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▶ インスティテュート デ メディシナ モレキュラーの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2021-12-27
(45)【発行日】2022-02-04
(54)【発明の名称】ＩＬＣ３細胞に関連する疾患を処置する方法
(51)【国際特許分類】
C12P 21/00 20060101AFI20220128BHJP
A61K 31/47 20060101ALI20220128BHJP
A61K 38/17 20060101ALI20220128BHJP
A61K 38/18 20060101ALI20220128BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20220128BHJP
A61P 1/00 20060101ALI20220128BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20220128BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20220128BHJP
C07D 215/46 20060101ALI20220128BHJP
C07K 14/475 20060101ALI20220128BHJP
C07K 14/71 20060101ALI20220128BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20220128BHJP
C12N 5/078 20100101ALI20220128BHJP
【ＦＩ】
C12P21/00 K ZNA
A61K31/47
A61K38/17
A61K38/18
A61K39/395 D
A61K39/395 N
A61P1/00
A61P29/00
A61P31/00
C07D215/46
C07K14/475
C07K14/71
C07K16/28
C12N5/078
【請求項の数】
11
(21)【出願番号】P 2018560036
(86)(22)【出願日】2017-05-11
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2019-06-06
(86)【国際出願番号】 IB2017000901
(87)【国際公開番号】W WO2017195042
(87)【国際公開日】2017-11-16
【審査請求日】2020-05-08
(31)【優先権主張番号】20161000032176
(32)【優先日】2016-05-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】PT
(73)【特許権者】
【識別番号】511115734
【氏名又は名称】インスティテュート デ メディシナ モレキュラー ジョアオ ロボ アントゥネス
【氏名又は名称原語表記】Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ ｄｅ Ｍｅｄｉｃｉｎａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｊｏａｏ Ｌｏｂｏ Ａｎｔｕｎｅｓ
【住所又は居所原語表記】Ｆａｃｕｌｄａｄｅ ｄｅ Ｍｅｄｉｃｉｎａ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｄａｄｅ ｄｅ Ｌｉｓｂｏａ， Ａｖｅｎｉｄａ ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ Ｅｇａｓ Ｍｏｎｉｚ，１６４９－０２８ Ｌｉｓｂｏｎ，Ｐｏｒｔｕｇｕｅｓｅ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ
(74)【代理人】
【識別番号】100102842
【弁理士】
【氏名又は名称】葛和 清司
(72)【発明者】
【氏名】イビザ マルティネス，サレス
(72)【発明者】
【氏名】ヴェイガ フェルナンデス，ホセ，エンリケ
(72)【発明者】
【氏名】ガルシア－カッサーニ，ベタニア
【審査官】西 賢二
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１３－５１３５８８（ＪＰ，Ａ）
【文献】Atanasova, M. et al.，Activation of the RET Receptor Tyrosine Kinase by Agonist Antibodies Results in Distinct Signaling Effects，FASEB J., [online]，2015年，Vol. 29, Issue S1，https://faseb.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1096/fasebj.29.1_supplement.728.44，Internet, [retrieved on 2021.02.01]
【文献】Paratcha, G. et al.，Released GFRalpha1 potentiates downstream signaling, neuronal survival, and differentiation via a novel mechanism of recruitment of c-Ret to lipid rafts，Neuron，2001年，Vol. 29，pp. 171-184
【文献】Yang, G. et al.，The mouse soluble GFRalpha4 receptor activates RET independently of its ligand persephin，Oncogene，2007年，Vol. 26，pp. 3892-3898
【文献】Robinette, M. L. et al.，Transcriptional Programs Define Molecular Characteristics of Innate Lymphoid Cell Classes and Subsets，Nat. Immunol.，2015年，Vol. 16，pp. 306-317
【文献】Zhou, L. et al.，GDNF family ligand dependent STAT3 activation is mediated by specific alternatively spliced isoforms of GFRα2 and RET，Biochimica et Biophysica Acta，2013年，Vol. 1833，pp. 2789-2802
【文献】Backert, I. et al.，STAT3 Activation in Th17 and Th22 Cells Controls IL-22-Mediated Epithelial Host Defense during Infectious Colitis，Journal of Immunology，2014年，Vol. 193，pp. 3779-3791
【文献】Guo, X. et al.，Induction of Innate Lymphoid Cell-Derived Interleukin-22 by the Transcription Factor STAT3 Mediates Protection against Intestinal Infection，Immunity，2014年，Vol. 40，pp. 25-39
【文献】Singh, A. K. et al.，DOCK8 regulates protective immunity by controlling the function and survival of ROR gamma t(+) ILCs，Nature Communications，2014年，Vol. 5, No. 4603，pp. 1-12
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｐ １／００－４１／００
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ１２Ｎ １／００－７／０８
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
Ａ６１Ｋ
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
グループ３自然リンパ球系細胞（ＩＬＣ３）によるインターロイキン－２２（ＩＬ－２２）の産生を増加させる方法であって、ＩＬＣ３を、ＩＬＣ３によるＩＬ－２２の産生を増加させるのに有効な量のトランスフェクション中の再編成（ＲＥＴ）のアゴニストとin vitroで接触させること、
を含み、ここで前記ＲＥＴのアゴニストが、
（１）可溶性ＧＤＮＦファミリー結合受容体アルファ（ＧＦＲα）およびＧＦＲαリガンド（ＧＦＬ）の組合わせ；または
（２）ＲＥＴに特異的に結合してＲＥＴチロシンキナーゼ活性を増加させる抗体、またはその抗原結合断片、
を含む、前記方法。
【請求項2】
可溶性ＧＤＮＦファミリー結合受容体アルファ（ＧＦＲα）およびＧＦＲαリガンドの組合わせが、（１）以下の組合わせ：（ａ）可溶性ＧＤＮＦファミリー結合受容体アルファ１（ＧＦＲα１）およびグリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）；（ｂ）可溶性ＧＦＲα２およびニュールツリン（ＮＴＲＮ）；（ｃ）可溶性ＧＦＲα３およびアルテミン（ＡＲＴＮ）；（ｄ）可溶性ＧＦＲα４およびパーセフィン（ＰＳＰＮ）；（ｅ）可溶性ＧＦＲαおよびＮ（４）－（７－クロロ－２－［（Ｅ）－２－（２－クロロ－フェニル）－ビニル］－キノリン－４－イル）－Ｎ（１），Ｎ（１）－ジエチル－ペンタン－１，４－ジアミン（ＸＩＢ４０３５）；（ｆ）可溶性ＧＦＲαおよびＢＴ化合物；（ｇ）可溶性ＧＦＲαおよび、ＧＦＲαに特異的に結合して二量化する抗体；または
（２）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）および（ｇ）の２つ以上の組合わせ、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
トランスフェクション中の再編成（ＲＥＴ）のアゴニストを含む医薬組成物であって、該医薬組成物は、グループ３自然リンパ球系細胞（ＩＬＣ３）によるインターロイキン－２２（ＩＬ－２２）の産生を増加させる方法における使用のためのものであり、
該方法は、ＩＬＣ３を、ＩＬＣ３によるＩＬ－２２の産生を増加させるのに有効な量のＲＥＴのアゴニストと接触させることを含み、
該ＲＥＴのアゴニストは、
（１）可溶性ＧＤＮＦファミリー結合受容体アルファ（ＧＦＲα）およびＧＦＲαリガンド（ＧＦＬ）の組合わせ；または
（２）ＲＥＴに特異的に結合してＲＥＴチロシンキナーゼ活性を増加させる抗体、またはその抗原結合断片、
を含む、前記医薬組成物。
【請求項4】
可溶性ＧＤＮＦファミリー結合受容体アルファ（ＧＦＲα）およびＧＦＲαリガンドの組合わせが、（１）以下の組合わせ：（ａ）可溶性ＧＤＮＦファミリー結合受容体アルファ１（ＧＦＲα１）およびグリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）；（ｂ）可溶性ＧＦＲα２およびニュールツリン（ＮＴＲＮ）；（ｃ）可溶性ＧＦＲα３およびアルテミン（ＡＲＴＮ）；（ｄ）可溶性ＧＦＲα４およびパーセフィン（ＰＳＰＮ）；（ｅ）可溶性ＧＦＲαおよびＮ（４）－（７－クロロ－２－［（Ｅ）－２－（２－クロロ－フェニル）－ビニル］－キノリン－４－イル）－Ｎ（１），Ｎ（１）－ジエチル－ペンタン－１，４－ジアミン（ＸＩＢ４０３５）；（ｆ）可溶性ＧＦＲαおよびＢＴ化合物；（ｇ）可溶性ＧＦＲαおよび、ＧＦＲαに特異的に結合して二量化する抗体；または
（２）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）および（ｇ）の２つ以上の組合わせ、
を含む、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項5】
接触がin vitroである、請求項３または４に記載の医薬組成物。
【請求項6】
接触がin vivoである、請求項３または４に記載の医薬組成物。
【請求項7】
アゴニストが対象に投与される、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項8】
対象がヒトである、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項9】
対象が、それ以外ではＲＥＴのアゴニストによる処置を必要としない、請求項７または８に記載の医薬組成物。
【請求項10】
ＲＥＴのアゴニストが、静脈内、経口的、経鼻的、直腸内、または皮膚吸収を介して投与される、請求項８または９に記載の医薬組成物。
【請求項11】
消化管の感染または炎症の処置方法における使用のための、請求項８～１０のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、該方法は、かかる処置を必要とする対象に、消化管の感染または炎症を処置するのに有効な量のＲＥＴのアゴニストを投与することを含む、前記医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
背景
グループ３自然リンパ球系細胞（ＩＬＣ３）は、粘膜バリアにおける炎症および感染の主要な調節因子である１。ＩＬＣ３の発生はプログラムされていると考えられている１。しかしながら、ＩＬＣ３がいかにして局所的な環境シグナルを認知し、統合し、応答するかは不明のままである。
グループ３自然リンパ球系細胞（ＩＬＣ３）は、粘膜バリアにおける炎症および感染の主要な調節因子である１。ＩＬＣ３の発生はプログラムされていると考えられている１。しかしながら、ＩＬＣ３がいかにして局所的な環境シグナルを認知し、統合し、応答するかは不明のままである。
【発明の概要】
【0002】
本明細書に示されるように、ＩＬＣ３は、神経栄養因子によって調整される新規なグリアＩＬＣ３上皮細胞ユニットの一部として、その環境を感知し消化管防御を制御する。本明細書にさらに示されるように、腸内のＩＬＣ３は、神経調節受容体であるトランスフェクション中の再編成（ＲＥＴ）を発現する。ＩＬＣ３自律的なＲｅｔ消失は、先天性インターロイキン－２２（ＩＬ－２２）の減少、上皮反応性の障害、腸内毒素症（dysbiosis）、および腸の炎症と感染に対する感受性の増加をもたらした。神経栄養因子は、ｐ３８ ＭＡＰＫ／ＥＲＫ－ＡＫＴカスケードおよびＳＴＡＴ３活性化の下流における先天性Ｉｌ２２を直接制御した。驚くべきことにＩＬＣ３は、ＩＬＣ３凝集体中に星状突起を示した神経栄養因子発現グリア細胞に隣接していた。グリア細胞は、ＭＹＤ８８依存的様式で微小環境のキューを感知して、神経栄養因子および先天性ＩＬ－２２を制御する。したがって、グリア内因性Ｍｙｄ８８欠損は、ＩＬＣ３由来ＩＬ－２２の障害および、消化管の炎症および感染への顕著な傾向をもたらした。この研究は新規な多組織防御ユニットに光を当て、ニューロンの中心的なハブとしてのグリア細胞および、神経栄養因子シグナルを介する自然免疫調節を明らかにする。
【0003】
一態様によれば、グループ３自然リンパ球系細胞（ＩＬＣ３）によるインターロイキン－２２（ＩＬ－２２）の産生を増加させる方法が提供される。方法は、ＩＬＣ３を、ＩＬＣ３によるＩＬ－２２の産生を増加させるのに有効な量のトランスフェクション中の再編成（ＲＥＴ）のアゴニストと接触させることを含む。
いくつかの態様において、ＲＥＴのアゴニストは、（１）可溶性ＧＤＮＦファミリー結合受容体アルファ（ＧＦＲα）およびＧＦＲαリガンド（ＧＦＬ）またはそれらの類似体もしくは模倣体の組合わせ；または（２）ＲＥＴに特異的に結合してＲＥＴチロシンキナーゼ活性を増加させる抗体、またはその抗原結合断片、を含む。いくつかの態様において、可溶性ＧＤＮＦファミリー結合受容体アルファ（ＧＦＲα）およびＧＦＲαリガンドまたはそれらの類似体もしくは模倣体の組合わせは、（１）以下の組合わせ：（ａ）可溶性ＧＤＮＦファミリー結合受容体アルファ１（ＧＦＲα１）およびグリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）またはそれらの類似体もしくは模倣体；（ｂ）可溶性ＧＦＲα２およびニュールツリン（ＮＴＲＮ）またはその類似体もしくは模倣体；（ｃ）可溶性ＧＦＲα３およびアルテミン（ＡＲＴＮ）またはその類似体もしくは模倣体；（ｄ）可溶性ＧＦＲα４およびパーセフィン（ＰＳＰＮ）またはその類似体もしくは模倣体；（ｅ）可溶性ＧＦＲαおよびＮ（４）－（７－クロロ－２－［（Ｅ）－２－（２－クロロ－フェニル）－ビニル］－キノリン－４－イル）－Ｎ（１），Ｎ（１）－ジエチル－ペンタン－１，４－ジアミン（ＸＩＢ４０３５）；（ｆ）可溶性ＧＦＲαおよびＢＴ化合物；（ｇ）可溶性ＧＦＲαおよび、ＧＦＲαに特異的に結合して二量化する抗体；または（２）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）および（ｇ）の２つ以上の組合わせ、を含む。
いくつかの態様において、ＲＥＴのアゴニストは、（１）可溶性ＧＤＮＦファミリー結合受容体アルファ（ＧＦＲα）およびＧＦＲαリガンド（ＧＦＬ）またはそれらの類似体もしくは模倣体の組合わせ；または（２）ＲＥＴに特異的に結合してＲＥＴチロシンキナーゼ活性を増加させる抗体、またはその抗原結合断片、を含む。いくつかの態様において、可溶性ＧＤＮＦファミリー結合受容体アルファ（ＧＦＲα）およびＧＦＲαリガンドまたはそれらの類似体もしくは模倣体の組合わせは、（１）以下の組合わせ：（ａ）可溶性ＧＤＮＦファミリー結合受容体アルファ１（ＧＦＲα１）およびグリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）またはそれらの類似体もしくは模倣体；（ｂ）可溶性ＧＦＲα２およびニュールツリン（ＮＴＲＮ）またはその類似体もしくは模倣体；（ｃ）可溶性ＧＦＲα３およびアルテミン（ＡＲＴＮ）またはその類似体もしくは模倣体；（ｄ）可溶性ＧＦＲα４およびパーセフィン（ＰＳＰＮ）またはその類似体もしくは模倣体；（ｅ）可溶性ＧＦＲαおよびＮ（４）－（７－クロロ－２－［（Ｅ）－２－（２－クロロ－フェニル）－ビニル］－キノリン－４－イル）－Ｎ（１），Ｎ（１）－ジエチル－ペンタン－１，４－ジアミン（ＸＩＢ４０３５）；（ｆ）可溶性ＧＦＲαおよびＢＴ化合物；（ｇ）可溶性ＧＦＲαおよび、ＧＦＲαに特異的に結合して二量化する抗体；または（２）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）および（ｇ）の２つ以上の組合わせ、を含む。
【0004】
いくつかの態様において、接触はin vitroである。いくつかの態様において、接触はin vivoである。
いくつかの態様において、アゴニストは対象に投与される。いくつかの態様において、対象はヒトである。いくつかの態様において、対象は、それ以外ではアゴニストによる処置を必要としない。
別の側面によれば、グループ３自然リンパ球系細胞（ＩＬＣ３）に関連する疾患を処置する方法が提供される。方法は、かかる処置を必要とする対象に、疾患を処置するのに有効な量のトランスフェクション中の再編成（ＲＥＴ）のアゴニストを投与することを含む。
いくつかの態様において、アゴニストは対象に投与される。いくつかの態様において、対象はヒトである。いくつかの態様において、対象は、それ以外ではアゴニストによる処置を必要としない。
別の側面によれば、グループ３自然リンパ球系細胞（ＩＬＣ３）に関連する疾患を処置する方法が提供される。方法は、かかる処置を必要とする対象に、疾患を処置するのに有効な量のトランスフェクション中の再編成（ＲＥＴ）のアゴニストを投与することを含む。
【0005】
いくつかの態様において、ＲＥＴのアゴニストは、（１）可溶性ＧＤＮＦファミリー結合受容体アルファ（ＧＦＲα）およびＧＦＲαリガンドまたはそれらの類似体もしくは模倣体の組合わせ；または（２）ＲＥＴに特異的に結合してＲＥＴチロシンキナーゼ活性を増加させる抗体、またはその抗原結合断片、を含む。いくつかの態様において、可溶性ＧＤＮＦファミリー結合受容体アルファ（ＧＦＲα）およびＧＦＲαリガンドまたはそれらの類似体もしくは模倣体の組合わせは、（１）以下の組合わせ：（ａ）可溶性ＧＤＮＦファミリー結合受容体アルファ１（ＧＦＲα１）およびグリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）またはそれらの類似体もしくは模倣体；（ｂ）可溶性ＧＦＲα２およびニュールツリン（ＮＴＲＮ）またはその類似体もしくは模倣体；（ｃ）可溶性ＧＦＲα３およびアルテミン（ＡＲＴＮ）またはその類似体もしくは模倣体；（ｄ）可溶性ＧＦＲα４およびパーセフィン（ＰＳＰＮ）またはその類似体もしくは模倣体；（ｅ）可溶性ＧＦＲαおよびＮ（４）－（７－クロロ－２－［（Ｅ）－２－（２－クロロ－フェニル）－ビニル］－キノリン－４－イル）－Ｎ（１），Ｎ（１）－ジエチル－ペンタン－１，４－ジアミン（ＸＩＢ４０３５）；（ｆ）可溶性ＧＦＲαおよびＢＴ化合物；（ｇ）可溶性ＧＦＲαおよび、ＧＦＲαに特異的に結合して二量化する抗体；または（２）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）および（ｇ）の２つ以上の組合わせ、を含む。
いくつかの態様において、対象はヒトである。
いくつかの態様において、対象はヒトである。
【0006】
いくつかの態様において、疾患は、感染、炎症、新形成、または消化管生理変容（altered gut physiology）である。
いくつかの態様において、対象は、それ以外ではＲＥＴのアゴニストによる処置を必要としない。
いくつかの態様において、ＲＥＴのアゴニストは、静脈内、経口的、経鼻的、直腸内、または皮膚吸収を介して投与される。
別の側面によれば、グループ３自然リンパ球系細胞（ＩＬＣ３）に関連する疾患の処置における使用のための、トランスフェクション中の再編成（ＲＥＴ）のアゴニストが提供され、これは、かかる処置を必要とする対象に、疾患を処置するのに有効な量のＲＥＴのアゴニストを投与することを含む。
いくつかの態様において、対象は、それ以外ではＲＥＴのアゴニストによる処置を必要としない。
いくつかの態様において、ＲＥＴのアゴニストは、静脈内、経口的、経鼻的、直腸内、または皮膚吸収を介して投与される。
別の側面によれば、グループ３自然リンパ球系細胞（ＩＬＣ３）に関連する疾患の処置における使用のための、トランスフェクション中の再編成（ＲＥＴ）のアゴニストが提供され、これは、かかる処置を必要とする対象に、疾患を処置するのに有効な量のＲＥＴのアゴニストを投与することを含む。
【0007】
いくつかの態様において、ＲＥＴのアゴニストは、（１）可溶性ＧＤＮＦファミリー結合受容体アルファ（ＧＦＲα）およびＧＦＲαリガンド（ＧＦＬ）またはそれらの類似体もしくは模倣体の組合わせ；または（２）ＲＥＴに特異的に結合してＲＥＴチロシンキナーゼ活性を増加させる抗体、またはその抗原結合断片、を含む。いくつかの態様において、可溶性ＧＤＮＦファミリー結合受容体アルファ（ＧＦＲα）およびＧＦＲαリガンドまたはそれらの類似体もしくは模倣体の組合わせは、（１）以下の組合わせ：（ａ）可溶性ＧＤＮＦファミリー結合受容体アルファ１（ＧＦＲα１）およびグリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）またはそれらの類似体もしくは模倣体；（ｂ）可溶性ＧＦＲα２およびニュールツリン（ＮＴＲＮ）またはその類似体もしくは模倣体；（ｃ）可溶性ＧＦＲα３およびアルテミン（ＡＲＴＮ）またはその類似体もしくは模倣体；（ｄ）可溶性ＧＦＲα４およびパーセフィン（ＰＳＰＮ）またはその類似体もしくは模倣体；（ｅ）可溶性ＧＦＲαおよびＮ（４）－（７－クロロ－２－［（Ｅ）－２－（２－クロロ－フェニル）－ビニル］－キノリン－４－イル）－Ｎ（１），Ｎ（１）－ジエチル－ペンタン－１，４－ジアミン（ＸＩＢ４０３５）；（ｆ）可溶性ＧＦＲαおよびＢＴ化合物；（ｇ）可溶性ＧＦＲαおよび、ＧＦＲαに特異的に結合して二量化する抗体；または（２）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）および（ｇ）の２つ以上の組合わせ、を含む。
【0008】
いくつかの態様において、対象はヒトである。
いくつかの態様において、疾患は、感染、炎症、新形成、または消化管生理変容である。
いくつかの態様において、対象は、それ以外ではＲＥＴのアゴニストによる処置を必要としない。
いくつかの態様において、ＲＥＴのアゴニストは、静脈内、経口的、経鼻的、直腸内、または皮膚吸収を介して投与される。
別の側面によれば、グループ３自然リンパ球系細胞（ＩＬＣ３）に関連する疾患を処置する方法が提供される。方法は、かかる処置を必要とする対象に、疾患を処置するのに有効な量の、ＩＬＣ３を含む組成物を投与することを含む。
いくつかの態様において、疾患は、感染、炎症、新形成、または消化管生理変容である。
いくつかの態様において、対象は、それ以外ではＲＥＴのアゴニストによる処置を必要としない。
いくつかの態様において、ＲＥＴのアゴニストは、静脈内、経口的、経鼻的、直腸内、または皮膚吸収を介して投与される。
別の側面によれば、グループ３自然リンパ球系細胞（ＩＬＣ３）に関連する疾患を処置する方法が提供される。方法は、かかる処置を必要とする対象に、疾患を処置するのに有効な量の、ＩＬＣ３を含む組成物を投与することを含む。
【0009】
いくつかの態様において、組成物は、トランスフェクション中の再編成（ＲＥＴ）のアゴニストをさらに含む。いくつかの態様において、ＲＥＴのアゴニストは、（１）可溶性ＧＤＮＦファミリー結合受容体アルファ（ＧＦＲα）およびＧＦＲαリガンド（ＧＦＬ）またはそれらの類似体もしくは模倣体の組合わせ；または（２）ＲＥＴに特異的に結合してＲＥＴチロシンキナーゼ活性を増加させる抗体、またはその抗原結合断片、を含む。いくつかの態様において、可溶性ＧＤＮＦファミリー結合受容体アルファ（ＧＦＲα）およびＧＦＲαリガンドまたはそれらの類似体もしくは模倣体の組合わせは、（１）以下の組合わせ：（ａ）可溶性ＧＤＮＦファミリー結合受容体アルファ１（ＧＦＲα１）およびグリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）またはそれらの類似体もしくは模倣体；（ｂ）可溶性ＧＦＲα２およびニュールツリン（ＮＴＲＮ）またはその類似体もしくは模倣体；（ｃ）可溶性ＧＦＲα３およびアルテミン（ＡＲＴＮ）またはその類似体もしくは模倣体；（ｄ）可溶性ＧＦＲα４およびパーセフィン（ＰＳＰＮ）またはその類似体もしくは模倣体；（ｅ）可溶性ＧＦＲαおよびＮ（４）－（７－クロロ－２－［（Ｅ）－２－（２－クロロ－フェニル）－ビニル］－キノリン－４－イル）－Ｎ（１），Ｎ（１）－ジエチル－ペンタン－１，４－ジアミン（ＸＩＢ４０３５）；（ｆ）可溶性ＧＦＲαおよびＢＴ化合物；（ｇ）可溶性ＧＦＲαおよび、ＧＦＲαに特異的に結合して二量化する抗体；または（２）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）および（ｇ）の２つ以上の組合わせ、を含む。
【0010】
いくつかの態様において、対象はヒトである。
いくつかの態様において、疾患は、感染、炎症、新形成、または消化管生理変容である。
いくつかの態様において、対象は、それ以外ではＩＬＣ３またはＲＥＴのアゴニストによる処置を必要としない。
いくつかの態様において、ＩＬＣ３またはＲＥＴのアゴニストは、静脈内、経口的、経鼻的、直腸内、または皮膚吸収を介して投与される。
別の側面によれば、活性化されたグループ３自然リンパ球系細胞（ＩＬＣ３）を含む組成物が、ＩＬＣ３に関連する疾患の処置に使用するために提供され、これは、かかる処置を必要とする対象に、疾患を処置するのに有効な量のＩＬＣ３を含む組成物を投与することを含む。
いくつかの態様において、疾患は、感染、炎症、新形成、または消化管生理変容である。
いくつかの態様において、対象は、それ以外ではＩＬＣ３またはＲＥＴのアゴニストによる処置を必要としない。
いくつかの態様において、ＩＬＣ３またはＲＥＴのアゴニストは、静脈内、経口的、経鼻的、直腸内、または皮膚吸収を介して投与される。
別の側面によれば、活性化されたグループ３自然リンパ球系細胞（ＩＬＣ３）を含む組成物が、ＩＬＣ３に関連する疾患の処置に使用するために提供され、これは、かかる処置を必要とする対象に、疾患を処置するのに有効な量のＩＬＣ３を含む組成物を投与することを含む。
【0011】
いくつかの態様において、組成物は、トランスフェクション中の再編成（ＲＥＴ）のアゴニストをさらに含む。いくつかの態様において、ＲＥＴのアゴニストは、（１）可溶性ＧＤＮＦファミリー結合受容体アルファ（ＧＦＲα）およびＧＦＲαリガンド（ＧＦＬ）またはそれらの類似体もしくは模倣体の組合わせ；または（２）ＲＥＴに特異的に結合してＲＥＴチロシンキナーゼ活性を増加させる抗体、またはその抗原結合断片、を含む。いくつかの態様において、可溶性ＧＤＮＦファミリー結合受容体アルファ（ＧＦＲα）およびＧＦＲαリガンドまたはそれらの類似体もしくは模倣体の組合わせは、（１）以下の組合わせ：（ａ）可溶性ＧＤＮＦファミリー結合受容体アルファ１（ＧＦＲα１）およびグリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）またはそれらの類似体もしくは模倣体；（ｂ）可溶性ＧＦＲα２およびニュールツリン（ＮＴＲＮ）またはその類似体もしくは模倣体；（ｃ）可溶性ＧＦＲα３およびアルテミン（ＡＲＴＮ）またはその類似体もしくは模倣体；（ｄ）可溶性ＧＦＲα４およびパーセフィン（ＰＳＰＮ）またはその類似体もしくは模倣体；（ｅ）可溶性ＧＦＲαおよびＮ（４）－（７－クロロ－２－［（Ｅ）－２－（２－クロロ－フェニル）－ビニル］－キノリン－４－イル）－Ｎ（１），Ｎ（１）－ジエチル－ペンタン－１，４－ジアミン（ＸＩＢ４０３５）；（ｆ）可溶性ＧＦＲαおよびＢＴ化合物；（ｇ）可溶性ＧＦＲαおよび、ＧＦＲαに特異的に結合して二量化する抗体；または（２）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）および（ｇ）の２つ以上の組合わせ、を含む。
【0012】
いくつかの態様において、対象はヒトである。
いくつかの態様において、疾患は、感染、炎症、新形成、または消化管生理変容である。
いくつかの態様において、対象は、それ以外ではＩＬＣ３またはＲＥＴのアゴニストによる処置を必要としない。
いくつかの態様において、ＩＬＣ３またはＩＬＣ３およびＲＥＴのアゴニストは、静脈内、経口的、経鼻的、直腸内、または皮膚吸収を介して投与される。
別の側面によれば、グループ３自然リンパ球系細胞（ＩＬＣ３）によるインターロイキン－２２（ＩＬ－２２）の産生を減少させる方法が提供される。方法は、ＩＬＣ３を、ＩＬＣ３によるＩＬ－２２の産生を減少させるのに有効な量のトランスフェクション中の再編成（ＲＥＴ）のアンタゴニストと接触させること、を含む。
いくつかの態様において、疾患は、感染、炎症、新形成、または消化管生理変容である。
いくつかの態様において、対象は、それ以外ではＩＬＣ３またはＲＥＴのアゴニストによる処置を必要としない。
いくつかの態様において、ＩＬＣ３またはＩＬＣ３およびＲＥＴのアゴニストは、静脈内、経口的、経鼻的、直腸内、または皮膚吸収を介して投与される。
別の側面によれば、グループ３自然リンパ球系細胞（ＩＬＣ３）によるインターロイキン－２２（ＩＬ－２２）の産生を減少させる方法が提供される。方法は、ＩＬＣ３を、ＩＬＣ３によるＩＬ－２２の産生を減少させるのに有効な量のトランスフェクション中の再編成（ＲＥＴ）のアンタゴニストと接触させること、を含む。
【0013】
いくつかの態様において、ＲＥＴのアンタゴニストは、（１）（ａ）ＲＥＴチロシンキナーゼ活性、（ｂ）ＧＤＮＦファミリー結合受容体アルファ（ＧＦＲα）、または（ｃ）ＧＦＲαリガンドに、特異的に結合して阻害する抗体、またはその抗原結合断片；（２）ＲＥＴ、ＧＦＲα、またはＧＦＲαリガンドの発現、転写または翻訳を減少させる、阻害性核酸分子；または（３）ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤、任意にＡＳＴ４８７、モテサニブ、カボザンチニブ、バンデタニブ、ポナチニブ、スニチニブ、ソラフェニブまたはアレクチニブ、である。いくつかの態様において、ＧＦＲαは、ＧＦＲα１、ＧＦＲα２、ＧＦＲα３またはＧＦＲα４であり；または、ＧＦＲαリガンドは、グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン（ＮＴＲＮ）、アルテミン（ＡＲＴＮ）、またはパーセフィン（ＰＳＰＮ）である。いくつかの態様において、阻害性核酸分子は、ｓＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはアンチセンス核酸分子である。
いくつかの態様において、接触はin vitroである。いくつかの態様において、接触はin vivoである。
いくつかの態様において、接触はin vitroである。いくつかの態様において、接触はin vivoである。
【0014】
いくつかの態様において、ＲＥＴのアンタゴニストは、対象に投与される。いくつかの態様において、対象はヒトである。いくつかの態様において、対象は、それ以外ではＲＥＴのアンタゴニストによる処置を必要としない。
別の側面によれば、グループ３自然リンパ球系細胞（ＩＬＣ３）に関連する疾患を処置する方法が提供される。方法は、かかる処置を必要とする対象に、疾患を処置するのに有効な量のトランスフェクション中の再編成（ＲＥＴ）のアンタゴニストを投与することを含む。
いくつかの態様において、ＲＥＴのアンタゴニストは、（１）（ａ）ＲＥＴチロシンキナーゼ活性、（ｂ）ＧＤＮＦファミリー結合受容体アルファ（ＧＦＲα）、または（ｃ）ＧＦＲαリガンドに、特異的に結合して阻害する抗体、またはその抗原結合断片；（２）ＲＥＴ、ＧＦＲα、またはＧＦＲαリガンドの発現、転写または翻訳を減少させる、阻害性核酸分子；または（３）ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤、任意にＡＳＴ４８７、モテサニブ、カボザンチニブ、バンデタニブ、ポナチニブ、スニチニブ、ソラフェニブまたはアレクチニブ、である。いくつかの態様において、ＧＦＲαは、ＧＦＲα１、ＧＦＲα２、ＧＦＲα３またはＧＦＲα４であり；または、ＧＦＲαリガンドは、グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン（ＮＴＲＮ）、アルテミン（ＡＲＴＮ）、またはパーセフィン（ＰＳＰＮ）である。いくつかの態様において、阻害性核酸分子は、ｓＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはアンチセンス核酸分子である。
別の側面によれば、グループ３自然リンパ球系細胞（ＩＬＣ３）に関連する疾患を処置する方法が提供される。方法は、かかる処置を必要とする対象に、疾患を処置するのに有効な量のトランスフェクション中の再編成（ＲＥＴ）のアンタゴニストを投与することを含む。
いくつかの態様において、ＲＥＴのアンタゴニストは、（１）（ａ）ＲＥＴチロシンキナーゼ活性、（ｂ）ＧＤＮＦファミリー結合受容体アルファ（ＧＦＲα）、または（ｃ）ＧＦＲαリガンドに、特異的に結合して阻害する抗体、またはその抗原結合断片；（２）ＲＥＴ、ＧＦＲα、またはＧＦＲαリガンドの発現、転写または翻訳を減少させる、阻害性核酸分子；または（３）ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤、任意にＡＳＴ４８７、モテサニブ、カボザンチニブ、バンデタニブ、ポナチニブ、スニチニブ、ソラフェニブまたはアレクチニブ、である。いくつかの態様において、ＧＦＲαは、ＧＦＲα１、ＧＦＲα２、ＧＦＲα３またはＧＦＲα４であり；または、ＧＦＲαリガンドは、グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン（ＮＴＲＮ）、アルテミン（ＡＲＴＮ）、またはパーセフィン（ＰＳＰＮ）である。いくつかの態様において、阻害性核酸分子は、ｓＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはアンチセンス核酸分子である。
【0015】
いくつかの態様において、対象はヒトである。
いくつかの態様において、対象は、それ以外ではＲＥＴのアンタゴニストによる処置を必要としない。
いくつかの態様において、疾患は上皮性腸がんである。
いくつかの態様において、ＲＥＴのアンタゴニストは、静脈内、経口的、経鼻的、直腸内、または皮膚吸収を介して投与される。
別の側面によれば、トランスフェクション中の再編成（ＲＥＴ）のアンタゴニストが、グループ３自然リンパ球系細胞（ＩＬＣ３）に関連する疾患の処置に使用するために提供され、これは、かかる処置を必要とする対象に、疾患を処置するのに有効な量のＲＥＴのアンタゴニストを投与することを含む。
いくつかの態様において、対象は、それ以外ではＲＥＴのアンタゴニストによる処置を必要としない。
いくつかの態様において、疾患は上皮性腸がんである。
いくつかの態様において、ＲＥＴのアンタゴニストは、静脈内、経口的、経鼻的、直腸内、または皮膚吸収を介して投与される。
別の側面によれば、トランスフェクション中の再編成（ＲＥＴ）のアンタゴニストが、グループ３自然リンパ球系細胞（ＩＬＣ３）に関連する疾患の処置に使用するために提供され、これは、かかる処置を必要とする対象に、疾患を処置するのに有効な量のＲＥＴのアンタゴニストを投与することを含む。
【0016】
いくつかの態様において、ＲＥＴのアンタゴニストは、（１）（ａ）ＲＥＴチロシンキナーゼ活性、（ｂ）ＧＤＮＦファミリー結合受容体アルファ（ＧＦＲα）、または（ｃ）ＧＦＲαリガンドに、特異的に結合して阻害する抗体、またはその抗原結合断片；（２）ＲＥＴ、ＧＦＲα、またはＧＦＲαリガンドの発現、転写または翻訳を減少させる、阻害性核酸分子；または（３）ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤、任意にＡＳＴ４８７、モテサニブ、カボザンチニブ、バンデタニブ、ポナチニブ、スニチニブ、ソラフェニブまたはアレクチニブ、である。いくつかの態様において、ＧＦＲαは、ＧＦＲα１、ＧＦＲα２、ＧＦＲα３またはＧＦＲα４であり；または、ＧＦＲαリガンドは、グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン（ＮＴＲＮ）、アルテミン（ＡＲＴＮ）、またはパーセフィン（ＰＳＰＮ）である。
いくつかの態様において、対象はヒトである。
いくつかの態様において、対象は、それ以外ではＲＥＴのアンタゴニストによる処置を必要としない。
いくつかの態様において、対象はヒトである。
いくつかの態様において、対象は、それ以外ではＲＥＴのアンタゴニストによる処置を必要としない。
【0017】
いくつかの態様において、疾患は上皮性腸がんである。
いくつかの態様において、ＲＥＴのアンタゴニストは、静脈内、経口的、経鼻的、直腸内、または皮膚吸収を介して投与される。
本発明は、その適用において、以下の説明に記載されるかまたは図面に示される構成および構成要素の配置の詳細に限定されない。本発明は他の態様が可能であり、様々な方法で実施されるか実行されることが可能である。また、本明細書で使用される表現および用語は説明のためのものであり、限定するものと見なされるべきではない。「含む（including）」、「含む（comprising）」、「有する」、「含有する」、「関与する」、およびそれらの変形は、その後に列挙される項目およびその均等物ならびに追加の項目を包含することを意味する。
いくつかの態様において、ＲＥＴのアンタゴニストは、静脈内、経口的、経鼻的、直腸内、または皮膚吸収を介して投与される。
本発明は、その適用において、以下の説明に記載されるかまたは図面に示される構成および構成要素の配置の詳細に限定されない。本発明は他の態様が可能であり、様々な方法で実施されるか実行されることが可能である。また、本明細書で使用される表現および用語は説明のためのものであり、限定するものと見なされるべきではない。「含む（including）」、「含む（comprising）」、「有する」、「含有する」、「関与する」、およびそれらの変形は、その後に列挙される項目およびその均等物ならびに追加の項目を包含することを意味する。
【図面の簡単な説明】
【0018】
添付の図面は一定の縮尺で描くことを意図していない。図面において、様々な図に示されている同一またはほぼ同一の各構成要素は、同様の番号で表されている。わかりやすくするために、すべての構成要素がすべての図面においてラベル付けされてはいない。図面においては、以下である：
【0019】
【図1a-1h】神経栄養因子受容体ＲＥＴは、腸のＩＬＣ３由来ＩＬ－２２を駆動する。図１ａ、ＬＴｉ、ＮＣＲ－、およびＮＣＲ＋ ＩＬＣ３サブセット、Ｔ細胞（Ｔ）、Ｂ細胞（Ｂ）、樹状細胞（Ｄｃ）、マクロファージ（Ｍφ）、腸内ニューロン（Ｎ）および粘膜グリア細胞（Ｇ）。図１ｂ、ＲｅｔＧＦＰＩＬＣ３。図１ｃ、左：ＲｅｔＧＦＰ消化管。白：ＧＦＰ。右：ＩＬＣ３凝集体。図１ｄ、クリプトパッチ（ＣＰ）、未成熟（ｉＩＬＦ）および成熟（ｍＩＬＦ）の単離されたリンパ濾胞。緑：ＲＥＴ／ＧＦＰ；青：ＲＯＲγｔ；赤：Ｂ２２０。図１ｅ、ＲｅｔＧＦＰキメラ。ｎ＝１５。図１ｆ、１ｇ、ＲｅｔＧＦＰキメラ。ＲｅｔＷＴ／ＧＦＰ ｎ＝２５；ＲｅｔＧＦＰ／ＧＦＰ ｎ＝２２。図１ｈ、ＲｅｔＭＥＮ２Ｂマウス。ｎ＝７。スケールバー：１ｍｍ（ｃの左、ｅ）；５０μｍ（ｃの右）；３０μｍ（ｄ）。データは４回の独立した実験の代表値である。エラーバーはｓ．ｅ．ｍを示す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；ｎｓ：非有意。
【0020】
【図2a-2n】ＩＬＣ３内因性ＲＥＴシグナルは消化管防御を調節する。図２ａ、ＩＬＣ３由来サイトカイン。ｎ＝１１。図２ｂ、ＲｅｔΔおよびＲｅｔＭＥＮ２ＢマウスをそれらのＷＴ同腹仔対照と比較した。ｎ＝７。図２ｃ－２ｆ、ＤＳＳ処置。Ｒｅｔｆｌ ｎ＝８；ＲｅｔΔ ｎ＝８。ｃ、組織病理。図２ｄ、炎症スコアおよび結腸の長さ。図２ｅ、先天性ＩＬ－２２。図２ｆ、細菌の移行。図２ｇ－２ｊ、ＤＳＳ処置。ＲｅｔＷＴ ｎ＝８；ＲｅｔＭＥＮ２Ｂ ｎ＝８。図２ｇ、組織病理。図２ｈ、炎症スコアおよび結腸の長さ。図２ｉ、先天性ＩＬ－２２。図２ｊ、細菌の移行。図２ｋ－２ｎ、C. rodentium感染。Ｒａｇ１－／－．Ｒｅｔｆｌ ｎ＝１５；Ｒａｇ１－／－．ＲｅｔΔｎ＝１７。図２ｋ、組織病理。図２ｌ、炎症スコアおよび結腸の長さ。図２ｍ、先天性ＩＬ－２２。図２ｎ、感染負荷。スケールバー：２００μｍ。データは４回の独立した実験の代表値である。エラーバーはｓ．ｅ．ｍを示す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；ｎｓ：非有意。
【0021】
【図3a-3j】ＩＬＣ３自律的ＲＥＴシグナルは、ｐＳＴＡＴ３の下流のＩｌ２２を直接制御する。図３ａ、３ｂ、上皮／ＩＬＣ３オルガノイド。ｎ＝９。図３ｃ、ＲｅｔΔＩＬＣ３をそれらのＷＴ対照と比較。ｎ＝４。図３ｄ、ＧＦＬによるＩＬＣ３活性化。ｎ＝４。図３ｅ、ＲｅｔΔＩＬＣ３．ｐＥＲＫ ｎ＝８；ｐＡＫＴ ｎ＝１２；リン酸化ｐ３８／ＭＡＰキナーゼ ｎ＝６；ｐＳＴＡＴ３ ｎ＝１４。図３ｆ、ＧＦＬによるＩＬＣ３活性化。ｐＥＲＫ ｎ＝１０；ｐＡＫＴ ｎ＝１６；リン酸化ｐ３８／ＭＡＰキナーゼ ｎ＝３；ｐＳＴＡＴ３ ｎ＝１５。図３ｇ、培地（ｎ＝７）、ＧＦＬ（ｎ＝１１）、またはＧＦＬおよび以下に対する阻害剤で培養した、ＩＬＣ３中のｐＳＴＡＴ３：ｐ３８ ＭＡＰＫ／ＥＲＫ－ＡＫＴ（ＬＹ）（ｎ＝７）；ＥＲＫ（ＰＤ）（ｎ＝７）；ＡＫＴ（ＶＩＩＩ）（ｎ＝８）；およびｐ３８ ＭＡＰＫ（ＳＢ）（ｎ＝６）。図３ｈ、ＧＦＬ（ｎ＝１７）またはＧＦＬおよび阻害剤ＬＹ（ｎ＝１８）；ＰＤ（ｎ＝１６）；ＶＩＩＩ（ｎ＝１５）；ＳＢ（ｎ＝１５）；およびＳＴＡＴ３阻害剤（Ｓ３Ｉ）（ｎ＝８）で培養したＩＬＣ３中のＩｌ２２。図３ｉ、Ｉｌ２２遺伝子座。図３ｊ、ＧＦＬで刺激されたＩＬＣ３のＣｈＩＰ分析。ｎ＝１０。データは３回の独立した実験の代表値である。エラーバーはｓ．ｅ．ｍを示す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；ｎｓ：非有意。
【0022】
【図4a-4m】グリア細胞は、微小環境のＭＹＤ８８依存性の感知を介してＧＦＬ発現および先天性ＩＬ－２２を設定する。図４ａ、共飼育のＲｅｔｆｌ（白丸）およびＲｅｔΔ（黒丸）同腹仔からの重み付きUnifrac PCoA分析および属レベル比較。ｎ＝５。属（下から上へ）：紫：未分類Ｓ２４－７；赤：Bacteroides；青：未分類のClostridiales；緑：Sutterella；灰色：その他。図４ｂ－４ｄ、定着した無菌（ＧＦ）マウスのＤＳＳ処置。ｎ＝５。図４ｂ、組織病理。図４ｃ、炎症スコア。図４ｄ、先天性ＩＬ－２２。図４ｅ、抗生物質処置後の先天性ＩＬ－２２。ｎ＝８。図４ｆ、ＲｅｔＧＦＰ．Ｇｆａｐ－Ｃｒｅ．Ｒｏｓａ２６ＲＦＰマウス。緑：ＲＥＴ／ＧＦＰ；赤：ＧＦＡＰ／ＲＦＰ。図４ｇ、４ｈ、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＩＬ－１β受容体およびＩＬ－３３受容体リガンドによるグリア細胞活性化。ｎ＝６。図４ｉ、ＷＴ（白のバー）またはＭｙｄ８８－／－グリア細胞（黒のバー）と共培養したＩＬＣ３の、ＴＬＲリガンド、ＩＬ－１βおよびＩＬ－３３活性化。ｎ＝６。図４ｊ－４ｍ、Ｇｆａｐ－Ｃｒｅ．Ｍｙｄ８８ΔマウスのＤＳＳ処置。ｎ＝１２。図４ｊ、組織病理。図４ｋ、炎症スコアおよび結腸の長さ。図４ｌ、先天性ＩＬ－２２。図４ｍ、体重。スケールバー：２００μｍ（ｂ、ｊ）；１０μｍ（ｆ）。データは３～４回の独立した実験の代表値である。エラーバーはｓ．ｅ．ｍを示す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；ｎｓ：非有意。
【0023】
【図5a-5j】ＩＬＣ３は、神経栄養因子受容体ＲＥＴを選択的に発現する。図５ａ、消化管ＣＤ４５＋Ｌｉｎ－Ｔｈｙ１．２ｈｉＩＬ７Ｒα＋ＲＯＲγｔ＋ＩＬＣ３における、ＲＥＴタンパク質の発現。図５ｂ、ＲｅｔＧＦＰマウスからの消化管ＩＬＣ３の分析。胎生１４．５日目（Ｅ１４．５）。図５ｃ、５ｄ、ＲｅｔＧＦＰマウスからの腸内ＩＬＣ３サブセットの分析。図５ｅ、ＲｅｔＧＦＰマウスからのサイトカイン産生ＩＬＣ３の分析。図５ｆ、妊娠中のＲｅｔＧＦＰマウスに、生後から６週間における分析まで維持された、抗生物質カクテルを与えた。左：ＲＥＴ／ＧＦＰ（白）。右：ＩＬＣ３におけるＲＥＴ／ＧＦＰ発現のフローサイトメトリー分析。細線：Ａｂ処置；太線：ＳＰＦ。図５ｇ、無菌（ＧＦ）マウスおよび特異的病原体フリー（ＳＰＦ）対照からの腸内ＩＬＣ３におけるＲｅｔ発現。ｎ＝４。図５ｈ、ＲｅｔＧＦＰマウスからの粘膜固有層集団の分析。図５ｉ、腸内ＩＬＣ３クラスター。緑：ＲＥＴ／ＧＦＰ；青：ＲＯＲγｔ；赤：Ｂ２２０。下：ＲＥＴ／ＧＦＰおよびＲＯＲγｔ同時発現の定量分析（７９，９７±４，７２％）。図５ｊ、腸管絨毛におけるＩＬＣ３を発現する希少ＲＥＴ。緑：ＲＥＴ／ＧＦＰ；青：ＲＯＲγｔ；赤：ＣＤ３ε。スケールバー：１０μｍ。データは４回の独立した実験の代表値である。エラーバーはｓ．ｅ．ｍを示す。ｎｓ：非有意。
【0024】
【図6a-6b】ＲｅｔＧＦＰキメラおよびＲｅｔＭＥＮ２ＢマウスにおけるＴ細胞由来ＩＬ－２２およびＩＬ－１７。図６ａ、ＲｅｔＧＦＰキメラにおけるＴ細胞由来ＩＬ－１７。ＲｅｔＷＴ／ＧＦＰ ｎ＝２５；ＲｅｔＧＦＰ／ＧＦＰ ｎ＝２２。図６ｂ、ＲｅｔＭＥＮ２ＢマウスおよびそれらのＷＴ同腹仔対照の腸における、Ｔ細胞由来ＩＬ－２２およびＩＬ１７。ＲｅｔＷＴ ｎ＝７；ＲｅｔＭＥＮ２Ｂ ｎ＝７。データは４回の独立した実験の代表値である。エラーバーはｓ．ｅ．ｍを示す。ｎｓ：非有意。
【図7a-7i】定常状態ＲｅｔΔマウスにおける腸内ホメオスタシス。図７ａ、Ｒｏｒｇｔ－ＣｒｅマウスをＲｏｓａ２６ＹＦＰに交配させた。Ｒｏｒｇｔ－Ｃｒｅ．Ｒｏｓａ２６ＹＦＰマウスからの消化管ＩＬＣ３におけるＲｏｓａ２６／ＹＦＰ発現の分析。図７ｂ、パイエル板の数（ＰＰ）。Ｒｅｔｆｌ ｎ＝１０；ＲｅｔΔ ｎ＝１０。図７ｃ、ＲｅｔΔマウスおよびそれらのＷＴ同腹仔対照におけるＴ細胞由来ＩＬ－２２。Ｒｅｔｆｌ ｎ＝１１；ＲｅｔΔ ｎ＝１１。図７ｄ、ＲｅｔΔマウスおよびそれらのＷＴ同腹仔対照におけるγδＴ細胞由来ＩＬ－２２。Ｒｅｔｆｌｎ＝４；ＲｅｔΔ ｎ＝４。図７ｅ、腸管の絨毛および陰窩の形態。Ｒｅｔｆｌ ｎ＝６；ＲｅｔΔ ｎ＝６。図７ｆ、上皮細胞増殖。Ｒｅｔｆｌ ｎ＝５；ＲｅｔΔ ｎ＝５。図７ｇ、血漿中のデキストランＦｉｔｃによって測定された腸管傍細胞透過性。Ｒｅｔｆｌ ｎ＝５；ＲｅｔΔ ｎ＝５。図７ｈ、ＲｅｔΔ腸管上皮における、それらのＷＴ同腹仔対照と比較した組織修復遺伝子。ｎ＝８。図７ｉ、ＲｅｔＭＥＮ２Ｂ腸管上皮と比較した、抗ＩＬ－２２遮断抗体で処置したＲｅｔＭＥＮ２Ｂマウスの反応性遺伝子。ＲｅｔＭＥＮ２Ｂ ｎ＝４；ＲｅｔＭＥＮ２Ｂ＋抗ＩＬ－２２ ｎ＝４。データは３回の独立した実験の代表値である。エラーバーはｓ．ｅ．ｍを示す。ｎｓ：非有意。
【0025】
【図8a-8g】変化したＲＥＴシグナルを有するマウスにおける腸内炎症。マウスを飲料水中ＤＳＳで処置した。図８ａ、ＤＳＳ処置ＲｅｔΔマウスおよびそれらの同腹子対照の体重減少。Ｒｅｔｆｌ ｎ＝８；ＲｅｔΔ ｎ＝８。図８ｂ、ＤＳＳ処置後のＲｅｔΔマウスおよびＷＴ同腹仔対照における、Ｔ細胞由来ＩＬ－２２。Ｒｅｔｆｌ ｎ＝８；ＲｅｔΔ ｎ＝８。図８ｃ、ＤＳＳ処置ＲｅｔＭＥＮ２ＢマウスおよびそれらのＷＴ同腹仔対照の体重減少。ＲｅｔＷＴ ｎ＝８；ＲｅｔＭＥＮ２Ｂ ｎ＝８。図８ｄ、ＲｅｔＭＥＮ２ＢマウスおよびそれらのＷＴ同腹仔対照におけるＴ細胞由来ＩＬ－２２。ＲｅｔＷＴ ｎ＝８；ＲｅｔＭＥＮ２Ｂ ｎ＝８。図８ｅ、腸管の絨毛および陰窩の形態。Ｒｅｔｆｌ ｎ＝６；ＲｅｔΔ ｎ＝６。図８ｆ、ＤＳＳ処置ＲｅｔΔマウスにおける、それらのＷＴ同腹仔対照と比較した上皮反応性遺伝子発現。ｎ＝８。図８ｇ、ＤＳＳ処置ＲｅｔΔマウスにおける、それらのＷＴ同腹仔対照と比較した組織修復遺伝子発現。ｎ＝４。データは３～４回の独立した実験の代表値である。エラーバーはｓ．ｅ．ｍを示す。ｎｓ：非有意。エラーバーはｓ．ｅ．ｍを示す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；ｎｓ：非有意。
【0026】
【図9a-9k】ＲｅｔΔマウスにおけるCitrobacter rodentium感染。図９ａ、感染後６日目のＲａｇ１－／－．ＲｅｔΔおよびそれらのＲａｇ１－／－．Ｒｅｔｆｌ同腹仔対照の肝臓への、C. rodentiumの移行。ｎ＝１５。図９ｂ、C. rodentium感染後６日目のＲａｇ１－／－．ＲｅｔΔおよびそれらのＲａｇ１－／－．Ｒｅｔｆｌ同腹仔対照からの肝臓細胞懸濁液の、マッコンキープレート。図９ｃ、ルシフェラーゼ発現C. rodentium感染後６日目のＲａｇ１－／－．ＲｅｔΔおよびそれらのＲａｇ１－／－．Ｒｅｔｆｌ同腹仔対照の、全身イメージング。図９ｄ、C.rodentium感染Ｒａｇ１－／－．ＲｅｔΔマウスおよびそれらのＲａｇ１－／－．Ｒｅｔｆｌ同腹仔対照における、上皮反応性遺伝子発現。Ｒａｇ１－／－．Ｒｅｔｆｌ ｎ＝１５；Ｒａｇ１－／－．ＲｅｔΔ ｎ＝１７。図９ｅ、C.rodentium感染Ｒａｇ１－／－．ＲｅｔΔマウスおよびそれらのＲａｇ１－／－．Ｒｅｔｆｌ同腹子対照における体重減少。Ｒａｇ１－／－．Ｒｅｔｆｌ ｎ＝８；Ｒａｇ１－／－．ＲｅｔΔ ｎ＝８。図９ｆ、C.rodentium感染Ｒａｇ１－／－．ＲｅｔΔマウスおよびそれらのＲａｇ１－／－．Ｒｅｔｆｌ同腹子対照における、生存曲線。Ｒａｇ１－／－．Ｒｅｔｆｌ ｎ＝８；Ｒａｇ１－／－．ＲｅｔΔ ｎ＝８。図９ｇ、感染後６日目のＲｅｔΔおよびそれらのＲｅｔｆｌ同腹仔対照の肝臓への、C. rodentiumの移行。ｎ＝６。図９ｈ、C.rodentium感染後６日目のＲｅｔΔおよびそれらのＲｅｔｆｌ同腹仔対照からの肝臓細胞懸濁液の、マッコンキープレート。図９ｉ、ルシフェラーゼ発現C.rodentium感染後６日目のＲｅｔΔおよびそれらのＲｅｔｆｌ同腹子対照の、全身イメージング。図９ｊ、C.rodentium感染負荷。Ｒｅｔｆｌ ｎ＝８；ＲｅｔΔ ｎ＝８。図９ｋ、C.rodentium感染ＲｅｔΔマウスおよびそれらのＲｅｔｆｌ同腹仔対照における、先天性ＩＬ－２２。Ｒｅｔｆｌ ｎ＝８；ＲｅｔΔ ｎ＝８。データは３～４回の独立した実験の代表値である。エラーバーはｓ．ｅ．ｍを示す。ｎｓ：非有意。エラーバーはｓ．ｅ．ｍを示す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；ｎｓ：非有意。
【0027】
【図10a-10f】ＩＬＣ３におけるグリア由来神経栄養因子ファミリーリガンド（ＧＦＬ）シグナル。図１０ａ、多組織腸管オルガノイド系。スケールバー：２０μｍ。黒矢印：ＩＬＣ３。図１０ｂ、ＲｅｔΔマウスからのＩＬＣ３における、同腹子対照と比較したＩＬＣ関連遺伝子の発現。ｎ＝４。図１０ｃ、ビヒクルＢＳＡと比較した、全てのＧＦＬ／ＧＦＲα対（ＧＦＬ）；単一のＧＤＮＦファミリーリガンド（ＧＤＮＦ、ＡＲＴＮまたはＮＲＴＮ）；または単一のＧＦＬ／ＧＦＲα対（ＧＤＮＦ／ＧＦＲα１、ＡＲＴＮ／ＧＦＲα３またはＮＲＴＮ／ＧＦＲα２）を用いたＩＬＣ３活性化。ｎ＝５。図１０ｄ、ＲｅｔΔマウス（白抜き黒色）およびそれらの同腹子対照（白抜き点線）からのＩＬＣ３。アイソタイプ（塗りつぶし灰色）。図１０ｅ、ビヒクルＢＳＡ（白抜き点線）と比較した、ＧＦＬ（白抜き黒色）によるＩＬＣ３の３０分間の活性化。アイソタイプ（塗りつぶし灰色）。図１０ｆ、ＧＦＬによるＩＬＣ３の１０分間の活性化。ｐＥＲＫ ｎ＝８；ｐＡＫＴ ｎ＝８；リン酸化ｐ３８／ＭＡＰキナーゼ ｎ＝８；ｐＳＴＡＴ３ ｎ＝８。同様の結果が少なくとも３～４回の独立した実験で得られた。エラーバーはｓ．ｅ．ｍを示す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；ｎｓ：非有意。
【0028】
【0029】
【図12a-12g】ＧＦＬ発現グリア細胞はＩＬＣ３と解剖学的に共局在する。図１２ａ、ＲｅｔＧＦＰマウスの腸。緑：ＲＥＴ／ＧＦＰ；赤：ＧＦＡＰ；青：ＲＯＲγｔ。３回の独立した実験において同様の結果が得られた。図１２ｂ、精製された粘膜固有層のＬＴｉ、ＮＣＲ－およびＮＣＲ＋ＩＬＣ３サブセット、Ｔ細胞（Ｔ）、Ｂ細胞（Ｂ）、樹状細胞（Ｄｃ）、マクロファージ（Ｍφ）、腸内ニューロン（Ｎ）および粘膜グリア細胞（Ｇ）。図１２ｃ、ニューロスフェア由来グリア細胞。図１２ｄ、Ｍ：培地。ＴＬＲ２（Ｐａｍ３ＣＳＫ４）、ＴＬＲ３（Ｐｏｌｉ Ｉ：Ｃ）、ＴＬＲ４（ＬＰＳ）およびＴＬＲ９（ＤｓＤＮＡ－ＥＣ）リガンド、ならびにＩＬ－１β、ＩＬ－１８およびＩＬ－３３による、ニューロスフェア由来グリア細胞の活性化。ｎ＝６。図１２ｅ、グリアとＩＬＣ３との共培養において、単一または組み合わせのＧＦＬアンタゴニストを使用した場合のＩ２２。ｎ＝６。図１２ｆ、ＩＬＣ３およびＩｌ１ｂ－／－またはそれらのＷＴ対照由来のグリア細胞の共培養における、Ｉｌ２２。ｎ＝３。図１２ｇ、ＴＬＲ２刺激時のグリア細胞およびＩＬＣ３における、Ｇｄｎｆ、ＡｒｔｎおよびＮｒｔｎ発現。ｎ＝３。スケールバー：３０μｍ。同様の結果が少なくとも４回の独立した実験で得られた。
【0030】
【図13a-13h】ＭＹＤ８８シグナルを介したグリア細胞感知。ａ～ｃ、腸管グリア細胞をフローサイトメトリーにより精製した。図１３ａ、無菌（ＧＦ）およびそれらのそれぞれの特異的病原体フリー（ＳＰＦ）対照。ｎ＝３。図１３ｂ、Ｍｙｄ８８－／－およびそれらのそれぞれのＷＴ同腹仔対照。ｎ＝３。ｃ、Ｇｆａｐ－Ｃｒｅ．Ｍｙｄ８８Δおよびそれらの同腹子対照（Ｍｙｄ８８ｆ１）。ｎ＝３。図１３ｄ、Ｇｆａｐ－Ｃｒｅ．Ｍｙｄ８８Δおよびそれらの同腹子対照（Ｍｙｄ８８ｆ１）の、総粘膜固有層細胞。ｎ＝６。図１３ｅ～１３ｈ、Ｇｆａｐ－Ｃｒｅ．Ｍｙｄ８８Δマウスおよびその同腹子対照（Ｍｙｄ８８ｆ１）のCitrobacter rodentium感染。ｎ＝６。図１３ｅ、先天性ＩＬ－２２。図１３ｆ、Citrobacter rodentiumの移行。図１３ｇ、感染負荷。図１３ｈ、体重減少。データは３回の独立した実験の代表値である。エラーバーはｓ．ｅ．ｍを示す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；ｎｓ：非有意。
【0031】
【図14】神経栄養因子によって調整される新規のグリアＩＬＣ３上皮細胞ユニット。粘膜固有層グリア細胞は、神経栄養因子発現を制御する微小環境生成物を感知する。グリア由来神経栄養因子は、ｐ３８ＭＡＰＫ／ＥＲＫ－ＡＫＴカスケード下流の先天性ＩＬ－２２およびＳＴＡＴ３リン酸化を直接制御するチロシンキナーゼＲＥＴを活性化することにより、ＩＬＣ３に内在する様式で作用する。ＧＦＬ誘導性のＩＬ－２２は上皮細胞に作用して、反応性遺伝子発現（ＣＢＰ：共生細菌産物；ＡＭＰ：抗菌ペプチド；Ｍｕｃ：ムチン）を誘導する。したがって神経栄養因子は、グリア細胞感知、先天性ＩＬ－２２産生および腸管上皮バリア防御の間の分子リンクである。
【0032】
詳細な説明
グループ３自然リンパ球系細胞（ＩＬＣ３）は炎症促進性サイトカインを産生し、粘膜ホメオスタシスおよび抗菌性防御を調節する１。その発生的に制御されている確立されたプログラムに加えて、ＩＬＣ３はまた微生物および食物のシグナルによっても制御されており１－６、ＩＬＣ３が、予想できない別の環境感知戦略を有するとの仮説が立てられる。神経栄養因子は、ニューロンに対する細胞外環境のキューであり、神経系、腎臓および造血前駆細胞におけるチロシンキナーゼ受容体ＲＥＴを活性化するグリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）ファミリーリガンド（ＧＦＬ）を含む７－１１。
本明細書に示されるデータが実証するように、ＩＬＣ３は、樹状細胞由来サイトカインを組み込む十分に確立された能力に加えて１、特にグリア細胞由来神経調節因子の組み込みを介して異なる多組織調節シグナルを認知し、ＳＴＡＴ３活性およびＩＬ－２２発現を導く。したがって、ＩＬＣ３免疫のための配線されたシグナルを提供するのではなく、ＲＥＴシグナルは先天性ＩＬ－２２を決定的に微調整し、効率的な消化管ホメオスタシスおよび防御をもたらす。
グループ３自然リンパ球系細胞（ＩＬＣ３）は炎症促進性サイトカインを産生し、粘膜ホメオスタシスおよび抗菌性防御を調節する１。その発生的に制御されている確立されたプログラムに加えて、ＩＬＣ３はまた微生物および食物のシグナルによっても制御されており１－６、ＩＬＣ３が、予想できない別の環境感知戦略を有するとの仮説が立てられる。神経栄養因子は、ニューロンに対する細胞外環境のキューであり、神経系、腎臓および造血前駆細胞におけるチロシンキナーゼ受容体ＲＥＴを活性化するグリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）ファミリーリガンド（ＧＦＬ）を含む７－１１。
本明細書に示されるデータが実証するように、ＩＬＣ３は、樹状細胞由来サイトカインを組み込む十分に確立された能力に加えて１、特にグリア細胞由来神経調節因子の組み込みを介して異なる多組織調節シグナルを認知し、ＳＴＡＴ３活性およびＩＬ－２２発現を導く。したがって、ＩＬＣ３免疫のための配線されたシグナルを提供するのではなく、ＲＥＴシグナルは先天性ＩＬ－２２を決定的に微調整し、効率的な消化管ホメオスタシスおよび防御をもたらす。
【0033】
以前の研究では、ニューロンは間接的に胎児リンパ組織誘導細胞を形成し、グリア細胞の消失は消化管炎症を引き起こすことが実証された２８，２９。本明細書に記載されるように、グリア細胞は、ニューロンおよび先天性免疫調節の中心的なハブである。注目すべきことに、神経栄養因子は、グリア細胞感知、先天性ＩＬ－２２および腸管上皮防御の間の分子リンクである。したがって、グリア細胞／免疫細胞ユニットは、他のバリアにおけるホメオスタシス、特に皮膚、肺および脳におけるホメオスタシスに重要となり得る３０。進化の観点から、先天性免疫およびニューロン機能の調整は、効率的な粘膜ホメオスタシスおよび、生体異物、腸管感染、食餌性攻撃およびがんを含む様々な環境的チャレンジに対する同時調節された神経免疫応答を、確実にすることができる。
【0034】
ＩＬＣ３の活性を増加させる
本明細書に開示される方法は、グループ３自然リンパ球系細胞（ＩＬＣ３）によるインターロイキン－２２（ＩＬ－２２）の産生を増加させる方法であって、ＩＬＣ３を、ＩＬ－２２の産生を増加させるのに有効な量のＲＥＴのアゴニストと接触させることによる、前記方法を含む。
本明細書に開示される方法はまた、グループ３自然リンパ球系細胞（ＩＬＣ３）に関連する疾患を処置する方法であって、かかる処置を必要とする対象に、疾患を処置するのに有効な量のＲＥＴのアゴニストを投与することによる、前記方法を含む。
疾患を処置するための他の方法は、かかる処置を必要とする対象に、疾患を処置するのに有効な量の活性化ＩＬＣ３を含む組成物を投与することを含む。これらの方法のいくつかにおいて、活性化ＩＬＣ３を含む組成物はまた、ＲＥＴのアゴニストも含む。代替的に、ＲＥＴのアゴニストは、活性化ＩＬＣ３を含む組成物とは別に投与することができる。本明細書に記載されるように、ＩＬＣ３は、ＩＬＣ３を１つ以上のＧＤＮＦファミリーリガンド（ＧＦＬ）／ＧＤＮＦファミリー結合受容体アルファ（ＧＦＲα）対と接触させることによって、活性化することができる。ＧＤＮＦ／ＧＦＲα１、ＡＲＴＮ／ＧＦＲα３およびＮＲＴＮ／ＧＦＲα２の１つまたは全てを用いた活性化を、図１０ｃに示す；これらの対の他の組み合わせ、およびＰＳＰＮ／ＧＦＲα４単独または他のＧＦＬ／ＧＦＲα対と組み合わせたものもまた、使用することができる。
本明細書に開示される方法は、グループ３自然リンパ球系細胞（ＩＬＣ３）によるインターロイキン－２２（ＩＬ－２２）の産生を増加させる方法であって、ＩＬＣ３を、ＩＬ－２２の産生を増加させるのに有効な量のＲＥＴのアゴニストと接触させることによる、前記方法を含む。
本明細書に開示される方法はまた、グループ３自然リンパ球系細胞（ＩＬＣ３）に関連する疾患を処置する方法であって、かかる処置を必要とする対象に、疾患を処置するのに有効な量のＲＥＴのアゴニストを投与することによる、前記方法を含む。
疾患を処置するための他の方法は、かかる処置を必要とする対象に、疾患を処置するのに有効な量の活性化ＩＬＣ３を含む組成物を投与することを含む。これらの方法のいくつかにおいて、活性化ＩＬＣ３を含む組成物はまた、ＲＥＴのアゴニストも含む。代替的に、ＲＥＴのアゴニストは、活性化ＩＬＣ３を含む組成物とは別に投与することができる。本明細書に記載されるように、ＩＬＣ３は、ＩＬＣ３を１つ以上のＧＤＮＦファミリーリガンド（ＧＦＬ）／ＧＤＮＦファミリー結合受容体アルファ（ＧＦＲα）対と接触させることによって、活性化することができる。ＧＤＮＦ／ＧＦＲα１、ＡＲＴＮ／ＧＦＲα３およびＮＲＴＮ／ＧＦＲα２の１つまたは全てを用いた活性化を、図１０ｃに示す；これらの対の他の組み合わせ、およびＰＳＰＮ／ＧＦＲα４単独または他のＧＦＬ／ＧＦＲα対と組み合わせたものもまた、使用することができる。
【0035】
本明細書にさらに提供されるのは、ＩＬＣ３に関連する疾患を処置する際に使用するためのＲＥＴのアゴニスト、およびＩＬＣ３に関連する疾患を処置する際に使用するための活性化ＩＬＣ３（および任意にＲＥＴのアゴニスト）を含む組成物である。
本明細書で使用する場合、ＲＥＴ（トランスフェクション中の再編成）とは、細胞外シグナル伝達分子のグリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）ファミリーのメンバーに対する受容体チロシンキナーゼであり、Ｒｅｔ、ＰＴＣ、ＲＥＴ５１、ＲＥＴ９、ｃ－Ｒｅｔ、ＣＤＨＦ１２、ＣＤＨＲ１６、ＨＳＣＲ１、ＭＥＮ２Ａ、ＭＥＮ２Ｂ、ＭＴＣ１、ＲＥＴ－ＥＬＥ１およびｒｅｔ癌原遺伝子としても知られている。アミノ酸配列は、例えばUniProtKB P07949に見出すことができ；これはP07949-1（アイソフォーム１）およびP07949-2（アイソフォーム２）の２つのアイソフォームを有する。ヌクレオチド配列は、例えばX15262（ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ配列）に見出すことができる。
本明細書で使用する場合、ＲＥＴ（トランスフェクション中の再編成）とは、細胞外シグナル伝達分子のグリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）ファミリーのメンバーに対する受容体チロシンキナーゼであり、Ｒｅｔ、ＰＴＣ、ＲＥＴ５１、ＲＥＴ９、ｃ－Ｒｅｔ、ＣＤＨＦ１２、ＣＤＨＲ１６、ＨＳＣＲ１、ＭＥＮ２Ａ、ＭＥＮ２Ｂ、ＭＴＣ１、ＲＥＴ－ＥＬＥ１およびｒｅｔ癌原遺伝子としても知られている。アミノ酸配列は、例えばUniProtKB P07949に見出すことができ；これはP07949-1（アイソフォーム１）およびP07949-2（アイソフォーム２）の２つのアイソフォームを有する。ヌクレオチド配列は、例えばX15262（ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ配列）に見出すことができる。
【0036】
本明細書の他の箇所に記載されているように、ＲＥＴのアゴニストは以下を含む：（１）可溶性ＧＤＮＦファミリー結合受容体アルファ（ＧＦＲα）およびＧＦＲαリガンド（ＧＦＬ）またはそれらの類似体もしくは模倣体の組合わせ；または（２）ＲＥＴに特異的に結合してＲＥＴチロシンキナーゼ活性を増加させる抗体、またはその抗原結合断片。
ＩＬＣ３とＲＥＴのアゴニストとの接触は、in vitroで行うことができ、またはin vivoで行うことができる。ＩＬＣ３とＲＥＴのアゴニストとの接触がin vivoで行われる方法のいくつかの態様において、ＲＥＴのアゴニストは、ヒトなどの対象に投与される。これらの方法のいくつかにおいて、対象は、それ以外ではＲＥＴのアゴニストによる処置を必要としない。
開示される方法において、対象はヒトであることができる。これらの方法のいくつかにおいて、対象は、それ以外ではＲＥＴのアゴニストおよび／またはＩＬＣ３による処置を必要としない。
ＩＬＣ３とＲＥＴのアゴニストとの接触は、in vitroで行うことができ、またはin vivoで行うことができる。ＩＬＣ３とＲＥＴのアゴニストとの接触がin vivoで行われる方法のいくつかの態様において、ＲＥＴのアゴニストは、ヒトなどの対象に投与される。これらの方法のいくつかにおいて、対象は、それ以外ではＲＥＴのアゴニストによる処置を必要としない。
開示される方法において、対象はヒトであることができる。これらの方法のいくつかにおいて、対象は、それ以外ではＲＥＴのアゴニストおよび／またはＩＬＣ３による処置を必要としない。
【0037】
開示された方法によって処置可能な疾患には、感染、炎症、結腸直腸がんを含む新形成、および消化管生理変容が含まれる。
ＲＥＴのアゴニストおよび／または活性化ＩＬＣ３は、任意の適切な投与経路または送達方法によって投与することができる。適切な投与経路には、静脈内、経口、経鼻、直腸内または皮膚吸収が含まれる。
ＲＥＴのアゴニストおよび／または活性化ＩＬＣ３は、任意の適切な間隔で、例えば毎日、１日２回、１日３回、１日４回、隔日、毎週、２週間ごと、４週間ごと、連続的に（例えば注入、パッチ、ポンプなどによって）等々で、投与することができる。
ＲＥＴのアゴニストおよび／または活性化ＩＬＣ３は、任意の適切な投与経路または送達方法によって投与することができる。適切な投与経路には、静脈内、経口、経鼻、直腸内または皮膚吸収が含まれる。
ＲＥＴのアゴニストおよび／または活性化ＩＬＣ３は、任意の適切な間隔で、例えば毎日、１日２回、１日３回、１日４回、隔日、毎週、２週間ごと、４週間ごと、連続的に（例えば注入、パッチ、ポンプなどによって）等々で、投与することができる。
【0038】
ＩＬＣ３の活性を低下させる
本明細書に開示されるさらなる方法は、グループ３自然リンパ球系細胞（ＩＬＣ３）によるインターロイキン－２２（ＩＬ－２２）の産生を減少させる方法であって、ＩＬＣ３を、ＩＬＣ３によるＩＬ－２２の産生を減少させるのに有効な量でＲＥＴのアンタゴニストと接触させることによる、前記方法を含む。
本明細書に開示される方法はまた、グループ３自然リンパ球系細胞（ＩＬＣ３）に関連する疾患を処置する方法であって、かかる処置を必要とする対象に、疾患を処置するのに有効な量のＲＥＴのアンタゴニストを投与することによる、前記方法を含む。
本明細書にさらに提供されるのは、ＩＬＣ３に関連する疾患を処置する際に使用するための、ＲＥＴのアンタゴニストである。
本明細書の他の箇所に記載されるように、ＲＥＴのアンタゴニストは、ＲＥＴの発現、転写または翻訳を減少させる阻害性核酸分子、例えばｓＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはアンチセンス核酸分子など；ＲＥＴに特異的に結合し阻害する抗体またはその抗原結合性断片、またはＲＥＴの小分子アンタゴニスト、などを含む。
本明細書に開示されるさらなる方法は、グループ３自然リンパ球系細胞（ＩＬＣ３）によるインターロイキン－２２（ＩＬ－２２）の産生を減少させる方法であって、ＩＬＣ３を、ＩＬＣ３によるＩＬ－２２の産生を減少させるのに有効な量でＲＥＴのアンタゴニストと接触させることによる、前記方法を含む。
本明細書に開示される方法はまた、グループ３自然リンパ球系細胞（ＩＬＣ３）に関連する疾患を処置する方法であって、かかる処置を必要とする対象に、疾患を処置するのに有効な量のＲＥＴのアンタゴニストを投与することによる、前記方法を含む。
本明細書にさらに提供されるのは、ＩＬＣ３に関連する疾患を処置する際に使用するための、ＲＥＴのアンタゴニストである。
本明細書の他の箇所に記載されるように、ＲＥＴのアンタゴニストは、ＲＥＴの発現、転写または翻訳を減少させる阻害性核酸分子、例えばｓＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはアンチセンス核酸分子など；ＲＥＴに特異的に結合し阻害する抗体またはその抗原結合性断片、またはＲＥＴの小分子アンタゴニスト、などを含む。
【0039】
ＩＬＣ３とＲＥＴのアンタゴニストの接触は、in vitroで行うことができ、またはin vivoで行うことができる。ＩＬＣ３とＲＥＴのアンタゴニストとの接触がin vivoで行われる方法のいくつかの態様において、ＲＥＴのアンタゴニストは、ヒトなどの対象に投与される。これらの方法のいくつかにおいて、対象は、それ以外ではＲＥＴのアンタゴニストによる処置を必要としない。
開示される方法において、対象はヒトであることができる。これらの方法のいくつかにおいて、対象は、それ以外ではＲＥＴのアンタゴニストによる処置を必要としない。
ＲＥＴのアンタゴニストを投与することにより疾患を処置するための本明細書に開示される方法において、疾患は上皮性腸がんであることができる。
ＲＥＴのアンタゴニストは、任意の適切な投与経路または送達方法によって投与することができる。適切な投与経路には、静脈内、経口、経鼻、直腸内または皮膚吸収が含まれる。
ＲＥＴのアンタゴニストは、任意の適切な間隔で、例えば毎日、１日２回、１日３回、１日４回、隔日、毎週、２週間ごと、４週間ごと、連続的に（例えば注入、パッチ、ポンプにより）等々で、投与することができる。
開示される方法において、対象はヒトであることができる。これらの方法のいくつかにおいて、対象は、それ以外ではＲＥＴのアンタゴニストによる処置を必要としない。
ＲＥＴのアンタゴニストを投与することにより疾患を処置するための本明細書に開示される方法において、疾患は上皮性腸がんであることができる。
ＲＥＴのアンタゴニストは、任意の適切な投与経路または送達方法によって投与することができる。適切な投与経路には、静脈内、経口、経鼻、直腸内または皮膚吸収が含まれる。
ＲＥＴのアンタゴニストは、任意の適切な間隔で、例えば毎日、１日２回、１日３回、１日４回、隔日、毎週、２週間ごと、４週間ごと、連続的に（例えば注入、パッチ、ポンプにより）等々で、投与することができる。
【0040】
トランスフェクション中の再編成（ＲＥＴ）のアゴニスト
ＲＥＴのアゴニストは、（１）可溶性ＧＤＮＦファミリー結合受容体アルファ（ＧＦＲα）およびＧＦＲαリガンド（ＧＦＬ）またはそれらの類似体もしくは模倣体の組合わせ；または（２）ＲＥＴに特異的に結合してＲＥＴチロシンキナーゼ活性を増加させる抗体またはその抗原結合断片、を含む。ＲＥＴのアゴニストは、ＲＥＴのチロシンキナーゼ活性に直接影響を与え得るか、またはＲＥＴ二量体化を増加または誘導し得、結果としてＲＥＴチロシンキナーゼ活性が増加し得る。
ＲＥＴアゴニストは、ＲＥＴに完全に特異的であり得、ＲＥＴに優先的に（他のチロシンキナーゼと比較して）作用し得るか、またはＲＥＴおよび他のチロシンキナーゼの両方に作用し得る。かかるアゴニストは、ＲＥＴが他のチロシンキナーゼよりも少なくアゴナイズされるとしても有用であり得るが、本明細書に記載の方法で使用されるアゴニストが、他のチロシンキナーゼよりもＲＥＴをよりアゴナイズすることが好ましい。本明細書で使用する場合、ＲＥＴを優先的に（他のチロシンキナーゼと比較して）アゴナイズするとは、アゴニストがＲＥＴを、少なくとも１０％、２５％、５０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、またはそれ以上、アゴナイズすることを意味する。
ＲＥＴのアゴニストは、（１）可溶性ＧＤＮＦファミリー結合受容体アルファ（ＧＦＲα）およびＧＦＲαリガンド（ＧＦＬ）またはそれらの類似体もしくは模倣体の組合わせ；または（２）ＲＥＴに特異的に結合してＲＥＴチロシンキナーゼ活性を増加させる抗体またはその抗原結合断片、を含む。ＲＥＴのアゴニストは、ＲＥＴのチロシンキナーゼ活性に直接影響を与え得るか、またはＲＥＴ二量体化を増加または誘導し得、結果としてＲＥＴチロシンキナーゼ活性が増加し得る。
ＲＥＴアゴニストは、ＲＥＴに完全に特異的であり得、ＲＥＴに優先的に（他のチロシンキナーゼと比較して）作用し得るか、またはＲＥＴおよび他のチロシンキナーゼの両方に作用し得る。かかるアゴニストは、ＲＥＴが他のチロシンキナーゼよりも少なくアゴナイズされるとしても有用であり得るが、本明細書に記載の方法で使用されるアゴニストが、他のチロシンキナーゼよりもＲＥＴをよりアゴナイズすることが好ましい。本明細書で使用する場合、ＲＥＴを優先的に（他のチロシンキナーゼと比較して）アゴナイズするとは、アゴニストがＲＥＴを、少なくとも１０％、２５％、５０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、またはそれ以上、アゴナイズすることを意味する。
【0041】
可溶性ＧＦＲαおよびＧＦＲαリガンド（ＧＦＬ）またはそれらの類似体もしくは模倣体の組合わせは、（１）以下の組合わせ：（ａ）可溶性ＧＤＮＦファミリー結合受容体アルファ１（ＧＦＲα１）およびグリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）またはそれらの類似体もしくは模倣体；（ｂ）可溶性ＧＦＲα２およびニュールツリン（ＮＴＲＮ）またはその類似体もしくは模倣体；（ｃ）可溶性ＧＦＲα３およびアルテミン（ＡＲＴＮ）またはその類似体もしくは模倣体；（ｄ）可溶性ＧＦＲα４およびパーセフィン（ＰＳＰＮ）またはその類似体もしくは模倣体；（ｅ）可溶性ＧＦＲαおよびＮ（４）－（７－クロロ－２－［（Ｅ）－２－（２－クロロ－フェニル）－ビニル］－キノリン－４－イル）－Ｎ（１），Ｎ（１）－ジエチル－ペンタン－１，４－ジアミン（ＸＩＢ４０３５）；（ｆ）可溶性ＧＦＲαおよびＢＴ化合物；（ｇ）可溶性ＧＦＲαおよび、ＧＦＲαに特異的に結合して二量化する抗体；または（２）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）および（ｇ）の２つ以上の組合わせ、を含む
可溶性ＧＦＲα分子およびＧＦＲαリガンド（ＧＦＬ）としては、本明細書に記載のＧＦＲαおよびＧＦＬ、例えばＧＦＲα１、ＧＦＲα２、ＧＦＲα３およびＧＦＲα４；およびそれぞれのリガンドＧＤＮＦ、ＮＴＲＮ、ＡＴＲＮ、およびＰＳＰＮが含まれる。ＧＦＲαおよびＧＦＬの類似体、模倣体、誘導体およびコンジュゲートとしては、天然ＧＦＲαおよびＧＦＬ配列と比較してアミノ酸配列に変化を有するが、ＲＥＴを活性化する機能は保持する、ＧＦＲαおよびＧＦＬ類似体が含まれる。
可溶性ＧＦＲα分子およびＧＦＲαリガンド（ＧＦＬ）としては、本明細書に記載のＧＦＲαおよびＧＦＬ、例えばＧＦＲα１、ＧＦＲα２、ＧＦＲα３およびＧＦＲα４；およびそれぞれのリガンドＧＤＮＦ、ＮＴＲＮ、ＡＴＲＮ、およびＰＳＰＮが含まれる。ＧＦＲαおよびＧＦＬの類似体、模倣体、誘導体およびコンジュゲートとしては、天然ＧＦＲαおよびＧＦＬ配列と比較してアミノ酸配列に変化を有するが、ＲＥＴを活性化する機能は保持する、ＧＦＲαおよびＧＦＬ類似体が含まれる。
【0042】
ＧＦＲα１はまた、ＧＤＮＦ受容体、ＧＦＲＡ１、ＧＤＮＦＲ、ＧＤＮＦＲＡ、ＧＦＲ－ＡＬＰＨＡ－１、ＲＥＴ１Ｌ、ＲＥＴＬ１、ＴＲＮＲ１、およびＧＤＮＦファミリー受容体アルファ１としても知られている。アミノ酸配列は、例えば、UniProtKB P56159に見出すことができ；これは２つのアイソフォーム、P56159-1（アイソフォーム１）およびP56159-2（アイソフォーム２）を有する。ヌクレオチド配列は、例えばAF042080.1（ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ配列）に見出すことができる。
ＧＦＲα２はまた、ニュールツリン受容体、ＧＦＲＡ２、ＧＤＮＦＲＢ、ＮＲＴＮＲ－ＡＬＰＨＡ、ＮＴＮＲＡ、ＲＥＴＬ２、ＴＲＮＲ２、およびＧＤＮＦファミリー受容体アルファ２としても知られている。アミノ酸配列は、例えば、UniProtKB-O00451に見出すことができ；これは３つのアイソフォーム、O00451-1（アイソフォーム１）、O00451-2（アイソフォーム２）およびO00451-3（アイソフォーム３）を有する。ヌクレオチド配列は、例えば、AY326396（ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ配列）に見出すことができる。
ＧＦＲα３はまた、アルテミン受容体、ＧＦＲＡ３、ＧＤＮＦＲ３、およびＧＤＮＦファミリー受容体アルファとしても知られている。アミノ酸配列は、例えば、UniProtKB O60609に見出すことができ；これは２つのアイソフォーム、O60609-1（アイソフォーム１）およびO60609-2（アイソフォーム２）を有する。ヌクレオチド配列は、例えば、AK297693（ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ配列）に見出すことができる。
ＧＦＲα２はまた、ニュールツリン受容体、ＧＦＲＡ２、ＧＤＮＦＲＢ、ＮＲＴＮＲ－ＡＬＰＨＡ、ＮＴＮＲＡ、ＲＥＴＬ２、ＴＲＮＲ２、およびＧＤＮＦファミリー受容体アルファ２としても知られている。アミノ酸配列は、例えば、UniProtKB-O00451に見出すことができ；これは３つのアイソフォーム、O00451-1（アイソフォーム１）、O00451-2（アイソフォーム２）およびO00451-3（アイソフォーム３）を有する。ヌクレオチド配列は、例えば、AY326396（ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ配列）に見出すことができる。
ＧＦＲα３はまた、アルテミン受容体、ＧＦＲＡ３、ＧＤＮＦＲ３、およびＧＤＮＦファミリー受容体アルファとしても知られている。アミノ酸配列は、例えば、UniProtKB O60609に見出すことができ；これは２つのアイソフォーム、O60609-1（アイソフォーム１）およびO60609-2（アイソフォーム２）を有する。ヌクレオチド配列は、例えば、AK297693（ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ配列）に見出すことができる。
【0043】
ＧＦＲα４はまた、パーセフィン受容体およびＧＦＲＡ４としても知られている。アミノ酸配列は、例えば、UniProtKB Q9GZZ7に見出すことができ；これは３つのアイソフォーム、Q9GZZ7-1（アイソフォームＧＦＲα４ｂ）、Q9GZZ7-2（アイソフォームＧＦＲα４ａ）およびQ9GZZ7-3（アイソフォームＧＦＲα４ｃ）を有する。ヌクレオチド配列は、例えば、AF253318に見出すことができる。
グリア細胞由来の神経栄養因子はまた、ＧＤＮＦ、ＡＴＦ１、ＡＴＦ２、ＨＦＢ１－ＨＳＣＲ３、およびグリア細胞由来の神経栄養因子としても知られている。アミノ酸配列は、例えばUniProtKB P39905に見出すことができ；これは３つのアイソフォーム、P39905-1（アイソフォーム１）、P39905-2（アイソフォーム２）およびP39905-3（アイソフォーム３）、P39905-2（アイソフォーム４）およびP39905-3（アイソフォーム５）を有する。ヌクレオチド配列は、例えばＣＲ５４１９２３（ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ配列）に見出すことができる。
ニューツリンは、ＮＴＲＮとしても知られている。アミノ酸配列は、例えば、UniProtKB Q99748に見出すことができる。ヌクレオチド配列は、例えばBC137399（ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ配列）に見出すことができる。
グリア細胞由来の神経栄養因子はまた、ＧＤＮＦ、ＡＴＦ１、ＡＴＦ２、ＨＦＢ１－ＨＳＣＲ３、およびグリア細胞由来の神経栄養因子としても知られている。アミノ酸配列は、例えばUniProtKB P39905に見出すことができ；これは３つのアイソフォーム、P39905-1（アイソフォーム１）、P39905-2（アイソフォーム２）およびP39905-3（アイソフォーム３）、P39905-2（アイソフォーム４）およびP39905-3（アイソフォーム５）を有する。ヌクレオチド配列は、例えばＣＲ５４１９２３（ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ配列）に見出すことができる。
ニューツリンは、ＮＴＲＮとしても知られている。アミノ酸配列は、例えば、UniProtKB Q99748に見出すことができる。ヌクレオチド配列は、例えばBC137399（ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ配列）に見出すことができる。
【0044】
アルテミンはまた、ＡＴＲＮ、エノビン、ニューブラスチン、ＥＶＮおよびＮＢＮとしても知られている。アミノ酸配列は、例えば、UniProtKB Q5T4W7に見出すことができ；これは３つのアイソフォーム、Q5T4W7-1（アイソフォーム１）、Q5T4W7-2（アイソフォーム２）およびQ5T4W7-3（アイソフォーム３）を有する。ヌクレオチド配列は、例えばAF109401（ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ配列）に見出すことができる。
パーセフィンは、ＰＳＰＮとしても知られている。アミノ酸配列は、例えば、UniProtKB O60542に見出すことができる。ヌクレオチド配列は、例えば、AF040962（ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ配列）に見出すことができる。
パーセフィンは、ＰＳＰＮとしても知られている。アミノ酸配列は、例えば、UniProtKB O60542に見出すことができる。ヌクレオチド配列は、例えば、AF040962（ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ配列）に見出すことができる。
【0045】
ＧＦＬの類似体、誘導体およびコンジュゲートの例としては、以下を含む：ＧＤＮＦ受容体アゴニスト機能を保持するＧＤＮＦのバリアント、米国特許第9,133,441号に記載；ＧＤＮＦのバリアント、米国特許第9,243,046号に記載；ＲＥＴを効率的に活性化するがヘパリン結合部位を欠き、細胞外マトリックス中のＨＳＰＧと相互作用しないＧＦＬバリアント（例えばΔＮ－ＧＤＮＦ）、米国特許第8,034,572号に記載；低減されたヘパリン、硫酸ヘパラン、およびヘパラン硫酸化プロテオグリカン結合能を有するが、ＲＥＴタンパク質のリン酸化を誘導する能力を保持する、ニュールツリン分子、米国特許第8,445,432号、第9,127,083号および第9,469,679号に記載；ＧＤＮＦ由来ペプチド、米国特許第8,138,148号に記載；ニューブラスチン分子および二量体化タンパク質、米国特許第7,276,580号、第7,598,059号および第7,655,463号に記載；およびＧＦＲα／ＲＥＴを活性化するキメラＧＤＮＦファミリーリガンド、米国特許第6,866,851号に記載。
【0046】
ＧＦＬの類似体、誘導体およびコンジュゲートの他の例としては、以下を含む：WO 2012/151476、EP 2440581およびその中で参照される他の特許公報に記載のＧＤＮＦ類似体、WO 2009/053536 US 2009/0069230、WO2008/069876、WO2007/019860、およびUS2006/0258576に記載の、ＧＤＮＦのアイソフォーム、前駆体、断片およびスプライス変異体。
ＲＥＴのさらに別のアゴニストには、米国特許第8,901,129号に記載のＧＤＮＦファミリーリガンド（ＧＦＬ）および模倣物またはＲＥＴシグナル伝達経路アクチベーターおよび直接ＲＥＴアクチベーターが含まれる。
ＲＥＴの別のアゴニストは、可溶性ＧＦＲαおよびＮ（４）－（７－クロロ－２－［（Ｅ）－２－（２－クロロ－フェニル）－ビニル］－キノリン－４－イル）－Ｎ（１），Ｎ（１）－ジエチル－ペンタン－１，４－ジアミン（ＸＩＢ４０３５）である。Tokugawa et al. (Neurochem Int. 2003 Jan;42(1):81-6)に示されるように、ＸＩＢ４０３５は、ＧＤＮＦと同様に、ＲＥＴ自己リン酸化を誘導した。ＸＩＢ４０３５の化学構造を以下に示す：
ＲＥＴのさらに別のアゴニストには、米国特許第8,901,129号に記載のＧＤＮＦファミリーリガンド（ＧＦＬ）および模倣物またはＲＥＴシグナル伝達経路アクチベーターおよび直接ＲＥＴアクチベーターが含まれる。
ＲＥＴの別のアゴニストは、可溶性ＧＦＲαおよびＮ（４）－（７－クロロ－２－［（Ｅ）－２－（２－クロロ－フェニル）－ビニル］－キノリン－４－イル）－Ｎ（１），Ｎ（１）－ジエチル－ペンタン－１，４－ジアミン（ＸＩＢ４０３５）である。Tokugawa et al. (Neurochem Int. 2003 Jan;42(1):81-6)に示されるように、ＸＩＢ４０３５は、ＧＤＮＦと同様に、ＲＥＴ自己リン酸化を誘導した。ＸＩＢ４０３５の化学構造を以下に示す：
【化1】
【0047】
ＲＥＴの別のアゴニストは、可溶性ＧＦＲαおよびＢＴ化合物である。ＢＴ化合物は、WO 2011/070177に記載されている。
ＲＥＴの別のアゴニストは、可溶性ＧＦＲαおよび、ＧＦＲαに特異的に結合して二量体化する抗体である。ＧＦＲαに特異的に結合してＧＦＲαを二量体化する抗体は、ＧＦＲα結合抗体のセットの中でこの活性についてスクリーニングすることにより、得ることができる。
ＲＥＴのさらなるアゴニストは、ＲＥＴに特異的に結合して、ＲＥＴチロシンキナーゼ活性を増加させる抗体、またはかかる抗体の抗原結合断片である。ＲＥＴ結合抗体は当技術分野で知られており、例えば米国特許第6,861,509号に記載されているもの、および様々な市販の抗体である。ＲＥＴに特異的に結合してＲＥＴチロシンキナーゼ活性を増加させる抗体は、ＲＥＴ結合抗体のセットの中でこの活性についてスクリーニングすることにより、得ることができる。
ＲＥＴの別のアゴニストは、可溶性ＧＦＲαおよび、ＧＦＲαに特異的に結合して二量体化する抗体である。ＧＦＲαに特異的に結合してＧＦＲαを二量体化する抗体は、ＧＦＲα結合抗体のセットの中でこの活性についてスクリーニングすることにより、得ることができる。
ＲＥＴのさらなるアゴニストは、ＲＥＴに特異的に結合して、ＲＥＴチロシンキナーゼ活性を増加させる抗体、またはかかる抗体の抗原結合断片である。ＲＥＴ結合抗体は当技術分野で知られており、例えば米国特許第6,861,509号に記載されているもの、および様々な市販の抗体である。ＲＥＴに特異的に結合してＲＥＴチロシンキナーゼ活性を増加させる抗体は、ＲＥＴ結合抗体のセットの中でこの活性についてスクリーニングすることにより、得ることができる。
【0048】
ＲＥＴのアンタゴニスト
ＲＥＴのアンタゴニストには、ペプチドアンタゴニスト（修飾ペプチドおよびコンジュゲートを含む）、阻害性抗体分子、阻害性核酸分子、および小分子が含まれる。ＲＥＴアンタゴニストのいくつかは、ＲＥＴに完全に特異的であり得、ＲＥＴに優先的に拮抗し得るか（他のチロシンキナーゼと比較して）、またはＲＥＴと他のチロシンキナーゼの両方に拮抗し得る（例えば、以下に記載される小分子ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤のいくつか）。かかるアンタゴニストは、ＲＥＴが他のチロシンキナーゼよりも少なく拮抗されるとしても有用であり得るが、本明細書に記載の方法で使用されるアンタゴニストが、他のチロシンキナーゼよりもＲＥＴにより多く拮抗することが好ましい。本明細書で使用する場合、ＲＥＴに優先的に拮抗する（他のチロシンキナーゼと比較して）とは、アンタゴニストがＲＥＴに、少なくとも１０％、２５％、５０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％またはそれ以上、他のチロシンキナーゼよりも多く拮抗することを意味する。
ＲＥＴのアンタゴニストには、ペプチドアンタゴニスト（修飾ペプチドおよびコンジュゲートを含む）、阻害性抗体分子、阻害性核酸分子、および小分子が含まれる。ＲＥＴアンタゴニストのいくつかは、ＲＥＴに完全に特異的であり得、ＲＥＴに優先的に拮抗し得るか（他のチロシンキナーゼと比較して）、またはＲＥＴと他のチロシンキナーゼの両方に拮抗し得る（例えば、以下に記載される小分子ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤のいくつか）。かかるアンタゴニストは、ＲＥＴが他のチロシンキナーゼよりも少なく拮抗されるとしても有用であり得るが、本明細書に記載の方法で使用されるアンタゴニストが、他のチロシンキナーゼよりもＲＥＴにより多く拮抗することが好ましい。本明細書で使用する場合、ＲＥＴに優先的に拮抗する（他のチロシンキナーゼと比較して）とは、アンタゴニストがＲＥＴに、少なくとも１０％、２５％、５０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％またはそれ以上、他のチロシンキナーゼよりも多く拮抗することを意味する。
【0049】
ＲＥＴのアンタゴニストには、（ａ）ＲＥＴチロシンキナーゼ活性、（ｂ）ＧＤＮＦファミリー結合受容体アルファ（ＧＦＲα）、または（ｃ）ＧＦＲαリガンドに特異的に結合し、これを阻害する抗体、またはその抗原結合断片が含まれる。例としては、ヒトＧＦＲα３に結合する、米国特許第8,968,736号、米国特許第9,522,185号、およびUS 2017/0096488に記載の抗体が挙げられる。ＲＥＴ結合抗体は当技術分野で知られており、例えば米国特許第6,861,509号に記載のもの、および様々な市販の抗体である。（ａ）ＲＥＴチロシンキナーゼ活性、（ｂ）ＧＤＮＦファミリー結合受容体アルファ（ＧＦＲα）、または（ｃ）ＧＦＲαリガンドに特異的に結合し、これを阻害する抗体は、ＲＥＴ、ＧＦＲα、またはＧＦＲαリガンドに結合する抗体のセットの中で、これらの活性の１つについてスクリーニングすることにより、得ることができる。
【0050】
ＲＥＴのアンタゴニストは、ＲＥＴ、ＧＦＲα、またはＧＦＲαリガンドの発現、転写または翻訳を減少させる阻害性核酸分子を含む。適切な阻害性核酸分子には、ＲＥＴ特異的、ＧＦＲα特異的、またはＧＦＲαリガンド特異的阻害核酸、例えばＲＥＴ、ＧＦＲαまたはＧＦＲαリガンドに特異的に標的化されたｓｉＲＮＡ、アンチセンス、アプタマーまたはリボザイムが含まれる。
ＲＥＴのアンタゴニストには、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤が含まれる。例示的なＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤としては、ＡＳＴ４８７、モテサニブ、カボザンチニブ、バンデタニブ、ポナチニブ、スニチニブ、ソラフェニブ、およびアレクチニブが挙げられる。
ＲＥＴのアンタゴニストには、ＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤が含まれる。例示的なＲＥＴチロシンキナーゼ阻害剤としては、ＡＳＴ４８７、モテサニブ、カボザンチニブ、バンデタニブ、ポナチニブ、スニチニブ、ソラフェニブ、およびアレクチニブが挙げられる。
【0051】
ＡＳＴ４８７（ＮＶＰ－ＡＳＴ４８７；６３０１２４－４６－８；ＵＮＩＩ－Ｗ３４ＵＯ２Ｍ４Ｔ６としても知られている）；ＩＵＰＡＣ名：１－［４－［（４－エチルピペラジン－１－イル）メチル］－３－（トリフルオロメチル）フェニル］－３－［４－（６－（メチルアミノ）ピリミジン－４－イル］オキシフェニル］尿素）は、ＲＥＴ、受容体型チロシンタンパク質キナーゼＦＬＴ３、キナーゼインサートドメイン受容体（ＫＤＲ；ＶＥＧＦＲ２）、エーベルソンネズミ白血病ウィルス癌遺伝子相同体１（ｃ－ＡＢＬ）、および幹細胞因子受容体（ｃ－ＫＩＴ）の、阻害剤であり、これは、ＲＥＴ自己リン酸化および下流エフェクターの活性化を阻害することも示されている（Akeno-Stuart et al., Cancer Res. 2007 Jul 15;67(14):6956-64）。ＡＳＴ４８７の化学構造を以下に示す：
【化2】
【0052】
モテサニブ（ＡＭＧ－７０６としても知られている；ＩＵＰＡＣ名：Ｎ－（３，３－ジメチル－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－インドール－６－イル）－２－［（ピリジン－４－イルメチル）アミノ］ピリジン－３－カルボキサミド）は、ＲＥＴ、ＶＥＧＦＲ、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、およびｃ－ＫＩＴの、阻害剤である。モテサニブの化学構造を以下に示す：
【化3】
【0053】
カボザンチニブ（ＣＡＢＯＭＥＴＹＸ；ＣＯＭＥＴＲＩＱ；ＸＬ－１８４；ＢＭＳ－９０７３５１としても知られている；ＩＵＰＡＣ名：Ｎ－（４－（（６，７－ジメトキシキノリン－４－イル）オキシ）フェニル）－Ｎ'－（４－フルオロフェニル）シクロプロパン－１，１－ジカルボキサミド）は、ＲＥＴ、肝細胞増殖因子受容体（ＭＥＴ）、ＡＸＬ受容体チロシンキナーゼ（ＡＸＬ；チロシンタンパク質キナーゼ受容体ＵＦＯ）およびＶＥＧＦＲ２を含む血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）の、阻害剤である。カボザンチニブの化学構造を以下に示す：
【化4】
【0054】
バンデタニブ（ＣＡＰＲＥＬＳＡ；ＺＡＣＴＩＭＡ；ＺＤ－６４７４としても知られている；ＩＵＰＡＣ名：Ｎ－（４－ブロモ－２－フルオロフェニル）－６－メトキシ－７－（（１－メチルピペリジン－４－イル）メトキシ）キナゾリン－４－アミン）は、ＲＥＴ、ＶＥＧＦＲ２を含むＶＥＧＦＲ、および上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）の、阻害剤である。バンデタニブの化学構造を以下に示す：
【化5】
【0055】
ポナチニブ（ＩＣＬＵＳＩＧ；ＡＰ２４５３４としても知られている；ＩＵＰＡＣ名：３－（２－イミダゾ［１，２－ｂ］ピリダジン－３－イルエチニル）－４－メチル－Ｎ－［４－［（４－メチルピペラジン－１－イル）メチル］－３－（トリフルオロメチル）フェニル］ベンズアミド）は、ＲＥＴおよび線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）の阻害剤である。ポナチニブの化学構造を以下に示す：
【化6】
【0056】
スニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ；ＳＵ１１２４８としても知られている；ＩＵＰＡＣ名：Ｎ－（２－ジエチルアミノエチル）－５－［（Ｚ）－（５－フルオロ－２－オキソ－１Ｈ－インドール－３－イリデン）メチル］－２，４－ジメチル－１Ｈ－ピロールー３－カルボキサミド）は、ＲＥＴ、ＰＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ｃ－ＫＩＴ、顆粒球コロニー刺激因子受容体（ＧＣＳＦＲ）およびＦＬＴ３の、阻害剤である。スニチニブの化学構造を以下に示す：
【化7】
【0057】
ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲとしても知られている；ＩＵＰＡＣ名：４－［４－［［４－クロロ－３－（トリフルオロメチル）フェニル］カルバモイルアミノ］フェノキシ］－Ｎ－メチル－ピリジン－２－カルボキサミド）は、ＲＥＴ、ＶＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲおよびＲａｆファミリーキナーゼの、阻害剤である。ソラフェニブの化学構造を以下に示す：
【化8】
【0058】
アレクチニブ（ＡＬＥＣＥＮＳＡとしても知られている；ＩＵＰＡＣ名：９－エチル－６，６－ジメチル－８－［４－（モルホリン－４－イル）ピペリジン－１－イル］－１１－オキソ－６，１１－ジヒドロ－５Ｈ－ベンゾ［ｂ］カルバゾール－３－カルボニトリル）は、ＲＥＴおよび未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）の阻害剤である。アレクチニブの化学構造を以下に示す：
【化9】
【0059】
他の適切なＲＥＴアンタゴニストとしては、以下に記載の分子を含む：米国特許第6,235,769号、米国特許第7,504,509号、米国特許第8,067,434号、米国特許第8,426,437号、米国特許第8,629,135号、米国特許第8,937,071号、8,999,973号、米国特許第9,035,063号、米国特許第9,382,238号、米国特許第9,297,011号、US 2015/0238477、US 2015/0272958、US 2016/0271123、US 20160354377、US 2017/0096425、およびUS 2017/0121312、ならびに世界中の関連特許出願。
【0060】
対象とは、ヒトまたは脊椎哺乳動物を意味するものとし、限定はされないが、イヌ、ネコ、ウマ、ヤギおよび非ヒト霊長類（例えば、サル）を含む。好ましくは、対象はヒトである。いくつかの態様において、対象は、それ以外ではＲＥＴアゴニストまたはＲＥＴアンタゴニストによる処置を必要としていない対象である。したがって、具体的に同定された態様において、対象は、ＲＥＴアゴニストまたはＲＥＴアンタゴニストが同定された処置の形態となっている障害であると、以前に診断されてはいないものであってよい。
対象は、処置を必要とする対象として最初に同定され得て、例えば、本明細書に開示の方法によって処置可能であり、次いでＲＥＴアゴニスト（および／またはＩＬＣ３）またはＲＥＴアンタゴニストで処置される疾患を有するものなどである。当業者は、対象を、本明細書に開示の方法により処置可能な疾患を有するとして同定するための方法を認識している。
対象は、処置を必要とする対象として最初に同定され得て、例えば、本明細書に開示の方法によって処置可能であり、次いでＲＥＴアゴニスト（および／またはＩＬＣ３）またはＲＥＴアンタゴニストで処置される疾患を有するものなどである。当業者は、対象を、本明細書に開示の方法により処置可能な疾患を有するとして同定するための方法を認識している。
【0061】
本明細書で使用する「処置する」、「処置された」または「処置している」という用語は、疾患を改善し（疾患改変）、疾患の症状を緩和し、疾患が悪化するのを防ぎ、または治療が不在の場合と比較して、疾患の進行を遅延させる、疾患の処置を言う。
本明細書で使用される「グループ３自然リンパ球系細胞（ＩＬＣ３）に関連する疾患」とは、ＩＬＣ３が疾患または障害の発症、維持または悪化において何らかの役割を果たす疾患または障害である。
本明細書に開示される方法のいくつかにおいて、かかる疾患は、ＩＬＣ３によるＩＬ－２２の産生を増加させることにより効率的に処置することができ、例えば、ＩＬＣ３を、ＩＬＣ３によるＩＬ－２２の産生を増加させるのに有効な量のＲＥＴのアゴニストと接触させることにより；かかる処置を必要とする対象に、疾患を処置するのに有効な量のＲＥＴアゴニストを投与することにより；または疾患を処置するのに有効な量のＩＬＣ３（および任意にＲＥＴのアゴニスト）を投与することにより、処置することができる。
本明細書で使用される「グループ３自然リンパ球系細胞（ＩＬＣ３）に関連する疾患」とは、ＩＬＣ３が疾患または障害の発症、維持または悪化において何らかの役割を果たす疾患または障害である。
本明細書に開示される方法のいくつかにおいて、かかる疾患は、ＩＬＣ３によるＩＬ－２２の産生を増加させることにより効率的に処置することができ、例えば、ＩＬＣ３を、ＩＬＣ３によるＩＬ－２２の産生を増加させるのに有効な量のＲＥＴのアゴニストと接触させることにより；かかる処置を必要とする対象に、疾患を処置するのに有効な量のＲＥＴアゴニストを投与することにより；または疾患を処置するのに有効な量のＩＬＣ３（および任意にＲＥＴのアゴニスト）を投与することにより、処置することができる。
【0062】
かかる方法によって処置可能な疾患には、感染、炎症、結腸直腸がんを含む新形成、および消化管生理変容が含まれる。
本明細書に開示される他の方法において、疾患は、ＩＬＣ３によるＩＬ－２２の産生を低減することにより、効率的に処置することができ、例えば、ＩＬＣ３を、ＩＬＣ３によるＩＬ－２２の産生を低減するのに有効な量のＲＥＴのアンタゴニストと接触させることにより；またはかかる処置を必要とする対象に、疾患を処置するのに有効な量のＲＥＴアンタゴニストを投与することにより、処置することができる。
本明細書に開示される他の方法において、疾患は、ＩＬＣ３によるＩＬ－２２の産生を低減することにより、効率的に処置することができ、例えば、ＩＬＣ３を、ＩＬＣ３によるＩＬ－２２の産生を低減するのに有効な量のＲＥＴのアンタゴニストと接触させることにより；またはかかる処置を必要とする対象に、疾患を処置するのに有効な量のＲＥＴアンタゴニストを投与することにより、処置することができる。
【0063】
かかる方法によって処置可能な疾患としては、上皮性腸がんが挙げられる。
本発明の方法の毒性および有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）またはＴＤ５０（集団の５０％に毒性である用量）、およびＥＤ５０（集団の５０％に治療的に有効な用量）を決定するための、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順により決定できる。毒性効果と治療効果との間の用量比は治療指数であり、これは比ＬＤ５０／ＥＤ５０またはＴＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きい治療指数を示す治療剤が好ましい。毒性副作用を示す治療剤を使用することができるが、その場合には、かかる薬剤を患部組織の部位に標的化する送達システムを使用して、他の細胞または組織への潜在的な損傷を最小限に抑え、その結果副作用を軽減することが好ましい。
本発明の方法の毒性および有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）またはＴＤ５０（集団の５０％に毒性である用量）、およびＥＤ５０（集団の５０％に治療的に有効な用量）を決定するための、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順により決定できる。毒性効果と治療効果との間の用量比は治療指数であり、これは比ＬＤ５０／ＥＤ５０またはＴＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きい治療指数を示す治療剤が好ましい。毒性副作用を示す治療剤を使用することができるが、その場合には、かかる薬剤を患部組織の部位に標的化する送達システムを使用して、他の細胞または組織への潜在的な損傷を最小限に抑え、その結果副作用を軽減することが好ましい。
【0064】
細胞培養アッセイおよび／または動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための治療剤の投与量の範囲を定式化する際に使用することができる。かかる薬剤の投与量は、毒性がほとんどまたは全くないＥＤ５０を含む、循環濃度の範囲内にあることが好ましい。投与量は、この範囲内で、使用される投与形態および利用される投与経路に依存して変化し得る。本発明の方法で使用される任意の薬剤について、治療有効用量は、初めに細胞培養アッセイから推定することができる。用量を動物モデルで処方して、細胞培養で決定されるＩＣ５０（すなわち、症状の半分の阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成することができる。かかる情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。
特定の態様において、医薬組成物は、例えば、少なくとも約０．１％の活性化合物を含み得る。他の態様において、活性化合物は、単位重量の約２％～約７５％、または例えば約２５％～約６０％、およびその中で誘導可能な任意の範囲を含み得る。他のより高いパーセンテージの活性化合物も使用することができる。
特定の態様において、医薬組成物は、例えば、少なくとも約０．１％の活性化合物を含み得る。他の態様において、活性化合物は、単位重量の約２％～約７５％、または例えば約２５％～約６０％、およびその中で誘導可能な任意の範囲を含み得る。他のより高いパーセンテージの活性化合物も使用することができる。
【0065】
いくつかの態様において、医薬組成物は滅菌されていてもよく、好ましくは滅菌されている。他の態様において、化合物は単離されてもよい。本明細書で使用する場合、用語「単離された」とは、参照の物質がその天然の環境、例えば細胞から取り出されることを意味する。したがって、単離された生物学的物質は、いくつかまたはすべての細胞成分、すなわち天然物質が天然に存在しているところの細胞の成分（例えば、細胞質または膜成分）を含まないことが可能である。核酸分子の場合、単離された核酸は、ＰＣＲ産物、単離されたＲＮＡ、合成的に（例えば化学的に）生成されたＲＮＡ例えばｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、アプタマーなどを含む。単離された核酸分子は、プラスミド、コスミド、または他のベクターに挿入されてキメラ組換え核酸構築物の一部を形成するか、またはそれをコードする核酸の発現によって産生される、配列を含む。したがって、特定の態様において、組換え核酸は単離された核酸である。単離されたタンパク質は、それが細胞内で会合する他のタンパク質または核酸またはその両方と会合してもよく、または膜結合タンパク質であれば細胞膜と会合してもよく、または合成的に（例えば、化学的に）産生されてもよく、またはそれをコードする核酸の発現によって産生されてもよい。単離された細胞、例えばＩＬＣ３細胞は、それが生物中に見出される解剖学的部位から除去され得るか、または単離された細胞もしくは細胞集団のin vitroでの増殖によって産生され得る。単離された物質は精製されていてもよいが、必ずしもその必要はない。
【0066】
タンパク質、核酸、または細胞または細胞集団に関して「精製された」という用語は、所望の目的のために医師が精製された物質を使用するのに十分な程度まで、所望の物質を汚染物質から分離することを指す。好ましくは、これは、出発物質または天然物質の精製の少なくとも１桁の大きさの精製が達成され、より好ましくは２または３桁の大きさ、最も好ましくは４または５桁の大きさの精製が達成されることを意味する。特定の態様において、精製されたＲＥＴのアゴニストまたはＲＥＴのアンタゴニストまたはＩＬＣ３集団は、全タンパク質または核酸または細胞集団の、場合により重量で少なくとも６０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％である。特定の態様において、精製されたＲＥＴのアゴニストまたはＲＥＴのアンタゴニストまたはＩＬＣ３集団は、標準的な関連実験プロトコールによってアッセイされるように、均一に精製される。
いくつかの態様において、精製および／または単離された分子は、合成分子である。
いくつかの態様において、精製および／または単離された分子は、合成分子である。
【0067】
本明細書に記載の化合物の対象用量は、典型的には、約０．１μｇ～１０，０００ｍｇ、より典型的には約１μｇ／日～８０００ｍｇ、最も典型的には約１０μｇ～１００μｇの範囲である。対象の体重に関して言えば、典型的な投薬量の範囲は、投与あたり、約１μｇ／ｋｇ／体重、約５μｇ／ｋｇ／体重、約１０μｇ／ｋｇ／体重、約５０μｇ／ｋｇ／体重、約１００μｇ／ｋｇ／体重、約２００μｇ／ｋｇ／体重、約３５０μｇ／ｋｇ／体重、約５００μｇ／ｋｇ／体重、約１ｍｇ／ｋｇ／体重、約５ｍｇ／ｋｇ／体重、約１０ｍｇ／ｋｇ／体重、約５０ｍｇ／ｋｇ／体重、約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約２００ｍｇ／ｋｇ／体重、約３５０ｍｇ／ｋｇ／体重、約５００ｍｇ／ｋｇ体重から、約１０００ｍｇ／ｋｇ体重またはそれ以上まで、およびその中で導き出せる任意の範囲である。本明細書に列挙した数からの誘導可能な範囲の非限定的な例において、上記の数値に基づき、約１ｍｇ／ｋｇ／体重～約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約５μｇ／ｋｇ／体重～約５００ｍｇ／ｋｇ／体重などを投与することができる。絶対量は、同時処置、用量の数、および年齢、身体状態、サイズおよび体重を含む個々の患者のパラメータを含む様々な要因に依存する。これらは当業者によく知られた要因であり、日常的な実験のみで対処することができる。一般に、最大用量、すなわち健常な医学的判断による最も高い安全な用量を使用することが好ましい。本発明の分子の複数用量も企図される。
【0068】
本明細書に記載の化合物および／または細胞は、本明細書に記載の疾患の処置のために、単独で他の活性治療薬なしで使用してもよく、または他の治療化合物と組み合わせてもよい。
本明細書に記載の化合物および細胞と組み合わせて使用する場合、副作用を回避するために、いくつかの例では既知の治療薬の投薬量を減らすことができる。いくつかの例において、本明細書に記載の化合物および／または細胞を別の治療薬とともに投与する場合、本明細書に記載の化合物および／もしくは細胞または既知の治療薬のいずれかの治療用量未満、または両者の治療用量未満を、対象の処置に使用することができる。本明細書で使用される「治療用量未満」とは、他の薬剤の不在下で投与された場合に、対象において治療結果を生じるであろう投薬量より少ない投薬量をいう。したがって、既知の治療薬の治療用量未満とは、本明細書に記載の化合物および細胞の投与の不在下では、対象において所望の治療結果を生じないであろうものである。本明細書に記載される疾患の既存の治療薬は医学の分野でよく知られており、参考文献、例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences；ならびに医療の専門家が処置の指針として依存している多くの他の医学文献も含まれる。
本明細書に記載の化合物および細胞と組み合わせて使用する場合、副作用を回避するために、いくつかの例では既知の治療薬の投薬量を減らすことができる。いくつかの例において、本明細書に記載の化合物および／または細胞を別の治療薬とともに投与する場合、本明細書に記載の化合物および／もしくは細胞または既知の治療薬のいずれかの治療用量未満、または両者の治療用量未満を、対象の処置に使用することができる。本明細書で使用される「治療用量未満」とは、他の薬剤の不在下で投与された場合に、対象において治療結果を生じるであろう投薬量より少ない投薬量をいう。したがって、既知の治療薬の治療用量未満とは、本明細書に記載の化合物および細胞の投与の不在下では、対象において所望の治療結果を生じないであろうものである。本明細書に記載される疾患の既存の治療薬は医学の分野でよく知られており、参考文献、例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences；ならびに医療の専門家が処置の指針として依存している多くの他の医学文献も含まれる。
【0069】
本明細書に記載の化合物および／または細胞を他の治療剤と組み合わせて投与する場合、かかる投与は、同時または逐次的であってよい。他の治療剤が同時に投与される場合、それらは同じかまたは別の製剤中で投与することができるが、同時に投与される。他の治療剤および本明細書に記載の化合物および／または細胞の投与はまた、時間的に分離することもでき、これは、他の治療剤が、本明細書に記載の化合物および細胞の投与の前後の異なる時間に投与されることを意味する。これらの化合物の投与間の時間間隔は数分であってもよく、またはそれより長くてもよい。
【0070】
本発明の活性剤（例えば、本明細書に記載の化合物および細胞）は、疾患を処置するのに有効な量で、対象に投与される。本発明のいくつかの側面によれば、有効量は、処置される疾患に依存して、ＲＥＴアゴニスト（および／またはＩＬＣ３）またはＲＥＴアンタゴニスト単独、または別の薬剤との組み合わせの量であり、これは、組み合わせまたは同時投与または単独投与されると、疾患に対する治療的応答が生じる。生物学的効果は、疾患または疾患に起因する症状の、改善および／または完全な除去であり得る。別の態様において、生物学的効果は、例えば、疾患の症状の不在によって証明されるように、疾患の完全な排除である。
【0071】
本明細書に記載の疾患の処置における本発明の方法において使用される化合物（すなわち、アゴニスト、アンタゴニスト、またはＩＬＣ３のいずれか）の有効量は、使用される特定の化合物、化合物の送達様式、それが単独でまたは組み合わせて使用されるかどうかに依存して変化し得る。任意の特定の用途のための有効量はまた、処置される疾患、投与される特定の化合物、対象のサイズ、または疾患もしくは状態の重篤度などの要因に依存して変化し得る。当業者は、過度の実験を必要とすることなく、当技術分野で知られている日常的かつ受け入れられた方法を用いて、本発明の特定の分子の有効量を経験的に決定することができる。本明細書で提供される教示と組み合わせて、様々な活性化合物から選択し、効力、相対的バイオアベイラビリティ、患者の体重、有害な副作用の重篤度および好ましい投与様式などの因子を重みづけすることによって、実質的な毒性を引き起こさず、しかも特定の対象を処置するのに有効な、効果的な治療処置レジメンを計画することができる。
【0072】
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容し得る担体中に溶解または分散された、有効量の１つ以上の薬剤を含む。「薬学的または薬理学的に許容し得る」という語句は、動物（例えば、ヒト）に適切に投与された場合に、有害な、アレルギー性のまたは他の不適当な反応を生じない、分子実体および組成物を指す。さらに、動物（例えば、ヒト）投与の場合、調製物は、関連する政府規制機関によって要求される、無菌性、発熱原性、一般的安全性および純度の基準を満たすべきであることが理解される。化合物は、一般にヒトへの投与に適している。この用語は、化合物または組成物が無毒性かつ十分に純粋であり、ヒトに投与する前に、化合物または組成物のさらなる操作を必要としないことが、求められる。
【0073】
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容し得る担体」は、任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング、界面活性剤、酸化防止剤、防腐剤（例えば抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、防腐剤、薬物、薬物安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、染料、類似の物質およびこれらの組合せであって、当業者に既知のものである（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences(1990)を参照）。任意の従来の担体が活性成分と不適合である場合を除いて、治療または医薬組成物におけるそれらの使用が意図される。
【0074】
本明細書に記載のように使用される治療用組成物は、それらが固体、液体またはエアロゾル形態で投与されるかどうか、および注入などの投与経路について滅菌である必要があるかどうかに応じて、異なる種類の担体を含むことができる。本明細書に記載の化合物および／または細胞の投与は、静脈内、皮内、動脈内、病巣内、頭蓋内、関節内、鼻腔内、硝子体内、膣内、直腸内、局所、筋肉内、腹腔内、皮下、膀胱内、粘膜、経口、局所、吸入により（例えば、エアロゾル吸入）、注射により、連続注入を含む注入により、局部的灌流により、カテーテルを介して、灌流を介して、クリームで、脂質組成物（例えば、リポソームによる）で、または当業者に知られている他の方法また前記の任意の組合せにより（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciencesを参照）、および処置される疾患に適切であるように、行うことができる。
【0075】
いずれの場合においても、組成物は、１つ以上の成分の酸化を遅らせるために様々な酸化防止剤を含むことができる。さらに、微生物の作用の防止は、パラベン（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールまたはそれらの組み合わせを含むがこれに限定されない様々な抗菌剤および抗真菌剤などの防腐剤によって、もたらすことができる。
本明細書に記載の化合物は、遊離塩基、中性または塩の形態の組成物中に製剤化することができる。薬学的に許容し得る塩には、酸付加塩、例えばタンパク質性組成物の遊離アミノ基で形成されたもの、または塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸またはマンデル酸などの有機酸で形成されたものを含む。遊離カルボキシル基で形成される塩はまた、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化第二鉄などの無機塩基；またはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジンまたはプロカインなどの有機塩基に由来することができる。
本明細書に記載の化合物は、遊離塩基、中性または塩の形態の組成物中に製剤化することができる。薬学的に許容し得る塩には、酸付加塩、例えばタンパク質性組成物の遊離アミノ基で形成されたもの、または塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸またはマンデル酸などの有機酸で形成されたものを含む。遊離カルボキシル基で形成される塩はまた、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化第二鉄などの無機塩基；またはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジンまたはプロカインなどの有機塩基に由来することができる。
【0076】
本明細書に記載の化合物および／または細胞が液体形態である態様において、担体は、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、脂質（例えば、トリグリセリド、植物油、リポソーム）およびそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない、溶媒または分散媒体であることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により；例えば液体ポリオールまたは脂質などの担体中での分散による必要な粒子サイズの維持により；例えばヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤の使用により；またはかかる方法の組み合わせにより、維持することができる。多くの場合、等張剤を、例えば糖、塩化ナトリウムまたはそれらの組み合わせを含むことが、好ましいであろう。
【0077】
本明細書に記載の化合物および／または細胞は、様々な方法で、および異なるクラスのレシピエントに投与することができる。いくつかの例において、投与は慢性的である。慢性投与とは、疾患を処置するための薬物の長期投与を指す。慢性的な投与は、必要に応じて行われてもよく、または定期的な間隔で行われてもよい。例えば、本明細書に記載の化合物および／または細胞は、１日２回、１日３回、１日４回、１日おき、毎週、２週間毎、４週間毎、連続的に（例えば、注入、パッチ、ポンプによる）等々で、投与され得る。
本明細書に記載の化合物および／または細胞は、組織に直接投与することができる。直接的な組織投与は、直接注射によって達成することができる。化合物は１回投与してもよく、または複数回投与で投与してもよい。複数回投与する場合、化合物は異なる経路で投与することができる。例えば、最初の（または最初の数回の）投与は、影響を受けた組織に直接行うことができ、後の投与は全身的であってよい。
本明細書に記載の化合物および／または細胞は、組織に直接投与することができる。直接的な組織投与は、直接注射によって達成することができる。化合物は１回投与してもよく、または複数回投与で投与してもよい。複数回投与する場合、化合物は異なる経路で投与することができる。例えば、最初の（または最初の数回の）投与は、影響を受けた組織に直接行うことができ、後の投与は全身的であってよい。
【0078】
本明細書に記載の化合物および／または細胞は、薬学的に許容し得る濃度の塩、緩衝剤、防腐剤、適合性担体、アジュバントおよび任意に他の治療成分を日常的に含み得る、薬学的に許容し得る溶液で投与される。
本明細書に記載の方法によれば、本明細書に記載の化合物および／または細胞は、医薬組成物で投与することができる。一般に医薬組成物は、本発明の化合物および薬学的に許容し得る担体を含む。本明細書に記載の化合物および／または細胞で有用な薬学的に許容し得る担体は、当業者によく知られている。本明細書で使用する場合、薬学的に許容し得る担体とは、本明細書に記載の化合物および／または細胞の生物学的活性の有効性を妨害しない、非毒性物質を意味する。
本明細書に記載の方法によれば、本明細書に記載の化合物および／または細胞は、医薬組成物で投与することができる。一般に医薬組成物は、本発明の化合物および薬学的に許容し得る担体を含む。本明細書に記載の化合物および／または細胞で有用な薬学的に許容し得る担体は、当業者によく知られている。本明細書で使用する場合、薬学的に許容し得る担体とは、本明細書に記載の化合物および／または細胞の生物学的活性の有効性を妨害しない、非毒性物質を意味する。
【0079】
薬学的に許容し得る担体としては、希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定剤、可溶化剤および当分野で知られている他の物質が挙げられる。特にペプチドに対する薬学的に許容し得る担体の例は、米国特許第5,211,657号に記載されている。かかる調製物は通常、塩、緩衝剤、防腐剤、適合性担体、および任意に他の治療剤を含むことができる。医薬に使用される場合、塩は薬学的に許容し得るべきであるが、薬学的に許容し得ない塩は、その薬学的に許容し得る塩を調製するために便宜的に使用され得、本発明の範囲から排除されない。かかる薬理学的および薬学的に許容し得る塩としては、限定はされないが、以下の酸から調製されるものが含まれる：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸など。また、薬学的に許容し得る塩は、ナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩などの、アルカリ金属塩またはアルカリ土類塩として調製することができる。
【0080】
本明細書に記載の化合物および／または細胞は、例えば錠剤、カプセル、散剤、顆粒剤、軟膏、液剤、坐剤、吸入剤および注射剤などの固体、半固体、液体または気体形態の製剤として、および経口、非経口または外科的投与のための通常の方法で、製剤化することができる。本発明はまた、インプラントなどによる局所投与用に製剤化された医薬組成物も包含する。
経口投与に適した組成物は、カプセル、錠剤、ロゼンジなどの個別の単位として提供され得、それぞれが所定量の活性剤を含有する。他の組成物としては、シロップ、エリキシルまたはエマルジョンなどの、水性液体または非水性液体中の懸濁液を含む。
経口投与に適した組成物は、カプセル、錠剤、ロゼンジなどの個別の単位として提供され得、それぞれが所定量の活性剤を含有する。他の組成物としては、シロップ、エリキシルまたはエマルジョンなどの、水性液体または非水性液体中の懸濁液を含む。
【0081】
経口投与の場合、化合物は、活性化合物を当分野で知られている薬学的に許容し得る担体と組み合わせることによって、容易に製剤化することができる。かかる担体は、本発明の化合物を、処置される対象による経口摂取のための錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして、製剤化することを可能にする。経口使用のための医薬調製物を、固体賦形剤として得ることができ、任意に、得られた混合物を粉砕し、所望により適切な助剤を加えた後に、顆粒混合物を加工して、錠剤または糖衣錠コアを得る。適切な賦形剤は、特に、糖などの充填剤、例えばラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトール；セルロース調製物、例えばトウモロコシデンプン、コムギデンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）である。所望により崩壊剤を添加してもよく、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムなどである。任意に、経口製剤はまた、生理食塩水または内部酸性条件を中和するための緩衝液中に製剤化してもよく、またはいかなる担体なしで投与してもよい。
【0082】
糖衣錠コアには適切なコーティングが施される。この目的のために、濃縮糖溶液を使用することができ、これは任意に、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適切な有機溶媒または溶媒混合物を含み得る。識別のために、または活性化合物用量の異なる組合わせを特徴付けるために、染料または顔料を錠剤または糖衣錠コーティングに添加してもよい。
経口的に使用することができる医薬製剤は、ゼラチン製のプッシュフィットカプセル、ならびにゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤でできた軟質密封カプセルを含む。プッシュフィットカプセルは、活性成分を、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、および／またはタルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、および任意に安定剤と混合して含むことができる。軟質カプセルにおいて、活性化合物は、脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどの適切な液体に溶解または懸濁されてもよい。さらに、安定剤を添加してもよい。経口投与用に製剤化されたマイクロスフェアを使用することもできる。かかるマイクロスフェアは、当技術分野において十分に定義されている。経口投与のための全ての製剤は、かかる投与に適した投薬量でなければならない。
経口的に使用することができる医薬製剤は、ゼラチン製のプッシュフィットカプセル、ならびにゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤でできた軟質密封カプセルを含む。プッシュフィットカプセルは、活性成分を、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、および／またはタルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、および任意に安定剤と混合して含むことができる。軟質カプセルにおいて、活性化合物は、脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどの適切な液体に溶解または懸濁されてもよい。さらに、安定剤を添加してもよい。経口投与用に製剤化されたマイクロスフェアを使用することもできる。かかるマイクロスフェアは、当技術分野において十分に定義されている。経口投与のための全ての製剤は、かかる投与に適した投薬量でなければならない。
【0083】
口腔投与のために、組成物は、従来の方法で製剤化された錠剤またはロゼンジの形態をとり得る。
吸入による投与のために、本明細書に記載の化合物および／または細胞は、適切な推進剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適切なガスの使用による、加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示の形態で、便利に送達することができる。加圧エアロゾルの場合、投薬量単位は、計量された量を送達するためのバルブを提供することによって決定され得る。例えば、吸入器または注入器での使用のためのゼラチンなどのカプセルおよびカートリッジは、化合物およびラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基剤との粉末混合物を含有するように、製剤化することができる。エアロゾル送達システムを調製するための技術は、当業者に知られている。一般に、かかるシステムは、活性剤の生物学的特性を著しく損なわない成分を利用すべきである（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences参照）。当業者は、過度の実験に頼ることなく、エアロゾルを製造するための様々なパラメータおよび条件を、容易に決定することができる。
吸入による投与のために、本明細書に記載の化合物および／または細胞は、適切な推進剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適切なガスの使用による、加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示の形態で、便利に送達することができる。加圧エアロゾルの場合、投薬量単位は、計量された量を送達するためのバルブを提供することによって決定され得る。例えば、吸入器または注入器での使用のためのゼラチンなどのカプセルおよびカートリッジは、化合物およびラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基剤との粉末混合物を含有するように、製剤化することができる。エアロゾル送達システムを調製するための技術は、当業者に知られている。一般に、かかるシステムは、活性剤の生物学的特性を著しく損なわない成分を利用すべきである（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences参照）。当業者は、過度の実験に頼ることなく、エアロゾルを製造するための様々なパラメータおよび条件を、容易に決定することができる。
【0084】
化合物は、それらを全身に送達することが望ましい場合、例えば、ボーラス注射または連続注入などの、注入による非経口投与のために製剤化することができる。注射用製剤は、単位剤形、例えば、アンプルまたは複数用量容器中に、防腐剤を加えて提供することができる。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンなどの形態をとり、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの処方剤を含み得る。
【0085】
非経口投与のための製剤には、滅菌の水性または非水性溶液、懸濁液およびエマルジョンが含まれる。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性担体には、水、アルコール／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液（生理食塩水および緩衝媒体を含む）が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンガーまたは固定油が含まれる。静脈内ビヒクルには、流体および栄養補充剤、電解質補充剤（リンガーデキストロースに基づくものなど）などが含まれる。防腐剤および他の添加剤、例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなども存在してよい。より低い用量は、静脈内投与などの他の投与形態から生じる。対象における応答が最初の用量で不十分である場合、より高い用量（または異なるより局所的な投与経路による、効果的により高い用量）を、患者の耐容性が許す範囲で使用してもよい。１日に複数回の投与は、化合物の適切な全身レベルを達成するため企図される。
【0086】
さらに他の態様において、本明細書に記載の化合物および／または細胞用のビヒクルは、哺乳動物レシピエントへの移植に適した生体適合性のマイクロ粒子またはインプラントである。例示的な生体内分解性インプラントは、当技術分野において知られている。インプラントは、マイクロスフェア（薬剤は固体ポリマーマトリックス全体に分散されている）またはマイクロカプセル（薬剤はポリマーシェルのコアに貯蔵されている）などのマイクロ粒子の形態のポリマーマトリックスであってもよい。薬剤を含有するためのポリマーマトリックスの他の形態には、フィルム、コーティング、ゲル、インプラント、およびステントが含まれる。ポリマーマトリックスデバイスのサイズおよび組成は、マトリックスデバイスが移植される組織において好ましい放出動態をもたらすように選択される。ポリマーマトリックスデバイスのサイズはさらに、使用される送達方法、典型的には組織への注射、または鼻および／または肺領域へのエアロゾルによる懸濁液の投与に従って選択される。ポリマーマトリクス組成物は、良好な分解速度を有し、また生体接着性の材料で形成されるように選択することができて、デバイスが血管、肺、または他の表面に投与された場合の移動の有効性をさらに高める。マトリックス組成物はまた、分解せず、むしろ長期間にわたって拡散により放出するよう選択することもできる。
【0087】
本明細書に記載の化合物および／または細胞を対象に送達するために、非生分解性および生分解性の両方のポリマーマトリックスを使用することができる。生分解性マトリックスが好ましい。かかるポリマーは、天然または合成ポリマーであってもよい。ポリマーは、放出が所望される期間に基づいて、一般的には数時間から１年またはそれ以上のオーダーで選択される。典型的には、数時間から３～１２ヶ月の範囲の放出が最も望ましい。ポリマーは任意に、水中で重量の約９０％まで吸収することができるヒドロゲルの形態であり、これはさらに、任意に多価イオンまたは他のポリマーと架橋されている。
【0088】
一般に、本明細書に記載の化合物および／または細胞は、拡散による、またはより好ましくはポリマーマトリックスの分解による、生侵食性インプラントを用いて送達され得る。生分解性送達システムを形成するために使用できる例示の合成ポリマーとしては、以下を含む：ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリビニルハライド、ポリビニルピロリドン、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタンおよびそのコポリマー、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、アクリルエステルおよびメタクリルエステルのポリマー、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、セルロースアセテート、セルロースプロピオネート、セルロースアセテートブチレート、セルロースアセテートフタレート、カルボキシエチルセルロース、セルローストリアセテート、セルロース硫酸ナトリウム塩、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリビニルアセテート、ポリビニルクロリド、ポリスチレンおよびポリビニルピロリドン。
【0089】
非生分解性ポリマーの例には、エチレンビニルアセテート、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリアミド、それらのコポリマーおよび混合物が含まれる。
他の送達システムには、時間放出、遅延放出または持続放出送達システムが含まれ得る。かかるシステムは、化合物の反復投与を避けることができ、対象および医師の利便性を高める。多くの種類の放出送達システムが利用可能であり、当業者に知られている。それらには、ポリマーベースシステム、例えばポリ（ラクチド－グリコリド）、コポリオキサレート、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸、およびポリ無水物などが含まれる。かかる送達システムはまた、コレステロールなどのステロール、コレステロールエステルおよび脂肪酸またはモノ－、ジ－およびトリ－グリセリドなどの中性脂肪を含む脂質などの、非ポリマーシステム；ヒドロゲル放出システム；シラスティックシステム；ペプチドベースのシステム；ワックスコーティング；従来の結合剤および賦形剤を用いた圧縮錠剤；部分融合インプラント；等が挙げられる。さらに、ポンプベースのハードウェア送達システムを使用することができ、そのうちのいくつかは移植のために適合される。
他の送達システムには、時間放出、遅延放出または持続放出送達システムが含まれ得る。かかるシステムは、化合物の反復投与を避けることができ、対象および医師の利便性を高める。多くの種類の放出送達システムが利用可能であり、当業者に知られている。それらには、ポリマーベースシステム、例えばポリ（ラクチド－グリコリド）、コポリオキサレート、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸、およびポリ無水物などが含まれる。かかる送達システムはまた、コレステロールなどのステロール、コレステロールエステルおよび脂肪酸またはモノ－、ジ－およびトリ－グリセリドなどの中性脂肪を含む脂質などの、非ポリマーシステム；ヒドロゲル放出システム；シラスティックシステム；ペプチドベースのシステム；ワックスコーティング；従来の結合剤および賦形剤を用いた圧縮錠剤；部分融合インプラント；等が挙げられる。さらに、ポンプベースのハードウェア送達システムを使用することができ、そのうちのいくつかは移植のために適合される。
【0090】
長期持続放出インプラントの使用は、慢性疾患の処置に特に適切であり得る。本明細書で使用される長期放出とは、インプラントが、治療レベルの活性成分を少なくとも３０日間、好ましくは少なくとも６０日間、送達するように構築され配置されることを意味する。長期持続放出インプラントは当業者に知られており、上記のシステムのいくつかを含む。
したがって、本明細書に記載される化合物および／または細胞は、いくつかの態様において、治療または研究用途におけるそれらの使用を容易にするために、製薬または研究キットに組み立てられてもよい。キットは、本発明の構成要素を収容する１つ以上の容器および使用説明書を含んでよい。具体的には、かかるキットは、本明細書に記載される１つ以上の化合物および／または細胞を、意図された治療用途およびこれらの薬剤の適切な投与について記載する説明書とともに含むことができる。特定の態様において、キット内の本明細書に記載の化合物および／または細胞は、特定の用途および薬剤の投与方法に適した医薬製剤および投薬量であることができる。
したがって、本明細書に記載される化合物および／または細胞は、いくつかの態様において、治療または研究用途におけるそれらの使用を容易にするために、製薬または研究キットに組み立てられてもよい。キットは、本発明の構成要素を収容する１つ以上の容器および使用説明書を含んでよい。具体的には、かかるキットは、本明細書に記載される１つ以上の化合物および／または細胞を、意図された治療用途およびこれらの薬剤の適切な投与について記載する説明書とともに含むことができる。特定の態様において、キット内の本明細書に記載の化合物および／または細胞は、特定の用途および薬剤の投与方法に適した医薬製剤および投薬量であることができる。
【0091】
キットは様々な形態をとることができ、例えば、ブリスターパウチ、シュリンク包装パウチ、真空密閉可能パウチ、密閉可能な熱成形トレイ、または類似のパウチまたはトレイ形態などであり、パウチ内にばらばらにパックされた付属品、1つ以上のチューブ、容器、ボックスまたはバッグを伴う。付属品を追加した後にキットを殺菌してもよく、容器内の個々の付属品をそれ以外で包装しないでよいようにする。キットは任意の適切な滅菌技術を使用して滅菌することができ、例えば、放射線滅菌、加熱滅菌、または当技術分野で知られている他の滅菌方法などである。キットはまた、特定の用途に応じて他の構成要素を、例えば、容器、細胞培地、塩、緩衝液、試薬、シリンジ、針、ガーゼなどの布地を消毒剤の適用または除去用に、使い捨て手袋、投与前の薬剤のサポートなどを含んでもよい。
【0092】
本発明はまた、完成し包装およびラベル付けされた医薬品を包含する。この製造物品は、適切な単位剤形を、適当な容器または入れ物、例えばガラスバイアルまたは密閉された他の容器中に含む。非経口投与に適した剤形の場合、活性成分は滅菌されており、粒子状物質非含有溶液として投与するのに適している。すなわち、本発明は非経口溶液および凍結乾燥粉末の両方を包含し、それぞれは滅菌されており、後者は注射前に再構成するのに適している。代替的に、単位剤形は、経口、経皮、局所または粘膜送達に適した固体であってもよい。
以下の実施例は、本発明の実施の具体例を説明するために提供され、本発明の範囲を限定することを意図しない。当業者には明らかであるように、本発明は、様々な組成物および方法において用途が見出されるであろう。
以下の実施例は、本発明の実施の具体例を説明するために提供され、本発明の範囲を限定することを意図しない。当業者には明らかであるように、本発明は、様々な組成物および方法において用途が見出されるであろう。
【実施例】
【0093】
材料および方法
マウス：Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスはCharles Riverから購入した。ＲｅｔＧＦＰ １３、Ｒａｇ１－／－γｃ－／－ ３１，３２、ＲｅｔＭＥＮ２Ｂ １４、Ｒｏｓａ２６ＹＦＰ ３３、Ｒｏｓａ２６ＲＦＰ ３４、Ｒｅｔｆｌ／ｆｌ １６、Ｒｏｒｇｔ－Ｃｒｅ １５、Ｉｌ１ｂ－／－ ３５およびＭｙｄ８８－／－ ３６は、完全なＣ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドであった。Ｍｙｄ８８ｆ１／ｆｌ ２７と交配させたＧｆａｐ－Ｃｒｅ２６は、Ｆ８－Ｆ９からＣ５７Ｂｌ／６Ｊバックグラウンドであった。すべての系統をIMM Lisboa動物施設で交配、維持した。マウスは、共飼育の同腹子対照と系統的に比較した。雄と雌の両方をこの研究では使用した。他に明記されていない限り、ランダム化およびブラインドは使用しなかった。すべての動物実験は、国家および制度上の倫理委員会、それぞれDirecao Geral de VeterinariaおよびiMM Lisboa ethical committeeによって承認された。無菌マウスは、動物保護のための施設ガイドラインに従い、ポルトガルのGulbenkian de CienciaおよびフランスのInstitut Pasteurに収容された。パワー分析を行って、実験マウスの数を推定した。
マウス：Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスはCharles Riverから購入した。ＲｅｔＧＦＰ １３、Ｒａｇ１－／－γｃ－／－ ３１，３２、ＲｅｔＭＥＮ２Ｂ １４、Ｒｏｓａ２６ＹＦＰ ３３、Ｒｏｓａ２６ＲＦＰ ３４、Ｒｅｔｆｌ／ｆｌ １６、Ｒｏｒｇｔ－Ｃｒｅ １５、Ｉｌ１ｂ－／－ ３５およびＭｙｄ８８－／－ ３６は、完全なＣ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドであった。Ｍｙｄ８８ｆ１／ｆｌ ２７と交配させたＧｆａｐ－Ｃｒｅ２６は、Ｆ８－Ｆ９からＣ５７Ｂｌ／６Ｊバックグラウンドであった。すべての系統をIMM Lisboa動物施設で交配、維持した。マウスは、共飼育の同腹子対照と系統的に比較した。雄と雌の両方をこの研究では使用した。他に明記されていない限り、ランダム化およびブラインドは使用しなかった。すべての動物実験は、国家および制度上の倫理委員会、それぞれDirecao Geral de VeterinariaおよびiMM Lisboa ethical committeeによって承認された。無菌マウスは、動物保護のための施設ガイドラインに従い、ポルトガルのGulbenkian de CienciaおよびフランスのInstitut Pasteurに収容された。パワー分析を行って、実験マウスの数を推定した。
【0094】
胎児肝臓キメラの生成：再構成実験のために、Ｅ１４．５ ＲｅｔＷＴ／ＧＦＰまたはＲｅｔＧＦＰ／ＧＦＰマウスから５×１０６個の胎児肝細胞を単離し、非致死的に照射した（２００ｒａｄ）無リンパ球Ｒａｇ１－／－γｃ－／－宿主に静脈内注射した。マウスは、移植の８週間後に分析した。
【0095】
デキストラン硫酸ナトリウム誘発性大腸炎：デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）（分子量３６，０００～５０，０００Ｄａ；MP Biomedicals）を、飲料水に３％（ｗ／ｖ）で５日間加え、続いて２日間通常の水を加えた。マウスを７日目に分析した。体重、血液の存在および糞便の粘稠度を毎日評価した。
【0096】
Citrobacter rodentium感染：Citrobacter rodentium ＩＣＣ１８０（ＤＢＳ１００株由来）３７による感染は、１０９コロニー形成単位の胃管接種によって行った３７，３８。ルシフェラーゼシグナルの獲得および定量は、ＩＶＩＳシステム（Caliper Life Sciences）で行った。感染の間、体重減少、下痢および血便を毎日モニターした。
【0097】
抗生物質処置：妊娠した雌または新生マウスを、３％スクロースを含む飲料水中のストレプトマイシン５ｇ／Ｌ、アンピシリン１ｇ／Ｌおよびコリスチン１ｇ／Ｌ（Sigma-Aldrich）で処置した。対照マウスには、前の記載のように、飲料水中３％のスクロースを与えた２２。
【0098】
顕微鏡検査：ＲｅｔＧＦＰおよびＲｅｔＧＦＰキメラからの腸を、ＧＦＰフィルターを用いたNeoLumar S ０．８ｘ対物レンズを備えたZeiss Lumar V12蛍光ステレオ顕微鏡で画像化した。全マウント分析は、前に記載のように実施した２，９。簡潔に述べると、成体の腸を冷ＰＢＳ（Gibco）で洗い流し、長手方向に開放した。粘液および上皮を除去し、腸を４％ＰＦＡ（Sigma-Aldrich）に室温で１０分間固定し、ブロッキング／透過化緩衝液（２％ＢＳＡ、２％ヤギ血清、０．６％Triton X-100を含有するＰＢＳ）中でインキュベートした。小腸の３次元構造を視覚化するために、試料をベンジルアルコール－安息香酸ベンジル（Sigma-Aldrich）を用いて清浄にした後、メタノール中で脱水した２，９。厚い消化管切片の分析のために、腸を４％ＰＦＡで４℃で一晩固定し、次いで４％低融点温度アガロース（Invitrogen）に入れた。１００μｍの切片を、Leica VT1200／VT1200 Sビブラトームで取得し、Mowiol（Calbiochem）に包埋した２。スライドまたは全マウント試料を、それぞれ４℃で一晩または１～２日間、次の抗体を用いてインキュベートした：ラットモノクローナル抗Ｂ２２０（ＲＡ３－６Ｂ２）（eBioscience）、マウスモノクローナル抗ＲＯＲγｔ（Ｑ３１－３７８）（BD Pharmigen）、マウスモノクローナル抗ＧＦＡＰ（ＧＡ－５）（Sigma-Aldrich）、マウスモノクローナル抗ＧＦＡＰ Ｃｙ３（ＧＡ－５）（Abcam）、抗ＧＤＮＦ抗体（Abcam）、ＤＡＰＩ（４'，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール、二塩酸塩）（Invitrogen）。Ａ６４７ヤギ抗ラット、Ａ５６８ヤギ抗ラット、Ａ６４７ヤギ抗マウス、Ａ４８８ウサギ抗ＧＦＰおよびＡ４８８ヤギ抗ウサギ二次抗体はInvitrogenから購入した。ニューロスフェアおよび培養グリア細胞は、ＰＦＡ４％中で室温で１０分間固定し、ＰＢＳ－Triton ０．１％で３０秒間透過性にした。ＰＢＳで数回洗浄した後、細胞を抗体とともに室温で３時間インキュベートし、次いでMowiolにマウントした３９。試料は、Zeiss LSM710共焦点顕微鏡で、EC Plan-Neofluar 10x/0.30 M27、Plan Apochromat 20x/0.8 M27およびEC Plan-Neofluar 40x/1.30対物レンズを用いて取得した。画像の３次元再構成をImarisソフトウェアを使用して達成し、スナップショット画像を３次元画像から得た。共焦点画像の分析のために、細胞を、MATLAB（Mathworks、Natick、MA）で記述された社内ソフトウェアを用いて計数した。簡潔に述べると、単一細胞ＩＬＣ３核は、ＲＯＲγｔを介して閾値処理および粒子分析により同定した。最小ピクセル数（通常２０）が所与の閾値を上回った場合に染色が陽性とみなされるＧＦＰチャネルにおける分析のために、各核から関心領域（ＲＯＩ）（図５ｉ；下のパネル）を定義した。このソフトウェアは、複数の画像のバッチ処理を可能にし、細胞計数結果および同時発現分析のユーザ検証用に、個々のレポート画像を生成する。（https://imm.medicina.ulisboa.pt/en/servicos-e-recursos/technical-facilities/bioimaging）。
【0099】
組織病理分析：結腸試料を、１０％中性緩衝ホルマリンで固定した。結腸は、複数の断面または「スイスロール」技術４０で調製され、パラフィン包埋のためにルーチン処理して、３－４μｍ切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。腸の病変は、実験群について盲検されている病理学者により、以前に公表された基準４１－４３に従ってスコアリングされた。簡潔に述べると、病変は、以下の基準で個々にスコアリングされた（重症度が０～４）；１－粘膜喪失；２－粘膜上皮肥厚、３－炎症の度合い、４－いずれかの様式で影響を受けた切片の程度、および５－前に記載のように、最も重篤な様式で影響を受けた切片の程度４３。最終スコアは、個々の病変および程度スコアを合計することによって得た。陰窩（crypt）の内径は、少なくとも５つの視野（１０倍の倍率）で測定され、陰窩構造における最も重大な変化が見られるホットスポットに対応していた。測定は、近位から遠位結腸まで、試料／マウス当たり平均で３５の陰窩で行った。腸管の絨毛の高さを測定した。測定は、ＮＤＰスキャンソフトウェアを実行するHamamatsu Nanozoomer SQデジタルスライドスキャナを用いてスキャンしたスライドで行った。
【0100】
腸グリア細胞の単離：腸グリア細胞の単離は、前に記載のプロトコール４４，４５から適合した。簡潔に述べると、筋層を粘膜下層から、外科用鉗子を用いて解剖顕微鏡（SteREO Lumar.V12、Zeiss）下で分離した。粘膜固有層を下にある粘膜下組織から、１．５ｍｍのカバースリップ（Thermo Scientific）を用いて機械的に削り取った。単離した組織を回収し、１％hepes、ピルビン酸ナトリウム、グルタミン、ストレプトマイシンおよびペニシリンおよび０．１％β－メルカプトエタノール（Gibco）を補充したＲＰＭＩ中の、Liberase TM（７，５μｇ／ｍＬ；Roche）およびDNase I（０．１ｍｇ／ｍＬ；Roche）で、３７℃で約４０分間消化した。単一細胞懸濁液を１００μｍ細胞ストレーナー（BD Biosciences）に通して、凝集塊および破片を除去した。
【0101】
フローサイトメトリーおよび細胞選別：粘膜固有層細胞を、前に記載のように単離した４６。簡潔に述べると、腸を、１０％ＦＢＳ、１％hepes、ピルビン酸ナトリウム、グルタミン、ストレプトマイシンおよびペニシリンおよび０．１％β－メルカプトエタノール（Gibco）を補充したＲＰＭＩ中の、コラゲナーゼＤ（０．５ｍｇ／ｍＬ；Roche）およびDNaseI（０．１ｍｇ／ｍＬ；Roche）で、３７℃で約３０分間、穏やかに攪拌しながら消化した。サイトカイン分析のために、細胞懸濁液をＰＭＡ／イオノマイシン（Sigma-Aldrich）およびBrefeldin A（eBioscience）中で３７℃で４時間インキュベートした。細胞内染色を、ＩＣ固定化／浸透化キット（eBioscience）を用いて行った。細胞を、ＰＢＳ、１％ＦＢＳ、１％hepesおよび０．６％ＥＤＴＡ（Gibco）を用いて染色した。フローサイトメトリー分析および細胞選別は、FORTESSAおよびFACSAriaフローサイトメーター（BD Biosciences）を用いて行った。データ分析は、FlowJoソフトウェア（Tristar）を用いて行った。選別集団は＞９５％純粋であった。細胞懸濁液を、以下を用いて染色した：抗ＣＤ４５（３０－Ｆ１１）、抗ＴＥＲ１１９（ＴＥＲ－１１９）、ＴＣＲβ（Ｈ５７－５９７）、抗ＣＤ３ε（ｅＢｉｏ５００Ａ２）、抗ＣＤ１９（ｅＢｉｏ１Ｄ３）、抗ＮＫ１．１（ＰＫ１３６）、抗ＣＤ１１ｃ（Ｎ４１８）、抗Ｇｒ１（ＲＢ６－８Ｃ５）、抗ＣＤ１１ｂ（Ｍｉ／７０）、抗ＣＣＲ６（２９－２Ｌ１７）、抗ＣＤ１２７（ＩＬ－７Ｒα；Ａ７Ｒ３４）、抗Ｔｈｙ１．２（５３－２．１）、抗ＣＤ４９ｂ（ＤＸ５）、抗ＴＣＲδ（ＧＬ３）、抗ＮＫｐ４６（２９Ａ１．４）、抗ＩＬ－１７（ｅＢｉｏ１７Ｂ７）、抗ＩＬ－２２（１Ｈ８ＰＷＳＲ）、ラットＩｇＧ１アイソタイプ対照（ｅＢＲＧ１）抗体、７ＡＡＤ生存力色素、抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２（Ｆｃブロック）、抗ＲＯＲγｔ（ＡＦＫＪＳ－９）；ラットＩｇＧ２ａκアイソタイプ対照（ｅＢＲ２ａ）およびストレプトアビジン蛍光色素コンジュゲート（すべてeBioscience製）；抗ＣＤ４（ＧＫ１．５）、抗ＣＤ３１（３９０）、抗ＣＤ８α（５３－６．７）、抗ＣＤ２４（Ｍ１／６９）、抗Ｅｐｃａｍ（Ｇ８．８）抗体はBiolegendから購入した。抗ＲＥＴ（ＩＣ７１８Ａ）抗体はR&D Systemsから購入した。LIVE/DEAD Fixable Atua Dead Cell Stain KitはInvitrogenから購入した。細胞集団を以下のように定義した：ＩＬＣ３：ＣＤ４５＋Ｌｉｎ－Ｔｈｙ１．２ｈｉＩＬ７Ｒα＋ＲＯＲγｔ＋；ＩＬＣ３サブセットについては、さらなるマーカーを使用した：ＬＴｉ：ＣＣＲ６＋Ｎｋｐ４６－；ＩＬＣ３ ＮＣＲ－：ＣＣＲ６－Ｎｋｐ４６－；ＩＬＣ３ ＮＣＲ＋：ＣＣＲ６－Ｎｋｐ４６＋；系統は、ＣＤ３ε、ＣＤ８α、ＴＣＲβ、ＴＣＲγδ、ＣＤ１９、Ｇｒ１、ＣＤ１１ｃおよびＴＥＲ１１９によって構成された；グリア細胞：ＣＤ４５－ＣＤ３１－ＴＥＲ１１９－ＣＤ４９ｂ＋ ４７；Ｔ細胞：ＣＤ４５＋ＣＤ３ε＋；γδＴ細胞：ＣＤ４５＋ＣＤ３ε＋γδＴＣＲ＋；Ｂ細胞：ＣＤ４５＋ＣＤ１９＋Ｂ２２０＋；マクロファージ：ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋；樹状細胞：ＣＤ４５＋ＣＤ１９－ＣＤ３ε－ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｃ＋；腸内ニューロン：ＣＤ４５－ＲＥＴ／ＧＦＰ＋１３、上皮細胞：ＣＤ４５－ＣＤ２４＋Ｅｐｃａｍ＋。
【0102】
定量的ＲＴ－ＰＣＲ：全ＲＮＡを、RNeasyマイクロキット（Qiagen）またはTrizol（Invitrogen）を用い、製造者のプロトコールに従って抽出した。ＲＮＡ濃度は、Nanodrop分光光度計（Nanodrop Technologies）を用いて測定した。定量的リアルタイムＲＴ－ＰＣＲは、前に記載のように実施した２、８、９。ＨｐｒｔおよびＧａｐｄｈを、ハウスキーピング遺伝子として用いた。TaqManアッセイ（Applied Biosystems）では、ＲＮＡをHigh Capacity RNA-to-cDNAキット（Applied Biosystems）を使用して逆転写した後、前増幅ＰＣＲをTaqMan PreAmp Master Mix（Applied Biosystems）を用いて行った。TaqMan Gene Expression Master Mix（Applied Biosystems）をリアルタイムＰＣＲに使用した。TaqMan Gene Expression Assays（Applied Biosystems）は、以下の通りであった：
リアルタイムＰＣＲ分析は、ABI Prism 7900HT Sequence Detection SystemまたはStepOne Real-Time PCR system（Applied Biosystems）を用いて行った。
【表1】
リアルタイムＰＣＲ分析は、ABI Prism 7900HT Sequence Detection SystemまたはStepOne Real-Time PCR system（Applied Biosystems）を用いて行った。
【0103】
ＩＬＣ３活性化および細胞シグナル伝達：選別された腸管ＩＬＣ３細胞を、ＲＰＭＩ中３７℃で３時間飢餓状態にして、ＩＬＣ３の生存力を確実にした。ＲｅｔｆｌまたはＲｅｔΔをex vivoで直接分析した。ＧＦＬ刺激時のＥＲＫ、ＡＫＴ、ｐ３８－ＭＡＰＫ（Cell Signaling Technology）およびＳＴＡＴ３（BD Pharmigen）を試験するために、ＷＴ ＩＬＣ３を、５００ｎｇ／ｍＬ（各ＧＦＬ）および共受容体（R&D SystemsからのｒｒＧＦＲ－α１、ｒｍＧＦＲ－α２、ｒｒＧＦＲ－α３およびｒｒＧＮＤＦ； PeproTechからのｒｈＮＲＴＮおよびｒｈＡＲＴＮ）で、１０および３０分間、活性化させた。「ＧＦＬ」の使用に言及する場合、我々はＧＤＮＦ、ＮＲＴＮ、ＡＲＴＮおよびそれらの特異的共受容体を組み合わせて使用した。阻害実験のために、細胞をＧＦＬ刺激の前に３７℃で１時間インキュベートし、ＥＲＫ、ＡＫＴ、ｐ３８／ＭＡＰＫおよびＳＴＡＴ３リン酸化を試験するか、またはＧＦＬでの一晩の刺激の間に、ＩＬ２２発現レベルを決定した。阻害剤はSigma-Aldrichから購入した：ｐ３８ＭＡＰＫ／ＥＲＫ－ＡＫＴ：ＬＹ２９４００２（ＬＹ）；ＥＲＫ：ＰＤ９８０５９（ＰＤ）；ＡＫＴ：ＡＫＴ阻害剤ＶＩＩＩ（ＶＩＩＩ）；ｐ３８ ＭＡＰＫ：ＳＢ２０２１９０（ＳＢ）；およびｐＳＴＡＴ３：Ｓ３Ｉ－２０１（Ｓ３Ｉ）。
【0104】
クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイ：成体Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスからの腸のＩＬＣ３をフローサイトメトリーにより単離した。細胞を、１％hepes、ピルビン酸ナトリウム、グルタミン、ストレプトマイシンおよびペニシリンおよび０．１％β－メルカプトエタノール（Gibco）を補充したＲＰＭＩで、３７℃で３時間飢餓状態にした。細胞をＧＦＬ（各５００ｎｇ／ｍＬ）８で刺激し、溶解し、架橋し、染色体ＤＮＡ－タンパク質複合体を超音波処理して、１００～３００塩基対の範囲のＤＮＡ断片を生成させた。ＤＮＡ／タンパク質複合体を、LowCell#ChIPキット（Diagenode）１８を用いて、抗ｐＳＴＡＴ３（Cell Signaling Technology）、ウサギ対照ＩｇＧ（Abcam）またはＨ３Ｋ３６ｍｅ３（07-030；Millipore）に対する３μｇのウサギポリクローナル抗体を用いて、免疫沈降させた。免疫沈降物を未架橋にし、定量的ＰＣＲにより、Ｉｌ２２上の推定部位に隣接するプライマー対（５'－３'）を用いて分析した。ビヒクル（BSA）刺激ＩＬＣ３を、対照として使用した。Ｉｌ２２プライマー配列は前に記載されており４８－５０、簡潔には以下である：
ａ、Ｆ－ＴＧＣＡＡＴＣＡＡＴＣＣＣＡＧＴＡＴＴＴＴＧ（配列番号：１）および
Ｒ－ＣＴＴＧＴＧＣＡＡＧＣＡＴＡＡＧＴＣＴＣＡＡ（配列番号：２）；
ｂ、Ｆ－ＧＡＡＧＴＴＧＧＴＧＧＧＡＡＡＡＴＧＡＧＴＣＣＧＴＧＡ（配列番号：３）および
Ｒ－ＧＣＣＡＴＧＧＣＴＴＴＧＣＣＧＴＡＧＴＡＧＡＴＴＣＴＧ（配列番号：４）；
ｃ、Ｆ－ＡＣＧＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡＧＧＣＴＧＣＴＣＴ（配列番号：５）および
Ｒ－ＧＣＣＡＡＣＡＡＧＧＴＧＣＴＴＴＴＧＣ（配列番号：６）；
ｄ、Ｆ－ＣＴＣＡＣＣＧＴＧＡＣＧＴＴＴＴＡＧＧＧ（配列番号：７）および
Ｒ－ＧＴＧＡＡＴＧＡＴＡＴＧＡＣＡＴＣＡＧＡＣ（配列番号：８）；
ｅ、Ｆ－ＣＧＡＣＧＡＡＣＡＴＧＣＴＣＣＣＣＴＧＡＴＧＴＴＴＴＴ（配列番号：９）および
Ｒ－ＡＡＡＣＴＣＡＴＡＧＡＴＴＴＣＴＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＣ（配列番号：１０）；
ｆ、Ｆ－ＡＧＣＴＧＣＡＴＣＴＣＴＴＴＣＴＣＴＣＣＡ（配列番号：１１）および
Ｒ－ＴＡＴＣＣＴＧＡＡＧＧＣＣＡＡＡＡＴＡＧＧＡ（配列番号：１２）；
ｇ、Ｆ－ＡＣＧＡＣＣＡＧＡＡＣＡＴＣＣＡＧＡＡＧＡ（配列番号：１３）および
Ｒ－ＧＣＡＧＡＧＡＡＡＧＡＡＡＴＣＣＣＣＧＣ（配列番号：１４）；
ｈ、Ｆ－ＡＧＧＧＧＧＡＣＴＴＧＣＴＴＴＧＣＣＡＴＴＴ（配列番号：１５）および
Ｒ－ＡＡＣＡＣＣＣＣＴＴＣＴＴＴＣＣＴＣＣＴＣＣＡＴ（配列番号：１６）；
ｉ、Ｆ－ＣＴＧＣＴＣＣＴＴＣＣＴＧＣＣＴＴＣＴＡ（配列番号：１７）および
Ｒ－ＣＴＧＡＧＣＣＡＧＧＴＴＴＣＡＴＧＴＧＡ（配列番号：１８）。プライマー位置は、Ｉｌ２２の転写開始コドンに対して図３ｉに示されている。
ａ、Ｆ－ＴＧＣＡＡＴＣＡＡＴＣＣＣＡＧＴＡＴＴＴＴＧ（配列番号：１）および
Ｒ－ＣＴＴＧＴＧＣＡＡＧＣＡＴＡＡＧＴＣＴＣＡＡ（配列番号：２）；
ｂ、Ｆ－ＧＡＡＧＴＴＧＧＴＧＧＧＡＡＡＡＴＧＡＧＴＣＣＧＴＧＡ（配列番号：３）および
Ｒ－ＧＣＣＡＴＧＧＣＴＴＴＧＣＣＧＴＡＧＴＡＧＡＴＴＣＴＧ（配列番号：４）；
ｃ、Ｆ－ＡＣＧＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡＧＧＣＴＧＣＴＣＴ（配列番号：５）および
Ｒ－ＧＣＣＡＡＣＡＡＧＧＴＧＣＴＴＴＴＧＣ（配列番号：６）；
ｄ、Ｆ－ＣＴＣＡＣＣＧＴＧＡＣＧＴＴＴＴＡＧＧＧ（配列番号：７）および
Ｒ－ＧＴＧＡＡＴＧＡＴＡＴＧＡＣＡＴＣＡＧＡＣ（配列番号：８）；
ｅ、Ｆ－ＣＧＡＣＧＡＡＣＡＴＧＣＴＣＣＣＣＴＧＡＴＧＴＴＴＴＴ（配列番号：９）および
Ｒ－ＡＡＡＣＴＣＡＴＡＧＡＴＴＴＣＴＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＣ（配列番号：１０）；
ｆ、Ｆ－ＡＧＣＴＧＣＡＴＣＴＣＴＴＴＣＴＣＴＣＣＡ（配列番号：１１）および
Ｒ－ＴＡＴＣＣＴＧＡＡＧＧＣＣＡＡＡＡＴＡＧＧＡ（配列番号：１２）；
ｇ、Ｆ－ＡＣＧＡＣＣＡＧＡＡＣＡＴＣＣＡＧＡＡＧＡ（配列番号：１３）および
Ｒ－ＧＣＡＧＡＧＡＡＡＧＡＡＡＴＣＣＣＣＧＣ（配列番号：１４）；
ｈ、Ｆ－ＡＧＧＧＧＧＡＣＴＴＧＣＴＴＴＧＣＣＡＴＴＴ（配列番号：１５）および
Ｒ－ＡＡＣＡＣＣＣＣＴＴＣＴＴＴＣＣＴＣＣＴＣＣＡＴ（配列番号：１６）；
ｉ、Ｆ－ＣＴＧＣＴＣＣＴＴＣＣＴＧＣＣＴＴＣＴＡ（配列番号：１７）および
Ｒ－ＣＴＧＡＧＣＣＡＧＧＴＴＴＣＡＴＧＴＧＡ（配列番号：１８）。プライマー位置は、Ｉｌ２２の転写開始コドンに対して図３ｉに示されている。
【0105】
コロニー形成単位および傍細胞透過性：器官を収穫し、計量し、懸濁させた。細菌コロニー形成単位（ＣＦＵ）を、組織および全器官のグラム当たりで決定した。ＣＦＵを、Luria Broth（ＬＢ）寒天およびマッコンキー寒天（Sigma-Aldrich）で段階希釈して決定した。コロニーを、３７℃で２日間の培養後に計数した。腸管傍細胞透過性を扱うために、一晩絶食した後、マウスあたり１６ｍｇのデキストランＦｉｔｃ（Sigma Aldrich）を胃管栄養により投与した。血漿を、デキストランＦｉｔｃ投与の4時間後に、Microplate Reader TECAN Infinity F500を用いて分析した。
【0106】
ＢｒｄＵ投与およびＫｉ－６７標識：ＢｒｄＵをｉ．ｐ．注射（１．２５ｍｇ／マウス）で投与した。上皮細胞増殖のフローサイトメトリー分析のために、抗ＢｒｄＵ（StainingKit for flow Cytometry- eBioscience）および抗マウスＫｉ－６７抗体（BioLegend）を用いた。
【0107】
門レベルでの便中の細菌の定量的ＰＣＲ分析：糞便ペレット試料からのＤＮＡをZR Fecal DNA MicroPrep（登録商標）（Zymo Research）で単離した。細菌の定量は、ｑＰＣＲによって確立された標準曲線から決定した。ｑＰＣＲは、Power SYBR（登録商標）Green PCR Master Mix（Applied Biosystems）およびStepOne Plus（Applied Biosystems）サーモサイクラーを使用し異なるプライマーセットで行った。試料を１６Ｓ ｒＤＮＡに対して標準化し、２－ΔΔＣＴ法に従って報告した。プライマー配列は、以下である：
１６Ｓ ｒＤＮＡ、Ｆ－ＡＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴ（配列番号１９）および
Ｒ－ＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＣ（配列番号２０）；Firmicutes、
Ｆ－ＡＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣ（配列番号２１）および
Ｒ－ＧＣＴＴＣＴＴＡＧＴＣＡＧＧＴＡＣＣＧＴＣＡＴ（配列番号２２）；Bacteroidetes、
Ｆ－ＧＧＴＴＣＴＧＡＧＡＧＧＡＧＧＴＣＣＣ（配列番号２３）および
Ｒ－ＧＣＴＧＧＣＴＣＣＣＧＴＡＧＧＡＧＴ（配列番号２４）；Protebacteria、
Ｆ－ＧＧＴＴＣＴＧＡＧＡＧＧＡＧＧＴＣＣＣ（配列番号２５）および
Ｒ－ＧＣＴＧＧＣＴＣＣＣＧＴＡＧＧＡＧＴ（配列番号２６）。
１６Ｓ ｒＤＮＡ、Ｆ－ＡＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴ（配列番号１９）および
Ｒ－ＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＣ（配列番号２０）；Firmicutes、
Ｆ－ＡＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣ（配列番号２１）および
Ｒ－ＧＣＴＴＣＴＴＡＧＴＣＡＧＧＴＡＣＣＧＴＣＡＴ（配列番号２２）；Bacteroidetes、
Ｆ－ＧＧＴＴＣＴＧＡＧＡＧＧＡＧＧＴＣＣＣ（配列番号２３）および
Ｒ－ＧＣＴＧＧＣＴＣＣＣＧＴＡＧＧＡＧＴ（配列番号２４）；Protebacteria、
Ｆ－ＧＧＴＴＣＴＧＡＧＡＧＧＡＧＧＴＣＣＣ（配列番号２５）および
Ｒ－ＧＣＴＧＧＣＴＣＣＣＧＴＡＧＧＡＧＴ（配列番号２６）。
【0108】
１６Ｓ ｒＲＮＡ定量および遺伝子配列決定：糞便を、共飼育するＲｅｔｆｌまたはＲｅｔΔ同腹仔から単離した。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の配列決定を、以前に記載のようにして行った５１。簡単に述べると、バーコードされたプライマーを使用して、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ４領域を増幅し、アンプリコンを、ＭｉＳｅｑ装置（Illumina、San Diego、USA）で、１５０ｂｐの対の端部のケミストリーを用いて、University of Pennsylvania Next Generation Sequencing Coreにて配列決定した。対の端部を組み立て、品質をフィルタリングし、品質スコアが３０以上の読み取りを選択した。＞１０ｂｐのホモポリマーおよび２４８ｂｐより短いかまたは２５５ｂｐより長い読取りを、解析から除外した。１６Ｓ ｒＲＮＡ配列データを、mothur v 1.25.0５２およびQIIME v 1.8５３を用いて処理した。キメラ配列をChimeraSlayer５４で除去した。操作上の分類単位（ＯＴＵ）は、ＣＤ－ＨＩＴ５５で９７％の配列類似性をカットオフとして用いて定義した。２以上の配列を含むＯＴＵのみが保持された；シアノバクテリアに割り当てられたＯＴＵまたはいずれの門にも割り当てられなかったＯＴＵを、分析から除外した。分類は、Ribosomal Database Project（ＲＤＰ）分類器v2.22５６を用いて割り当てられ、複数の配列割り当てはPyNAST（v1.2.2）５７で実施され、FastTree５８を系統発生の構築に用いた。試料を、アルファおよびベータ－ダイバーシティ分析のために、１試料あたり２２，０００個の配列に調製した。分類学的相対存在量は、中央値と標準偏差として報告される。Wilcoxon順位和検定を用いてＰ値を算出した。統計的試験は、R v．3.2.0で行った。どの要因が微生物群集の組成と関連しているかを調べるために、統計的試験を、ノンパラメトリック類似分析（ＡＮＯＳＩＭ）と加重UniFrac距離メトリクス５９を用いて実施した。
【0109】
データアクセス：この研究で生成された配列決定データは、NCBI Sequence Read Archiveに、BioProject PRJNA314493（SRA: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=PRJNA314493）として提出されている。
【0110】
腸管オルガノイド：IntestiCult（商標）Organoid Growth MediumおよびGentle Cell Dissociation Reagentは、StemCellから購入した。腸管陰窩をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスから、製造者の説明書に従って単離し、予め解凍した氷冷マトリゲルに１：１の比で、最終濃度５，０００～７，０００陰窩／ｍＬで加えた。この混合物１５μＬを、９６ウェル丸底プレートのウェルごとに播種した。マトリゲル固化後、１００μＬの増殖培地（１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン）を添加し、３日毎に交換した。オルガノイドは、３７℃、５％ＣＯ２で増殖させ、製造者の指示に従って継代させた。新しく選別した腸管ＩＬＣ３を、抗マウスＩＬ－２２抗体（R&D Systems）有りまたは無しで２４時間播種した後、５～８日の上皮オルガノイドに添加した。
【0111】
ＩＬ－２２アゴニストのin vivo投与：１５０μｇの抗ＩＬ－２２抗体（８Ｅ１１;Genentech, South San Francisco, CAからの寄贈品）またはマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照（ＭＯＰＣ－２１；Bio X Cell）を、ＲｅｔＭＥＮ２Ｂマウスに２日毎にｉ．ｐ．投与した。動物を、最初の投与の２週間後に分析した。
【0112】
ニューロスフェア由来グリア細胞：ニューロスフェア由来グリア細胞は、前に記載のようにして得た６０。簡潔に述べると、Ｅ１４．５ Ｃ５７ＢＬ／６ＪおよびＭｙｄ８８－／－マウスからの全腸を、１％hepes、ストレプトマイシン／ペニシリンおよび０．１％β－メルカプトエタノール（Gibco）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ－１２、GlutaMAX中の、コラゲナーゼＤ（０．５ｍｇ／ｍＬ；Roche）およびDNaseI（０．１ｍｇ／ｍＬ；Roche）で、３７℃で約３０分間、穏やかに攪拌しながら消化した。細胞を、Ｂ２７（Gibco）、ＥＧＦ（Gibco）およびＦＧＦ２（Gibco）２０ｎｇ／ｍＬを補充したＤＭＥＭ／Ｆ－１２、GlutaMAX（商標）、ストレプトマイシンおよびペニシリンおよび０．１％β－メルカプトエタノール（Gibco）中、３７℃のＣＯ２インキュベーター内で１週間培養した。１週間の培養後、細胞を０．０５％トリプシン（Gibco）で処理し、ＰＤＬ（Sigma-Aldrich）被覆プレートに移し、１０％ＦＢＳ、１％hepes、グルタミン、ストレプトマイシンおよびペニシリンおよび０．１％メルカプトエタノール（Gibco）を補充したＤＭＥＭ中で、コンフルエントになるまで培養した。グリア細胞は、InvivogenからのＴＬＲ２（５μｇ／ｍｌ）（Ｐａｍ３ＣＳＫ４）、ＴＬＲ３（１００μｇ／ｍｌ）（ＰｏｌｙＩ：Ｃ）、ＴＬＲ４（５０ｎｇ／ｍｌ）（ＬＰＳ）、ＴＬＲ９（５０μｇ／ｍｌ）（ＤｓＤＮＡ－ＥＣ）リガンドおよびR&D SystemsからのＩＬ－１β（１０ｎｇ／ｍＬ）（４０１ＭＬ００５）、ＩＬ－１８（５０ｎｇ／ｍＬ）（Ｂ００２－５）、ＩＬ－３３（０．１ｎｇ／ｍＬ）（３６２６ＭＬ）組換えタンパク質で活性化させた。細胞はまた、ＷＴおよびＩｌ１ｂ欠損マウスからの精製ＩＬＣ３と共培養した。ＴＬＲ４活性化時のグリア－ＩＬＣ３共培養におけるＩＬ－２２発現を、ＧＤＮＦ（２μｇ／ｍＬ）（ＡＢ－２１２－ＮＡ）、ＮＲＴＮ（２μｇ／ｍＬ）（ＡＦ－３８７ｓｐ）およびＡＲＴＮ（０．３μｇ／ｍＬ）（ＡＦ－１０８５－ｓｐ）遮断抗体を用いて実施した。細胞を、２４時間の共培養後に分析した。
【0113】
統計：結果は、平均±ＳＥＭとして示される。統計的分析にはMicrosoft Excelを使用した。分散は、Ｆ検定を用いて分析した。スチューデントｔ検定を同胞集団で行い、ウェルチ補正を用いたスチューデントｔ検定を、異なる分散を有する試料に適用した。生存曲線の解析はMAntel-Cox試験を用いて行った。結果は、＊ｐ≦０．０５；＊＊ｐ≦０．０１で有意であると考えられた。メタゲノミクス分析の統計的処理は、方法のセクション：１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列決定および分析に記載されている。
【0114】
実施例１：神経栄養因子受容体ＲＥＴは、腸内ＩＬＣ３由来ＩＬ－２２を駆動する
消化管粘膜固有層の分析により、ＩＬＣ３が高レベルのＲｅｔ（図１ａ）を発現することが明らかとなり７，１２、これは、タンパク質レベルおよびＲｅｔＧＦＰノックインマウスにより確認された発見である（図１ｂ～１ｄおよび図５ａ～５ｄ）１３。ＩＬＣ３サブセットはＲｅｔＧＦＰを発現し、クリプトパッチ（ＣＰ）および分離リンパ球（ＩＬＦ）に凝集し、ＩＬＣ３における神経調節物質の役割を示唆した（図１ｂ～１ｄおよび図５ｂ～５ｊ）。この仮説を調べるために、胎仔性肝細胞を、Ｒｅｔ競合的（ＲｅｔＷＴ／ＧＦＰ）または欠損（ＲｅｔＧＦＰ／ＧＦＰ）１３動物から、無リンパ球Ｒａｇ１－／－γｃ－／－宿主に移植した。Ｒｅｔ欠損キメラは、摂動のないＩＬＣ３およびＣＰ発生を明らかにした（図１ｅ）。驚くべきことに、ＩＬ－２２を発現するＩＬＣ３は、正常なＩＬ－２２産生Ｔ細胞にもかかわらず、大幅に減少した（図１ｆ、１ｇ）。対照的に、先天性ＩＬ－１７は、Ｒｅｔ消失による影響を受けなかった（図１ｆおよび図６ａ）。これと一致して、機能獲得型ＲｅｔＭＥＮ２Ｂマウス１４の分析は、ＩＬ－２２を産生するＩＬＣ３の選択的増加を明らかにし、一方そのＩＬ－１７対応物は影響を受けなかった（図１ｈおよび図６ｂ）。ＩＬＣ３におけるＲＥＴの効果をより具体的に評価するために、Ｒｅｔを、Ｒｏｒｇｔ－ＣｒｅをＲｅｔｆｌ／ｆｌマウスに交配させることによって、ＲＯＲγｔ発現細胞で欠失させた（図７ａ、７ｂ）。Ｒｏｒｇｔ－Ｃｒｅ．Ｒｅｔｆｌ／ｆｌ（ＲｅｔΔ）マウスの解析により、ＩＬＣ３由来のＩＬ－２２の選択的かつ大幅な減少と、しかし正常なＩＬ－２２産生Ｔ細胞が明らかにされた（図２ａおよび図７ｃ、７ｄ）。ＩＬ－２２は、上皮細胞に作用して反応性および修復遺伝子を誘導する１。ＲｅｔΔ上皮は、野生型（ＷＴ）同腹仔対照と比較して、正常な形態、増殖および傍細胞透過性を示したが、上皮反応性および修復遺伝子の顕著な減少を示した（図２ｂおよび図７ｅ～７ｈ）。したがって、ＲｅｔＭＥＮ２Ｂ上皮は、これら分子のレベルの増加をＩＬ－２２依存的に示した（図２ｂおよび図７ｉ）。これらの結果は、ＲＥＴシグナルが先天性ＩＬ－２２を選択的に制御し、腸管上皮反応性を形成することを示す。
消化管粘膜固有層の分析により、ＩＬＣ３が高レベルのＲｅｔ（図１ａ）を発現することが明らかとなり７，１２、これは、タンパク質レベルおよびＲｅｔＧＦＰノックインマウスにより確認された発見である（図１ｂ～１ｄおよび図５ａ～５ｄ）１３。ＩＬＣ３サブセットはＲｅｔＧＦＰを発現し、クリプトパッチ（ＣＰ）および分離リンパ球（ＩＬＦ）に凝集し、ＩＬＣ３における神経調節物質の役割を示唆した（図１ｂ～１ｄおよび図５ｂ～５ｊ）。この仮説を調べるために、胎仔性肝細胞を、Ｒｅｔ競合的（ＲｅｔＷＴ／ＧＦＰ）または欠損（ＲｅｔＧＦＰ／ＧＦＰ）１３動物から、無リンパ球Ｒａｇ１－／－γｃ－／－宿主に移植した。Ｒｅｔ欠損キメラは、摂動のないＩＬＣ３およびＣＰ発生を明らかにした（図１ｅ）。驚くべきことに、ＩＬ－２２を発現するＩＬＣ３は、正常なＩＬ－２２産生Ｔ細胞にもかかわらず、大幅に減少した（図１ｆ、１ｇ）。対照的に、先天性ＩＬ－１７は、Ｒｅｔ消失による影響を受けなかった（図１ｆおよび図６ａ）。これと一致して、機能獲得型ＲｅｔＭＥＮ２Ｂマウス１４の分析は、ＩＬ－２２を産生するＩＬＣ３の選択的増加を明らかにし、一方そのＩＬ－１７対応物は影響を受けなかった（図１ｈおよび図６ｂ）。ＩＬＣ３におけるＲＥＴの効果をより具体的に評価するために、Ｒｅｔを、Ｒｏｒｇｔ－ＣｒｅをＲｅｔｆｌ／ｆｌマウスに交配させることによって、ＲＯＲγｔ発現細胞で欠失させた（図７ａ、７ｂ）。Ｒｏｒｇｔ－Ｃｒｅ．Ｒｅｔｆｌ／ｆｌ（ＲｅｔΔ）マウスの解析により、ＩＬＣ３由来のＩＬ－２２の選択的かつ大幅な減少と、しかし正常なＩＬ－２２産生Ｔ細胞が明らかにされた（図２ａおよび図７ｃ、７ｄ）。ＩＬ－２２は、上皮細胞に作用して反応性および修復遺伝子を誘導する１。ＲｅｔΔ上皮は、野生型（ＷＴ）同腹仔対照と比較して、正常な形態、増殖および傍細胞透過性を示したが、上皮反応性および修復遺伝子の顕著な減少を示した（図２ｂおよび図７ｅ～７ｈ）。したがって、ＲｅｔＭＥＮ２Ｂ上皮は、これら分子のレベルの増加をＩＬ－２２依存的に示した（図２ｂおよび図７ｉ）。これらの結果は、ＲＥＴシグナルが先天性ＩＬ－２２を選択的に制御し、腸管上皮反応性を形成することを示す。
【0115】
実施例２：ＩＬＣ３－内因性ＲＥＴシグナルは、消化管の防御およびホメオスタシスを調節する
神経栄養因子が腸管防御を調節するかどうかを調べるために、ＲＥＴシグナルの程度の変化がどのように腸内侵襲を制御するかを試験した。デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）で処置したＲｅｔΔマウスは、体重減少の増加および炎症の増加、ＩＬ－２２産生ＩＬＣ３の減少、上皮反応性／修復遺伝子の減少および消化管からの顕著な細菌移行を示したが、ＲｅｔＭＥＮ２Ｂ突然変異体は、それらのＷＴ同腹仔対照よりも高度に保護されていた（図２ｃ～２ｊおよび図８）。ＤＳＳは主に上皮傷害を引き起こすので、ＩＬＣ３自律的ＲＥＴシグナルが感染を制御するために必要であるかどうかを試験した。このために、ＲｅｔΔマウスをＲａｇ１－／－マウスに交配させて、適応性Ｔ細胞効果を正式に排除した。Ｒａｇ１－／－．ＲｅｔΔマウスに、付着して退行する細菌Citrobacter rodentiumを感染させた。それらの同腹子対照と比較して、Ｒａｇ１－／－．ＲｅｔΔマウスは、顕著な消化管炎症、ＩＬ－２２産生ＩＬＣ３の減少、C. rodentium感染および移行の増加、上皮反応性遺伝子の減少、体重減少の増加および生存率の減少を示した（図２ｋ－２ｎおよび図９）。まとめると、これらのデータは、ＩＬＣ３内因性神経栄養因子のキューが、消化管の防御およびホメオスタシスを調節することを示している。
神経栄養因子が腸管防御を調節するかどうかを調べるために、ＲＥＴシグナルの程度の変化がどのように腸内侵襲を制御するかを試験した。デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）で処置したＲｅｔΔマウスは、体重減少の増加および炎症の増加、ＩＬ－２２産生ＩＬＣ３の減少、上皮反応性／修復遺伝子の減少および消化管からの顕著な細菌移行を示したが、ＲｅｔＭＥＮ２Ｂ突然変異体は、それらのＷＴ同腹仔対照よりも高度に保護されていた（図２ｃ～２ｊおよび図８）。ＤＳＳは主に上皮傷害を引き起こすので、ＩＬＣ３自律的ＲＥＴシグナルが感染を制御するために必要であるかどうかを試験した。このために、ＲｅｔΔマウスをＲａｇ１－／－マウスに交配させて、適応性Ｔ細胞効果を正式に排除した。Ｒａｇ１－／－．ＲｅｔΔマウスに、付着して退行する細菌Citrobacter rodentiumを感染させた。それらの同腹子対照と比較して、Ｒａｇ１－／－．ＲｅｔΔマウスは、顕著な消化管炎症、ＩＬ－２２産生ＩＬＣ３の減少、C. rodentium感染および移行の増加、上皮反応性遺伝子の減少、体重減少の増加および生存率の減少を示した（図２ｋ－２ｎおよび図９）。まとめると、これらのデータは、ＩＬＣ３内因性神経栄養因子のキューが、消化管の防御およびホメオスタシスを調節することを示している。
【0116】
実施例３：ＲＥＴシグナルは、Ｉｌ２２の直接調節によりＩＬＣ３機能および消化管防御を制御する
ＩＬ－２２が、ＲＥＴ依存性ＩＬＣ３活性化と上皮反応性との間の分子リンクであるという正式な定義は、多組織オルガノイド系によって提供された。ＧＦＬのＩＬＣ３／上皮オルガノイドへの添加は、上皮反応性遺伝子を、ＩＬ－２２およびＲＥＴ依存的様式で強く誘導した（図３ａ、３ｂおよび図１０ａ）。ＲＥＴシグナルが先天性ＩＬ－２２をどのように制御するかをさらに調べるために、ＩＬＣアイデンティティに関連する遺伝子シグネチャーを調べた１。これらの遺伝子のほとんどが摂動を受けていないが、主なＩＬＣ転写因子Ｒｕｎｘ１、Ｉｄ２、Ｇａｔａ３、Ｒｏｒａ、Ｒｏｒｇｔ、ＡｈｒおよびＳｔａｔ３、Ｉｌ２２が、ＲｅｔΔＩＬＣ３では有意に低下していた（図３ｃおよび図１０ｂ）。これと一致して、in transでの全部または別個のＧＦＬ／ＧＦＲα対によるＩＬＣ３の活性化は、他のＩＬＣ３関連遺伝子の正常な発現にもかかわらず、効率的にＩｌ２２を増加させた（図３ｄおよび図１０ｃ）。ＧＦＬによるＲＥＴの活性化は、ニューロンにおけるｐ３８ ＭＡＰＫ／ＥＲＫ－ＡＫＴカスケード活性化を導くが、一方ＳＴＡＴ３のリン酸化は、ＩＬ２２発現を形成する７，１７。ＲｅｔΔＩＬＣ３の分析は、低リン酸化ＥＲＫ１／２、ＡＫＴ、ｐ３８／ＭＡＰキナーゼおよびＳＴＡＴ３を明らかにした（図３ｅおよび図１０ｄ）。したがって、ＩＬＣ３におけるＧＦＬ誘発ＲＥＴ活性化は、急速なＥＲＫ１／２、ＡＫＴ、ｐ３８／ＭＡＰキナーゼおよびＳＴＡＴ３リン酸化をもたらし、Ｉｌ２２移行を増加させた（図３ｄ、３ｆおよび図１０ｅ、１０ｆ）。これと一致して、ＧＦＬ活性化に際してのＥＲＫ、ＡＫＴまたはｐ３８／ＭＡＰキナーゼの阻害は、ＳＴＡＴ３活性化およびＩｌ２２発現の障害をもたらした（図３ｇ、３ｈ）。最後に、ＧＦＬ誘導性ＲＥＴ活性化時のＳＴＡＴ３の阻害は、ＩＬ２２を減少させた（図３ｈ）。ＧＦＬが直接Ｉｌ２２を調節するかどうかを調べるために、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）を行った（図３ｉ、３ｊ）１８。ＩＬＣ３のＧＦＬによる刺激は、Ｉｌ２２プロモーター中のｐＳＴＡＴ３の結合の増加およびＩｌ２２の３'末端におけるトリメチル－Ｈ３Ｋ３６の増加をもたらし、活性なＩｌ２２転写領域を示した（図３ｄ、３ｊ）１９。したがって、細胞自律的ＲＥＴシグナルは、ＳＴＡＴ３活性化の下流のＩｌ２２の直接調節を介して、ＩＬＣ３機能および消化管防御を制御する。
ＩＬ－２２が、ＲＥＴ依存性ＩＬＣ３活性化と上皮反応性との間の分子リンクであるという正式な定義は、多組織オルガノイド系によって提供された。ＧＦＬのＩＬＣ３／上皮オルガノイドへの添加は、上皮反応性遺伝子を、ＩＬ－２２およびＲＥＴ依存的様式で強く誘導した（図３ａ、３ｂおよび図１０ａ）。ＲＥＴシグナルが先天性ＩＬ－２２をどのように制御するかをさらに調べるために、ＩＬＣアイデンティティに関連する遺伝子シグネチャーを調べた１。これらの遺伝子のほとんどが摂動を受けていないが、主なＩＬＣ転写因子Ｒｕｎｘ１、Ｉｄ２、Ｇａｔａ３、Ｒｏｒａ、Ｒｏｒｇｔ、ＡｈｒおよびＳｔａｔ３、Ｉｌ２２が、ＲｅｔΔＩＬＣ３では有意に低下していた（図３ｃおよび図１０ｂ）。これと一致して、in transでの全部または別個のＧＦＬ／ＧＦＲα対によるＩＬＣ３の活性化は、他のＩＬＣ３関連遺伝子の正常な発現にもかかわらず、効率的にＩｌ２２を増加させた（図３ｄおよび図１０ｃ）。ＧＦＬによるＲＥＴの活性化は、ニューロンにおけるｐ３８ ＭＡＰＫ／ＥＲＫ－ＡＫＴカスケード活性化を導くが、一方ＳＴＡＴ３のリン酸化は、ＩＬ２２発現を形成する７，１７。ＲｅｔΔＩＬＣ３の分析は、低リン酸化ＥＲＫ１／２、ＡＫＴ、ｐ３８／ＭＡＰキナーゼおよびＳＴＡＴ３を明らかにした（図３ｅおよび図１０ｄ）。したがって、ＩＬＣ３におけるＧＦＬ誘発ＲＥＴ活性化は、急速なＥＲＫ１／２、ＡＫＴ、ｐ３８／ＭＡＰキナーゼおよびＳＴＡＴ３リン酸化をもたらし、Ｉｌ２２移行を増加させた（図３ｄ、３ｆおよび図１０ｅ、１０ｆ）。これと一致して、ＧＦＬ活性化に際してのＥＲＫ、ＡＫＴまたはｐ３８／ＭＡＰキナーゼの阻害は、ＳＴＡＴ３活性化およびＩｌ２２発現の障害をもたらした（図３ｇ、３ｈ）。最後に、ＧＦＬ誘導性ＲＥＴ活性化時のＳＴＡＴ３の阻害は、ＩＬ２２を減少させた（図３ｈ）。ＧＦＬが直接Ｉｌ２２を調節するかどうかを調べるために、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）を行った（図３ｉ、３ｊ）１８。ＩＬＣ３のＧＦＬによる刺激は、Ｉｌ２２プロモーター中のｐＳＴＡＴ３の結合の増加およびＩｌ２２の３'末端におけるトリメチル－Ｈ３Ｋ３６の増加をもたらし、活性なＩｌ２２転写領域を示した（図３ｄ、３ｊ）１９。したがって、細胞自律的ＲＥＴシグナルは、ＳＴＡＴ３活性化の下流のＩｌ２２の直接調節を介して、ＩＬＣ３機能および消化管防御を制御する。
【0117】
実施例４：粘膜グリア細胞は神経栄養因子を介して先天性ＩＬ－２２を調整する
炎症への傾向および腸管ホメオスタシスの調節不全は、腸内毒素症（dysbiosis）に関連する２０，２１。ＲｅｔΔマウスは、そのＷＴ同腹子と比較して、定量分析、加重UniFrac分析によって実証されるように変化した微生物群、およびSutterella、未分類のClostridialesおよびBacteroidesの顕著に変化したレベルを有する（図４ａおよび図１１）。離散した微生物群は、伝播性の腸炎惹起性ポテンシャルを有し得る２０、２１。それにもかかわらず、ＲｅｔΔまたはそれらの対照同腹仔の微生物が定着した無菌マウスは、ＤＳＳ誘導大腸炎に対する同様の感受性、および同一の先天性ＩＬ－２２を示した（図４ｂ～４ｄ）。これと一致して、共飼育したＲｅｔΔおよびＷＴ同腹仔は、腸管炎症に対して異なる傾向を示した（図２ｃ、２ｄ）。これらのデータはともに、腸内毒素症自体が、ＲｅｔΔマウスで観察されるように、先天性ＩＬ－２２および消化管炎症に対する感受性の変化を引き起こすには不十分であることを示している（図２ｃ～２ｆ）。こうして、ＧＦＬ産生細胞は、共生および環境シグナルを統合して、先天性ＩＬ－２２を制御すると仮定された。したがって、ＲｅｔΔおよびそれらのＷＴ同腹仔対照の抗生物質処置は、同様のＩＬＣ３由来ＩＬ－２２をもたらした（図４ｅ）２２。
炎症への傾向および腸管ホメオスタシスの調節不全は、腸内毒素症（dysbiosis）に関連する２０，２１。ＲｅｔΔマウスは、そのＷＴ同腹子と比較して、定量分析、加重UniFrac分析によって実証されるように変化した微生物群、およびSutterella、未分類のClostridialesおよびBacteroidesの顕著に変化したレベルを有する（図４ａおよび図１１）。離散した微生物群は、伝播性の腸炎惹起性ポテンシャルを有し得る２０、２１。それにもかかわらず、ＲｅｔΔまたはそれらの対照同腹仔の微生物が定着した無菌マウスは、ＤＳＳ誘導大腸炎に対する同様の感受性、および同一の先天性ＩＬ－２２を示した（図４ｂ～４ｄ）。これと一致して、共飼育したＲｅｔΔおよびＷＴ同腹仔は、腸管炎症に対して異なる傾向を示した（図２ｃ、２ｄ）。これらのデータはともに、腸内毒素症自体が、ＲｅｔΔマウスで観察されるように、先天性ＩＬ－２２および消化管炎症に対する感受性の変化を引き起こすには不十分であることを示している（図２ｃ～２ｆ）。こうして、ＧＦＬ産生細胞は、共生および環境シグナルを統合して、先天性ＩＬ－２２を制御すると仮定された。したがって、ＲｅｔΔおよびそれらのＷＴ同腹仔対照の抗生物質処置は、同様のＩＬＣ３由来ＩＬ－２２をもたらした（図４ｅ）２２。
【0118】
ＧＤＮＦファミリーの神経栄養因子は、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）を発現するニューロンサテライトである腸内グリア細胞によって産生されることが示されている７，２３。驚くべきことに、ＩＬＣ３（ＲｅｔＧＦＰ）およびグリア細胞（Ｇｆａｐ－Ｃｒｅ．Ｒｏｓａ２６ＲＦＰ）の二重レポーターマウスは、グリア細胞の星状突起が、ＣＰ内のＲＯＲγｔ＋ ＩＬＣ３に隣接する（４．３５μｍ±１．４２）ことを明らかにした（図４ｆおよび図１２ａ）。これらのデータは、神経栄養因子によって調整されたパラクリングリアＩＬＣ３クロストークを示唆している。これに一致して、粘膜固有層のグリア細胞は、ＧＦＬの主な産生者であった（図１２ｂ）。最近の研究は、グリア細胞がパターン認識受容体、特にＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）を発現することを示している２４，２５。ニューロスフェア由来グリア細胞の活性化は、それらがＴＬＲ２、ＴＬＲ４、およびアラルミンＩＬ－１βおよびＩＬ－３３に特異的に応答することを明らかにし、これはＧＦＬ発現を効率的に制御し、強力な先天性ＩＬ２２をＭＹＤ８８依存性の様式で誘導した（図４ｇ～４ｉ、１２ｃ～１２ｇ）。先天性ＩＬ－２２に対するＭＹＤ８８依存性グリア細胞感知の生理学的重要性を正式に実証するために、Ｇｆａｐ－ＣｒｅをＭｙｄ８８ｆｌ／ｆｌマウスに交配させることにより、Ｍｙｄ８８をＧＦＡＰ発現グリア細胞で欠失させた２６，２７。注目すべきことに、Ｍｙｄ８８のグリア内因性欠失は、腸管ＧＦＬの減少、消化管炎症の増加、ＩＬＣ３由来ＩＬ－２２の障害、および体重減少の増加をもたらした（図４ｊ～４ｍ；図１３ａ～１３ｄ）。これと一致して、Ｇｆａｐ－Ｃｒｅ．Ｍｙｄ８８Δマウスは、C. rodentium感染に対する感受性が高まった（図１３ｅ～１３ｈ）。したがって粘膜グリア細胞は、共生産物およびアラルミンのＭＹＤ８８依存性感知の下流で、神経栄養因子を介して先天性ＩＬ－２２を調整する。
【0119】
ＩＬＣ３が環境的キューを統合するメカニズムを定義することは、粘膜ホメオスタシスを理解する上で重要である。この研究は、ＩＬＣ３とその微小環境との関係を、特に、神経栄養因子によって調整される新規なグリアＩＬＣ３上皮細胞ユニットの解読により、明らかにしている（図１４）。グリア由来の神経栄養因子は、ｐ３８ ＭＡＰＫ／ＥＲＫ－ＡＫＴの下流の先天性ＩＬ－２２およびＳＴＡＴ３リン酸化を直接制御するチロシンキナーゼＲＥＴを活性化することにより、ＩＬＣ３に内在する様式で機能する（図１４）。
【0120】
参考文献
【表2-1】
【0121】
【表2-2】
【0122】
【表2-3】
【0123】
【表2-4】
【0124】
【表2-5】
【0125】
本発明の少なくとも１つの態様のいくつかの側面をこのように説明したので、当業者が様々な変更、修正、および改良を容易に思い付くであろうことが理解されるべきである。かかる変更、修正、および改良は、この開示の一部であることが意図され、本発明の精神および範囲内にあることが意図される。したがって、前述の説明および図面は、単なる例である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【配列表】