特許 7000396 微生物発酵からの中性ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯｓ）の効果的な精製のためのプロセス

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2021-12-27

(45)【発行日】2022-02-10

(54)【発明の名称】微生物発酵からの中性ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯｓ）の効果的な精製のためのプロセス

(51)【国際特許分類】

   C12P 19/00 20060101AFI20220203BHJP

   C07H 3/06 20060101ALI20220203BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20220203BHJP

   A23K 20/163 20160101ALN20220203BHJP

   A23L 33/10 20160101ALN20220203BHJP

   A61P 1/04 20060101ALN20220203BHJP

   A61K 31/702 20060101ALN20220203BHJP

【ＦＩ】

C12P19/00

C07H3/06

C12N1/21

A23K20/163

A23L33/10

A61P1/04

A61K31/702

【請求項の数】 11

(21)【出願番号】P 2019191254

(22)【出願日】2019-10-18

(62)【分割の表示】P 2016547592の分割

【原出願日】2014-12-23

(65)【公開番号】P2020014482

(43)【公開日】2020-01-30

【審査請求日】2019-11-15

(31)【優先権主張番号】14151737.5

(32)【優先日】2014-01-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】511297753

【氏名又は名称】クリスチャン・ハンセン・ハーエムオー・ゲーエムベーハー

【氏名又は名称原語表記】Ｃｈｒ． Ｈａｎｓｅｎ ＨＭＯ ＧｍｂＨ

【住所又は居所原語表記】Ｍａａｒｗｅｇ ３２ ５３６１９ Ｒｈｅｉｎｂｒｅｉｔｂａｃｈ Ｇｅｒｍａｎｙ

(74)【代理人】

【識別番号】240000327

【弁護士】

【氏名又は名称】弁護士法人クレオ国際法律特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】イェンネワイン シュテファン

【審査官】伊達 利奈

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１２／１１２７７７（ＷＯ，Ａ２）

【文献】欧州特許出願公開第０２４７９２６３（ＥＰ，Ａ１）

【文献】国際公開第２００９／００８３６２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２００１－５１４８６５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１２－５２０６６６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１３－１２１３４３（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２００６／０３８５５２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開２００３－０４７４０２（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開昭６３－２７３４９１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１２－５２２８２７（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｐ １９／００

Ｃ１２Ｎ １／００

Ｃ１２Ｎ １５／００

ＰｕｂＭｅｄ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

中性ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯｓ）を組換え微生物を使用する微生物発酵によって得られる発酵ブロスからバッチ式または連続式で精製するためのプロセスにおいて、前記発酵ブロスは、中性ＨＭＯ、バイオマス、培地成分および混入物を含み、
前記中性ＨＭＯは、２’－フコシルラクトース、３－フコシルラクトース、２’，３－ジフコシルラクトース、ラクト－Ｎ－トリオースＩＩ、ラクト－Ｎ－テトラオース、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ、ラクト－Ｎ－ネオフコペンタオース、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩ、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩＩ、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＶ、ラクト－Ｎ－ネオフコペンタオースＶ、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩ、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩＩ、６’－ガラクトシルラクトース、３’－ガラクトシルラクトース、ラクト－Ｎ－ヘキサオースおよびラクト－Ｎ－ネオヘキサオースからなる群から選択され、
前記発酵ブロス中の前記中性ＨＭＯの純度は８０％未満であり、
前記発酵ブロスは、以下の精製ステップｉ）～ｉｖ）に適用され、
ｉ）前記バイオマスの前記発酵ブロスからの分離ステップ、
ｉｉ）正帯電物質の除去のための陽イオン交換体処理ステップ、
ｉｉｉ）負帯電物質の除去のための陰イオン交換体処理ステップ、
ｉｖ）電気透析ステップ、
前記中性ＨＭＯを８０％以上の純度で含む精製された溶液が提供され、
前記精製された溶液は、ＤＮＡ、タンパク質、および組換え遺伝子材料を含まず、
前記精製された溶液は、減菌濾過され、エンドトキシン除去に供され、
前記精製された溶液は、噴霧乾燥されることを特徴とするプロセス。

【請求項2】

前記発酵ブロス中の前記中性ＨＭＯの前記純度は、７０％以下であり、かつ／または前記精製された溶液は、８５％以上の純度で前記中性ＨＭＯを含むことを特徴とする請求項１に記載のプロセス。

【請求項3】

前記発酵ブロスからのバイオマスの分離は、
ａ）限外濾過；および／または
ｂ）クロスフローフィルターによる濾過；によって実現されることを特徴とする請求項１または２に記載のプロセス。

【請求項4】

前記精製ステップｉｉ）～iｖ）の少なくとも１つは、前記プロセス中に少なくとも１回繰り返されることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載のプロセス。

【請求項5】

前記精製ステップｉ）～ｉｖ）の少なくとも１つの後に、色を与える物質および大型のオリゴ糖を活性炭素に吸着させるための少なくとも１回の活性炭素処理を前記発酵ブロスに行うことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載のプロセス。

【請求項6】

ａ）精製ステップｉ）～ｉｖ）の少なくとも１つの後に；または
ｂ）色を与える物質および大型のオリゴ糖活性炭素に吸着させるための少なくとも１回の活性炭素処理の後に；または
ｃ）精製ステップｉ）～ｉｖ）の少なくとも１つの後に実施される濃縮ステップの前に；
前記中性ヒトミルクオリゴ糖を含む前記溶液を透析濾過および／または濃縮されることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載のプロセス。

【請求項7】

ステップｉ）の前のステップで、グルコシダーゼ処理を発酵ブロスで実施してよいことを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載のプロセス。

【請求項8】

前記発酵ブロスは、前記精製ステップｉ）～ｉｖ）の少なくとも１つの後に、真空蒸発または逆浸透またはナノフィルトレーションを用いて
ａ）１００ｇ／Ｌ以上の濃度まで；かつ／または
ｂ）真空蒸発または逆浸透の間、８０℃より低い温度で；かつ／または
ｃ）８０℃より低い温度で、濃縮されることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか１項に記載のプロセス。

【請求項9】

前記精製溶液は滅菌濾過され、かつ／または、３ｋＤａのフィルタによる前記精製溶液の濾過によるエンドトキシン除去に供されることを特徴とする請求項１乃至８のいずれか１項に記載のプロセス。

【請求項10】

前記精製溶液を１．５Ｍより大きい濃度に濃縮し、温度２５℃未満に冷却して、前記中性ＨＭＯの結晶性物質が得られることを特徴とする請求項１乃至９のいずれか１項に記載のプロセス。

【請求項11】

前記精製溶液は、２０～６０（ｗ／ｖ）の前記中性ＨＭＯ濃度、１１０～１５０℃のノズル温度、および／または６０～８０℃の出口温度で噴霧乾燥されることを特徴とする請求項１乃至１０のいずれか１項に記載のプロセス。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本願は、微生物発酵によって生成された中性ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯｓ）の精製のための簡単なプロセスを開示する。このプロセスは、陽イオン交換体処理、陰イオン交換体処理、およびナノフィルトレーションおよび／または電気透析ステップの組合せを使用し、それにより大量の中性ＨＭＯｓを高純度で効率的に精製することが可能である。中性ＨＭＯｓの発酵生産で現在使用される精製とは逆に、提示されるプロセスは、クロマトグラフィー分離の必要なくＨＭＯｓの供給を可能にする。そのように精製されたＨＭＯｓは、噴霧乾燥によって固体形態で、結晶性物質として、または除菌濾過された濃縮物として得ることができる。提供されるＨＭＯｓは、タンパク質および使用した組換え微生物菌株に由来する組換え物質を含まないので、食品、医療用食品および飼料（例えばペットフード）用途での使用に非常によく適している。

【背景技術】

【0002】

人乳は、炭水化物、脂肪、タンパク質、ビタミン、ミネラルおよび微量元素の複雑な混合物を表す。際立って最も優勢な画分は炭水化物に代表され、これはラクトースと、より複雑なオリゴ糖とにさらに分けることができる。ラクトースはエネルギー源として使用されるのに対し、複合型オリゴ糖は、乳児によって代謝されない。複合型オリゴ糖の画分は、全炭水化物画分の１／１０までを占め、おそらく１５０を超える異なるオリゴ糖で構成される。これらの複合型オリゴ糖の出現および濃度はヒトに特有であり、例えば家畜化された酪農動物のようなその他の哺乳動物の乳の中でこのように大量に見出すことはできない。

【0003】

人乳中にこれらの複合型オリゴ糖が存在することは既に長い間公知であり、これらのオリゴ糖の生理的機能は、数十年間医学研究の対象であった（Ｇｕｒａ，Ｔ．（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ’ｓ ｆｉｒｓｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｆｏｏｄ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４５（６１９８）７４７－７４９）。いくつかのより豊富なヒトミルクオリゴ糖に関して、具体的な機能が既に特定されている（Ｂｏｄｅ，Ｌ．（２０１２）Ｈｕｍａｎ ｍｉｌｋ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ：ｅｖｅｒｙ ｂａｂｙ ｎｅｅｄｓ ａ ｓｕｇａｒ ｍａｍａ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２２（９），１１４７－１１６２．；Ｂｏｄｅ Ｌ，Ｊａｎｔｓｃｈｅｒ－Ｋｒｅｎｎ Ｅ（２０１２）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｉｌｋ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．Ａｄｖ Ｎｕｔｒ ３（３）３８３Ｓ－３９１Ｓ；Ｍｏｒｒｏｗ ＡＬ，Ｒｕｉｚ－Ｐａｌａｃｉｏｓ ＧＭ，Ａｌｔａｙｅ Ｍ，Ｊｉａｎｇ Ｘ，Ｇｕｅｒｒｅｒｏ ＭＬ，Ｍｅｉｎｚｅｎ－Ｄｅｒｒ ＪＫ，Ｆａｒｋａｓ Ｔ，Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉ Ｐ，Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇ ＬＫ，Ｎｅｗｂｕｒｇ ＤＳ（２００４）Ｈｕｍａｎ ｍｉｌｋ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ａｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｄｉａｒｒｈｅａ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ－ｆｅｄ ｉｎｆａｎｔｓ．Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ １４５（３）２９７－３０３）。

【0004】

個々のヒトミルクオリゴ糖の供給が限られていることと純粋な画分を得ることが困難なことが、一部のこれらの複合分子の化学経路の開発につながった。しかし、化学合成、酵素合成または発酵によるヒトミルクオリゴ糖の合成は、困難であることが分かった。食品用途に十分な品質だけでなく少なくとも大規模な量は、今日まで提供されることができない。この点で、特にヒトミルクオリゴ糖への化学合成経路（例えば、２’－フコシルラクトース；国際公開第２０１０／１１５９３５Ａ１号参照）は、いくつかの有害化学物質を含み、それは最終生成物を汚染するリスクを課す。

【0005】

ヒトミルクオリゴ糖の化学合成に関する課題のために、いくつかの酵素的方法および発酵によるアプローチが開発された（Ｍｉｙａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．４８０，５１１－５２４；Ｍｕｒａｔａ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．１６，１８９－１９５；Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，（２０１３）Ｍｉｃｒｏｂ．Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ．１２，４０；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｍｉｃｒｏｂ．Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ．１１，４８；米国特許第７，５２１，２１２Ｂ１号またはＡｌｂｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３３４（２）ｐ９７－１０３）。しかし、これらの方法は、オリゴ糖の複合混合物を生み出し、すなわち望ましい生成物はラクトースなどの出発物質、生合成中間体ならびに個々の単糖およびポリペプチドなどの基質によって汚染されている。

【0006】

これらの複合混合物から個々のオリゴ糖生成物を精製するための最先端プロセスは、技術的に複雑であり、食品用途には不経済でもある。二糖類のラクトースまたはスクロースを乳清または糖蜜などの複合混合物から精製するために、複数の結晶化を含む産業規模のプロセスが開発された。前記方法の欠点は、それらが複雑であり、少ない収量しかもたらさないことである。

【0007】

微生物発酵から複合型オリゴ糖、例えば特定のヒトミルクオリゴ糖などを精製するためにこれまでに選択される方法は、ゲル濾過クロマトグラフィーである。ゲル濾過クロマトグラフィーの欠点は、それが効率的にスケールアップできないことと、連続運転に適していないことである。従って、ゲル濾過クロマトグラフィーは、不経済であり、特定のヒトミルクオリゴ糖（２’－フコシルラクトースまたはラクト－Ｎ－テトラオースのように）を、人間の食品またはその他の用途、例えば動物用食品（例えばペットフード）などで使用するために合理的な量および品質で提供することを困難にする。動物用飼料またはペットフードとしての用途は、その他の哺乳動物もその乳中に人間と同じまたは同様の中性複合型オリゴ糖を含む（例えば、２’－フコシルラクトースは、イヌ、ブタ、チンパンジーの乳にも見出される）という理由から興味深い（Ｃａｓｔａｎｙｓ－Ｍｕｎｚｏ，Ｅ．，Ｍａｒｔｉｎ，Ｊ．Ｍ＆Ｐｒｉｅｔｏ，Ｐ．Ａ．（２０１３）２’－ｆｕｃｏｓｙｌｌａｃｔｏｓｅ：ａｎ ａｂｕｎｄａｎｔ，ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｓｏｌｕｂｌｅ ｇｌｙｃａｎ ｐｒｅｓｅｎｔ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｍｉｌｋ．Ｎｕｔｒ．Ｒｅｖ．７１（１２）７７３－７８９）。

【0008】

もう一つの問題は、微生物発酵において組換え菌株（組換え細菌株または酵母菌株）の使用であって、その結果、発酵生成物が組換え物質で汚染されることである。しかし、組換えＤＮＡまたはタンパク質による汚染は、今日、監督機関および消費者に許容されない。特に組換えＤＮＡ分子の検出限界は非常に低い。現在、検出の黄金基準とみなされているｑＰＣＲに基づく検出を用いる場合、たった１つのＤＮＡ分子でさえも検出することができる。タンパク質は、その上に、アレルギー反応のリスクをもたらす。そのために望ましいオリゴ糖生成物から効率的に除去されるべきである。

【0009】

電気透析（ＥＤ）は、透析と電気分解を組み合わせた技術を表し、半透膜によるそれらの選択的エレクトロマイグレーションに基づく溶液中のイオンの分離または濃縮に使用することができる。電気透析の最初の産業用途は、１９６０年代初期に遡り、乳児用処方で用いるためのチーズ乳清の脱塩である。電気透析のさらに開発された用途には、ワイン、ブドウ液、リンゴ果汁およびオレンジ果汁などの飲料のｐＨの調整が含まれる。

【0010】

飲料水の製造のための汽水の真水化および乳児用食品製造のための乳清の脱塩は、現在、最大の応用範囲となっている。

【0011】

基本的な電気透析の原理は、直流発電機に接続されたイオンの伝導のための電解質に沈められた一対の電極からなる電解槽で構成される。直流発電機の陽極に接続された電極はアノードであり、陰極に接続された電極はカソードと呼ばれる。次に、電解質溶液は電流の流れを支える。この流れは負電荷イオンおよび正電荷イオンがそれぞれアノードおよびカソードの方へ動くことから生じる。電気透析に用いる膜は、本質的に、負または正の荷電基を有し、そのためにそれぞれ陽イオン性膜または陰イオン性膜と呼ばれる多孔性イオン交換樹脂のシートである。イオン交換体膜は、通常、ジビニルベンゼンで架橋された適切な官能基を（例えば陽イオン性膜または陰イオン性膜に、それぞれスルホン酸基または第四級アンモニウム基などを）有するポリスチレンでできている。電解質として、塩化ナトリウム、または酢酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウムなどを用いることができる。その後、電気透析（ｅｌｅｃｔｏｄｉａｌｙｓｉｓ）スタックは、イオン減少を受ける流れが、イオン濃縮を受ける流れ（これら２つの溶液は、希釈液（ｄｉｌｕａｔｅ）（イオン減少を受ける）および濃縮液（イオン濃縮を受ける）とも呼ばれる）から十分に離れている２つの電極ブロック間のフィルタープレスのように、陰イオン性膜と陽イオン性膜が平行であるように構築される。電気透析プロセスの本質は膜スタックであり、それはスペーサーで分離され、２つの電極間に設置されたいくつかの陰イオン交換膜および陽イオン交換膜からなる。直流を印加することにより、陰イオンおよび陽イオンは膜を横切って電極の方に移動し、希釈液（ｄｉｌｕａｔｅ）（脱塩液）および濃縮液の流れを生じる。

【0012】

一般に、生成物が希釈液（ｄｉｌｕａｔｅ）から濃縮液の流れへ拡散する（しばしば、２つの流れの間の高い濃度差によって起こる）ことを防ぐために、用いる膜の孔径はやや小さい。バイオマスから分離した後、タンパク質および特に（全ゲノムのサイズの）組換えＤＮＡ分子は、望ましい生成物から定量的に除去される必要がある。できれば、そのような大きい分子（ＨＭＯｓの分子サイズと比較）の電気透析は、どちらかといえば長いものとなり、希釈液（ｄｉｌｕａｔｅ）から濃縮液への望ましい生成物のかなりの損失を確実に伴うであろう。

【0013】

ダイアフィルトレーションは、膜透過性の成分を「洗い落とす」または除去するために、新鮮な水を溶液に添加することを伴うプロセスである。従って、ダイアフィルトレーションは、適切な膜を使用することによって、成分をそれらの分子サイズに基づいて分離するのに使用されることができる。ここでは、１以上の種が効果的に保持され、その他の種が膜透過性である。特に、ナノフィルトレーション膜を使用することによるダイアフィルトレーションは、低分子化合物を塩から分離するのに効果的である。一般に、ナノフィルトレーション膜は、１５０～３００ダルトンの範囲の分子量カットオフを有する。今日、ナノフィルトレーション（ＮＦ）は、酪農産業で乳清の濃縮および脱塩に広く使用されている。ナノフィルトレーションは、人乳からヒトミルクオリゴ糖画分を濃縮するために既に用いられている。このアプローチでは、ＨＭＯ画分をミルクラクトースから分離するために、ナノフィルトレーションはラクトースの酵素分解と組み合わせて使用されていた（Ｓａｒｎｅｙ Ｄ．Ｂ，Ｈａｌｅ，Ｃ．，Ｆｒａｎｋｅｌ，Ｇ＆Ｖｕｌｆｓｏｎ，Ｅ．Ｎ．（２０００）Ａ ｎｏｖｅｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｅ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｆｒｏｍ ｍｉｌｋ ｕｓｉｎｇ ａ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｎｄ ｎａｎｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ ６９，４６１－４６７）。

【0014】

食品等級のヒトミルクオリゴ糖を微生物発酵から効率的に精製するための開発されたプロセスでは、ナノフィルトレーションは、望ましい生成物を濃縮するために、さらに膜透過性の塩を除去するためにも用いられる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0015】

【文献】国際公開第２０１０／１１５９３５Ａ１号公報

【文献】米国特許第７，５２１，２１２Ｂ１号明細書

【文献】欧州特許第１１１１５１５７１．４号公報

【非特許文献】

【0016】

【文献】Ｇｕｒａ，Ｔ．（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ’ｓ ｆｉｒｓｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｆｏｏｄ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４５（６１９８）７４７－７４９

【文献】Ｂｏｄｅ，Ｌ．（２０１２）Ｈｕｍａｎ ｍｉｌｋ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ：ｅｖｅｒｙ ｂａｂｙ ｎｅｅｄｓ ａ ｓｕｇａｒ ｍａｍａ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２２（９），１１４７－１１６２．

【文献】Ｂｏｄｅ Ｌ，Ｊａｎｔｓｃｈｅｒ－Ｋｒｅｎｎ Ｅ（２０１２）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｉｌｋ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．Ａｄｖ Ｎｕｔｒ ３（３）３８３Ｓ－３９１Ｓ

【文献】Ｍｏｒｒｏｗ ＡＬ，Ｒｕｉｚ－Ｐａｌａｃｉｏｓ ＧＭ，Ａｌｔａｙｅ Ｍ，Ｊｉａｎｇ Ｘ，Ｇｕｅｒｒｅｒｏ ＭＬ，Ｍｅｉｎｚｅｎ－Ｄｅｒｒ ＪＫ，Ｆａｒｋａｓ Ｔ，Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉ Ｐ，Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇ ＬＫ，Ｎｅｗｂｕｒｇ ＤＳ（２００４）Ｈｕｍａｎ ｍｉｌｋ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ａｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｄｉａｒｒｈｅａ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ－ｆｅｄ ｉｎｆａｎｔｓ．Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ １４５（３）２９７－３０３

【文献】Ｍｉｙａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．４８０，５１１－５２４

【文献】Ｍｕｒａｔａ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．１６，１８９－１９５

【文献】Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，（２０１３）Ｍｉｃｒｏｂ．Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ．１２，４０

【文献】Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｍｉｃｒｏｂ．Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ．１１，４８

【文献】Ａｌｂｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３３４（２）ｐ９７－１０３

【文献】Ｃａｓｔａｎｙｓ－Ｍｕｎｚｏ，Ｅ．，Ｍａｒｔｉｎ，Ｊ．Ｍ＆Ｐｒｉｅｔｏ，Ｐ．Ａ．（２０１３）２’－ｆｕｃｏｓｙｌｌａｃｔｏｓｅ：ａｎ ａｂｕｎｄａｎｔ，ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｓｏｌｕｂｌｅ ｇｌｙｃａｎ ｐｒｅｓｅｎｔ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｍｉｌｋ．Ｎｕｔｒ．Ｒｅｖ．７１（１２）７７３－７８９

【文献】Ｓａｒｎｅｙ Ｄ．Ｂ，Ｈａｌｅ，Ｃ．，Ｆｒａｎｋｅｌ，Ｇ＆Ｖｕｌｆｓｏｎ，Ｅ．Ｎ．（２０００）Ａ ｎｏｖｅｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｅ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｆｒｏｍ ｍｉｌｋ ｕｓｉｎｇ ａ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｎｄ ｎａｎｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ ６９，４６１－４６７

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0017】

この先行技術から始まり、技術的課題は、中性ＨＭＯｓを大量に、高純度で、そして優れた収量で得るための新規なプロセスを提供することである。

【0018】

技術的課題は、請求項１に記載のプロセス、請求項１５に記載のヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）および請求項１９に記載のＨＭＯの使用によって解決される。従属クレームは有利な実施形態を示す。

【課題を解決するための手段】

【0019】

本発明は、中性ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）を微生物発酵によって得られる発酵ブロスからバッチ式または連続式で精製するためのプロセスを提供する。ここでは、中性ＨＭＯを８０％以上の純度で含む精製された溶液が提供される。発酵ブロスは、中性ＨＭＯ、バイオマス、培地成分および混入物を含む。発酵ブロス中の中性ＨＭＯの純度は８０％未満である。

【0020】

プロセスの間、発酵ブロスは、以下の精製ステップに適用される：
ｉ）バイオマスの発酵ブロスからの分離、
ｉｉ）正帯電物質の除去のための陽イオン交換体処理、
ｉｉｉ）負帯電物質の除去のための陰イオン交換体処理、
ｉｖ）ナノフィルトレーションステップ（中性ＨＭＯの濃縮および／またはダイアフィルトレーションを含むかまたはそれからなる）および／または電気透析ステップ（特に塩およびその他の低分子量化合物の除去のため）。

【0021】

無細胞発酵ブロス中に存在する混入物は、例えば望ましい中性ＨＭＯ以外のオリゴ糖、例えば一価および二価の塩、アミノ酸、ポリペプチド、タンパク質、有機酸、核酸などである。望ましい中性ＨＭＯは、精製溶液中に８０％以上の純度で得ることができる。

【0022】

本出願人は、本発明の精製プロセスによって、微生物発酵から中性ＨＭＯｓの効率的な精製を達成することができ、その精製によりＨＭＯが食品および飼料用途に適した純度で生成されることを見出した。さらに、このプロセスは、クロマトグラフィー分離ステップを必要としないので、費用対効果が高い。さらに、ステップｉｖ）で電気透析ステップまたはナノフィルトレーションステップが実施されようと、両方のステップが連続して実施されようと、８０％以上の純度が達成されることが見出された。

【0023】

本発明によるプロセスの１つの利点は、望ましい中性ＨＭＯｓが、使用した組換え微生物発酵菌株からＤＮＡおよびタンパク質を含まずに得られることである。特に、陽イオン交換体処理（ステップｉｉ）の実施は、例えば、正帯電タンパク質などの正帯電物質の除去を可能にする。従って、本発明の方法は、陽イオン交換体処理を実行しない先行技術で公知の従来の精製スキームと比較して、少ない正帯電混入物質を含むＨＭＯを提供する。バイオマスから（好ましくは限外濾過によって）分離した発酵ブロスを陽イオン交換体（プロトン形態）に通した後に、得られる溶液は安定していて、室温または冷却下で数週間貯蔵することができ得ることがさらに見出された。さらに、最大５０の増幅サイクルでの定量的ＰＣＲによって判断されるように、得られる中性ＨＭＯは組換え物質を含まない。さらに、本発明によるプロセスから得られる生成物は、少量のタンパク質またはタンパク質が存在しないことを特徴とする。

【0024】

さらに、本発明による中性ＨＭＯの精製は、非常に効率的であり、精製されたＨＭＯの収量は未知の７０％より多い（場合により７５％より多い）（ＨＭＯ濃縮物に対する無細胞発酵培地から求める）。

【0025】

従って、組換え発酵菌株を用いる発酵プロセスから、組換え遺伝子材料、エンドトキシンおよびタンパク質を含まない、高純度の中性ＨＭＯｓを効率的に提供するための、バイオマスを分離するステップ、イオン交換体のステップ、ならびにナノフィルトレーションおよび／または電気透析のステップを含み、好ましくは活性炭素処理をさらに含むハイブリッドプロセスが提供される。本発明によるプロセスによって、大量の高品質のヒトミルクオリゴ糖を非常に簡便かつ経済的に提供することができる。

【0026】

中性ＨＭＯは、組換え微生物、好ましくは細菌または酵母、より好ましくは化学的に明確な培地で増殖した組換え微生物を使用する微生物発酵によって得られる発酵ブロスから精製されてもよい。場合により、ステップｉ）で分離されたバイオマスは、微生物発酵に再利用される。

【0027】

本発明によるプロセスのもう一つの好ましい実施形態では、発酵ブロス中の中性ＨＭＯの純度は、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下または５％以下であり、かつ／または精製された溶液は、８５％以上、好ましくは９０％以上の純度で中性ＨＭＯを含む。

【0028】

本発明によるプロセスのもう一つの好ましい実施形態では、中性ＨＭＯの収量は、７０％より多く（場合により７５％より多く）、かつ／または精製された溶液は、ＤＮＡ、タンパク質、および／または組換え遺伝子材料を含まない。

【0029】

本発明によるプロセスのもう一つの好ましい実施形態では、中性ＨＭＯは、２’－フコシルラクトース、３－フコシルラクトース、２’，３－ジフコシルラクトース、ラクト－Ｎ－トリオースＩＩ、ラクト－Ｎ－テトラオース、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ、ラクト－Ｎ－ネオフコペンタオース、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩ、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩＩ、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＶ、ラクト－Ｎ－ネオフコペンタオースＶ、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩ、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩＩ、６’－ガラクトシルラクトース、３’－ガラクトシルラクトース、ラクト－Ｎ－ヘキサオースおよびラクト－Ｎ－ネオヘキサオースからなる群から選択される。

【0030】

本発明によるプロセスの特に好ましい実施形態では、中性ＨＭＯは、２’－フコシルラクトースである。

【0031】

本発明によるプロセスのもう一つの好ましい実施形態では、発酵ブロスからのバイオマスの分離は、
ａ）好ましくは、５００ｋＤａよりも大きい、より好ましくは１５０ｋＤａよりも大きいバイオマスおよび物質を分離することによる、限外濾過；および／または
ｂ）好ましくは１００ｋＤａ以下のカットオフを有する、より好ましくは１０ｋＤａ以下のカットオフを有する、さらにより好ましくは５ｋＤａ以下のカットオフを有するクロスフローフィルターによる濾過；
によって実現され、この際、ステップａ）は、ステップｂ）の前に実施されることが好ましい。

【0032】

本発明によるプロセスのもう一つの好ましい実施形態では、本発明のプロセスの精製ステップｉｉ）～ｖ）の少なくとも１つは、プロセス中に少なくとも１回繰り返される。

【0033】

本発明によるプロセスのもう一つの好ましい実施形態では、精製ステップｉ）～ｉｖ）の少なくとも１つの後に、色を与える物質および大型のオリゴ糖を活性炭素に吸着させるための少なくとも１回の活性炭素処理を発酵ブロスに行う。発酵ブロスにこの追加の精製ステップを加えることにより、色を与える物質および大型のオリゴ糖を発酵ブロスから除去することができる。

【0034】

本発明のプロセスは、
ａ）精製ステップｉ）～ｉｖ）の少なくとも１つの後に；または
ｂ）色を与える物質および大型のオリゴ糖活性炭素に吸着させるための少なくとも１回の活性炭素処理の後に；または
ｃ）精製ステップｉ）～ｉｖ）の少なくとも１つの後に実施される濃縮ステップの前に；
中性ヒトミルクオリゴ糖を含む溶液を透析濾過および／または濃縮することを特徴とし得る。好ましくは、前記溶液は、ナノフィルトレーション膜で、より好ましくは２０Å以下のサイズ排除限界を有するナノフィルトレーション膜で透析濾過および／または濃縮される。最も好ましくは、溶液は、導電率が１５ｍＳ／ｃｍ以下、好ましくは１０ｍＳ／ｃｍ以下、より好ましくは５ｍＳ／ｃｍ以下に達するまで透析濾過される。

【0035】

ナノフィルトレーションを用いるダイアフィルトレーションは、ＨＭＯ含有溶液の電気透析処理の前に、かなりの量の混入物を除去する前処理として効果的であることが見出された。その上、ナノフィルトレーションは、限外濾過ステップの後の低分子混入物の除去（前記除去は、ＨＭＯ溶液をイオン交換処理の前に濃縮および脱塩するのに有益である）においても効率的であることが見出された。ヒトミルクオリゴ糖の精製において濃縮およびダイアフィルトレーションのためにナノフィルトレーション膜を使用することにより、より少ないエネルギーおよび加工コスト、ならびに生成物の品質の改良がもたらされる、それは、熱への曝露の減少に起因してメイラード反応およびアルドール反応の減少がもたらされるためである。

【0036】

ステップｉ）の前のステップで、グルコシダーゼ処理、好ましくはβ－グルコシダーゼ処理を発酵ブロスで実施してよく、前記処理は、好ましくは
ａ）望ましくない中間体、基質および／またはオリゴ糖副生成物の分解に適した１以上のグリコシダーゼ酵素類を発現することのできる微生物菌株を添加すること；および／または
ｂ）好ましくは誘導物質を発酵ブロスに添加することにより、かつ／または発酵ブロスの温度を変えることにより、１以上のグリコシダーゼ酵素類を発現する発酵菌株を使用すること；および／または
ｃ）１以上のグリコシダーゼ類、好ましくは少なくともβ－グルコシダーゼを粗酵素として、または精製酵素として発酵ブロスに添加すること
によって実施される。

【0037】

本発明によるプロセスのもう一つの好ましい実施形態では、発酵ブロスは、精製ステップｉ）～ｉｖ）の少なくとも１つの後に、好ましくは精製ステップｉｖ）の後に、真空蒸発または逆浸透またはナノフィルトレーション（例えば、サイズ排除限界が２０Å以下のナノフィルトレーション膜を用いるナノフィルトレーション）を用いて
ａ）１００ｇ／Ｌ以上、好ましくは２００ｇ／Ｌ以上、より好ましくは３００ｇ／Ｌ以上の濃度まで；かつ／または
ｂ）８０℃より低く、好ましくは５０℃より低く、より好ましくは２０℃～５０℃、さらにより好ましくは３０℃～４５℃、最も好ましくは３５℃～４５℃（真空蒸発または逆浸透に特に適切である）の温度で；かつ／または
ｃ）８０℃より低く、好ましくは５０℃より低く、より好ましくは４℃～４０℃の温度（ナノフィルトレーションに特に適切である）で
濃縮される。

【0038】

本発明によるプロセスのもう一つの好ましい実施形態では、精製溶液は滅菌濾過され、かつ／または、好ましくは３ｋＤａのフィルタによる精製溶液の濾過によるエンドトキシン除去に供される。

【0039】

本発明によるプロセスのもう一つの好ましい実施形態では、中性ＨＭＯ含有溶液は、一価および二価の塩などの荷電物質をさらに除去するために電気透析に供される。

【0040】

本発明によるプロセスのもう一つの好ましい実施形態では、精製溶液を１．５Ｍより大きい濃度に濃縮し、温度２５℃未満、より好ましくは８℃未満に冷却して、中性ＨＭＯの結晶性物質が得られる。

【0041】

本発明によるプロセスのもう一つの好ましい実施形態では、精製溶液は噴霧乾燥、特に２０～６０（ｗ／ｖ）、好ましくは３０～５０（ｗ／ｖ）、より好ましくは３５～４５（ｗ／ｖ）の中性ＨＭＯ濃度、１１０～１５０℃、好ましくは１２０～１４０℃、より好ましくは１２５～１３５℃のノズル温度、および／または６０～８０℃、好ましくは６５～７０℃の出口温度で噴霧乾燥される。

【0042】

さらに、本発明には、本発明によるプロセスによって製造できる中性ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）が含まれる。

【0043】

好ましい実施形態では、ＨＭＯは、除菌濾過された濃縮物、例えば、中性ＨＭＯ生成物を３０％（ｗ／ｖ）以上、より好ましくは４０％（ｗ／ｖ）以上で含有する無菌濃縮物中に存在する。

【0044】

もう一つの好ましい実施形態では、ＨＭＯは、噴霧乾燥または結晶化されている。

【0045】

もう一つの好ましい実施形態では、ＨＭＯは、２’－フコシルラクトース、３－フコシルラクトース、２’，３－ジフコシルラクトース、ラクト－Ｎ－トリオースＩＩ、ラクト－Ｎ－テトラオース、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ、ラクト－Ｎ－ネオフコペンタオース、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩ、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩＩ、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＶ、ラクト－Ｎ－ネオフコペンタオースＶ、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩ、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩＩ、６’－ガラクトシルラクトース、３’－ガラクトシルラクトース、ラクト－Ｎ－ヘキサオースおよびラクト－Ｎ－ネオヘキサオースからなる群から選択される。

【0046】

特に好ましい実施形態では、ＨＭＯは、２’－フコシルラクトースである。

【0047】

もう一つの好ましい実施形態では、ＨＭＯは、
ａ）３００ｇ／ｌ溶液で１ｍＳｉ／ｃｍ未満の導電率を有し；
ｂ）組換えＤＮＡ物質、場合によりＤＮＡを含まず；かつ／または
ｃ）組換え微生物由来のタンパク質、所望によりタンパク質を含まない。

【0048】

もう一つの好ましい実施形態は、医薬、好ましくは胃腸障害の予防または治療で使用するためのＨＭＯに関する。

【0049】

さらに、本発明には、食品中の添加剤としての、好ましくは人間の食品および／またはペットフード中の添加剤としての、より好ましくは人間のベビーフード中の添加剤としての、本発明によるＨＭＯの使用が含まれる。

【0050】

本願の主題は、特定の実施形態に制限されることはなく、以降の図および実施例を参照してより詳細に説明される。

【図面の簡単な説明】

【0051】

【図1】限外濾過、陽イオンおよび陰イオン交換体処理、活性炭素処理、ナノフィルトレーション、電気透析および濃縮のステップを含む、発酵ブロスから２’－フコシルラクトースを精製するための本発明によるプロセスの好ましい実施形態のスキームを示す。

【図2】限外濾過、ナノフィルトレーション、陽イオンおよび陰イオン交換体処理、活性炭素処理、電気透析および濃縮のステップを含む、発酵ブロスから２’－フコシルラクトースを精製するための本発明によるプロセスの別の好ましい実施形態のスキームを示す。

【図3】限外濾過、陽イオンおよび陰イオン交換体処理、ナノフィルトレーション、活性炭素処理、電気透析および濃縮のステップを含む、発酵ブロスから２’－フコシルラクトースを精製するための本発明によるプロセスの別の好ましい実施形態のスキームを示す。

【発明を実施するための形態】

【実施例1】

【0052】

実施例１：組換え微生物産生菌Ｉを用いる発酵からの２’－フコシルラクトースの精製。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株（大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｌａｃＺ）を合成する組換え２’－フコシルラクトースを用い、ｗｂｇＬ遺伝子によりコード化されるゲノム組込み２’－フコシルトランスフェラーゼ（ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）（欧州特許第１１１１５１５７１．４号参照）を含有し、かつ、遺伝子ｇａｌＭ、ｇａｌＫ、ｇａｌＴおよびｇａｌＥを含む機能性ｇａｌオペロンを含有する大腸菌ｌａｃＹ、ｍａｎＢ、ｍａｎＣ、ｇｍｄおよびｆｃｌのさらなるコピーを全て強い構成的テトラサイクリンプロモーターの制御下で有する、２’－フコシルラクトースのフィードバッチ発酵（ｆｅｅｄ－ｂａｔｃｈ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を、限定された塩培地で増殖させた。限定された塩培地は、７ｇ ｌ^－１ＮＨ_４Ｈ_３ＰＯ_４、７ｇ ｌ^－１Ｋ_２ＨＰＯ_４、２ｇ ｌ^－１ＫＯＨ、０．３７ｇ ｌ^－１クエン酸、１ｍｌ ｌ^－１消泡剤（Ｓｔｒｕｋｔｏｌ Ｊ６７３、Ｓｃｈｉｌｌ＋Ｓｅｉｌａｃｈｅｒ社製）、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、４ｍＭ ＭｇＳＯ_４、微量元素および炭素源としての２％グリセロールからなった。

【0053】

微量元素は、０．１０１ｇ ｌ^－１ニトリロ三酢酸、ｐＨ６．５、０．０５６ｇ ｌ^－１クエン酸鉄アンモニウム、０．０１ｇ ｌ^－１ＭｎＣｌ_２×４Ｈ_２Ｏ、０．００２ｇ ｌ^－１ＣｏＣｌ_２×６Ｈ_２Ｏ、０．００１ｇ ｌ^－１ＣｕＣｌ_２×２Ｈ_２Ｏ、０．００２ｇ ｌ^－１ホウ酸、０．００９ｇ ｌ^－１ＺｎＳＯ_４×７Ｈ_２Ｏ、０．００１ｇ ｌ^－１Ｎａ_２ＭｏＯ_４×２Ｈ_２Ｏ、０．００２ｇ ｌ^－１Ｎａ_２ＳｅＯ_３、０．００２ｇ ｌ^－１ＮｉＳＯ_４×６Ｈ_２Ｏで構成された。

【0054】

グリセロール供給材料は、グリセロール８００ｇ ｌ^－１、ＭｇＳＯ_４２．６４ｇ ｌ^－１および微量元素溶液４ｍｌ ｌ^－１からなった。２’－フコシルラクトース形成には、２１６ｇ ｌ^－１のラクトース供給材料を用いた。ｐＨはアンモニア溶液（２５％ ｖ／ｖ）を使用して制御した。フィードバッチ発酵（Ｆｅｅｄ ｂａｔｃｈ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を、一定の通気および撹拌下で９０時間、３０℃で培養した。発酵の開始から９０時間後、添加したラクトースの大部分は２’－フコシルラクトースに変換された。発酵上清になお存在するラクトースを除去するために、発酵の開始から９０時間後に、第２の細菌株を発酵容器に添加した。

【0055】

添加した第２の細菌株は、最初に用いた細菌株と遺伝的に同一であったが、ゲノムを統合したβ－ガラクトシダーゼの発現だけが異なった。添加した二次細菌株をインキュベートすると、５時間以内に残留ラクトースが消失した。約１０ｍｌの、第２のβ－ガラクトシダーゼ発現細菌株の種菌を、発酵ブロス１ｌごとに添加した。

【0056】

次に、１０ｋＤａのカットオフを有するクロスフローフィルターを使用して、発酵培地から限外濾過によってバイオマスを分離した（Ｍｉｃｒｏｄｙｎ Ｎａｒｄｉｒ）。

【0057】

４２ｇ／ｌの２’－フコシルラクトースを含有する約１ｍ^３の無細胞発酵培地を得た。次に、正帯電混入物を除去するために、無細胞発酵培地を強力な陽イオン交換体に通した（Ｈ^＋形態のＬｅｗａｔｉｔ Ｓ ６３６８Ａ（Ｌａｎｘｅｓｓ）、イオン交換体の床体積の大きさは１００ｌであった）。次に、２Ｍ水酸化ナトリウム溶液を添加して、得られた溶液をｐＨ７に調整した。

【0058】

次に、溶液を（遅滞なく）陰イオン交換体カラムに通した（イオン交換体の床体積は１００ｌであった）。使用した強力な陰イオン交換体Ｌｅｗａｔｉｔ Ｓ ２５６８（Ｌａｎｘｅｓｓ）は塩化物イオン（Ｃｌ^－）形態であった。得られた溶液を再びｐＨ７に中和させた。次に、このようにして得た溶液を、Ａｌｆａ－Ｌａｖａｌ ＮＦ９９ＨＦナノフィルトレーション膜および６容積の無菌の脱イオン水を用いてダイアフィルトレーションした。この溶液をナノフィルトレーション膜を用いてさらに濃縮し、２００ｇ／ｌの２’－フコシルラクトース溶液および７ｍＳ／ｃｍの導電率が得られた。

【0059】

次に、メイラード反応生成物およびアルドール反応生成物などの色を与える物質を取り除くために、濃縮した２’－フコシルラクトース溶液を活性炭素で処理した。活性炭素として、１ｌの濃縮２’－フコシルラクトース溶液あたり２０ｇのＮｏｒｉｔ ＧＡＣ ＥＮを使用し、著しく脱色された溶液を得た。

【0060】

このようにして得た濃縮２’－フコシルラクトース溶液を、次に、ＰＣ－Ｃｅｌｌ Ｅ２００膜スタックを装備したＰＣ－Ｃｅｌｌ ＢＥＤ １－３電気透析装置（ＰＣ－Ｃｅｌｌ、ドイツ、ホイスヴァイラー）を用いて０．３ｍＳ／ｃｍまで電気透析した。前記スタックは以下の膜を含んでいた：陽イオン交換膜ＣＥＭ：ＰＣ ＳＫおよび６０Ｄａのサイズ排除限界を有する陰イオン交換膜ＡＥＭ：ＰｃＡｃｉｄ６０。０．０２５Ｍスルファミン酸（アミドスルホン酸）溶液をＥＤ法の電解質として使用した。

【0061】

その後、得られた溶液を次に４０℃で真空濃縮して４５％の２’－フコシルラクトース溶液を得た。濃縮した溶液を次にＮａ^＋形態のイオン交換体、Ｌｅｗａｔｉｔ Ｓ ６３６８ Ａ（Ｌａｎｘｅｓｓ）（使用したイオン交換体の床体積は１０リットルであった）で再び処理し、中和後にＣｌ^－形態の陰イオン交換体Ｌｅｗａｔｉｔ Ｓ ２５６８（Ｌａｎｘｅｓｓ）（用いたイオン交換体の床体積は１０リットルであった）で処理した。

【0062】

次に、得られた２’－フコシルラクトース溶液を活性炭素（Ｎｏｒｉｔ ＤＸ１ Ｕｌｔｒａ）で処理した。１ｌの４５％２’－フコシルラクトース溶液に対して３０ｇの活性炭素を用いた。

【0063】

次に、溶液を、０．３ｍＳｉ／ｃｍ未満の導電率が得られるまで再び電気透析に供した。

【0064】

その後、溶液を３ｋＤａフィルタ（Ｐａｌｌ Ｍｉｃｒｏｚａ限外濾過用ホローファイバーモジュールＳＥＰ－２０１３、Ｐａｌｌ社、ドライアイヒ）に通すことによって溶液を除菌濾過に供した。

【0065】

次に、得られた２’－フコシルラクトース溶液の一部を分析用に噴霧乾燥させた。

【0066】

ＮＭＲスペクトル記録のために、噴霧乾燥した生成物をヘキサジューテロジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ－ｄ_６）に溶解させた。プロトンおよび^１３Ｃ分析のために、以下の特徴的な化学シフトが観察された：

【0067】

^１Ｈ ＮＭＲ（５００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ ６．６３（ｄ，Ｊ＝６．５ Ｈｚ，１Ｈ），６．２８（ｄ，Ｊ＝４．７ Ｈｚ，１Ｈ），５．２１（ｄ，Ｊ＝２．４ Ｈｚ，１Ｈ），５．１９（ｄ，Ｊ＝２．４ Ｈｚ，１Ｈ），５．０１（ｄ，Ｊ＝２．２，２Ｈ），４．９２（ｄ，Ｊ＝５．０ Ｈｚ，１Ｈ），４．８９（ｄｄ，Ｊ＝４．６，１．３ Ｈｚ，２Ｈ），４．７８（ｄ，Ｊ＝５．３ Ｈｚ，１Ｈ），４．７４（ｄ，Ｊ＝５．１ Ｈｚ，１Ｈ），４．６３（ｍ，６Ｈ），４．５３（ｔ，ｄ，Ｊ＝５．５，１Ｈ），４．４６（ｄ，Ｊ＝５．２ Ｈｚ，１Ｈ），４．４４（ｄ，Ｊ＝５．０ Ｈｚ，１Ｈ），４．３８－４．２６（ｍ，５Ｈ），４．２３（ｄ，Ｊ＝０．９，１Ｈ），４．０５（ｄ，Ｊ＝０．９，１Ｈ），４．００（ｑｕｉｎ，Ｊ＝３．３，１Ｈ），３．６８－３．６０（ｍ，７Ｈ），３．５９－３．５０（ｍ，１３Ｈ），３．５０－３．３７（ｍ，６Ｈ），３．２４（ｄｔ，Ｊ＝８．８，２．２ Ｈｚ，１Ｈ），３．１４（ｍ，２Ｈ），２．９６（ｔｄ，Ｊ＝８．４，４．７ Ｈｚ，１Ｈ），１．０４（ｄ，Ｊ＝６．１ Ｈｚ，３Ｈ），１．０３（ｄ，Ｊ＝６．１ Ｈｚ，３Ｈ）．

【0068】

^１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ_６）δ １００．９９，１００．８５，１００．３５，１００．２５，９６．５９，９２．０２，７８．１３，７７．７８，７７．１６，７７．０１，７５．２７ ７５．０５，７４．６７，７３．７０，７２．３３，７１．６２，７１．５６，７０．９１，６９．９０，６９．６４，６８．７５，６８．１６，６６．３３，６０．１７，５９．８２，５９．６７，１６．３７，１６．３６．

【0069】

化学シフトは、２’－フコシルラクトース構造と一致していることが見出された。

【0070】

このプロトコルを用いて、純度が９４．５％の４５％の２’－フコシルラクトース濃縮物を得ることができた（ＨＰＬＣ分析により決定）。主な混入物は、３’－フコシルラクトース（１．８％）、ジフコシルラクトース（２．９％）、およびラクトース（０．３％）であった。

【0071】

精製収量は約７０％であった。

【0072】

重要なことに、組換え物質は、５０サイクルのｑＰＣＲを用いて１０ｇの凍結物質中に定量することができなかった。得られた物質中のタンパク質の量は、ナノ－ブラッドフォードアッセイ（Ｒｏｔｈ、ドイツ、カールスルーエ）を用いることによって、凍結乾燥物質１ｇあたり５０μｇ未満として定量された。灰の総量は、０．１９％で測定された。重金属の濃度は、０．１μｇ／物質ｇよりも低かった（ヒ素カドミウム、鉛および水銀）。エンドトキシンレベルは、２’－フコシルラクトース濃縮物１ｍｌあたり０．００５ＥＵ未満であると決定された。

【実施例2】

【0073】

実施例２：組換え微生物産生菌ＩＩを用いる発酵からの２’－フコシルラクトースの精製。

【0074】

２’－フコシルラクトースを４７ｇ／Ｌの濃度で含む１ｍ^３の微生物発酵を、１００ｋＤａのカットオフを有するクロスフローフィルター（Ｍｉｃｒｏｄｙｎ Ｎａｄｉｒ）によって濾過して、無細胞の発酵培地を得た。

【0075】

発酵培地として、以下の培地を用いた：主な培地成分：グリセロール ３０ｇ／ｌ、ＮＨ_４Ｈ_２ＰＯ_４ ７ｇ／ｌ、Ｋ_２ＨＰＯ_４ ７ｇ／ｌ、クエン酸塩 ０．３ｇ／ｌ、ＫＯＨ ２ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ２ｇ／ｌ；微量元素：ＣａＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ ２０ｍｇ／ｌ、ニトリロ三酢酸 １０１ｍｇ／ｌ、クエン酸鉄アンモニウム ５６ｍｇ／ｌ、ＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ ９．８ｍｇ／ｌ、ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ １．６ ｍｇ／ｌ、ＣｕＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ １ｍｇ／ｌ、Ｈ_３ＢＯ_３ １．６ｍｇ／ｌ、ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ９ｍｇ／ｌ、Ｎａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ １．２ｍｇ／ｌ、Ｎａ_２ＳｅＯ_３ １．２ｍｇ／ｌ；供給物質：グリセロールおよびラクトース。

【0076】

次に、正帯電混入物を除去するために、無細胞発酵培地をＨ^＋形態の陽イオン交換体（Ｌｅｗａｔｉｔ Ｓ ６３６８Ａ（Ｌａｎｘｅｓｓ））に通した（イオン交換体床の体積は１００ｌであった）。次に、２Ｍ水酸化ナトリウム溶液を添加して、得られた溶液をｐＨ７に調整した。次に、溶液を遅滞なく塩化物イオン（ｃｌｏｒｉｄｅ）（Ｃｌ^－）形態の強力な陰イオン交換体Ｌｅｗａｔｉｔ Ｓ ２５６８（Ｌａｎｘｅｓｓ）を含む陰イオン交換体カラム（使用したイオン交換体床体積は１００ｌであった）に通した。得られた溶液を再びｐＨ７に中和させた。そのように得られた溶液を次にダイアフィルトレーションし（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｅｄ）（１０容量の滅菌脱イオン水を使用）、ナノフィルトレーション膜（Ａｌｆａ－Ｌａｖａｌ ＮＦ９９ＨＦ）を用いて濃縮して、２’－フコシルラクトース溶液２００ｇ／ｌおよび約７ｍＳｉ／ｃｍの導電率を得た。

【0077】

次に、１ｌの濃縮２’－フコシルラクトース溶液につき２０ｇのＮｏｒｉｔ ＧＡＣＥＮを使用して、濃縮２’－フコシルラクトース溶液を活性炭素で処理した。濾過した２’－フコシルラクトース溶液に、４０ｇ／ｌのＮｏｒｉｔ ＤＸ１ Ｕｌｔｒａ活性炭素を添加した。次に、溶液を４℃で約１８時間、活性炭素に曝した。１８時間後、活性炭素を濾過によって２’－フコシルラクトース溶液から除去した。

【0078】

次に、溶液を、ＰＣ－Ｃｅｌｌ Ｅ２００膜スタックを装備したＰＣ－Ｃｅｌｌ ＢＥＤ １－３電気透析装置（ＰＣ－Ｃｅｌｌ、ドイツ、ホイスヴァイラー）を用いて０．３ｍＳ／ｃｍ未満の導電率まで電気透析した。前記スタックは以下の膜を含んでいた：陽イオン交換膜ＣＥＭ：ＰＣ ＳＫおよび６０Ｄａのサイズ排除限界を有する陰イオン交換膜ＡＥＭ：ＰｃＡｃｉｄ６０。０．０２５Ｍスルファミン酸（アミドスルホン酸）溶液をＥＤ法の電解質として使用した。

【0079】

次に、得られた溶液を濃縮して４０％の２’－フコシルラクトース溶液を得た。次に、得られた２’－フコシルラクトース溶液をＬｅｗａｔｉｔ Ｓ ２５６８（Ｌａｎｘｅｓｓ）Ｃｌ^－型（床体積１０リットル）に通し、活性炭素（Ｎｏｒｉｔ ＤＸ１ Ｕｌｔｒａ）で８℃で１８時間処理した。次に、溶液を３ｋＤａフィルタ（Ｐａｌｌ Ｍｉｃｒｏｚａ限外濾過用ホローファイバーモジュールＳＥＰ－２０１３、Ｐａｌｌ社、ドライアイヒ）に通すことによって溶液を除菌濾過に供し、ＮＵＢＩＬＯＳＡ ＬＴＣ－ＧＭＰ噴霧乾燥器（ＮＵＢＩＬＯＳＡ、ドイツ、コンスタンツ）を用いて噴霧乾燥させた。

【0080】

このプロトコルを用いて、純度が９４％の２’－フコシルラクトースを得ることができた（ＨＰＬＣ分析により決定）。主な混入物は、３’－フコシルラクトース（１．８％）、ジフコシルラクトース（３．２％）、およびラクトース（０．２％）であった。精製収量は約７０％であった。

【図1】

【図2】

【図3】