知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ デーエルカー−ブルートシュペンデディーンスト・バーデン−ヴェルテンブルク−ヘッセン・ゲーゲーエムベーハーの特許一覧
特許7000394補因子の非存在下で凝固活性を有する、及び／又は、第ＩＸ因子凝固活性が増加した第ＩＸ因子変異体、並びに、出血性疾患を処置するためのその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2021-12-27
(45)【発行日】2022-02-04
(54)【発明の名称】補因子の非存在下で凝固活性を有する、及び／又は、第ＩＸ因子凝固活性が増加した第ＩＸ因子変異体、並びに、出血性疾患を処置するためのその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/12 20060101AFI20220128BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220128BHJP
C07K 14/745 20060101ALI20220128BHJP
C12Q 1/37 20060101ALI20220128BHJP
A61P 7/04 20060101ALI20220128BHJP
A61K 38/36 20060101ALI20220128BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220128BHJP
C12N 9/64 20060101ALI20220128BHJP
C12Q 1/56 20060101ALI20220128BHJP
C12N 15/57 20060101ALI20220128BHJP
【ＦＩ】
C12N15/12 ZNA
C12N15/63 Z
C07K14/745
C12Q1/37
A61P7/04
A61K38/36
A61K48/00
C12N9/64 Z
C12Q1/56
C12N15/57
【請求項の数】
18
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2019176968
(22)【出願日】2019-09-27
(62)【分割の表示】P 2016537997の分割
【原出願日】2014-12-03
(65)【公開番号】P2020010717
(43)【公開日】2020-01-23
【審査請求日】2019-10-03
(31)【優先権主張番号】13196284.7
(32)【優先日】2013-12-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】511025329
【氏名又は名称】デーエルカー－ブルートシュペンデディーンスト・バーデン－ヴェルテンブルク－ヘッセン・ゲーゲーエムベーハー
【氏名又は名称原語表記】ＤＲＫ－ＢＬＵＴＳＰＥＮＤＥＤＩＥＮＳＴ ＢＡＤＥＮ－ＷＵＲＴＴＥＭＢＥＲＧ－ＨＥＳＳＥＮ ＧＧＭＢＨ
(74)【代理人】
【識別番号】110001508
【氏名又は名称】特許業務法人 津国
(72)【発明者】
【氏名】シュットルンプ，ヨルク
(72)【発明者】
【氏名】クアド－リッシー，パトリシア
(72)【発明者】
【氏名】ミラノフ，ペーター
(72)【発明者】
【氏名】ザイフリート，エアハルト
【審査官】林 康子
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１１－５２８９１３（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２００７／１４９４０６（ＷＯ，Ａ２）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ １／００～１９／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
野生型と比較して補因子の存在下において増加した凝固活性を有することを特徴とする、第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸ）の変異体であって、該補因子は、第ＶＩＩＩ因子（Ｆ．ＶＩＩＩ）又は活性化第ＶＩＩＩ因子（Ｆ．ＩＩＩａ）であり、
Ｖ１０Ｋ／Ｒ３３８Ｌ／Ｓ３７７Ｗ変異体、
Ｖ１０Ｋ／Ｒ３３８Ｌ／Ｓ３７７Ｗ／Ｌ６Ｆ変異体、
Ｖ１０Ｋ／Ｒ３３８Ｌ／Ｓ３７７Ｗ／Ｅ２４３Ｄ変異体、
Ｖ１０Ｋ／Ｒ３３８Ｌ／Ｓ３７７Ｗ／Ｅ２２４Ｇ変異体、
Ｖ１０Ｋ／Ｒ３３８Ｌ／Ｓ３７７Ｗ／Ｌ６Ｆ／Ｅ２２４Ｇ変異体、
Ｖ１０Ｋ／Ｒ３３８Ｌ／Ｓ３７７Ｗ／Ｅ２４３Ｄ／Ｅ２２４Ｇ変異体、
Ｖ１０Ｋ／Ｒ３３８Ｌ／Ｓ３７７Ｗ／Ｋ２６５Ｔ変異体、
Ｋ５Ａ／Ｒ３３８Ｌ／Ｓ３７７Ｗ変異体、
Ｋ５Ａ／Ｖ１０Ｋ／Ｒ３３８Ｌ／Ｓ３７７Ｗ変異体、
Ｇ４Ｙ／Ｖ８６Ａ／Ｒ３３８Ｌ／Ｓ３７７Ｗ変異体、及び
Ｇ４Ｙ／Ｖ８６Ａ／Ｒ３３８Ｌ／Ｓ３７７Ｗ／Ｋ２６５Ｔ変異体、
から選択される、第ＩＸ因子の変異体。
【請求項2】
Ｖ１０Ｋ／Ｒ３３８Ｌ／Ｓ３７７Ｗ変異体、Ｋ５Ａ／Ｖ１０Ｋ／Ｒ３３８Ｌ／Ｓ３７７Ｗ変異体、及び
Ｇ４Ｙ／Ｖ８６Ａ／Ｒ３３８Ｌ／Ｓ３７７Ｗ変異体、
から選択される、請求項１の第ＩＸ因子の変異体。
【請求項3】
変異体に、さらなる化合物又は部分含む、請求項１又は２の第ＩＸ因子の変異体。
【請求項4】
さらなる化合物又は部分が、変異体に、共有結合的に付着している、請求項３の第ＩＸ因子の変異体。
【請求項5】
さらなる化合物又は部分が、タンパク質、ラベル及び／又はバイオポリマー／ポリマーを含む、請求項４の第ＩＸ因子の変異体。
【請求項6】
請求項５の第ＩＸ因子の変異体をコードする核酸。
【請求項7】
プロモーター及び／又は転写終結配列に作動可能に連結されている、請求項６記載の核酸。
【請求項8】
遺伝子修復のための発現プラスミド、遺伝子療法構築物、ウイルス性ベクター及び非ウイルスベクター又は鋳型である、請求項６又は７記載の核酸。
【請求項9】
請求項１～５のいずれか１項の少なくとも１つの第ＩＸ因子の変異体又は請求項６の少なくとも１つの核酸を含む、医薬組成物。
【請求項10】
さらに、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤を含む、請求項９の医薬組成物。
【請求項11】
疾病の診断、予防及び／又は治療に使用するための、請求項１～５のいずれか１項の第ＩＸ因子の変異体、請求項６～８の核酸、又は請求項９又は１０の医薬組成物。
【請求項12】
出血性疾患又は出血の治療に使用するための、請求項１～５のいずれか１項の第ＩＸ因子の変異体、請求項６～８の核酸、又は請求項９又は１０の医薬組成物。
【請求項13】
出血性疾患が、血友病Ａ、第Ｆ．ＶＩＩＩ因子若しくは第Ｆ．ＶＩＩＩａ因子、血友病Ｂに対する阻害性抗体によって引き起こされたか若しくは合併した血友病であり及び／又は、出血性疾患又は出血が、たとえば、新生児凝固障害、重度の肝疾病；ハイリスクな手術技法；外傷性失血；骨髄移植；血小板減少症及び血小板機能異常症；経口抗凝固療法の迅速な逆転；第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第Ｘ因子及び第ＸＩ因子の先天性欠乏症；並びにフォンヴィルブランド因子に対するインヒビターによるフォンヴィルブランド病、大きな損傷に関連した失血、脳出血、血小板機能異常症を含む、バイパス剤が使用される出血性疾患である、請求項１２の第ＩＸ因子の変異体、核酸、又は医薬組成物。
【請求項14】
細胞療法、遺伝子療法又は送達、タンパク質輸液療法のための、請求項１１～１３の第ＩＸ因子の変異体、核酸、又は医薬組成物。
【請求項15】
遺伝子療法又は遺伝子送達構築物が、ウイルス性又は非ウイルス性ベクターであり、及び／又は、遺伝子療法又は遺伝子送達構築物が、キトサンナノ粒子に製剤化されている、第ＩＸ因子の変異体、核酸、又は医薬組成物を含む遺伝子療法又は遺伝子送達構築物の使用を含む、遺伝子療法又は送達のための、請求項１４の第ＩＸ因子の変異体、核酸、又は医薬組成物。
【請求項16】
遺伝子療法又は遺伝子送達構築物が、ミニサークルベクターである、請求項１５の第ＩＸ因子の変異体、核酸、又は医薬組成物。
【請求項17】
請求項１～５のいずれかの変異第ＩＸ因子の使用を含む、抗凝固剤をスクリーニングするための方法。
【請求項18】
抗凝固剤が、Ｆ．ＩＸａを直接阻害する物質である、請求項１７の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、補因子の非存在下において凝固活性を有することを特徴とする第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸ）又は活性化第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸａ）の変異体に関する。本発明はさらに、第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸ）又は活性化第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸａ）の変異体に関し、ここで、該変異体は、野生型と比較して増加したＦ．ＩＸ凝固活性を有することを特徴とする。本発明はさらに、出血性疾患、特に血友病Ａ及び／若しくは血友病Ｂ、又はＦ．ＶＩＩＩに対する阻害性抗体によって引き起こされたか若しくはこれに合併した血友病の治療及び／又は予防のためのこれらの変異体の使用に関する。本発明はまた、所望の特性を有し、したがって、それぞれの特定の治療適用のためにテーラーメードできる、第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸ）のさらなる変異体にも関する。
【0002】
発明の背景
凝固第ＩＸ因子
血液凝固第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸ）は、凝固カスケードにおいて中心的な役割を果たしている。Ｆ．ＩＸは、一本鎖の不活性なチモーゲンとして血漿中を循環するトリプシン様のビタミンＫ依存性セリンプロテアーゼである（DiScipio et al., 1977; Davie et al., 1991）。第ＩＸ因子は、第ＸＩａ因子又は第ＶＩＩａ因子－組織因子のいずれかによってＣａ２＋依存的に活性化される。活性化には、活性化第ＶＩＩ因子（Ｆ．ＶＩＩａ）－組織因子複合体又は活性化第ＸＩ因子（Ｆ．ＸＩａ）のいずれかによる２つのペプチド結合の開裂により（Fujikawa et al., 1974; Lindquist et al., 1978）、３５残基の活性化ペプチドを除去することが必要である。
凝固第ＩＸ因子
血液凝固第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸ）は、凝固カスケードにおいて中心的な役割を果たしている。Ｆ．ＩＸは、一本鎖の不活性なチモーゲンとして血漿中を循環するトリプシン様のビタミンＫ依存性セリンプロテアーゼである（DiScipio et al., 1977; Davie et al., 1991）。第ＩＸ因子は、第ＸＩａ因子又は第ＶＩＩａ因子－組織因子のいずれかによってＣａ２＋依存的に活性化される。活性化には、活性化第ＶＩＩ因子（Ｆ．ＶＩＩａ）－組織因子複合体又は活性化第ＸＩ因子（Ｆ．ＸＩａ）のいずれかによる２つのペプチド結合の開裂により（Fujikawa et al., 1974; Lindquist et al., 1978）、３５残基の活性化ペプチドを除去することが必要である。
【0003】
Ｆ．ＩＸはマルチドメインタンパク質である。Ｎ末端γ－カルボキシグルタミン酸（ＧＬＡ）ドメインに、２つの上皮成長因子様（ＥＧＦ）反復配列、活性化ペプチド（ＡＰ）、及びトリプシン様の活性部位を含むＣ末端セリンプロテアーゼドメインが続く（DiScipio et al., 1978）。このドメイン構造は、凝固因子のセリンプロテアーゼファミリーを規定し（Furie and Furie, 1988）、これには、第ＩＩ因子（Ｆ．ＩＩ）、第ＶＩＩ因子（Ｆ．ＶＩＩ）、第Ｘ因子（Ｆ．Ｘ）、第ＸＩ因子（Ｆ．ＸＩ）、第ＸＩＩ因子（Ｆ．ＸＩＩ）、及びプロテインＣ（ＰＣ）も含まれる。このファミリー内で、Ｆ．ＩＸａは独特なタンパク質分解特性を有する。リン脂質表面上でのＦ．ＩＸａとＦ．ＶＩＩＩａの複合体の形成は、天然基質であるＦ．Ｘに対する反応性を１０６倍増加させるが（Duffy and Lollar, 1992）、対応するＦ．Ｘ配列を有するペプチドの開裂は実質的に全く観察されなかった（McRae et al., 1981）。
【0004】
Freedman et al.（1996）は、第ＩＸ因子の膜結合部位が、アミノ酸残基１～１１に存することを提唱した。特にロイシン６、フェニルアラニン９、及びバリン１０が、脂質二重層内に埋もれたＦＩＸタンパク質の外面上で疎水性部位を形成することが同定された。
【0005】
Chang et al.（2002）は、Ｆ．ＩＸのＥＧＦ２様ドメイン内の残基１０２～１０８が、Ｆ．Ｘへの適切な結合にとって重要であることを記載している。Wilkinson et al.は、残基８８～１０９（しかしＡｒｇ９４ではない）についても類似した結果を得、リン脂質小胞又は血小板上でのＦ．Ｘ活性化複合体の会合にとってのその重要性を提唱した（Wilkinson et al., 2002-a, Wilkinson et al., 2002-b）。
【0006】
活性化第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸａ）は次いで、カルシウムイオン、膜表面（リン脂質）、及び非酵素的なタンパク質補因子、活性化第ＶＩＩＩ因子（Ｆ．ＶＩＩＩａ）の存在に依存的である反応において、第Ｘ因子（Ｆ．Ｘ）を活性化する（Davie et al., 1991）。
【0007】
止血におけるＦ．ＩＸａの重要性は、Ｆ．ＩＸ遺伝子に突然変異を有する個体における出血性疾患の血友病Ｂの発症によって反映される（Gianelli et al., 1998）。Ｆ．ＩＸａは、その補因子ＦＶＩＩＩａの非存在下では天然基質又は合成基質に対して非常に僅かなタンパク質分解活性しか示さない。Ｆ．ＶＩＩＩａの結合により、Ｆ．Ｘに対するタンパク質分解活性は１０６倍増加するが、一方、ペプチド基質を用いての活性はあまり影響を受けないままである（Duffy and Lollar, 1992; McRae et al., 1981）。Ｆ．ＩＸａモデュレーションの後者の基質依存性活性は、同じように、関連した凝血酵素である活性型ＰＣ（補因子はプロテインＳ）、Ｆ．Ｘａ（補因子は第Ｖａ因子）、Ｆ．ＶＩＩａ（補因子は組織因子）、及びＦＩＩａ（補因子はトロンボモジュリン）にも観察され、これはその補因子の存在下で、その天然基質と共に有意な活性又は特異的な変化を達成する（Mann et al.2003）。全ての凝血セリンプロテアーゼは、広範な構造的及び機能的相同性を共有する。
【0008】
さらに、凝固第ＩＸａ因子（Ｆ．ＩＸａ）及び第Ｘａ因子（Ｆ．Ｘａ）は両方共、リン脂質表面において補因子と共にある場合にのみ効果的に天然基質を開裂する。Hopfner et al.（1997）は、大腸菌において切断短縮されたＦ．ＩＸａ（ｒｆ９ａ）及びＦ．Ｘａ（ｒｆ１０ａ）の変異体を調査して、Ｆ．Ｘａより１０４倍低いＦ．ＩＸａのアミド分解活性の差の決定基を同定した。Ｆ．ＩＸａ及びＦ．Ｘａの結晶構造に基づいて、４つの特徴的な活性部位成分（すなわち、キモトリプシン番号付けに基づいて、Ｇｌｕ２１９、１４８－ループ、Ｉｌｅ２１３、９９－ループ）をその後、ｒｆ９ａとｒｆ１０ａとの間で交換した。さらに、４つ全ての突然変異を組み合わせることにより、本質的にＦ．Ｘａ特性がｒｆ９ａに導入され、すなわちアミド分解活性は、Ｆ．Ｘａ基質選択性と共に１３０倍増加した。
【0009】
酵素的には、Ｆ．ＩＸａは、補因子である第ＶＩＩＩａ因子（Ｆ．ＶＩＩＩａ）の存在下でも向上しないその非常に低いアミド分解活性によって特徴付けられ、この点において、Ｆ．ＩＸａは全ての他の凝固因子と異なっている。Ｆ．ＩＸａ－Ｆ．ＶＩＩＩａ複合体の活性化は、その巨大分子基質である第Ｘ因子（Ｆ．Ｘ）を必要とする。活性部位の近くに位置する９９－ループが、Ｆ．ＩＸａの低い活性の原因の一部であり、なぜならそれは、サブサイトＳ２－Ｓ４においてカノニカルな基質の結合に干渉するコンフォメーションを採っているからである。Sichler et al.（2003）は、残基Ｌｙｓ－９８及びＴｙｒ－９９（キモトリプシン番号付け）が、Ｆ．ＩＸａのアミド分解特性に決定的に連関していることを開示している。Ｔｙｒ－９９をより小さな残基と交換すると、全体的に活性が減少しただけでなく、Ｓ１における結合も損なわれた。Ｌｙｓ－９８をより小さく非荷電の残基と交換すると、活性は増加した。Ｌｙｓ－９８、Ｔｙｒ－１７７及びＴｙｒ－９４の同時突然変異誘発（ｒｆ９－Ｙ９４Ｆ／Ｋ９８Ｔ／Ｙ１７７Ｔ、キモトリプシン番号付け）は、７０００倍増加した活性及び第Ｘａ因子に対して変化した特異性を有する酵素を産生した。Sichler et al.（2003）は、これらの残基が第ＩＸａ因子の低い活性を説明すると結論付けた。Sichler et al.（2003）は、この三重突然変異体のｒｆ９－Ｙ９４Ｆ／Ｋ９８Ｔ／Ｙ１７７Ｔ（キモトリプシン番号付け）がおそらく、補因子及び基質への結合によって生理学的に誘発されるコンフォメーション変化を模倣するのだろうと結論付けた。
【0010】
国際公開公報第２０１０／０１２４５１号は、補因子の非存在下でも凝固活性を有する第ＩＸ因子変異体、及び、出血性疾患を処置するためのその使用を開示する。国際公開公報第２０１０／０１２４５１号では、本発明者らは、特に、突然変異Ｖ１８１Ｉ、Ｋ２６５Ｔ及びＩ３８３Ｖを含有している、工学操作された第ＩＸ因子変異体ＩＴＶが、第ＶＩＩＩ因子を迂回することができ、中和抗体の存在下でＦ．ＶＩＩＩノックアウトマウスの血友病表現型を修正することができることを実証した（Milanov et al., 2012）。
【0011】
血友病
最もよく知られている凝固因子疾患は血友病である。血友病は、生体が血液凝固又は凝血を制御する能力を損なう、遺伝性の遺伝子疾患のファミリー名である。最もよく見られる形態である血友病Ａは、第ＶＩＩＩ因子（Ｆ．ＶＩＩＩ）遺伝子の突然変異によって引き起こされ、これにより、Ｆ．ＶＩＩＩの欠損症が起こる。遺伝は、Ｘ連鎖劣性であり；したがって、男性は発症するが、女性はキャリアであるか又は非常に稀に軽度の表現型を示す。５，０００人中１人の男性が発症する。血友病Ｂは、第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸ）欠損症としても知られ、これは２番目に最もよく見られるタイプの血友病であるが、血友病Ｂは血友病Ａよりもはるかに頻度が少ない。
最もよく知られている凝固因子疾患は血友病である。血友病は、生体が血液凝固又は凝血を制御する能力を損なう、遺伝性の遺伝子疾患のファミリー名である。最もよく見られる形態である血友病Ａは、第ＶＩＩＩ因子（Ｆ．ＶＩＩＩ）遺伝子の突然変異によって引き起こされ、これにより、Ｆ．ＶＩＩＩの欠損症が起こる。遺伝は、Ｘ連鎖劣性であり；したがって、男性は発症するが、女性はキャリアであるか又は非常に稀に軽度の表現型を示す。５，０００人中１人の男性が発症する。血友病Ｂは、第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸ）欠損症としても知られ、これは２番目に最もよく見られるタイプの血友病であるが、血友病Ｂは血友病Ａよりもはるかに頻度が少ない。
【0012】
これらの遺伝子欠損症は、正常な凝固過程に必要とされる凝血因子の血漿中凝固因子レベルを下げる可能性がある。血管が損傷されると、一時的な瘡蓋が形成されるが、欠乏している凝血因子が、血塊を維持するのに必要とされるフィブリンの形成を妨げる。したがって、血友病患者は健常人よりも強くは出血しないが、はるかにより長い時間出血する。重度の血友病患者は、小さな損傷でさえ、何日間、何週間も続くか、又はもう二度と完全には治癒しない失血が生じる可能性がある。ここでの重大なリスクは通常の小さな出血であり、これはＦ．ＶＩＩＩの欠乏により、治癒するのに長い時間がかかる。脳又は関節内などの領域では、これは致命的であるか又は生命を衰弱させ得る。外部損傷による出血は正常であるが、後で起こる再出血及び内出血、特に筋肉、関節への出血、又は閉じた空間への出血の発生率は増加する。主な合併症は、関節血症、出血、消化管出血、及び月経過多を含む。
【0013】
血友病の治癒法はないが、欠損している凝固因子の定期的な点滴、すなわち血友病ＡではＦ．ＶＩＩＩ、又は血友病ＢではＦ．ＩＸを用いて制御することができる。
【0014】
西洋諸国では、血友病の治療の一般的な標準は、２つのカテゴリーの１つに該当する：（ｉ）予防、又は（ｉｉ）オンデマンド。予防は、自発的な出血エピソードを予防するに十分に高い凝固レベルを保持するように、定期的なスケジュールでの凝固因子の点滴を含む。オンデマンド処置は、一旦、出血エピソードが発生したらそれらを処置することを含む。
【0015】
しかしながら、幾人かの血友病患者は、彼らに投与された補充因子に対する抗体（インヒビター）を発達させるので、該因子の量を増加しなければならないか、又は、非ヒト補充製品、例えばブタＦ．ＶＩＩＩ又はその改変変異体を投与しなければならない、例えば、国際公開公報第０１／６８１０９Ａ１号（エモリー大学）を参照。
【0016】
患者が、循環中のインヒビターの結果として補充凝固因子に対して不応性となった場合、これを組換えヒト第ＶＩＩ因子（ノボセブン（登録商標））を用いて克服し得る、欧州特許第１２８２４３８Ｂ１号及び欧州特許第１２８２４３９Ｂ１号（ノボノルディスク社）も参照。このアプローチのこれまでの限界は、それぞれ第ＶＩＩＩ因子（１０～１４時間）又は第ＩＸ因子（１８～３９時間）と比較してそして製剤に応じて、第ＶＩＩａ因子（２～３時間）の短い半減期であり、これが第ＶＩＩａ因子を用いての予防療法を困難としている。さらに、より長い期間におよび第ＶＩＩａ因子のようなすでに活性化されたプロテアーゼを使用するリスクは、血栓リスク、血管内皮の定常的な活性化及び血管傷害を通したリスク、腫瘍の成長又は転移を促進し得る向凝血シグナル伝達のリスクをはじめとする、リスクを有し得る。
【0017】
国際公開公報第０２／４０５４４Ａ２号は、ヘパリンに対する突然変異体ヒトＦ．ＩＸの親和性を野生型Ｆ．ＩＸと比較して減少させる、ヘパリン結合ドメインにおける突然変異を含む突然変異体ヒト第ＩＸ因子、及び、血友病Ｂの治療介入におけるその使用を開示する。
【0018】
遺伝子療法
血友病は、遺伝子療法アプローチに理想的である。なぜなら、必要とされる凝血は血流中を循環しており、それ故、生体中の基本的にどこにでも発現され得るからである。さらに、重度な形態の疾病を患う患者の予防処置を用いての研究は、循環中の凝血因子の１％超の最小限の上昇が、すでに臨床結果を改善し得、そして疾病によって引き起こされる大半の病変、すなわち関節破壊を回避し得ることを実証した。いくつかの遺伝子療法アプローチが開発されたが、試験は依然として初期の臨床段階である。最も有望なアプローチは現在、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）を用いての血友病Ｂの処置のためのものである。
血友病は、遺伝子療法アプローチに理想的である。なぜなら、必要とされる凝血は血流中を循環しており、それ故、生体中の基本的にどこにでも発現され得るからである。さらに、重度な形態の疾病を患う患者の予防処置を用いての研究は、循環中の凝血因子の１％超の最小限の上昇が、すでに臨床結果を改善し得、そして疾病によって引き起こされる大半の病変、すなわち関節破壊を回避し得ることを実証した。いくつかの遺伝子療法アプローチが開発されたが、試験は依然として初期の臨床段階である。最も有望なアプローチは現在、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）を用いての血友病Ｂの処置のためのものである。
【0019】
血友病Ｂを患うヒトの骨格筋へのＡＡＶの筋肉内注射は安全であるが、第ＩＸ因子の治療レベルを達成するにはより高い用量が必要とされる。しかしながら、用量の漸増はこのアプローチでは可能ではない。なぜなら、阻害抗体形成のリスクは、１箇所の注射部位あたりの筋肉中に発現されるＦ．ＩＸ抗原の量に依存するからである。血友病Ｂイヌモデルにおける推定により、ヒトにおいて約１％のＦ．ＩＸ発現レベルを得るには４００回超の筋肉内注射が必要であろうという結論が得られた（Arruda et al., 2004）。それ故、この手順は、ヒトには適用できない。このアプローチの効力は、筋肉細胞外空間におけるＦ．ＩＸの保持によって、及び高い発現率で完全に活性なＦ．ＩＸを合成する筋肉の能力が低いことによって妨げられる。これらの限界を克服するために、Schuettrumpf et al.（2005）は、血友病Ｂマウスにおける筋肉又は肝臓に指向された発現のためのＦ．ＩＸ変異体をコードするＡＡＶベクターを構築した。細胞外マトリックスに対して低い親和性を有する変異体であるＡＡＶ－Ｆ．ＩＸ－Ｋ５Ａ／Ｖ１０Ｋ（Ｆ．ＩＸ番号付け）の筋肉内注射後の循環中のＦ．ＩＸレベルは、野生型（ＷＴ）Ｆ．ＩＸと比較して２～５倍高かったが、一方で、タンパク質特異的活性は同じままであった。Ｆ．ＩＸ－Ｒ３３８Ａの発現は、それぞれ骨格筋又は肝臓にベクターを送達した後、Ｆ．ＩＸ－ＷＴよりも２倍又は６倍高い比活性を有するタンパク質を生成した。Ｆ．ＩＸ－ＷＴ及び変異体形は、テールクリッピングアッセイにより攻撃した場合にインビボにおいて効果的な止血を提供する。重要なことには、ＡＡＶ－Ｆ．ＩＸ変異体の筋肉内注射は、Ｆ．ＩＸ－ＷＴに認容性のあるマウスにおいて、Ｆ．ＩＸに対する抗体の形成を引き起こさなかった。最初にChang et al.（1998）によって記載された、前記Ｒ３３８Ａ変異体の他に、より高いＦ．ＩＸ比活性を有する別の変異体であるＶ８６Ａが記載されている(Chang et al. 2002)。
【0020】
血友病Ｂと比較して血友病Ａへの遺伝子療法戦略の適用は、Ｆ．ＩＸと比較してＦ．ＶＩＩＩのより高い免疫原性及びより大きなサイズによってさらに複雑化される。
【0021】
したがって、当技術分野において、出血性疾患、特に血友病Ａ及び／又はＢの治療及び／又は予防のための改良された手段及び方法を提供する必要がある。
【0022】
したがって、本発明は、先行技術において存在しているような出血性疾患の治療及び／又は予防のための方法及び手段をさらに改良することを目的とし、したがって、本発明の目的は、出血性疾患、特に血友病Ａ及び／又はＢの効果的で、特異的で及び標的化された治療及び／又は予防を可能とするさらに改良された方法及び手段を提供することである。
【0023】
補因子の非存在下で凝固活性を有する第ＩＸ因子の変異タンパク質
本発明によると、この目的は、第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸ）又は活性化第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸａ）の変異体を提供することによって解決され、Ｆ．ＩＸ変異体は、それが補因子の非存在下で凝固活性を有することを特徴とし、該補因子は第ＶＩＩＩ因子（Ｆ．ＶＩＩＩ）又は活性化第ＶＩＩＩ因子（Ｆ．ＶＩＩＩａ）である。
本発明によると、この目的は、第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸ）又は活性化第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸａ）の変異体を提供することによって解決され、Ｆ．ＩＸ変異体は、それが補因子の非存在下で凝固活性を有することを特徴とし、該補因子は第ＶＩＩＩ因子（Ｆ．ＶＩＩＩ）又は活性化第ＶＩＩＩ因子（Ｆ．ＶＩＩＩａ）である。
【0024】
本明細書において使用される用語「変異体」は、好ましくは、天然に存在するタンパク質のアミノ酸の置換、付加（挿入）又は欠失の変異体又は誘導体をいう。変異体はさらに、改変アミノ酸、非天然アミノ酸、又はペプチド骨格／構造を模倣することのできるペプチド模倣体若しくはさらなる化合物を含む、アミノ酸配列を含む。変異体はまた、他の分子の一部による置換若しくはカップリング、又は他の分子とのカップリングを含み得る。
【0025】
アミノ酸置換は、他のアミノ酸による又はアイソスター（タンパク質のアミノ酸に対して構造的及び空間的に近い類似性を有する改変アミノ酸）による保存的並びに非保存的な置換、アミノ酸の付加、又はアイソスターの付加を含む。
【0026】
保存的なアミノ酸置換は、典型的には、同じクラスのアミノ酸間での置換に関する。これらのクラスは、例えば、
－非荷電極性側鎖を有するアミノ酸、例えばアスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン及びチロシン；
－塩基性側鎖を有するアミノ酸、例えばリジン、アルギニン及びヒスチジン；
－酸性側鎖を有するアミノ酸、例えばアスパラギン酸及びグルタミン酸；並びに
－非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン及びシステインを含む。
－非荷電極性側鎖を有するアミノ酸、例えばアスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン及びチロシン；
－塩基性側鎖を有するアミノ酸、例えばリジン、アルギニン及びヒスチジン；
－酸性側鎖を有するアミノ酸、例えばアスパラギン酸及びグルタミン酸；並びに
－非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン及びシステインを含む。
【0027】
本特許出願内の第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸ）は、Kurachi and Davie, 1982によって記載されたヒトＦ．ＩＸのタンパク質及びｃＤＮＡをいう。
ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡについてはRefseq NM_000133（配列番号１）、及び
タンパク質配列についてはRefseq NP_000124（配列番号２）。
配列番号２のアミノ酸配列は、Ｆ．ＩＸのシグナルペプチド及びプロペプチドを含有する。実際の番号付けは、－４６（Ｍｅｔ）から始まり；＋１はＴｙｒである。
ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡについてはRefseq NM_000133（配列番号１）、及び
タンパク質配列についてはRefseq NP_000124（配列番号２）。
配列番号２のアミノ酸配列は、Ｆ．ＩＸのシグナルペプチド及びプロペプチドを含有する。実際の番号付けは、－４６（Ｍｅｔ）から始まり；＋１はＴｙｒである。
【0028】
Ｆ．ＩＸの遺伝子並びにアミノ酸配列においていくつかの天然に生じた多形が存在する。キングス・カレッジ・ロンドンの血友病Ｂ突然変異データベースからのリスト(http://www.kcl.ac.uk/ip/petergreen/haemBdatabase.htmlを参照)を以下に示す。例えば、最も頻度の高い多形は１４７位であり、この位置においてトレオニンが個体群の６７％において、そしてアラニンが３３％において見い出され得る。興味深いことに、あまり頻度の高くないアラニンが、唯一入手できる組換えＦ．ＩＸ治療薬に存在する。
【0029】
【表1】
【0030】
本特許出願内の活性化第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸａ）は、前記したような３５アミノ酸活性化ペプチドの開裂を通して活性化されたＦ．ＩＸ分子をいう。
【0031】
凝固因子Ｆ．ＩＸ及びＦ．ＶＩＩＩは両方共に常に、その機能を示し得る前に活性化されなくてはならないので、Ｆ．ＩＸ／Ｆ．ＩＸａ又はＦ．ＶＩＩＩ／Ｆ．ＶＩＩＩａの両方を同義語として使用することができる。
【0032】
アミノ酸残基の番号付けのために、Ｆ．ＩＸ番号付けシステムが使用される（Kurachi and Davie, 1982による、特記した場合を除く）。当技術分野において幾人かの著者によって、キモトリプシノーゲンの番号付けが、セリンプロテアーゼのキモトリプシンに対して相同性がある特定のアミノ酸の記載に使用されている。本発明では、キモトリプシン番号付けを、本明細書において明示した場合にのみ使用する。
【0033】
Ｆ．ＩＸの「凝固活性」又は「機能的活性」は、Ｆ．ＩＸ比活性ということができ、これは通常、ユニット/mg（Ｕ/mg）で測定される。Ｆ．ＩＸの１ユニット（１Ｕ）は１ミリリットル（ml）の正常なヒト血漿中のＦ．ＩＸの量（これは５０００ngのＦ．ＩＸに相当する）といわれるので、通常の比活性は約２００Ｕ/mgである。Ｆ．ＩＸの比活性は、Ｆ．ＶＩＩＩの存在下における血漿中のプロテアーゼ活性として定義されるので、補因子Ｆ．ＶＩＩＩの非存在下における（凝固）活性についての当技術分野において使用されている定義は存在しない。それ故、Ｆ．ＶＩＩＩの非存在下における凝固活性、これを「Ｆ．ＶＩＩＩ様活性」とも呼ぶが、これは本明細書において等量の野生型Ｆ．ＩＸがＦ．ＶＩＩＩの存在下において示すであろう活性の比率として表現される。
【0034】
したがって、Ｆ．ＩＸ変異体は、それが血液中の凝固性Ｆ．ＶＩＩＩの非存在によって引き起こされた凝血欠損症（これは、疾病の場合においては、Ｆ．ＶＩＩＩタンパク質の非存在、欠陥のあるＦ．ＶＩＩＩタンパク質の存在、又はＦ．ＶＩＩＩタンパク質の阻害、例えば阻害抗体による阻害のいずれかに起因し得る）を修正する場合、補因子の非存在下において「凝固活性」を有する。
【0035】
凝血カスケードのビタミンＫ依存性セリンプロテアーゼの変異体、好ましくはＦ．ＩＸ変異体の「凝固活性」又は「機能的活性」を決定するために本発明において使用されるアッセイシステムは、ａＰＴＴに基づいた一段アッセイである。活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ又はＡＰＴＴ）は、「内因性」凝血経路（現在では接触活性化経路といわれる）及び共通凝血経路の両方の効力を測定する成績指標である。それは、血液凝固における異常の検出とは別に、主要な抗凝血剤であるヘパリンを用いての処置効果をモニタリングするためにも使用される。試料中のＦ．ＶＩＩＩ又はＦ．ＩＸの活性レベルの決定のために、試験は、それぞれＦ．ＶＩＩＩ又はＦ．ＩＸの活性の測定のためにＦ．ＶＩＩＩ又はＦ．ＩＸ欠損血漿中に試料を添加することによって行なわれる。この試験は、Ｆ．ＶＩＩＩ又はＦ．ＩＸの一段アッセイといわれる。現在、Ｆ．ＩＸ変異体のＦ．ＶＩＩＩ非依存性活性を、一段アッセイによって、そしてＦ．ＶＩＩＩ欠損血漿を使用して決定することができる。
【0036】
簡潔には、血液を、カルシウムと結合することによって凝血を抑止するシュウ酸塩又はクエン酸塩を用いて回収する。血漿を、遠心分離によって血液の血球部分から分離する。組換え発現されそして精製されたタンパク質の場合、前記タンパク質をイミダゾール緩衝液中で希釈する。試料を混合し、そして標準化した因子（ＶＩＩＩ又はＩＸ）欠損血漿に加える。内因性経路を活性化するために、リン脂質、アクチベーター（例えばシリカ、セライト、カオリン、エラグ酸）及びカルシウム（シュウ酸塩の抗凝血作用を逆転するため）を血漿試料中に混合する。血栓（血塊）が形成されるまでの時間を測定する。試験は、反応混合物に組織因子が存在しないことに因り「部分」と呼ばれる(Langdell et al., 1953参照)。
【0037】
好ましくは、本発明による第ＩＸ因子変異体は、臨床的に適切な凝固活性（又は臨床的妥当性を有する凝固活性）、すなわち、該変異体を、本明細書において以下に開示したような臨床適用に適したものにさせる凝固活性を有する。
【0038】
臨床的妥当性を有する好ましい凝固活性は、補因子Ｆ．ＶＩＩＩの非存在下において前記変異体の１％以上の凝固活性であり、ここで、１００％は、補因子Ｆ．ＶＩＩＩ又はＦ．ＶＩＩＩａの存在下における野生型Ｆ．ＩＸの活性をいう。
【0039】
約１％を維持した第ＶＩＩＩ因子又は第ＩＸ因子のレベルは、重度の血友病患者における主要な出血性合併症を予防するための予防処置レジメンにおいて十分である。Ｆ．ＶＩＩＩの非存在下において「１％のＦ．ＶＩＩＩ様」活性を有する第ＩＸ因子変異体を用いて、重度の血友病Ａ患者において１％レベルに到達するためには、すでに生理的に存在するＦ．ＩＸに加えて、正常（約５０００ng/ml）の１００％のＦ．ＩＸ変異体レベルが必要となろう。このような処置は実行可能と思われ、それ故、臨床的に適切な「第ＶＩＩＩ因子様」活性は１％と推定される。
【0040】
１つの実施態様において、本発明の変異第ＩＸ因子は、好ましくはアミノ酸の置換、挿入及び／又は欠失による、９９－ループの改変を含む。９９－ループの改変を、隣接するアミノ酸残基か、該アミノ酸残基以外に９９－ループと相互作用する残基のアミノ酸かの置換、挿入及び／又は欠失によりループ構造に影響を及ぼすことによっても達成することができる。
【0041】
第ＩＸ因子の９９－ループ又は挿入ループ８０～９０（キモトリプシノーゲン番号付けによる）は、アミノ酸残基２５６～２６８（Ｆ．ＩＸ番号付け）を包含する。９９－ループは活性部位の近くに位置し、そしてＦ．ＩＸの活性化に役割を果たす。Sichler et al.（2003）によると、Ｔｙｒ－１７７は不活性なコンフォメーションで９９－ループを固定化し、これは生理的複合体において補因子Ｆ．ＶＩＩＩａによって解き放たれる。その後、Ｆ．Ｘは、固定化されていない９９－ループを再編成でき、その後、活性部位溝に結合する。
【0042】
国際公開公報第２０１０／０１２４５１号では、本発明者らは、特に、突然変異Ｖ１８１Ｉ、Ｋ２６５Ｔ及びＩ３８３Ｖを含有している、工学操作された第ＩＸ因子変異体ＩＴＶが、第ＶＩＩＩ因子を迂回することができ、中和抗体の存在下でＦ．ＶＩＩＩノックアウトマウスの血友病表現型を修正することができることを実証した（Milanov et al., 2012）。本発明では、活性の増加に寄与する異なる単一の突然変異を組み合わせることによって、さらなる改変が施されて、その補因子Ｆ．ＶＩＩＩの非存在下でさらにより効果的なＦ．ＩＸ分子を作製する、並びに、その補因子Ｆ．ＶＩＩＩの存在下で増加した比活性を有する強力なＦ．ＩＸ変異体を作製する。
【0043】
本発明は、第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸ）又は活性化第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸａ）の変異体を提供し、ここで、Ｆ．ＩＸ変異体は、それが補因子の非存在下で凝固活性を有することを特徴とし、該補因子は第ＶＩＩＩ因子（Ｆ．ＶＩＩＩ）又は活性化第ＶＩＩＩ因子（Ｆ．ＶＩＩＩａ）である。
【0044】
前記変異第ＩＸ因子又は活性化第ＩＸ因子は、アミノ酸置換Ｖ１８１Ｉ及び／又はＩ３８３Ｖと組み合わせて２６５位に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【0045】
アミノ酸置換Ｖ１８１Ｉ及び／又はＩ３８３Ｖと組み合わせて２６５位にアミノ酸置換を有する変異体（好ましくはＫ２６５Ｔ又はＫ２６５Ａ）は、本明細書において「基本変異第ＩＸ因子」と呼ばれる。
【0046】
好ましくは、本発明による変異第ＩＸ因子は、２５５～２６９、３８３、１８１、６、４４、７２、７５、１０２、１０５、１２２、１８５、２２４、２６３、３３８及び／又は９９－ループの改変の群より選択された位置に少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換を含む。
【0047】
より好ましくは、変異第ＩＸ因子は、Ｋ２６５Ｔ、Ｋ２６５Ａ、Ｉ３８３Ｖ、Ｖ１８１Ｉ、Ｌ６Ｆ、Ｑ４４Ｈ、Ｗ７２Ｒ、Ｆ７５Ｖ、Ｓ１０２Ｎ、Ｓ１０２Ｋ、Ｓ１０２Ｐ、Ｓ１０２Ｒ、Ｓ１０２Ｑ、Ｓ１０２Ｗ、Ｎ１０５Ｓ、Ｋ１２２Ｒ、Ｅ１８５Ｄ、Ｅ１８５Ｓ、Ｅ１８５Ｆ、Ｅ１８５Ｋ、Ｅ１８５Ｐ、Ｅ１８５Ｑ、Ｅ１８５Ｒ、Ｅ２２４Ｇ、Ｅ２４３Ｄ、Ｉ２６３Ｓ、Ｒ３３８Ｅ、Ｔ３７６Ａ、及び／又は９９－ループの改変から選択された少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【0048】
本発明による変異第ＩＸ因子は、アミノ酸置換Ｖ１８１Ｉ及び／又はＩ３８３Ｖと組み合わせて２６５位に少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、
さらに、６、１１、２５、４４、５４、７２、７５、７８、８６、８９、１０２、１０５、１１３、１１９、１２２、１２５、１３５、１３９、１５４、１５９、１８５、１９５、１９６、２１１、２１９、２２２、２２４、２３６、２４３、２５１、２６０、２６２、２６３、２６８、２８９、２９９、３０２、３０４、３１０、３１９、３３０、３３４、３３６、３３８、３６６、３６８、３７６、３８３、３８６、３９１、３９２、３９４、３９９、及び／又は９９－ループの改変、
好ましくは２５５～２６９、３８３、６、４４、７２、７５、１０２、１０５、１２２、１８５、２２４、２６３、３３８、及び／又は９９－ループの改変、
より好ましくは６、１０２及び／又は１８５
の群から選択された位置にアミノ酸置換を含む。
さらに、６、１１、２５、４４、５４、７２、７５、７８、８６、８９、１０２、１０５、１１３、１１９、１２２、１２５、１３５、１３９、１５４、１５９、１８５、１９５、１９６、２１１、２１９、２２２、２２４、２３６、２４３、２５１、２６０、２６２、２６３、２６８、２８９、２９９、３０２、３０４、３１０、３１９、３３０、３３４、３３６、３３８、３６６、３６８、３７６、３８３、３８６、３９１、３９２、３９４、３９９、及び／又は９９－ループの改変、
好ましくは２５５～２６９、３８３、６、４４、７２、７５、１０２、１０５、１２２、１８５、２２４、２６３、３３８、及び／又は９９－ループの改変、
より好ましくは６、１０２及び／又は１８５
の群から選択された位置にアミノ酸置換を含む。
【0049】
好ましい実施態様では、さらなるアミノ酸置換は、Ｌ６Ｆ、Ｑ１１Ｒ、Ｆ２５Ｌ、Ｑ４４Ｈ、Ｎ５４Ｄ、Ｗ７２Ｒ、Ｆ７５Ｖ、Ｅ７８Ｄ、Ｖ８６Ａ、Ｎ８９Ｄ、Ｓ１０２Ｎ、Ｎ１０５Ｓ、Ｅ１１３Ｖ、Ｅ１１９Ｖ、Ｋ１２２Ｒ、Ｅ１２５Ｄ、Ｖ１３５Ａ、Ｑ１３９Ｅ、Ｄ１５４Ｎ、Ｔ１５９Ｓ、Ｅ１８５Ｄ、Ｑ１９５Ｌ、Ｖ１９６Ｉ、Ｖ２１１Ｉ、Ａ２１９Ｖ、Ｃ２２２Ｙ、Ｅ２２４Ｇ、Ｉ２６３Ｓ、Ｈ２３６Ｌ、Ｅ２４３Ｄ、Ｉ２５１Ｖ、Ｎ２６０Ｋ、Ａ２６２Ｄ、Ｉ２６３Ｓ、Ｈ２６８Ｄ、Ｈ２６８Ｒ、Ｃ２８９Ｒ、Ｆ２９９Ｔ、Ｆ３０２Ｙ、Ｓ３０４Ｆ、Ｇ３１０Ｒ、Ｋ３１９Ｒ、Ｌ３３０Ｉ、Ａ３３４Ｓ、Ｒ３３８Ｅ、Ｌ３３６Ｈ、Ｇ３６６Ｒ、Ｐ３６８Ｓ、Ｐ３６８Ｉ、Ｔ３７６Ａ、Ｉ３８３Ａ、Ｔ３８６Ａ、Ｍ３９１Ｋ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３９４Ｒ、Ｔ３９９Ｓ、及び／又は９９－ループの改変、
好ましくは、Ｌ６Ｆ、Ｑ４４Ｈ、Ｗ７２Ｒ、Ｆ７５Ｖ、Ｓ１０２Ｎ、Ｓ１０２Ｋ、Ｓ１０２Ｐ、Ｓ１０２Ｒ、Ｓ１０２Ｑ、Ｓ１０２Ｗ、Ｎ１０５Ｓ、Ｋ１２２Ｒ、Ｅ１８５Ｄ、Ｅ１８５Ｓ、Ｅ１８５Ｆ、Ｅ１８５Ｋ、Ｅ１８５Ｐ、Ｅ１８５Ｑ、Ｅ１８５Ｒ、Ｅ２２４Ｇ、Ｅ２４３Ｄ、Ｉ２６３Ｓ、Ｒ３３８Ｅ、Ｔ３７６Ａ、及び／又は９９－ループの改変、
より好ましくはＬ６Ｆ、Ｓ１０２Ｎ及び／又はＥ１８５Ｄ
の群から選択される。
好ましくは、Ｌ６Ｆ、Ｑ４４Ｈ、Ｗ７２Ｒ、Ｆ７５Ｖ、Ｓ１０２Ｎ、Ｓ１０２Ｋ、Ｓ１０２Ｐ、Ｓ１０２Ｒ、Ｓ１０２Ｑ、Ｓ１０２Ｗ、Ｎ１０５Ｓ、Ｋ１２２Ｒ、Ｅ１８５Ｄ、Ｅ１８５Ｓ、Ｅ１８５Ｆ、Ｅ１８５Ｋ、Ｅ１８５Ｐ、Ｅ１８５Ｑ、Ｅ１８５Ｒ、Ｅ２２４Ｇ、Ｅ２４３Ｄ、Ｉ２６３Ｓ、Ｒ３３８Ｅ、Ｔ３７６Ａ、及び／又は９９－ループの改変、
より好ましくはＬ６Ｆ、Ｓ１０２Ｎ及び／又はＥ１８５Ｄ
の群から選択される。
【0050】
好ましい実施態様では、変異第ＩＸ因子は、さらなるアミノ酸置換と組み合わせて、好ましくはＫ２６５Ｔ、Ｋ２６５Ａ、Ｋ２６５Ｄ、Ｋ２６５Ｅ、Ｋ２６５Ｆ、Ｋ２６５Ｇ、Ｋ２６５Ｈ、Ｋ２６５Ｉ、Ｋ２６５Ｎ、Ｋ２６５Ｓ及びＫ２６５Ｖから、より好ましくはＫ２６５Ｔ、Ｋ２６５Ａから選択された、２６５位（キモトリプシノーゲンの番号付けによると９８位）にアミノ酸置換を含む。
【0051】
好ましい実施態様では、前記の基本変異第ＩＸ因子は、以下の群の少なくとも１つのアミノ酸置換を含む：
グループＡ
－補因子Ｆ．ＶＩＩＩの非存在下における凝固活性
（Ｆ．ＶＩＩＩ非依存性活性）
野生型と比較して増加
グループＢ
－補因子Ｆ．ＶＩＩＩの非存在下における凝固活性
Ｆ．ＶＩＩＩ非依存性凝固活性は、基本変異体のそれぞれの凝固活性と比較して増加している
グループＡ
－補因子Ｆ．ＶＩＩＩの非存在下における凝固活性
（Ｆ．ＶＩＩＩ非依存性活性）
野生型と比較して増加
グループＢ
－補因子Ｆ．ＶＩＩＩの非存在下における凝固活性
Ｆ．ＶＩＩＩ非依存性凝固活性は、基本変異体のそれぞれの凝固活性と比較して増加している
【0052】
【表2】
【0053】
２６５位のアミノ酸の置換は、好ましくは、Ｋ２６５Ｔ、Ｋ２６５Ａ、Ｋ２６５Ｄ、Ｋ２６５Ｅ、Ｋ２６５Ｆ、Ｋ２６５Ｇ、Ｋ２６５Ｈ、Ｋ２６５Ｉ、Ｋ２６５Ｎ、Ｋ２６５Ｓ及びＫ２６５Ｖ、好ましくはＫ２６５Ｔ、Ｋ２６５Ａから選択される。
【0054】
好ましい実施態様では、さらなるアミノ酸置換は、６位、１０２位、及び１８５位から、
好ましくは、Ｌ６Ｆ、Ｓ１０２Ｎ、Ｓ１０２Ｋ、Ｓ１０２Ｐ、Ｓ１０２Ｒ、Ｓ１０２Ｑ、Ｓ１０２Ｗ、Ｅ１８５Ｄ、Ｅ１８５Ｓ、Ｅ１８５Ｆ、Ｅ１８５Ｋ、Ｅ１８５Ｐ、Ｅ１８５Ｑ、Ｅ１８５Ｒから選択され、
１つの実施態様では、２６５位のアミノ酸置換は、Ｋ２６５Ｔ又はＫ２６５Ａである。
好ましくは、Ｌ６Ｆ、Ｓ１０２Ｎ、Ｓ１０２Ｋ、Ｓ１０２Ｐ、Ｓ１０２Ｒ、Ｓ１０２Ｑ、Ｓ１０２Ｗ、Ｅ１８５Ｄ、Ｅ１８５Ｓ、Ｅ１８５Ｆ、Ｅ１８５Ｋ、Ｅ１８５Ｐ、Ｅ１８５Ｑ、Ｅ１８５Ｒから選択され、
１つの実施態様では、２６５位のアミノ酸置換は、Ｋ２６５Ｔ又はＫ２６５Ａである。
【0055】
本発明による変異第ＩＸ因子は、好ましくは、
Ｖ１８１Ｉ／Ｋ２６５Ｔ／Ｉ３８３Ｖ／Ｌ６Ｆ変異体、
Ｖ１８１Ｉ／Ｋ２６５Ｔ／Ｉ３８３Ｖ／Ｓ１０２Ｎ変異体、
Ｖ１８１Ｉ／Ｋ２６５Ｔ／Ｉ３８３Ｖ／Ｅ１８５Ｄ変異体、
Ｖ１８１Ｉ／Ｋ２６５Ｔ／Ｉ３８３Ｖ／Ｅ１８５Ｓ変異体、
Ｖ１８１Ｉ／Ｋ２６５Ｔ／Ｉ３８３Ｖ／Ｌ６Ｆ／Ｓ１０２Ｎ変異体、
Ｖ１８１Ｉ／Ｋ２６５Ｔ／Ｉ３８３Ｖ／Ｌ６Ｆ／Ｓ１０２Ｋ変異体、
Ｖ１８１Ｉ／Ｋ２６５Ｔ／Ｉ３８３Ｖ／Ｓ１０２Ｎ／Ｅ１８５Ｄ変異体、及び
Ｖ１８１Ｉ／Ｋ２６５Ｔ／Ｉ３８３Ｖ／Ｓ１０２Ｎ／Ｅ１８５Ｓ変異体
から選択される。
Ｖ１８１Ｉ／Ｋ２６５Ｔ／Ｉ３８３Ｖ／Ｌ６Ｆ変異体、
Ｖ１８１Ｉ／Ｋ２６５Ｔ／Ｉ３８３Ｖ／Ｓ１０２Ｎ変異体、
Ｖ１８１Ｉ／Ｋ２６５Ｔ／Ｉ３８３Ｖ／Ｅ１８５Ｄ変異体、
Ｖ１８１Ｉ／Ｋ２６５Ｔ／Ｉ３８３Ｖ／Ｅ１８５Ｓ変異体、
Ｖ１８１Ｉ／Ｋ２６５Ｔ／Ｉ３８３Ｖ／Ｌ６Ｆ／Ｓ１０２Ｎ変異体、
Ｖ１８１Ｉ／Ｋ２６５Ｔ／Ｉ３８３Ｖ／Ｌ６Ｆ／Ｓ１０２Ｋ変異体、
Ｖ１８１Ｉ／Ｋ２６５Ｔ／Ｉ３８３Ｖ／Ｓ１０２Ｎ／Ｅ１８５Ｄ変異体、及び
Ｖ１８１Ｉ／Ｋ２６５Ｔ／Ｉ３８３Ｖ／Ｓ１０２Ｎ／Ｅ１８５Ｓ変異体
から選択される。
【0056】
本発明による変異第ＩＸ因子は、好ましくは、
Ｖ１８１Ｉ／Ｋ２６５Ａ／Ｉ３８３Ｖ／Ｌ６Ｆ変異体、
Ｖ１８１Ｉ／Ｋ２６５Ａ／Ｉ３８３Ｖ／Ｓ１０２Ｎ変異体、
Ｖ１８１Ｉ／Ｋ２６５Ａ／Ｉ３８３Ｖ／Ｅ１８５Ｄ変異体、
Ｖ１８１Ｉ／Ｋ２６５Ａ／Ｉ３８３Ｖ／Ｅ１８５Ｓ変異体、
Ｖ１８１Ｉ／Ｋ２６５Ａ／Ｉ３８３Ｖ／Ｌ６Ｆ／Ｓ１０２Ｎ変異体、
Ｖ１８１Ｉ／Ｋ２６５Ａ／Ｉ３８３Ｖ／Ｌ６Ｆ／Ｓ１０２Ｋ変異体、
Ｖ１８１Ｉ／Ｋ２６５Ａ／Ｉ３８３Ｖ／Ｓ１０２Ｎ／Ｅ１８５Ｄ変異体、及び
Ｖ１８１Ｉ／Ｋ２６５Ａ／Ｉ３８３Ｖ／Ｓ１０２Ｎ／Ｅ１８５Ｓ変異体
から選択される。
Ｖ１８１Ｉ／Ｋ２６５Ａ／Ｉ３８３Ｖ／Ｌ６Ｆ変異体、
Ｖ１８１Ｉ／Ｋ２６５Ａ／Ｉ３８３Ｖ／Ｓ１０２Ｎ変異体、
Ｖ１８１Ｉ／Ｋ２６５Ａ／Ｉ３８３Ｖ／Ｅ１８５Ｄ変異体、
Ｖ１８１Ｉ／Ｋ２６５Ａ／Ｉ３８３Ｖ／Ｅ１８５Ｓ変異体、
Ｖ１８１Ｉ／Ｋ２６５Ａ／Ｉ３８３Ｖ／Ｌ６Ｆ／Ｓ１０２Ｎ変異体、
Ｖ１８１Ｉ／Ｋ２６５Ａ／Ｉ３８３Ｖ／Ｌ６Ｆ／Ｓ１０２Ｋ変異体、
Ｖ１８１Ｉ／Ｋ２６５Ａ／Ｉ３８３Ｖ／Ｓ１０２Ｎ／Ｅ１８５Ｄ変異体、及び
Ｖ１８１Ｉ／Ｋ２６５Ａ／Ｉ３８３Ｖ／Ｓ１０２Ｎ／Ｅ１８５Ｓ変異体
から選択される。
【0057】
より好ましくは、本発明による変異第ＩＸ因子は、
Ｖ１８１Ｉ／Ｋ２６５Ａ／Ｉ３８３Ｖ／Ｌ６Ｆ変異体、及び
Ｖ１８１Ｉ／Ｋ２６５Ａ／Ｉ３８３Ｖ／Ｅ１８５Ｄ変異体
から選択される。
Ｖ１８１Ｉ／Ｋ２６５Ａ／Ｉ３８３Ｖ／Ｌ６Ｆ変異体、及び
Ｖ１８１Ｉ／Ｋ２６５Ａ／Ｉ３８３Ｖ／Ｅ１８５Ｄ変異体
から選択される。
【0058】
増加したＦ．ＩＸ凝固活性を有する第ＩＸ因子の変異タンパク質
本発明によると、この目的は、第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸ）又は活性化第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸａ）の変異体を提供することによって解決され、ここで、Ｆ．ＩＸ変異体は、それが野生型と比較してその補因子の存在下で増加した凝固活性を有することを特徴とし、ここで、該補因子は、第ＶＩＩＩ因子（Ｆ．ＶＩＩＩ）又は活性化第ＶＩＩＩ因子（Ｆ．ＶＩＩＩａ）である。
本発明によると、この目的は、第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸ）又は活性化第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸａ）の変異体を提供することによって解決され、ここで、Ｆ．ＩＸ変異体は、それが野生型と比較してその補因子の存在下で増加した凝固活性を有することを特徴とし、ここで、該補因子は、第ＶＩＩＩ因子（Ｆ．ＶＩＩＩ）又は活性化第ＶＩＩＩ因子（Ｆ．ＶＩＩＩａ）である。
【0059】
「その補因子の存在下において増加した凝固活性」という用語はまた、本明細書において「高機能Ｆ．ＩＸ活性」と呼ばれる。
【0060】
本発明による変異第ＩＸ因子は、好ましくは、５、６、１０、１１、４４、７２、７５、７８、１０２、１０５、１２２、１３５、１５９、１８５、１８６、２１１、２２４、２４３、２６２、２６３、２６８、３２７、３３８、３６７、３６８、３７６、３８３、３９４の群から選択された位置にアミノ酸置換を含み、
好ましくは、Ｋ５Ａ、Ｋ５Ｆ、Ｌ６Ｆ、Ｖ１０Ｋ、Ｖ１０Ｆ、Ｖ１０Ｒ、Ｑ１１Ｒ、Ｑ１１Ｈ、Ｑ１１Ｋ、Ｑ４４Ｈ、Ｗ７２Ｒ、Ｆ７５Ｖ、Ｅ７８Ｄ、Ｓ１０２Ｎ、Ｎ１０５Ｓ、Ｋ１２２Ｒ、Ｖ１３５Ａ、Ｔ１５９Ｓ、Ｅ１８５Ｄ、Ｄ１８６Ｅ、Ｖ２１１Ｉ、Ｅ２２４Ｇ、Ｅ２４３Ｄ、Ａ２６２Ｄ、Ｉ２６３Ｓ、Ｈ２６８Ｒ、Ｒ３２７Ｓ、Ｎ３６７Ｄ、Ｐ３６８Ｉ、Ｔ３７６Ａ、Ｉ３８３Ａ、Ｋ３９４Ｒ、
より好ましくはＫ５Ａ、Ｌ６Ｆ、Ｑ１１Ｒ、Ｑ４４Ｈ、Ｗ７２Ｒ、Ｆ７５Ｖ、Ｅ７８Ｄ、Ｓ１０２Ｎ、Ｎ１０５Ｓ、Ｋ１２２Ｒ、Ｅ１８５Ｄ、Ｄ１８６Ｅ、Ｖ２１１Ｉ、Ｅ２２４Ｇ、Ｅ２４３Ｄ、Ｉ２６３Ｓ、Ｔ３７６Ａ、Ｋ３９４Ｒ
の少なくとも１つと組み合わせて、アミノ酸置換Ｒ３３８Ｌ又はＲ３３８Ｅを含む。
好ましくは、Ｋ５Ａ、Ｋ５Ｆ、Ｌ６Ｆ、Ｖ１０Ｋ、Ｖ１０Ｆ、Ｖ１０Ｒ、Ｑ１１Ｒ、Ｑ１１Ｈ、Ｑ１１Ｋ、Ｑ４４Ｈ、Ｗ７２Ｒ、Ｆ７５Ｖ、Ｅ７８Ｄ、Ｓ１０２Ｎ、Ｎ１０５Ｓ、Ｋ１２２Ｒ、Ｖ１３５Ａ、Ｔ１５９Ｓ、Ｅ１８５Ｄ、Ｄ１８６Ｅ、Ｖ２１１Ｉ、Ｅ２２４Ｇ、Ｅ２４３Ｄ、Ａ２６２Ｄ、Ｉ２６３Ｓ、Ｈ２６８Ｒ、Ｒ３２７Ｓ、Ｎ３６７Ｄ、Ｐ３６８Ｉ、Ｔ３７６Ａ、Ｉ３８３Ａ、Ｋ３９４Ｒ、
より好ましくはＫ５Ａ、Ｌ６Ｆ、Ｑ１１Ｒ、Ｑ４４Ｈ、Ｗ７２Ｒ、Ｆ７５Ｖ、Ｅ７８Ｄ、Ｓ１０２Ｎ、Ｎ１０５Ｓ、Ｋ１２２Ｒ、Ｅ１８５Ｄ、Ｄ１８６Ｅ、Ｖ２１１Ｉ、Ｅ２２４Ｇ、Ｅ２４３Ｄ、Ｉ２６３Ｓ、Ｔ３７６Ａ、Ｋ３９４Ｒ
の少なくとも１つと組み合わせて、アミノ酸置換Ｒ３３８Ｌ又はＲ３３８Ｅを含む。
【0061】
好ましくは、本発明による変異第ＩＸ因子は、５、６、１０、１１、４４、７２、７５、１０２、１０５、１２２、１８５、２２４、２４３、２６３、３３８、３７６の群より選択された位置に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【0062】
本発明は、第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸ）又は活性化第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸａ）の変異体を提供し、ここで、Ｆ．ＩＸ変異体は、それが野生型と比較してその補因子の存在下で増加した凝固活性を有することを特徴とし、ここで、該補因子は第ＶＩＩＩ因子（Ｆ．ＶＩＩＩ）又は活性化第ＶＩＩＩ因子（Ｆ．ＶＩＩＩａ）である。
【0063】
前記の変異第ＩＸ因子又は活性化第ＩＸ因子は、３７７位のアミノ酸置換（好ましくはＳ３７７Ｗ）と組み合わせて、３３８位に少なくとも１つのアミノ酸置換（好ましくはＲ３３８Ｌ又はＲ３３８Ｅ）を含む。
【0064】
好ましい実施態様では、３７７位のアミノ酸置換（好ましくはＳ３７７Ｗ）と組み合わせて、３３８位にアミノ酸置換を含む前記変異第第ＩＸ因子（好ましくはＲ３３８Ｌ又はＲ３３８Ｅ）は、以下の群の少なくとも１つのアミノ酸置換を含む：
グループＤ
－補因子Ｆ．ＶＩＩＩの存在下で増加した凝固活性
（Ｆ．ＶＩＩＩ依存性活性）
野生型と比較して増加
グループＤ
－補因子Ｆ．ＶＩＩＩの存在下で増加した凝固活性
（Ｆ．ＶＩＩＩ依存性活性）
野生型と比較して増加
【0065】
【表3】
【0066】
本発明は、野生型と比較してその補因子の存在下で増加した凝固活性を有することを特徴とする、第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸ）変異体を提供し、
該補因子は第ＶＩＩＩ因子（Ｆ．ＶＩＩＩ）又は活性化第ＶＩＩＩ因子（Ｆ．ＶＩＩＩａ）であり、
該変異第ＩＸ因子又は活性化第ＩＸ因子は、４、５、６、１０、１１、４４、７２、７５、７８、１０２、１０５、１２２、１３５、１５９、１８５、１８６、２１１、２２４、２４３、２６２、２６３、２６５、２６８、３２７、３６７、３６８、３７６、３７７、３８３、３９４、
好ましくは４、５、６、１０、１１、４４、７２、７５、１０２、１０５、１２２、１８５、２２４、２４３、２６３、２６５、３７６、３７７、
より好ましくは３７７、１０、４、５及び／又は２６５
の群から選択された位置のアミノ酸置換と組み合わせて、３３８位にアミノ酸置換を含む。
該補因子は第ＶＩＩＩ因子（Ｆ．ＶＩＩＩ）又は活性化第ＶＩＩＩ因子（Ｆ．ＶＩＩＩａ）であり、
該変異第ＩＸ因子又は活性化第ＩＸ因子は、４、５、６、１０、１１、４４、７２、７５、７８、１０２、１０５、１２２、１３５、１５９、１８５、１８６、２１１、２２４、２４３、２６２、２６３、２６５、２６８、３２７、３６７、３６８、３７６、３７７、３８３、３９４、
好ましくは４、５、６、１０、１１、４４、７２、７５、１０２、１０５、１２２、１８５、２２４、２４３、２６３、２６５、３７６、３７７、
より好ましくは３７７、１０、４、５及び／又は２６５
の群から選択された位置のアミノ酸置換と組み合わせて、３３８位にアミノ酸置換を含む。
【0067】
好ましい実施態様では、さらなるアミノ酸置換は、Ｇ４Ｙ、Ｋ５Ａ、Ｋ５Ｆ、Ｌ６Ｆ、Ｖ１０Ｋ、Ｖ１０Ｆ、Ｖ１０Ｒ、Ｑ１１Ｒ、Ｑ１１Ｈ、Ｑ１１Ｋ、Ｑ４４Ｈ、Ｗ７２Ｒ、Ｆ７５Ｖ、Ｅ７８Ｄ、Ｓ１０２Ｎ、Ｎ１０５Ｓ、Ｋ１２２Ｒ、Ｖ１３５Ａ、Ｔ１５９Ｓ、Ｅ１８５Ｄ、Ｄ１８６Ｅ、Ｖ２１１Ｉ、Ｅ２２４Ｇ、Ｅ２４３Ｄ、Ａ２６２Ｄ、Ｉ２６３Ｓ、Ｋ２６５Ｔ、Ｈ２６８Ｒ、Ｒ３２７Ｓ、Ｎ３６７Ｄ、Ｐ３６８Ｉ、Ｔ３７６Ａ、Ｓ３７７Ｗ、Ｉ３８３Ａ、Ｋ３９４Ｒ、
好ましくはＫ５Ａ、Ｌ６Ｆ、Ｑ１１Ｒ、Ｑ４４Ｈ、Ｗ７２Ｒ、Ｆ７５Ｖ、Ｅ７８Ｄ、Ｓ１０２Ｎ、Ｎ１０５Ｓ、Ｋ１２２Ｒ、Ｅ１８５Ｄ、Ｄ１８６Ｅ、Ｖ２１１Ｉ、Ｅ２２４Ｇ、Ｅ２４３Ｄ、Ｉ２６３Ｓ、Ｋ２６５Ｔ、Ｔ３７６Ａ、Ｓ３７７Ｗ、Ｋ３９４Ｒ、
より好ましくはＳ３７７Ｗ、Ｖ１０Ｋ、Ｇ４Ｙ、Ｋ５Ａ及び／又はＫ２６５Ｔ
の群から選択される。
好ましくはＫ５Ａ、Ｌ６Ｆ、Ｑ１１Ｒ、Ｑ４４Ｈ、Ｗ７２Ｒ、Ｆ７５Ｖ、Ｅ７８Ｄ、Ｓ１０２Ｎ、Ｎ１０５Ｓ、Ｋ１２２Ｒ、Ｅ１８５Ｄ、Ｄ１８６Ｅ、Ｖ２１１Ｉ、Ｅ２２４Ｇ、Ｅ２４３Ｄ、Ｉ２６３Ｓ、Ｋ２６５Ｔ、Ｔ３７６Ａ、Ｓ３７７Ｗ、Ｋ３９４Ｒ、
より好ましくはＳ３７７Ｗ、Ｖ１０Ｋ、Ｇ４Ｙ、Ｋ５Ａ及び／又はＫ２６５Ｔ
の群から選択される。
【0068】
好ましい実施態様では、変異第ＩＸ因子は、
５位のアミノ酸置換、
１０位のアミノ酸置換、及び／又は
３７７位のアミノ酸置換
と組み合わせて、３３８位にアミノ酸置換を含む。
５位のアミノ酸置換、
１０位のアミノ酸置換、及び／又は
３７７位のアミノ酸置換
と組み合わせて、３３８位にアミノ酸置換を含む。
【0069】
好ましくは、３３８位のアミノ酸置換は、Ｒ３３８Ｌ又はＲ３３８Ｅであり、
５位のアミノ酸置換はＫ５Ａであり、
１０位のアミノ酸置換はＶ１０Ｋであり、
及び／又は３７７位のアミノ酸置換はＳ３７７Ｗである。
５位のアミノ酸置換はＫ５Ａであり、
１０位のアミノ酸置換はＶ１０Ｋであり、
及び／又は３７７位のアミノ酸置換はＳ３７７Ｗである。
【0070】
本発明による変異第ＩＸ因子は、好ましくは、
Ｖ１０Ｋ／Ｒ３３８Ｌ変異体、
Ｒ３３８Ｌ／Ｓ３７７Ｗ変異体、
Ｖ１０Ｋ／Ｒ３３８Ｌ／Ｓ３７７Ｗ変異体、
Ｖ１０Ｋ／Ｒ３３８Ｌ／Ｓ３７７Ｗ／Ｌ６Ｆ変異体、
Ｖ１０Ｋ／Ｒ３３８Ｌ／Ｓ３７７Ｗ／Ｅ２４３Ｄ変異体、
Ｖ１０Ｋ／Ｒ３３８Ｌ／Ｓ３７７Ｗ／Ｅ２２４Ｇ変異体、
Ｖ１０Ｋ／Ｒ３３８Ｌ／Ｓ３７７Ｗ／Ｌ６Ｆ／Ｅ２２４Ｇ変異体、
Ｖ１０Ｋ／Ｒ３３８Ｌ／Ｓ３７７Ｗ／Ｅ２４３Ｄ／Ｅ２２４Ｇ変異体、
Ｖ１０Ｋ／Ｒ３３８Ｌ／Ｓ３７７Ｗ／Ｋ２６５Ｔ変異体、
Ｋ５Ａ／Ｒ３３８Ｌ変異体、
Ｋ５Ａ／Ｒ３３８Ｌ／Ｓ３７７Ｗ変異体、
Ｋ５Ａ／Ｖ１０Ｋ／Ｒ３３８Ｌ／Ｓ３７７Ｗ変異体、
Ｇ４Ｙ／Ｖ８６Ａ／Ｒ３３８Ｌ／Ｓ３７７Ｗ変異体、及び
Ｇ４Ｙ／Ｖ８６Ａ／Ｒ３３８Ｌ／Ｓ３７７Ｗ／Ｋ２６５Ｔ変異体
から選択される。
Ｖ１０Ｋ／Ｒ３３８Ｌ変異体、
Ｒ３３８Ｌ／Ｓ３７７Ｗ変異体、
Ｖ１０Ｋ／Ｒ３３８Ｌ／Ｓ３７７Ｗ変異体、
Ｖ１０Ｋ／Ｒ３３８Ｌ／Ｓ３７７Ｗ／Ｌ６Ｆ変異体、
Ｖ１０Ｋ／Ｒ３３８Ｌ／Ｓ３７７Ｗ／Ｅ２４３Ｄ変異体、
Ｖ１０Ｋ／Ｒ３３８Ｌ／Ｓ３７７Ｗ／Ｅ２２４Ｇ変異体、
Ｖ１０Ｋ／Ｒ３３８Ｌ／Ｓ３７７Ｗ／Ｌ６Ｆ／Ｅ２２４Ｇ変異体、
Ｖ１０Ｋ／Ｒ３３８Ｌ／Ｓ３７７Ｗ／Ｅ２４３Ｄ／Ｅ２２４Ｇ変異体、
Ｖ１０Ｋ／Ｒ３３８Ｌ／Ｓ３７７Ｗ／Ｋ２６５Ｔ変異体、
Ｋ５Ａ／Ｒ３３８Ｌ変異体、
Ｋ５Ａ／Ｒ３３８Ｌ／Ｓ３７７Ｗ変異体、
Ｋ５Ａ／Ｖ１０Ｋ／Ｒ３３８Ｌ／Ｓ３７７Ｗ変異体、
Ｇ４Ｙ／Ｖ８６Ａ／Ｒ３３８Ｌ／Ｓ３７７Ｗ変異体、及び
Ｇ４Ｙ／Ｖ８６Ａ／Ｒ３３８Ｌ／Ｓ３７７Ｗ／Ｋ２６５Ｔ変異体
から選択される。
【0071】
免責事項：
本発明は、本発明者らの国際公開公報第２０１０／０１２４５１号のこれより以前の出願にすでに開示されている変異第ＩＸ因子を包含しない。特に、本発明は、以下を包含しない：
－単一変異体：Ｒ３３８Ａ、Ｓ３７７Ｗ、Ｇ４Ｙ、Ｖ８６Ａ、Ｋ２６５Ｔ、Ｋ２６５Ａ、
－Ｇ４Ｙ／Ｖ１０Ｋ変異体、
－Ｓ３４０Ｔ／Ｒ３３８Ａ／Ｙ３４５Ｔ変異体、
－Ｒ３３８Ａ／Ｓ３７７Ｗ変異体、
－Ｓ３６０Ａ／Ｒ３３８Ａ／Ｓ３７７Ｗ変異体、
－Ｖ８６Ａ／Ｒ３３８Ａ／Ｓ３７７Ｗ変異体、
－Ｇ４Ｙ／Ｒ３３８Ａ／Ｓ３７７Ｗ変異体、
－Ｒ３３８Ａ／Ｋ２６５Ｔ変異体、
－Ｋ２６５Ｔ／Ｒ３３８Ａ／Ｉ３８３Ｖ変異体、
－Ｙ２５９Ｆ／Ｋ２６５Ｔ／Ｒ３３８Ａ／Ｔ３４０Ｓ／Ｙ３４５Ｔ変異体、
－Ｖ１８１Ｉ、Ｋ２６５Ｔ／Ｉ３８３Ｖ変異体、
－Ｖ１８１Ｉ／Ｋ２６５Ｔ／Ｒ３３８Ａ／Ｓ３７７Ｗ／Ｉ３８３Ｖ変異体。
本発明は、本発明者らの国際公開公報第２０１０／０１２４５１号のこれより以前の出願にすでに開示されている変異第ＩＸ因子を包含しない。特に、本発明は、以下を包含しない：
－単一変異体：Ｒ３３８Ａ、Ｓ３７７Ｗ、Ｇ４Ｙ、Ｖ８６Ａ、Ｋ２６５Ｔ、Ｋ２６５Ａ、
－Ｇ４Ｙ／Ｖ１０Ｋ変異体、
－Ｓ３４０Ｔ／Ｒ３３８Ａ／Ｙ３４５Ｔ変異体、
－Ｒ３３８Ａ／Ｓ３７７Ｗ変異体、
－Ｓ３６０Ａ／Ｒ３３８Ａ／Ｓ３７７Ｗ変異体、
－Ｖ８６Ａ／Ｒ３３８Ａ／Ｓ３７７Ｗ変異体、
－Ｇ４Ｙ／Ｒ３３８Ａ／Ｓ３７７Ｗ変異体、
－Ｒ３３８Ａ／Ｋ２６５Ｔ変異体、
－Ｋ２６５Ｔ／Ｒ３３８Ａ／Ｉ３８３Ｖ変異体、
－Ｙ２５９Ｆ／Ｋ２６５Ｔ／Ｒ３３８Ａ／Ｔ３４０Ｓ／Ｙ３４５Ｔ変異体、
－Ｖ１８１Ｉ、Ｋ２６５Ｔ／Ｉ３８３Ｖ変異体、
－Ｖ１８１Ｉ／Ｋ２６５Ｔ／Ｒ３３８Ａ／Ｓ３７７Ｗ／Ｉ３８３Ｖ変異体。
【0072】
さらに、本発明は、Chang et al., 1998、国際公開公報第９９／０３４９６Ａ１号、米国特許第２００８／１６７２１９Ａ１号、Chang et al., 2002若しくはKao et al., 2013に開示されているか、又はQuade-Lyssy et al., 2012に論評されているような、以下の変異体を包含しない：
－単一変異体：Ｋ５Ａ、Ｖ１０Ｋ、Ｖ８６Ａ、Ｅ２７７Ａ、Ｒ３３８Ａ、Ｒ３３８Ｌ、
－単一変異体：Ｓ１０２Ａ、Ｅ１１３Ａ、Ｋ１２２Ａ、Ｎ１０５Ａ、
－Ｋ５Ａ／Ｖ１０Ｋ変異体、
－Ｖ８６Ａ／Ｅ２７７Ａ変異体、
－Ｅ２７７Ａ／Ｒ３３８Ａ変異体、
－Ｖ８６Ａ／Ｅ２７７Ａ／Ｒ３３８Ａ変異体、
－Ｖ８６Ａ／Ｅ２７７Ａ／Ｒ３３８Ｌ変異体、
－Ｙ２５９Ｆ／Ｋ２６５Ｔ／Ｙ３４５Ｔ変異体。
－単一変異体：Ｋ５Ａ、Ｖ１０Ｋ、Ｖ８６Ａ、Ｅ２７７Ａ、Ｒ３３８Ａ、Ｒ３３８Ｌ、
－単一変異体：Ｓ１０２Ａ、Ｅ１１３Ａ、Ｋ１２２Ａ、Ｎ１０５Ａ、
－Ｋ５Ａ／Ｖ１０Ｋ変異体、
－Ｖ８６Ａ／Ｅ２７７Ａ変異体、
－Ｅ２７７Ａ／Ｒ３３８Ａ変異体、
－Ｖ８６Ａ／Ｅ２７７Ａ／Ｒ３３８Ａ変異体、
－Ｖ８６Ａ／Ｅ２７７Ａ／Ｒ３３８Ｌ変異体、
－Ｙ２５９Ｆ／Ｋ２６５Ｔ／Ｙ３４５Ｔ変異体。
【0073】
－コンジュゲート
好ましい実施態様では、本発明による第ＩＸ因子変異体は、該変異体に好ましくは共有結合的に付着した、さらなる化合物又は部分を含む（コンジュゲート）。
好ましい実施態様では、本発明による第ＩＸ因子変異体は、該変異体に好ましくは共有結合的に付着した、さらなる化合物又は部分を含む（コンジュゲート）。
【0074】
好ましくは、さらなる化合物又は部分は、
－タンパク質、例えばアルブミン、
－ラベル、例えば発色団、フルオロフォア、アイソトープ、
及び／又は
－バイオポリマー／ポリマー、例えばキトサン、ＰＥＧ
から選択される。
－タンパク質、例えばアルブミン、
－ラベル、例えば発色団、フルオロフォア、アイソトープ、
及び／又は
－バイオポリマー／ポリマー、例えばキトサン、ＰＥＧ
から選択される。
【0075】
１つの実施態様では、キトサン－コンジュゲートは、遺伝子療法に、例えばＦ．ＩＸ変異体の経口遺伝子送達に適している。
【0076】
Ｆ．ＩＸ変異体の核酸及び医薬組成物
本発明によると、上記の目的はさらに、本発明による変異第ＩＸ因子をコードする核酸を提供することによって解決される。
本発明によると、上記の目的はさらに、本発明による変異第ＩＸ因子をコードする核酸を提供することによって解決される。
【0077】
「核酸」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びその誘導体をいい、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡは改変したヌクレオチド／ヌクレオシドを含む。
【0078】
好ましくは、核酸は、プロモーター及び／又は転写終結配列に作動可能に連結されている。好ましいプロモーター及び／又は転写終結配列は、ヒトα１抗トリプシンプロモーター、肝遺伝子座制御領域１、或いはサイトメガロウイルスプロモーター、及びヒト若しくはウシ成長ホルモン又はシミアンウイルス４０に由来するポリアデニル化シグナルである。当業者は適切なプロモーター及び／又は転写終結配列を選択することができる。核酸は、例えばコードされたタンパク質を核酸から得ることができるように、核酸の転写／翻訳が、好ましくは細胞においてそれぞれのプロモーター／転写終結配列によって、及び細胞性転写／翻訳機械によって制御されている場合に、プロモーター及び／又は転写終結配列に「作動可能に連結」されている。
【0079】
好ましくは、核酸は、発現プラスミド、遺伝子療法構築物若しくは遺伝子送達構築物、遺伝子導入ベクターにコードされる配列、ＤＮＡ改変若しくは修復のために使用される遺伝子配列、又は類似物である。
【0080】
好ましい遺伝子療法構築物又は遺伝子送達構築物は、ウイルス性ベクター及び非ウイルスベクター、例えばアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、プラスミドベクター、又は例えばSchuettrumpf et al., 2005及びMilanov et al., 2012に記載のようなミニサークルベクター、又はキトサンナノ粒子である。
【0081】
好ましい遺伝子療法構築物又は遺伝子送達構築物は、ミニサークルベクター、例えば肝臓に指向されるプロモーター又はＣＭＶプロモーターの制御下にあるミニサークルベクターである。
【0082】
例えば、インビボでの発現のために、本発明による変異Ｆ．ＩＸをコードする核酸（例えばＦ．ＩＸ発現カセット）を、ミニサークル産生プラスミド、例えばｐＭＣ．ＢＥＳＰＸ－ＭＣＳ２（System Biosciences）に導入し、例えば強力な肝臓特異的エンハンサー／プロモーターＨＣＲ／ｈＡＡＴ（肝遺伝子座制御領域１／ヒトα－１－抗トリプシン）又はＣＭＶプロモーターによって制御する。このようなミニサークルベクターは、キトサンナノ粒子に封入されると、注射によって、非経口的に、又は経口で投与され得る。詳細については実施例１を参照されたい。
【0083】
好ましい遺伝子療法構築物又は遺伝子送達構築物は、経口遺伝子療法に特に適し、かつ当技術分野において記載されている、キトサンナノ粒子である。Mao et al., 2001又はBowman & Leong, 2006を参照されたい。ナノ粒子は、キトサンと核酸、好ましくはＤＮＡを含有する。
【0084】
キチンの部分的脱アセチル化から得られる無毒性で生分解性の多糖であるキトサンを、Bowman & Leong, 2006に論評されている、強力な経口での薬物及び遺伝子の送達システムとしてのナノ粒子を形成するために使用することができる。ナノ粒子は、陰イオン性ＤＮＡと、封入されたＤＮＡを消化から保護し、かつ腸の経細胞透過性及び傍細胞透過性並びにその粘膜付着性を改善することによって腸への取り込みを増強させる陽イオン性キトサンとの間の、静電的相互作用を通して形成される。詳細については、実施例２を参照されたい。
【0085】
本発明によると、前記目的はさらに、本発明の少なくとも１つの第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸ）変異体又は本発明の少なくとも１つの核酸と、場合により薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤とを含む、医薬組成物を提供することによって解決される。
【0086】
適切な薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤は、当技術分野において公知である。当業者は、医薬組成物の目的とする適用、例えば処置しようとする疾患、処置しようとする患者、処置レジメンなどに応じて、好ましい薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤を選択するだろう。
【0087】
医学用途
本発明によると、前記目的は、疾病の診断、予防及び／又は治療のために、本発明において開示したような、第ＩＸ因子変異体、又はそれらをコードする核酸、又は本発明の医薬組成物を提供することによってさらに解決される。
本発明によると、前記目的は、疾病の診断、予防及び／又は治療のために、本発明において開示したような、第ＩＸ因子変異体、又はそれらをコードする核酸、又は本発明の医薬組成物を提供することによってさらに解決される。
【0088】
診断、予防及び又は処置しようとする疾病は、好ましくは、出血性疾患又は出血である。
【0089】
「出血性疾患」は、好ましくは血友病Ａ及び／又は血友病Ｂ、第ＶＩＩＩ因子に対する阻害抗体によって、第ＶＩＩＩ因子若しくは第ＩＸ因子の欠損によって、又は非機能的第ＶＩＩＩ因子若しくは第ＩＸタンパク質の存在によって引き起こされたか若しくは併発した血友病、あるいは任意の他の出血又は出血傾向である。
【0090】
好ましくは、出血性疾患は血友病Ａ、第Ｆ．ＶＩＩＩ因子又は第Ｆ．ＶＩＩＩａ因子に対する阻害抗体によって引き起こされたか又は併発した血友病、血友病Ｂである。
【0091】
好ましくは、出血性疾患又は出血は、例えば、新生児凝固障害；重度の肝疾病；ハイリスクな手術技法；外傷性失血；骨髄移植；血小板減少症及び血小板機能異常症；経口抗凝血療法の迅速な逆転；第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第Ｘ因子及び第ＸＩ因子の先天性欠損症；並びにフォンヴィルブランド因子に対するインヒビターによるフォンヴィルブランド病、大きな損傷に関連した失血、脳出血、血小板機能異常症を含む、バイパス剤が使用される出血性疾患である。
【0092】
好ましくは、本発明の第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸ）変異体、核酸又は医薬組成物は、出血性疾患若しくは出血のタンパク質輸液療法、細胞療法、遺伝子送達若しくは遺伝子療法、及び／又は予防のために使用される。
【0093】
１つの実施態様では、遺伝子療法又は遺伝子送達は、第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸ）変異体、核酸、又は医薬組成物を含む、遺伝子療法構築物又は遺伝子送達構築物の使用を含む。
【0094】
好ましい遺伝子療法構築物又は遺伝子送達構築物は、ウイルス性ベクター及び非ウイルスベクター、例えばアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、プラスミドベクター、又は例えばSchuettrumpf et al., 2005及びMilanov et al., 2012に記載のようなミニサークルベクター、又はキトサンナノ粒子である。
【0095】
このようなミニサークルベクターは、注射によって、非経口で、又は経口で投与され得る。
【0096】
本発明の変異体は、タンパク質の投与、又は細胞若しくは遺伝子の治療薬の投与（ウイルス、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は他のベクター）を使用して、出血性疾患を患う患者を処置するのに適したツールである。処置のための疾病は、出血の処置のため及び予防治療のためのＦＶＩＩＩに対する阻害抗体によってまた引き起こされたか又は合併した血友病Ａ及びＢである。
【0097】
本発明者らは、本発明の変異体が、
－Ｆ．ＶＩＩＩの非存在下でトロンビンの生成を用量依存的に向上させ、Ｆ．ＶＩＩＩの存在下においても野生型Ｆ．ＩＸと比較してあまり変わらない効果を示し、
－Ｆ．ＶＩＩＩの存在下及び非存在下においてＦ．Ｘの活性化を向上させ、
－Ｆ．ＶＩＩＩに対する阻害抗体の存在下で凝固時間を修正し（Ｆ．ＶＩＩＩインヒビターの存在下でも試験したＦ．ＩＸ変異体の機能を確認）、
－事前に活性化されないが、チモーゲン様であり、
－インビボで凝固を修正し、出血を止める（Ｆ．ＩＸ変異体が、インビボにおいて止血活性のある治療薬として働くことができる最初の証拠である）
ことを実証した。さらなる詳細については、実施例６～８及び図１～７を参照されたい。
－Ｆ．ＶＩＩＩの非存在下でトロンビンの生成を用量依存的に向上させ、Ｆ．ＶＩＩＩの存在下においても野生型Ｆ．ＩＸと比較してあまり変わらない効果を示し、
－Ｆ．ＶＩＩＩの存在下及び非存在下においてＦ．Ｘの活性化を向上させ、
－Ｆ．ＶＩＩＩに対する阻害抗体の存在下で凝固時間を修正し（Ｆ．ＶＩＩＩインヒビターの存在下でも試験したＦ．ＩＸ変異体の機能を確認）、
－事前に活性化されないが、チモーゲン様であり、
－インビボで凝固を修正し、出血を止める（Ｆ．ＩＸ変異体が、インビボにおいて止血活性のある治療薬として働くことができる最初の証拠である）
ことを実証した。さらなる詳細については、実施例６～８及び図１～７を参照されたい。
【0098】
スクリーニング法
本発明によると、前記目的はさらに、抗凝固化合物（抗凝固剤）、好ましくはＦ．ＩＸａを直接阻害する物質のスクリーニング法を提供することによって解決される。
本発明によると、前記目的はさらに、抗凝固化合物（抗凝固剤）、好ましくはＦ．ＩＸａを直接阻害する物質のスクリーニング法を提供することによって解決される。
【0099】
このような方法は、本明細書において定義されているような、本発明の少なくとも１つの変異第ＩＸ因子の使用を含む。
【0100】
このような方法において、テナーゼ複合体のさらなる成分は全く必要とされない（ここで、「テナーゼ」は活性型の血液凝固因子の第ＶＩＩＩ因子（Ｆ．ＶＩＩＩａ）と第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸａ）との複合体をいう。それは、リン脂質表面上でカルシウムの存在下において形成し、そして第Ｘ因子の活性化に関与する）。
【0101】
記載した変異体の有益な態様は、Ｆ．ＶＩＩＩａ、並びにＦ．Ｘ開裂及び発色基質開裂の両方に向けてのより高い活性の必要性を伴わず、該変異体は、診断試験システムにおいて、又は、抗凝血剤として昔から望まれていたが、テナーゼ複合体での会合を伴わないとＦ．ＩＸａの効力が低いために効果的なスクリーニングが不可能であった直接的なＦ．ＩＸａ阻害物質のための開発及びスクリーニングのために適したツールであることである。
【0102】
本発明によるスクリーニング法は、好ましくは、本発明の変異第ＩＸ因子に結合し、そして／又はその活性をモデュレーションする化合物を同定するための方法であり、好ましくは以下のステップを含む：
－試験しようとする化合物／物質を提供し、
－本発明の少なくとも１つの変異第ＩＸ因子を提供し、
－試験しようとする化合物／物質を、本発明の少なくとも１つの変異第ＩＸ因子と接触させ、
－該化合物／物質が、少なくとも１つの変異第ＩＸ因子に結合するかどうかを決定し、
－場合により、該化合物／物質が、少なくとも１つの変異第ＩＸ因子の活性をモデュレーションするかどうかを決定する。
－試験しようとする化合物／物質を提供し、
－本発明の少なくとも１つの変異第ＩＸ因子を提供し、
－試験しようとする化合物／物質を、本発明の少なくとも１つの変異第ＩＸ因子と接触させ、
－該化合物／物質が、少なくとも１つの変異第ＩＸ因子に結合するかどうかを決定し、
－場合により、該化合物／物質が、少なくとも１つの変異第ＩＸ因子の活性をモデュレーションするかどうかを決定する。
【0103】
以下の実施例及び図面は本発明を説明するものであるが、しかしながらそれを制限するものではない。
【図面の簡単な説明】
【0104】
【図1A】Ｆ．ＶＩＩＩ欠損血漿中におけるＦ．ＩＸ変異体ＩＴＶのトロンビン生成アッセイ（ＲＤ １：２０）。トロンビン生成開始までの時間。
【図1B】Ｆ．ＶＩＩＩ欠損血漿中におけるＦ．ＩＸ変異体ＩＴＶのトロンビン生成アッセイ（ＲＤ １：２０）。ピーク時のトロンビン。
【図1C】Ｆ．ＶＩＩＩ欠損血漿中におけるＦ．ＩＸ変異体ＩＴＶのトロンビン生成アッセイ（ＲＤ １：２０）。速度指数。
【図1D】Ｆ．ＶＩＩＩ欠損血漿中におけるＦ．ＩＸ変異体ＩＴＶのトロンビン生成アッセイ（ＲＤ １：２０）。ＡＵＣ。
【図1E】Ｆ．ＶＩＩＩ欠損血漿中におけるＦ．ＩＸ変異体ＩＴＶのトロンビン生成アッセイ（ＲＤ １：２０）。代表的なグラフ。
【図2A】Ｆ．ＶＩＩＩ欠損血漿中におけるＦ．ＩＸ変異体ＩＴＶのトロンビン生成アッセイ（ＲＤ １：２０）。トロンビン生成開始までの時間。
【図2B】Ｆ．ＶＩＩＩ欠損血漿中におけるＦ．ＩＸ変異体ＩＴＶのトロンビン生成アッセイ（ＲＤ １：２０）。ピーク時のトロンビン。
【図2C】Ｆ．ＶＩＩＩ欠損血漿中におけるＦ．ＩＸ変異体ＩＴＶのトロンビン生成アッセイ（ＲＤ １：２０）。速度指数。
【図2D】Ｆ．ＶＩＩＩ欠損血漿中におけるＦ．ＩＸ変異体ＩＴＶのトロンビン生成アッセイ（ＲＤ １：２０）。ＡＵＣ。
【図2E】Ｆ．ＶＩＩＩ欠損血漿中におけるＦ．ＩＸ変異体ＩＴＶのトロンビン生成アッセイ（ＲＤ １：２０）。代表的なグラフ。
【図3A】Ｆ．ＶＩＩＩ欠損血漿中におけるＦ．ＶＩＩＩ非依存的活性を有するＦ．ＩＸ変異体のトロンビン生成アッセイ（ＲＤ １：２０）。トロンビン生成開始までの時間。
【図3B】Ｆ．ＶＩＩＩ欠損血漿中におけるＦ．ＶＩＩＩ非依存的活性を有するＦ．ＩＸ変異体のトロンビン生成アッセイ（ＲＤ １：２０）。ピーク時のトロンビン。
【図3C】Ｆ．ＶＩＩＩ欠損血漿中におけるＦ．ＶＩＩＩ非依存的活性を有するＦ．ＩＸ変異体のトロンビン生成アッセイ（ＲＤ １：２０）。速度指数。
【図3D】Ｆ．ＶＩＩＩ欠損血漿中におけるＦ．ＶＩＩＩ非依存的活性を有するＦ．ＩＸ変異体のトロンビン生成アッセイ（ＲＤ １：２０）。ＡＵＣ。
【図3E】Ｆ．ＶＩＩＩ欠損血漿中におけるＦ．ＶＩＩＩ非依存的活性を有するＦ．ＩＸ変異体のトロンビン生成アッセイ（ＲＤ １：２０）。代表的なグラフ。
【図4A】Ｆ．ＩＸ欠損血漿中におけるＦ．ＶＩＩＩ非依存的活性を有するＦ．ＩＸ変異体のトロンビン生成アッセイ（ＲＤ １：１００）。トロンビン生成開始までの時間。
【図4B】Ｆ．ＩＸ欠損血漿中におけるＦ．ＶＩＩＩ非依存的活性を有するＦ．ＩＸ変異体のトロンビン生成アッセイ（ＲＤ １：１００）。ピーク時のトロンビン。
【図4C】Ｆ．ＩＸ欠損血漿中におけるＦ．ＶＩＩＩ非依存的活性を有するＦ．ＩＸ変異体のトロンビン生成アッセイ（ＲＤ １：１００）。速度指数。
【図4D】Ｆ．ＩＸ欠損血漿中におけるＦ．ＶＩＩＩ非依存的活性を有するＦ．ＩＸ変異体のトロンビン生成アッセイ（ＲＤ １：１００）。ＡＵＣ。
【図4E】Ｆ．ＩＸ欠損血漿中におけるＦ．ＶＩＩＩ非依存的活性を有するＦ．ＩＸ変異体のトロンビン生成アッセイ（ＲＤ １：１００）。代表的なグラフ。
【図5A】Ｆ．ＩＸ欠損血漿中における高機能Ｆ．ＩＸ活性を有するＦ．ＩＸ変異体のトロンビン生成アッセイ（ＲＤ １：１００）。トロンビン生成開始までの時間。
【図5B】Ｆ．ＩＸ欠損血漿中における高機能Ｆ．ＩＸ活性を有するＦ．ＩＸ変異体のトロンビン生成アッセイ（ＲＤ １：１００）。ピーク時のトロンビン。
【図5C】Ｆ．ＩＸ欠損血漿中における高機能Ｆ．ＩＸ活性を有するＦ．ＩＸ変異体のトロンビン生成アッセイ（ＲＤ １：１００）。速度指数。
【図5D】Ｆ．ＩＸ欠損血漿中における高機能Ｆ．ＩＸ活性を有するＦ．ＩＸ変異体のトロンビン生成アッセイ（ＲＤ １：１００）。ＡＵＣ。
【図5E】Ｆ．ＩＸ欠損血漿中における高機能Ｆ．ＩＸ活性を有するＦ．ＩＸ変異体のトロンビン生成アッセイ（ＲＤ １：１００）。代表的なグラフ。
【図6A】Ｆ．ＶＩＩＩの存在下におけるＦＩＸ変異体ＩＴＶによるＦ．Ｘの活性化。
【図6B】Ｆ．ＶＩＩＩの非存在下におけるＦＩＸ変異体ＩＴＶによるＦ．Ｘの活性化。
【図6C】Ｆ．ＶＩＩＩの存在下におけるＦ．ＶＩＩＩ非依存性活性を有するＦＩＸ変異体によるＦ．Ｘの活性化。
【図6D】Ｆ．ＶＩＩＩの非存在下におけるＦ．ＶＩＩＩ非依存性活性を有するＦＩＸ変異体によるＦ．Ｘの活性化。
【図6E】Ｆ．ＶＩＩＩの存在下における高機能Ｆ．ＩＸ活性を有するＦＩＸ変異体によるＦ．Ｘの活性化。
【図7A】Ｆ．ＩＸ変異体のインビトロでの効力。ＦＶＩＩＩ中和抗体の存在下におけるＦ．ＩＸ変異体の凝固活性。
【図7B】Ｆ．ＩＸ変異体のインビトロでの効力。Ｆ．ＩＸ変異体の活性化状態。
【図8A】Ｆ．ＶＩＩＩ非依存性活性を有するＦ．ＩＸ変異体のインビボでの効力。ＦＶＩＩＩ非依存性活性を有するＦ．ＩＸ変異体の発現後の、Ｆ．ＶＩＩＩ欠損マウスにおける凝固時間。
【図8B】Ｆ．ＶＩＩＩ非依存性活性を有するＦ．ＩＸ変異体のインビボでの効力。ＦＶＩＩＩ非依存性活性を有するＦ．ＩＸ変異体の発現後の、Ｆ．ＶＩＩＩ欠損マウスの表現型修正。
【図9】ＦＩＸ－ＷＴ（ｎ＝７）、ＦＩＸ－ＦＩＡＶ（ｎ＝７）及びＦＩＸ－ＩＤＡＶ（ｎ＝７）をコードする肝臓に指向されるミニサークルベクター ２５μgの水力学的注射後の、Ｆ．ＶＩＩＩノックアウトマウスにおける、ＦＶＩＩＩ非依存性活性を有するＦＩＸ変異体のインビボでの効力。対照群は、野生型マウス（ｎ＝７）及びナイーブマウス（ｎ＝６）を含む。それぞれヒトＦ．ＩＸ欠損血漿又はＦ．ＶＩＩＩ欠損血漿において１段階の凝固アッセイによって測定されたＦ．ＩＸ活性（Ａ）及びＦ．ＶＩＩＩ非依存性活性（Ｂ）を、注射から３日後に分析した。（Ｃ）屠殺から１０分後に１．５mm直径で尾を切断した後の失血。（Ｄ）凝血亢進症のマーカーとしてのＴＡＴレベル。平均値±ＳＥＭが示されている。野生型ＦＩＸ群との多重比較のためのホルム－シダック検定を使用した分散分析によると＊ｐ＜０．０５及び＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図10】ＨＢマウスへのキトサン－ＤＮＡナノ粒子の経口投与後のインビボでのトランスフェクション効力。（Ａ）タイムスケジュール。（Ｂ）１用量の製剤化されていない及びキトサンで製剤化されたｅＧＦＰの経口投与後の小腸におけるレポーター遺伝子ＧＦＰの免疫染色。ＧＦＰ染色は、肝臓、脾臓及び大腸において検出不可能なままであった。（Ｃ）１回量の経口投与後の小腸へのキトサンで製剤化されたＦＩＸ－ＷＴ又は高機能ＦＩＸムテインの送達。（Ｄ）処置から７２時間後の定量ＲＴ－ＰＣＲによって決定された１回の摂食後の組織におけるｍＲＮＡ発現。データは平均値±標準偏差を示す、ｎ＝３／群。
【図11】キトサン－ＤＮＡナノ粒子の経口投与後の小腸における機能的ＦＩＸタンパク質の発現。（Ａ）摂食及び血液採取のためのタイムスケジュール。（Ｂ）ＦＩＸ変異体を含有するキトサンで製剤化されたｐｃＤＮＡ３．１ベクターの経口送達。バーは平均値±ＳＥＭを示す、ｎ＝５／群。（Ｃ）コラーゲンＩＶ結合部位に欠陥を有するＦＩＸムテインを含有する、キトサンで製剤化されたミニサークルの経口送達。平均値±ＳＥＭが示されている、ｎ＝５～６／群。キトサン群／偽群との多重比較のためのダネット検定を使用した分散分析によると＊ｐ＜０．０５。
【図12】キトサンで製剤化されたＦＩＸムテインの送達後のＨＢマウスの表現型の修正。（Ａ）タイムスケジュール。（Ｂ）ＦＩＸ－ＷＴ（ｎ＝７）、ＦＩＸ－ＫＬＷ（ｎ＝８）及びＦＩＸ－ＡＫＬＷ（ｎ＝７）をコードしている製剤化されたベクターの経口投与後の１．５mm直径で尾を切断した後のテールクリップ実験。対照群は、野生型マウス（ｎ＝６）及びナイーブＨＢマウス（ｎ＝７）を含む。（Ｃ）１段階ａＰＴＴによって測定された凝固時間、及び（Ｄ）凝血亢進症のマーカーとしてのＴＡＴレベル。平均値±ＳＥＭが示されている。ＨＢ群との多重比較のためのダネット検定を使用した分散分析によると＊＊ｐ＜０．０１。
【0105】
実施例
実施例１
材料及び方法
非ウイルス性ベクター
プラスミドｐｃＤＮＡ（商標）３．１（インビトロジェン社、カールスバッド、ＣＡ、米国）は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター／エンハンサーの制御下にある１．４kbのイントロンＡのフラグメントとウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルとを含むヒトＦＩＸミニ遺伝子を含有していた（Schuettrumpf et al., 2005）。インビボでの発現のために、ヒトＦＩＸ発現カセットをミニサークル産生プラスミドｐＭＣ．ＢＥＳＰＸ－ＭＣＳ２（System Biosciences）に導入し、強力な肝臓特異的エンハンサー／プロモーターＨＣＲ／ｈＡＡＴ（肝遺伝子座制御領域１／ヒトα－１－抗トリプシン）によって制御された。ヌクレオチド置換を、クイックチェンジＩＩ ＸＬ－部位特異的突然変異誘発キット（Agilent technologies）を使用してｈＦＩＸ ｃＤＮＡに導入し、配列決定によって確認した。
実施例１
材料及び方法
非ウイルス性ベクター
プラスミドｐｃＤＮＡ（商標）３．１（インビトロジェン社、カールスバッド、ＣＡ、米国）は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター／エンハンサーの制御下にある１．４kbのイントロンＡのフラグメントとウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルとを含むヒトＦＩＸミニ遺伝子を含有していた（Schuettrumpf et al., 2005）。インビボでの発現のために、ヒトＦＩＸ発現カセットをミニサークル産生プラスミドｐＭＣ．ＢＥＳＰＸ－ＭＣＳ２（System Biosciences）に導入し、強力な肝臓特異的エンハンサー／プロモーターＨＣＲ／ｈＡＡＴ（肝遺伝子座制御領域１／ヒトα－１－抗トリプシン）によって制御された。ヌクレオチド置換を、クイックチェンジＩＩ ＸＬ－部位特異的突然変異誘発キット（Agilent technologies）を使用してｈＦＩＸ ｃＤＮＡに導入し、配列決定によって確認した。
【0106】
ＦＩＸムテインについてのランダムなスクリーニング
ランダムな突然変異を、製造業者によって記載されているようにGeneMorph II EZClone Domain Mutagenesisキット（Agilent technologies）によってＶ１８１Ｉ、Ｋ２６５Ｔ及びＩ３８３Ｖの置換（ＦＩＸ－ＩＴＶと命名；Milanov et al., 2012）をすでに有しているｐｃＤＮＡ（商標）３．１のｈＦＩＸ発現カセットに導入した。メガプライマー合成は、１．２kbのフラグメントを増幅するｈＦＩＸ ｃＤＮＡのエキソン２～８にかけての
正方向5’ TCTGAATCGGCCAAAGAGG ‘3［配列番号３］プライマー、及び
逆方向5’ CAGTTGACATACCGGGATACC ’3［配列番号４］プライマー
を使用して行なわれた。標的ＤＮＡの初期量を７５０ngに設定して、１kbあたり２．７の突然変異頻度を得た。プラスミドＤＮＡを、QIAprep 96 Turbo Miniprepキット（キアゲン社）を使用して各々の個々の形質転換された大腸菌コロニー（総数：１６００）から抽出した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、９６ウェルプレートでリポフェクション（リポフェクタミン；インビトロジェン社）によって、ＦＩＸ－ＷＴ、ＦＩＸ－ＩＴＶ、又は個々の変異体をコードするプラスミドＤＮＡ ２．５μgを用いてトランスフェクトし、最初の細胞密度は５×１０４個の細胞／ウェルであった。１０μg/mlのビタミンＫの補充されたＯｐｔｉＭｅｍ培地中におけるタンパク質の発現は４８時間かけて行なわれた。各々の変異体の回収された上清を、それぞれＦＶＩＩＩの存在下及び非存在下において、市販の発色アッセイ（Biophen Faktor IX; Hyphen BioMed）を僅かに改変したものを使用してＦＩＸバイパス活性及びＦＶＩＩＩバイパス活性についてアッセイした。正常なヒト血漿（対照血漿Ｎ；シーメンス社）を標準曲線のために使用し、工学操作された変異体ＦＩＸ－ＩＴＶを、活性レベルの比較のための参照基準として使用した。有望な変異体／クローンを配列決定して、活性の増加に関与する具体的なアミノ酸の置換を同定した。
ランダムな突然変異を、製造業者によって記載されているようにGeneMorph II EZClone Domain Mutagenesisキット（Agilent technologies）によってＶ１８１Ｉ、Ｋ２６５Ｔ及びＩ３８３Ｖの置換（ＦＩＸ－ＩＴＶと命名；Milanov et al., 2012）をすでに有しているｐｃＤＮＡ（商標）３．１のｈＦＩＸ発現カセットに導入した。メガプライマー合成は、１．２kbのフラグメントを増幅するｈＦＩＸ ｃＤＮＡのエキソン２～８にかけての
正方向5’ TCTGAATCGGCCAAAGAGG ‘3［配列番号３］プライマー、及び
逆方向5’ CAGTTGACATACCGGGATACC ’3［配列番号４］プライマー
を使用して行なわれた。標的ＤＮＡの初期量を７５０ngに設定して、１kbあたり２．７の突然変異頻度を得た。プラスミドＤＮＡを、QIAprep 96 Turbo Miniprepキット（キアゲン社）を使用して各々の個々の形質転換された大腸菌コロニー（総数：１６００）から抽出した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、９６ウェルプレートでリポフェクション（リポフェクタミン；インビトロジェン社）によって、ＦＩＸ－ＷＴ、ＦＩＸ－ＩＴＶ、又は個々の変異体をコードするプラスミドＤＮＡ ２．５μgを用いてトランスフェクトし、最初の細胞密度は５×１０４個の細胞／ウェルであった。１０μg/mlのビタミンＫの補充されたＯｐｔｉＭｅｍ培地中におけるタンパク質の発現は４８時間かけて行なわれた。各々の変異体の回収された上清を、それぞれＦＶＩＩＩの存在下及び非存在下において、市販の発色アッセイ（Biophen Faktor IX; Hyphen BioMed）を僅かに改変したものを使用してＦＩＸバイパス活性及びＦＶＩＩＩバイパス活性についてアッセイした。正常なヒト血漿（対照血漿Ｎ；シーメンス社）を標準曲線のために使用し、工学操作された変異体ＦＩＸ－ＩＴＶを、活性レベルの比較のための参照基準として使用した。有望な変異体／クローンを配列決定して、活性の増加に関与する具体的なアミノ酸の置換を同定した。
【0107】
組換えタンパク質の産生
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン及び１％Ｌ－グルタミンの補充されたＤＭＥＭ中で培養し、トランスフェクションの２４時間前に、１×１０６個の細胞／ウェルの初期細胞密度で６ウェルプレートに播種した。一過性の発現のために、細胞に、リン酸カルシウムにより媒介される沈降法を使用して、ＣＭＶ－ｈＦＩＸ ｐｃＤＮＡ（商標）３．１プラスミド １５μgを用いてトランスフェクトした。タンパク質の発現は、１０μg/mlのビタミンＫを含むが、血清及び抗生物質不含Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ中で行なわれた。トランスフェクションから２４時間後に上清を回収し、ＦＩＸ活性、ＥＬＩＳＡ、動的パラメーター、及びトロンビン生成についてアッセイした。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン及び１％Ｌ－グルタミンの補充されたＤＭＥＭ中で培養し、トランスフェクションの２４時間前に、１×１０６個の細胞／ウェルの初期細胞密度で６ウェルプレートに播種した。一過性の発現のために、細胞に、リン酸カルシウムにより媒介される沈降法を使用して、ＣＭＶ－ｈＦＩＸ ｐｃＤＮＡ（商標）３．１プラスミド １５μgを用いてトランスフェクトした。タンパク質の発現は、１０μg/mlのビタミンＫを含むが、血清及び抗生物質不含Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ中で行なわれた。トランスフェクションから２４時間後に上清を回収し、ＦＩＸ活性、ＥＬＩＳＡ、動的パラメーター、及びトロンビン生成についてアッセイした。
【0108】
凝血活性アッセイ及びＦＩＸ抗原
凝血活性を、以前に記載されているように（Milanov et al., 2012）、ＦＩＸ欠損血漿又はＦＶＩＩＩ欠損血漿における改変された１段階の活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）及び非活性化ａＰＴＴ（ｎａＰＴＴ）アッセイによって決定した。ＦＩＸ比活性は、凝血活性を抗原レベルによって割ることによって算出され、野生型タンパク質（１００％と設定）に対して標準化された。ＦＩＸ抗原レベルは、記載のように（Schuettrumpf et al., 2005）、ＥＬＩＳＡによって決定された。
凝血活性を、以前に記載されているように（Milanov et al., 2012）、ＦＩＸ欠損血漿又はＦＶＩＩＩ欠損血漿における改変された１段階の活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）及び非活性化ａＰＴＴ（ｎａＰＴＴ）アッセイによって決定した。ＦＩＸ比活性は、凝血活性を抗原レベルによって割ることによって算出され、野生型タンパク質（１００％と設定）に対して標準化された。ＦＩＸ抗原レベルは、記載のように（Schuettrumpf et al., 2005）、ＥＬＩＳＡによって決定された。
【0109】
トロンビン生成アッセイ
トロンビン生成は、製造業者の説明書に従って市販のアッセイ（Technothrombin TGA; Technoclone）を用いて測定した。ＴＧＡ ＲＤ緩衝液を、それぞれＦＶＩＩＩ欠損血漿又はＦＩＸ欠損血漿中で１：２０又は１：１００の最終希釈率で使用した。ＦＩＸタンパク質の最終濃度は、ＴＧＡ緩衝液（Technoclone）中で希釈された正常な血漿レベルの０．０５％～５％であった。ｒｈＦＩＸ（ベネフィクス；ファイザー社）又はｒｈＦＶＩＩＩ（コージネイト；バイエル社）の製剤を対照として使用した。トロンビン生成分析を、提供されたTechnothrombinＴＧＡ評価ソフトウェアによって評価した。
トロンビン生成は、製造業者の説明書に従って市販のアッセイ（Technothrombin TGA; Technoclone）を用いて測定した。ＴＧＡ ＲＤ緩衝液を、それぞれＦＶＩＩＩ欠損血漿又はＦＩＸ欠損血漿中で１：２０又は１：１００の最終希釈率で使用した。ＦＩＸタンパク質の最終濃度は、ＴＧＡ緩衝液（Technoclone）中で希釈された正常な血漿レベルの０．０５％～５％であった。ｒｈＦＩＸ（ベネフィクス；ファイザー社）又はｒｈＦＶＩＩＩ（コージネイト；バイエル社）の製剤を対照として使用した。トロンビン生成分析を、提供されたTechnothrombinＴＧＡ評価ソフトウェアによって評価した。
【0110】
ＦＶＩＩＩａの存在下又は非存在下におけるＦＩＸａによるＦＸの活性化
ＦＩＸタンパク質試料を、５mMのＣａＣｌ２の存在下、１：１００の酵素／基質のモル比で室温で５時間かけて、活性化ＦＸＩ（Haematologic Technologies）によってＦＩＸａへと活性化した。次いで、ＦＸＩａを、プロテインＧでコーティングされた磁気ビーズ（DynabeadsプロテインＧ；インビトロジェン社）に結合させたアフィニティ精製ヤギ抗ＦＩＸ ＩｇＧ（Haemachromdiagnostica）によって除去した。ＦＸ活性化を、１０nMのｒｈＦＶＩＩＩ（コージネイト（登録商標）；バイエル社）及び１nMのＦＩＸの存在下、又は、ＦＶＩＩＩの非存在下で４nMのＦＩＸと共に、記載の通りに行なった（７）。反応を、３７℃でマイクロタイタープレートリーダーで１分間隔で１０分間４０５nmで測定した。吸光値を、ｐＮＡについての９６００Ｍ－１cm－１のモル吸光係数、及び総容量１００μlに対して０．５cmの光路長を使用して、モル濃度へと変換した。動態パラメーターを、ミカエリス－メンテンの式に従ってSigmaPlotバージョン１２．０によって計算した。
ＦＩＸタンパク質試料を、５mMのＣａＣｌ２の存在下、１：１００の酵素／基質のモル比で室温で５時間かけて、活性化ＦＸＩ（Haematologic Technologies）によってＦＩＸａへと活性化した。次いで、ＦＸＩａを、プロテインＧでコーティングされた磁気ビーズ（DynabeadsプロテインＧ；インビトロジェン社）に結合させたアフィニティ精製ヤギ抗ＦＩＸ ＩｇＧ（Haemachromdiagnostica）によって除去した。ＦＸ活性化を、１０nMのｒｈＦＶＩＩＩ（コージネイト（登録商標）；バイエル社）及び１nMのＦＩＸの存在下、又は、ＦＶＩＩＩの非存在下で４nMのＦＩＸと共に、記載の通りに行なった（７）。反応を、３７℃でマイクロタイタープレートリーダーで１分間隔で１０分間４０５nmで測定した。吸光値を、ｐＮＡについての９６００Ｍ－１cm－１のモル吸光係数、及び総容量１００μlに対して０．５cmの光路長を使用して、モル濃度へと変換した。動態パラメーターを、ミカエリス－メンテンの式に従ってSigmaPlotバージョン１２．０によって計算した。
【0111】
動物手順
全ての動物手順は、地域の動物の管理、保護及び使用の当局（Regierungsprasidium Darmstadt）によって認可された。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスはHarlan Laboratoriesから購入した。ＦＶＩＩＩ遺伝子のエキソン１６の破壊を含有しているＦＸＩＩＩ欠損マウスは、Charles River Laboratoriesから入手した。マウスは、実験開始時には９～１２週令であった。肝臓に指向された遺伝子導入のために、ＦＩＸ－ＷＴ又は変異体をコードしている非ウイルス性ベクターＭＣ．ＨＣＲ／ｈＡＡＴ．ＦＩＸを、以前に記載（Milanov et al., 2012）されているように、マウス１匹あたり２５μgのベクター用量で尾静脈に水力学的に投与した。注射から３日後に、血液試料を後眼窩神経叢から採取した。テールクリップ出血アッセイを、以前に記載（Milanov et al., 2012）されているように行ない、５７５nmでのヘモグロビンの吸光度を測定することによって定量した。ＴＡＴ複合体を、製造業者の説明書に従ってＥＬＩＳＡ（Enzygnost TAT; Siemens）によって測定した。
全ての動物手順は、地域の動物の管理、保護及び使用の当局（Regierungsprasidium Darmstadt）によって認可された。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスはHarlan Laboratoriesから購入した。ＦＶＩＩＩ遺伝子のエキソン１６の破壊を含有しているＦＸＩＩＩ欠損マウスは、Charles River Laboratoriesから入手した。マウスは、実験開始時には９～１２週令であった。肝臓に指向された遺伝子導入のために、ＦＩＸ－ＷＴ又は変異体をコードしている非ウイルス性ベクターＭＣ．ＨＣＲ／ｈＡＡＴ．ＦＩＸを、以前に記載（Milanov et al., 2012）されているように、マウス１匹あたり２５μgのベクター用量で尾静脈に水力学的に投与した。注射から３日後に、血液試料を後眼窩神経叢から採取した。テールクリップ出血アッセイを、以前に記載（Milanov et al., 2012）されているように行ない、５７５nmでのヘモグロビンの吸光度を測定することによって定量した。ＴＡＴ複合体を、製造業者の説明書に従ってＥＬＩＳＡ（Enzygnost TAT; Siemens）によって測定した。
【0112】
統計
データの統計学的評価を、SigmaPlotバージョン１２．０（Systat software Inc.、サンノゼ、米国）を使用して分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって行なった。
データの統計学的評価を、SigmaPlotバージョン１２．０（Systat software Inc.、サンノゼ、米国）を使用して分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって行なった。
【0113】
結果
ＩＴＶ変異体及びＩＡＶ変異体の特性をさらに向上させるために、本発明者らはさらなる突然変異を導入して、異なる特性を有するＦ．ＩＸ分子を作製した。
ＩＴＶ変異体及びＩＡＶ変異体の特性をさらに向上させるために、本発明者らはさらなる突然変異を導入して、異なる特性を有するＦ．ＩＸ分子を作製した。
【0114】
表１～４は、試験された突然変異、及び、Ｆ．ＶＩＩＩ欠損血漿又はＦ．ＩＸ欠損血漿中の変異体の活性を示す。
【0115】
【表4】
【0116】
【表5】
【0117】
【表6】
【0118】
【表7】
【0119】
Ｆ．ＶＩＩＩ非依存性活性を有するＦ．ＩＸ突然変異体の肝臓での発現は、Ｆ．ＶＩＩＩノックアウトマウスに止血をもたらす。
ＦＩＸ突然変異体が、インビボでの凝血活性を改善し、かつＨＡマウスの出血表現型を修正する能力を調べるために、本発明者らは、ＦＩＸ－ＷＴ又は変異体ＦＩＸ－ＦＩＡＶ（ＩＡＶ＋Ｌ６Ｆ）又はＦＩＸ－ＩＤＡＶ（ＩＡＶ＋Ｅ１８５Ｄ）をコードしている肝臓に指向されるミニサークルを、２５μgのベクター用量で、ＦＶＩＩＩノックアウトマウスの尾静脈に水力学的に注射した。遺伝子送達から３日後、突然変異体ＦＩＸの発現レベルは、全ての処置群において類似しており、正常の約３００％の血漿中活性レベルに達した（図９Ａ）。ＦＩＸ－ＩＤＡＶで処置されたマウスのみが、有意により短い凝血時間を示し、１段階のａＰＴＴアッセイによってＦＶＩＩＩ欠損血漿中で測定したところ、ＦＶＩＩＩ非依存性活性は１０％であった（図９Ｂ）。それにも関わらず、ＦＩＸ－ＦＩＡＶ及びＦＩＸ－ＩＤＡＶの両方の突然変異体が、テールクリップ出血アッセイ後に血友病表現型を部分的に修正し（図９Ｃ）、このことは、少量のＦＶＩＩＩバイパス活性で、凝固カスケードを開始しかつ回復させるのに十分であることを示唆する。本発明者らはまた、凝固系の一般的な活性化マーカーを代表する、ＴＡＴ複合体レベルに対するＦＩＸ突然変異体の効果も調べた。ＴＡＴレベルは、全ての群において依然として同じであったが、個体間のばらつきは大きかった（図９Ｄ）。
ＦＩＸ突然変異体が、インビボでの凝血活性を改善し、かつＨＡマウスの出血表現型を修正する能力を調べるために、本発明者らは、ＦＩＸ－ＷＴ又は変異体ＦＩＸ－ＦＩＡＶ（ＩＡＶ＋Ｌ６Ｆ）又はＦＩＸ－ＩＤＡＶ（ＩＡＶ＋Ｅ１８５Ｄ）をコードしている肝臓に指向されるミニサークルを、２５μgのベクター用量で、ＦＶＩＩＩノックアウトマウスの尾静脈に水力学的に注射した。遺伝子送達から３日後、突然変異体ＦＩＸの発現レベルは、全ての処置群において類似しており、正常の約３００％の血漿中活性レベルに達した（図９Ａ）。ＦＩＸ－ＩＤＡＶで処置されたマウスのみが、有意により短い凝血時間を示し、１段階のａＰＴＴアッセイによってＦＶＩＩＩ欠損血漿中で測定したところ、ＦＶＩＩＩ非依存性活性は１０％であった（図９Ｂ）。それにも関わらず、ＦＩＸ－ＦＩＡＶ及びＦＩＸ－ＩＤＡＶの両方の突然変異体が、テールクリップ出血アッセイ後に血友病表現型を部分的に修正し（図９Ｃ）、このことは、少量のＦＶＩＩＩバイパス活性で、凝固カスケードを開始しかつ回復させるのに十分であることを示唆する。本発明者らはまた、凝固系の一般的な活性化マーカーを代表する、ＴＡＴ複合体レベルに対するＦＩＸ突然変異体の効果も調べた。ＴＡＴレベルは、全ての群において依然として同じであったが、個体間のばらつきは大きかった（図９Ｄ）。
【0120】
実施例２
材料及び方法
組換えタンパク質の産生、及び凝固活性の測定
上記の実施例１を参照されたい。
材料及び方法
組換えタンパク質の産生、及び凝固活性の測定
上記の実施例１を参照されたい。
【0121】
トロンビン生成アッセイ
トロンビン生成を、製造業者の説明書に従って市販のアッセイ（TechnothrombinTGA; Technoclone）を用いて測定した。ＴＧＡ ＲＤ緩衝液を、それぞれＦＶＩＩＩ欠損血漿又はＦＩＸ欠損血漿中で最終希釈率１：２０又は１：１００で使用した。ＦＩＸタンパク質の最終濃度は、ＴＧＡ緩衝液（Technoclone）で希釈された正常な血漿レベルの０．０５％～５％であった。ｒｈＦＩＸ（ベネフィクス；ファイザー社）又はｒｈＦＶＩＩＩ（コージネイト；ファイザー社）の製剤を対照として使用した。トロンビン生成の分析を、提供されたTechnothrombinＴＧＡ評価ソフトウェアによって評価した。
トロンビン生成を、製造業者の説明書に従って市販のアッセイ（TechnothrombinTGA; Technoclone）を用いて測定した。ＴＧＡ ＲＤ緩衝液を、それぞれＦＶＩＩＩ欠損血漿又はＦＩＸ欠損血漿中で最終希釈率１：２０又は１：１００で使用した。ＦＩＸタンパク質の最終濃度は、ＴＧＡ緩衝液（Technoclone）で希釈された正常な血漿レベルの０．０５％～５％であった。ｒｈＦＩＸ（ベネフィクス；ファイザー社）又はｒｈＦＶＩＩＩ（コージネイト；ファイザー社）の製剤を対照として使用した。トロンビン生成の分析を、提供されたTechnothrombinＴＧＡ評価ソフトウェアによって評価した。
【0122】
ＦＶＩＩＩａの存在下及び非存在下におけるＦＩＸａによるＦＸの活性化
ＦＩＸタンパク質試料を、５mMのＣａＣｌ２の存在下で、酵素／基質のモル比１：１００で、室温で５時間かけて、活性化ＦＸＩ（Haematologic Technologies）によってＦＩＸａへと活性化した。次いで、ＦＸＩａを、プロテインＧでコーティングされた磁気ビーズ（DynabeadsプロテインＧ；インビトロジェン社）に結合させたアフィニティ精製ヤギ抗ＦＸＩ ＩｇＧ（Haemachrom diagnostica）によって除去した。ＦＸ活性化を、１０nMのｒｈＦＶＩＩＩ（コージネイト（登録商標）、バイエル社）及び１nMのＦＩＸの存在下で、記載されているように（Hartmann et al., 2009）行なった。反応を、３７℃でマイクロタイタープレートリーダーで１分間隔で１０分間４０５nmで測定した。吸光値を、ｐＮＡについての９６００Ｍ－１cm－１のモル吸光係数、及び総容量１００μlに対して０．５cmの光路長を使用して、モル濃度へと変換した。動態パラメーターを、ミカエリス－メンテンの式に従ってSigmaPlotバージョン１２．０によって計算した。
ＦＩＸタンパク質試料を、５mMのＣａＣｌ２の存在下で、酵素／基質のモル比１：１００で、室温で５時間かけて、活性化ＦＸＩ（Haematologic Technologies）によってＦＩＸａへと活性化した。次いで、ＦＸＩａを、プロテインＧでコーティングされた磁気ビーズ（DynabeadsプロテインＧ；インビトロジェン社）に結合させたアフィニティ精製ヤギ抗ＦＸＩ ＩｇＧ（Haemachrom diagnostica）によって除去した。ＦＸ活性化を、１０nMのｒｈＦＶＩＩＩ（コージネイト（登録商標）、バイエル社）及び１nMのＦＩＸの存在下で、記載されているように（Hartmann et al., 2009）行なった。反応を、３７℃でマイクロタイタープレートリーダーで１分間隔で１０分間４０５nmで測定した。吸光値を、ｐＮＡについての９６００Ｍ－１cm－１のモル吸光係数、及び総容量１００μlに対して０．５cmの光路長を使用して、モル濃度へと変換した。動態パラメーターを、ミカエリス－メンテンの式に従ってSigmaPlotバージョン１２．０によって計算した。
【0123】
キトサン／ＤＮＡナノ粒子の調製
ナノ粒子を、記載のように（Mao et al., 2001）複合体のコアセルベーションによって調製した。脱アセチル化度が７５％超である高分子量のキトサン（シグマ－アルドリッチ社）を、５０mMのＮａＯＡｃ緩衝液に溶解して、ｐＨ５．５の０．０２％～０．０８％溶液とした。キトサン及び５０mM Ｎａ２ＳＯ４緩衝液中５０μg/ml又は１００μg/mlのプラスミドＤＮＡ溶液を、別々に５５℃まで加熱した。等容量（５００μl）の両方の溶液を共に、高速ボルテックス下で３０秒間混合した。ナノ粒子を経口投与まで室温で保存した。
ナノ粒子を、記載のように（Mao et al., 2001）複合体のコアセルベーションによって調製した。脱アセチル化度が７５％超である高分子量のキトサン（シグマ－アルドリッチ社）を、５０mMのＮａＯＡｃ緩衝液に溶解して、ｐＨ５．５の０．０２％～０．０８％溶液とした。キトサン及び５０mM Ｎａ２ＳＯ４緩衝液中５０μg/ml又は１００μg/mlのプラスミドＤＮＡ溶液を、別々に５５℃まで加熱した。等容量（５００μl）の両方の溶液を共に、高速ボルテックス下で３０秒間混合した。ナノ粒子を経口投与まで室温で保存した。
【0124】
ＤＮａｓｅＩ保護アッセイ
キトサン／ＤＮＡナノ粒子（２０μl、１μgに等しい）又は複合体を形成していないＤＮＡ（１μg）を、１、１００、又は３００mUのＤＮａｓｅＩ（サーモフィッシャー社）のいずれかと共に３７℃で１時間インキュベートした。反応を、ＥＤＴＡの存在下で６５℃で１０分間の熱失活によって停止させた。３７℃で４時間かけて０．８Ｕのキトサナーゼ（シグマ－アルドリッチ社）と共にさらにインキュベートすることにより、ナノ粒子からＤＮＡが放出された。ベクターＤＮＡの完全性を、０．８％アガロースゲル上でのその後の電気泳動によって調べた。
キトサン／ＤＮＡナノ粒子（２０μl、１μgに等しい）又は複合体を形成していないＤＮＡ（１μg）を、１、１００、又は３００mUのＤＮａｓｅＩ（サーモフィッシャー社）のいずれかと共に３７℃で１時間インキュベートした。反応を、ＥＤＴＡの存在下で６５℃で１０分間の熱失活によって停止させた。３７℃で４時間かけて０．８Ｕのキトサナーゼ（シグマ－アルドリッチ社）と共にさらにインキュベートすることにより、ナノ粒子からＤＮＡが放出された。ベクターＤＮＡの完全性を、０．８％アガロースゲル上でのその後の電気泳動によって調べた。
【0125】
動物手順
全ての動物手順は、地域の動物の管理、保護及び使用の当局（Regierungsprasidium Darmstadt）によって認可された。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスはHarlan Laboratoriesから購入した。Ｃ５７Ｂｌ／６バックグラウンドのＦＩＸ欠損マウス（ＨＢマウス）は、Katherine High（フィラデルフィア小児病院）によって親切にも提供された。マウスは、実験開始時には９～１２週令であった。肝臓に指向された遺伝子導入のために、ＦＩＸ－ＷＴ又は変異体をコードしている非ウイルス性遺伝子導入ベクターＭＣ．ＨＣＲ／ｈＡＡＴを、以前に記載（Milanov et al., 2012）されているように、マウス１匹あたり１０μgのベクター用量で、尾静脈に水力学的に投与した。経口でのＦＩＸ遺伝子の送達のために、マウスに、キトサンナノ粒子として製剤化され、ベビーシリアルと混合された、ＣＭＶプロモーターにより駆動されるベクター（ｐｃＤＮＡ３．１又はＭＣ）を与えた。ＦＩＸ欠損マウスの免疫化を、２ＩＵのｒｈＦＩＸタンパク質（ベネフィクス；ファイザー社）の２回の皮下注射によって不完全フロイントアジュバントの存在下で２週間の間隔で行なった。血液を、イソフルラン麻酔下で後眼窩神経叢から１／１０容量の３．８％クエン酸ナトリウム緩衝液中に採取した。テールクリップアッセイを以前に記載（Milanov et al., 2012）されているように行ない、５７５nmでのヘモグロビンの吸光度を測定することによって定量した。
全ての動物手順は、地域の動物の管理、保護及び使用の当局（Regierungsprasidium Darmstadt）によって認可された。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスはHarlan Laboratoriesから購入した。Ｃ５７Ｂｌ／６バックグラウンドのＦＩＸ欠損マウス（ＨＢマウス）は、Katherine High（フィラデルフィア小児病院）によって親切にも提供された。マウスは、実験開始時には９～１２週令であった。肝臓に指向された遺伝子導入のために、ＦＩＸ－ＷＴ又は変異体をコードしている非ウイルス性遺伝子導入ベクターＭＣ．ＨＣＲ／ｈＡＡＴを、以前に記載（Milanov et al., 2012）されているように、マウス１匹あたり１０μgのベクター用量で、尾静脈に水力学的に投与した。経口でのＦＩＸ遺伝子の送達のために、マウスに、キトサンナノ粒子として製剤化され、ベビーシリアルと混合された、ＣＭＶプロモーターにより駆動されるベクター（ｐｃＤＮＡ３．１又はＭＣ）を与えた。ＦＩＸ欠損マウスの免疫化を、２ＩＵのｒｈＦＩＸタンパク質（ベネフィクス；ファイザー社）の２回の皮下注射によって不完全フロイントアジュバントの存在下で２週間の間隔で行なった。血液を、イソフルラン麻酔下で後眼窩神経叢から１／１０容量の３．８％クエン酸ナトリウム緩衝液中に採取した。テールクリップアッセイを以前に記載（Milanov et al., 2012）されているように行ない、５７５nmでのヘモグロビンの吸光度を測定することによって定量した。
【0126】
免疫組織化学的検査
連続凍結切片（８～１０μm）を、肝臓、脾臓、小腸、及び大腸から免疫蛍光染色のために得た。使用される抗体を表Ｓ１に列挙する。画像は、共焦点レーザー走査顕微鏡（LSM, Zeiss）を使用して撮影し、Zeiss software LSM Image Browserを用いて分析した。
連続凍結切片（８～１０μm）を、肝臓、脾臓、小腸、及び大腸から免疫蛍光染色のために得た。使用される抗体を表Ｓ１に列挙する。画像は、共焦点レーザー走査顕微鏡（LSM, Zeiss）を使用して撮影し、Zeiss software LSM Image Browserを用いて分析した。
【0127】
ナノ粒子の経口投与後のＦＩＸ発現のためのＲＴ－ＰＣＲ
全ＲＮＡを、脾臓、肝臓、十二指腸／空腸、回腸、及び大腸から、High pure RNA isolationキット（Roche Diagnostics Deutschland GmbH）を使用して単離した。High capacity cDNA reverse transcriptaseキット（Applied Biosystems）を、ｍＲＮＡからｃＤＮＡへの翻訳のために使用した。定量リアルタイムＰＣＲを、Power SYBR Green（Applied Biosystems）を用いて行なった。プライマー配列を表Ｓ２に列挙する。
全ＲＮＡを、脾臓、肝臓、十二指腸／空腸、回腸、及び大腸から、High pure RNA isolationキット（Roche Diagnostics Deutschland GmbH）を使用して単離した。High capacity cDNA reverse transcriptaseキット（Applied Biosystems）を、ｍＲＮＡからｃＤＮＡへの翻訳のために使用した。定量リアルタイムＰＣＲを、Power SYBR Green（Applied Biosystems）を用いて行なった。プライマー配列を表Ｓ２に列挙する。
【0128】
統計
データの統計学的評価を、SigmaPlotバージョン１２．０（Systat software Inc.、サンノゼ、ＣＡ）を使用して分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって行なった。
データの統計学的評価を、SigmaPlotバージョン１２．０（Systat software Inc.、サンノゼ、ＣＡ）を使用して分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって行なった。
【0129】
結果
野生型タンパク質、ＩＴＶ変異体及びＩＡＶ変異体の特性をさらに向上させるために、本発明者らは、さらなる突然変異を単一で又は組み合わせて導入して、異なる特性を有するＦ．ＩＸ分子を作製した。
野生型タンパク質、ＩＴＶ変異体及びＩＡＶ変異体の特性をさらに向上させるために、本発明者らは、さらなる突然変異を単一で又は組み合わせて導入して、異なる特性を有するＦ．ＩＸ分子を作製した。
【0130】
表５及び６は、試験された突然変異、及び変異体の活性を示す。
【0131】
【表8】
【0132】
【表9】
【0133】
ＦＩＸ突然変異体の肝臓での発現は、効果的に止血を引き起こす
インビボでＦＩＸ突然変異体の発現及び凝血活性を調べるために、本発明者らは、ＦＩＸ－ＫＬＷ、ＦＩＸ－ＡＫＬＷ、ＦＩＸ－ＹＡＬＷ、又はＦＩＸ－ＷＴのいずれかをコードしている肝臓に指向されたミニサークルを、１０μgのベクター用量で、ＨＢマウスの尾静脈に水力学的に注射した。遺伝子送達から３日後に、ＦＩＸ発現レベルは、全ての処置群において正常な血漿レベルの約１００％に達した（データは示されていない）。予想された通り、高機能なＦＩＸ突然変異体が選択されれば、３つ全ての突然変異体の凝血活性は、ＦＩＸ－ＷＴよりも最大１０倍まで有意により高かった（図８Ｃ）。活性の比と抗原により、ＦＩＸ比活性の１０～１７倍の増加が判明した（ｐ＜０．０５）。さらに、尾切断出血アッセイにより、止血的に正常なマウスと同等である、出血性表現型の完全な正常化が判明した（図８Ｄ）。
インビボでＦＩＸ突然変異体の発現及び凝血活性を調べるために、本発明者らは、ＦＩＸ－ＫＬＷ、ＦＩＸ－ＡＫＬＷ、ＦＩＸ－ＹＡＬＷ、又はＦＩＸ－ＷＴのいずれかをコードしている肝臓に指向されたミニサークルを、１０μgのベクター用量で、ＨＢマウスの尾静脈に水力学的に注射した。遺伝子送達から３日後に、ＦＩＸ発現レベルは、全ての処置群において正常な血漿レベルの約１００％に達した（データは示されていない）。予想された通り、高機能なＦＩＸ突然変異体が選択されれば、３つ全ての突然変異体の凝血活性は、ＦＩＸ－ＷＴよりも最大１０倍まで有意により高かった（図８Ｃ）。活性の比と抗原により、ＦＩＸ比活性の１０～１７倍の増加が判明した（ｐ＜０．０５）。さらに、尾切断出血アッセイにより、止血的に正常なマウスと同等である、出血性表現型の完全な正常化が判明した（図８Ｄ）。
【0134】
経口による遺伝子送達
キトサン－ＤＮＡナノ粒子の経口投与により、ＨＢマウスの小腸においてＦＩＸタンパク質が産生される。
まず、ナノ粒子の安定性及びトランスフェクション効率の特徴付けを、一連のインビトロでの実験で行なった（データは示されていない）。次に、ナノ粒子を経口投与した（図１０Ａ）。インビボでは、キトサンで製剤化されたｅＧＦＰの１回量をＨＢマウスに経口投与した後に、小腸でのＧＦＰの発現が成功裡に染色された（図１０Ｂ）。予想された通り、肝臓、脾臓又は大腸において（データは示されていない）、及び製剤化されていないベクターの投与後に、シグナルは全く検出されなかった。キトサンで製剤化されたＦＩＸ－ＷＴの経口送達により、ＦＩＸの提示は、主に、内皮細胞周辺の微絨毛に位置し、部分的に細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に位置していることが判明した（図１０Ｃ、１列目）。しかし、また、ＦＩＸタンパク質と、ＦＩＸの天然リガンドであるコラーゲンＩＶとの共局在も認められ、よって、本発明者らは、コラーゲンＩＶが、循環中へのＦＩＸタンパク質の放出を妨害する可能性があると仮定した（図１０Ｃ、３列目）。この障害を克服するために、どちらもコラーゲンＩＶへの低い親和性を伴う、ＦＩＸ変異体のＫＬＷ又はＡＫＬＷを、ＨＢマウスに投与した。全体的に同じような発現パターンが観察されたが、腸におけるＦＩＸ変異体の細胞外コラーゲンＩＶとの結合は僅かに減少したようにみえた（図１０Ｃ、４～５列目）。ＦＩＸｍＲＮＡ発現は、全小腸において専ら検出され、このことは、免疫組織化学的染色によって得られた結果を確認し、この領域におけるナノ粒子の取り込みの選択性を示す。裸ＤＮＡと、偽プラスミドを含有しているナノ粒子の適用により、検出不可能な発現レベルが得られた（図１０Ｄ）。
キトサン－ＤＮＡナノ粒子の経口投与により、ＨＢマウスの小腸においてＦＩＸタンパク質が産生される。
まず、ナノ粒子の安定性及びトランスフェクション効率の特徴付けを、一連のインビトロでの実験で行なった（データは示されていない）。次に、ナノ粒子を経口投与した（図１０Ａ）。インビボでは、キトサンで製剤化されたｅＧＦＰの１回量をＨＢマウスに経口投与した後に、小腸でのＧＦＰの発現が成功裡に染色された（図１０Ｂ）。予想された通り、肝臓、脾臓又は大腸において（データは示されていない）、及び製剤化されていないベクターの投与後に、シグナルは全く検出されなかった。キトサンで製剤化されたＦＩＸ－ＷＴの経口送達により、ＦＩＸの提示は、主に、内皮細胞周辺の微絨毛に位置し、部分的に細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に位置していることが判明した（図１０Ｃ、１列目）。しかし、また、ＦＩＸタンパク質と、ＦＩＸの天然リガンドであるコラーゲンＩＶとの共局在も認められ、よって、本発明者らは、コラーゲンＩＶが、循環中へのＦＩＸタンパク質の放出を妨害する可能性があると仮定した（図１０Ｃ、３列目）。この障害を克服するために、どちらもコラーゲンＩＶへの低い親和性を伴う、ＦＩＸ変異体のＫＬＷ又はＡＫＬＷを、ＨＢマウスに投与した。全体的に同じような発現パターンが観察されたが、腸におけるＦＩＸ変異体の細胞外コラーゲンＩＶとの結合は僅かに減少したようにみえた（図１０Ｃ、４～５列目）。ＦＩＸｍＲＮＡ発現は、全小腸において専ら検出され、このことは、免疫組織化学的染色によって得られた結果を確認し、この領域におけるナノ粒子の取り込みの選択性を示す。裸ＤＮＡと、偽プラスミドを含有しているナノ粒子の適用により、検出不可能な発現レベルが得られた（図１０Ｄ）。
【0135】
ヒトＦＩＸ突然変異体の反復経口投与により、ＨＢマウスに止血がもたらされる
ＨＢマウスは、実験設計計画（図１１Ａ）に示されているように、キトサンで製剤化されたプラスミド又はＭＣベクターによって媒介される高機能ＦＩＸ変異体の１日量を７回連続して受けた。ＦＩＸ抗原発現は、１％という検出限界より低いままであった（データは示されていない）。しかし、コラーゲンＩＶに対する結合が損なわれた突然変異体（ＦＩＸ－ＫＬＷ及びＦＩＸ－ＡＫＬＷ対ＦＩＸ－ＹＡＬＷ）のＦＩＸ活性は、３日目から８日目の間に蓄積するようであり、８日目には（最も長い処置の時点）プラスミドで処置された群（図１１Ｂ）では３％までの範囲の、ＭＣで処置された群（図１１Ｃ）では１４％までの範囲のレベルに達した。経口による遺伝子療法を中止した後、ＦＩＸ突然変異体の凝血活性は少なくとも３週間持続したが、有意なばらつきがあり、これは抗体の形成には関連しなかった（データは示されていない）。これに対し、キトサンで製剤化されたＦＩＸ－ＷＴ又は偽の経口送達後、凝血活性は検出限界（１％）未満のままであった（図１１Ｂ＋Ｃ）。本発明者らは、テールクリップ出血アッセイにおいてインビボでの効力をさらに調べた（図１２Ａ）。マウスは、ＦＩＸ突然変異体の経口投与後に、１段階のａＰＴＴによって測定された、有意により短いインビトロでの凝血時間を有していた（図１２Ｂ）。観察と一致して、ＦＩＸ－ＫＬＷ及びＦＩＸ－ＡＫＬＷの発現は、ＨＢマウスの出血表現型を部分的に修正した（図１２Ｃ）。凝血系の一般的な活性化マーカーを代表し、血友病の置換療法の脈絡で高機能な又は自然発生的な凝血の指標となるであろう、ＴＡＴ複合体レベルは、全ての群において同じままであった（図１２Ｄ）。
ＨＢマウスは、実験設計計画（図１１Ａ）に示されているように、キトサンで製剤化されたプラスミド又はＭＣベクターによって媒介される高機能ＦＩＸ変異体の１日量を７回連続して受けた。ＦＩＸ抗原発現は、１％という検出限界より低いままであった（データは示されていない）。しかし、コラーゲンＩＶに対する結合が損なわれた突然変異体（ＦＩＸ－ＫＬＷ及びＦＩＸ－ＡＫＬＷ対ＦＩＸ－ＹＡＬＷ）のＦＩＸ活性は、３日目から８日目の間に蓄積するようであり、８日目には（最も長い処置の時点）プラスミドで処置された群（図１１Ｂ）では３％までの範囲の、ＭＣで処置された群（図１１Ｃ）では１４％までの範囲のレベルに達した。経口による遺伝子療法を中止した後、ＦＩＸ突然変異体の凝血活性は少なくとも３週間持続したが、有意なばらつきがあり、これは抗体の形成には関連しなかった（データは示されていない）。これに対し、キトサンで製剤化されたＦＩＸ－ＷＴ又は偽の経口送達後、凝血活性は検出限界（１％）未満のままであった（図１１Ｂ＋Ｃ）。本発明者らは、テールクリップ出血アッセイにおいてインビボでの効力をさらに調べた（図１２Ａ）。マウスは、ＦＩＸ突然変異体の経口投与後に、１段階のａＰＴＴによって測定された、有意により短いインビトロでの凝血時間を有していた（図１２Ｂ）。観察と一致して、ＦＩＸ－ＫＬＷ及びＦＩＸ－ＡＫＬＷの発現は、ＨＢマウスの出血表現型を部分的に修正した（図１２Ｃ）。凝血系の一般的な活性化マーカーを代表し、血友病の置換療法の脈絡で高機能な又は自然発生的な凝血の指標となるであろう、ＴＡＴ複合体レベルは、全ての群において同じままであった（図１２Ｄ）。
【0136】
ここで、本発明者らは、血友病Ｂの処置のためのバイオポリマーキトサンに基づいたＦＩＸ突然変異体の経口での遺伝子送達の効力を実証する。経口での遺伝子送達と高機能な突然変異体を組み合わせることによって、機能的なＦＩＸレベルを達成することができる。ヒトＦＩＸに対するマウスの感作、及び従って、ヒトＦＩＸに対する抗体の中和は、使用されたレジメンでは観察されなかった。血友病Ａ（ＨＡ）を含む、経口遺伝子療法の一般的な原則が以前に記載されているが（例えばBowman et al., 2008）、本発明者らの今回の研究によって示される重要な進歩は、機能が最適化されたＦＩＸと、このアプローチを用いて改良された送達システムの組合せに存し、その結果、治療タンパク質の臨床的に適切な量が放出される。それ故、提供されたデータは、ナノ粒子に基づいた経口遺伝子療法の確証的な原理証明データを反映するだけでなく、臨床的恩恵の可能性も示す。
【0137】
前記の説明、特許請求の範囲及び／又は添付の図面に開示された特徴は、別々に及びその任意の組合せの両方において、その多様な形態で本発明を実現するために重要であり得る。
【0138】
【表10】
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【配列表】