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特許7002077クズの花から分離した酵母の取得方法、クズの花から分離した酵母、この酵母を用いた清酒の製造方法及びその他の飲食物の製造方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-01-04
(45)【発行日】2022-02-04
(54)【発明の名称】クズの花から分離した酵母の取得方法、クズの花から分離した酵母、この酵母を用いた清酒の製造方法及びその他の飲食物の製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 1/16 20060101AFI20220128BHJP
A23L 5/00 20160101ALI20220128BHJP
A23L 31/10 20160101ALI20220128BHJP
C12G 3/022 20190101ALI20220128BHJP
A21D 8/04 20060101ALN20220128BHJP
C12N 1/18 20060101ALN20220128BHJP
【ＦＩ】
C12N1/16 B ZNA
C12N1/16 G
A23L5/00 J
A23L31/10
C12G3/022 119G
A21D8/04
C12N1/18
【請求項の数】
6
(21)【出願番号】P 2018004857
(22)【出願日】2018-01-16
(65)【公開番号】P2019122295
(43)【公開日】2019-07-25
【審査請求日】2020-06-17
【微生物の受託番号】NPMD NITE P-02600
(73)【特許権者】
【識別番号】398055037
【氏名又は名称】株式会社井上天極堂
(73)【特許権者】
【識別番号】000225142
【氏名又は名称】奈良県
(74)【代理人】
【識別番号】100104569
【弁理士】
【氏名又は名称】大西 正夫
(72)【発明者】
【氏名】藤野 布久代
(72)【発明者】
【氏名】西尾 実紗
(72)【発明者】
【氏名】都築 正男
【審査官】山本 晋也
(56)【参考文献】
【文献】西海酒造株式会社、清酒『空の鶴』葛の花 葛酒：製品紹介、２０１７年３月２２日、［検索日：２０２１年５月１２日］、インターネット 〈URL:https://web.archive.org/web/20170322150618/http://www.soranotsuru.com/product/kuzushu.html〉，2017年03月22日
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／１６
Ｃ１２Ｇ ３／０２２
Ａ２３Ｌ ３１／１０
Ａ２３Ｌ ５／００
Ａ２１Ｄ ８／０４
Ｃ１２Ｎ １／１８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
クズの花より採取された酵母を、麹汁液体培地（Ｂｒｉｘ５～１５、ｐＨ３以上５以下）を使用して２５～３７℃で増殖させ、次に５０～１５００ｐｐｍの抗生物質及び５～１０容積％のアルコールを添加した麹汁液体培地を使用して、１０～３７℃で培養し、生育旺盛で１０容積％以上のアルコール生産性を示すサッカロマイセスセレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）クズノハナ酵母（特許微生物寄託センター受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０２６００）株を選択することを特徴とするクズの花から分離した酵母の取得方法。
【請求項2】
前記抗生物質は、クロラムフェニコールであることを特徴とする請求項１記載のクズの花から分離した酵母の取得方法。
【請求項3】
クズの花より採取された酵母を、麹汁液体培地（Ｂｒｉｘ５～１５、ｐＨ３以上５以下）を使用して２５～３７℃で増殖させ、５０～１５００ｐｐｍの抗生物質及び５～１０容積％のアルコールを添加した麹汁液体培地を使用して、１０～３７℃で培養し、生育旺盛で１０容積％以上のアルコール生産性を示す酵母を選択することによって、クズの花から分離された酵母から選択され、そしてリンゴ酸、コハク酸の生産が多く、且つ、アルコール生産能が１７容積％以下で、フルーティーな香気を有する清酒を製造することができることを特徴とする酵母サッカロマイセスセレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）クズノハナ酵母（特許微生物寄託センター受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０２６００）株。
【請求項4】
前記抗生物質は、クロラムフェニコールであることを特徴とする請求項３記載の酵母サッカロマイセスセレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）クズノハナ酵母（特許微生物寄託センター受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０２６００）株。
【請求項5】
請求項３又は４に記載された酵母を用いて醸造することを特徴とする清酒の製造方法。
【請求項6】
請求項３又は４に記載された酵母を用いることを特徴とする飲食物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、マメ科クズ属のつる性の多年草であるクズ（葛、学名：Ｐｕｅｒａｒｉａ ｍｏｎｔａｎａ ｖａｒ．ｌｏｂａｔａ）の花から分離した酵母、その取得方法、その酵母を用いた清酒の製造方法及びその酵母を用いた他の飲食物の製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
クズ（葛）はマメ科のつる性植物で、その根は葛根湯などの漢方薬の原料や吉野葛で知られた葛でんぷんの原料として広く用いられている。また、葛の花は二日酔いの予防なども目的とした漢方薬の原料として、蔓は葛布や工芸品として、葉は家畜の飼料として古来より広く用いられている。このように古くから利用されてきた葛ではあるが、その知名度は決して高いとは言えない。
出願人である株式会社井上天極堂は１８７０年創業の葛の老舗として長く吉野葛の普及に努めてきたところであり、さらなる葛の利用、知名度の向上を目指して葛を利用した清酒づくりに取り組むこととした。
また、奈良県は良質な葛粉の生産地としても知られており、かねてよりクズの幅広い利用、知名度の向上に取り組んでいた。
出願人である株式会社井上天極堂は１８７０年創業の葛の老舗として長く吉野葛の普及に努めてきたところであり、さらなる葛の利用、知名度の向上を目指して葛を利用した清酒づくりに取り組むこととした。
また、奈良県は良質な葛粉の生産地としても知られており、かねてよりクズの幅広い利用、知名度の向上に取り組んでいた。
【0003】
植物から分離した清酒用酵母としては、２００９年に奈良県産業振興総合センターが国立大学法人奈良女子大学と共同研究で、奈良公園内のヤエザクラから分離された低アルコール酒用酵母「奈良八重桜酵母」がある（特許文献１、非特許文献１参照）。
また、２０１５年には奈良県産業振興総合センターが奈良県桜井市の大神神社境内のササユリからリンゴ酸を多く含む清酒を醸造できる酵母を分離している（特許文献２、非特許文献２参照）。
また、２０１５年には奈良県産業振興総合センターが奈良県桜井市の大神神社境内のササユリからリンゴ酸を多く含む清酒を醸造できる酵母を分離している（特許文献２、非特許文献２参照）。
【0004】
【文献】特許第４６０１０１５号公報
【文献】特許第６１７５６９７号公報
【文献】大橋正孝、都築正男、清水浩美、松澤一幸、藤野千代、鈴木孝仁、岩口伸一；奈良県工業技術センター研究報告、（３５）、３５－３８、２００９
【文献】都築正男、大橋正孝、清水浩美；奈良県産業振興総合センター研究報告、（４１）、５－１１、２０１５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
しかしながら、クズから分離した酵母やそれを用いた清酒の製造方法については知られていない。古来より知られている葛粉や葛根湯、葛布等以外の新たな利用法を開発することでよりクズの利用、知名度の向上を図ることとする。
【0006】
本発明は、上記事情に鑑みて創案されたもので、クズの花から分離した酵母、それを用いた清酒の製造方法等を開発することでクズの利用、知名度の向上を図ることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明に係るクズの花から分離した酵母の取得方法は、クズの花より採取された酵母を、麹汁液体培地（Ｂｒｉｘ５～１５、ｐＨ３以上５以下）を使用して２５～３７℃で増殖させ、次に５０～１５００ｐｐｍの抗生物質及び５～１０容積％のアルコールを添加した麹汁液体培地を使用して、１０～３７℃で培養し、生育旺盛で１０容積％以上のアルコール生産性を示すサッカロマイセスセレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）クズノハナ酵母（特許微生物寄託センター受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０２６００）株を選択する。
【0008】
また、前記抗生物質としては、クロラムフェニコールが好適である。
【0009】
本発明に係る酵母は、クズの花より採取された酵母を、麹汁液体培地（Ｂｒｉｘ５～１５、ｐＨ３以上５以下）を使用して２５～３７℃で増殖させ、５０～１５００ｐｐｍの抗生物質及び５～１０容積％のアルコールを添加した麹汁液体培地を使用して、１０～３７℃で培養し、生育旺盛で１０容積％以上のアルコール生産性を示す酵母を選択することによって、クズの花から分離された酵母から選択され、そしてリンゴ酸、コハク酸の生産が多く、且つ、アルコール生産能が１７容積％以下で、フルーティーな香気を有する清酒を製造することができることを特徴とする酵母サッカロマイセスセレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）クズノハナ酵母（特許微生物寄託センター受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０２６００）株である。
【0010】
また、前記抗生物質としては、クロラムフェニコールが好適である。
【0011】
本発明に係る清酒の製造方法は、前記酵母サッカロマイセスセレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）クズノハナ酵母（特許微生物寄託センター受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０２６００）株を用いて行われる。
【0012】
本発明に係る飲食物の製造方法は、前記酵母サッカロマイセスセレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）クズノハナ酵母（特許微生物寄託センター受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０２６００）株を用いて行われる。
【発明の効果】
【0013】
本発明に係るクズの花から分離した酵母の取得方法は、クズの花より採取された酵母を、麹汁液体培地（Ｂｒｉｘ５～１５、ｐＨ３以上５以下）を使用して２５～３７℃で増殖させ、次に５０～１５００ｐｐｍの抗生物質及び５～１０容積％のアルコールを添加した麹汁液体培地を使用して、１０～３７℃で培養し、生育旺盛で１０容積％以上のアルコール生産性を示すサッカロマイセスセレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）クズノハナ酵母（特許微生物寄託センター受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０２６００）株を選択する。
【0014】
また、本発明に係る酵母は、クズの花より採取された酵母を、麹汁液体培地（Ｂｒｉｘ５～１５、ｐＨ３以上５以下）を使用して２５～３７℃で増殖させ、５０～１５００ｐｐｍの抗生物質及び５～１０容積％のアルコールを添加した麹汁液体培地を使用して、１０～３７℃で培養し、生育旺盛で１０容積％以上のアルコール生産性を示す酵母を選択することによって、クズの花から分離された酵母から選択され、そしてリンゴ酸、コハク酸の生産が多く、且つ、アルコール生産能が１７容積％以下で、フルーティーな香気を有する清酒を製造することができることを特徴とする酵母サッカロマイセスセレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）クズノハナ酵母（特許微生物寄託センター受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０２６００）株である。
【0015】
本発明に係る清酒の製造方法は、前記酵母サッカロマイセスセレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）クズノハナ酵母（特許微生物寄託センター受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０２６００）株を用いて行われる。
【0016】
本発明に係る飲食物の製造方法は、前記酵母サッカロマイセスセレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）クズノハナ酵母（特許微生物寄託センター受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０２６００）株を用いて行われる。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】ＤＮＡ分子量マーカー、クズノハナ酵母、協会酵母Ｋ７０１、協会酵母Ｋ９０１のＡＷＡ１遺伝子及びＹＬＲＷｄｅｌｔａ２０の領域をＰＣＲで増幅したものをアガロースゲル電気泳動した写真図である。レーンＭはＤＮＡ分子量マーカー、レーン１はクズノハナ酵母のＡＷＡ１遺伝子、レーン２は協会酵母Ｋ７０１のＡＷＡ１遺伝子、レーン３は協会酵母Ｋ９０１のＡＷＡ１遺伝子、レーン４はクズノハナ酵母のＹＬＲＷｄｅｌｔａ２０、レーン５は協会酵母Ｋ７０１のＹＬＲＷｄｅｌｔａ２０、レーン６は協会酵母Ｋ９０１のＹＬＲＷｄｅｌｔａ２０をそれぞれ示している。
【発明を実施するための形態】
【0018】
自然界の花には種々の酵母が付着していることが知られている。そこで、奈良県の特産品でもある『クズ』の花から清酒醸造に適した酵母を分離した。
まず、奈良県の天理市、御所市、橿原市、香芝市、大和郡山市、高取町、明日香村、斑鳩町の各所で『クズ』の花から１４３検体、株式会社井上天極堂の御所市の本社敷地内で栽培している『クズ』の花から３６検体の合計１７９検体を採取した。
なお、本明細書中では、試料番号１～１０１は天理市の山の辺の道及び天理ダム周辺、１０２～１０４は御所市、１０５～１０８は株式会社井上天極堂の橿原工場内、１０９～１１２は高取町、１１３～１１５は明日香村、１１６～１２１は斑鳩町、１２２は香芝市、１２３～１４２は大和郡山市、１－２～１８－２は株式会社井上天極堂の御所本社敷地内でそれぞれ採取したものである。
まず、奈良県の天理市、御所市、橿原市、香芝市、大和郡山市、高取町、明日香村、斑鳩町の各所で『クズ』の花から１４３検体、株式会社井上天極堂の御所市の本社敷地内で栽培している『クズ』の花から３６検体の合計１７９検体を採取した。
なお、本明細書中では、試料番号１～１０１は天理市の山の辺の道及び天理ダム周辺、１０２～１０４は御所市、１０５～１０８は株式会社井上天極堂の橿原工場内、１０９～１１２は高取町、１１３～１１５は明日香村、１１６～１２１は斑鳩町、１２２は香芝市、１２３～１４２は大和郡山市、１－２～１８－２は株式会社井上天極堂の御所本社敷地内でそれぞれ採取したものである。
【0019】
まず、この花房を無菌的に１本の５０ｍｌのチューブに１房ずつ入れ、調製した麹汁液体培地（Ｂｒｉｘ１０、ｐＨ３．５）を注ぎ、３０℃で培養した（集積培養）。
次に、２次培養として、抗生物質であるクロラムフェニコール１００ｐｐｍを添加した麹汁液体培地（Ｂｒｉｘ１０、ｐＨ３．５）を注ぎ、３０℃で培養した。
さらに、３次培養として、クロラムフェニコール１００ｐｐｍ及びアルコールであるエタノールを５容積％を添加した麹汁液体培地（Ｂｒｉｘ１０、ｐＨ３．５）を注ぎ、３０℃で培養した。
次に、２次培養として、抗生物質であるクロラムフェニコール１００ｐｐｍを添加した麹汁液体培地（Ｂｒｉｘ１０、ｐＨ３．５）を注ぎ、３０℃で培養した。
さらに、３次培養として、クロラムフェニコール１００ｐｐｍ及びアルコールであるエタノールを５容積％を添加した麹汁液体培地（Ｂｒｉｘ１０、ｐＨ３．５）を注ぎ、３０℃で培養した。
【0020】
４次培養として、エタノールを５容積％を添加した麹汁液体培地（Ｂｒｉｘ１０、ｐＨ３．５）を注ぎ、１５℃で培養した。
さらに、５次培養として、エタノールを１０容積％を添加した麹汁液体培地（Ｂｒｉｘ１０、ｐＨ３．５）を注ぎ、１５℃で培養した。
さらに、５次培養として、エタノールを１０容積％を添加した麹汁液体培地（Ｂｒｉｘ１０、ｐＨ３．５）を注ぎ、１５℃で培養した。
【0021】
５次培養で発泡した懸濁培養液を、無菌的にＴＴＣ寒天下層培養地に塗布し、育成させたコロニーから白金耳で１株採取し、新たなＴＴＣ寒天下層培養地に塗布させるという工程を１０回繰り返して純化培養を行い、培養した菌体を分離株として保存した。
【0022】
なお、前記麹汁液体培地は、米麹１ｋｇに水３０００ｍｌを加えて５５℃で一晩加熱後ろ過搾汁して得られた麹汁を目標とするＢｒｉｘとなるように水で希釈した後、乳酸でｐＨを調整後、オートクレーブで滅菌し、必要に応じてエタノールを無菌的に添加したものである。
【0023】
上述した培養作業を１７９検体に行った。
最初の集積培養の結果、主に発泡の状況から１７９検体中の８５検体に酵母が存在する可能性があると判断された。
次の１次培養の結果で８５検体中の８０検体、２次培養の結果で８０検体中７７検体、３次培養の結果で７７検体中５０検体、４次培養の結果で５０検体中４４検体、最後の５次培養の結果で４４検体中２０検体の酵母が存在する可能性があると判断された。
その結果を表１に示す。
最初の集積培養の結果、主に発泡の状況から１７９検体中の８５検体に酵母が存在する可能性があると判断された。
次の１次培養の結果で８５検体中の８０検体、２次培養の結果で８０検体中７７検体、３次培養の結果で７７検体中５０検体、４次培養の結果で５０検体中４４検体、最後の５次培養の結果で４４検体中２０検体の酵母が存在する可能性があると判断された。
その結果を表１に示す。
【0024】
なお、明細書中では、検体番号と酵母の番号を一致させる。例として検体番号９５の酵母は、酵母９５と称する如くである。
また、検体番号９５の酵母９５をクズノハナ酵母（特許微生物寄託センター受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０２６００）とも称している。
また、検体番号９５の酵母９５をクズノハナ酵母（特許微生物寄託センター受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０２６００）とも称している。
【0025】
【表1】
【0026】
５次培養まで行って得られた分離株のうち、５次培養において特に発泡性に優れていた１８検体である検体番号２０、２３、３４、４０、４３、５７、６８、７９、８１、９５（クズノハナ酵母）、１１８、１２４、１２８、１２９、１３６、１－２、５－１、１５－１に対して、酵母様真菌同定キットＩＤ３２ＣＡＰＩ（シスメックス・ビオメリュー株式会社製）を用いて種の同定を行った。
この同定では、酵母菌体をサスペンションメディウム２ｍｌに懸濁し、ＩＤ３２ＣＡＰＩに２５０μｌ添加した。そして、この懸濁液をＩＤ３２ＣＡＰＩプレートに接種し、３０℃で４８時間培養した後、プレート上の下記の３１種類の炭素源の資化性パターンからシスメックス・ビオメリュー株式会社の細菌名検索用ソフトウエアであるａｐｉｗｅｂ（アピウェブ）により種を推定した。
この同定では、酵母菌体をサスペンションメディウム２ｍｌに懸濁し、ＩＤ３２ＣＡＰＩに２５０μｌ添加した。そして、この懸濁液をＩＤ３２ＣＡＰＩプレートに接種し、３０℃で４８時間培養した後、プレート上の下記の３１種類の炭素源の資化性パターンからシスメックス・ビオメリュー株式会社の細菌名検索用ソフトウエアであるａｐｉｗｅｂ（アピウェブ）により種を推定した。
【0027】
その結果、検体番号２０、４０、４３、５７、６８、９５（クズノハナ酵母）、１３６、１－２、５－１、１５－１の１０検体がサッカロマイセスセレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であると推定された。
また、検体番号２３、３４、８１、１１８、１２４、１２８、１２９の７試料がカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）であり、検体番号７９がジゴサッカロマイセス属酵母（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｅｓ）であると推定された。
また、検体番号２３、３４、８１、１１８、１２４、１２８、１２９の７試料がカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）であり、検体番号７９がジゴサッカロマイセス属酵母（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｅｓ）であると推定された。
【0028】
なお、上記の３１種類の炭素源は、ガラクトース、シクロヘキシミド、スクロース、Ｎ－アセチルグルコサミン、乳酸、Ｌ－アラビノース、Ｄ－セロビオース、ラフィノース、Ｄ－マルトース、トレハロース、２－ケトグルコン酸カルシウム、α－メチル－α－Ｄ－グルコシド、マンニトール、ラクトース、イノシトール、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－キシロース、Ｄ－リボース、グリセリン、Ｌ－ラムノース、パラチノース、エリスリトール、Ｄ－メリビオース、グルクロン酸ナトリウム、Ｄ－メレチトース、グルコン酸カリウム、レブリン酸、グルコース、Ｌ－ソルボース、Ｄ－グルコサミン塩酸塩、エスクリンである。
【0029】
遺伝子解析による種の同定
真菌の種の推定に用いられる２８ＳｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の塩基配列を用いて種の同定を行った。
ＰＣＲの鋳型は菌体から調製した染色体ＤＮＡを用いた。プライマーはＮＬ１（５’－ＧＣＡＴＡＴＣＡＡＴＡＡＧＣＧＧＡＧＧＡＡＡＡＧ－３’）及びＮＬ４（５’－ＧＧＴＣＣＧＴＧＴＴＣＡＡＧＣＧＧ－３’）を用いた。
ＰＣＲの反応液は、タカラバイオ株式会社製のＥｘＴａｑを０．５μｌ、１０×ＥｘＴａｑｂｕｆｆｅｒを２．５μｌ、ｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍＭｅａｃｈ）を２．５μｌ、プライマー（１０μＭ）を２．５μｌ、ＴｒｉｔｏｎＸ１００を２．５μｌ、鋳型ＤＮＡを１μｌ加え、滅菌水で２５μｌに調製した。
９４℃、３分間でＤＮＡの変性を行った後、９４℃で３０秒（変性）、５２℃で３０秒（アニーリング）、７２℃で１分（伸長）を２５サイクル行った。
アフィメトリックス・ジャパン株式会社製のＥｘｏＳＡＰ－ＩＴで精製したものをシークエンス用試料とし、ユーロフィンジェノミクス株式会社のＤＮＡ受託サービスを利用して塩基配列を解析した。
得られた塩基配列はＢｌａｓｔ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）により相同性検索を行い、酵母の同定を行った。
その結果、ＩＤ３２ＣＡＰＩでＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅと推定された菌株については全てＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅであると、同定された。
真菌の種の推定に用いられる２８ＳｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域の塩基配列を用いて種の同定を行った。
ＰＣＲの鋳型は菌体から調製した染色体ＤＮＡを用いた。プライマーはＮＬ１（５’－ＧＣＡＴＡＴＣＡＡＴＡＡＧＣＧＧＡＧＧＡＡＡＡＧ－３’）及びＮＬ４（５’－ＧＧＴＣＣＧＴＧＴＴＣＡＡＧＣＧＧ－３’）を用いた。
ＰＣＲの反応液は、タカラバイオ株式会社製のＥｘＴａｑを０．５μｌ、１０×ＥｘＴａｑｂｕｆｆｅｒを２．５μｌ、ｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍＭｅａｃｈ）を２．５μｌ、プライマー（１０μＭ）を２．５μｌ、ＴｒｉｔｏｎＸ１００を２．５μｌ、鋳型ＤＮＡを１μｌ加え、滅菌水で２５μｌに調製した。
９４℃、３分間でＤＮＡの変性を行った後、９４℃で３０秒（変性）、５２℃で３０秒（アニーリング）、７２℃で１分（伸長）を２５サイクル行った。
アフィメトリックス・ジャパン株式会社製のＥｘｏＳＡＰ－ＩＴで精製したものをシークエンス用試料とし、ユーロフィンジェノミクス株式会社のＤＮＡ受託サービスを利用して塩基配列を解析した。
得られた塩基配列はＢｌａｓｔ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）により相同性検索を行い、酵母の同定を行った。
その結果、ＩＤ３２ＣＡＰＩでＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅと推定された菌株については全てＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅであると、同定された。
【0030】
ＰＣＲ法による菌株判別
ＩＤ３２ＣＡＰＩによってサッカロマイセスセレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であると推定された菌株が、既知の酵母と異なることを調べるためにＰＣＲ法による菌株判別を行った。
各検体の培養液からＧｅｎとるくん（タカラバイオ株式会社製）を使用して染色体ＤＮＡを調整し、ＴＥ緩衝液４０μｌを加えて溶解した。これを鋳型としてＰＣＲを行った。条件は９０℃で１分（変性）、６０℃で１分（アニーリング）、７５℃で５分（伸長）を３０サイクルである。
ＰＣＲ反応液は、タカラバイオ株式会社製のＥｘＴａｑを０．１２５μｌ、１０×ＥｘＴａｑを２．５μｌ、ｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍＭｅａｃｈ）を２μｌ、プライマー（１０μＭ）を２．５μｌに鋳型ＤＮＡを＜０．５μｇを加え、滅菌水で２０μｌに調製した。
増幅した領域は、長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）の１つであるＹＬＲＷｄｅｌｔａ２０及びＡＷＡ１遺伝子である。
ＹＬＲＷｄｅｌｔａ２０のプライマーは、５' －ＴＣＡＣＧＴＣＡＧＡＡＴＡＧＴＴＴＴＴＧＣＡＴＣＴＡＴＧ－３' 及び５' －ＡＡＡＴＧＧＡＴＧＧＡＴＡＡＴＴＴＧＡＴＡＡＴＴＧＣＴＧＧＧ－３' を用いた。
また、ＡＷＡ１遺伝子のプライマーは、５' －ＡＴＧＴＴＣＡＡＴＣＧＣＴＴＴＡＡＴＡＴＧＡＴＡＡＴＴＧＣＴＧＧＧ－３' 及び５' －ＴＴＡＧＴＴＡＡＡＧＡＡＡＧＣＡＡＧＡＡＣＧＡＡＡＡＴＡＣＣ－３' を用いた。
１％アガロースゲル電気泳動で増幅したＤＮＡ断片の大きさを確認した。
ＩＤ３２ＣＡＰＩによってサッカロマイセスセレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であると推定された菌株が、既知の酵母と異なることを調べるためにＰＣＲ法による菌株判別を行った。
各検体の培養液からＧｅｎとるくん（タカラバイオ株式会社製）を使用して染色体ＤＮＡを調整し、ＴＥ緩衝液４０μｌを加えて溶解した。これを鋳型としてＰＣＲを行った。条件は９０℃で１分（変性）、６０℃で１分（アニーリング）、７５℃で５分（伸長）を３０サイクルである。
ＰＣＲ反応液は、タカラバイオ株式会社製のＥｘＴａｑを０．１２５μｌ、１０×ＥｘＴａｑを２．５μｌ、ｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍＭｅａｃｈ）を２μｌ、プライマー（１０μＭ）を２．５μｌに鋳型ＤＮＡを＜０．５μｇを加え、滅菌水で２０μｌに調製した。
増幅した領域は、長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）の１つであるＹＬＲＷｄｅｌｔａ２０及びＡＷＡ１遺伝子である。
ＹＬＲＷｄｅｌｔａ２０のプライマーは、５' －ＴＣＡＣＧＴＣＡＧＡＡＴＡＧＴＴＴＴＴＧＣＡＴＣＴＡＴＧ－３' 及び５' －ＡＡＡＴＧＧＡＴＧＧＡＴＡＡＴＴＴＧＡＴＡＡＴＴＧＣＴＧＧＧ－３' を用いた。
また、ＡＷＡ１遺伝子のプライマーは、５' －ＡＴＧＴＴＣＡＡＴＣＧＣＴＴＴＡＡＴＡＴＧＡＴＡＡＴＴＧＣＴＧＧＧ－３' 及び５' －ＴＴＡＧＴＴＡＡＡＧＡＡＡＧＣＡＡＧＡＡＣＧＡＡＡＡＴＡＣＣ－３' を用いた。
１％アガロースゲル電気泳動で増幅したＤＮＡ断片の大きさを確認した。
【0031】
このＰＣＲ法で増幅したＹＬＲＷｄｅｌｔａ２０及びＡＷＡ１遺伝子を２種の協会酵母Ｋ７０１、協会酵母Ｋ９０１とクズノハナ酵母と比較した。
その結果、図１に示すように、クズノハナ酵母のＹＬＲＷｄｅｌｔａ２０は協会酵母Ｋ７０１と同じ大きさであったが、ＡＷＡ１遺伝子はＫ７０１、Ｋ９０１より小さいので、既知の清酒酵母ではなく、独自の菌株であると考えられた。
その結果、図１に示すように、クズノハナ酵母のＹＬＲＷｄｅｌｔａ２０は協会酵母Ｋ７０１と同じ大きさであったが、ＡＷＡ１遺伝子はＫ７０１、Ｋ９０１より小さいので、既知の清酒酵母ではなく、独自の菌株であると考えられた。
【0032】
βーアラニン（パントテン酸要求性）試験
分離した酵母が協会７号系の酵母であるか否かを確認するためβーアラニン培地での生育を確認した。
清酒酵母は一般的に無機窒素源培地では、パントテン酸を要求しないが、協会７号系酵母はこれを要求する特性を有する。このパントテン酸を要求する特性は、高温になるほど強く表れるが、３５℃以上ではβーアラニン代替効果が認められなくなる。
かかる性質を利用して２０検体（検体番号１６、２０、２３、３４、４０、４３、５７、６８、７９、８１、９５（クズノハナ酵母）、１１８、１２４、１２８、１２９、１３６、１－２、５－１、１３－１、１５－１）が協会７号系酵母であるか否かを確認した。 その結果、検体番号２０の酵母のみがパントテン酸要求性がなく、他の１９検体（検体番号１６、２３、３４、４０、４３、５７、６８、７９、８１、９５（クズノハナ酵母）、１１８、１２４、１２８、１２９、１３６、１－２、５－１、１３－１、１５－１）にはパントテン酸要求性が確認された。
これにより、検体番号２０の酵母のみ協会７号系酵母ではないことが確認された。
分離した酵母が協会７号系の酵母であるか否かを確認するためβーアラニン培地での生育を確認した。
清酒酵母は一般的に無機窒素源培地では、パントテン酸を要求しないが、協会７号系酵母はこれを要求する特性を有する。このパントテン酸を要求する特性は、高温になるほど強く表れるが、３５℃以上ではβーアラニン代替効果が認められなくなる。
かかる性質を利用して２０検体（検体番号１６、２０、２３、３４、４０、４３、５７、６８、７９、８１、９５（クズノハナ酵母）、１１８、１２４、１２８、１２９、１３６、１－２、５－１、１３－１、１５－１）が協会７号系酵母であるか否かを確認した。 その結果、検体番号２０の酵母のみがパントテン酸要求性がなく、他の１９検体（検体番号１６、２３、３４、４０、４３、５７、６８、７９、８１、９５（クズノハナ酵母）、１１８、１２４、１２８、１２９、１３６、１－２、５－１、１３－１、１５－１）にはパントテン酸要求性が確認された。
これにより、検体番号２０の酵母のみ協会７号系酵母ではないことが確認された。
【0033】
なお、このβーアラニン（パントテン酸要求性）試験は以下のように行われた。
まず、１次培養で用いた麹汁液体培地１０ｍｌに協会酵母Ｋ７０１及び２０検体を３０℃で２４時間培養した。
次に、１０4 倍に希釈した培養液２００μｌをβーアラニン培地に１検体につき２枚塗布し、それぞれ３５℃、２０℃で４８時間培養し、後から生じるコロニーを計測した。
まず、１次培養で用いた麹汁液体培地１０ｍｌに協会酵母Ｋ７０１及び２０検体を３０℃で２４時間培養した。
次に、１０4 倍に希釈した培養液２００μｌをβーアラニン培地に１検体につき２枚塗布し、それぞれ３５℃、２０℃で４８時間培養し、後から生じるコロニーを計測した。
【0034】
ＴＴＣ染色試験
４次培養で酵母が存在すると判断したもののなかから５検体（検体番号１９、６２、８０、８７、９８）、５次培養で酵母が存在すると判断したもののなかから２０検体（検体番号１６、２０、２３、３４、４０、４３、５７、６８、７９、８１、９５（クズノハナ酵母）、１１８、１２４、１２８、１２９、１３６、１－２、５－１、１３－１、１５－１）を選択し、それぞれにＴＴＣ染色試験を行った。
その結果、明らかに濃いピンク色を呈したものが検体番号２０、４３、６８、７９、８１、９５（クズノハナ酵母）、１３６、１－２、５－１、１５－１の１０検体、ピンク又は薄い赤色を呈したものが検体番号１６、１９、２３、３４、４０、５７、６２、８０、８７、９８、１１８、１２４、１２８、１２９の１４検体、白色を呈したものが検体番号１３－１の１検体であった。
４次培養で酵母が存在すると判断したもののなかから５検体（検体番号１９、６２、８０、８７、９８）、５次培養で酵母が存在すると判断したもののなかから２０検体（検体番号１６、２０、２３、３４、４０、４３、５７、６８、７９、８１、９５（クズノハナ酵母）、１１８、１２４、１２８、１２９、１３６、１－２、５－１、１３－１、１５－１）を選択し、それぞれにＴＴＣ染色試験を行った。
その結果、明らかに濃いピンク色を呈したものが検体番号２０、４３、６８、７９、８１、９５（クズノハナ酵母）、１３６、１－２、５－１、１５－１の１０検体、ピンク又は薄い赤色を呈したものが検体番号１６、１９、２３、３４、４０、５７、６２、８０、８７、９８、１１８、１２４、１２８、１２９の１４検体、白色を呈したものが検体番号１３－１の１検体であった。
【0035】
なお、このＴＴＣ染色試験は、分離した酵母を生理食塩水に懸濁し、１プレートに約２００ＣＦＵ程度となるように希釈したものをＴＴＣ下層培地に塗布して３０℃で４８時間培養し、コロニーが生じたプレートにＴＴＣ上層培地を静かに重層し、固まった後に３０℃で約２時間保温した後のコロニーの呈色を観察することで行った。
【0036】
キラー性試験
サッカロマイセスセレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、さまざまな菌株が知られており、その中には他の酵母を死滅させるキラー因子と呼ばれるタンパク質を分泌するキラー酵母が存在する。清酒製造現場にキラー酵母が持ち込まれると、従来から使用されている酒造用酵母に悪影響を及ぼすことが考えられるため、キラー性の有無の確認は非常に大切である。
そこで、ＡＰＩ試験において、サッカロマイセスセレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であると判定された１０検体（検体番号２０、４０、４３、５７、６８、９５（クズノハナ酵母）、１３６、１－２、５－１、１５－１）の酵母について協会酵母Ｋ７０１に対するキラー性を調べた。
その結果、１０検体すべてにキラー性はないことが判明した。
サッカロマイセスセレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、さまざまな菌株が知られており、その中には他の酵母を死滅させるキラー因子と呼ばれるタンパク質を分泌するキラー酵母が存在する。清酒製造現場にキラー酵母が持ち込まれると、従来から使用されている酒造用酵母に悪影響を及ぼすことが考えられるため、キラー性の有無の確認は非常に大切である。
そこで、ＡＰＩ試験において、サッカロマイセスセレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であると判定された１０検体（検体番号２０、４０、４３、５７、６８、９５（クズノハナ酵母）、１３６、１－２、５－１、１５－１）の酵母について協会酵母Ｋ７０１に対するキラー性を調べた。
その結果、１０検体すべてにキラー性はないことが判明した。
【0037】
なお、このキラー性試験は、ＹＥＰＤ培地にメチレンブルーを０．００３％となるように添加した寒天平板培地を用いて行った。
この寒天平板培地に協会酵母Ｋ７０１及びキラー性をチェックする酵母を麹汁液体培地（Ｂｒｉｘ１０、ｐＨ４．０）にそれぞれ植菌し、菌数が１０8 ＣＦＵ／ｍｌ以上となるように３０℃で２４～４８時間培養した。そして、協会酵母Ｋ７０１を１０倍に希釈して寒天平板培地に塗布した後、表面を乾燥させて、５倍濃縮したキラー性をチェックする酵母を寒天平板培地に記号様に塗布した。
その協会酵母Ｋ７０１及びキラー性をチェックする酵母を３０℃で４８～７２時間培養し、協会酵母Ｋ７０１に対するキラー性をチェックすることで行った。
この寒天平板培地に協会酵母Ｋ７０１及びキラー性をチェックする酵母を麹汁液体培地（Ｂｒｉｘ１０、ｐＨ４．０）にそれぞれ植菌し、菌数が１０8 ＣＦＵ／ｍｌ以上となるように３０℃で２４～４８時間培養した。そして、協会酵母Ｋ７０１を１０倍に希釈して寒天平板培地に塗布した後、表面を乾燥させて、５倍濃縮したキラー性をチェックする酵母を寒天平板培地に記号様に塗布した。
その協会酵母Ｋ７０１及びキラー性をチェックする酵母を３０℃で４８～７２時間培養し、協会酵母Ｋ７０１に対するキラー性をチェックすることで行った。
【0038】
上述のようにして特定した検体番号２０、４３、６８、７９、８１、９５（クズノハナ酵母）、１３６、１－２、５－１、１５－１の各酵母を用いた清酒の仕込み試験について説明する。
まず、汲み水３３２ｍｌに７５％乳酸を０．１２ｍｌ、乾燥麹米（歩留８６％）３９．６ｇを加え、半日おいて水麹とした。
その後、α化米（歩留９７％）１４９．４ｇと麹汁液体培地で２４時間培養しておいた酵母液１．０ｍｌを加えて軽く攪拌し、１０℃の培養試験室において２週間培養した。
その間に重量、アルコール度、酸度及び日本酒度を測定した。
なお、比較対照として協会酵母Ｋ７０１についても同様の試験を行った。
まず、汲み水３３２ｍｌに７５％乳酸を０．１２ｍｌ、乾燥麹米（歩留８６％）３９．６ｇを加え、半日おいて水麹とした。
その後、α化米（歩留９７％）１４９．４ｇと麹汁液体培地で２４時間培養しておいた酵母液１．０ｍｌを加えて軽く攪拌し、１０℃の培養試験室において２週間培養した。
その間に重量、アルコール度、酸度及び日本酒度を測定した。
なお、比較対照として協会酵母Ｋ７０１についても同様の試験を行った。
【0039】
なお、総米２ｋｇの清酒の仕込み配合を表２に示す。
【0040】
【表2】
【0041】
なお、検体番号２０、４０、４３、５７、６８、９５（クズノハナ酵母）、１３６、１－２、５－１、１５－１の各酵母と協会酵母Ｋ７０１について試験を行った。
その結果を表３に示す。
その結果を表３に示す。
【0042】
【表3】
【0043】
また、検体番号２０、４０、４３、５７、６８、９５（クズノハナ酵母）、１３６、１－２、５－１、１５－１、協会酵母Ｋ７０１で醸造した清酒の各種有機酸濃度を測定した。
その結果を表４に示す。
その結果を表４に示す。
【0044】
【表4】
4
ＮＤ：検出せず
【0045】
また、検体番号２０、４０、４３、５７、６８、７９、８１、９５（クズノハナ酵母、特許微生物寄託センター受託番号：ＮＩＴＥ ＡＰ－０２６００）、１３６、１－２、５－１、１５－１の各酵母と協会酵母Ｋ７０１で醸造した清酒の香気成分濃度を測定した。その結果を表５及び表６に示す。
検体番号４０、５７、６８の各酵母を用いて醸造された清酒は酢酸エチル臭が強く、酢酸エチルは測定範囲を超えた。
他の成分では、協会酵母Ｋ７０１を用いて醸造された清酒と比較して、酢酸イソアミル、プロパノールが１／３～１／６程度であった。
なお、酢酸イソアミルはバナナ、カプロン酸エチルはリンゴを想起させるフルーティーな香気成分として知られている。
特に、検体番号９５の酵母９５（クズノハナ酵母、特許微生物寄託センター受託番号：ＮＩＴＥ ＡＰ－０２６００）では、協会酵母Ｋ７０１と比較すると酢酸イソアミル、プロパノールは１／３程度であった。一方、酢酸イソアミルの前躯体イソアミルアルコールは１．３倍、吟醸香の成分であるカプロン酸エチル、カプリル酸エチルは同等であり、酵母９５（クズノハナ酵母）を用いて醸造した清酒はフルーティーな香気を有するものといえる。
また、検体番号９５の酵母９５では、他の酵母と比較してリンゴ酸、コハク酸の生成能が高いことが確認された。
なお、検体番号６８の酵母６８も、他の酵母と比較してリンゴ酸、コハク酸の生成能が高いが、酢酸の生成能も高いので、清酒の醸造には適していないと判断される。
検体番号４０、５７、６８の各酵母を用いて醸造された清酒は酢酸エチル臭が強く、酢酸エチルは測定範囲を超えた。
他の成分では、協会酵母Ｋ７０１を用いて醸造された清酒と比較して、酢酸イソアミル、プロパノールが１／３～１／６程度であった。
なお、酢酸イソアミルはバナナ、カプロン酸エチルはリンゴを想起させるフルーティーな香気成分として知られている。
特に、検体番号９５の酵母９５（クズノハナ酵母、特許微生物寄託センター受託番号：ＮＩＴＥ ＡＰ－０２６００）では、協会酵母Ｋ７０１と比較すると酢酸イソアミル、プロパノールは１／３程度であった。一方、酢酸イソアミルの前躯体イソアミルアルコールは１．３倍、吟醸香の成分であるカプロン酸エチル、カプリル酸エチルは同等であり、酵母９５（クズノハナ酵母）を用いて醸造した清酒はフルーティーな香気を有するものといえる。
また、検体番号９５の酵母９５では、他の酵母と比較してリンゴ酸、コハク酸の生成能が高いことが確認された。
なお、検体番号６８の酵母６８も、他の酵母と比較してリンゴ酸、コハク酸の生成能が高いが、酢酸の生成能も高いので、清酒の醸造には適していないと判断される。
【0046】
【表5】
@0005
【0047】
【表6】
@0006
【0048】
検体番号９５のクズノハナ酵母を用いて醸造した清酒と協会酵母Ｋ９０１を用いて醸造した清酒とのアミノ酸の比較結果を表７に示す。
【0049】
【表7】
@0007
【0050】
検体番号９５のクズノハナ酵母を用いて醸造した清酒は、協会酵母Ｋ９０１を用いて醸造した清酒と比較して、アスパラギン酸、アスパラギン、セリン、グルタミン、ヒスチジン、スレオニン、プロリン、チロシンの含有量が多いという特徴を有していることが判明した。
このように、特に検体番号９５のクズノハナ酵母を用いて醸造した清酒は、フルーティーな香気のみならず、各種の有効なアミノ酸の含有量が多いという特徴を有するものとなった。
このように、特に検体番号９５のクズノハナ酵母を用いて醸造した清酒は、フルーティーな香気のみならず、各種の有効なアミノ酸の含有量が多いという特徴を有するものとなった。
【0051】
これまで、検体番号９５のクズノハナ酵母を用いた清酒の製造について説明したが、この酵母９５は清酒のみならず、一般的な酵母と同様に食酢、パン、味噌、醤油等の飲食物の製造に用いることができる。
【0052】
このクズノハナ酵母は、上述したようにリンゴ酸、コハク酸の生産能が高いので、これによって製造された飲食物は特有のフルーティーな香気、味わいを有することになる。
【0053】
例えば、このクズノハナ酵母を用いたフルーティーな香気、味わいを有するパンは以下のようにして製造される。
強力粉１５０ｇ、クズノハナ酵母を２４時間培養しておいた麹汁液体培地１０ｍｌ、砂糖２０ｇ、食塩２．５ｇを混ぜ合わせた後、かき混ぜながら水８５ｍｌを数回に分けて加えてこねあげる。
強力粉１５０ｇ、クズノハナ酵母を２４時間培養しておいた麹汁液体培地１０ｍｌ、砂糖２０ｇ、食塩２．５ｇを混ぜ合わせた後、かき混ぜながら水８５ｍｌを数回に分けて加えてこねあげる。
【0054】
こねあがった生地を丸めて表面を滑らかにして、食品ラップを被せるなどの方法で乾燥を防ぎ、３５℃の恒温状態で５０～６０分間かけて一次発酵させる。
一次発酵が終わった生地を適宜分割し、表面が滑らかになるように丸めて乾燥しないようにして１０分ねかせる。
一次発酵が終わった生地を適宜分割し、表面が滑らかになるように丸めて乾燥しないようにして１０分ねかせる。
【0055】
この後、生地をのばし、適当な形に整える。
これを３５℃程度で４０分間、二次発酵を行う。なお、この二次発酵の際には、生地には霧吹きで水を吹きかけておく。 この二次発酵が終わった後、オーブンを１８０℃に加温し、１８分間かけて生地を焼いてパンとする。
これを３５℃程度で４０分間、二次発酵を行う。なお、この二次発酵の際には、生地には霧吹きで水を吹きかけておく。 この二次発酵が終わった後、オーブンを１８０℃に加温し、１８分間かけて生地を焼いてパンとする。
【0056】
なお、上述したパンの製造方法は、このクズノハナ酵母に特有のものではなく、ごく一般的なパンの製造方法である。
【0057】
特許微生物寄託センター受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０２６００
【図1】
