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特許7003057グリコシル化クロリンｅ６誘導体、または、その薬学的に許容される塩、医薬組成物、標的を破壊する方法、および、グリコシル化クロリンｅ６誘導体、またはその薬学的に許容される塩の製造方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-01-05
(45)【発行日】2022-02-10
(54)【発明の名称】グリコシル化クロリンｅ６誘導体、または、その薬学的に許容される塩、医薬組成物、標的を破壊する方法、および、グリコシル化クロリンｅ６誘導体、またはその薬学的に許容される塩の製造方法
(51)【国際特許分類】
C07H 15/14 20060101AFI20220203BHJP
A61K 31/7056 20060101ALI20220203BHJP
A61K 41/00 20200101ALI20220203BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20220203BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20220203BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220203BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220203BHJP
C07H 1/00 20060101ALI20220203BHJP
A61K 49/00 20060101ALI20220203BHJP
【ＦＩ】
C07H15/14 CSP
A61K31/7056
A61K41/00
A61P17/00
A61P27/02
A61P35/00
A61P43/00 121
C07H1/00
A61K49/00
A61P43/00 111
【請求項の数】
5
(21)【出願番号】P 2018554260
(86)(22)【出願日】2017-11-30
(86)【国際出願番号】 JP2017043144
(87)【国際公開番号】W WO2018101434
(87)【国際公開日】2018-06-07
【審査請求日】2020-10-02
(31)【優先権主張番号】P 2016233486
(32)【優先日】2016-11-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】516360720
【氏名又は名称】片岡 洋望
(73)【特許権者】
【識別番号】516360731
【氏名又は名称】西江 裕忠
(73)【特許権者】
【識別番号】507029030
【氏名又は名称】城 卓志
(73)【特許権者】
【識別番号】500018273
【氏名又は名称】矢野 重信
(74)【代理人】
【識別番号】100152984
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 秀明
(74)【代理人】
【識別番号】100148080
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 史生
(72)【発明者】
【氏名】矢野 重信
(72)【発明者】
【氏名】片岡 洋望
(72)【発明者】
【氏名】西江 裕忠
(72)【発明者】
【氏名】城 卓志
(72)【発明者】
【氏名】福本 圭介
(72)【発明者】
【氏名】仲野 靖浩
【審査官】松澤 優子
(56)【参考文献】
【文献】特表２００４－５３２８９０（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２００８／１０２６６９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】中国特許出願公開第１１１３９１４（ＣＮ，Ａ）
【文献】LONIN, I. S. et al.，Mendeleev Communications，2012年，22(3)，p.157-8，DOI 10.1016/j.mencom.2012.05.016
【文献】AKSENOVA, A. A. et al.，Russian Journal of Bioorganic Chemistry，2000年，26(2)，p.111-114
【文献】SYLVAIN, I. et al.，Bioorganic & Medicinal Chemistry，2002年，10(1)，p.57-69
【文献】AKSENOVA, A. A. et al.，Russian Journal of Bioorganic Chemistry，2001年，27(2)，p.124-129
【文献】矢野重信ら，医工連携による次世代光医療用糖鎖連結光感受性物質の開発，MEDICAL PHOTONICS，2016年07月13日，2(22)，p.19-28
【文献】FUHRHOP, J. H. et al.，Journal of the American Chemical Society，1992年，114(11)，p.4159-65
【文献】CIECKIEWICZ, E. et al.，European Journal of Organic Chemistry，2015年，(27)，p.6061-74
【文献】JIANG, X. et al.，Tetrahedron Letters，1995年，36(3)，p.365-368
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｈ
Ａ６１Ｋ
Ａ６１Ｐ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記一般式（４）、（５）または（６）で示される、グリコシル化クロリンｅ６誘導体、またはその薬学的に許容される塩。【化1】
【化2】
【化3】
【請求項2】
腫瘍、皮膚疾患、眼疾患または加齢黄斑変性の光線力学治療用であり、請求項１に記載のグリコシル化クロリンｅ６誘導体、またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含む医薬組成物。
【請求項3】
請求項１に記載のグリコシル化クロリンｅ６誘導体、またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、医薬組成物。
【請求項4】
腫瘍、皮膚疾患、眼疾患または加齢黄斑変性の、治療、診断または検出のための、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項5】
クロリンｅ６と糖とを連結基を介して結合させる工程を含む、請求項１に記載のグリコシル化クロリンｅ６誘導体、またはその薬学的に許容される塩の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、光線力学的療法（Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ；ＰＤＴ）および／または、光線力学的診断（Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ：ＰＤＤ）において好適に用いることができる、グリコシル化クロリンｅ６誘導体、または、その薬学的に許容される塩に関する。また、本発明は、医薬組成物、標的を破壊する方法、および、グリコシル化クロリンｅ６誘導体、またはその薬学的に許容される塩の製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
光線力学的療法（ＰＤＴ）は、標的となる疾患組織（以下、「標的組織」ともいう。）を有する患者に光感受性物質を投与し、標的組織（癌組織、腫瘍組織、皮膚病変部、および、新生血管等）に光感受性物質を集積させた後、光感受性物質を励起するのに適切な波長の光を照射することにより、標的組織のみを選択的に破壊する治療方法である。この場合、光励起されて活性化した光感受性物質が、近傍の分子状酸素に対して直接的または間接的にエネルギー移動を行い、これによる一重項酸素の生成が標的組織破壊の主要メカニズムであると考えられている。
【0003】
ＰＤＴに用いられる光感受性物質としては、ヘマトポルフィリン誘導体（例えばフォトフリン（登録商標））がよく知られており、既に実用化されている。しかしヘマトポルフィリン誘導体は、人体に投与した際に副作用として一時的な光過敏症を引き起こすことが知られている。また、ヘマトポルフィリン誘導体の癌組織に対する選択性は充分なものではなく、正常組織への集積性も認められる。したがって、投与を受けた患者は、正常組織に集積したヘマトポルフィリン誘導体（ポルフィマーナトリウム）による光増感作用で正常細胞が破壊されないように、それが体外に排泄されるまで長時間に渡って暗所に留まることが必要である。しかし、ポルフィマーナトリウムは正常組織からの排出速度が遅いため、４週間以上にわたって光過敏症が残ることが報告されている。加えて、ポルフィリン誘導体の最大吸収波長は約６３０ｎｍであり、モル吸光係数も低いため、ＰＤＴの治療効果（言い換えれば、標的組織）が５～１０ｎｍ程度の表層癌に限定されてしまう。
【0004】
このような化合物に対し、より長波長領域（６５０ｎｍ～８００ｎｍ）に吸収をもつフタロシアニン系化合物、および、クロリン系化合物等が第２世代の薬物として提案されている。例えば、クロリン系化合物にアスパラギン酸を結合させたタラポルフィンナトリウム（以下、本明細書において、「ＴＳ」ともいう。レザフィリン（登録商標））等は既に実用化され、臨床使用量を徐々に伸ばしている。このような薬剤においては、代謝性および吸収波長の長波長化等の問題をクリアしているものの、殺腫瘍細胞性および腫瘍組織の成長抑制効果については不十分といった問題がある。
【0005】
上記のようなＰＤＴ用薬剤として、特許文献１には、クロリン系化合物であるクロリンｅ６と葉酸とを結合させた化合物が提案されている。また特許文献２にはガレクチンバイオマーカーの検出用にクロリン系化合物とガラクトサミンとを結合させた化合物が提案されている。さらに、非特許文献１には、１２４ヨウ素でラベルしたクロリン系化合物に糖を結合させた化合物を合成し、ＰＥＴ（Ｐｏｓｉｔｒｏｎ Ｅｍｉｓｓｉｏｎ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）イメージングおよび光線力学的療法への提案がされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【文献】特表２０１１－５１８８９０号公報
【文献】ＫＲ２００９０４７８７２Ａ
【非特許文献】
【0007】
【文献】Ravindra K . Pandey et al., Journal of Medical Chemistry 2009, 52, 445-455
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
以上のように、ポルフィリン系化合物およびクロリン系化合物についても開発、研究が進められているが、殺腫瘍細胞性および腫瘍組織の成長抑制効果の点では改善の余地があった。
そこで、本発明は、優れた殺腫瘍細胞性（光毒性）、および、優れた腫瘍組織の成長抑制効果を有するグリコシル化クロリンｅ６誘導体、またはその薬学的に許容される塩の提供を課題とする。
また本発明は、医薬組成物、標的を破壊する方法、および、グリコシル化クロリンｅ６誘導体、またはその薬学的に許容される塩の製造方法の提供も課題とする。
そこで、本発明は、優れた殺腫瘍細胞性（光毒性）、および、優れた腫瘍組織の成長抑制効果を有するグリコシル化クロリンｅ６誘導体、またはその薬学的に許容される塩の提供を課題とする。
また本発明は、医薬組成物、標的を破壊する方法、および、グリコシル化クロリンｅ６誘導体、またはその薬学的に許容される塩の製造方法の提供も課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは、種々のポルフィリン誘導体、および、クロリン誘導体を検討した結果、光線力学的治療用薬として有用な、生体に対する安全性を確保し且つ少量で高い光毒性を示す光感受性物質となる、新規なグリコシル化クロリンｅ６誘導体およびその製造方法を見出し、本発明に至ったのである。
【0010】
すなわち、本発明は、以下の通りである。
［１］ 後述する一般式（１）で示されるグリコシル化クロリンｅ６誘導体、または、その薬学的に許容される塩。
［２］ 後述する一般式（１）において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が、それぞれ独立に、炭素数１～６のアセトキシアルキル基または炭素数１～６の炭化水素基である、［１］に記載のグリコシル化クロリンｅ６誘導体、またはその薬学的に許容される塩。
［３］ 後述する一般式（１）において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が、メチル基である、［１］または［２］に記載のグリコシル化クロリンｅ６誘導体、またはその薬学的に許容される塩。
［４］ 後述する一般式（１）において、－Ｘ－が－Ｘ３－Ｏ－であり、後述する一般式（２）で示される、［１］～［３］のいずれかに記載のグリコシル化クロリンｅ６誘導体、またはその薬学的に許容される塩。
［５］ 後述する一般式（２）において、Ｘ３が、Ｒのアノマー位炭素原子と結合した基、または、アノマー位炭素原子に隣接する炭素原子と結合した基である、［４］に記載のグリコシル化クロリンｅ６誘導体、またはその薬学的に許容される塩。
［６］ 後述する一般式（２）において、－Ｘ３－が－Ｓ－Ｘ４－であり、後述する一般式（３）で示される、［４］または［５］に記載のグリコシル化クロリンｅ６誘導体、またはその薬学的に許容される塩。
［７］ 後述する一般式（３）において、Ｘ４が、炭素数１～１６の直鎖状または分岐鎖状のアルキレン基である、［６］に記載のグリコシル化クロリンｅ６誘導体、またはその薬学的に許容される塩。
［８］ 後述する一般式（３）において、Ｘ４が－（ＣＨ２）ｎ－で示されるアルキレン基であり、ｎが１～１６の整数である、［６］または［７］に記載のグリコシル化クロリンｅ６誘導体、またはその薬学的に許容される塩。
［９］ 後述する一般式（３）において、Ｘ４が－（ＣＨ２）ｎ－で示されるアルキレン基であり、ｎが３～１０の整数である、［６］～［８］のいずれかに記載のグリコシル化クロリンｅ６誘導体、またはその薬学的に許容される塩。
［１０］ 糖が、単糖類、オリゴ糖、多糖類、アミノ基を含む単糖類、アミノ基を含むオリゴ糖、またはアミノ基を含む多糖類である、［１］～［９］のいずれかに記載のグリコシル化クロリンｅ６誘導体、またはその薬学的に許容される塩。
［１１］ 糖が、単糖類であり、ＳがＲのアノマー位炭素原子と結合した、［１］～［１０］のいずれかに記載のグリコシル化クロリンｅ６誘導体、またはその薬学的に許容される塩。
［１２］ 糖が、グルコース、ガラクトースまたはマンノースである、［１］～［１１］のいずれかに記載のグリコシル化クロリンｅ６誘導体、またはその薬学的に許容される塩。
［１３］ 下記一般式（４）、（５）または（６）で示される、［１］～［１２］のいずれかに記載のグリコシル化クロリンｅ６誘導体、またはその薬学的に許容される塩。
［１４］ 腫瘍、皮膚疾患、眼疾患または加齢黄斑変性の光線力学治療用であり、［１］～［１３］のいずれかに記載のクロリンｅ６誘導体、またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含む医薬組成物。
［１５］ ウイルス、微生物およびこれらのいずれかの感染細胞、腫瘍細胞、腫瘍状組織、ならびに、新生血管からなる群より選択される標的に、［１］～［１３］のいずれかに記載のグリコシル化クロリンｅ６誘導体、またはその薬学的に許容される塩を接触させた後に、標的に対して、クロリンｅ６誘導体、またはその薬学的に許容される塩に吸収される波長の光を照射する工程を含む、標的を破壊する方法。
［１６］ ［１］～［１３］のいずれかに記載のグリコシル化クロリンｅ６誘導体、またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、医薬組成物。
［１７］ 腫瘍、皮膚疾患、眼疾患または加齢黄斑変性の、治療、診断または検出のための、［１６］に記載の医薬組成物。
［１８］ クロリンｅ６と糖とを連結基を介して結合させる工程を含む、［１］～［１３］のいずれか１項に記載のグリコシル化クロリンｅ６誘導体、またはその薬学的に許容される塩の製造方法。
［１］ 後述する一般式（１）で示されるグリコシル化クロリンｅ６誘導体、または、その薬学的に許容される塩。
［２］ 後述する一般式（１）において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が、それぞれ独立に、炭素数１～６のアセトキシアルキル基または炭素数１～６の炭化水素基である、［１］に記載のグリコシル化クロリンｅ６誘導体、またはその薬学的に許容される塩。
［３］ 後述する一般式（１）において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が、メチル基である、［１］または［２］に記載のグリコシル化クロリンｅ６誘導体、またはその薬学的に許容される塩。
［４］ 後述する一般式（１）において、－Ｘ－が－Ｘ３－Ｏ－であり、後述する一般式（２）で示される、［１］～［３］のいずれかに記載のグリコシル化クロリンｅ６誘導体、またはその薬学的に許容される塩。
［５］ 後述する一般式（２）において、Ｘ３が、Ｒのアノマー位炭素原子と結合した基、または、アノマー位炭素原子に隣接する炭素原子と結合した基である、［４］に記載のグリコシル化クロリンｅ６誘導体、またはその薬学的に許容される塩。
［６］ 後述する一般式（２）において、－Ｘ３－が－Ｓ－Ｘ４－であり、後述する一般式（３）で示される、［４］または［５］に記載のグリコシル化クロリンｅ６誘導体、またはその薬学的に許容される塩。
［７］ 後述する一般式（３）において、Ｘ４が、炭素数１～１６の直鎖状または分岐鎖状のアルキレン基である、［６］に記載のグリコシル化クロリンｅ６誘導体、またはその薬学的に許容される塩。
［８］ 後述する一般式（３）において、Ｘ４が－（ＣＨ２）ｎ－で示されるアルキレン基であり、ｎが１～１６の整数である、［６］または［７］に記載のグリコシル化クロリンｅ６誘導体、またはその薬学的に許容される塩。
［９］ 後述する一般式（３）において、Ｘ４が－（ＣＨ２）ｎ－で示されるアルキレン基であり、ｎが３～１０の整数である、［６］～［８］のいずれかに記載のグリコシル化クロリンｅ６誘導体、またはその薬学的に許容される塩。
［１０］ 糖が、単糖類、オリゴ糖、多糖類、アミノ基を含む単糖類、アミノ基を含むオリゴ糖、またはアミノ基を含む多糖類である、［１］～［９］のいずれかに記載のグリコシル化クロリンｅ６誘導体、またはその薬学的に許容される塩。
［１１］ 糖が、単糖類であり、ＳがＲのアノマー位炭素原子と結合した、［１］～［１０］のいずれかに記載のグリコシル化クロリンｅ６誘導体、またはその薬学的に許容される塩。
［１２］ 糖が、グルコース、ガラクトースまたはマンノースである、［１］～［１１］のいずれかに記載のグリコシル化クロリンｅ６誘導体、またはその薬学的に許容される塩。
［１３］ 下記一般式（４）、（５）または（６）で示される、［１］～［１２］のいずれかに記載のグリコシル化クロリンｅ６誘導体、またはその薬学的に許容される塩。
［１４］ 腫瘍、皮膚疾患、眼疾患または加齢黄斑変性の光線力学治療用であり、［１］～［１３］のいずれかに記載のクロリンｅ６誘導体、またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含む医薬組成物。
［１５］ ウイルス、微生物およびこれらのいずれかの感染細胞、腫瘍細胞、腫瘍状組織、ならびに、新生血管からなる群より選択される標的に、［１］～［１３］のいずれかに記載のグリコシル化クロリンｅ６誘導体、またはその薬学的に許容される塩を接触させた後に、標的に対して、クロリンｅ６誘導体、またはその薬学的に許容される塩に吸収される波長の光を照射する工程を含む、標的を破壊する方法。
［１６］ ［１］～［１３］のいずれかに記載のグリコシル化クロリンｅ６誘導体、またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、医薬組成物。
［１７］ 腫瘍、皮膚疾患、眼疾患または加齢黄斑変性の、治療、診断または検出のための、［１６］に記載の医薬組成物。
［１８］ クロリンｅ６と糖とを連結基を介して結合させる工程を含む、［１］～［１３］のいずれか１項に記載のグリコシル化クロリンｅ６誘導体、またはその薬学的に許容される塩の製造方法。
【発明の効果】
【0011】
本発明の実施形態に係るグリコシル化クロリンｅ６誘導体、または、その薬学的に許容される塩（以下、単に「本クロリン誘導体等」ともいう。）は、暗所での毒性が非常に低く、生体に対する安全性を確保し、光線照射による殺腫瘍細胞性および腫瘍組織の成長抑制効果に優れているため、インビトロまたはインビボにて、標的となるウイルス、細菌、若しくはこれらの感染細胞、腫瘍細胞、または腫瘍状組織と接触させた後、本クロリン誘導体等に吸収される波長の光線を照射することにより、上記標的を破壊する用途に適用できる。従って、本クロリン誘導体等は、上記本クロリン誘導体等を有効成分とする医薬、特に、腫瘍、または皮膚病の光線力学的治療用薬、あるいは光線力学診断薬として用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】本発明の実施形態に係るグリコシル化クロリンｅ６誘導体の製造方法の一例を説明するための図である。
【図2】本発明の実施形態に係るグリコシル化クロリンｅ６誘導体の製造方法の一例を説明するための図である。
【図3】食道癌細胞株および不死化食道正常上皮細胞株を用いた、本発明の実施形態に係るグリコシル化クロリンｅ６誘導体の細胞内取り込み性能評価結果を表すグラフである。
【図4】光線力学的療法における、本発明の実施形態に係るグリコシル化クロリンｅ６誘導体の抗腫瘍効果の評価結果を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0013】
〔グリコシル化クロリンｅ６誘導体およびその製造方法〕
以下では、本クロリン誘導体等のうち、特に、グリコシル化クロリンｅ６誘導体を例に説明することがあるが、その説明は、特に記載した場合を除き、グリコシル化クロリンｅ６誘導体の薬学的に許容される塩にも当てはまる。
以下では、本クロリン誘導体等のうち、特に、グリコシル化クロリンｅ６誘導体を例に説明することがあるが、その説明は、特に記載した場合を除き、グリコシル化クロリンｅ６誘導体の薬学的に許容される塩にも当てはまる。
【0014】
【化1】
【0015】
一般式（１）中、Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立に、Ｈ（水素原子）またはＲ－Ｘ－＊で表される基（＊は結合位置を表す）であり、かつ、Ｘ１およびＸ２の少なくとも一方はＲ－Ｘ－＊で表される基である。合成がより容易である観点、すなわち、より優れた生産性を有する観点からは、Ｘ１およびＸ２のいずれか一方がＲ－Ｘ－＊で表される基であることが好ましく、Ｘ１がＲ－Ｘ－＊で表される基であり、かつ、Ｘ２がＨ（水素原子）であることがより好ましい。
【0016】
ここで、Ｒは糖の残基（以下「糖残基」という。）を表す。糖残基とは糖が有する炭素原子に結合した水酸基を１個除いた残基を表し、糖のヘミアセタール性（アノマー性）の水酸基を除いた残基が好ましい。
ＸはＲを構成する炭素原子のいずれか１つと結合した２価の基であり、かつ、ＲはＣ（炭素原子）、Ｎ（窒素原子）、Ｏ（酸素原子）、Ｈ（水素原子）、およびＳ（硫黄原子）からなる群より選択される少なくとも１種の原子からなる直鎖状または分岐鎖状の２価の基である。Ｘとしては、例えば、－Ｓ－、－Ｏ－、－ＮＲｘ－（Ｒｘは水素原子、または、ヘテロ原子を有してもよい炭化水素基）、カルボニル基、アルキレン基、アルケニレン基、および、これらを組合せた基が挙げられ、Ｏ（酸素原子）および／またはＳ（硫黄原子）を含むことが好ましく、－Ｓ－、－Ｏ－、および、アルキレン基からなる群より選択される２種以上を組み合わせた基がより好ましく、－Ｓ－、－Ｏ－、および、アルキレン基とを組み合わせた基がさらに好ましい。
ＸはＲを構成する炭素原子のいずれか１つと結合した２価の基であり、かつ、ＲはＣ（炭素原子）、Ｎ（窒素原子）、Ｏ（酸素原子）、Ｈ（水素原子）、およびＳ（硫黄原子）からなる群より選択される少なくとも１種の原子からなる直鎖状または分岐鎖状の２価の基である。Ｘとしては、例えば、－Ｓ－、－Ｏ－、－ＮＲｘ－（Ｒｘは水素原子、または、ヘテロ原子を有してもよい炭化水素基）、カルボニル基、アルキレン基、アルケニレン基、および、これらを組合せた基が挙げられ、Ｏ（酸素原子）および／またはＳ（硫黄原子）を含むことが好ましく、－Ｓ－、－Ｏ－、および、アルキレン基からなる群より選択される２種以上を組み合わせた基がより好ましく、－Ｓ－、－Ｏ－、および、アルキレン基とを組み合わせた基がさらに好ましい。
【0017】
Ｒの糖としては、特に制限されないが、例えば、アルドペントース（リボース、アラビノース、キシロース、および、リキソース等）、アルドヘキソース（アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、および、タロース等）、アルドヘプトース、ケトペントース（リブロース、および、キシルロース等）、ケトヘキソース（プシコース、フルクトース、ソルボース、および、タガトース等）、ケトヘプトース（セドヘプツロース、および、コリオース等）、並びに、アミノ基を有するこれらの誘導体等の単糖類；
ショ糖、マルトース、ラクトース、マルトトリオース、ラフィノース、および、マルトテトラオース等のオリゴ糖、並びに、アミノ基を有するこれらの誘導体；
デンプン、アミロース、および、グリコーゲン等の多糖類、並びに、アミノ基を有するこれらの誘導体；等が挙げられる。なかでも、単糖類が好ましく、ヘキソースまたはヘキソサミンがより好ましく、ヘキソースがさらに好ましく、グルコースが特に好ましい。
単糖類は、Ｄ体であってもよいし、Ｌ体であってもよいが、Ｄ体が好ましい。
ショ糖、マルトース、ラクトース、マルトトリオース、ラフィノース、および、マルトテトラオース等のオリゴ糖、並びに、アミノ基を有するこれらの誘導体；
デンプン、アミロース、および、グリコーゲン等の多糖類、並びに、アミノ基を有するこれらの誘導体；等が挙げられる。なかでも、単糖類が好ましく、ヘキソースまたはヘキソサミンがより好ましく、ヘキソースがさらに好ましく、グルコースが特に好ましい。
単糖類は、Ｄ体であってもよいし、Ｌ体であってもよいが、Ｄ体が好ましい。
【0018】
なお、本明細書において、オリゴ糖とは２～９個の単糖単位を含む化合物を意味し、多糖類とは１０個以上の単糖単位を含む化合物を意味する（Ｊ．Ｄ．ＲＯＢＥＲＴＳ＆Ｍ．Ｃ．ＣＡＳＥＲＩＯ（１９６４）．ＢＡＳＩＣ ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＯＦ ＯＲＧＡＮＩＣ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ． Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ．Ｉｎｃ．（Ｊ．Ｄ．ロバーツ＆Ｍ．Ｃ．カセリオ 大木道則（訳）（１９６９）．ロバーツ有機化学 株式会社東京化学同人）より引用）。グリコシド結合する単糖同士は、同じでもよく、異なっていてもよい。また、単糖同士のグリコシド結合は、α－結合であっても、β－結合であってもよい。
【0019】
ヘキソースとしては、具体的には、グルコース、ガラクトース、マンノース、アロース、アルトロース、グロース、イドース、および、タロースが挙げられ、これらのうち、グルコースが最も好ましい。グルコースのときの光毒性が優れているからである。
【0020】
ヘキソサミンとしては、具体的には、グルコサミン、ガラクトサミン、マンノサミン、ダウノサミン、および、ペロサミンが挙げられ、これらのうち、グルコサミンが最も好ましい。グルコサミンのときの光毒性が優れているからである。
【0021】
式（１）中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立に、Ｈ（水素原子）、炭素数１～６のアセトキシアルキル基または炭素数１～６の炭化水素基であり、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の少なくとも１つは炭素数１～６のアセトキシアルキル基または炭素数１～６の炭化水素基である。
ここで、炭素数１～６のアセトキシアルキルとしては、アセトキシメチル、アセトキシエチル、アセトキシプロピル、およびアセトキシブチル等が挙げられる。また、炭素数１～６の炭化水素としては、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｎ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ペンチル、シクロペンチル、ヘキシル、およびシクロヘキシル等の炭素数１～６の直鎖状、分岐鎖状または環状アルキルが挙げられる。なかでも、より優れた本発明の効果を有するグリコシル化クロリンｅ６誘導体が得られる点で、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立に、炭素数１～６のアセトキシアルキル基または炭素数１～６の炭化水素基であることが好ましい。癌細胞に対する取り込み性が向上するからである。
ここで、炭素数１～６のアセトキシアルキルとしては、アセトキシメチル、アセトキシエチル、アセトキシプロピル、およびアセトキシブチル等が挙げられる。また、炭素数１～６の炭化水素としては、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｎ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ペンチル、シクロペンチル、ヘキシル、およびシクロヘキシル等の炭素数１～６の直鎖状、分岐鎖状または環状アルキルが挙げられる。なかでも、より優れた本発明の効果を有するグリコシル化クロリンｅ６誘導体が得られる点で、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立に、炭素数１～６のアセトキシアルキル基または炭素数１～６の炭化水素基であることが好ましい。癌細胞に対する取り込み性が向上するからである。
【0022】
またＲ１、Ｒ２およびＲ３は、水溶性の観点から、それぞれ独立に、炭素数は１～３の炭化水素基であることが好ましく、メチル基がより好ましい。
【0023】
Ｒ－Ｘ－＊で表される基（＊は結合位置を表す）において、２価の基（連結基）Ｘには、Ｏ（酸素原子）が含まれることが好ましく、ＯおよびＳ（硫黄原子）が含まれていることがより好ましい。
なかでも、より優れた本発明の効果を有するグリコシド化クロリンｅ６誘導体が得られる点で、Ｒ－Ｘ－＊で表される基としては、Ｒ－Ｘ３－Ｏ－＊で表される基が好ましい。ここで、Ｘ３は、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｈ、およびＳからなる群より選択される少なくとも１種からなる直鎖状または分岐鎖状の２価の基であり、かつ、Ｒを構成する炭素原子のいずれか１個と結合している。Ｘ３の２価の基としては特に制限されないが、すでに説明したＸの２価の基と同様の形態である。
すなわち、グリコシド化クロリンｅ６誘導体は、以下の式（２）で表されることが好ましい。なお、式（２）中、糖残基Ｒの形態としては、式（１）中のＲとして既に説明したとおりである。
なかでも、より優れた本発明の効果を有するグリコシド化クロリンｅ６誘導体が得られる点で、Ｒ－Ｘ－＊で表される基としては、Ｒ－Ｘ３－Ｏ－＊で表される基が好ましい。ここで、Ｘ３は、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｈ、およびＳからなる群より選択される少なくとも１種からなる直鎖状または分岐鎖状の２価の基であり、かつ、Ｒを構成する炭素原子のいずれか１個と結合している。Ｘ３の２価の基としては特に制限されないが、すでに説明したＸの２価の基と同様の形態である。
すなわち、グリコシド化クロリンｅ６誘導体は、以下の式（２）で表されることが好ましい。なお、式（２）中、糖残基Ｒの形態としては、式（１）中のＲとして既に説明したとおりである。
【0024】
【化2】
【0025】
さらに優れた本発明の効果を有するグリコシド化クロリンｅ６誘導体が得られる点で、Ｒ－Ｘ３－Ｏ－＊で表される基としては、Ｒ－Ｌ－Ｓ－Ｘ４－Ｏ－＊で表される基がさらに好ましい。ここで、Ｌは、単結合または２価の基を表す。Ｌの２価の連結基としては特に制限されないが、例えば、Ｘの２価の基として既に説明したとおりである。
なかでも、より優れた本発明の効果を有するグリコシド化クロリンｅ６誘導体が得られる点で、Ｒ－Ｌ－Ｓ－Ｘ４－Ｏ－＊で表される基のＬが単結合であることが好ましい。すなわち、Ｒ－Ｘ－＊で表される基は、Ｒ－Ｓ－Ｘ４－Ｏ－＊で表される基、言い換えれば、糖残基Ｒが－Ｓ－Ｘ４－Ｏ－に直接連結された基が好ましい。ここで直接連結とは、例えば糖のアノマー位のＣ（炭素原子）と－Ｓ－Ｘ４－Ｏ－が連結している構造（－Ｃ－Ｓ－Ｘ４－Ｏ－）を指す。
なかでも、より優れた本発明の効果を有するグリコシド化クロリンｅ６誘導体が得られる点で、Ｒ－Ｌ－Ｓ－Ｘ４－Ｏ－＊で表される基のＬが単結合であることが好ましい。すなわち、Ｒ－Ｘ－＊で表される基は、Ｒ－Ｓ－Ｘ４－Ｏ－＊で表される基、言い換えれば、糖残基Ｒが－Ｓ－Ｘ４－Ｏ－に直接連結された基が好ましい。ここで直接連結とは、例えば糖のアノマー位のＣ（炭素原子）と－Ｓ－Ｘ４－Ｏ－が連結している構造（－Ｃ－Ｓ－Ｘ４－Ｏ－）を指す。
【0026】
【化3】
【0027】
また、Ｒ－Ｓ－Ｘ４－Ｏ－＊で表される基におけるＳ（硫黄原子）は、合成の観点からＲのアノマー位炭素原子（１位炭素原子）と結合した連結基、またはアノマー位炭素原子に隣接する炭素原子（２位炭素原子）と結合した連結基であることが好ましく、Ｒのアノマー位炭素原子（１位炭素原子）と結合した連結基であることがより好ましい。
【0028】
Ｘ４はＯ（酸素原子）とＳ（硫黄原子）と結合している。また、Ｘ４はＣ（炭素原子）およびＨ（水素原子）を有する直鎖状または分岐鎖状の２価の基である。Ｘ４としては特に制限されないが、例えばアルキレン基、オキシアルキレン基、およびアルキレンオキシ基等が挙げられるが、なかでも、炭素数１～１６の直鎖状または分岐鎖状のアルキレン基であることが好ましく、－（ＣＨ２）ｎ－で示される直鎖状アルキレン基であることがより好ましい。ｎは１～１６の整数であることが好ましく、ｎが２～１３の整数であることがより好ましく、ｎが３～１０の整数であることがさらに好ましい。合成が容易であり、かつ化合物の水溶性が高まるからである。
【0029】
なお、式（３）中、糖残基Ｒの形態としては、式（１）中のＲとして既に説明したとおりである。
【0030】
なかでも、特に優れた本発明の効果を有する点で、グリコシル化クロリンｅ６誘導体は、下記式（４）、（５）、または、（６）で表されることが好ましい。なお、下記式（４）～（６）において、ｎは、それぞれ３～１０の整数を表す。
【0031】
【化4】
【0032】
【化5】
【0033】
【化6】
【0034】
なお、グリコシル化クロリンｅ６誘導体１種を単独で用いても、２種以上を併用してもよい。
【0035】
薬学的に許容される塩としては、アルカリ金属塩（例えばナトリウム塩、およびカリウム塩等）、アルカリ土類金属塩（例えばマグネシウム塩、およびカルシウム塩等）、アンモニウム塩、モノ－、ジ－またはトリ－低級（アルキルまたはヒドロキシアルキル）アンモニウム塩（例えばエタノールアンモニウム塩、ジエタノールアンモニウム塩、トリエタノールアンモニウム塩、トロメタミン塩）、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、リン酸塩、硫酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩、トリクロロ酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、メシチレンスルホン酸塩およびナフタレンスルホン酸塩等が挙げられる。
また、塩は、無水物、または溶媒和物であってよく、溶媒和物としては、水和物、メタノール和物、エタノール和物、プロパノール和物、および２－プロパノール和物等が挙げられる。
また、塩は、無水物、または溶媒和物であってよく、溶媒和物としては、水和物、メタノール和物、エタノール和物、プロパノール和物、および２－プロパノール和物等が挙げられる。
【0036】
以上のような構成を有する本クロリン誘導体等は、暗所では細胞毒性は示さないが、光線照射下で強い細胞毒性を示す。そして、ポルフィリン誘導体と比べて長波長における吸収が大きく（吸収極大波長６５０ｎｍ）、また糖の連結により化合物は細胞親和性および／または細胞透過性が高くなっているものと推測される。
【0037】
次に、本クロリン誘導体等の製造方法について説明する。本発明の実施形態に係るクロリン誘導体等の製造方法は、クロリンｅ６と糖とを連結基を介して結合させる（グリコシド化）工程を含む。より具体的には、クロリンｅ６アルキルエステルの３位二重結合と糖とを連結基を介して結合させ、グリコシル化する工程を含む。連結基を結合させる手順は、糖と連結基とを結合させた後にクロリンｅ６と連結させてもよいが、連結基とクロリンｅ６とを結合させた後に糖と連結させてもよく、目的に応じて製造方法を選択すればよい。
【0038】
以下では、まず、糖と連結基とを結合させた後にクロリンｅ６と連結させる製造方法を図１を参照しつつ詳述する。
まず、チオール糖（Ｒ－ＳＨ）に対し、チオール糖と連結できる官能基、例えばハロゲン、トシル基、およびメシル基等の脱離基（Ｅ）を有し、かつヒドロキシル基（－ＯＨ）を有する連結基（Ｅ－Ｘ４－ＯＨ）を導入する。
まず、チオール糖（Ｒ－ＳＨ）に対し、チオール糖と連結できる官能基、例えばハロゲン、トシル基、およびメシル基等の脱離基（Ｅ）を有し、かつヒドロキシル基（－ＯＨ）を有する連結基（Ｅ－Ｘ４－ＯＨ）を導入する。
【0039】
ここで用いられるチオール糖（Ｒ－ＳＨ）の有する糖残基Ｒは、水酸基がアシル基等の保護基で保護されることが好ましい。保護基としては、アセチル、およびピバロイル等の脂肪族アシル基；ベンゾイル基等の芳香族アシル基；ベンジル基等のアラルキル基が挙げられる。これらの保護基のうち、アセチル基が特に好ましい。
【0040】
チオール糖（Ｒ－ＳＨ）と連結させる連結基（Ｅ－Ｘ４－ＯＨ）としては、クロロアルコール、ブロモアルコール、ヨードアルコール、トシルアルコール、およびメシルアルコール等が挙げられる。
【0041】
この反応において用いられる溶媒としては、反応が進行する限り特に制限されないが、例えば、ピリジン、ルチジン、および、キノリン等の芳香族アミン類；ジクロロメタン、クロロホルム、１，２－ジクロロエタン、および、四塩化炭素等のハロゲン化炭化水素類；ヘキサン、ペンタン、および、シクロヘキサン等の脂肪族炭化水素類；ベンゼン、トルエン、キシレン、および、クロロベンゼン等の芳香族炭化水素類；ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジフェニルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、および、１，２－ジメトキシエタン等のエーテル類；Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、および、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド等のアミド類；水；および、これらの混合物等が挙げられる。上記反応で特に好ましい溶媒は、クロロホルム、または、ジクロロメタンである。
【0042】
またこの反応において塩基が用いられる場合は、例えば、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、および、炭酸セシウム等の塩基性塩類；水酸化ナトリウム、および、水酸化カリウム等の無機塩基類；ピリジン、および、ルチジン等の芳香族アミン類；トリエチルアミン、トリプロピルアミン、トリブチルアミン、シクロヘキシルジメチルアミン、４－ジメチルアミノピリジン、Ｎ，Ｎ－ジメチルアニリン、Ｎ－メチルピペリジン、Ｎ－メチルピロリジン、および、Ｎ－メチルモルホリン等の第３級アミン類；水素化ナトリウム、および、水素化カリウム等のアルカリ金属水素化物類；ナトリウムアミド、リチウムジイソプロピルアミド、および、リチウムヘキサメチルジシラジド等の金属アミド類；ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、および、カリウムｔｅｒｔ－ブトキシド等の金属アルコキシド類；等から選択される。
なお、この反応で得られる最終生成物は、濃縮、溶媒抽出、分溜、結晶化、再結晶、および、クロマトグラフィー等の公知の手段によって反応混合物から単離、精製できる。
なお、この反応で得られる最終生成物は、濃縮、溶媒抽出、分溜、結晶化、再結晶、および、クロマトグラフィー等の公知の手段によって反応混合物から単離、精製できる。
【0043】
次に、クロリンｅ６トリメチルエステルに対し、チオール糖連結基結合体（Ｒ－Ｓ－Ｘ４－ＯＨ）を導入する。
【0044】
まずクロリンｅ６トリメチルエステルに対し、ポルフィリン環の１～２４番号法における３位の二重結合に、ハロゲン化水素を付加することにより、クロリンｅ６トリメチルエステルハロゲン化水素付加体を得る。使用するハロゲン化水素としては、塩化水素、臭化水素、およびヨウ化水素等が挙げられる。ハロゲン化水素としては、クロリンｅ６トリメチルエステルハロゲン化水素付加体の反応性と安定性の観点から、臭化水素が好ましい。
この反応において用いられる溶媒としては、反応が進行する限り特に制限されないが、ギ酸、酢酸、およびプロピオン酸等が挙げられる。
この反応において用いられる溶媒としては、反応が進行する限り特に制限されないが、ギ酸、酢酸、およびプロピオン酸等が挙げられる。
【0045】
得られたクロリンｅ６トリメチルエステルハロゲン化水素付加体に、チオール糖連結基結合体（Ｒ－Ｓ－Ｘ４－ＯＨ）を作用させて、チオール糖連結基結合体（Ｒ－Ｓ－Ｘ４－ＯＨ）をクロリンｅ６トリメチルエステルハロゲン化水素付加体に結合させて、糖連結クロリンｅ６トリメチルエステルを得る。上記反応で加える、チオール糖連結基結合体（Ｒ－Ｓ－Ｘ４－ＯＨ）は、クロリンｅ６トリメチルエステルハロゲン化水素付加体に対し、３等量以上加えることが好ましい。糖連結クロリンｅ６トリメチルエステルの収率が向上するためである。
【0046】
また、この反応において塩基が用いられる場合は、例えば、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、および、炭酸セシウム等の塩基性塩類；、水酸化ナトリウム、および、水酸化カリウム等の無機塩基類；ピリジン、および、ルチジン等の芳香族アミン類；トリエチルアミン、トリプロピルアミン、トリブチルアミン、シクロヘキシルジメチルアミン、４－ジメチルアミノピリジン、Ｎ，Ｎ－ジメチルアニリン、Ｎ－メチルピペリジン、Ｎ－メチルピロリジン、および、Ｎ－メチルモルホリン等の第３級アミン類；水素化ナトリウム、および、水素化カリウム等のアルカリ金属水素化物類；ナトリウムアミド、リチウムジイソプロピルアミド、および、リチウムヘキサメチルジシラジド等の金属アミド類；ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、および、カリウムｔｅｒｔ－ブトキシド等の金属アルコキシド類等から選択される。
この反応において用いられる溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、例えば、ピリジン、ルチジン、および、キノリン等の芳香族アミン類；ジクロロメタン、クロロホルム、１，２－ジクロロエタン、および、四塩化炭素等のハロゲン化炭化水素類；ヘキサン、ペンタン、および、シクロヘキサン等の脂肪族炭化水素類；ベンゼン、トルエン、キシレン、および、クロロベンゼン等の芳香族炭化水素類；ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジフェニルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、および、１，２－ジメトキシエタン等のエーテル類；Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、および、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド等のアミド類またはこれら二種以上の混合物等が挙げられる。上記反応で特に好ましい溶媒は、反応性の観点からジクロロメタン、クロロホルムおよびこれらの混合物である。
この反応において用いられる溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、例えば、ピリジン、ルチジン、および、キノリン等の芳香族アミン類；ジクロロメタン、クロロホルム、１，２－ジクロロエタン、および、四塩化炭素等のハロゲン化炭化水素類；ヘキサン、ペンタン、および、シクロヘキサン等の脂肪族炭化水素類；ベンゼン、トルエン、キシレン、および、クロロベンゼン等の芳香族炭化水素類；ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジフェニルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、および、１，２－ジメトキシエタン等のエーテル類；Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、および、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド等のアミド類またはこれら二種以上の混合物等が挙げられる。上記反応で特に好ましい溶媒は、反応性の観点からジクロロメタン、クロロホルムおよびこれらの混合物である。
【0047】
なお、この反応で得られる最終生成物は、濃縮、溶媒抽出、分溜、結晶化、再結晶、およびクロマトグラフィー等の公知の手段によって反応混合物から単離、精製できる。
【0048】
次に、連結基とクロリンｅ６とを結合させた後に糖と連結させる製造方法を、図２を参照しつつ詳述する。
【0049】
まず、クロリンｅ６トリメチルエステルに対し、糖と連結できる官能基、例えばハロゲン、トシル基、およびメシル基等の脱離基（Ｅ）を有し、かつヒドロキシル基（－ＯＨ）を有する連結基（Ｅ－Ｘ４－ＯＨ）を導入する。
【0050】
クロリンｅ６トリメチルエステルにおいて、ポルフィリン環の１～２４番号法における３位の二重結合に、ハロゲン化水素を付加することにより、クロリンｅ６トリメチルエステルハロゲン化水素付加体を得る。使用するハロゲン化水素としては、塩化水素、臭化水素、および、ヨウ化水素等が挙げられる。ハロゲン化水素としては、クロリンｅ６トリメチルエステルハロゲン化水素付加体の反応性と安定性の観点から、臭化水素が好ましい。
この反応において用いられる溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、ギ酸、酢酸、および、プロピオン酸等が挙げられる。
この反応において用いられる溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、ギ酸、酢酸、および、プロピオン酸等が挙げられる。
【0051】
得られたクロリンｅ６トリメチルエステルハロゲン化水素付加体に、連結基（Ｅ－Ｘ４－ＯＨ）を作用させて、連結基（Ｅ－Ｘ４－ＯＨ）をクロリンｅ６トリメチルエステルハロゲン化水素付加体に結合させて、連結基結合クロリンｅ６トリメチルエステルを得る。
連結基（Ｅ－Ｘ４－ＯＨ）としては、クロロアルコール、ブロモアルコール、ヨードアルコール、トシルアルコール、およびメシルアルコール等が挙げられる。上記反応で加える、連結基（Ｅ－Ｘ４－ＯＨ）は、クロリンｅ６トリメチルエステルハロゲン化水素付加体に対し、１０等量以上加えることが好ましい。連結基結合クロリンｅ６トリメチルエステルの収率が向上するためである。
連結基（Ｅ－Ｘ４－ＯＨ）としては、クロロアルコール、ブロモアルコール、ヨードアルコール、トシルアルコール、およびメシルアルコール等が挙げられる。上記反応で加える、連結基（Ｅ－Ｘ４－ＯＨ）は、クロリンｅ６トリメチルエステルハロゲン化水素付加体に対し、１０等量以上加えることが好ましい。連結基結合クロリンｅ６トリメチルエステルの収率が向上するためである。
【0052】
またこの反応において塩基が用いられる場合は、例えば、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、および、炭酸セシウム等の塩基性塩類；水酸化ナトリウム、および、水酸化カリウム等の無機塩基類；ピリジン、および、ルチジン等の芳香族アミン類；トリエチルアミン、トリプロピルアミン、トリブチルアミン、シクロヘキシルジメチルアミン、４－ジメチルアミノピリジン、Ｎ，Ｎ－ジメチルアニリン、Ｎ－メチルピペリジン、Ｎ－メチルピロリジン、および、Ｎ－メチルモルホリン等の第３級アミン類；水素化ナトリウム、および、水素化カリウム等のアルカリ金属水素化物類；ナトリウムアミド、リチウムジイソプロピルアミド、および、リチウムヘキサメチルジシラジド等の金属アミド類；ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、および、カリウムｔｅｒｔ－ブトキシド等の金属アルコキシド類等から選択される。
この反応において用いられる溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、例えば、ピリジン、ルチジン、および、キノリン等の芳香族アミン類；ジクロロメタン、クロロホルム、１，２－ジクロロエタン、および、四塩化炭素等のハロゲン化炭化水素類；ヘキサン、ペンタン、および、シクロヘキサン等の脂肪族炭化水素類；ベンゼン、トルエン、キシレン、および、クロロベンゼン等の芳香族炭化水素類；ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジフェニルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、および、１，２－ジメトキシエタン等のエーテル類；Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、および、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド等のアミド類；これら二種以上の混合物等が挙げられる。上記反応で特に好ましい溶媒は、反応性の観点からジクロロメタン、クロロホルムおよびこれらの混合物である。
この反応において用いられる溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、例えば、ピリジン、ルチジン、および、キノリン等の芳香族アミン類；ジクロロメタン、クロロホルム、１，２－ジクロロエタン、および、四塩化炭素等のハロゲン化炭化水素類；ヘキサン、ペンタン、および、シクロヘキサン等の脂肪族炭化水素類；ベンゼン、トルエン、キシレン、および、クロロベンゼン等の芳香族炭化水素類；ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジフェニルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、および、１，２－ジメトキシエタン等のエーテル類；Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、および、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド等のアミド類；これら二種以上の混合物等が挙げられる。上記反応で特に好ましい溶媒は、反応性の観点からジクロロメタン、クロロホルムおよびこれらの混合物である。
【0053】
なお、この反応で得られる最終生成物は、濃縮、溶媒抽出、分溜、結晶化、再結晶、およびクロマトグラフィー等の公知の手段によって反応混合物から単離、精製できる。
次に、連結基結合クロリンｅ６トリメチルエステルに対し、チオール糖（Ｒ－ＳＨ）を導入する。
次に、連結基結合クロリンｅ６トリメチルエステルに対し、チオール糖（Ｒ－ＳＨ）を導入する。
【0054】
ここで用いられるチオール糖（Ｒ－ＳＨ）は、糖中の水酸基をアシル基等の保護基で保護したものを用いることが好ましい。保護基としては、アセチル基、および、ピバロイル基等の脂肪族アシル基；ベンゾイル基等の芳香族アシル基；ベンジル基等のアラルキル基；等が挙げられる。これらの保護基のうち、アセチル基が特に好ましい。
【0055】
この反応において用いられる溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、例えば、ピリジン、ルチジン、および、キノリン等の芳香族アミン類；ジクロロメタン、クロロホルム、１，２－ジクロロエタン、および、四塩化炭素等のハロゲン化炭化水素類；ヘキサン、ペンタン、および、シクロヘキサン等の脂肪族炭化水素類；ベンゼン、トルエン、キシレン、および、クロロベンゼン等の芳香族炭化水素類；ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジフェニルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、および、１，２－ジメトキシエタン等のエーテル類；Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、および、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド等のアミド類；水；これら二種以上の混合物等が挙げられる。上記反応で特に好ましい溶媒は、クロロホルム、および、ジクロロメタンである。
【0056】
またこの反応において塩基が用いられる場合は、例えば、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、および、炭酸セシウム等の塩基性塩類；水酸化ナトリウム、および、水酸化カリウム等の無機塩基類；ピリジン、およびルチジン等の芳香族アミン類；トリエチルアミン、トリプロピルアミン、トリブチルアミン、シクロヘキシルジメチルアミン、４－ジメチルアミノピリジン、Ｎ，Ｎ－ジメチルアニリン、Ｎ－メチルピペリジン、Ｎ－メチルピロリジン、および、Ｎ－メチルモルホリン等の第３級アミン類；水素化ナトリウム、および、水素化カリウム等のアルカリ金属水素化物類；ナトリウムアミド、リチウムジイソプロピルアミド、および、リチウムヘキサメチルジシラジド等の金属アミド類；ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、および、カリウムｔｅｒｔ－ブトキシド等の金属アルコキシド類；等から選択される。
なお、この反応で得られる最終生成物は、濃縮、溶媒抽出、分溜、結晶化、再結晶、および、クロマトグラフィー等の公知の手段によって反応混合物から単離、精製できる。
なお、この反応で得られる最終生成物は、濃縮、溶媒抽出、分溜、結晶化、再結晶、および、クロマトグラフィー等の公知の手段によって反応混合物から単離、精製できる。
【0057】
以上の製造方法において、保護基で水酸基がブロックされている糖残基Ｒを使用した場合には、次いで、アルカリ処理等により、保護基を脱離除去する。保護基がアシル基の場合には、アルカリ溶液を加えて加水分解すればよい。例えば、ジクロロメタン、メタノール、エタノール、テトラヒドロフラン、またはこれらの混合溶媒中、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、ナトリウム－ｔ－ブトキシド、カリウムメトキシド、カリウムエトキシド、および、カリウム－ｔ－ブトキシド等のアルカリ金属アルコキシドのようなアルカリを用いて保護された化合物を処理することにより、保護基を除去する。保護基がアラルキル基の場合には、パラジウム触媒を使った水素添加により除去することができる。糖残基Ｒの水酸基を脱保護すると、細胞内への本クロリン誘導体等の移行がより促進され、細胞毒性により優れる。
【0058】
〔用途〕
本クロリン誘導体等は、暗所下では細胞毒性を示さないが、光線照射下で強い細胞毒性を示すことを利用して、標的となる生物材料と、暗所下でインビトロまたはインビボで接触させて細胞内に取り込ませた後、本クロリン誘導体等の吸収波長の光を照射することにより、標的を破壊する用途に用いることができる。
本クロリン誘導体等は、暗所下では細胞毒性を示さないが、光線照射下で強い細胞毒性を示すことを利用して、標的となる生物材料と、暗所下でインビトロまたはインビボで接触させて細胞内に取り込ませた後、本クロリン誘導体等の吸収波長の光を照射することにより、標的を破壊する用途に用いることができる。
【0059】
ここで、標的としては、ウイルス、微生物およびこれらの感染細胞、腫瘍細胞、腫瘍状組織、ならびに新生血管からなる群より選択される標的が挙げられ、特に腫瘍細胞に親和性を有し、腫瘍細胞により集積されやすいことから、腫瘍の破壊に用いることができる。
【0060】
従って、本クロリン誘導体等は、悪性腫瘍（ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｔｕｍｏｒ）に分類される癌（ｃａｎｃｅｒ）の治療薬として利用できる。悪性腫瘍としては、上皮性悪性腫瘍、および、肉腫（ｓａｒｃｏｍａ）に分類されるような非上皮組織を発生母地とするような悪性腫瘍等が挙げられる。本クロリン誘導体等は、腫瘍細胞のうち、特に腫瘍細胞が塊状、および、充実性に増殖する固形癌（ｓｏｌｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、光が届く表層癌の治療にとくに有用である。
具体的には、食道癌、肺癌、胃癌、子宮頸癌、子宮体癌等の子宮癌、皮膚癌、前立腺癌、および、腎臓癌等が挙げられる。皮膚癌には、原発性（扁平上皮癌、基底細胞癌、および、表皮付属機癌）の他、内臓癌の皮膚転移も含まれる。
具体的には、食道癌、肺癌、胃癌、子宮頸癌、子宮体癌等の子宮癌、皮膚癌、前立腺癌、および、腎臓癌等が挙げられる。皮膚癌には、原発性（扁平上皮癌、基底細胞癌、および、表皮付属機癌）の他、内臓癌の皮膚転移も含まれる。
【0061】
また、本クロリン誘導体等は、腫瘍細胞のうち、良性腫瘍に対しても親和性を有することから、局所投与により、日光角化症、重症ニキビ、および、皮膚乾癬症等の皮膚病の光線力学的治療用薬としての利用、ならびに、加齢黄斑変性等の眼疾患の光線力学的治療用薬としての利用も可能である。
【0062】
さらに、本発明のグリコシル化クロリンｅ６誘導体の腫瘍集積性を利用して、ＰＥＴ等との併用により、癌の診断に利用することも可能である。さらに本発明のグリコシル化クロリン誘導体は、その腫瘍集積性および良性腫瘍に対する親和性を利用して、腫瘍の検出に利用することも可能である。
【0063】
〔標的を破壊する方法〕
既に説明したとおり、本クロリン誘導体等は、上記の標的を破壊する方法に適用できる。本発明の実施形態に係る標的を破壊する方法は、標的に、本クロリン誘導体等を接触させた後に、標的に対して、本クロリン誘導体等に吸収される波長の光を照射する工程を含む。
なお、上記方法は、ヒト個体、及び、ヒト個体以外で実施できる。すなわち、上記標的を破壊する方法は、ヒト個体での実施が可能であり、及び、ヒト個体での実施を除く形態での実施も可能である。
既に説明したとおり、本クロリン誘導体等は、上記の標的を破壊する方法に適用できる。本発明の実施形態に係る標的を破壊する方法は、標的に、本クロリン誘導体等を接触させた後に、標的に対して、本クロリン誘導体等に吸収される波長の光を照射する工程を含む。
なお、上記方法は、ヒト個体、及び、ヒト個体以外で実施できる。すなわち、上記標的を破壊する方法は、ヒト個体での実施が可能であり、及び、ヒト個体での実施を除く形態での実施も可能である。
【0064】
〔医薬組成物〕
本発明の実施形態に係る医薬組成物は、腫瘍、皮膚疾患、眼疾患または加齢黄斑変性の光線力学治療用であり、上記グリコシル化クロリンｅ６誘導体を有効成分として含有する。なかでも腫瘍の光線力学治療用としてより優れた効果を有する。
本発明の実施形態に係る医薬組成物は、腫瘍、皮膚疾患、眼疾患または加齢黄斑変性の光線力学治療用であり、上記グリコシル化クロリンｅ６誘導体を有効成分として含有する。なかでも腫瘍の光線力学治療用としてより優れた効果を有する。
【0065】
有効成分であるグリコシル化クロリンｅ６誘導体は、上述のように、優れた水溶性を有し、しかも細胞透過性に優れ、光毒性が高いので、腫瘍（特に固形癌）の光線力学的治療用薬として好適に使用できる。
【0066】
本医薬組成物は、カテーテル、静脈内または筋肉内注射により投与でき、またその他の非経口的な経路で投与できる。
また、クリーム状の薬剤組成物としてもよく、これにより経皮的にも投与できる。その他、体内の深部の腫瘍組織へ直接に局所注入できる。
また、クリーム状の薬剤組成物としてもよく、これにより経皮的にも投与できる。その他、体内の深部の腫瘍組織へ直接に局所注入できる。
【0067】
また、本医薬組成物は、本クロリン誘導体等を含有していれば、必要に応じてその他の成分を含有していてもよい。その他の成分としては、例えば、賦形剤が挙げられる。
【0068】
賦形剤としては、例えば、固形物として、乳糖、カオリン、ショ糖、結晶セルロース、コーンスターチ、タルク、寒天、ペクチン、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、レシチン、および、塩化ナトリウム等が挙げられ、液状物として、グリセリン、落花生油、ポリビニルピロリドン、オリーブ油、エタノール、ベンジルアルコール、プロピレングリコール、および、水等が挙げられる。
【0069】
本医薬組成物は、賦形剤以外にも、必要に応じて、基剤、界面活性剤、保存剤、乳化剤、着色剤、矯臭剤、香料、安定化剤、防腐剤、酸化防止剤、潤沢剤、抗菌剤、溶解補助剤、懸濁化剤、結合剤、および、崩壊剤等を含有してもよい。
【0070】
本医薬組成物の剤型としては、特に制限されず、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、トローチ剤、シロップ剤、乳液、軟ゼラチンカプセル、ゲル、ペースト、注射用製剤、クリーム、ジェル、ローション、および、貼付剤等が挙げられる。
【0071】
本医薬組成物に用いられる担体は、製剤の種類に応じて適宜選択される。注射用製剤として調製する場合、本クロリン誘導体等を含む無菌の水溶液もしくは分散液または本クロリン誘導体等を含む無菌の凍結乾燥剤の形に製剤化できる。液体担体としては、例えば、水、生理食塩水、エタノール、含水エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、および、植物油等が好ましい。
【0072】
本医薬組成物には、本クロリン誘導体等とともに、ラクトース、スクロース、第２リン酸カルシウム、および、カルボキシメチルセルロース等の希釈剤；ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、および、タルクのような滑剤；デンプン、グルコース、糖蜜、ポリビニルピロリドン、セルロース、および、その誘導体等；の結合剤を含み得る。
【0073】
本実施形態における一製剤当たりの有効成分の含量は、治療すべき対象や用法によって適宜とすることができるが、例えば、グリコシル化クロリンｅ６誘導体の量として、１～２０００ｍｇとすることができ、５～１０００ｍｇが好ましく、１０～５００ｍｇがさらに好ましい。
【0074】
本クロリン誘導体等の投与量は、治療すべき対象や目的によって異なるが、一般に、本クロリン誘導体等の量として、腫瘍の診断または検出、腫瘍治療のためには０．１～３０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．２～２０ｍｇ／ｋｇが目安となる。
有効成分である本クロリン誘導体等は、その細胞毒性が高いことから、従来品（フォトフリンやレザフィリン）よりも投与量を少なくして、同等以上の効果を得ることを期待できる。このことは、代謝、および、排泄に要する時間が短くて済むことを意味し、光線力学的療法の活用利便性を高める。
有効成分である本クロリン誘導体等は、その細胞毒性が高いことから、従来品（フォトフリンやレザフィリン）よりも投与量を少なくして、同等以上の効果を得ることを期待できる。このことは、代謝、および、排泄に要する時間が短くて済むことを意味し、光線力学的療法の活用利便性を高める。
【0075】
腫瘍の治療のためには、本クロリン誘導体等を投与した後、治療すべき部位に、該当化合物の吸収帯を含む光線を照射する。具体的には、５００ｎｍ以上の光線照射により一重項酸素を発生して、目的の細胞毒性を発揮することができるが、好ましくは最大吸収波長の光の割合が高い光線を照射することである。
【0076】
照射源としては、ＬＥＤ（Ｌｉｇｈｔ Ｅｍｉｔｔｉｎｇ Ｄｉｏｄｅ）、レーザー、および、ハロゲンランプ等が用いられる。レーザーとしては、色素レーザー、半導体レーザー、および、アルゴンレーザー等、励起に必要な波長の光線が得られるものであればよい。
【実施例】
【0077】
以下に本発明を、実施例および比較例に基づき詳細に説明する。ただし、本発明はこれらによってなんら制限されるものではない。実施例および比較例に基づいて製造した化合物は以下の方法によって評価を実施した。
【0078】
［光毒性の評価方法］
光毒性評価にはＩＣ５０（Ｈａｌｆ ｍａｘｉｍａｌ（５０％）ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を用いることとし、以下の手順で測定した。
ヒト胃癌由来細胞であるＭＫＮ４５（ＪＣＲＢ細胞バンクより入手して６か月間継代培養したもの）およびＭＫＮ２８（株式会社免疫生物研究所より入手して６か月間継代培養したもの）を、それぞれ９６穴プレートの所定数量のｗｅｌｌに５×１０３個／ｗｅｌｌ播種し（ＦＢＳを１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地、１００μＬ）、５％ＣＯ２存在下、３７℃で２４時間培養した。次にそれぞれのｗｅｌｌに、薬剤を異なる濃度で含む同培地溶液を１００μＬ加え、各ｗｅｌｌを所定の薬剤濃度に調整し、４時間培養した後、１００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ-Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）で１回洗浄し、再度１００μＬのＰＢＳを加えた。その後、６６０ｎｍのＬＥＤ光源（３０．８ｍＷ／ｃｍ２、LEDR-660DL, OptoCode）を用いて８分４０秒、光線照射した（１６Ｊ／ｃｍ２）。照射後、ＰＢＳを取り除き、２％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地を１００μＬ加え、２４時間培養した。
光毒性評価にはＩＣ５０（Ｈａｌｆ ｍａｘｉｍａｌ（５０％）ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を用いることとし、以下の手順で測定した。
ヒト胃癌由来細胞であるＭＫＮ４５（ＪＣＲＢ細胞バンクより入手して６か月間継代培養したもの）およびＭＫＮ２８（株式会社免疫生物研究所より入手して６か月間継代培養したもの）を、それぞれ９６穴プレートの所定数量のｗｅｌｌに５×１０３個／ｗｅｌｌ播種し（ＦＢＳを１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地、１００μＬ）、５％ＣＯ２存在下、３７℃で２４時間培養した。次にそれぞれのｗｅｌｌに、薬剤を異なる濃度で含む同培地溶液を１００μＬ加え、各ｗｅｌｌを所定の薬剤濃度に調整し、４時間培養した後、１００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ-Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）で１回洗浄し、再度１００μＬのＰＢＳを加えた。その後、６６０ｎｍのＬＥＤ光源（３０．８ｍＷ／ｃｍ２、LEDR-660DL, OptoCode）を用いて８分４０秒、光線照射した（１６Ｊ／ｃｍ２）。照射後、ＰＢＳを取り除き、２％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地を１００μＬ加え、２４時間培養した。
【0079】
培養後、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ－８（Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ：生細胞数測定キット）のプロトコルに従って操作を行い、マイクロプレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＡ ＭＡＸ３４０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）で４５０ｎｍの吸光度を測定することで、薬剤を添加していない場合に対する相対値としての細胞生存率を算出した。なお測定はｎ＝８で行い、８回で得た値の最大値と最小値を除き、平均値をＩＣ５０の値とし、ＩＣ５０が０．０１μｍｏｌ／Ｌ未満のものはＡ、０．０１μｍｏｌ／Ｌ以上０．１μｍｏｌ／Ｌ未満のものはＢ、０．１μｍｏｌ／Ｌ以上１μｍｏｌ／Ｌ未満のものはＣ、１μｍｏｌ／Ｌ以上１０μｍｏｌ／Ｌ未満のものはＤ、１０μｍｏｌ／Ｌ以上のものはＥと評価した。
【0080】
［腫瘍成長抑制率の評価方法］
ヌードマウス（各群各々４～６匹ずつ、雌４～５週齢、体重２０±２ｇ、ＢｉｏＬＡＳＣＯ社より入手）の右臀部に、５％ＣＯ２下、３７℃で１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ製）および１％抗生物質を添加した１ｍｍｏｌ／ｌピルビン酸ナトリウム含有ダルベッコ変法イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ製）にて増殖させたヒト大腸癌細胞株ＨＴ２９を２×１０７個皮下注射（０日目）し、腫瘍の大きさを２日ごとに測定した。腫瘍体積は、１／２（４π／３）（Ｌ／２）（Ｗ／２）Ｈで計算した（Ｌ：腫瘍の長さ、Ｗ：幅、Ｈ：高さ）。腫瘍体積が５０～１００ｍｍ３に達したところ（１０日目）で、ヌードマウスの側部尾静脈からそれぞれ生理食塩水（コントロール群）を０．１ｍｌ、生理食塩水または２０％ＰＥＧ水溶液に薬剤濃度１．２５ｍＭで溶解させた薬剤溶液０．１ｍｌを投与した。投与４時間後または２４時間後に、腫瘍に６６０ｎｍ（１５Ｊｃｍ－２）、直径２ｃｍのスポットのダイオードレーザー（１００ｍＷ／ｃｍ２、ＣｒｙｓｔａＬａｓｅｒ ＣＬ６６０）を照射した。
腫瘍の大きさを２日ごとに測定し、腫瘍成長抑制率（ＴＧＩ％）を２４日目の腫瘍体積から次式で計算を行い、ＴＧＩ％が６５％未満のものはＤ、６５％以上７０％未満のものはＣ、７０％以上７５％未満のものはＢ、７５％以上のものはＡと評価した。
ヌードマウス（各群各々４～６匹ずつ、雌４～５週齢、体重２０±２ｇ、ＢｉｏＬＡＳＣＯ社より入手）の右臀部に、５％ＣＯ２下、３７℃で１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ製）および１％抗生物質を添加した１ｍｍｏｌ／ｌピルビン酸ナトリウム含有ダルベッコ変法イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ製）にて増殖させたヒト大腸癌細胞株ＨＴ２９を２×１０７個皮下注射（０日目）し、腫瘍の大きさを２日ごとに測定した。腫瘍体積は、１／２（４π／３）（Ｌ／２）（Ｗ／２）Ｈで計算した（Ｌ：腫瘍の長さ、Ｗ：幅、Ｈ：高さ）。腫瘍体積が５０～１００ｍｍ３に達したところ（１０日目）で、ヌードマウスの側部尾静脈からそれぞれ生理食塩水（コントロール群）を０．１ｍｌ、生理食塩水または２０％ＰＥＧ水溶液に薬剤濃度１．２５ｍＭで溶解させた薬剤溶液０．１ｍｌを投与した。投与４時間後または２４時間後に、腫瘍に６６０ｎｍ（１５Ｊｃｍ－２）、直径２ｃｍのスポットのダイオードレーザー（１００ｍＷ／ｃｍ２、ＣｒｙｓｔａＬａｓｅｒ ＣＬ６６０）を照射した。
腫瘍の大きさを２日ごとに測定し、腫瘍成長抑制率（ＴＧＩ％）を２４日目の腫瘍体積から次式で計算を行い、ＴＧＩ％が６５％未満のものはＤ、６５％以上７０％未満のものはＣ、７０％以上７５％未満のものはＢ、７５％以上のものはＡと評価した。
【0081】
ＴＧＩ％＝（（コントロール群の腫瘍体積）－（処理群の腫瘍体積））／（コントロール群の腫瘍体積）× １００％
【0082】
［実施例１］
１－（３－ヒドロキシ－プロパンチオ）－β－Ｄ－グルコース連結クロリンｅ６トリメチ
ルエステルの製造と評価
（１－１）１－（３－ヒドロキシ－プロパンチオ）－β－Ｄ－グルコーステトラアセテートの合成
窒素雰囲気下、１－チオ－β－Ｄ－グルコーステトラアセテート（２．７３ｇ、７．５０ｍｍｏｌ）をクロロホルム（５．０ｍｌ）に溶解し、トリエチルアミン（２．０８ｍｌ、１５．００ｍｍｏｌ）を加えた。得られた溶液を０℃に冷却し、３－ブロモ－１－プロパノール（０．８５ｍｌ、９．７５ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下しながら撹拌した。滴下終了後、溶液の温度を２５℃に上げて３時間撹拌した。撹拌後の溶液に水（５０ｍｌ）、クロロホルム（３０ｍｌ）を入れて分液操作を行い、クロロホルム層を分取した。得られたクロロホルム層を飽和食塩水（５０ｍｌ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水させた。
次に、得られたクロロホルム溶液を吸引ろ過し、溶媒を減圧留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラム（ハイフラッシュカラム、山善株式会社製）に充填し、酢酸エチルとヘキサンの混合溶媒にて溶離した。溶離液を減圧濃縮することにより、１－（３－ヒドロキシ－プロパンチオ）－β－Ｄ－グルコーステトラアセテートを得た（収量２．６８ｇ、収率８５％）。
１－（３－ヒドロキシ－プロパンチオ）－β－Ｄ－グルコース連結クロリンｅ６トリメチ
ルエステルの製造と評価
（１－１）１－（３－ヒドロキシ－プロパンチオ）－β－Ｄ－グルコーステトラアセテートの合成
窒素雰囲気下、１－チオ－β－Ｄ－グルコーステトラアセテート（２．７３ｇ、７．５０ｍｍｏｌ）をクロロホルム（５．０ｍｌ）に溶解し、トリエチルアミン（２．０８ｍｌ、１５．００ｍｍｏｌ）を加えた。得られた溶液を０℃に冷却し、３－ブロモ－１－プロパノール（０．８５ｍｌ、９．７５ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下しながら撹拌した。滴下終了後、溶液の温度を２５℃に上げて３時間撹拌した。撹拌後の溶液に水（５０ｍｌ）、クロロホルム（３０ｍｌ）を入れて分液操作を行い、クロロホルム層を分取した。得られたクロロホルム層を飽和食塩水（５０ｍｌ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水させた。
次に、得られたクロロホルム溶液を吸引ろ過し、溶媒を減圧留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラム（ハイフラッシュカラム、山善株式会社製）に充填し、酢酸エチルとヘキサンの混合溶媒にて溶離した。溶離液を減圧濃縮することにより、１－（３－ヒドロキシ－プロパンチオ）－β－Ｄ－グルコーステトラアセテートを得た（収量２．６８ｇ、収率８５％）。
【0083】
得られた化合物は、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１３，７８，５１９６－５２０４に基づき、１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，重クロロホルム溶媒）にて確認した。
【0084】
【化7】
【0085】
（１－２）クロリンｅ６トリメチルエステルの合成
窒素雰囲気下、クロリンｅ６（１１．９３ｇ、２０．００ｍｍｏｌ）を脱水ジクロロメタン（５００ｍｌ）と脱水メタノール（２５０ｍｌ）の混合溶媒に溶解した。得られた溶液にトリメチルシリルジアゾメタン（２．０ｍｏｌ／ｌヘキサン溶液、３４．０ｍｌ）を滴下し、２５℃で２時間撹拌した。得られた反応液から溶媒を減圧留去し、得られた残渣をジクロロメタン／ヘキサンから再結晶することにより、クロリンｅ６トリメチルエステルを得た（収量１１．６４ｇ、収率９１％）。
窒素雰囲気下、クロリンｅ６（１１．９３ｇ、２０．００ｍｍｏｌ）を脱水ジクロロメタン（５００ｍｌ）と脱水メタノール（２５０ｍｌ）の混合溶媒に溶解した。得られた溶液にトリメチルシリルジアゾメタン（２．０ｍｏｌ／ｌヘキサン溶液、３４．０ｍｌ）を滴下し、２５℃で２時間撹拌した。得られた反応液から溶媒を減圧留去し、得られた残渣をジクロロメタン／ヘキサンから再結晶することにより、クロリンｅ６トリメチルエステルを得た（収量１１．６４ｇ、収率９１％）。
【0086】
得られた化合物は、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００７，８３，１００６－１０１５に基づき、１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，重クロロホルム溶媒）にて確認した。
【0087】
【化8】
【0088】
（１－３）１－（３－ヒドロキシ－プロパンチオ）－β－Ｄ－グルコーステトラアセテート連結クロリンｅ６トリメチルエステルの合成
上記（１－２）で合成したクロリンｅ６トリメチルエステル（０．９５ｇ、１．４８ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下、２５％臭化水素－酢酸溶液（１８．０ｍｌ）に溶解し、３０℃で２時間撹拌した。得られた反応液から臭化水素－酢酸溶液を減圧留去し、反応液を乾固させた。得られた残渣を脱水ジクロロメタン（５０ｍｌ）に溶解し、炭酸カリウム（２．０５ｇ、１４．８０ｍｍｏｌ）を入れて、３０℃で３０分撹拌した。得られた溶液に、上記（１－１）で合成した１－（３－ヒドロキシ－プロパンチオ）－β－Ｄ－グルコーステトラアセテート（１．８８ｇ、４．４５ｍｍｏｌ）を脱水ジクロロメタン（５０ｍｌ）に溶解して滴下し、３０℃で５時間撹拌した。得られた反応液に水（１００ｍｌ）とジクロロメタン（２００ｍｌ）を加えて分液操作を行い、ジクロロメタン層を分取した。得られたジクロロメタン層を水（２００ｍｌ）および飽和食塩水（２００ｍｌ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水させた。得られたジクロロメタン溶液を吸引ろ過し、溶媒を減圧留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラム（ハイフラッシュカラム，山善株式会社製）に充填し、酢酸エチルとジクロロメタンの混合溶媒にて溶離した。溶離液を減圧濃縮することにより、１－（３－ヒドロキシ－プロパンチオ）－β－Ｄ－グルコーステトラアセテート連結クロリンｅ６トリメチルエステルを得た（収量０．４２ｇ、収率２７％）。
上記（１－２）で合成したクロリンｅ６トリメチルエステル（０．９５ｇ、１．４８ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下、２５％臭化水素－酢酸溶液（１８．０ｍｌ）に溶解し、３０℃で２時間撹拌した。得られた反応液から臭化水素－酢酸溶液を減圧留去し、反応液を乾固させた。得られた残渣を脱水ジクロロメタン（５０ｍｌ）に溶解し、炭酸カリウム（２．０５ｇ、１４．８０ｍｍｏｌ）を入れて、３０℃で３０分撹拌した。得られた溶液に、上記（１－１）で合成した１－（３－ヒドロキシ－プロパンチオ）－β－Ｄ－グルコーステトラアセテート（１．８８ｇ、４．４５ｍｍｏｌ）を脱水ジクロロメタン（５０ｍｌ）に溶解して滴下し、３０℃で５時間撹拌した。得られた反応液に水（１００ｍｌ）とジクロロメタン（２００ｍｌ）を加えて分液操作を行い、ジクロロメタン層を分取した。得られたジクロロメタン層を水（２００ｍｌ）および飽和食塩水（２００ｍｌ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水させた。得られたジクロロメタン溶液を吸引ろ過し、溶媒を減圧留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラム（ハイフラッシュカラム，山善株式会社製）に充填し、酢酸エチルとジクロロメタンの混合溶媒にて溶離した。溶離液を減圧濃縮することにより、１－（３－ヒドロキシ－プロパンチオ）－β－Ｄ－グルコーステトラアセテート連結クロリンｅ６トリメチルエステルを得た（収量０．４２ｇ、収率２７％）。
【0089】
得られた化合物は１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，重クロロホルム溶媒）にてクロリンｅ６トリメチルエステルの３位二重結合に由来するピークが消失し、１－（３－ヒドロキシ－プロパンチオ）－β－Ｄ－グルコーステトラアセテートが結合していることを確認した。またＥＳＩ＋ＭＳ（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）法による解析にて分子量が一致することを確認した。
ＭＳ：ｍ／ｚ（［Ｍ＋Ｈ］+）；ｃａｌｃｄ．１０６１．４５ ｆｏｒ Ｃ５４Ｈ６８Ｎ４Ｏ１６Ｓ、ｆｏｕｎｄ．１０６１．４１。
ＭＳ：ｍ／ｚ（［Ｍ＋Ｈ］+）；ｃａｌｃｄ．１０６１．４５ ｆｏｒ Ｃ５４Ｈ６８Ｎ４Ｏ１６Ｓ、ｆｏｕｎｄ．１０６１．４１。
【0090】
【化9】
【0091】
（１－１′）３－ブロモ－１－プロパノール連結クロリンｅ６トリメチルエステルの合成
上記（１－２）で合成したクロリンｅ６トリメチルエステル（０．９６ｇ、１．５０ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下、２５％臭化水素－酢酸溶液（１８．０ｍｌ）に溶解し、３０℃で２時間撹拌した。得られた反応液から臭化水素－酢酸溶液を減圧留去し、反応液を乾固させた。得られた残渣を脱水ジクロロメタン（５０ｍｌ）に溶解し、炭酸カリウム（２．０７ｇ、１５．００ｍｍｏｌ）を入れて、３０℃で３０分撹拌した。得られた溶液に、３－ブロモ－１－プロパノール（２．６０ｍｌ、３０．００ｍｍｏｌ）を滴下し、３０℃で５時間撹拌した。得られた反応液に水（１００ｍｌ）とジクロロメタン（２００ｍｌ）を加えて分液操作を行い、ジクロロメタン層を分取した。得られたジクロロメタン層を水（２００ｍｌ）、飽和食塩水（２００ｍｌ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水させた。得られたジクロロメタン溶液を吸引ろ過し、溶媒を減圧留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラム（ハイフラッシュカラム，山善株式会社製）に充填し、酢酸エチルとジクロロメタンの混合溶媒にて溶離した。溶離液を減圧濃縮することにより、３－ブロモ－１－プロパノール連結クロリンｅ６トリメチルエステルを得た（収量０．９１ｇ、収率７８％）。
上記（１－２）で合成したクロリンｅ６トリメチルエステル（０．９６ｇ、１．５０ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下、２５％臭化水素－酢酸溶液（１８．０ｍｌ）に溶解し、３０℃で２時間撹拌した。得られた反応液から臭化水素－酢酸溶液を減圧留去し、反応液を乾固させた。得られた残渣を脱水ジクロロメタン（５０ｍｌ）に溶解し、炭酸カリウム（２．０７ｇ、１５．００ｍｍｏｌ）を入れて、３０℃で３０分撹拌した。得られた溶液に、３－ブロモ－１－プロパノール（２．６０ｍｌ、３０．００ｍｍｏｌ）を滴下し、３０℃で５時間撹拌した。得られた反応液に水（１００ｍｌ）とジクロロメタン（２００ｍｌ）を加えて分液操作を行い、ジクロロメタン層を分取した。得られたジクロロメタン層を水（２００ｍｌ）、飽和食塩水（２００ｍｌ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水させた。得られたジクロロメタン溶液を吸引ろ過し、溶媒を減圧留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラム（ハイフラッシュカラム，山善株式会社製）に充填し、酢酸エチルとジクロロメタンの混合溶媒にて溶離した。溶離液を減圧濃縮することにより、３－ブロモ－１－プロパノール連結クロリンｅ６トリメチルエステルを得た（収量０．９１ｇ、収率７８％）。
【0092】
得られた化合物は１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，重クロロホルム溶媒）にてクロリンｅ６トリメチルエステルの３位二重結合に由来するピークが消失し、３－ブロモ－１－プロパノールが結合していることを確認した。またＥＳＩ＋ＭＳ法による解析にて分子量が一致することを確認した。
【0093】
ＭＳ：ｍ／ｚ（［Ｍ＋Ｈ］+）；ｃａｌｃｄ．７７７．２９ ｆｏｒ Ｃ４０Ｈ４９ＢｒＮ４Ｏ７、ｆｏｕｎｄ．７７７．２９。
【0094】
【化10】
【0095】
（１－２′）１－（３－ヒドロキシ－プロパンチオ）－β－Ｄ－グルコーステトラアセテート連結クロリンｅ６トリメチルエステルの合成
窒素雰囲気下、１－チオ－β－Ｄ－グルコーステトラアセテート（１３１ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）をクロロホルム（１．０ｍｌ）に溶解し、トリエチルアミン（９０μｌ、０．６５ｍｍｏｌ）を加えた。得られた溶液を０℃に冷却し、３－ブロモ－１－プロパノール連結クロリンｅ６トリメチルエステル（８６ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下しながら撹拌した。滴下終了後、溶液の温度を２０℃に上げて１４時間撹拌した。撹拌後の溶液に水（１０ｍｌ）、クロロホルム（１０ｍｌ）を入れて分液操作を行い、クロロホルム層を分取した。得られたクロロホルム層を飽和食塩水（１０ｍｌ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水させた。得られたクロロホルム溶液を吸引ろ過し、溶媒を減圧留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラム（ハイフラッシュカラム，山善株式会社製）に充填し、酢酸エチルとジクロロメタンの混合溶媒にて溶離した。溶離液を減圧濃縮することにより、１－（３－ヒドロキシ－プロパンチオ）－β－Ｄ－グルコーステトラアセテート連結クロリンｅ６トリメチルエステル（収量５２ｍｇ、収率４５％）。
得られた化合物は、１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、重クロロホルム溶媒）にて１－チオ－β－Ｄ－グルコーステトラアセテートが結合していることを確認した。またＥＳＩ＋ＭＳ法による解析にて分子量が一致することを確認した。
窒素雰囲気下、１－チオ－β－Ｄ－グルコーステトラアセテート（１３１ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）をクロロホルム（１．０ｍｌ）に溶解し、トリエチルアミン（９０μｌ、０．６５ｍｍｏｌ）を加えた。得られた溶液を０℃に冷却し、３－ブロモ－１－プロパノール連結クロリンｅ６トリメチルエステル（８６ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下しながら撹拌した。滴下終了後、溶液の温度を２０℃に上げて１４時間撹拌した。撹拌後の溶液に水（１０ｍｌ）、クロロホルム（１０ｍｌ）を入れて分液操作を行い、クロロホルム層を分取した。得られたクロロホルム層を飽和食塩水（１０ｍｌ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水させた。得られたクロロホルム溶液を吸引ろ過し、溶媒を減圧留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラム（ハイフラッシュカラム，山善株式会社製）に充填し、酢酸エチルとジクロロメタンの混合溶媒にて溶離した。溶離液を減圧濃縮することにより、１－（３－ヒドロキシ－プロパンチオ）－β－Ｄ－グルコーステトラアセテート連結クロリンｅ６トリメチルエステル（収量５２ｍｇ、収率４５％）。
得られた化合物は、１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、重クロロホルム溶媒）にて１－チオ－β－Ｄ－グルコーステトラアセテートが結合していることを確認した。またＥＳＩ＋ＭＳ法による解析にて分子量が一致することを確認した。
【0096】
ＭＳ：ｍ／ｚ（［Ｍ＋Ｈ］+）；ｃａｌｃｄ．１０６１．４５ ｆｏｒ Ｃ５４Ｈ６８Ｎ４Ｏ１６Ｓ、ｆｏｕｎｄ．１０６１．４５。
【0097】
【化11】
【0098】
（１－４）１－（３－ヒドロキシ－プロパンチオ）－β－Ｄ－グルコース連結クロリンｅ６トリメチルエステルの合成
上記（１－３）および（１－２′）で合成した１－（３－ヒドロキシ－プロパンチオ）－β－Ｄ－グルコーステトラアセテート連結クロリンｅ６（１０７ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下、脱水メタノール（８．０ｍｌ）に溶解し、ナトリウムメトキシド（５４ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）を入れて２５℃で３０分撹拌した。得られた反応溶液に酢酸（５８μｌ、１．００ｍｍｏｌ）を加えて反応を停止させた。得られた溶液から溶媒を減圧留去し、残渣をＰＬＣガラスプレート（シリカゲル６０ Ｆ２５４、メルク株式会社製）に充填し、ジクロロメタンとメタノールの混合溶媒にて溶離した。溶離液を減圧濃縮後、逆相シリカゲルクロマト（Ｓｅｐ－Ｐａｋ Ｃ１８、Ｗａｔｅｒｓ社製）に充填し、イオン交換水で塩を溶離させた後、メタノールにて溶離した。得られたメタノール溶液を減圧濃縮し、１－（３－ヒドロキシ－プロパンチオ）－β－Ｄ－グルコース連結クロリンｅ６トリメチルエステルを得た（収量６４ｍｇ、収率７２％）。
得られた化合物は、１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，重クロロホルム溶媒）にて１－（３－ヒドロキシ－プロパンチオ）－β－Ｄ－グルコーステトラアセテート連結クロリンｅ６トリメチルエステルのアセチル基由来のピークが消失していることを確認した。またＥＳＩ＋ＭＳ法による解析にて分子量が一致することを確認した。
上記（１－３）および（１－２′）で合成した１－（３－ヒドロキシ－プロパンチオ）－β－Ｄ－グルコーステトラアセテート連結クロリンｅ６（１０７ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下、脱水メタノール（８．０ｍｌ）に溶解し、ナトリウムメトキシド（５４ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）を入れて２５℃で３０分撹拌した。得られた反応溶液に酢酸（５８μｌ、１．００ｍｍｏｌ）を加えて反応を停止させた。得られた溶液から溶媒を減圧留去し、残渣をＰＬＣガラスプレート（シリカゲル６０ Ｆ２５４、メルク株式会社製）に充填し、ジクロロメタンとメタノールの混合溶媒にて溶離した。溶離液を減圧濃縮後、逆相シリカゲルクロマト（Ｓｅｐ－Ｐａｋ Ｃ１８、Ｗａｔｅｒｓ社製）に充填し、イオン交換水で塩を溶離させた後、メタノールにて溶離した。得られたメタノール溶液を減圧濃縮し、１－（３－ヒドロキシ－プロパンチオ）－β－Ｄ－グルコース連結クロリンｅ６トリメチルエステルを得た（収量６４ｍｇ、収率７２％）。
得られた化合物は、１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，重クロロホルム溶媒）にて１－（３－ヒドロキシ－プロパンチオ）－β－Ｄ－グルコーステトラアセテート連結クロリンｅ６トリメチルエステルのアセチル基由来のピークが消失していることを確認した。またＥＳＩ＋ＭＳ法による解析にて分子量が一致することを確認した。
【0099】
ＭＳ：ｍ／ｚ（［Ｍ＋Ｈ］+）；ｃａｌｃｄ．８９３．４０ ｆｏｒ Ｃ４６Ｈ６０Ｎ４Ｏ１２Ｓ、ｆｏｕｎｄ．８９３．４５。
【0100】
【化12】
【0101】
（１－５）１－（３－ヒドロキシ－プロパンチオ）－β－Ｄ－グルコース連結クロリンｅ６トリメチルエステルの評価
上記製造方法に基づいて得られた１－（３－ヒドロキシ－プロパンチオ）－β－Ｄ－グルコース連結クロリンｅ６トリメチルエステルについて、光毒性の評価方法および腫瘍成長抑制率の評価方法に基づいて評価を実施した。結果を表１、表２および表３に示す。また腫瘍成長抑制率の評価期間内において、全てのヌードマウスが体重減少することなく生存していることを確認し、薬剤投与およびレーザー照射によるヌードマウスへの悪影響は見られなかった。
上記製造方法に基づいて得られた１－（３－ヒドロキシ－プロパンチオ）－β－Ｄ－グルコース連結クロリンｅ６トリメチルエステルについて、光毒性の評価方法および腫瘍成長抑制率の評価方法に基づいて評価を実施した。結果を表１、表２および表３に示す。また腫瘍成長抑制率の評価期間内において、全てのヌードマウスが体重減少することなく生存していることを確認し、薬剤投与およびレーザー照射によるヌードマウスへの悪影響は見られなかった。
【0102】
［実施例２］
１－（６－ヒドロキシ－ヘキサンチオ）－β－Ｄ－グルコース連結クロリンｅ６トリメチルエステルの製造と評価
（２－１）１－（６－ヒドロキシ－ヘキサンチオ）－β－Ｄ－グルコーステトラアセテートの合成
窒素雰囲気下、１－チオ－β－Ｄ－グルコーステトラアセテート（１．３７ｇ、３．７５ｍｍｏｌ）をクロロホルム（２．５ｍｌ）に溶解し、トリエチルアミン（１．０４ｍｌ、７．５０ｍｍｏｌ）を加えた。得られた溶液を０℃に冷却し、６－ブロモ－１－ヘキサノール（０．６６ｍｌ、４．８８ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下しながら撹拌した。滴下終了後、溶液の温度を２５℃に上げて３時間撹拌した。撹拌後の溶液に水（２５ｍｌ）、クロロホルム（１５ｍｌ）を入れて分液操作を行い、クロロホルム層を分取した。得られたクロロホルム層を飽和食塩水（２５ｍｌ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水させた。得られたクロロホルム溶液を吸引ろ過し、溶媒を減圧留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラム（ハイフラッシュカラム，山善株式会社製）に充填し、酢酸エチルとヘキサンの混合溶媒にて溶離した。溶離液を減圧濃縮することにより、１－（６－ヒドロキシ－ヘキサンチオ）－β－Ｄ－グルコーステトラアセテートを得た（収量１．３９ｇ、収率８０％）。
１－（６－ヒドロキシ－ヘキサンチオ）－β－Ｄ－グルコース連結クロリンｅ６トリメチルエステルの製造と評価
（２－１）１－（６－ヒドロキシ－ヘキサンチオ）－β－Ｄ－グルコーステトラアセテートの合成
窒素雰囲気下、１－チオ－β－Ｄ－グルコーステトラアセテート（１．３７ｇ、３．７５ｍｍｏｌ）をクロロホルム（２．５ｍｌ）に溶解し、トリエチルアミン（１．０４ｍｌ、７．５０ｍｍｏｌ）を加えた。得られた溶液を０℃に冷却し、６－ブロモ－１－ヘキサノール（０．６６ｍｌ、４．８８ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下しながら撹拌した。滴下終了後、溶液の温度を２５℃に上げて３時間撹拌した。撹拌後の溶液に水（２５ｍｌ）、クロロホルム（１５ｍｌ）を入れて分液操作を行い、クロロホルム層を分取した。得られたクロロホルム層を飽和食塩水（２５ｍｌ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水させた。得られたクロロホルム溶液を吸引ろ過し、溶媒を減圧留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラム（ハイフラッシュカラム，山善株式会社製）に充填し、酢酸エチルとヘキサンの混合溶媒にて溶離した。溶離液を減圧濃縮することにより、１－（６－ヒドロキシ－ヘキサンチオ）－β－Ｄ－グルコーステトラアセテートを得た（収量１．３９ｇ、収率８０％）。
【0103】
構造同定は、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１３，７８，５１９６－５２０４に基づき、１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，重クロロホルム溶媒）にて行った。
【0104】
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ５．２２（ｔ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ－３），５．０８（ｔ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ－４），５．０４（ｔ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ－２）４．４８（ｄ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ－１），４．２５（ｄｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ－６），４．１４（ｄｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ－６），３．７０－３．７２（ｍ，１Ｈ，Ｈ－５），３．６３－３．６５（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２ＯＨ），２．６４－２．７２（ｍ，２Ｈ，ＳＣＨ２），２．０６，２．０５，２．０３，２．０１（ｓ，１２Ｈ，４×ＯＣＯＣＨ３），１．５２－１．６５（ｍ，４Ｈ，－ＣＨ２－），１．３５－１．４２（ｍ，４Ｈ，－ＣＨ２－）
【0105】
【化13】
【0106】
（２－２）１－（６－ヒドロキシ－ヘキサンチオ）－β－Ｄ－グルコーステトラアセテート連結クロリンｅ６トリメチルエステルの合成
実施例１で合成したクロリンｅ６トリメチルエステル（６６４ｍｇ、１．０４ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下、２５％臭化水素－酢酸溶液（１２．０ｍｌ）に溶解し、３０℃で２時間撹拌した。得られた反応液から臭化水素－酢酸溶液を減圧留去し、反応液を乾固させた。得られた残渣を脱水ジクロロメタン（３５ｍｌ）に溶解し、炭酸カリウム（１４３７ｍｇ、１０．４０ｍｍｏｌ）を入れて、３０℃で３０分撹拌した。得られた溶液に、上記（１－１）で合成した１－（６－ヒドロキシ－ヘキサンチオ）－β－Ｄ－グルコーステトラアセテート（１４５０ｍｇ、３．１２ｍｍｏｌ）を脱水ジクロロメタン（３５ｍｌ）に溶解して滴下し、３０℃で５時間撹拌した。得られた反応液に水（７０ｍｌ）とジクロロメタン（１４０ｍｌ）を加えて分液操作を行い、ジクロロメタン層を分取した。得られたジクロロメタン層を水（１４０ｍｌ）、飽和食塩水（１４０ｍｌ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水させた。得られたジクロロメタン溶液を吸引ろ過し、溶媒を減圧留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラム（ハイフラッシュカラム，山善株式会社製）に充填し、酢酸エチルとジクロロメタンの混合溶媒にて溶離した。溶離液を減圧濃縮することにより、１－（６－ヒドロキシ－ヘキサンチオ）－β－Ｄ－グルコーステトラアセテート連結クロリンｅ６トリメチルエステルを得た（収量１４５ｍｇ、収率１３％）。
実施例１で合成したクロリンｅ６トリメチルエステル（６６４ｍｇ、１．０４ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下、２５％臭化水素－酢酸溶液（１２．０ｍｌ）に溶解し、３０℃で２時間撹拌した。得られた反応液から臭化水素－酢酸溶液を減圧留去し、反応液を乾固させた。得られた残渣を脱水ジクロロメタン（３５ｍｌ）に溶解し、炭酸カリウム（１４３７ｍｇ、１０．４０ｍｍｏｌ）を入れて、３０℃で３０分撹拌した。得られた溶液に、上記（１－１）で合成した１－（６－ヒドロキシ－ヘキサンチオ）－β－Ｄ－グルコーステトラアセテート（１４５０ｍｇ、３．１２ｍｍｏｌ）を脱水ジクロロメタン（３５ｍｌ）に溶解して滴下し、３０℃で５時間撹拌した。得られた反応液に水（７０ｍｌ）とジクロロメタン（１４０ｍｌ）を加えて分液操作を行い、ジクロロメタン層を分取した。得られたジクロロメタン層を水（１４０ｍｌ）、飽和食塩水（１４０ｍｌ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水させた。得られたジクロロメタン溶液を吸引ろ過し、溶媒を減圧留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラム（ハイフラッシュカラム，山善株式会社製）に充填し、酢酸エチルとジクロロメタンの混合溶媒にて溶離した。溶離液を減圧濃縮することにより、１－（６－ヒドロキシ－ヘキサンチオ）－β－Ｄ－グルコーステトラアセテート連結クロリンｅ６トリメチルエステルを得た（収量１４５ｍｇ、収率１３％）。
【0107】
得られた化合物は１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，重クロロホルム溶媒）にてクロリンｅ６トリメチルエステルの３位二重結合に由来するピークが消失し、１－（６－ヒドロキシ－ヘキサンチオ）－β－Ｄ－グルコーステトラアセテートが結合していることを確認した。またＥＳＩ＋ＭＳ法による解析にて分子量が一致することを確認した。
【0108】
【化14】
【0109】
（２－３）１－（６－ヒドロキシ－ヘキサンチオ）－β－Ｄ－グルコース連結クロリンｅ６トリメチルエステルの合成
上記（２－２）で合成した１－（６－ヒドロキシ－ヘキサンチオ）－β－Ｄ－グルコーステトラアセテート連結クロリンｅ６トリメチルエステル（１３４ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下、脱水メタノール（１０．０ｍｌ）に溶解し、ナトリウムメトキシド（６５ｍｇ、１．２１ｍｍｏｌ）を入れて２５℃で３０分撹拌した。得られた溶液に酢酸（６９μｌ、１．２１ｍｍｏｌ）を加えて反応を停止させた。得られた溶液から溶媒を減圧留去し、残渣をＰＬＣガラスプレート（シリカゲル６０ Ｆ２５４、メルク株式会社製）に充填し、ジクロロメタンとメタノールの混合溶媒にて溶離した。溶離液を減圧濃縮後、逆相シリカゲルクロマト（Ｓｅｐ－Ｐａｋ Ｃ１８、Ｗａｔｅｒｓ社製）に充填し、イオン交換水で塩を溶離させた後、メタノールにて溶離した。得られたメタノール溶液を減圧濃縮し、１－（６－ヒドロキシ－ヘキサンチオ）－β－Ｄ－グルコース連結クロリンｅ６トリメチルエステルを得た（収量７５ｍｇ、収率６７％）。
上記（２－２）で合成した１－（６－ヒドロキシ－ヘキサンチオ）－β－Ｄ－グルコーステトラアセテート連結クロリンｅ６トリメチルエステル（１３４ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下、脱水メタノール（１０．０ｍｌ）に溶解し、ナトリウムメトキシド（６５ｍｇ、１．２１ｍｍｏｌ）を入れて２５℃で３０分撹拌した。得られた溶液に酢酸（６９μｌ、１．２１ｍｍｏｌ）を加えて反応を停止させた。得られた溶液から溶媒を減圧留去し、残渣をＰＬＣガラスプレート（シリカゲル６０ Ｆ２５４、メルク株式会社製）に充填し、ジクロロメタンとメタノールの混合溶媒にて溶離した。溶離液を減圧濃縮後、逆相シリカゲルクロマト（Ｓｅｐ－Ｐａｋ Ｃ１８、Ｗａｔｅｒｓ社製）に充填し、イオン交換水で塩を溶離させた後、メタノールにて溶離した。得られたメタノール溶液を減圧濃縮し、１－（６－ヒドロキシ－ヘキサンチオ）－β－Ｄ－グルコース連結クロリンｅ６トリメチルエステルを得た（収量７５ｍｇ、収率６７％）。
【0110】
得られた化合物は１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、重クロロホルム溶媒）にて１－（６－ヒドロキシ－ヘキサンチオ）－β－Ｄ－グルコーステトラアセテート連結クロリンｅ６トリメチルエステルのアセチル基由来のピークが消失していることを確認した。またＥＳＩ＋ＭＳ法による解析にて分子量が一致することを確認した。
【0111】
【化15】
【0112】
（２－４）１－（６－ヒドロキシ－ヘキサンチオ）－β－Ｄ－グルコース連結クロリンｅ６トリメチルエステルの評価
上記製造方法に基づいて得られた１－（６－ヒドロキシ－ヘキサンチオ）－β－Ｄ－グルコース連結クロリンｅ６トリメチルエステルについて、光毒性の評価方法および腫瘍成長抑制率の評価方法に基づいて評価を実施した。結果を表１、表２および表３に示す。また腫瘍成長抑制率の評価期間内において、全てのヌードマウスが体重減少することなく生存していることを確認し、薬剤投与およびレーザー照射によるヌードマウスへの悪影響は見られなかった。
上記製造方法に基づいて得られた１－（６－ヒドロキシ－ヘキサンチオ）－β－Ｄ－グルコース連結クロリンｅ６トリメチルエステルについて、光毒性の評価方法および腫瘍成長抑制率の評価方法に基づいて評価を実施した。結果を表１、表２および表３に示す。また腫瘍成長抑制率の評価期間内において、全てのヌードマウスが体重減少することなく生存していることを確認し、薬剤投与およびレーザー照射によるヌードマウスへの悪影響は見られなかった。
【0113】
［実施例３］
１－（１０－ヒドロキシ－デカンチオ）－β－Ｄ－グルコース連結クロリンｅ６トリメチルエステルの製造と評価
（３－１）１－（１０－ヒドロキシ－デカンチオ）－β－Ｄ－グルコーステトラアセテートの合成
窒素雰囲気下、１－チオ－β－Ｄ－グルコーステトラアセテート（１．３７ｇ、３．７５ｍｍｏｌ）をクロロホルム（２．５ｍｌ）に溶解し、トリエチルアミン（１．０４ｍｌ、７．５０ｍｍｏｌ）を加えた。得られた溶液を０℃に冷却し、１０－ブロモ－１－デカノール（１．００ｍｌ、４．８８ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下しながら撹拌した。滴下終了後、溶液の温度を２５℃に上げて３時間撹拌した。撹拌後の溶液に水（２５ｍｌ）、クロロホルム（１５ｍｌ）を入れて分液操作を行い、クロロホルム層を分取した。得られたクロロホルム層を飽和食塩水（２５ｍｌ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水させた。得られたクロロホルム溶液を吸引ろ過し、溶媒を減圧留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラム（ハイフラッシュカラム，山善株式会社製）に充填し、酢酸エチルとヘキサンの混合溶媒にて溶離した。溶離液を減圧濃縮することにより、１－（１０－ヒドロキシ－デカンチオ）－β－Ｄ－グルコーステトラアセテートを得た（収量１．６０ｇ、収率８２％）。
１－（１０－ヒドロキシ－デカンチオ）－β－Ｄ－グルコース連結クロリンｅ６トリメチルエステルの製造と評価
（３－１）１－（１０－ヒドロキシ－デカンチオ）－β－Ｄ－グルコーステトラアセテートの合成
窒素雰囲気下、１－チオ－β－Ｄ－グルコーステトラアセテート（１．３７ｇ、３．７５ｍｍｏｌ）をクロロホルム（２．５ｍｌ）に溶解し、トリエチルアミン（１．０４ｍｌ、７．５０ｍｍｏｌ）を加えた。得られた溶液を０℃に冷却し、１０－ブロモ－１－デカノール（１．００ｍｌ、４．８８ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下しながら撹拌した。滴下終了後、溶液の温度を２５℃に上げて３時間撹拌した。撹拌後の溶液に水（２５ｍｌ）、クロロホルム（１５ｍｌ）を入れて分液操作を行い、クロロホルム層を分取した。得られたクロロホルム層を飽和食塩水（２５ｍｌ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水させた。得られたクロロホルム溶液を吸引ろ過し、溶媒を減圧留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラム（ハイフラッシュカラム，山善株式会社製）に充填し、酢酸エチルとヘキサンの混合溶媒にて溶離した。溶離液を減圧濃縮することにより、１－（１０－ヒドロキシ－デカンチオ）－β－Ｄ－グルコーステトラアセテートを得た（収量１．６０ｇ、収率８２％）。
【0114】
構造同定は、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１３，７８，５１９６－５２０４に基づき、１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、重クロロホルム溶媒）にて行った。
【0115】
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ５．２２（ｔ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ－３），５．０７（ｔ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ－４），５．０３（ｔ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ－２）４．４９（ｄ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ－１），４．２５（ｄｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ－６），４．１３（ｄｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ－６），３．６９－３．７２（ｍ，１Ｈ，Ｈ－５），３．６１－３．６４（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２ＯＨ），２．６０－２．７２（ｍ，２Ｈ，ＳＣＨ２），２．０７，２．０５，２．０２，２．０１（ｓ，１２Ｈ，４×ＯＣＯＣＨ３），１．５２－１．６５（ｍ，４Ｈ，－ＣＨ２－），１．２５－１．４２（ｍ，１２Ｈ，－ＣＨ２－）
【0116】
【化16】
【0117】
（３－２）１－（１０－ヒドロキシ－デカンチオ）－β－Ｄ－グルコーステトラアセテート連結クロリンｅ６トリメチルエステルの合成
実施例１で合成したクロリンｅ６トリメチルエステル（７１５ｍｇ、１．１２ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下、２５％臭化水素－酢酸溶液（１３．０ｍｌ）に溶解し、３０℃で２時間撹拌した。得られた反応液から臭化水素－酢酸溶液を減圧留去し、反応液を乾固させた。得られた残渣を脱水ジクロロメタン（４０ｍｌ）に溶解し、炭酸カリウム（１５４９ｍｇ、１１．２０ｍｍｏｌ）を入れて、３０℃で３０分撹拌した。得られた溶液に、上記（３－１）で合成した１－（１０－ヒドロキシ－デカンチオ）－β－Ｄ－グルコーステトラアセテート（１７５０ｍｇ、３．３６ｍｍｏｌ）を脱水ジクロロメタン（４０ｍｌ）に溶解して滴下し、３０℃で５時間撹拌した。得られた反応液に水（８０ｍｌ）とジクロロメタン（１６０ｍｌ）を加えて分液操作を行い、ジクロロメタン層を分取した。得られたジクロロメタン層を水（１６０ｍｌ）、飽和食塩水（１６０ｍｌ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水させた。得られたジクロロメタン溶液を吸引ろ過し、溶媒を減圧留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラム（ハイフラッシュカラム，山善株式会社製）に充填し、酢酸エチルとジクロロメタンの混合溶媒にて溶離した。溶離液を減圧濃縮することにより、１－（１０－ヒドロキシ－デカンチオ）－β－Ｄ－グルコーステトラアセテート連結クロリンｅ６トリメチルエステルを得た（収量２８５ｍｇ、収率２２％）。
実施例１で合成したクロリンｅ６トリメチルエステル（７１５ｍｇ、１．１２ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下、２５％臭化水素－酢酸溶液（１３．０ｍｌ）に溶解し、３０℃で２時間撹拌した。得られた反応液から臭化水素－酢酸溶液を減圧留去し、反応液を乾固させた。得られた残渣を脱水ジクロロメタン（４０ｍｌ）に溶解し、炭酸カリウム（１５４９ｍｇ、１１．２０ｍｍｏｌ）を入れて、３０℃で３０分撹拌した。得られた溶液に、上記（３－１）で合成した１－（１０－ヒドロキシ－デカンチオ）－β－Ｄ－グルコーステトラアセテート（１７５０ｍｇ、３．３６ｍｍｏｌ）を脱水ジクロロメタン（４０ｍｌ）に溶解して滴下し、３０℃で５時間撹拌した。得られた反応液に水（８０ｍｌ）とジクロロメタン（１６０ｍｌ）を加えて分液操作を行い、ジクロロメタン層を分取した。得られたジクロロメタン層を水（１６０ｍｌ）、飽和食塩水（１６０ｍｌ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水させた。得られたジクロロメタン溶液を吸引ろ過し、溶媒を減圧留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラム（ハイフラッシュカラム，山善株式会社製）に充填し、酢酸エチルとジクロロメタンの混合溶媒にて溶離した。溶離液を減圧濃縮することにより、１－（１０－ヒドロキシ－デカンチオ）－β－Ｄ－グルコーステトラアセテート連結クロリンｅ６トリメチルエステルを得た（収量２８５ｍｇ、収率２２％）。
【0118】
得られた化合物は１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，重クロロホルム溶媒）にてクロリンｅ６トリメチルエステルの３位二重結合に由来するピークが消失し、１－（１０－ヒドロキシ－デカンチオ）－β－Ｄ－グルコーステトラアセテートが結合していることを確認した。またＥＳＩ＋ＭＳ法による解析にて分子量が一致することを確認した。
【0119】
【化17】
【0120】
（３－３）１－（１０－ヒドロキシ－デカンチオ）－β－Ｄ－グルコース連結クロリンｅ６トリメチルエステルの合成
上記（３－２）で合成した１－（１０－ヒドロキシ－デカンチオ）－β－Ｄ－グルコーステトラアセテート連結クロリンｅ６トリメチルエステル（２６８ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下、脱水メタノール（２０．０ｍｌ）に溶解し、ナトリウムメトキシド（１２５ｍｇ、２．３１ｍｍｏｌ）を入れて２０℃で１時間撹拌した。得られた溶液に酢酸（１３２μｌ、２．３１ｍｍｏｌ）を加えて反応を停止させた。得られた溶液から溶媒を減圧留去し、残渣をＰＬＣガラスプレート（シリカゲル６０ Ｆ２５４、メルク株式会社製）に充填し、ジクロロメタンとメタノールの混合溶媒にて溶離した。溶離液を減圧濃縮後、逆相シリカゲルクロマト（Ｓｅｐ－Ｐａｋ Ｃ１８、Ｗａｔｅｒｓ社製）に充填し、イオン交換水で塩を溶離させた後、メタノールにて溶離した。得られたメタノール溶液を減圧濃縮し、１－（１０－ヒドロキシ－デカンチオ）－β－Ｄ－グルコース連結クロリンｅ６トリメチルエステルを得た（収量１４９ｍｇ、収率６５％）。
上記（３－２）で合成した１－（１０－ヒドロキシ－デカンチオ）－β－Ｄ－グルコーステトラアセテート連結クロリンｅ６トリメチルエステル（２６８ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下、脱水メタノール（２０．０ｍｌ）に溶解し、ナトリウムメトキシド（１２５ｍｇ、２．３１ｍｍｏｌ）を入れて２０℃で１時間撹拌した。得られた溶液に酢酸（１３２μｌ、２．３１ｍｍｏｌ）を加えて反応を停止させた。得られた溶液から溶媒を減圧留去し、残渣をＰＬＣガラスプレート（シリカゲル６０ Ｆ２５４、メルク株式会社製）に充填し、ジクロロメタンとメタノールの混合溶媒にて溶離した。溶離液を減圧濃縮後、逆相シリカゲルクロマト（Ｓｅｐ－Ｐａｋ Ｃ１８、Ｗａｔｅｒｓ社製）に充填し、イオン交換水で塩を溶離させた後、メタノールにて溶離した。得られたメタノール溶液を減圧濃縮し、１－（１０－ヒドロキシ－デカンチオ）－β－Ｄ－グルコース連結クロリンｅ６トリメチルエステルを得た（収量１４９ｍｇ、収率６５％）。
【0121】
得られた化合物は１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，重クロロホルム溶媒）にて１－（１０－ヒドロキシ－デカンチオ）－β－Ｄ－グルコーステトラアセテート連結クロリンｅ６トリメチルエステルのアセチル基由来のピークが消失していることを確認した。またＥＳＩ＋ＭＳ法による解析にて分子量が一致することを確認した。
【0122】
【化18】
【0123】
（３－４）１－（１０－ヒドロキシ－デカンチオ）－β－Ｄ－グルコース連結クロリンｅ６トリメチルエステルの評価
上記製造方法に基づいて得られた１－（１０－ヒドロキシ－デカンチオ）－β－Ｄ－グルコース連結クロリンｅ６トリメチルエステルについて、光毒性の評価方法および腫瘍成長抑制率の評価方法に基づいて評価を実施した。結果を表１、表２および表３に示す。また腫瘍成長抑制率の評価期間内において、全てのヌードマウスが体重減少することなく生存していることを確認し、薬剤投与およびレーザー照射によるヌードマウスへの悪影響は見られなかった。
上記製造方法に基づいて得られた１－（１０－ヒドロキシ－デカンチオ）－β－Ｄ－グルコース連結クロリンｅ６トリメチルエステルについて、光毒性の評価方法および腫瘍成長抑制率の評価方法に基づいて評価を実施した。結果を表１、表２および表３に示す。また腫瘍成長抑制率の評価期間内において、全てのヌードマウスが体重減少することなく生存していることを確認し、薬剤投与およびレーザー照射によるヌードマウスへの悪影響は見られなかった。
【0124】
［実施例４］
１－（３－ヒドロキシ－プロパンチオ）－β－Ｄ－ガラクト―ス連結クロリンｅ６トリメチルエステルの製造と評価
（４－１）１－チオ－β－Ｄ－ガラクトーステトラアセテートの合成
２，３，４，６－テトラ－Ｏ－アセチル－Ｄ－ガラクトピラノース（３４８ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５．０ｍｌ）に溶解し、テトラブロモメタン（６６３ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）とトリフェニルホスフィン（５２５ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）を入れて２５℃で４時間撹拌した。得られた反応溶液に対し、ジメチルホルムアミド（２．０ｍｌ）に溶解させた二硫化炭素（１１４ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）と硫化ナトリウム９水和物（４８０ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）の混合溶液を加え、２５℃で５分撹拌した。得られた反応溶液に水（３０ｍｌ）、ジクロロメタン（５０ｍｌ）を入れて分液操作を行い、ジクロロメタン層を分取した。得られたジクロロメタン層を水（３０ｍｌ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水させた。得られたジクロロメタン層を吸引ろ過し、溶媒を減圧留去した。得られた粗生成物を得られた粗生成物をシリカゲルカラム（ハイフラッシュカラム、山善株式会社製）に充填し、酢酸エチルとヘキサンの混合溶媒にて溶離した。溶離液を減圧濃縮することにより、１－チオ－β－Ｄ－ガラクトーステトラアセテートを得た（収量２９１ｍｇ、収率８０％）。
１－（３－ヒドロキシ－プロパンチオ）－β－Ｄ－ガラクト―ス連結クロリンｅ６トリメチルエステルの製造と評価
（４－１）１－チオ－β－Ｄ－ガラクトーステトラアセテートの合成
２，３，４，６－テトラ－Ｏ－アセチル－Ｄ－ガラクトピラノース（３４８ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５．０ｍｌ）に溶解し、テトラブロモメタン（６６３ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）とトリフェニルホスフィン（５２５ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）を入れて２５℃で４時間撹拌した。得られた反応溶液に対し、ジメチルホルムアミド（２．０ｍｌ）に溶解させた二硫化炭素（１１４ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）と硫化ナトリウム９水和物（４８０ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）の混合溶液を加え、２５℃で５分撹拌した。得られた反応溶液に水（３０ｍｌ）、ジクロロメタン（５０ｍｌ）を入れて分液操作を行い、ジクロロメタン層を分取した。得られたジクロロメタン層を水（３０ｍｌ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水させた。得られたジクロロメタン層を吸引ろ過し、溶媒を減圧留去した。得られた粗生成物を得られた粗生成物をシリカゲルカラム（ハイフラッシュカラム、山善株式会社製）に充填し、酢酸エチルとヘキサンの混合溶媒にて溶離した。溶離液を減圧濃縮することにより、１－チオ－β－Ｄ－ガラクトーステトラアセテートを得た（収量２９１ｍｇ、収率８０％）。
【0125】
構造同定はＢｅｉｌｓｔｅｉｎ Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１３，９，９７４－９８２に基づき、１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，重クロロホルム溶媒）にて行った。
【0126】
【化19】
【0127】
（４－２）１－（３－ヒドロキシ－プロパンチオ）－β－Ｄ－ガラクト―ス連結クロリンｅ６トリメチルエステルの合成と評価
１－チオ－β－Ｄ－グルコーステトラアセテートの代わりに（４－１）で合成した１－チオ－β－Ｄ－ガラクトーステトラアセテートを用いて、実施例１と同様の製造方法を実施し、１－（３－ヒドロキシ－プロパンチオ）－β－Ｄ－ガラクト―ス連結クロリンｅ６トリメチルエステルを得た。
１－チオ－β－Ｄ－グルコーステトラアセテートの代わりに（４－１）で合成した１－チオ－β－Ｄ－ガラクトーステトラアセテートを用いて、実施例１と同様の製造方法を実施し、１－（３－ヒドロキシ－プロパンチオ）－β－Ｄ－ガラクト―ス連結クロリンｅ６トリメチルエステルを得た。
【0128】
上記製造方法に基づいて得られた１－（３－ヒドロキシ－プロパンチオ）－β－Ｄ－ガラクト―ス連結クロリンｅ６トリメチルエステルについて、光毒性の評価方法および腫瘍成長抑制率の評価方法に基づいて評価を実施した。結果を表１、表２および表３に示す。また腫瘍成長抑制率の評価期間内において、全てのヌードマウスが体重減少することなく生存していることを確認し、薬剤投与およびレーザー照射によるヌードマウスへの悪影響は見られなかった。
【0129】
［実施例５］
１－（６－ヒドロキシ－ヘキサンチオ）－β－Ｄ－ガラクト―ス連結クロリンｅ６トリメチルエステルの製造と評価
１－チオ－β－Ｄ－グルコーステトラアセテートの代わりに（４－１）で合成した１－チオ－β－Ｄ－ガラクトーステトラアセテートを用いて、実施例２と同様の製造方法を実施し、１－（６－ヒドロキシ－ヘキサンチオ）－β－Ｄ－ガラクト―ス連結クロリンｅ６トリメチルエステルを得た。
１－（６－ヒドロキシ－ヘキサンチオ）－β－Ｄ－ガラクト―ス連結クロリンｅ６トリメチルエステルの製造と評価
１－チオ－β－Ｄ－グルコーステトラアセテートの代わりに（４－１）で合成した１－チオ－β－Ｄ－ガラクトーステトラアセテートを用いて、実施例２と同様の製造方法を実施し、１－（６－ヒドロキシ－ヘキサンチオ）－β－Ｄ－ガラクト―ス連結クロリンｅ６トリメチルエステルを得た。
【0130】
上記製造方法に基づいて得られた１－（６－ヒドロキシ－ヘキサンチオ）－β－Ｄ－ガラクト―ス連結クロリンｅ６トリメチルエステルについて、光毒性の評価方法および腫瘍成長抑制率の評価方法に基づいて評価を実施した。結果を表１、表２および表３に示す。また腫瘍成長抑制率の評価期間内において、全てのヌードマウスが体重減少することなく生存していることを確認し、薬剤投与およびレーザー照射によるヌードマウスへの悪影響は見られなかった。
【0131】
［実施例６］
１－（１０－ヒドロキシ－デカンチオ）－β－Ｄ－ガラクト―ス連結クロリンｅ６トリメチルエステルの製造と評価
１－チオ－β－Ｄ－グルコーステトラアセテートの代わりに（４－１）で合成した１－チオ－β－Ｄ－ガラクトーステトラアセテートを用いて、実施例３と同様の製造方法を実施し、１－（１０－ヒドロキシ－デカンチオ）－β－Ｄ－ガラクト―ス連結クロリンｅ６トリメチルエステルを得た。
１－（１０－ヒドロキシ－デカンチオ）－β－Ｄ－ガラクト―ス連結クロリンｅ６トリメチルエステルの製造と評価
１－チオ－β－Ｄ－グルコーステトラアセテートの代わりに（４－１）で合成した１－チオ－β－Ｄ－ガラクトーステトラアセテートを用いて、実施例３と同様の製造方法を実施し、１－（１０－ヒドロキシ－デカンチオ）－β－Ｄ－ガラクト―ス連結クロリンｅ６トリメチルエステルを得た。
【0132】
上記製造方法に基づいて得られた１－（１０－ヒドロキシ－デカンチオ）－β－Ｄ－ガラクト―ス連結クロリンｅ６トリメチルエステルについて、光毒性の評価方法および腫瘍成長抑制率の評価方法に基づいて評価を実施した。結果を表１、表２および表３に示す。また腫瘍成長抑制率の評価期間内において、全てのヌードマウスが体重減少することなく生存していることを確認し、薬剤投与およびレーザー照射によるヌードマウスへの悪影響は見られなかった。
【0133】
［実施例７］
１－（３－ヒドロキシ－プロパンチオ）－β－Ｄ－マンノ―ス連結クロリンｅ６トリメチルエステルの製造と評価
（７－１）１－チオ－β－Ｄ－マンノーステトラアセテートの合成
２，３，４，６－テトラ－Ｏ－アセチル－Ｄ－マンノピラノース（３４８ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５．０ｍｌ）に溶解し、テトラブロモメタン（６６３ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）とトリフェニルホスフィン（５２５ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）を入れて２５℃で４時間撹拌した。得られた反応溶液に対し、ジメチルホルムアミド（２．０ｍｌ）に溶解させた二硫化炭素（１１４ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）と硫化ナトリウム９水和物（４８０ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）の混合溶液を加え、２５℃で５分撹拌した。得られた反応溶液に水（３０ｍｌ）、ジクロロメタン（５０ｍｌ）を入れて分液操作を行い、ジクロロメタン層を分取した。得られたジクロロメタン層を水（３０ｍｌ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水させた。得られたジクロロメタン層を吸引ろ過し、溶媒を減圧留去した。得られた粗生成物を得られた粗生成物をシリカゲルカラム（ハイフラッシュカラム、山善株式会社製）に充填し、酢酸エチルとヘキサンの混合溶媒にて溶離した。溶離液を減圧濃縮することにより、１－チオ－β－Ｄ－マンノーステトラアセテートを得た（収量２５５ｍｇ、収率７０％）。
１－（３－ヒドロキシ－プロパンチオ）－β－Ｄ－マンノ―ス連結クロリンｅ６トリメチルエステルの製造と評価
（７－１）１－チオ－β－Ｄ－マンノーステトラアセテートの合成
２，３，４，６－テトラ－Ｏ－アセチル－Ｄ－マンノピラノース（３４８ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５．０ｍｌ）に溶解し、テトラブロモメタン（６６３ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）とトリフェニルホスフィン（５２５ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）を入れて２５℃で４時間撹拌した。得られた反応溶液に対し、ジメチルホルムアミド（２．０ｍｌ）に溶解させた二硫化炭素（１１４ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）と硫化ナトリウム９水和物（４８０ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）の混合溶液を加え、２５℃で５分撹拌した。得られた反応溶液に水（３０ｍｌ）、ジクロロメタン（５０ｍｌ）を入れて分液操作を行い、ジクロロメタン層を分取した。得られたジクロロメタン層を水（３０ｍｌ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水させた。得られたジクロロメタン層を吸引ろ過し、溶媒を減圧留去した。得られた粗生成物を得られた粗生成物をシリカゲルカラム（ハイフラッシュカラム、山善株式会社製）に充填し、酢酸エチルとヘキサンの混合溶媒にて溶離した。溶離液を減圧濃縮することにより、１－チオ－β－Ｄ－マンノーステトラアセテートを得た（収量２５５ｍｇ、収率７０％）。
【0134】
構造同定はＢｅｉｌｓｔｅｉｎ Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１３，９，９７４－９８２に基づき、１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、重クロロホルム溶媒）にて行った。
【0135】
【化20】
【0136】
（７－２）１－（３－ヒドロキシ－プロパンチオ）－β－Ｄ－マンノ―ス連結クロリンｅ６トリメチルエステルの合成と評価
１－チオ－β－Ｄ－グルコーステトラアセテートの代わりに（７－１）で合成した１－チオ－β－Ｄ－マンノ―ステトラアセテートを用いて、実施例１と同様の製造方法を実施し、１－（３－ヒドロキシ－プロパンチオ）－β－Ｄ－マンノ―ス連結クロリンｅ６トリメチルエステルを得た。
１－チオ－β－Ｄ－グルコーステトラアセテートの代わりに（７－１）で合成した１－チオ－β－Ｄ－マンノ―ステトラアセテートを用いて、実施例１と同様の製造方法を実施し、１－（３－ヒドロキシ－プロパンチオ）－β－Ｄ－マンノ―ス連結クロリンｅ６トリメチルエステルを得た。
【0137】
上記製造方法に基づいて得られた１－（３－ヒドロキシ－プロパンチオ）－β－Ｄ－マンノ―ス連結クロリンｅ６トリメチルエステルについて、光毒性の評価方法および腫瘍成長抑制率の評価方法に基づいて評価を実施した。結果を表１、表２および表３に示す。また腫瘍成長抑制率の評価期間内において、全てのヌードマウスが体重減少することなく生存していることを確認し、薬剤投与およびレーザー照射によるヌードマウスへの悪影響は見られなかった。
【0138】
［実施例８］
１－（６－ヒドロキシ－ヘキサンチオ）－β－Ｄ－マンノース連結クロリンｅ６トリメチルエステルの製造と評価
１－チオ－β－Ｄ－グルコーステトラアセテートの代わりに（４－１）で合成した１－チオ－β－Ｄ－マンノ―ステトラアセテートを用いて、実施例２と同様の製造方法を実施し、１－（６－ヒドロキシ－ヘキサンチオ）－β－Ｄ－マンノ―ス連結クロリンｅ６トリメチルエステルを得た。
１－（６－ヒドロキシ－ヘキサンチオ）－β－Ｄ－マンノース連結クロリンｅ６トリメチルエステルの製造と評価
１－チオ－β－Ｄ－グルコーステトラアセテートの代わりに（４－１）で合成した１－チオ－β－Ｄ－マンノ―ステトラアセテートを用いて、実施例２と同様の製造方法を実施し、１－（６－ヒドロキシ－ヘキサンチオ）－β－Ｄ－マンノ―ス連結クロリンｅ６トリメチルエステルを得た。
【0139】
上記製造方法に基づいて得られた１－（６－ヒドロキシ－ヘキサンチオ）－β－Ｄ－マンノ―ス連結クロリンｅ６トリメチルエステルについて、光毒性の評価方法および腫瘍成長抑制率の評価方法に基づいて評価を実施した。結果を表１、表２および表３に示す。また腫瘍成長抑制率の評価期間内において、全てのヌードマウスが体重減少することなく生存していることを確認し、薬剤投与およびレーザー照射によるヌードマウスへの悪影響は見られなかった。
【0140】
［実施例９］
１－（１０－ヒドロキシ－デカンチオ）－β－Ｄ－マンノース連結クロリンｅ６トリメチルエステルの製造と評価
１－チオ－β－Ｄ－グルコーステトラアセテートの代わりに（４－１）で合成した１－チオ－β－Ｄ－マンノ―ステトラアセテートを用いて、実施例３と同様の製造方法を実施し、１－（１０－ヒドロキシ－デカンチオ）－β－Ｄ－マンノ―ス連結クロリンｅ６トリメチルエステルを得た。
１－（１０－ヒドロキシ－デカンチオ）－β－Ｄ－マンノース連結クロリンｅ６トリメチルエステルの製造と評価
１－チオ－β－Ｄ－グルコーステトラアセテートの代わりに（４－１）で合成した１－チオ－β－Ｄ－マンノ―ステトラアセテートを用いて、実施例３と同様の製造方法を実施し、１－（１０－ヒドロキシ－デカンチオ）－β－Ｄ－マンノ―ス連結クロリンｅ６トリメチルエステルを得た。
【0141】
上記製造方法に基づいて得られた１－（１０－ヒドロキシ－デカンチオ）－β－Ｄ－マンノ―ス連結クロリンｅ６トリメチルエステルについて、光毒性の評価方法および腫瘍成長抑制率の評価方法に基づいて評価を実施した。結果を表１、表２および表３に示す。また腫瘍成長抑制率の評価期間内において、全てのヌードマウスが体重減少することなく生存していることを確認し、薬剤投与およびレーザー照射によるヌードマウスへの悪影響は見られなかった。
【0142】
［比較例１］
タラポルフィンナトリウムの評価
市販品のタラポルフィンナトリウム（モノ－Ｌ－アスパルチルクロリンｅ６、Ｍｅｄｋｏｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて、前記光毒性の評価方法および腫瘍成長抑制率の評価方法に基づいて評価を実施した。結果を表１、表２および表３に示す。また腫瘍成長抑制率の評価期間内において、全てのヌードマウスが体重減少することなく生存していることを確認し、薬剤投与およびレーザー照射によるヌードマウスへの悪影響は見られなかった。
タラポルフィンナトリウムの評価
市販品のタラポルフィンナトリウム（モノ－Ｌ－アスパルチルクロリンｅ６、Ｍｅｄｋｏｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて、前記光毒性の評価方法および腫瘍成長抑制率の評価方法に基づいて評価を実施した。結果を表１、表２および表３に示す。また腫瘍成長抑制率の評価期間内において、全てのヌードマウスが体重減少することなく生存していることを確認し、薬剤投与およびレーザー照射によるヌードマウスへの悪影響は見られなかった。
【0143】
［光毒性の評価結果］
光毒性の評価結果を以下の表１および表２に示した。なお、表中、「ＩＣ５０」とあるのは、「ＩＣ５０」を表す。
光毒性の評価結果を以下の表１および表２に示した。なお、表中、「ＩＣ５０」とあるのは、「ＩＣ５０」を表す。
【0144】
【表1】
【0145】
【表2】
【0146】
［腫瘍成長抑制率の評価結果］
【0147】
【表3】
【0148】
表１および表２より、１－（３－ヒドロキシ－プロパンチオ）－β－Ｄ－グルコース連結クロリンｅ６トリメチルエステル（実施例１）、１－（６－ヒドロキシ－ヘキサンチオ）－β－Ｄ－グルコース連結クロリンｅ６トリメチルエステル（実施例２）、１－（１０－ヒドロキシ－デカンチオ）－β－Ｄ－グルコース連結クロリンｅ６トリメチルエステル（実施例３）、１－（３－ヒドロキシ－プロパンチオ）－β－Ｄ－ガラクトース連結クロリンｅ６トリメチルエステル（実施例４）、１－（６－ヒドロキシ－ヘキサンチオ）－β－Ｄ－ガラクトース連結クロリンｅ６トリメチルエステル（実施例５）、１－（１０－ヒドロキシ－デカンチオ）－β－Ｄ－ガラクトース連結クロリンｅ６トリメチルエステル（実施例６）、１－（３－ヒドロキシ－プロパンチオ）－β－Ｄ－マンノース連結クロリンｅ６トリメチルエステル（実施例７）、１－（６－ヒドロキシ－ヘキサンチオ）－β－Ｄ－マンノース連結クロリンｅ６トリメチルエステル（実施例８）および１－（１０－ヒドロキシ－デカンチオ）－β－Ｄ－マンノース連結クロリンｅ６トリメチルエステル（実施例９）のＩＣ５０は、いずれもタラポルフィンナトリウム（比較例１）のＩＣ５０よりも小さいことが分かった。
【0149】
表３より、１－（３－ヒドロキシ－プロパンチオ）－β－Ｄ－グルコース連結クロリンｅ６トリメチルエステル（実施例１）、１－（６－ヒドロキシ－ヘキサンチオ）－β－Ｄ－グルコース連結クロリンｅ６トリメチルエステル（実施例２）、１－（１０－ヒドロキシ－デカンチオ）－β－Ｄ－グルコース連結クロリンｅ６トリメチルエステル（実施例３）、１－（３－ヒドロキシ－プロパンチオ）－β－Ｄ－ガラクトース連結クロリンｅ６トリメチルエステル（実施例４）、１－（６－ヒドロキシ－ヘキサンチオ）－β－Ｄ－ガラクトース連結クロリンｅ６トリメチルエステル（実施例５）、１－（１０－ヒドロキシ－デカンチオ）－β－Ｄ－ガラクトース連結クロリンｅ６トリメチルエステル（実施例６）、１－（３－ヒドロキシ－プロパンチオ）－β－Ｄ－マンノース連結クロリンｅ６トリメチルエステル（実施例７）、１－（６－ヒドロキシ－ヘキサンチオ）－β－Ｄ－マンノース連結クロリンｅ６トリメチルエステル（実施例８）および１－（１０－ヒドロキシ－デカンチオ）－β－Ｄ－マンノース連結クロリンｅ６トリメチルエステル（実施例９）の腫瘍成長抑制率は、いずれもタラポルフィンナトリウム（比較例１）の腫瘍成長抑制率よりも大きいことが分かった。
【0150】
以上の実施例と比較例より、１－（３－ヒドロキシ－プロパンチオ）－β－Ｄ－グルコース連結クロリンｅ６トリメチルエステル、１－（６－ヒドロキシ－ヘキサンチオ）－β－Ｄ－グルコース連結クロリンｅ６トリメチルエステル、１－（１０－ヒドロキシ－デカンチオ）－β－Ｄ－グルコース連結クロリンｅ６トリメチルエステル、１－（３－ヒドロキシ－プロパンチオ）－β－Ｄ－ガラクトース連結クロリンｅ６トリメチルエステル、１－（６－ヒドロキシ－ヘキサンチオ）－β－Ｄ－ガラクトース連結クロリンｅ６トリメチルエステル、１－（１０－ヒドロキシ－デカンチオ）－β－Ｄ－ガラクトース連結クロリンｅ６トリメチルエステル、１－（３－ヒドロキシ－プロパンチオ）－β－Ｄ－マンノース連結クロリンｅ６トリメチルエステル、１－（６－ヒドロキシ－ヘキサンチオ）－β－Ｄ－マンノース連結クロリンｅ６トリメチルエステルおよび１－（１０－ヒドロキシ－デカンチオ）－β－Ｄ－マンノース連結クロリンｅ６トリメチルエステルは、タラポルフィンナトリウムに比較して優れた光毒性と優れた腫瘍成長抑制効果を有する。
【0151】
［使用細胞株を変更した光毒性の評価］
食道癌細胞株：ＫＹＳＥ３０（Ｎｏ．１１Ｄ０２８； ＥＣＡＣＣ）、ＯＥ２１（Ｎｏ．１１Ｄ０２８；ＥＣＡＣＣ）、胃癌細胞株：ＭＫＮ４５（Ｎｏ．０２５４；Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂａｎｋ）、および、大腸癌細胞株：ＨＴ２９（Ｎｏ．ＨＴＢ－３８；ＡＴＣＣ）を使用し、以下の条件で培養した。
食道癌細胞株：ＫＹＳＥ３０（Ｎｏ．１１Ｄ０２８； ＥＣＡＣＣ）、ＯＥ２１（Ｎｏ．１１Ｄ０２８；ＥＣＡＣＣ）、胃癌細胞株：ＭＫＮ４５（Ｎｏ．０２５４；Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂａｎｋ）、および、大腸癌細胞株：ＨＴ２９（Ｎｏ．ＨＴＢ－３８；ＡＴＣＣ）を使用し、以下の条件で培養した。
【0152】
ＫＹＳＥ３０：ＲＰＭＩ １６４０
ＯＥ２１：ＲＰＭＩ １６４０とＨａｍ′ｓ Ｆ１２の半量ずつの混合液
ＭＫＮ４５： ＲＰＭＩ １６４０
ＨＴ２９： ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ
全ての培養液は１０％牛胎児血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンとストレプトマイシン、０．２５ｍｇ／ｍｌのアンホテリシンＢを含有し、５％ＣＯ２濃度、３７℃の条件下で培養した。
ＯＥ２１：ＲＰＭＩ １６４０とＨａｍ′ｓ Ｆ１２の半量ずつの混合液
ＭＫＮ４５： ＲＰＭＩ １６４０
ＨＴ２９： ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ
全ての培養液は１０％牛胎児血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンとストレプトマイシン、０．２５ｍｇ／ｍｌのアンホテリシンＢを含有し、５％ＣＯ２濃度、３７℃の条件下で培養した。
【0153】
上記細胞を使用し、既に説明した「光毒性の評価方法」と同様の方法で、実施例１の１－（３－ヒドロキシ－プロパンチオ）－β－Ｄ－グルコース連結クロリンｅ６トリメチルエステル（表３中「実施例１」と記載した。）、および、ＴＳ（比較例）について、ＩＣ５０（５０％癌細胞殺細胞濃度）を求め、「光毒性の評価方法」と同様の基準で評価した。結果を表４に示した。
【0154】
【表4】
【0155】
表４に示した結果から、実施例１の化合物は、優れた光毒性を有しており、本発明の効果を有していることがわかった。
一方、比較例のＴＳは、癌細胞株の種類によらず、本発明の効果を有していなかった。
一方、比較例のＴＳは、癌細胞株の種類によらず、本発明の効果を有していなかった。
【0156】
［癌細胞株への取り込み性能の評価］
細胞株として、ヒト胃癌細胞株：ＭＫＮ４５（Ｎｏ．０２５４；Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂａｎｋ）、および、大腸癌細胞株：ＨＴ２９（Ｎｏ．ＨＴＢ－３８；ＡＴＣＣ）を使用した。
細胞株として、ヒト胃癌細胞株：ＭＫＮ４５（Ｎｏ．０２５４；Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂａｎｋ）、および、大腸癌細胞株：ＨＴ２９（Ｎｏ．ＨＴＢ－３８；ＡＴＣＣ）を使用した。
【0157】
細胞培養の条件、および、使用機器は以下のとおりである。
【0158】
培養条件：
培養液としてＭＫＮ４５についてはＲＰＭＩ １６４０を使用し、ＨＴ２９についてはＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａを使用した。全ての培養液は１０％牛胎児血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンとストレプトマイシン、０．２５ｍｇ／ｍｌのアンホテリシンＢを含有し、５％ＣＯ２濃度、３７℃の条件下で培養した。
培養液としてＭＫＮ４５についてはＲＰＭＩ １６４０を使用し、ＨＴ２９についてはＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａを使用した。全ての培養液は１０％牛胎児血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンとストレプトマイシン、０．２５ｍｇ／ｍｌのアンホテリシンＢを含有し、５％ＣＯ２濃度、３７℃の条件下で培養した。
【0159】
使用実験機器：
Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙには、ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｉｃｅｎｃｅｓ）を使用した。
Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙには、ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｉｃｅｎｃｅｓ）を使用した。
【0160】
（試験方法）
６ｃｍ培養プレートを用いて、２×１０５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの上記癌細胞株を、それぞれ上記条件で２８時間培養した。
次に、培養液を除去し、（１）培養液のみ（コントロール）、（２）５μＭの実施例１のグリコシル化クロリンｅ６誘導体を含有した培養液、（３）５μＭのＴａｌａｐｏｒｆｉｎ Ｓｏｄｉｕｍ （ＴＳ； レザフィリン（登録商標）、Ｍｅｉｊｉ Ｓｅｉｋａファルマ）を含有した培養液に置換しさらに４時間培養した。
４時間の培養後、培養液を除去しｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）で３回洗浄し、ＴｒｙｐＬＥ－Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して培養プレートより細胞を回収した。
次に、上記ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩを用いて、４０５ｎｍで励起して、６８０ｎｍの蛍光発光を測定した。各サンプルで少なくとも１０，０００イベントは測定を行った。測定は、ＴＳ、および、実施例１の化合物の蛍光波長帯である６５０ｎｍ近傍を評価するＭｅａｎ Ａｍｃｙａｎ ａｒｅａ（ＭＡＡ）を測定し、結果を表５に示した。
６ｃｍ培養プレートを用いて、２×１０５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの上記癌細胞株を、それぞれ上記条件で２８時間培養した。
次に、培養液を除去し、（１）培養液のみ（コントロール）、（２）５μＭの実施例１のグリコシル化クロリンｅ６誘導体を含有した培養液、（３）５μＭのＴａｌａｐｏｒｆｉｎ Ｓｏｄｉｕｍ （ＴＳ； レザフィリン（登録商標）、Ｍｅｉｊｉ Ｓｅｉｋａファルマ）を含有した培養液に置換しさらに４時間培養した。
４時間の培養後、培養液を除去しｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）で３回洗浄し、ＴｒｙｐＬＥ－Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して培養プレートより細胞を回収した。
次に、上記ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩを用いて、４０５ｎｍで励起して、６８０ｎｍの蛍光発光を測定した。各サンプルで少なくとも１０，０００イベントは測定を行った。測定は、ＴＳ、および、実施例１の化合物の蛍光波長帯である６５０ｎｍ近傍を評価するＭｅａｎ Ａｍｃｙａｎ ａｒｅａ（ＭＡＡ）を測定し、結果を表５に示した。
【0161】
【表5】
【0162】
表５に示したとおり、細胞株としてＭＫＮ４５を用いた場合、ＴＳ（比較例）のＭＡＡは２３５、実施例１の化合物のＭＡＡは１７０５１であり、実施例１の化合物のＭＡＡは、ＴＳのＭＡＡの約７０倍高い値だった。
また、細胞株として、ＨＴ２９を用いた場合、ＴＳ（比較例）のＭＡＡは９７、実施例１の化合物のＭＡＡは１８６６９であり、実施例１の化合物のＭＡＡは、ＴＳの約１９０倍高い値だった。
また、細胞株として、ＨＴ２９を用いた場合、ＴＳ（比較例）のＭＡＡは９７、実施例１の化合物のＭＡＡは１８６６９であり、実施例１の化合物のＭＡＡは、ＴＳの約１９０倍高い値だった。
【0163】
上記から、実施例１の化合物は臨床応用されているＴＳ（比較例）と比較しｉｎ ｖｉｔｒｏでは約７０～１９０倍高い細胞内への取り込み性能を有していることがわかった。このことから、本クロリン誘導体等を用いると、強い腫瘍蛍光が得られることから、光線力学的診断（Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ； ＰＤＤ）に適用した場合、より優れた感度が得られることが推測される。また、本クロリン誘導体等は、ＴＳと比較して、癌細胞株へのより優れた取り込み性能を有しており、このことから、本クロリン誘導体等が、ＴＳよりも優れたＰＤＴによる殺細胞効果を有していることがわかった。
【0164】
［食道癌細胞株および不死化食道正常上皮細胞株を用いた細胞内取り込み性能評価］
食道癌細胞株：ＯＥ２１（Ｎｏ．１１Ｄ０２８；ＥＣＡＣＣ）および不死化食道上皮細胞株：Ｈｅｔ－１Ａ（Ｎｏ． ３５２７８３６；ＡＴＣＣ）を使用し、細胞内取り込み性能を評価した。
食道癌細胞株：ＯＥ２１（Ｎｏ．１１Ｄ０２８；ＥＣＡＣＣ）および不死化食道上皮細胞株：Ｈｅｔ－１Ａ（Ｎｏ． ３５２７８３６；ＡＴＣＣ）を使用し、細胞内取り込み性能を評価した。
【0165】
細胞培養の条件は以下のとおりである。
ＯＥ２１：ＲＰＭＩ １６４０とＨａｍ′ｓ Ｆ１２の半量ずつの混合液
Ｈｅｔ－１Ａ：ＢＥＧＭ Ｂｕｌｌｅｔ ｋｉｔを培養液として使用した
全ての培養液は１０％牛胎児血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンとストレプトマイシン、２５ｍｇ／ｍｌのアンホテリシンＢを含有し、５％ＣＯ２濃度、３７℃の条件下で培養した。
ＯＥ２１：ＲＰＭＩ １６４０とＨａｍ′ｓ Ｆ１２の半量ずつの混合液
Ｈｅｔ－１Ａ：ＢＥＧＭ Ｂｕｌｌｅｔ ｋｉｔを培養液として使用した
全ての培養液は１０％牛胎児血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンとストレプトマイシン、２５ｍｇ／ｍｌのアンホテリシンＢを含有し、５％ＣＯ２濃度、３７℃の条件下で培養した。
【0166】
（試験方法）
９６穴プレートを用いて５×１０３ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの細胞を２４時間培養した。その後、１μＭのＴａｌａｐｏｒｆｉｎ Ｓｏｄｉｕｍ（ＴＳ；レザフィリン（登録商標）、Ｍｅｉｊｉ Ｓｅｉｋａファルマ）を含有した培養液、および、１μＭの実施例１の化合物を含有した培養液でそれぞれ置換し、４時間培養した。次に、培養液を吸引除去後、ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）で細胞を洗浄し、各ｗｅｌｌ １００μｌのＰＢＳを入れ、スペクトロメーター（Ｇｅｍｉｎｉ ＥＭ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を使用し、波長４０５ｎｍの光で励起し、細胞からの波長６５０ｎｍの蛍光発光の強度を測定した。各検体の蛍光強度はブランクで除した値とした。得られた結果はＳｏｆｔＭＡＸ ｐｒｏ ｓｏｆｔｗａｒｅで解析した。８回の独立した実験から結果を解析した。結果を図３に示した。なお、図３のグラフの縦軸が蛍光発光強度を示し、これが大きいほど細胞内に化合物が取り込まれていることを表している。
９６穴プレートを用いて５×１０３ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの細胞を２４時間培養した。その後、１μＭのＴａｌａｐｏｒｆｉｎ Ｓｏｄｉｕｍ（ＴＳ；レザフィリン（登録商標）、Ｍｅｉｊｉ Ｓｅｉｋａファルマ）を含有した培養液、および、１μＭの実施例１の化合物を含有した培養液でそれぞれ置換し、４時間培養した。次に、培養液を吸引除去後、ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）で細胞を洗浄し、各ｗｅｌｌ １００μｌのＰＢＳを入れ、スペクトロメーター（Ｇｅｍｉｎｉ ＥＭ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を使用し、波長４０５ｎｍの光で励起し、細胞からの波長６５０ｎｍの蛍光発光の強度を測定した。各検体の蛍光強度はブランクで除した値とした。得られた結果はＳｏｆｔＭＡＸ ｐｒｏ ｓｏｆｔｗａｒｅで解析した。８回の独立した実験から結果を解析した。結果を図３に示した。なお、図３のグラフの縦軸が蛍光発光強度を示し、これが大きいほど細胞内に化合物が取り込まれていることを表している。
【0167】
図３のグラフに示した結果から、正常食道上皮であるＨｅｔ－１ＡではＴＳ（比較例）、実施例１の化合物の細胞内取り込み性能には差は見られなかった。一方、食道癌細胞株であるＯＥ２１においてはＴＳ（比較例）と比較して、実施例１の化合物の細胞内取り込み性能が有意に亢進していた（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定 Ｐ＝０．０００２）。
【0168】
［光線力学的療法における抗腫瘍効果の評価］
細胞株として、マウス大腸癌細胞株：ＣＴ２６（Ｎｏ．ＣＲＬ－２６３８；ＡＴＣＣ）を使用した。細胞培養の条件、使用した動物、および、マウス皮下腫瘍モデルの作製方法は以下のとおりである。
細胞株として、マウス大腸癌細胞株：ＣＴ２６（Ｎｏ．ＣＲＬ－２６３８；ＡＴＣＣ）を使用した。細胞培養の条件、使用した動物、および、マウス皮下腫瘍モデルの作製方法は以下のとおりである。
【0169】
培養条件：
ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）に１０％牛胎児血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンとストレプトマイシン、０．２５ｍｇ／ｍｌのアンホテリシンＢを含有し、５％ＣＯ２濃度、３７℃の条件下で培養した。
ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）に１０％牛胎児血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンとストレプトマイシン、０．２５ｍｇ／ｍｌのアンホテリシンＢを含有し、５％ＣＯ２濃度、３７℃の条件下で培養した。
【0170】
使用動物：
マウスは８～１０週齢、雌、約２０ｇ体重マウス（ＢＡＬＢ／ｃ ＣｒＳｌｃ）を使用した。マウスは２週間飼育し環境に順応させた。
マウスは８～１０週齢、雌、約２０ｇ体重マウス（ＢＡＬＢ／ｃ ＣｒＳｌｃ）を使用した。マウスは２週間飼育し環境に順応させた。
【0171】
マウス皮下腫瘍モデルの作製：
マウス右大腿根部背側を中心として約１０ｍｍ程度の円形に除毛し、皮下に２７Ｇ針を使用して１×１０６個のＣＴ２６を接種した。接種７日後、腫瘍サイズが平均１００ｍｍ３（長径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）×短径（ｍｍ））の皮下腫瘍モデルが作製された。
マウス右大腿根部背側を中心として約１０ｍｍ程度の円形に除毛し、皮下に２７Ｇ針を使用して１×１０６個のＣＴ２６を接種した。接種７日後、腫瘍サイズが平均１００ｍｍ３（長径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）×短径（ｍｍ））の皮下腫瘍モデルが作製された。
【0172】
（試験方法）
作製されたマウス皮下腫瘍モデルを３群(未治療コントロール群、実施例１の化合物による治療群、Ｔａｌａｐｏｒｆｉｎ Ｓｏｄｉｕｍ（ＴＳ（比較例）；レザフィリン（登録商標）、Ｍｅｉｊｉ Ｓｅｉｋａファルマ）治療群)に平均腫瘍サイズが均等になるように１０匹ずつ割り付けた。マウス尾静脈より１．５６μｍｏｌ／Ｋｇの濃度の実施例１の化合物またはＴＳを経静脈投与し、３０分後に６６４ｎｍの赤色半導体レーザー（ＫＯＹＯ－ＰＤＬ６６４、ＯＫファイバーテクノロジー）を使用し、計１００Ｊ／ｃｍ２（１５０ｍＷ／ｃｍ２）の単回照射を施行した。治療後の腫瘍サイズは３日毎に電子ノギスを使用し計測した。計測結果はｗｅｌｃｈのｔ検定を用いて２群間を比較した。結果を図４のグラフに示した。
作製されたマウス皮下腫瘍モデルを３群(未治療コントロール群、実施例１の化合物による治療群、Ｔａｌａｐｏｒｆｉｎ Ｓｏｄｉｕｍ（ＴＳ（比較例）；レザフィリン（登録商標）、Ｍｅｉｊｉ Ｓｅｉｋａファルマ）治療群)に平均腫瘍サイズが均等になるように１０匹ずつ割り付けた。マウス尾静脈より１．５６μｍｏｌ／Ｋｇの濃度の実施例１の化合物またはＴＳを経静脈投与し、３０分後に６６４ｎｍの赤色半導体レーザー（ＫＯＹＯ－ＰＤＬ６６４、ＯＫファイバーテクノロジー）を使用し、計１００Ｊ／ｃｍ２（１５０ｍＷ／ｃｍ２）の単回照射を施行した。治療後の腫瘍サイズは３日毎に電子ノギスを使用し計測した。計測結果はｗｅｌｃｈのｔ検定を用いて２群間を比較した。結果を図４のグラフに示した。
【0173】
図４のグラフに示したとおり、実施例１の化合物を投与した群はコントロールと比較し有意に腫瘍抑制を示しつつ、かつ、マウスの死亡率は０％であった（ｎ＝１０）。さらに、腫瘍完全消失率は１０例中４例で４０％であった。一方、ＴＳを投与した群では治療後数日で全例が死亡した。
上記の結果から、実施例１の化合物を用いた場合、投与後３０分後に光線を照射しても、マウスの死亡率は０％であり、かつ、高い抗腫瘍効果を示した。これは、実施例１の化合物が、体外へより移出されやすく、投与後の早期に光線照射しても、安全性がより高いことを示している。一方、ＴＳは、投与３０分後に光線を照射すると、マウスが全例死亡してしまうことから、投与後の早期に光線照射した場合に、安全性が劣ることが示された。
上記の結果から、実施例１の化合物を用いた場合、投与後３０分後に光線を照射しても、マウスの死亡率は０％であり、かつ、高い抗腫瘍効果を示した。これは、実施例１の化合物が、体外へより移出されやすく、投与後の早期に光線照射しても、安全性がより高いことを示している。一方、ＴＳは、投与３０分後に光線を照射すると、マウスが全例死亡してしまうことから、投与後の早期に光線照射した場合に、安全性が劣ることが示された。
【0174】
［マウスを用いた単回静脈内投与毒性試験］
実施例１の化合物をマウス（Ｃｒｌ：ＣＤ１（ＩＣＲ）、雌雄各５匹／用量群）に、６０、１２５、および、２５０ｍｇ／ｋｇの用量で単回静脈内投与し、現れる毒性変化を確認した。
照明条件による毒性発現の差を確認するため、本試験では通常照明下（明条件下）と暗条件下の２飼育条件を設定した。投与液量は１０ｍｌ／ｋｇとした。投与液媒体として１０％Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ＋５％エタノール含有局方生理食塩液を用いた。
実施例１の化合物をマウス（Ｃｒｌ：ＣＤ１（ＩＣＲ）、雌雄各５匹／用量群）に、６０、１２５、および、２５０ｍｇ／ｋｇの用量で単回静脈内投与し、現れる毒性変化を確認した。
照明条件による毒性発現の差を確認するため、本試験では通常照明下（明条件下）と暗条件下の２飼育条件を設定した。投与液量は１０ｍｌ／ｋｇとした。投与液媒体として１０％Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ＋５％エタノール含有局方生理食塩液を用いた。
【0175】
投与の結果：明条件飼育の２５０ｍｇ／ｋｇ群において、雄３例、雌１例が第２日、雌１例が第３日に死亡した。また、暗条件飼育の２５０ｍｇ／ｋｇ群においても、雄２例が第２日と第５日に、雌３例が第２～４日に死亡した。これらの動物の一部では、自発運動の低下、呼吸緩徐、および、体温低下が認められた。死亡の発現状況に明暗条件間の差は認められなかった。
【0176】
生存例における一般状態観察：明条件飼育の２５０ｍｇ／ｋｇ群の雄２例、雌３例において、第２日以降に尾の腫脹、第９日から耳介の変色が認められた。尾の腫脹は第１２日には消失し、回復したが、耳介の変色については、解剖時まで回復せず、雄２例では耳介の一部が欠損となった。暗条件飼育の２５０ｍｇ／ｋｇ群の雄１例においても、第１４日より耳介の変色が認められたが、耳介先端部における限局的なものであり、症状は明条件飼育において顕著に発現した。
【0177】
体重測定：明条件および暗条件飼育ともに１２５および２５０ｍｇ／ｋｇ群で第４日または第８日に体重減少が認められた。いずれも一時的なものであり、回復する傾向が認められた。体重変動に明暗条件間の差は認められなかった。
【0178】
剖検結果：２５０ｍｇ／ｋｇ群に一般症状として認められた耳介の変色、欠損、および、尾の痂皮が認められたのみであった。
【0179】
上記の結果から、実施例１の化合物の単回静脈内投与における最小致死量は、本試験条件下では明飼育条件、暗飼育条件のいずれにおいても雌雄共に２５０ｍｇ／ｋｇであると結論した。また、明条件飼育下では、２５０ｍｇ／ｋｇ群投与で尾の腫脹および耳介の変色が認められ、照明条件による差が認められた。
上記の結果から、実施例１の化合物は、安全性が認められる用量で十分な本発明の効果が得られることが推測された。
上記の結果から、実施例１の化合物は、安全性が認められる用量で十分な本発明の効果が得られることが推測された。
【0180】
［実施例１の化合物の薬物動態試験］
１４Ｃ標識された実施例１の化合物を、ラットに静脈内投与し、以下の結果を得た（ｄｏｓｅ：５ｍｇ／ｋｇ）。
最初の測定時間である投与後５分に血漿中放射能濃度２３．３０μｇ ｅｑ． ｏｆ Ｓ実施例１化合物／ｍｌを示した後、急速に減少した。投与後６～８時間において、血漿中放射能濃度の再上昇が認められた後、消失半減期（ｔ１／２）４２．６５ｈで消失した。投与直後の血漿中放射能濃度（Ｃ０）は５１．５２μｇ ｅｑ．／ｍｌ、ＡＵＣ０－ｌａｓｔは３０．４２μｇ ｅｑ ｈ／ｍｌ、ＡＵＣ０－∞は３１．８９μｇ ｅｑ．・ｈ／ｍｌであった。実施例１の化合物とＴＳの結果を表６に示した。
１４Ｃ標識された実施例１の化合物を、ラットに静脈内投与し、以下の結果を得た（ｄｏｓｅ：５ｍｇ／ｋｇ）。
最初の測定時間である投与後５分に血漿中放射能濃度２３．３０μｇ ｅｑ． ｏｆ Ｓ実施例１化合物／ｍｌを示した後、急速に減少した。投与後６～８時間において、血漿中放射能濃度の再上昇が認められた後、消失半減期（ｔ１／２）４２．６５ｈで消失した。投与直後の血漿中放射能濃度（Ｃ０）は５１．５２μｇ ｅｑ．／ｍｌ、ＡＵＣ０－ｌａｓｔは３０．４２μｇ ｅｑ ｈ／ｍｌ、ＡＵＣ０－∞は３１．８９μｇ ｅｑ．・ｈ／ｍｌであった。実施例１の化合物とＴＳの結果を表６に示した。
【0181】
【表6】
【0182】
表６に示した結果から、実施例１の化合物は、ＴＳと比較して、血漿中から消失しやすい（消失が早い）ものと推測される。
【0183】
投与後４時間までの胆汁中に投与放射能の８８．９％、４８時間までに９４．９％が排泄された。投与後４８時間までの尿及び糞中に、それぞれ投与放射能の４．４％及び０．８％が排泄された。投与後４８時間における体内残存率は０．８％であり、総回収率は１００．９％であった。以上の結果より，実施例１の化合物の主排泄経路は胆汁を介した糞排泄であることが示唆された。結果を表７に示した。
【0184】
【表7】
【0185】
表７に示した結果から、実施例１の化合物はＴＳと比較して、０－２４時間、及び、４８時間後の排出量がいずれもＴＳを上回っており、より排出されやすいものと推測される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
