するために、健常ドナーからの末梢血製剤からの単核細胞を、サイトカインＩＬ７およびＩＬ４と、アデノウイルスの最も免疫優性度の高い抗原、すなわちヘキソンおよびペントン、の配列全体にわたる臨床グレードのペプチド混合物（ｐｅｐｍｉｘ）とを補足したＴ細胞培地とともに、ＧＲｅｘ培養デバイスに添加することによって、前記単核細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化し、増殖させた。２回目の（培養１０～１３日目における）刺激のために、自家ＰＢＭＣにヘキソンおよびペントンに対して特異的なｐｅｐｍｉｘを再びパルスし、次いで照射（８０Ｇｙ）し、その後、それらをＡＰＣとして使用し、その後、ＩＬ４およびＩＬ７を補足し、そして後にＩＬ２を補足した培地で、増殖させた。培養物の特異性および細胞溶解能力を、図３９に示すように、０、１０および２０日目に評定した。０日目の未操作ＰＢＭＣと比較して、１０日目の培養物は、＞２０ ＩＦＮγ生産ＳＦＣによって証明されるように、ヘキソン指向およびペントン指向Ｔ細胞の出現頻度の実質的増加（それぞれ、２８．７および３２．３倍増加）を示した。２０日目の培養物は、１０日目の培養物に比べてＴ細胞特異性のさらなる増加（ヘキソンまたはペントン反応性細胞において、それぞれ、２．７および１．９倍増加）を示した。重要なこととして、２０日目の培養物は、アデノウイルス抗原負荷標的細胞の＞１０％細胞傷害性によって証明されるように、抗原負荷標的細胞を殺滅する能力を増殖細胞に付与する２回目の刺激を受けた細胞を含有した。
【0337】
［３．２ ＢＫウイルス］
【0338】
ＢＫＶは、一般集団の＞９０％において潜在性、無症候性の感染症を確立する偏在性ポリオーマウイルスである。しかし、固形臓器およびＨＳＣＴ同種移植レシピエント両方において、ウイルスの再活性化は度々起こり、循環ＢＫＶ特異的Ｔ細胞の非存在と相関する。それ故、ＢＫＶの尿排出がＨＳＣＴレシピエントの６０～８０％において起こり（Ｔｏｍｂｌｙｎ Ｍら、Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌ．、２００９）、５～１５％においてＢＫＶ関連出血性膀胱炎（ＰＶＨＣ）に進展し、その結果、長期入院、重度の罹患、および死亡率上昇となる。現在、ＢＫウイルス感染症の処置のための承認された抗ウイルス剤はまだ存在しない。
【0339】
ＢＫウイルス特異的Ｔ細胞を生成するために、健常ドナーからの末梢血からの単核細胞を、サイトカインＩＬ７およびＩＬ４と、ＢＫウイルスの最も免疫優性度の高い抗原、すなわちＬＴおよびＶＰ１、の配列全体にわたる臨床グレードのペプチド混合物（ｐｅｐｍｉｘ）とを補足したＴ細胞培地とともに、ＧＲｅｘ培養デバイスに添加することによって、前記単核細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化し、増殖させた。２回目の（培養１０～１３日目における）刺激のために、自家ＰＢＭＣにＬＴおよびＶＰ１に対して特異的なｐｅｐｍｉｘを再びパルスし、次いで照射（８０Ｇｙ）し、その後、それらをＡＰＣとして使用し、その後、ＩＬ４およびＩＬ７を補足した、そして後にＩＬ２を補足した培地で、増殖させた。培養物の特異性および細胞溶解能力を、上で説明したように、また図４０に示すように、０、１０および２０日目に評定した。０日目の無感作培養物と比較して、１０日目の培養物は、＞２０ ＩＦＮγ生産ＳＦＣによって証明されるように、ＬＴおよびＶＰ１特異的Ｔ細胞の出現頻度の実質的増加（それぞれ、３１６．８および３８．６倍増加）を示した。２０日目の培養物は、１０日目の培養物に比べてＴ細胞特異性のさらなる増加（ＬＴおよびＶＰ１反応性細胞において、それぞれ、２．７および１．９倍増加）を示した。重要なこととして、これらの培養物は、ＢＫウイルス抗原負荷標的細胞の＞２０％細胞傷害性によって証明されるように、抗原負荷標的細胞を殺滅する能力を増殖細胞に付与する２回目の刺激を受けた細胞を含有した。
【0340】
［３．３ サイトメガロウイルス］
【0341】
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）は、免疫正常個体において通常は無症候性感染を引き起こす潜在性ベータヘルペスウイルスである。ＣＭＶは、健常な成人のおおよそ７０％において存続し、上皮細胞、線維芽細胞および単球において複製する。幹細胞レシピエントにおけるＣＭＶの再活性化は、有意な罹患率および死亡率をもたらすことができ、間質性肺炎、胃腸炎、発熱、肝炎、脳炎および網膜炎をはじめとする臨床症状を伴う（Ｂｏｅｃｋｈ Ｍら、Ｂｉｏｌ．Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌ．、２００３）。細胞性免疫は、ＣＭＶ感染症を抑えるのに最も重要な因子と考えられ、ＣＭＶ特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋リンパ球は、一次感染症とその後の再活性化の両方に対する免疫防御に重要な役割を果す。
【0342】
ＣＭＶウイルス特異的Ｔ細胞を生成するために、健常ドナーからの末梢血からの単核細胞を、サイトカインＩＬ７およびＩＬ４と、ＣＭＶウイルスの最も免疫優性度の高い抗原、すなわちＩＥ１およびｐｐ６５、の配列全体にわたる臨床グレードのペプチド混合物（ｐｅｐｍｉｘ）とを補足したＴ細胞培地とともに、ＧＲｅｘ培養デバイスに添加することによって、前記単核細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化し、増殖させた。２回目の（培養１０～１３日目における）刺激のために、自家ＰＢＭＣにＩＥ１およびｐｐ６５に対して特異的なｐｅｐｍｉｘを再びパルスし、次いで照射（８０Ｇｙ）し、その後、それらをＡＰＣとして使用し、その後、ＩＬ４およびＩＬ７を補足し、そして後にＩＬ２を補足した培地で、増殖させた。培養物の特異性および細胞溶解能力を、上で説明したように、また図４１に示すように、０、１０および２０日目に評定した。０日目の無感作培養物と比較して、１０日目の培養物は、＞２０ ＩＦＮγ生産ＳＦＣによって証明されるように、ＩＥ１およびｐｐ６５の出現頻度の実質的増加（それぞれ、６．６６および５．７倍増加）を示した。２０日目の培養物は、１０日目の培養物に比べてＴ細胞特異性のさらなる増加（ＩＥ１およびｐｐ６５反応性細胞において、それぞれ、１．１および１．４倍増加）を示した。重要なこととして、これらの培養物は、ＣＭＶ抗原負荷標的細胞の＞２０％細胞傷害性によって証明されるように、抗原負荷標的細胞を殺滅する能力を増殖細胞に付与する２回目の刺激を受けた細胞を含有した。
【0343】
このセクションでは、ウイルスの１つ以上の免疫優性抗原に対して特異的なＴ細胞の製造および特徴づけを説明している。３つの実施例－ＡｄＶ、ＢＫウルスおよびＣＭＶ－を提供することにより、本発明者らは、このプロセスが堅牢であり、再現性のあるものであることを明らかにした。加えて、このプロセスにより、製造プロセスに含まれる２回目の刺激に主として起因する、免疫優性抗原に対する＞２０ ＩＦＮγ ＳＦＣおよび＞１０％の細胞傷害性を有する、ウイルス特異的Ｔ細胞の生成が可能になる。したがって、このプロセスを使用して、前に説明したようなｈＭＰＶおよびＰＩＶ３を含む任意のウイルスに対して特異的なＴ細胞を生成し、特徴づけることができる。
【0344】
［４．範囲］
【0345】
上で説明したプロセスによって製造し、特徴づけられた抗原特異的Ｔ細胞は、ドナー特異的設定と第３者設定の両方で用いることができる。その２つを後段で詳細に説明する：
【0346】
［４．１ ドナー特異的設定］
【0347】
この設定では、セクション１に概要を示した通りのステップに従って末梢血または白血球アフェレーシス産物から抗原特異的Ｔ細胞を生成する。その後、これらの細胞を患者に投与することができる。この概要を図４２に示す。
【0348】
［４．２ 第三者設定］
【0349】
この設定では、セクション１に概要を示したのと同様のステップに従って末梢血または白血球アフェレーシス産物から抗原特異的Ｔ細胞を生成し、凍結保存する。その後、図４３に概要を示すように、ＨＬＡがある程度適合している多数のレシピエントに投与することができる。
【0350】
［産物の使用］
【0351】
以下の説明は、産物が治療的に有用であるか否かを判定する方法に関する。特定の実施形態において、産物の使用は、
【0352】
［（ＲＴＢ）＋（ＲＴＫ）］×Ｔｈ
によって定義され得るものであり、この式が、≧１である場合、産物を患者に投与し、この式が、＜１である場合、投与しない。
によって定義され得るものであり、この式が、≧１である場合、産物を患者に投与し、この式が、＜１である場合、投与しない。
【0353】
この方程式中、
【0354】
Ｔｈ＝ＨＬＡＰ対ＨＬＡＰｔ、（共有アレル数）、この式が≧１である場合、１のＴｈ値に相当し、＜１である場合、０のＴｈ値に対応する
【0355】
ＨＬＡＰ＝産物のＨＬＡ型
【0356】
ＨＬＡＰｔ＝患者のＨＬＡ型
【0357】
実施例１は、産物を特定の患者に投与することになるシナリオを例証するものである。
【0358】
Ｔｂｉｏ－Ｐ＝２１２ＳＦＣ（２×１０５あたり）ＩＬ２
【0359】
Ｔｂｉｏ－Ｕ＝４４ＳＦＣ（２×１０５あたり）ＩＬ２
【0360】
ＴＳｐｅｃ－Ｐ＝５％
【0361】
ＴＣＳｐｅｃ＝１０％
【0362】
ＲＴＢ＝［（Ｔｂｉｏ－Ｐ）＋１］／［（Ｔｂｉｏ－Ｕ）＋１］
【0363】
ＲＴＢ＝［（２１２）＋１］／［（４４）＋１］＝４．７
【0364】
したがって、
【0365】
ＲＴＢ＝１
【0366】
ＲＴＫ＝［（ＴＳｐｅｃ－Ｐ）／（ＴＣＳｐｅｃ）］
【0367】
ＲＴＫ＝［（５％）／（１０％）］＝０．５
【0368】
したがって、
【0369】
ＲＴＫ＝０
【0370】
ＨＬＡＰ＝Ａ（２，３１）、Ｂ（３５，５１）、ＤＲ（３，４）、ＤＱ（２，４）
【0371】
ＨＬＡＰｔ＝Ａ（２，１１）、Ｂ（２７，３５）、ＤＲ（４，８）、ＤＱ（３，４）
【0372】
ＨＬＡＰ対ＨＬＡＰｔ＝４
【0373】
したがって、Ｔｈ＝１
【0374】
［（ＲＴＢ）＋（ＲＴＫ）］×Ｔｈ
【0375】
［（１）＋（０）］×１＝１
【0376】
したがって、この産物をこの特定の患者に投与することになる。
【0377】
実施例２は、産物を特定の患者に投与することになるシナリオを例証するものである。
【0378】
Ｔｂｉｏ－Ｐ＝５００ＳＦＣ（２×１０５あたり）ＩＬ２
【0379】
Ｔｂｉｏ－Ｕ＝１０ＳＦＣ（２×１０５あたり）ＩＬ２
【0380】
ＴＳｐｅｃ－Ｐ＝５５％
【0381】
ＴＣＳｐｅｃ＝１０％
【0382】
ＲＴＢ＝［（Ｔｂｉｏ－Ｐ）＋１］／［（Ｔｂｉｏ－Ｕ）＋１］
【0383】
ＲＴＢ＝［（５００）＋１］／［（１０）＋１］＝４５．５
【0384】
したがって、
【0385】
ＲＴＢ＝１
【0386】
ＲＴＫ＝［（ＴＳｐｅｃ－Ｐ）／（ＴＣＳｐｅｃ）］
【0387】
ＲＴＫ＝［（５５％）／（１０％）］＝５．５
【0388】
したがって、
【0389】
ＲＴＫ＝１
【0390】
ＨＬＡＰ＝Ａ（２，２４）、Ｂ（８，１４）、ＤＲ（１，３）、ＤＱ（２，５）
【0391】
ＨＬＡＰｔ＝Ａ（２，２３）、Ｂ（１５，４４）、ＤＲ（７，１３）、ＤＱ（３，３）
【0392】
ＨＬＡＰ対ＨＬＡＰｔ＝１
【0393】
したがって、Ｔｈ＝１
【0394】
［（ＲＴＢ）＋（ＲＴＫ）］×Ｔｈ
【0395】
［（１）＋（１）］×１＝２
【0396】
したがって、この産物をこの特定の患者に投与することになる。
【0397】
実施例３は、産物を特定の患者に投与しないことになるシナリオを例証するものである。
【0398】
Ｔｂｉｏ－Ｐ＝１２００ＳＦＣ（２×１０５あたり）ＩＬ２
【0399】
Ｔｂｉｏ－Ｕ＝５４ＳＦＣ（２×１０５あたり）ＩＬ２
【0400】
ＴＳｐｅｃ－Ｐ＝８７％
【0401】
ＴＣＳｐｅｃ＝１０％
【0402】
ＲＴＢ＝［（Ｔｂｉｏ－Ｐ）＋１］／［（Ｔｂｉｏ－Ｕ）＋１］
【0403】
ＲＴＢ＝［（１２００）＋１］／［（５４）＋１］＝２１．８
【0404】
したがって、
【0405】
ＲＴＢ＝１
【0406】
ＲＴＫ＝［（ＴＳｐｅｃ－Ｐ）／（ＴＣＳｐｅｃ）］
【0407】
ＲＴＫ＝［（８７％）／（１０％）］＝８．７
【0408】
したがって、
【0409】
ＲＴＫ＝１
【0410】
ＨＬＡＰ＝Ａ（１，２４）、Ｂ（８，１４）、ＤＲ（１１，８）、ＤＱ（２，５）
【0411】
ＨＬＡＰｔ＝Ａ（２，２３）、Ｂ（１５，４４）、ＤＲ（７，１３）、ＤＱ（３，３）
【0412】
ＨＬＡＰ対ＨＬＡＰｔ＝０
【0413】
したがって、Ｔｈ＝０
【0414】
［（ＲＴＢ）＋（ＲＴＫ）］×Ｔｈ
【0415】
［（１）＋（１）］×０＝０
【0416】
したがって、この産物をこの特定の患者に投与しないことになる。
【0417】
一実施例は、（ＲＴＢ）＋（ＲＴＫ）≧１によって定義され、［（ＲＴＢ）＋（ＲＴＫ）］×Ｔｈ≧１によって選択されたＣＭＶ特異的Ｔ細胞産物で処置した、活動性ＣＭＶ感染症を有する患者の臨床成績を代表するものである。図４５に示すように、ＣＭＶ特異的Ｔ細胞の投与後、患者の末梢血においてＰＣＲによって検出されたウイルス負荷のその後の減少があり、これは、ＩＦＮγ ＥＬＩｓｐｏｔによって検出されたＣＭＶ特異的Ｔ細胞の増加と逆相関があった。
【0418】
一実施例は、（ＲＴＢ）＋（ＲＴＫ）≧１によって定義され、［（ＲＴＢ）＋（ＲＴＫ）］×Ｔｈ≧１によって選択されたＥＢＶ特異的Ｔ細胞産物で処置した、活動性ウイルス感染症を有する患者の臨床成績を代表するものである。図４６に示すように、ＥＢＶ特異的Ｔ細胞の投与後、患者の末梢血においてＰＣＲによって検出されたウイルス負荷のその後の減少があり、これは、ＩＦＮγ ＥＬＩｓｐｏｔによって検出されたＥＢＶ特異的Ｔ細胞の増加と逆相関があった。
【0419】
この実施例は、（ＲＴＢ）＋（ＲＴＫ）≧１によって定義され、［（ＲＴＢ）＋（ＲＴＫ）］×Ｔｈ≧１によって選択されたＢＫＶ特異的Ｔ細胞産物で処置した、活動性ウイルス感染症を有する患者の臨床成績を代表するものである。図４７に示すように、ＢＫＶ特異的Ｔ細胞の投与後、患者の尿においてＰＣＲによって検出されたウイルス量のその後の減少があり、これは、ＩＦＮγ ＥＬＩｓｐｏｔによって検出されたＢＫＶ特異的Ｔ細胞の増加と逆相関があった。
【0420】
本発明の実施形態およびその利点を詳細に説明したが、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨および精神から逸脱することなく、この中で様々な変更、置換および代替を行うことができることは、理解されるはずである。さらに、本願の範囲は、本明細書に記載のプロセス、機械、製造（物）、物の組成物、手段、方法およびステップの特定の実施形態に限定されることを意図したものではない。本明細書に記載の対応する実施形態と実質的に同じ機能を果すまたは実質的に同じ結果を達成する、現在存在するまたは後に開発されるプロセス、機械、製造（物）、物の組成物、手段、方法またはステップを本発明に従って用いることができるということは、本発明の開示から当業者には容易に理解されるであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、それらの範囲内にそのようなプロセス、機械、製造（物）、物の組成物、手段、方法またはステップを含むことを意図したものである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41】
【図42】
【図43】
【図44】
【図45】
【図46】
【図47】