特許 7002788 ポリペプチドの薬学的に許容される塩およびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-01-05

(45)【発行日】2022-03-03

(54)【発明の名称】ポリペプチドの薬学的に許容される塩およびその使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 7/06 20060101AFI20220224BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20220224BHJP

   C07K 7/08 20060101ALI20220224BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20220224BHJP

   A61P 25/04 20060101ALI20220224BHJP

   A61P 25/22 20060101ALI20220224BHJP

   A61P 25/08 20060101ALI20220224BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20220224BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20220224BHJP

   A61P 25/14 20060101ALI20220224BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20220224BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20220224BHJP

   A61K 38/08 20190101ALI20220224BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20220224BHJP

   A61K 47/64 20170101ALI20220224BHJP

   C40B 40/10 20060101ALN20220224BHJP

【ＦＩ】

C07K7/06 ZNA

C07K19/00

C07K7/08

A61P25/00

A61P25/04

A61P25/22

A61P25/08

A61P25/28

A61P25/16

A61P25/14

A61P21/00

A61P9/10

A61K38/08

A61K38/16

A61K47/64

C40B40/10

【請求項の数】 14

(21)【出願番号】P 2020522762

(86)(22)【出願日】2017-07-05

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2020-08-27

(86)【国際出願番号】 CN2017091792

(87)【国際公開番号】W WO2019006690

(87)【国際公開日】2019-01-10

【審査請求日】2020-03-11

(73)【特許権者】

【識別番号】520005071

【氏名又は名称】拜西欧斯（北京）生物技術有限公司

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】特許業務法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】韓化敏

(72)【発明者】

【氏名】田雨佳

(72)【発明者】

【氏名】賈紅軍

【審査官】松原 寛子

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１２－５３００５７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１１－５２０９００（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１３／０１５６７０４（ＵＳ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１２／１７６１７２（ＷＯ，Ａ２）

【文献】米国特許出願公開第２００５／００１９８４１（ＵＳ，Ａ１）

【文献】Stroke，2008年，Vol.39，p.2544-2553

【文献】Stroke，2011年，Vol.42，p.3265-3270

【文献】Nature，2012年，Vol.483，p.213-217

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｋ ７／０６

Ｃ０７Ｋ ７／０８

Ａ６１Ｐ ２５／００

Ａ６１Ｐ ２５／０４

Ａ６１Ｐ ２５／２２

Ａ６１Ｐ ２５／０８

Ａ６１Ｐ ２５／２８

Ａ６１Ｐ ２５／１６

Ａ６１Ｐ ２５／１４

Ａ６１Ｐ ２１／００

Ａ６１Ｐ ９／１０

Ａ６１Ｋ ３８／０８

Ａ６１Ｋ ３８／１６

Ａ６１Ｋ ４７／６４

Ｃ０７Ｋ ７／０６

Ｃ０７Ｋ ７／０８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ポリペプチドの薬学的に許容される塩であって、
当該ポリペプチドは、アミノ酸配列ＹＥＫＬＬＤＴＥＩ（配列番号：１）又はその機能的変異体を含み、
当該機能的変異体は、アミノ酸配列ＹＥＫＬＬＤＴＥＩ（配列番号：１）において、１つまたは複数の保存的置換を有する変異体であって、
前記保存的置換は、ＤとＥとの間の置換、ＬとＶとＩとの間の置換、およびＴとＳとの間の置換からなる群から選ばれるものであり、
前記ポリペプチドは、ＰＳＤ－９５のＰＤＺ１／２ドメインへの結合能を有し、且つ、ＰＳＤ－９５とＮＭＤＡＲとの結合を阻害し、
前記塩は、酢酸塩である、
ポリペプチドの薬学的に許容される塩。

【請求項2】

前記機能的変異体は、配列番号：１におけるＬＤＴＥＩセグメントの１つまたは複数の保存的置換によって生成された変異体であり、前記保存的置換は、ＤとＥとの間の置換、ＬとＶとＩとの間での置換、およびＴとＳとの間の置換からなる群より選ばれる、請求項１に記載のポリペプチドの薬学的に許容される塩。

【請求項3】

前記機能的変異体は、配列番号：１におけるＬＤＴＥＩ（配列番号：６）セグメントを、ＬＤＴＥＬ（配列番号：７）、ＬＤＴＥＶ（配列番号：８）、ＬＤＴＤＩ（配列番号：９）、ＬＤＴＤＬ（配列番号：１０）、ＬＤＴＤＶ（配列番号：１１）、ＬＤＳＥＩ（配列番号：１２）、ＬＤＳＥＬ（配列番号：１３）、ＬＤＳＥＶ（配列番号：１４）、ＬＤＳＤＩ（配列番号：１５）、ＬＤＳＤＬ（配列番号：１６）、ＬＤＳＤＶ（配列番号：１７）、ＬＥＴＥＩ（配列番号：１８）、ＬＥＴＥＬ（配列番号：１９）、ＬＥＴＥＶ（配列番号：２０）、ＬＥＴＤＩ（配列番号：２１）、ＬＥＴＤＬ（配列番号：２２）、ＬＥＴＤＶ（配列番号：２３）、ＶＤＴＥＩ（配列番号：２４）、ＶＤＴＥＬ（配列番号：２５）、ＶＤＴＥＶ（配列番号：２６）、ＶＤＴＤＩ（配列番号：２７）、ＶＤＴＤＬ（配列番号：２８）、ＶＤＴＤＶ（配列番号：２９）、ＩＤＴＥＩ（配列番号：３０）、ＩＤＴＥＬ（配列番号：３１）、ＩＤＴＥＶ（配列番号：３２）、ＩＤＴＤＩ（配列番号：３３）、ＩＤＴＤＬ（配列番号：３４）、ＩＤＴＤＶ（配列番号：３５）、ＩＥＴＥＩ（配列番号：３６）、ＩＥＴＥＬ（配列番号：３７）、ＩＥＴＥＶ（配列番号：３８）、ＩＥＴＤＩ（配列番号：３９）、ＩＥＴＤＬ（配列番号：４０）、およびＩＥＴＤＶ（配列番号：４１）からなる群より選ばれる配列のいずれかで置換することによって生成される変異体である、請求項２に記載のポリペプチドの薬学的に許容される塩。

【請求項4】

前記ポリペプチドは、内在化ペプチド部分および活性ペプチド部分を含むキメラペプチドであり、前記活性ペプチド部分は、アミノ酸配列ＹＥＫＬＬＤＴＥＩ（配列番号：１）またはその機能的変異体であり、前記内在化ペプチド部分は、前記キメラペプチドが細胞に取り込まれることを促進できる、請求項１～３のいずれか１項に記載のポリペプチドの薬学的に許容される塩。

【請求項5】

前記内在化ペプチド部分は、アミノ酸配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号：２）を含む、請求項４に記載のポリペプチドの薬学的に許容される塩。

【請求項6】

前記キメラペプチドは、アミノ酸配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＹＥＫＬＬＤＴＥＩ（配列番号：３）を含む、請求項５に記載のポリペプチドの薬学的に許容される塩。

【請求項7】

請求項１～６のいずれか１項に記載のポリペプチドの薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体、賦形剤および／または希釈剤とを含む、医薬組成物。

【請求項8】

予備凍結乾燥製剤、凍結乾燥製剤、又は再構成製剤である、請求項７に記載の医薬組成物。

【請求項9】

個体の神経系損傷、神経系損傷に関する疾患もしくは疼痛、神経変性疾患、不安またはてんかんを治療、改善または予防するために用いられ、あるいは神経保護剤として用いられる、請求項７又は８に記載の医薬組成物。

【請求項10】

前記神経系損傷は、興奮性神経毒性によって引き起こされる神経系損傷である、請求項９に記載の医薬組成物。

【請求項11】

前記興奮性神経毒性によって引き起こされる神経系損傷は、脳卒中、脊髄損傷、脳もしくは脊髄の虚血性または外傷性損傷、中枢神経系（ＣＮＳ）神経細胞の損傷（急性ＣＮＳ損傷、虚血性脳卒中または脊髄損傷と、低酸素症、虚血、機械的損傷とを含み）、および神経変性疾患、不安、てんかん、脳卒中による損傷からなる群より選ばれる損傷を含む、請求項１０に記載の医薬組成物。

【請求項12】

前記神経変性疾患は、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、およびハンチントン病からなる群より選ばれる、請求項９に記載の医薬組成物。

【請求項13】

前記神経系損傷に関する疾患は脳卒中である、請求項９に記載の医薬組成物。

【請求項14】

前記脳卒中は、虚血性卒中、出血性卒中、および虚血性卒中から変換された出血性卒中からなる群より選ばれる、請求項１３に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、全般に生物医学分野に関する。具体的に、本発明は、神経系に関連する病症（障害、状態）を治療、改善または予防するためのポリペプチドの薬学的に許容される塩、組成物および方法を提供する。

【背景技術】

【0002】

神経系関連疾患は様々な形で現れ、人々の健康と生活の質を深刻に損なうことになっている。

【0003】

脳卒中は、中老や高齢者の急性脳血管疾患であり、且つ若年層への進展する傾向がある。それは、現在、世界中にヒトに最も有害である３つの疾患（癌、心血管疾患、糖尿病）の一つである。統計によれば、中国では、毎年、約３００万人が脳血管疾患に起因して死亡し、米国やヨーロッパよりも４～５倍高く、日本の３．５倍であり、タイやインドなどの発展途上国よりもさらに高くなっている。発病率が年間のあたり８．７％の速率で上昇し、再発率が３０％を超え、５年内に再発率が５４％に達し、脳卒中患者の生存者の７５％が様々な程度で作業能力を失い、重度の障害が４０％である。

【0004】

脳卒中は、虚血性脳卒中および出血性脳卒中という２つの種類に大きく分けることができ、虚血性脳卒中は、脳卒中患者の総数の８５％を占める。現在、虚血性脳卒中の治療薬は、主に次の種類：血管拡張剤（例えば、ジピリダモールなど）、微小循環を改善し、血液容量を拡張する薬物（例えば、低分子デキストランなど）、血栓溶解薬（例えば、ウロキナーゼなど）、抗凝固療法、（例えば、アスピリン）、中国医学、神経保護などを防ぐために、キナーゼ）、抗凝固療法、血小板凝集防止剤（例えば、アスピリンなど）、漢方薬、神経細胞保護剤などに分けられるが、これらの薬は、ほとんど副作用が大きく、潜在的なリスクがあり、または治療効果が著しくない問題を持っているため、脳卒中の発病メカニズムを検討してその発病メカニズムに対して医薬品開発を行い、脳血管疾患の発生や進展を予防および治療するために重要な社会的意義を持っている。

【0005】

脳卒中は、局所虚血領域、脳出血領域および／または創傷領域における神経細胞死であることを特徴とする。脳虚血により引き起こされる神経細胞死または損傷は、損傷カスケード反応のプロセスであり、脳虚血後、組織の血液灌流が減少し、興奮性神経伝達物質が増加し、ＮＭＤＡおよびＡＭＰＡ受容体を活性化させ、イオンチャネルの開放、カルシウムイオンの流入を引き起こし、多くの酵素を活性化させてシグナルカスケード反応をもたらし、複数の経路における神経細胞損傷を誘発する。その下流のシナプス後密度９５タンパク質（ＰＳＤ－９５）は、様々なタンパク質との相互作用を介して一連の虚血性損傷を引き起こし、脳虚血損傷の鍵サイトであり、同時に薬物療のための潜在的な標的であるため、ＰＳＤ－９５阻害剤の研究開発は、脳卒中を含む多種の興奮性神経毒性による神経系損傷に対して非常に大きい薬用意義を持っている。

【0006】

また、研究によれば、興奮性神経伝達物質ＮＭＤＡは、不安、てんかん（癲癇）、および様々な神経変性疾患、例えばアルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病またはハンチントン病などにおいて重要な役割を果たしていることが示されている。例えば、研究によれば、中枢におけるグルタミン酸作動系（ｇｌｕｔａｍａｔｅｒｇｉｃ ｓｙｓｔｅｍ）の過剰興奮は不安をもたらすことができ、且つＮＭＤＡ受容体（ＮＭＤＡＲ）は、グルタミン酸興奮性神経毒性の主要な部分を担っていることが示されている。てんかんの発作は、起動、発作性放電の維持および拡大、並びに発作性放電の抑制という３つの異なる連続病態生理学的プロセスを含み、該プロセスにおいてグルタミン酸、アスパラギン酸などの興奮性神経伝達物質は重要な役割を果たしている。アルツハイマー病では、ＰＳＤ－９５はＧｌｕＲ６－ＰＳＤ－９５－ＭＬＫ３経路により、それにつながる神経毒性のメカニズムに関与している。さらに、ハンチントン病では、ＰＳＤ－９５はＮＭＤＡ受容体、およびハンチンチンの突然変異体の神経毒性のメディエーターである。したがって、ＰＳＤ－９５阻害剤の研究開発は、上記の疾患の治療、改善および予防のためにも重要な意味を持っている。

【発明の概要】

【0007】

第１の態様によれば、本発明は、ポリペプチドがアミノ酸配列ＹＥＫＬＬＤＴＥＩ（配列番号：１）またはその機能的変異体を含む、ポリペプチドの薬学的に許容される塩を提供する。

【0008】

いくつかの実施形態において、前記機能的変異体は、配列番号：１におけるＬＤＴＥＩセグメントに１つまたは複数の箇所で保存的置換によって生成された変異体である。
いくつかの実施形態において、保存的な置換は、ＤとＥの間、Ｌ、ＶとＩの間、およびＴとＳの間の置換からなる群から選ばれる。

【0009】

いくつかの実施形態において、前記機能的変異体は、配列番号：１におけるＬＤＴＥＩ（配列番号：６）セグメントがＬＤＴＥＬ（配列番号：７）、ＬＤＴＥＶ（配列番号：８）、ＬＤＴＤＩ（配列番号：９）、ＬＤＴＤＬ（配列番号：１０）、ＬＤＴＤＶ（配列番号：１１）、ＬＤＳＥＩ（配列番号：１２）、ＬＤＳＥＬ（配列番号：１３）、ＬＤＳＥＶ（配列番号：１４）、ＬＤＳＤＩ（配列番号：１５）、ＬＤＳＤＬ（配列番号：１６）、ＬＤＳＤＶ（配列番号：１７）、ＬＥＴＥＩ（配列番号：１８）、ＬＥＴＥＬ（配列番号：１９）、ＬＥＴＥＶ（配列番号：２０）、ＬＥＴＤＩ（配列番号：２１）、ＬＥＴＤＬ（配列番号：２２）、ＬＥＴＤＶ（配列番号：２３）、ＶＤＴＥＩ（配列番号：２４）、ＶＤＴＥＬ（配列番号：２５）、ＶＤＴＥＶ（配列番号：２６）、ＶＤＴＤＩ（配列番号：２７）、ＶＤＴＤＬ（配列番号：２８）、ＶＤＴＤＶ（配列番号：２９）、ＩＤＴＥＩ（配列番号：３０）、ＩＤＴＥＬ（配列番号：３１）、ＩＤＴＥＶ（配列番号：３２）、ＩＤＴＤＩ（配列番号：３３）、ＩＤＴＤＬ（配列番号：３４）、ＩＤＴＤＶ（配列番号：３５）、ＩＥＴＥＩ（配列番号：３６）、ＩＥＴＥＬ（配列番号：３７）、ＩＥＴＥＶ（配列番号：３８）、ＩＥＴＤＩ（配列番号：３９）、ＩＥＴＤＬ（配列番号：４０）、およびＩＥＴＤＶ（配列番号：４１）からなる群より選ばれる配列のいずれかで置換することによって生成される変異体である。

【0010】

いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドは、内在化ペプチド部分および活性ペプチド部分を含むキメラペプチドであり、前記活性ペプチド部分は、アミノ酸配列ＹＥＫＬＬＤＴＥＩ（配列番号：１）またはその機能的変異体であり、前記内在化ペプチド部分は、前記キメラペプチドが細胞に取り込まれることを促進できる。

【0011】

いくつかの実施形態において、前記内因性ペプチドは、アミノ酸配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号：２）を含む。
いくつかの実施形態において、前記キメラペプチドは、アミノ酸配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＹＥＫＬＬＤＴＥＩ（配列番号：３）を含む。
いくつかの実施形態において、前記薬学的に許容される塩は、トリフルオロ酢酸塩、酢酸塩、塩酸塩およびリン酸塩からなる群より選ばれる。

【0012】

第２の態様によれば、本発明は、第１の態様に記載のポリペプチドの薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体、賦形剤および／または希釈剤とを含む医薬組成物を提供する。

【0013】

いくつかの実施形態において、前記医薬組成物は予備凍結乾燥製剤であり、好ましくは、ヒスチジンおよびトレハロースを含む。
いくつかの実施形態において、医薬組成物は凍結乾燥製剤であり、好ましくは、前記予備凍結乾燥製剤を凍結乾燥することにより製造される。

【0014】

いくつかの実施形態において、医薬組成物は再構成製剤であり、好ましくは、前記凍結乾燥製剤を水溶液と組み合わせすることにより製造される。

【0015】

いくつかの実施形態において、前記医薬組成物は、個体の神経系損傷、神経系損傷に関する疾患もしくは疼痛、神経変性疾患、不安またはてんかんを治療、改善または予防するために用いられる。
いくつかの実施形態において、前記医薬組成物は、神経保護剤として用いられる。

【0016】

第３の態様によれば、本発明は、第１の態様に記載のポリペプチドの薬学的に許容される塩、あるいは第２の態様に記載の医薬組成物を個体に投与することを含む、前記個体の神経系損傷、神経系損傷に関する疾患もしくは疼痛、神経変性疾患、不安またはてんかんを治療、改善または予防する方法を提供する。

【0017】

第４の態様によれば、本発明は、第１の態様に記載のポリペプチドの薬学的に許容される塩、あるいは第２の態様に記載の医薬組成物の、個体における神経系損傷、神経系損傷に関する疾患もしくは疼痛、神経変性疾患、不安またはてんかんを治療、改善または予防するために用いられる医薬の製造あるいは神経保護剤の製造における使用を提供する。

【0018】

第２、第３または第４の態様のいくつかの実施形態において、前記神経系損傷は、興奮性神経毒性によって引き起こされる神経系損傷である。

【0019】

いくつかの実施形態において、前記興奮性神経毒性によって引き起こされる神経系損傷は、脳卒中、脊髄損傷、脳もしくは脊髄の虚血性または外傷性損傷、中枢神経系（ＣＮＳ）神経細胞の損傷（急性ＣＮＳ損傷、虚血性脳卒中または脊髄損傷と、低酸素症、虚血、機械的損傷とを含み）、および神経変性疾患、不安、てんかん、脳卒中による損傷からなる群より選ばれる損傷を含む。

【0020】

第２、第３および第４の態様のいくつかの実施形態において、前記神経変性疾患は、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、およびハンチントン病からなる群より選ばれる。

【0021】

第２、第３または第４の態様のいくつかの実施形態において、前記神経系損傷または疼痛は、末梢神経系または中枢神経系に位置する。

【0022】

第２、第３または第４の態様のいくつかの実施形態において、前記神経系損傷に関する疾患は、脳卒中である。いくつかの実施形態において、前記脳卒中は、虚血性脳卒中、出血性卒中、および虚血性卒中から変換された出血性卒中を含む。いくつかの実施形態において、前記脳卒中は虚血性脳卒中である。

【0023】

第２、第３または第４の態様のいくつかの実施形態において、前記個体は、例えば、非霊長類または霊長類などの哺乳類（例えば、ヒト）である。

【図面の簡単な説明】

【0024】

【図1】図１は、プルダウン（Ｐｕｌｌ－ｄｏｗｎ）実験でＰ５とＰＤＺ１／２ドメインとの相互作用を検出することを示している図である。Ｍはタンパク質分子量マーカーを表し、レーン１はＨｉｓ＋ＰＤＺ１／２＋Ｐ５であり、レーン２は単独のＰ５であり、レーン３はＨｉｓ＋Ｐ５であり、レーン４はＨｉｓ＋ＰＤＺ１／２である。レーン１に示す溶出バンドには、Ｐ５およびＰＤＺ１／２の両方を含み、Ｐ５がＰＤＺ１／２ドメインとを結合できることが裏付けられる。

【図2】図２は、ラットの生体内で異なるポリペプチド塩の薬力学実験データの比較を示している図である。

【図3】図３は、異なるポリペプチド塩の細胞毒性の測定結果を示している図である。

【図4】図４は、異なるポリペプチド塩の安定性を示しており、図４のＡおよびＢには、それぞれ、異なるポリペプチド塩の固形物形態の、光照（光照射）＋紫外（ＵＶ、紫外線）で高温、高湿条件下に置かれた後の含有量と不純物の種類数を示しており、図４のＣおよびＤには、それぞれ異なるポリペプチド塩の水溶液形態の、光照で高温の条件下に置かれた後の含有量と不純物の種類数を示している。

【発明の詳細な説明】

【0025】

本願の発明者らは、少なくとも一部のＮＭＤＡＲ興奮性神経毒性に媒介される神経障害の損傷効果を低減することができるペプチドを鋭意検討した。いかなる理論にも拘束されることを望まないが、このようなペプチドの少なくとも一部は、ＮＭＤＡＲとシナプス後肥厚部９５タンパク質（ＰＳＤ－９５）との間の相互作用を阻害することにより機能する（すなわち、ＰＳＤ－９５阻害剤）と考えられている。これに基づいて、本出願の発明者らは、神経系関連疾患の複数の治療ターゲットに対して深く検討し、生体内外の薬理学的および薬力学実験を介してポリペプチドの神経保護剤を設計してスクリーニングし、そしてスクリーニングされたペプチドをさらに改善して望ましい特性を有するポリペプチドの薬学的に許容される塩が得られた。

【0026】

特に断らない限り、本明細書に記載の用語は、一般的に、当業者によって理解される意味を有する。

【0027】

本明細書に記載のアミノ酸に対して単一文字または３文字の略語は、国際慣習に従っているものである。

【0028】

本明細書および特許請求の範囲に記載の用語「含む」、「含有／有する」および「備える／挙げられる」などの類似な形態とは、「…を含むがこれらに限定されない」ということを意味し、その他の部分（ｐａｒｔｓ）、添加物、成分（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）または手順（ｓｔｅｐｓ）を除外することを意図していない。

【0029】

第１の態様によれば、本発明は、ポリペプチドがアミノ酸配列ＹＥＫＬＬＤＴＥＩ（配列番号：１）またはその機能的変異体を含む、ポリペプチドの薬学的に許容される塩を提供する。

【0030】

用語「機能的変異体」は、母体（親）が同一または類似の生物学的機能および特性を有する変異体を指す。非限定的な例として、「機能的変異体」は、母体における１つまたは複数の箇所で保存的置換を行うことによって得られてもよい。アミノ酸配列ＹＥＫＬＬＤＴＥＩ（配列番号：１）またはその機能的変異体は、本発明において「活性ペプチド部分」とも呼ばれ、それは、本発明において、中枢神経系損傷の治療のために用いられ、または神経保護剤の活性部位として用いられる。

【0031】

既存の研究では、ＮＭＤＡＲとＰＳＤ－９５との間の相互作用を阻害する活性ペプチドは、ＮＭＤＡＲの構造に基づくものである。例えば、ＮＭＤＡＲ２Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ４０９９６１２）は、Ｃ末端における２０個のアミノ酸のＦＮＧＳＳＮＧＨＶＹＥＫＬＳＳＬＥＳＤＶ（配列番号：４２）、およびＰＬモチーフＥＳＤＶ（配列番号：４３）を有する。いくつかの既知の活性ペプチドは、ＮＭＤＡＲ２ＢのＣ末端の一部アミノ配列を選択することにより、ＮＭＤＡＲ２ＢとがＰＳＤ－９５に対する競争阻害を生じる。ある研究では、上記ペプチドにおけるＥＳＤＶまたはＬＥＳＤＶ（配列番号：４４）セグメントは、ＮＭＤＡＲとＰＳＤ－９５タンパク質との相互作用を阻害することで重要な役割を果たしていることが考えられる。本出願の発明者らは、解析および検証によりペプチド配列ＹＥＫＬＬＤＴＥＩを得、それは上記のＮＭＤＡＲ２ＢのＣ末端のアミノ酸組成に対してＫＬ後のＳＳの２つの残基を含まない同時に、ＰＬモチーフに対してＮ末端方向におけるＹＥＫＬ（配列番号：４５）アミノ酸配列を増加したことを見出した。本出願の発明者らはこのような配列が活性ペプチドとＰＤＺ１／２ドメインとの相互作用を高めることが裏つけられる。ＹＥＫＬモチーフに対して、そのＣ末端におけるＬＤＴＥＩセグメントは、変更することができ、活性ペプチドの活性に影響を及ぼさなく、またはその活性を高める可能性があることが予想されている。したがって、いくつかの実施形態において、本発明に係る機能的変異体は、配列番号：１におけるＬＤＴＥＩセグメントに１つまたは複数の箇所で保存的置換によって生成された変異体である。

【0032】

いくつかの実施形態において、保存的な置換は、ＤとＥの間、Ｌ、ＶとＩの間、およびＴとＳの間の置換からなる群から選ばれる。

【0033】

いくつかの特定の実施形態において、機能的変異体は、配列番号：１におけるＬＤＴＥＩセグメントを、ＬＤＴＥＬ、ＬＤＴＥＶ、ＬＤＴＤＩ、ＬＤＴＤＬ、ＬＤＴＤＶ、ＬＤＳＥＩ、ＬＤＳＥＬ、ＬＤＳＥＶ、ＬＤＳＤＩ、ＬＤＳＤＬ、ＬＤＳＤＶ、ＬＥＴＥＩ、ＬＥＴＥＬ、ＬＥＴＥＶ、ＬＥＴＤＩ、ＬＥＴＤＬ、ＬＥＴＤＶ、ＶＤＴＥＩ、ＶＤＴＥＬ、ＶＤＴＥＶ、ＶＤＴＤＩ、ＶＤＴＤＬ、ＶＤＴＤＶ、ＩＤＴＥＩ、ＩＤＴＥＬ、ＩＤＴＥＶ、ＩＤＴＤＩ、ＩＤＴＤＬ、ＩＤＴＤＶ、ＩＥＴＥＩ、ＩＥＴＥＬ、ＩＥＴＥＶ、ＩＥＴＤＩ、ＩＥＴＤＬ、およびＩＥＴＤＶからなる群より選ばれる配列のいずれかで置換することによって生成される変異体である。

【0034】

いくつかの実施形態において、本発明に記載の機能的変異体は、前記ペプチドと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列をさらに含む。本領域で既に分かるように、２種の蛋白質の間の「同一性（アイデンティティ）」は、１種のタンパク質のアミノ酸配列と、その保守的アミノ酸で置換された第２種の蛋白質の配列との比較によって決定される。２種のタンパク質の間の同一性の程度は、当業者に周知のコンピュータアルゴリズムおよび方法によって決定される。２つのアミノ酸配列の間の同一性は、好ましくは、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムによって決定される。

【0035】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の機能的変異体は、上記ペプチドに比べると、上記で開示された具体的なペプチドと異なっている１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上のアミノ酸残基の置換、削除、追加、および／または挿入を有する。

【0036】

前述のように、機能的変異体は、１つまたは多数の置換、削除、追加、および／または挿入により、上記で開示された特定のペプチドから区別することができる。これらの変異体は、天然に存在しまたは合成的に生成したものでもよい。例えば、本明細書に記載の上記ペプチド配列の１つ以上を修飾し、本明細書に記載の当該分野によく知られている様々な技術のいずれかでその生物活性を評価することができる。

【0037】

いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドは、内在化ペプチド部分および活性ペプチド部分を含むキメラペプチドであり、前記活性ペプチド部分は、アミノ酸配列ＹＥＫＬＬＤＴＥＩ（配列番号：１）またはその機能的変異体であり、前記内在化ペプチド部分は、前記キメラペプチドが細胞に取り込まれることを促進できる。

【0038】

活性ペプチドおよび内因性ペプチドをキメラペプチドに組み込む主な目的は、より良好に活性ペプチドを作用の標的に送達することにあると、当業者によって理解されるべきである。また、当業者は、活性ペプチドの作用ターゲットが主に神経細胞内にあるために、神経細胞に特異的に適合することができる内因性ペプチドが好ましいと、理解すべきである。いくつかの実施形態において、内因性ペプチドはＴａｔペプチドであってもよい。いくつかの実施形態において、Ｔａｔペプチドのアミノ酸配列はＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号：２）である。いくつかの実施形態において、キメラペプチドは、アミノ酸配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＹＥＫＬＬＤＴＥＩ（配列番号：３）を含む。

【0039】

内因性ペプチドは、アミド結合を介して活性ペプチドに連結されて融合ペプチドを形成することができると理解すべきであるが、また、化学結合などの他の適切な手段を介して連結されてもよい。２つのコンポーネントのカップリングは、カップリング剤や接合剤により実現できる。このような試薬の多くは市販されており、「Ｓ．Ｓ．Ｗｏｎｇ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓ－Ｌｉｎｋｉｎｇ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）」に記載されている。架橋剤のいくつかの例としては、Ｊ－スクシンイミド－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＯＰ）またはＮ、Ｎ’－（１，３－フェニレン）ビスマレイミド、Ｎ、Ｎ’－エチリデン－ビス－（ヨードアセトアミド）または、６～１１個の炭素メチレン橋（ｃａｒｂｏｎ ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ ｂｒｉｄｇｅｓ）を有する他のこのような試薬（これはチオール基に対して比較的特異的である）、および１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン（それとアミノ基およびチロシン基とが不可逆的な結合を形成する）が挙げられる。その他の架橋剤は、Ｐ，Ｐ’－ジフルオロ－ｍ，ｍ’－ジニトロジフェニルスルホン（これはアミノ基とフェノール基と不可逆的な架橋を形成する）、ジエチルアミンヘキサン酸ジメチル（これはアミノ基に特異的である）、フェノール－１，４－ジスルホニルクロライド（これは主にアミノ基と反応する）、１，６－ヘキサメチレンジイソシアネートもしくはジイソチオシアネート、またはフェニルアゾーｐージイソシアネート（これは主にアミノ基と反応する）、グルタルアルデヒド（これはいくつかの異なる側鎖と反応する）およびビスジアゾ化ベンチジン（これは主にチロシンやヒスチジンと反応する）が挙げられる。

【0040】

本発明に係る活性ペプチド、およびそれを内因性ペプチドに融合した融合ペプチドは、固相合成法または組換え方法で合成される。ペプチドミメティクスは、科学文献および特許文献に記載の様々なプロトコルや方法により合成することができ、前記科学文献および特許文献は、例えば、「Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｖｅ Ｖｏｌｕｍｅｓ，Ｇｉｌｍａｎら（編集）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，ａｌ－Ｏｂｅｉｄｉ（１９９８）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：２０５－２２３；Ｈｒｕｂｙ（１９９７）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１：１１４－１１９；０ｓｔｅｒｇａａｒｄ（１９９７）Ｍｏｌ．Ｄｉｖｅｒｓ．３：１７－２７；０ｓｔｒｅｓｈ（１９９６）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６７：２２０－２３４」が挙げられる。

【0041】

いずれの理論に拘束されることは望まなく、薬物と反対の電荷を持つ分子またはイオンを使用して薬物と結合して塩を形成すると、例えば薬物の溶解度または溶出度を変化させ、吸湿性を低下させ、安定性を向上させ、融点を変化させるなどの、薬物のいくつかの好ましくない理化学的性質または生物学的性質を改善することが期待されている。理想的な塩の形態を最終的に決定するには、理化学的性質と生物学的性質との間でバランスを見いだす必要がある。薬物の薬学的に許容される塩形態を選択する場合、溶解性、吸湿性、異なる状態での環境因子に対する安定性という要件を優先的に考慮する必要がある。本発明に係るポリペプチドの薬学的に許容できる塩は、任意の適切な薬学的に許容できる塩の形態であってもよい。いくつかの実施形態において、ポリペプチドの薬学的に許容される塩は、トリフルオロ酢酸塩である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドの薬学的に許容される塩は、酢酸塩である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドの薬学的に許容される塩は、塩酸塩である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドの薬学的に許容される塩は、リン酸塩である。いくつかの具体的実施形態において、ポリペプチドの薬学的に許容される塩は、酢酸塩または塩酸塩である。

【0042】

第２の態様によれば、本発明は、第１の態様に記載のポリペプチドの薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体、賦形剤および／または希釈剤とを含む医薬組成物を提供する。

【0043】

本明細書に記載の化合物は、凍結乾燥製剤の形態として製造することができる。いくつかの実施形態において、本発明は、凍結乾燥製剤を提供する。凍結乾燥製剤は、凍結乾燥により予備凍結乾燥製剤から製造され、少なくとも活性成分、緩衝剤、充填剤、および水を含み、その中でも活性成分が本発明に係る化合物またはその薬学的に許容される塩である。いくつかの実施形態において、好ましくは、緩衝液はヒスチジンである。その他の緩衝液としては、コハク酸塩、クエン酸塩、グルコン酸塩、酢酸塩、リン酸塩およびＴｒｉｓ等からなる群より選ばれる。充填剤は凍結乾燥化合物に構造を提供するものである。いくつかの実施形態において、充填剤は、マンニトール、トレハロース、デキストラン－４０、グリシン、乳糖、ソルビトールおよびショ糖等からなる群より選ばれ、そのうち、トレハロースが好ましい。いくつかの実施形態において、本発明に係る凍結乾燥製剤は、上記化合物またはその薬学的に許容される塩、ならびにヒスチジンおよびトレハロースを含む。

【0044】

凍結乾燥製剤を再構成（復元）することができ、すなわち溶液で凍結乾燥製剤を肉眼では見えない微粒子の溶液に再水和する。いくつかの実施形態において、本発明は、凍結乾燥製剤を水溶液と組み合わせることにより製造される再構成製剤を提供する。いくつかの実施形態において、前記水溶液は注射用水である。いくつかの実施形態において、前記水溶液は生理食塩水である。

【0045】

用語「凍結乾燥」は、乾燥しようとする原料をまず凍結し、次に真空環境で昇華させて氷や凍結溶剤を除去するプロセスに関する。

【0046】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるポリペプチドの薬学的に許容される塩は、医薬組成物の形で投与することができる。医薬組成物は、従来の方法、例えば、混合、溶解、造粒、錠剤化、研磨、乳化、カプセル化、捕捉、または凍結乾燥という方法により調製することができる。

【0047】

医薬組成物は、１つ以上の生理学的に許容される、ポリペプチドの薬学的に許容される塩を医薬用可能な製剤に調製しやすい担体、希釈剤、賦形剤または補助原料を用い、従来の方法で製剤化することができる。適切な製剤化は、その選ばれる投与経路に依存する。

【0048】

いくつかの実施形態において、投与は、非経口、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、髄腔内、腹腔内、局所、鼻腔内、または筋肉内であってもよく、静脈内投与であることが好ましい。

【0049】

いくつかの実施形態において、非経口投与のための医薬組成物は、好ましくは無菌、および実質的に等張性である。注射については、ポリペプチドの薬学的に許容される塩を水溶液に加えて調製してもよく、好ましくは、（注射部位に不快感を低減させるために）生理学的に適合する緩衝液、例えばハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理食塩水もしくは酢酸緩衝液に加えて調製する。当該溶液は、懸濁剤、安定剤、および／または分散剤などの製剤化薬剤を含有してもよい。

【0050】

あるいは、ポリペプチドの薬学的に許容される塩は、使用前に適切な担体（例えば、滅菌非熱源水）から構成するための粉末形態であってもよい。

【0051】

経粘膜投与については、浸透しようとするバリアに適した浸透剤が製剤中に用いられる。該投与経路は、化合物を鼻腔まで転送することに用いられ、または舌下投与に用いられる。

【0052】

いくつかの実施形態において、経口投与については、ポリペプチドの薬学的に許容される塩と薬学的に許容可能な担体（キャリア）と共に、タブレット、丸剤、錠剤、トローチ、カプセル、液体、ゲル（ジェル）、シロップ、スラリー、懸濁液などに調製して、患者の治療のために経口摂取することに用いられる。例えば、粉末、カプセルおよびタブレットなどの経口固形製剤（調合物）に対して適切な賦形剤は、乳糖、ショ糖、マンニトールおよびソルビトール等の糖類などの充填剤、コーンスターチ、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロースおよび／またはポビドン（ＰＶＰ）などのセルロース製剤、並びに造粒剤および結合剤が挙げられる。必要に応じて、崩壊剤（例えば、架橋性のポリビニルピロリドン、寒天など）、またはアルギン酸もしくはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウムなど）を添加することができる。必要に応じて、固形剤形は、標準的な技術を用いて、糖または腸溶性コーティングで被覆することができる。例えば、懸濁剤、エリキシル剤および液剤などのような経口液体製剤に対して適切な担体、賦形剤または希釈剤は、水、グリセロール、油およびアルコールが挙げられる。さらに、香味剤、防腐剤、着色剤等を添加してもよい。

【0053】

前述製剤に加えて、本発明に係るポリペプチドの薬学的に許容される塩をデポー製剤として製剤化してもよい。そのような長時間作用型製剤は、移植（例えば、皮下または筋肉内）、または筋肉内注射によって投与することができる。従っ従って、例えば、化合物は、適当なポリマー材料、または疎水性材料（例えば、許容される油におけるエマルジョンとして調製され）、またはイオン交換樹脂と共に製剤化することができ、または、例えば難溶性塩のような難溶性誘導体に製剤化することができる。

【0054】

あるいは、他の薬物送達システムを用いることができる。キメラペプチドは、リポソーム、エマルションを用いて送達することができる。また、例えばジメチルスルホキシドのようないくつかの有機溶剤をも用いることができる。さらに、化合物は、治療剤含有固体重合体の半透性基質のような徐放性システム（持続放出性製剤）を用いて送達することができる。

【0055】

化学的性質によると、徐放性カプセルは、キメラペプチドを数週間乃至１００日間以上まで放出することができる。治療剤の化学的性質と生物学的安定性によると、タンパク質の安定化のための他の策略を用いることができる。

【0056】

ポリペプチドの薬学的に許容される塩は、意図した目的を効果的に達成する（例えば、損傷的な脳卒中関連障害の損傷効果を低減させる）ための量で用いられる。治療有効量とは、本発明に係るポリペプチドの薬学的に許容される塩で治療していない患者（または動物モデル）対照群における中枢神経系の損傷に対して、本発明に係るポリペプチドの薬学的に許容される塩で治療している患者（または動物モデル）における、脳卒中によって引き起こされる損傷を有意に低減するのに十分な量を意味する。本明細書に記載の方法によって治療が行われない比較可能な患者対照群における平均出力（梗塞ボリュームまたは障害指数によって測定される）に比べると、個体（対象）として治療された患者がより良い出力を達成した場合、この量は治療有効であると見なされる。個体として治療された患者がランキンスケール（Ｒａｎｋｉｎ ｓｃａｌｅ）において２以下の障害を示しており、またはバーテルスケール（Ｂａｒｔｈｅｌ ｓｃａｌｅ）において７５以上を示している場合、この量も治療有効量であると考えられる。比較可能な、治療していない群に比べると、治療された患者群が障害スケールに有意な改善（すなわち、障害がより少ない）のスコア分布を示している場合、この用量も治療上有効であると考えられる（Ｌｅｅｓら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ ２００６；３５４：５８８－６００を参照）。治療的に有効なレジメンは、治療的に有効な用量および上記所望な目的を達成するために必要な投与頻度の組み合わせを表す。

【0057】

いくつかの実施形態において、ポリペプチドの薬学的に許容される塩の好ましい用量範囲は、患者の体重１ｋｇあたり本発明に係る塩０．００１から２０μｍｏｌの用量範囲、必要に応じて患者の体重１ｋｇあたり０．０３から３μｍｏｌの用量範囲、それらの範囲内における任意の数値またはいずれか２つの数値の間の用量範囲を含んでいる。いくつかの方法において、６時間以内、患者体重１ｋｇあたり０．１～２０μｍｏｌの本発明に係る塩を投与する。いくつかの方法において、６時間以内、患者体重１ｋｇあたり０．１～１０μｍｏｌの本発明に係る塩を投与し、より好ましくは、６時間以内、患者体重１ｋｇあたり約０．３μｍｏｌの本発明に係る塩を投与する。また、他の場合、用量範囲は患者体重１ｋｇあたり０．００５～０．５μｍｏｌの本発明に係る塩である。６．２で除することにより、異なる表面積：質量比を補償して体重１ｋｇあたりの用量をラットからヒトに変換することができる。言い換えると、グラムで計算し、ヒトに適用される本発明に係る塩の適切な用量は、０．０１～１００ｍｇ／ｋｇ患者体重、より好ましくは０．０１～３０ｍｇ／ｋｇ患者体重、または０．０１～１０ｍｇ／ｋｇ患者体重、または０．０１～１ｍｇ／ｋｇ患者体重の用量範囲を含み、それらの範囲内における任意の数値またはいずれか２つの数値の間の用量範囲を含んでいる。

【0058】

いくつかの実施形態では、投与されるポリペプチドの薬学的に許容される塩の量は、治療されている被験者の体重、痛みの重症度、投与方法、処方医師の調整に依存している。症状が検出可能の時に、ひいては検出不能の時に、治療を繰り返すことができる。治療には、単独または他の薬と組み合わせてを投与することができる。

【0059】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドの薬学的に許容される塩の治療に有効な投与量は、有意な毒性を引き起こすことがなく、治療上の有益効果を与えることができる。キメラペプチドの毒性は、標準的な薬学的手順によって細胞培養物または実験動物において測定し、例えば、ＬＤ５０（個体群の５０％を殺す用量）やＬＤ１００（個体群の１００％％を殺す用量）を測定して決定することができる。毒性効果と治療効果との用量比は、治療指数である。高い治療指数を示しているポリペプチドの薬学的に許容される塩が好ましい（例えば、Ｆｉｎｇｌ等、１９７５、Ｉｎ：Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第１章、第１頁を参照）。

【0060】

第２の態様によれば、本発明は、第１の態様に記載のポリペプチドの薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体、賦形剤および／または希釈剤とを含む医薬組成物を提供する。

【0061】

いくつかの実施形態において、医薬組成物は、個体の神経系損傷、神経系損傷に関する疾患もしくは疼痛、神経変性疾患、不安またはてんかんを治療、改善または予防するために用いられる。
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、神経保護剤として用いられる。
いくつかの実施形態において、神経系損傷は、興奮性神経毒性によって引き起こされる神経系損傷である。

【0062】

いくつかの実施形態において、興奮性神経毒性によって引き起こされる神経系損傷は、脳卒中、脊髄損傷、脳もしくは脊髄の虚血性または外傷性損傷、中枢神経系（ＣＮＳ）神経細胞の損傷（急性ＣＮＳ損傷、虚血性脳卒中または脊髄損傷と、低酸素症、虚血、機械的損傷とを含み）、および神経変性疾患、不安、てんかん、脳卒中による損傷からなる群より選ばれる損傷を含む。

【0063】

いくつかの実施形態において、医薬組成物は、虚血性脳卒中、または虚血性脳卒中に起因する神経系損傷を治療、改善または予防するために用いられる。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、出血性脳卒中、または出血性脳卒中に起因する神経系損傷を治療、改善または予防するために用いられる。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、虚血性卒中から変換された出血性卒中、または虚血性卒中から変換された出血性卒中に起因する神経系損傷を治療、改善または予防するために用いられる。

【0064】

脳卒中は、中枢神経系中の被害の血流によって引き起こされる病症である。可能な原因は、塞栓（症）、出血（症）、血栓（症）を含む。いくつかの神経細胞（ニューロン細胞）は、被害の血流に起因してすぐに死亡する。これらの細胞は、その構成分子（グルタミン酸を含む）を放出し、そして前記構成分子はＮＭＤＡ受容体を活性化させ、前記ＮＭＤＡ受容体が細胞内カルシウムレベルおよび細胞内酵素レベルを高め、これにより、さらに多くの神経細胞死（興奮性神経毒性カスケード増幅）をもたらす。中枢神経系（ＣＮＳ）組織の死亡を梗塞と言われる。梗塞体積（すなわち、脳中に脳卒中による死亡の神経細胞の体積）は、脳卒中による病理学的損傷の程度の指標として使用できる。症候性効果は、梗塞の体積と梗塞の脳における存在場所との両方に依存している。障害指数は、症候性損傷の尺度（指標）、例えば、ランキン卒中出力ランキンスケール（Ｒａｎｋｉｎ Ｓｔｒｏｋｅ Ｏｕｔｃｏｍｅ Ｓｃａｌｅ，Ｒａｎｋｉｎ，Ｓｃｏｔｔ ＭｅｄＪ；２：２００－１５（１９５７））およびバーテルインデックス（Ｂａｒｔｈｅｌ Ｉｎｄｅｘ）として用いることができる。ランキンスケールは、次のとおり患者の全身状態（全身症状）を直接に評価することに基づいている。

【0065】

０： 症状がまったくない。
１： 症状があるが、顕著な障害がなく、日常の仕事や活動を実行できる。
２： 軽度の障害で、すべての以前の活動を実行することができないが、助けなしに自分の身辺の世話をすることができる。
３： いくつかの助けを必要となる中等度の障害であるが、助けなしに歩くことができる。
４： 中等度から重度の障害であり、助けなしに歩くことができなく、助けがなければ自分の体の世話をすることができない。
５： 重度の障害であり、寝たきり、失禁、且つ持続的なケアと注意を必要とする。

【0066】

Ｂａｒｔｈｅｌインデックスは、患者の日常生活における１０種類の基本的な活動を実施する能力について一連の質問に基づき、前記質問から０と１００の間のスコアを得、低いスコアはより多くの障害を表す（Ｍａｈｏｎｅｙら、Ｍａｒｙｌａｎｄ Ｓｔａｔｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ １４：５６－６１（１９６５））。

【0067】

あるいは、Ｗｅｂ（ワールドワイドウェブ）においてｎｉｎｄｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｏｃｔｏｒｓ／ＮＩＨ＿Ｓｔｒｏｋｅ＿Ｓｃａｌｅ＿Ｂｏｏｋｌｅｔ．ｐｄｆから入手可能であるＮＩＨ脳卒中スケールを用いて脳卒中の重症度／出力を測定することができる。該スケールは、患者の意識、運動、感覚、言語機能のレベルの評価を含む１１群の機能を実行する患者の能力に基づいている。

【0068】

虚血性脳卒中は、より明確に、脳への血流の閉塞による脳卒中の１種類であることを指定している。そのような閉塞の潜在的な病状は、最も一般的に、血管壁に沿って脂肪沈着物が起こっていることである。この病症は、アテローム性動脈硬化症と呼ばれている。これらの脂肪沈着物は、２種類の閉塞を引き起こす可能性がある。脳血栓症は、血管の閉塞部で形成された血栓（血塊）を指す。「脳塞栓症」は、通常、血液中の様々な塞栓（例えば、心臓内の壁性血栓、動脈硬化性プラーク、脂肪、腫瘍細胞、線維軟骨または空気など）のような血流に伴って脳動脈に入って血管を閉塞し、側副循環で補償できない場合、該脳動脈での血液供給領域における脳組織が虚血性壊死を引き起こして局所神経障害となっていることを意味する。塞栓症の第２の要因は、動脈細動と呼ばれる不整脈である。これは、次の病症を引き起こし、その中でも血塊が心に形成し、移動して脳に転送されることが可能である。虚血性脳卒中の他の潜在的な原因は、出血、血栓、動脈や静脈の切断、心停止、何らかの原因（出血を含む）によるショック、および脳血管または脳に導入する血管に対する直接の外科手術的損傷あるいは心臓手術に行く医原性原因が挙げられる。虚血性脳卒中は、すべての脳卒中症例の約８３％を占めている。

【0069】

いくつかの他の神経学的病症は、ＮＤＭＡＲにより媒介される興奮性神経毒性による神経細胞死を引き起こす可能性もある。上記病症は、神経変性疾患、不安、てんかん、低酸素症、脳卒中と関係のないＣＮＳへの損傷、例えば外傷性脳損傷および脊髄損傷などが挙げられる。したがって、いくつかの実施形態において、医薬組成物は、神経変性疾患、不安またはてんかんを治療、改善または予防するために用いられ、前記神経変性疾患は、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、およびハンチントン病を含む。

【0070】

いくつかの実施形態において、医薬組成物は、神経保護剤として用いられる。

【0071】

第３の態様によれば、本発明は、第１の態様に記載のポリペプチドの薬学的に許容される塩、あるいは第２の態様に記載の医薬組成物を個体に投与することを含む、前記個体の神経系損傷、神経系損傷に関する疾患もしくは疼痛、神経変性疾患、不安またはてんかんを治療、改善または予防する方法を提供する。

【0072】

いくつかの実施形態において、神経系損傷は、興奮性神経毒性によって引き起こされる神経系損傷であり、その中で前記損傷または疼痛は末梢神経系または中枢神経系に位置する。いくつかの実施形態において、興奮性神経毒性によって引き起こされる神経系損傷は、脳卒中もしくは脊髄損傷、脳もしくは脊髄の虚血性または外傷性損傷、中枢神経系（ＣＮＳ）神経細胞の損傷（急性ＣＮＳ損傷、虚血性脳卒中または脊髄損傷と、低酸素症、虚血、機械的損傷とを含み）、および神経変性疾患、不安、てんかん、脳卒中による損傷からなる群より選ばれる損傷を含む。

【0073】

いくつかの実施形態において、神経変性疾患は、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、およびハンチントン病を含む。

【0074】

いくつかの実施形態において、前記疾患は、虚血性脳卒中、または虚血性脳卒中に起因する神経系損傷である。いくつかの実施形態において、前記疾患は、出血性脳卒中、または出血性脳卒中に起因する神経系損傷である。いくつかの実施形態において、前記疾患は、虚血性卒中から変換された出血性卒中、または虚血性卒中から変換された出血性卒中に起因する神経系損傷である。

【0075】

第４の態様によれば、本発明は、第１の態様に記載のポリペプチドの薬学的に許容される塩、あるいは第２の態様に記載の医薬組成物の、個体における神経系損傷、神経系損傷に関する疾患もしくは疼痛、神経変性疾患、不安またはてんかんを治療、改善または予防するために用いられる医薬の製造あるいは神経保護剤の製造における使用を提供する。

【0076】

いくつかの実施形態において、前記神経系損傷は、興奮性神経毒性によって引き起こされる神経系損傷であり、前記損傷または疼痛は末梢神経系または中枢神経系に位置する。いくつかの実施形態において、興奮性神経毒性によって引き起こされる神経系損傷は、脳卒中もしくは脊髄損傷、脳もしくは脊髄の虚血性または外傷性損傷、中枢神経系（ＣＮＳ）神経細胞の損傷（急性ＣＮＳ損傷、虚血性脳卒中または脊髄損傷と、低酸素症、虚血、機械的損傷とを含み）、および神経変性疾患、不安、てんかん、脳卒中による損傷からなる群より選ばれる損傷を含む。

【0077】

いくつかの実施形態において、前記神経変性疾患は、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、およびハンチントン病を含む。

【0078】

いくつかの実施形態において、前記疾患は、虚血性脳卒中、または虚血性脳卒中に起因する神経系損傷である。いくつかの実施形態において、前記疾患は、出血性脳卒中、または出血性脳卒中に起因する神経系損傷である。いくつかの実施形態において、前記疾患は、虚血性卒中から変換された出血性卒中、または虚血性卒中から変換された出血性卒中に起因する神経系損傷である。

【0079】

本明細書に記載の「個体」とは、鳥類、爬虫類および哺乳類を含む動物を意味する。いくつかの実施形態において、前記個体は哺乳類動物であり、霊長類および非霊長類動物、例えば、ヒト、チンパンジー、牛、ウマ、豚、ヒツジ、ヤギ、イヌ、猫、およびラット、マウス等のげっ歯類動物を含む。

【0080】

上記の詳細な説明は、本発明を当業者にさらに明確に理解させるだけを目指しているが、いずれの態様を限定するものではないことを理解すべきである。当業者は、前記実施形態に様々な修正および変更をすることができる。

【実施例】

【0081】

以下の実施例は、単に本発明のいくつかの実施形態を説明するために提供されたものであり、如何なる制限の目的や性質にならない。

【0082】

実施例１： 活性ペプチド分子のスクリーニング
既に報告された研究結果によれば、Ｔａｔ膜貫通ペプチドＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号：２）を選択して他の異なる数のアミノ酸に連結してペプチドライブラリーを形成した。ペプチドライブラリーにおけるキメラペプチド分子を、それぞれ生体外で発現・精製されたＰＤＺ１／２ドメインに相互作用し、相互作用力の強さによりポリペプチドに対して予備スクリーニングをした。

【0083】

固定相分子（リガンド）は、ＰＤＺ１／２タンパク質で、分子量：約２０ｋＤ、濃度：２ｍｇ／ｍＬである。移動相分子（分析物）は、スクリーニングされているポリペプチドで、分子量：約２ｋＤ、濃度：１０ｍｇ／ｍＬであった。Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００機器を使用して、ＣＭ５チップが固定に用いられた。泳動バッファーは、ＰＢＳ＋０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０であった。アミノカップリング法を用いて固定した。リガンドの濃度は、１０μｇ／ｍＬであった。固定バッファーは、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０であった。一定量の１４００ＲＵでフロー細胞（ｆｌｏｗｃｅｌｌ）２に固定された。流速が１０μＬ／ｍＬであり、リガンド試料導入（サンプル注入）が１分間である。再生液がＰＨ２．０＋２．５の１０ｍＭのＧｌｙを用い、再生は流速３０μＬ／分間で行った。試料導入時間は３０ｓであった。

【0084】

動力学的分析は以下の条件で行われ、すなわち、対照チャネル：フロー細胞１、泳動バッファー：ＰＢＳ、運行モード：Ｋｉｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｗｉｚａｒｄモード、濃度勾配：６．２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、試料導入時間：１分間、解離時間：２分間、流速：３０μＬ／分間。

【0085】

データは、フィッティングソフトウェアＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ４．１により適合（フィッティング）させた。フィッティングモデルは、１：１の結合モデルである。解離定数ＫＤ値は作用力に反比例した。

【0086】

スクリーニングにより、ＰＤＺ１／２ドメインと強い相互作用能力を持つキメラペプチドが得られ、Ｐ５と命名し、その配列は次の通りである。

【0087】

Ｐ５： ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＹＥＫＬＬＤＴＥＩ
報告された研究における類似のキメラペプチドと直接に比較するために、次のような配列を持つ対照キメラペプチドＮＡ－１が導入された。

【0088】

ＮＡ－１： ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＫＬＳＳＩＥＳＤＶ（配列番号：４）
また、Ｐ５とＮＡ－１との構造的差異を比較することにより、キメラペプチドＮＡ－１の活性ペプチドのＮ末端に２つの残基ＹＥを追加したキメラペプチドＹＥ－ＮＡ－１はさらに導入され、その配列は、次の通りである。

【0089】

ＹＥ－ＮＡ－１： ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＹＥＫＬＳＳＩＥＳＤＶ（配列番号：５）
キメラペプチドＮＡ－１、ＹＥ－ＮＡ－１とＰ５と同時に上記のＰＤＺ１／２ドメインとの相互作用を試験した結果、下記表１に示した。

【0090】

【表1】

表１に示すように、対照キメラペプチドＮＡ－１に比べると、キメラペプチドＹＥ－ＮＡ－１およびＰ５とＰＤＺ１／２ドメインとの相互作用力はより強く、且つＰ５の作用性質はより良い。したがって、本発明者らの推測によれば、活性ペプチドのＮ末端に付加的な２つのアミノ酸残基ＹＥは、ポリペプチドとＰＤＺ１／２ドメインとの相互作用に対して一定の強化効果をもたらした。また、Ｐ５は、ＹＥ－ＮＡ－１のカルボキシル末端に対して疎水性が比較的弱いセリン（ＳＳ）２つを低減した。発明者らの推測によれば、これによりポリペプチドとＰＤＺ１／２ドメインとの相互作用をさらに高める可能性がある。

【0091】

実施例２：プルダウン実験でＰ５とＰＤＺ１／２ドメインとの相互作用を検出する
Ｐ５がＰＤＺ１／２ドメインとを相互作用できることを裏付けるために、プルダウン実験をした。

【0092】

カラムは、１００μＬのＨｉｓビーズおよび１ｍＬのＭＣＡＣ－０バッファーを用いて５分間平衡させた。４℃で振とうした。得られた混合物を、４℃で５０００ｇで遠心分離させ、上澄みを捨てた。混合物に、ＰＤＺ１／２タンパク質１ｍｇを加え、そしてバッファーを用いて１ｍＬになるまで追加した。４℃で、得られた混合物を１時間回転して結合させた。前記混合物を、４℃で５０００ｇで１分間遠心分離させ、上澄みを捨てた。得られた混合物を、１ｍＬのＭＣＡＣ－０バッファーを用いて、１回あたり５分間（４℃で、振とうで洗浄し）で３回洗浄した。混合物に、Ｐ５タンパク質１ｍｇを加え、そしてバッファーを用いて１ｍＬになるまで追加した。４℃で、得られた混合物を２時間回転して結合させた。前記混合物を、４℃で５０００ｇで１分間遠心分離させ、上澄みを捨てた。得られた混合物を、１ｍＬの溶解液（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）を用いて、１回あたり５分間（４℃で、振とうで洗浄し）で３回洗浄した。洗浄後、２０μＬのＭＣＡＣ－３００を加えた。遠心分離し、溶出液を取ってＳＤＳ－ＰＡＧＥ検出を行った。実験結果は図１に示した。

【0093】

図１に示すように、キメラペプチドＰ５の溶出バンドに、Ｐ５とＰＤＺ１／２ドメインとの両方を同時に含んでおり、これにより、キメラペプチドＰ５がＰＤＺ１／２ドメインに結合できることが裏付けられた。

【0094】

実施例３： 異なるＰ５塩のラットＭＣＡＯモデルに対する治療効果
本発明者らは、実施例１および２で得られたキメラペプチドＰ５に基づき、Ｐ５－トリフルオロ酢酸塩（Ｐ５－ＴＦＡ）、Ｐ５－酢酸塩（Ｐ５－Ａｃ）、Ｐ５－塩酸塩（Ｐ５－Ｃｌ）を設計し、中国杭州にあるＣｈｉｎｅｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．に合成を依頼した。製造された３種類のＰ５塩には、その治療効果についてラットＭＣＡＯモデルで測定した。

【0095】

実験動物および材料
動物： 成年ＳＤラット（Ｖｉｔｔａｌｉａ）、ＳＰＦグレード、体重２２０～２５０ｇ、雄を用いた。

【0096】

機器および薬品： 線切断用鋏１つ、眼科手術鋏２つ、湾曲ピンセット４つ、手術用縫合糸４＃と５＃、三角形縫合針６×１７、直径０．２６ｍｍの咬合線、持針器１つ。Ｅｎｂｉｐｕ塩化ナトリウム注射剤（ＮＢＰ）（石薬グループ恩必普薬業有限公司（Ｓｈｉｊｉａｚｈｕａｎｇ Ｇｒｏｕｐ ＮＢＰ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．））、抱水クロラール、フロセミド（２０ｍｇ／瓶）、硫酸ゲンタマイシン（８０ｍｇ／瓶）、綿棒、医用トレイなど。

【0097】

ＭＣＡＯモデル方法：
局所脳虚血再灌流モデルの作製は、ロンガ（ｌｏｎｇａ）によって提案された可逆中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）縫合法に従ってラットの脳解剖学的構造に基づいて改善し、局所脳虚血再灌流モデルの作製した。１０％抱水クロラールを用いて用量０．３ｍＬ／ｋｇで腹腔内投与して麻酔させた。麻酔後、頚部正中線で切開して総頚動脈（ＣＣＡ）、外頚動脈（ＥＣＡ）と翼口蓋動脈を露出させた。モノフィラメントナイロン釣り糸（０．２６ｍｍ）の糸端部（０．５ｃｍ）をパラフィンで被覆し、長さ２０ｍｍの位置をマークし、全てのラットに対して右側ＣＣＡ切口部から挿入され、翼口蓋動脈が誤挿入を防止するために一時的にクランプで締められた。咬合線の長さは、ＣＣＡ分岐部から約１８～２０ｍｍとし、動物体重によって決め、右側にある中大脳動脈を閉塞し、次いで皮膚を縫合し、咬合線の末端部が皮膚に固定された。虚血が２時間に達した後、慎重に咬合線を抽出し、すなわち、再灌流を形成した。体の温度は、虚血期間および再灌流後２時間、（３７±０．５）℃に維持した。モデルの成功マーカー（判断基準）としては、ラットが手術麻酔から覚めた後、左側の肢体が麻痺しており、直立が不安定になっていることで、ラットの尾を持ち上げた時に片側に回すことである。

【0098】

実験の群分け（グルーピング）
実験動物は、対照群（正常群）、モデル群（生理食塩水群）、陽性薬物ブチルフタリド群（ＮＢＰ）およびＰ５塩投与群に分けられた。虚血のモデル化１時間後、生理食塩水、陽性薬ブチルフタリド（２．５ｍｇ／ｋｇ）、各種のＰ５塩（１０ｍｇ／ｋｇ）を、それぞれ各群のラットに尾静脈を介して注射した。

【0099】

梗塞体積の計算
投与２４時間後、ラットを断頭により犠牲死させ、脳組織を速やかに取って－２０℃の冷蔵庫に入れ、１０分間後、室温環境下に置いた。そして、前記脳をラット脳切片用金型に配置して嗅球、小脳および低脳幹部を切除した後、プロファイルに示すような厚さ（間隔）２ｍｍで５回カットして６つの脳連続冠状粗切片にカットした。その後、脳切片は速やかに２％のＴＴＣを含む溶液５ｍＬに入れ、恒温３７℃、遮光で３０分間インキュベートし、この期間５分間おきに脳切片を反転した。ＴＴＣ染色後、正常組織はローズレッドを呈し、梗塞組織は未染色で白色を呈した。各群の脳切片をきれいに配列し、撮影して保存し、画像解析システムのソフトウエアで処理して統計し、各脳切片の梗塞面積を計算して各脳切片の厚さ２ｍｍを乗じた。個々の動物は、それぞれのすべての脳切片の梗塞面積に厚さを掛けて加算すると、脳梗塞体積となる。体積は、脳浮腫の影響を排除するために、大脳半球を占める割合として表した。

【0100】

実験結果を図２に示した。その結果は、モデル群に比べ、Ｐ５－ＴＦＡ、Ｐ５－Ａｃ、Ｐ５－Ｃｌの投与により、ラット脳部の梗塞体積を有意に減少させ、そのうちｐ＜０．０１である。陽性薬物ＮＢＰに比べ、Ｐ５－ＴＦＡ、Ｐ５－Ａｃ、Ｐ５－Ｃｌの投与により、ラット脳部の梗塞体積を減少させる効果も陽性薬物ＮＢＰより著しく優れ、そのうちｐ＜０．０５であることを示した。

【0101】

実施例４：異なるＰ５塩の細胞毒性の測定
本実施例では、実施例３におけるＰ５－ＡｃおよびＰ５－Ｃｌの二種類のポリペプチド塩の細胞毒性を検出した。

【0102】

実験材料
検出用細胞株ＰＣ１２細胞、垂直層流クリーンベンチ、蒸気滅菌器、遠心分離機、顕微鏡、マイクロプレートリーダー、カバースリップ、血球計算板、手動カウンター、アルコールランプ、ピペット（計器）、ピペットチューブ、ピペットチップ、遠心管、９６ウェルプレート、ＰＢＳ／生理食塩水、高糖ＤＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳおよび１％二重抗体を含む）。ＣＣＫ８はＳｏｌａｒｂｉｏ社から購入した。

【0103】

実験手順
対数期の細胞を消化し、それらを４×１０^４／ウェルの密度で９６ウェルプレートに移し、各群で３つの重複ウェルを設定し、そして細胞を一晩培養した。培地でＰ５塩（例えば５μＭ）を調製した。９６ウェルプレートの上清を捨て、ＰＢＳ／生理食塩水で２～３回洗浄した後、各ウェルにＰ５塩１００μＬを加え、ブランク対照（細胞なし）に同じＰ５塩を加え、細胞を２４時間培養した。９６ウェルプレートの各ウェルにＣＣＫ８を１０μＬ加え、１時間インキュベートした。９６ウェルプレートを取り出し、マイクロプレートリーダーを使用して波長４５０ｎｍでの吸光度を測定した。測定された数値から細胞生存率を算出した。計算式は次のとおりである。

【0104】

細胞生存率（％）＝（実験群－対応のブランク対照群）／（０μＭ実験群－０μＭブランク対照群）×１００％
実験結果を図３に示した。結果は、Ｐ５－ＡｃおよびＰ５－Ｃｌの２種類のＰ５ポリペプチドの薬学的に許容される塩は、５μＭの濃度で有意な細胞毒性を持たないことを示した。

【0105】

実施例５：異なるＰ５塩の安定性
本実施例は、実施例３における３種類のＰ５塩の光照、高温高湿条件下での安定性をそれぞれ検出した。

【0106】

Ｐ５塩粉末の安定性分析
実施例３で調製された３種類のＰ５塩の粉末を、光照（３０００Ｌｘ）＋紫外、高温（６０℃）および高湿（７５％ＲＨ）の条件下で１０日間処理した。処理後、粉末を水に溶解して濃度２ｍｇ／ｍＬの溶液に調製し、そして精密に１０μＬを取って液体クロマトグラフに注入し、クロマトグラムを記録し、相対面積比較法に基づいて関連物質を計算して含有量と不純物の種類を分析した。

【0107】

計器および試薬
高速液体クロマトグラフ（Ａｇｉｌｅｎｔ、１２６０ ＥＺＣｈｒｏｍ）、クロマトグラフィーカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ、ＺＯＲＢＡＸ ３００ＳＢ－Ｃ１８（４．６＊２５０ｍｍ、５μｍ）ＳＮ：ＵＳＨＨ００８４１６）、分析天秤（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ＢＴ２５Ｓ）、濾過膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、０．４５μｍ ＰＴＦＥ）、アセトニトリル（ＭＲＥＤＡ）、水（ＡＬＫＡＱＵＡ）、ＴＦＡ（ＭＲＥＤＡ）、３箱型総合薬物安定性試験ボックス（上海佐誠実験儀器有限公司（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｚｕｏｃｈｅｎｇ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）、型番：ＳＨＨ－３ＳＤＴ）。

【0108】

クロマトグラフィー条件
移動相：Ａ ０．０６５％ＴＦＡ－水、
Ｂ ０．０５％ＴＦＡ－ＡＣＮ
検出波長λ＝２２０ｎｍ、流速Ｖ＝１．０ｍＬ／ｍｉｎ、温度Ｔ＝３６℃
注入量Ｉｎｊ＝１０μＬ
勾配条件：０～３０ｍｉｎ、Ｂ％＝５～６５％

【0109】

結果の分析
３種類のＰ５塩粉末の安定性分析の結果を以下の表２と図４のＡおよびＢに示した。

【0110】

【表2】

結果が下記のように明らかにした。

【0111】

光照＋紫外条件下で処理した後、３種類の塩の主ピーク面積百分率、不純物の種類数が明らかに異なっており、相対的安定性の順序は、「トリフルオロ酢酸塩＞酢酸塩＞塩酸塩」である。
高温条件で処理した後、３種類の塩の主ピーク面積百分率はいずれも９９．５％以上であり、明らかな差がなく、不純物の種類数で比べると、酢酸塩は最も安定的である。

【0112】

高湿条件下で処理した後、酢酸塩の主ピーク面積百分率が明らかに低減しており、相対的安定性の順序は、「トリフルオロ酢酸塩＞塩酸塩＞酢酸塩」である。

【0113】

全体的に言えば、３種類の塩は異なる処理下で比較的よい安定性を示した。

【0114】

Ｐ５食塩水の安定性分析
実施例３の３種類のＰ５塩を水に溶解して２ｍｇ／ｍＬの溶液に調製した。光照（３０００Ｌｘ）および高温（６０℃）の条件下で１０日間処理した。処理後、精密に１０μＬを取って液体クロマトグラフに注入し、クロマトグラムを記録し、相対面積比較法（ａｒｅａ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）に基づいて関連物質を計算して含有量と不純物の種類を分析した。

【0115】

計器および試薬
高速液体クロマトグラフ（Ａｇｉｌｅｎｔ、１２６０ ＥＺＣｈｒｏｍ）、クロマトグラフィーカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ、ＺＯＲＢＡＸ ３００ＳＢ－Ｃ１８（４．６＊２５０ｍｍ、５μｍ）ＳＮ：ＵＳＨＨ００８４１６）、分析天秤（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ＢＴ２５Ｓ）、濾過膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、０．４５μｍ ＰＴＦＥ）、アセトニトリル（ＭＲＥＤＡ）、水（ＡＬＫＡＱＵＡ）、ＴＦＡ（ＭＲＥＤＡ）、３箱型総合薬物安定性試験ボックス（上海佐誠実験儀器有限公司（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｚｕｏｃｈｅｎｇ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）、型番：ＳＨＨ－３ＳＤＴ）。

【0116】

クロマトグラフィー条件
移動相：Ａ ０．０６５％ＴＦＡ－水、
Ｂ ０．０５％ＴＦＡ－ＡＣＮ
検出波長λ＝２２０ｎｍ、流速Ｖ＝１．０ｍＬ／ｍｉｎ、温度Ｔ＝３６℃
注入量Ｉｎｊ＝１０μＬ
勾配条件：０～３０ｍｉｎ、Ｂ％＝５～６５％

【0117】

結果の分析
３種類のＰ５塩の水溶液の安定性分析の結果を表３と図４のＣおよびＤに示した。

【0118】

【表3】

結果が下記のように明らかにした。

【0119】

光照条件下で処理した後、３種類の塩溶液の主ピーク面積百分率、不純物の種類数が異なっており、相対的安定性の順序は、「酢酸塩＞トリフルオロ酢酸塩＞塩酸塩」である。

【0120】

高温条件下で処理した後、塩酸塩と酢酸塩の主ピーク面積百分率、不純物の種類数が異なっており、相対的安定性の順序は、「酢酸塩＞塩酸塩」である。

【0121】

全体的に言えば、３種類の塩の溶液は異なる処理下でも比較的よい安定性を示した。

【0122】

本明細書に引用されている全ての出版物、特許文献は、個々の出版物または特許がそれぞれ本明細書に組み込まれて参照としていることを明確に示されているように、参照により本明細書に援用する。本発明に開示された真の精神および範囲から逸脱しない限り、本明細書に記載の実施形態に対して様様な変更および均等物に置き換えることができる。特に文脈で断らない限り、本明細書に記載の実施態様に係る任意の特徴、ステップや実施形態は、任意の他の特徴、ステップや実施形態とを組み合わせて用いることができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

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