特許 7004665 癌治療用の前酵素の組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-01-06

(45)【発行日】2022-02-04

(54)【発明の名称】癌治療用の前酵素の組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/48 20060101AFI20220128BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220128BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220128BHJP

【ＦＩ】

A61K38/48 100

A61P35/00

A61P43/00 121

【請求項の数】 8

(21)【出願番号】P 2018553345

(86)(22)【出願日】2017-04-12

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2019-04-25

(86)【国際出願番号】 AU2017050323

(87)【国際公開番号】W WO2017177270

(87)【国際公開日】2017-10-19

【審査請求日】2020-03-26

(31)【優先権主張番号】62/321,370

(32)【優先日】2016-04-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】512104834

【氏名又は名称】プロパンク・ピーティーワイ・リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】ジュリアン・ケンヨン

(72)【発明者】

【氏名】ラルフ・ブラント

【審査官】伊藤 基章

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１３－５０８３０７（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３８／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

キモトリプシノーゲンおよびトリプシノーゲンを含む、対象における癌を治療するための組成物であって、キモトリプシノーゲン：トリプシノーゲンの重量比は、１：１超であるが、４：１未満であり、アミラーゼを含有しない、組成物。

【請求項2】

前記重量比が、１：１超であるが、２：１以下である、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記重量比が、２：１である、請求項１または２に記載の組成物。

【請求項4】

前記重量比が、３：１である、請求項１に記載の組成物。

【請求項5】

前記癌が、膵臓癌、食道癌、結腸癌、腸癌、前立腺癌、卵巣癌、胃癌、乳癌、肝臓癌、悪性黒色腫または肺癌のいずれか１つである、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項6】

前記癌が、卵巣癌、黒色腫、脳腫瘍、前立腺癌、結腸直腸癌、肝臓癌または肺癌である、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項7】

前記癌が、膵臓癌、結腸癌または卵巣癌、好ましくは膵臓癌である、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項8】

対象における線維肉腫を治療するための、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、癌を治療するための組成物、方法、使用およびキットに関する。

【0002】

出願の相互参照
本出願は、全内容が全体として本明細書に組み込まれる米国特許出願第６２／３２１，３７０号明細書からの優先権を主張する。

【背景技術】

【0003】

近年、癌の治療におけるプロテアーゼの使用が示唆されてきた。最初に、新鮮膵臓酵素抽出物が考えられる癌療法として企図され、いくつかの良好な実験がＪｅｒｓｅｎマウス肉腫モデルを用いて実施された。マウスにプロテアーゼ酵素トリプシンを注射した後、腫瘍の退縮が観察された。得られた結果は非常に興味が注がれるものであり、ヒト癌患者を治療して腫瘍進行を低減させ、生存時間を延長させるためにヒツジ膵臓から調製された粗製酵素抽出物が使用された。

【0004】

前酵素（酵素の不活性前駆体形態）の使用は、酵素の経口投与が直面する課題の克服を試みるために使用され、結果は様々であった。セリンプロテアーゼ阻害物質トリプシンの前酵素形態であるトリプシノーゲンを含む前酵素混合物は癌腫の治療において有用であることが示されており、腫瘍細胞の表面において選択的に活性化されると考えられている。トリプシンの作用機序は、腫瘍細胞のタンパク質分解として生じると考えられている。キモトリプシノーゲンおよびトリプシノーゲンを含む組成物は、癌、例として、膵臓癌および結腸癌についてのアッセイにおいて有効であることが示されている（特許文献１）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【文献】国際公開第２０１１／０４７４３４号パンフレット

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

しかしながら、新たな、または改善された癌治療を提供することが必要とされている。

【0007】

本明細書における任意の従来技術への言及は、いかなる管轄においてもこの従来技術が共通一般知識の一部を形成するという認識でも示唆でもなく、またはこの従来技術が当業者により理解され、関連するとみなされ、および／もしくは他の従来技術の一部と組み合わされることが妥当に予測され得るという認識でも示唆でもない。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明は、キモトリプシノーゲンおよびトリプシノーゲンを含む、対象における癌を治療するための組成物であって、キモトリプシノーゲン：トリプシノーゲンの重量比は、１：１超であるが、４：１未満（すなわち、キモトリプシノーゲンの量がトリプシノーゲンと比較して１倍超であるが、４倍未満である）である組成物を提供する。好ましくは、重量比は、１：１超であるが、２：１以下である。好ましくは、キモトリプシノーゲン：トリプシノーゲンの重量比は、約２：１である。

【0009】

本発明は、キモトリプシノーゲン、トリプシノーゲンおよび薬学的に許容可能な希釈剤、賦形剤または担体を含む、対象における癌を治療するための医薬組成物であって、キモトリプシノーゲン：トリプシノーゲンの重量比は、１：１超であるが、４：１未満である医薬組成物を提供する。好ましくは、重量比は、１：１超であるが、２：１以下である。好ましくは、キモトリプシノーゲン：トリプシノーゲンの重量比は、約２：１である。一実施形態において、組成物中に存在する唯一の活性抗腫瘍成分がキモトリプシノーゲンおよびトリプシノーゲンである。

【0010】

本発明は、活性成分としてキモトリプシノーゲンおよびトリプシノーゲンを含む、対象における癌を治療するための医薬組成物であって、薬学的に許容可能な希釈剤、賦形剤または担体をさらに含み、キモトリプシノーゲン：トリプシノーゲンの重量比は、１：１超であるが、４：１未満である医薬組成物を提供する。好ましくは、重量比は、１：１超であるが、２：１以下である。好ましくは、キモトリプシノーゲン：トリプシノーゲンの重量比は、約２：１である。一実施形態において、組成物中に存在する唯一の活性抗腫瘍成分がキモトリプシノーゲンおよびトリプシノーゲンである。

【0011】

本発明は、主成分としてキモトリプシノーゲンおよびトリプシノーゲンを含む、対象における癌を治療するための医薬組成物であって、薬学的に許容可能な希釈剤、賦形剤または担体をさらに含み、キモトリプシノーゲン：トリプシノーゲンの重量比は、１：１超であるが、４：１未満である医薬組成物を提供する。好ましくは、重量比は、１：１超であるが、２：１以下である。好ましくは、キモトリプシノーゲン：トリプシノーゲンの重量比は、約２：１である。一実施形態において、組成物中に存在する唯一の活性抗腫瘍成分がキモトリプシノーゲンおよびトリプシノーゲンである。

【0012】

本発明は、キモトリプシノーゲン、トリプシノーゲンおよび薬学的に許容可能な希釈剤、賦形剤または担体を含む、対象における膵臓癌を治療するための医薬組成物であって、キモトリプシノーゲン：トリプシノーゲンの重量比は、１：１超であるが、４：１未満である医薬組成物を提供する。好ましくは、重量比は、１：１超であるが、２：１以下である。好ましくは、キモトリプシノーゲン：トリプシノーゲンの重量比は、約２：１である。

【0013】

本発明は、キモトリプシノーゲン、トリプシノーゲンおよび薬学的に許容可能な希釈剤、賦形剤または担体を含む、対象における卵巣癌を治療するための医薬組成物であって、キモトリプシノーゲン：トリプシノーゲンの重量比は、１：１超であるが、４：１未満である医薬組成物を提供する。好ましくは、重量比は、１：１超であるが、２：１以下である。好ましくは、キモトリプシノーゲン：トリプシノーゲンの重量比は、約２：１である。

【0014】

本発明はまた、対象における癌の治療において使用される医薬組成物であって、キモトリプシノーゲン、トリプシノーゲンおよび薬学的に許容可能な希釈剤、賦形剤または担体を含み、キモトリプシノーゲン：トリプシノーゲンの重量比は、１：１超であるが、４：１未満である医薬組成物を提供する。好ましくは、重量比は、１：１超であるが、２：１以下である。好ましくは、キモトリプシノーゲン：トリプシノーゲンの重量比は、約２：１である。

【0015】

本発明はまた、対象における癌の治療において使用される、キモトリプシノーゲン、トリプシノーゲンおよび薬学的に許容可能な希釈剤、賦形剤または担体を含む医薬組成物であって、キモトリプシノーゲン：トリプシノーゲンの重量比は、１：１超であるが、４：１未満である医薬組成物を提供する。好ましくは、重量比は、１：１超であるが、２：１以下である。好ましくは、キモトリプシノーゲン：トリプシノーゲンの重量比は、約２：１である。

【0016】

本発明はまた、キモトリプシノーゲンおよびトリプシノーゲンを含む単位用量組成物であって、単位用量は、キモトリプシノーゲンを６ｍｇ以上の量で、または本明細書に記載の任意の他の量以上の量で投与するために適合されており、キモトリプシノーゲン：トリプシノーゲンの重量比は、１：１超であるが、４：１未満である組成物を提供する。好ましくは、重量比は、１：１超であるが、２：１以下である。好ましくは、キモトリプシノーゲン：トリプシノーゲンの重量比は、約２：１である。好ましくは、キモトリプシノーゲンは、９ｍｇ、１５ｍｇ、２４ｍｇ、７２ｍｇ、２１０ｍｇ、６００ｍｇ、１２００ｍｇ、または２４００ｍｇ以上の量である。

【0017】

本発明はまた、キモトリプシノーゲンおよびトリプシノーゲンを含む単位用量組成物であって、単位用量は、トリプシノーゲンを１ｍｇ以上の量で、または本明細書に記載の任意の他の量以上の量で投与するために適合されており、キモトリプシノーゲン：トリプシノーゲンの重量比は、１：１超であるが、４：１未満である組成物を提供する。好ましくは、重量比は、１：１超であるが、２：１以下である。好ましくは、キモトリプシノーゲン：トリプシノーゲンの重量比は、約２：１である。好ましくは、トリプシノーゲンは、１．５ｍｇ、３ｍｇ、３．５ｍｇ、１２ｍｇ、３６ｍｇ、９０ｍｇ、１８０ｍｇまたは３６０ｍｇ以上の量である。

【0018】

本発明の任意の態様において、組成物は、キモトリプシノーゲンおよびトリプシノーゲンを含み、またはそれらからなり、キモトリプシノーゲンの量は、１．５ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、１３５ｍｇ／ｋｇ、２５０ｍｇ／ｋｇまたは５００ｍｇ／ｋｇ以上である。キモトリプシノーゲンおよびトリプシノーゲンの量は、本明細書に記載の任意のｍｇ／ｋｇ値以上であり得る。

【0019】

本発明の任意の態様において、ヒトにおける癌を治療するための組成物は、キモトリプシノーゲンおよびトリプシノーゲンを含み、またはそれらからなり、キモトリプシノーゲンの量は、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、３．５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇまたは４０ｍｇ／ｋｇ以上である。キモトリプシノーゲンおよびトリプシノーゲンの量は、本明細書に記載の任意のｍｇ／ｋｇ値以上であり得る。

【0020】

本発明の任意の態様において、組成物は、キモトリプシノーゲンおよびトリプシノーゲンを含み、またはそれらからなり、トリプシノーゲンの量は、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇまたは８０ｍｇ／ｋｇ以上である。キモトリプシノーゲンおよびトリプシノーゲンの量は、本明細書に記載の任意のｍｇ／ｋｇ値以上であり得る。

【0021】

本発明の任意の態様において、ヒトにおける癌を治療するための組成物は、キモトリプシノーゲンおよびトリプシノーゲンを含み、またはそれらからなり、トリプシノーゲンの量は、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇまたは６ｍｇ／ｋｇ以上である。キモトリプシノーゲンおよびトリプシノーゲンの量は、本明細書に記載の任意のｍｇ／ｋｇ値以上であり得る。

【0022】

本発明の任意の態様において、医薬組成物は、キモトリプシノーゲンおよびトリプシノーゲンを含み、それらからなり、またはそれらを投与するために適合されており、キモトリプシノーゲンの量は、１．５ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、１３５ｍｇ／ｋｇ、２５０ｍｇ／ｋｇまたは５００ｍｇ／ｋｇ以上である。キモトリプシノーゲンおよびトリプシノーゲンの量は、本明細書に記載の任意のｍｇ／ｋｇ値以上であり得る。

【0023】

本発明の任意の態様において、ヒトに使用される医薬組成物は、キモトリプシノーゲンおよびトリプシノーゲンを含み、それらからなり、またはそれらを投与するために適合されており、キモトリプシノーゲンの量は、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、３．５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇまたは４０ｍｇ／ｋｇ以上である。キモトリプシノーゲンの量は、本明細書に記載の任意のｍｇ／ｋｇ値以上であり得る。

【0024】

本発明の任意の態様において、医薬組成物は、キモトリプシノーゲンおよびトリプシノーゲンを含み、それらからなり、またはそれらを投与するために適合されており、投与されるトリプシノーゲンの量は、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇまたは８０ｍｇ／ｋｇ以上である。トリプシノーゲンの量は、本明細書に記載の任意のｍｇ／ｋｇ値以上であり得る。

【0025】

本発明の任意の態様において、ヒトに使用される医薬組成物は、キモトリプシノーゲンおよびトリプシノーゲンを含み、それらからなり、またはそれらを投与するために適合されており、投与されるトリプシノーゲンの量は、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇまたは６ｍｇ／ｋｇ以上である。トリプシノーゲンの量は、本明細書に記載の任意のｍｇ／ｋｇ値以上であり得る。

【0026】

本発明はまた、キモトリプシノーゲンおよびトリプシノーゲンを投与することを含む、対象における癌を治療する方法であって、キモトリプシノーゲン：トリプシノーゲンの重量比は、１：１超であるが、４：１未満であり、それにより癌を治療する方法を含む。好ましくは、重量比は、１：１超であるが、２：１以下である。好ましくは、キモトリプシノーゲン：トリプシノーゲンの重量比は、約２：１である。

【0027】

本発明は、対象に、治療有効量のトリプシノーゲンおよびキモトリプシノーゲンを含む医薬組成物を投与することを含む、固形腫瘍を治療する方法であって、組成物は、アミラーゼを含有せず、キモトリプシノーゲン：トリプシノーゲンの重量比は、１：１超であるが、４：１未満である方法を含む。

【0028】

本発明は、対象に、本質的に治療有効量のトリプシノーゲンおよびキモトリプシノーゲンからなる医薬組成物を投与することを含む、固形腫瘍を治療する方法であって、キモトリプシノーゲン：トリプシノーゲンの重量比は、１：１超であるが、４：１未満である方法を含む。

【0029】

本発明はまた、対象に、
薬学的に許容可能な担体、ビヒクルまたは希釈剤；および
トリプシノーゲンおよびキモトリプシノーゲンからなるプロテアーゼ前酵素組成物
を含む医薬組成物を投与することを含む固形腫瘍を治療する方法であって、キモトリプシノーゲン：トリプシノーゲンの重量比は、１：１超であるが、４：１未満である方法を提供する。

【0030】

本発明は、キモトリプシノーゲンおよびトリプシノーゲンを投与することを含む、対象における癌を治療する方法であって、キモトリプシノーゲンを、０．１ｍｇ／ｋｇ超の量で投与し、キモトリプシノーゲン：トリプシノーゲンの重量比は、１：１超であるが、４：１未満であり、それにより癌を治療する方法を含む。好ましくは、重量比は、１：１超であるが、２：１以下である。好ましくは、キモトリプシノーゲン：トリプシノーゲンの重量比は、約２：１である。好ましくは、キモトリプシノーゲンは、１ｍｇ／ｋｇ超の量で投与する。

【0031】

本発明は、キモトリプシノーゲンおよびトリプシノーゲンを投与することを含む、対象における癌を治療する方法であって、トリプシノーゲンを、０．０２ｍｇ／ｋｇ超の量で投与し、キモトリプシノーゲン：トリプシノーゲンの重量比は、１：１超であるが、４：１未満であり、それにより癌を治療する方法を含む。好ましくは、重量比は、１：１超であるが、２：１以下である。好ましくは、キモトリプシノーゲン：トリプシノーゲンの重量比は、約２：１である。好ましくは、キモトリプシノーゲンは、０．２ｍｇ／ｋｇ超の量で投与する。

【0032】

特に規定のない限り、本明細書において使用される、１：１超であるが、４：１未満は、３：１および２：１を含む。換言すると、本発明の任意の態様において１：１超であるが、４：１未満であるキモトリプシノーゲン：トリプシノーゲンの重量比は、３：１または２：１の実施形態を含む。

【0033】

本発明は、キモトリプシノーゲンおよびトリプシノーゲンを投与することを含み、それにより対象における線維肉腫を治療する、対象における線維肉腫を治療する方法を含む。好ましくは、アミラーゼを対象に投与しない。キモトリプシノーゲン：トリプシノーゲンの重量比は、１：１超、２：１超、４：１超、６：１超または８：１超であり得る。キモトリプシノーゲン：トリプシノーゲンの重量比は、１：１超であるが、８：１以下、１：１超であるが、６：１以下、１：１超であるが、４：１以下、または１：１超であるが、２：１以下であり得る。重量比は、約２：１、約４：１、約６：１または約８：１であり得る。

【0034】

本発明はまた、線維肉腫の治療のための医薬品の製造におけるキモトリプシノーゲンおよびトリプシノーゲンの使用を提供する。好ましくは、医薬品は、アミラーゼを含有しない。キモトリプシノーゲン：トリプシノーゲンの重量比は、１：１超、２：１超、４：１超、６：１超または８：１超であり得る。キモトリプシノーゲン：トリプシノーゲンの重量比は、１：１超であるが、８：１以下、１：１超であるが、６：１以下、１：１超であるが、４：１以下、または１：１超であるが、２：１以下であり得る。重量比は、約２：１、約４：１、約６：１または約８：１であり得る。

【0035】

本発明の任意の方法において、２４時間の期間の期間にわたり単回用量または複数回用量で投与されるキモトリプシノーゲンの量は、０．１ｍｇ／ｋｇ超であるが、５００ｍｇ／ｋｇ未満である。好ましくは、キモトリプシノーゲンは、１ｍｇ／ｋｇ超の量で投与する。

【0036】

本発明の任意の方法において、２４時間の期間の期間にわたり単回用量または複数回用量で投与されるトリプシノーゲンの量は、少なくとも０．０２ｍｇ／ｋｇ超であるが、９０ｍｇ／ｋｇ未満である。好ましくは、トリプシノーゲンは、０．２ｍｇ／ｋｇ超の量で投与する。

【0037】

本発明の任意の方法において、トリプシノーゲンおよびキモトリプシノーゲンの量の投与は、投与１週間後、投与１日後、または好ましくは、投与１時間後に対象においていかなる臨床的に観察可能な有害事象ももたらさない。臨床的に観察可能な有害事象は、体重損失、注射部位における発赤および挙動変化、または本明細書に記載の任意の他の事象の任意の１つ以上であり得る。

【0038】

本発明はまた、癌の治療のための医薬品の製造におけるキモトリプシノーゲンおよびトリプシノーゲンの使用であって、キモトリプシノーゲン：トリプシノーゲンの重量比は、１：１超であるが、４：１未満であり、それにより癌を治療する使用を提供する。好ましくは、重量比は、１：１超であるが、２：１以下である。好ましくは、キモトリプシノーゲン：トリプシノーゲンの重量比は、約２：１である。好ましくは、医薬品は、キモトリプシノーゲンを１ｍｇ／ｋｇ超の量で投与するために適合されている。好ましくは、医薬品は、トリプシノーゲンを０．２ｍｇ／ｋｇ超の量で、または本明細書に記載の任意の他の量を超える量で投与するために適合されている。

【0039】

本発明はまた、少なくとも１つの投薬単位を含む、癌を治療するためのキットであって、投薬単位は、キモトリプシノーゲン、トリプシノーゲンおよび薬学的に許容可能な希釈剤、賦形剤または担体を含み、投薬単位は、キモトリプシノーゲンおよびトリプシノーゲンを、本明細書に記載の任意の量またはｍｇ／ｋｇ値以上で投与するために適合されているキットを提供する。

【0040】

場合により、キットは、１ｍｇ／ｋｇ超の量のキモトリプシノーゲン、または本明細書に記載の任意の他の量を超える量の投薬単位を投与することを使用者に指示する説明書も含む。

【0041】

場合により、キットは、０．２ｍｇ／ｋｇ超の量のトリプシノーゲン、または本明細書に記載の任意の他の量を超える量の投薬単位を投与することを使用者に指示する説明書も含む。

【0042】

本発明の方法および医薬組成物は、癌および転移性癌腫、例として、膵臓癌、食道癌、結腸癌、腸癌、子宮癌、前立腺癌、卵巣癌、脳腫瘍、胃癌、乳癌、肝臓癌、腎臓癌、悪性黒色腫、線維肉腫または肺癌の治療に有用である。好ましくは、癌は、膵臓癌、結腸癌または卵巣癌である。より好ましくは、癌は、膵臓癌である。好ましくは、脳腫瘍は、膠芽細胞腫である。

【0043】

本発明の方法または使用の任意の態様において、方法または使用は、癌を有し、またはその発症リスクがある対象を同定するステップをさらに含む。好ましくは、癌は、本明細書に記載のいずれかのものである。

【0044】

本発明の任意の態様において、組成物はアミラーゼを含有せず、または方法もしくは使用は、アミラーゼを投与せず、すなわち、組成物は、アミラーゼ不含であり、方法は、アミラーゼ不含組成物の投与を含む。

【0045】

本明細書に記載の本発明の任意の態様、実施形態または形態において、投与されるキモトリプシノーゲンの量は、１ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、１３５ｍｇ／ｋｇ、２５０ｍｇ／ｋｇまたは５００ｍｇ／ｋｇ以上であり得る。投与されるキモトリプシノーゲンは、本明細書に記載の任意のｍｇ／ｋｇ値以上であり得る。

【0046】

本明細書に記載の本発明の任意の態様、実施形態または形態において、投与されるトリプシノーゲンの量は、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇまたは８０ｍｇ／ｋｇ以上であり得る。投与されるトリプシノーゲンは、本明細書に記載の任意のｍｇ／ｋｇ値以上であり得る。

【0047】

本明細書に記載の本発明の任意の態様、実施形態または形態において、ヒトに投与されるキモトリプシノーゲンの量は、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、３．５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇまたは４０ｍｇ／ｋｇ以上であり得る。キモトリプシノーゲンの量は、本明細書に記載の任意のｍｇ／ｋｇ値以上であり得る。

【0048】

本明細書に記載の本発明の任意の態様、実施形態または形態において、ヒトに投与されるトリプシノーゲンの量は、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇまたは６ｍｇ／ｋｇ以上であり得る。トリプシノーゲンの量は、本明細書に記載の任意のｍｇ／ｋｇ値以上であり得る。

【0049】

好ましくは、本明細書に記載の本発明の任意の態様、実施形態または形態において、投与されるキモトリプシノーゲンの量は、１ｍｇ／ｋｇ～４１ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ～５００ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ～２５０ｍｇ／ｋｇ、３．５ｍｇ／ｋｇ～１３５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇ～４５ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得る。投与されるキモトリプシノーゲンは、本明細書に記載の任意の２つのｍｇ／ｋｇ値間の範囲内であり得る。

【0050】

好ましくは、本明細書に記載の本発明の任意の態様、実施形態または形態において、投与されるトリプシノーゲンの量は、０．２ｍｇ／ｋｇ～７ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ～８０ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ～４０ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ～８ｍｇ／ｋｇ、または２．５ｍｇ／ｋｇ～８ｍｇ／ｋｇ超であり得る。投与されるトリプシノーゲンは、本明細書に記載の任意の２つのｍｇ／ｋｇ値間の範囲内であり得る。

【0051】

上記の本発明の任意の組成物において、組成物は、関連するｍｇ、またはｍｇ／ｋｇのキモトリプシノーゲンおよびトリプシノーゲンを対象に投与するために適合させることができる。

【0052】

本発明はまた、「約」上記の記述値である値を含む上記の本発明の任意の態様を提供する。例えば、本発明のさらなる態様は、５００ｍｇ／ｋｇへの言及が約５００ｍｇ／ｋｇである上記態様のいずれかである。これは、本発明の全ての態様または実施形態について、および全ての値について企図される。

【0053】

本発明の任意の態様において、キモトリプシノーゲンおよびトリプシノーゲンは、静脈内、腹腔内、皮下または筋肉内投与する。

【0054】

本発明の任意の態様において、キモトリプシノーゲントリプシノーゲンは、同時または連続投与することができる。連続投与に関して、最初にキモトリプシノーゲン、次いでトリプシノーゲンを投与し、または最初にトリプシノーゲン、次いでキモトリプシノーゲンを投与することができる。

【0055】

文脈がそうでないことを要求する場合を除き、本明細書において使用される用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」およびその用語の変形語、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含んだ（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」は、さらなる添加剤も、構成成分も、整数も、ステップも排除するものではない。

【0056】

本発明のさらなる態様および上記段落に記載の態様のさらなる実施形態は実施例として挙げられ、添付の図面を参照して以下の詳細な説明から明らかになる。

【図面の簡単な説明】

【0057】

【図1】Ａ２７８０ヒト卵巣腫瘍細胞の増殖に対するトリプシノーゲンおよびキモトリプシノーゲンの組合せの効果。トリプシノーゲンおよびキモトリプシノーゲンの組合せアッセイを、既に決定されたトリプシノーゲンのＩＣ_５０（３．１７４ｍｇ／ｍｌ）に基づき１：１、１：２および１：４の比において実施した。１日相互作用係数（Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ ｄａｉｌｙ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）（ＣＤＩ）値を記載のとおり計算した。

【図2】ＡＣＨＮヒト腎腫瘍細胞の増殖に対するトリプシノーゲンおよびキモトリプシノーゲンの組合せの効果。トリプシノーゲンおよびキモトリプシノーゲンの組合せアッセイを、既に決定されたトリプシノーゲンのＩＣ５０（２．９８４ｍｇ／ｍｌ）に基づき１：１、１：２および１：４の比において実施した。ＣＤＩ値を記載のとおり計算した。

【図3】Ｃ８１６１．９ヒト黒色腫細胞の増殖に対するトリプシノーゲンおよびキモトリプシノーゲンの組合せの効果。トリプシノーゲンおよびキモトリプシノーゲンの組合せアッセイを、既に決定されたトリプシノーゲンのＩＣ５０（３．９１７ｍｇ／ｍｌ）に基づき１：１、１：２および１：４の比において実施した。ＣＤＩ値を記載のとおり計算した。

【図4】ＤＡＯＹヒト脳腫瘍細胞の増殖に対するトリプシノーゲンおよびキモトリプシノーゲンの組合せの効果。トリプシノーゲンおよびキモトリプシノーゲンの組合せアッセイを、既に決定されたトリプシノーゲンのＩＣ５０（２．６５４ｍｇ／ｍｌ）に基づき１：１、１：２および１：４の比において実施した。ＣＤＩ値を記載のとおり計算した。

【図5】ＤＵ１４５ヒト前立腺腫瘍細胞の増殖に対するトリプシノーゲンおよびキモトリプシノーゲンの組合せの効果。トリプシノーゲンおよびキモトリプシノーゲンの組合せアッセイを、既に決定されたトリプシノーゲンのＩＣ５０（３．８４３ｍｇ／ｍｌ）に基づき１：１、１：２および１：４の比において実施した。ＣＤＩ値を記載のとおり計算した。

【図6】Ｇ－３６１ヒト黒色腫細胞の増殖に対するトリプシノーゲンおよびキモトリプシノーゲンの組合せの効果。トリプシノーゲンおよびキモトリプシノーゲンの組合せアッセイを、既に決定されたトリプシノーゲンのＩＣ５０（１６．０５ｍｇ／ｍｌ）に基づき１：１、１：２および１：４の比において実施した。ＣＤＩ値を記載のとおり計算した。

【図7】ＨＣＴ１１６ヒト結腸直腸腫瘍細胞の増殖に対するトリプシノーゲンおよびキモトリプシノーゲンの組合せの効果。トリプシノーゲンおよびキモトリプシノーゲンの組合せアッセイを、既に決定されたトリプシノーゲンのＩＣ５０（１６．４３ｍｇ／ｍｌ）に基づき１：１、１：２および１：４の比において実施した。ＣＤＩ値を記載のとおり計算した。

【図8】ＨＣＴ－１５ヒト結腸直腸腫瘍細胞の増殖に対するトリプシノーゲンおよびキモトリプシノーゲンの組合せの効果。トリプシノーゲンおよびキモトリプシノーゲンの組合せアッセイを、既に決定されたトリプシノーゲンのＩＣ５０（２．９７７ｍｇ／ｍｌ）に基づき１：１、１：２および１：４の比において実施した。ＣＤＩ値を記載のとおり計算した。

【図9】Ｈｅｐ３Ｂ２．１－７ヒト肝腫瘍細胞の増殖に対するトリプシノーゲンおよびキモトリプシノーゲンの組合せの効果。トリプシノーゲンおよびキモトリプシノーゲンの組合せアッセイを、既に決定されたトリプシノーゲンのＩＣ５０（２．４８３ｍｇ／ｍｌ）に基づき１：１、１：２および１：４の比において実施した。ＣＤＩ値を記載のとおり計算した。

【図10】ＨＴ－１０８０ヒト線維肉腫細胞の増殖に対するトリプシノーゲンおよびキモトリプシノーゲンの組合せの効果。トリプシノーゲンおよびキモトリプシノーゲンの組合せアッセイを、既に決定されたトリプシノーゲンのＩＣ５０（４．２２４ｍｇ／ｍｌ）に基づき１：１、１：２、１：４、１：６および１：８の比において実施した。ＣＤＩ値を記載のとおり計算した。

【図11】ＨＴ－２９ヒト結腸直腸腫瘍細胞の増殖に対するトリプシノーゲンおよびキモトリプシノーゲンの組合せの効果。トリプシノーゲンおよびキモトリプシノーゲンの組合せアッセイを、既に決定されたトリプシノーゲンのＩＣ５０（１５．１２ｍｇ／ｍｌ）に基づき１：１、１：２および１：４の比において実施した。ＣＤＩ値を記載のとおり計算した。

【図12】ＨｕＨ－７ヒト肝腫瘍細胞の増殖に対するトリプシノーゲンおよびキモトリプシノーゲンの組合せの効果。トリプシノーゲンおよびキモトリプシノーゲンの組合せアッセイを、既に決定されたトリプシノーゲンのＩＣ５０（３．９３４ｍｇ／ｍｌ）に基づき１：１、１：２、１：４、１：６および１：８の比において実施した。ＣＤＩ値を記載のとおり計算した。

【図13】ＭＣＦ－７ヒト乳房腫瘍細胞の増殖に対するトリプシノーゲンおよびキモトリプシノーゲンの組合せの効果。トリプシノーゲンおよびキモトリプシノーゲンの組合せアッセイを、既に決定されたトリプシノーゲンのＩＣ５０（１６．５７ｍｇ／ｍｌ）に基づき１：１、１：２および１：４の比において実施した。ＣＤＩ値を記載のとおり計算した。

【図14】ＭＥＳ－ＳＡヒト子宮腫瘍細胞の増殖に対するトリプシノーゲンおよびキモトリプシノーゲンの組合せの効果。トリプシノーゲンおよびキモトリプシノーゲンの組合せアッセイを、既に決定されたトリプシノーゲンのＩＣ５０（７．８０６ｍｇ／ｍｌ）に基づき１：１、１：２および１：４の比において実施した。ＣＤＩ値を記載のとおり計算した。

【図15】ＮＣＩ－Ｈ４６０ヒト肺腫瘍細胞の増殖に対するトリプシノーゲンおよびキモトリプシノーゲンの組合せの効果。トリプシノーゲンおよびキモトリプシノーゲンの組合せアッセイを、既に決定されたトリプシノーゲンのＩＣ５０（４．０２８ｍｇ／ｍｌ）に基づき１：１、１：２および１：４の比において実施した。ＣＤＩ値を記載のとおり計算した。

【図16】ＰＣ－３ヒト前立腺腫瘍細胞の増殖に対するトリプシノーゲンおよびキモトリプシノーゲンの組合せの効果。トリプシノーゲンおよびキモトリプシノーゲンの組合せアッセイを、既に決定されたトリプシノーゲンのＩＣ５０（１７．４６ｍｇ／ｍｌ）に基づき１：１、１：２および１：４の比において実施した。ＣＤＩ値を記載のとおり計算した。

【図17】ＳＫ－ＯＶ－３ヒト卵巣腫瘍細胞の増殖に対するトリプシノーゲンおよびキモトリプシノーゲンの組合せの効果。トリプシノーゲンおよびキモトリプシノーゲンの組合せアッセイを、既に決定されたトリプシノーゲンのＩＣ５０（８．６６２ｍｇ／ｍｌ）に基づき１：１、１：２および１：４の比において実施した。ＣＤＩ値を記載のとおり計算した。

【図18】ＳＮＢ－１９ヒト脳腫瘍細胞の増殖に対するトリプシノーゲンおよびキモトリプシノーゲンの組合せの効果。トリプシノーゲンおよびキモトリプシノーゲンの組合せアッセイを、既に決定されたトリプシノーゲンのＩＣ５０（３．９４５ｍｇ／ｍｌ）に基づき１：１、１：２および１：４の比において実施した。ＣＤＩ値を記載のとおり計算した。

【発明を実施するための形態】

【0058】

本明細書に開示および定義される本発明は、本文または図面に挙げられ、またはそれらから明らかな個々の特徴部の２つ以上の全ての代替組合せに及ぶことが理解される。これらの異なる組合せの全ては、本発明の種々の代替態様を構成する。

【0059】

目下、本発明のある実施形態が詳細に参照される。本発明は実施形態とともに記載される一方、本発明は、本発明をそれらの実施形態に限定するものでないことが理解される。対照的に、本発明は、特許請求の範囲により定義される本発明の範囲内に含まれ得る全ての代替物、改変、および均等物をカバーするものとする。

【0060】

当業者は、本発明の実施において使用することができる、本明細書に記載のものと類似または同等の多くの方法および材料を認識する。本発明は、記載される方法および材料に決して限定されない。本明細書に開示および定義される発明は、本文または図面に挙げられ、またはそれらから明らかな個々の特徴部の２つ以上の全ての代替組合せに及ぶことが理解される。これらの異なる組合せの全ては、本発明の種々の代替態様を構成する。

【0061】

本明細書に言及される特許および刊行物の全ては、参照により全体として組み込まれる。

【0062】

本明細書を解釈する目的のため、単数形で使用される用語は複数形も含み、その逆も同様である。

【0063】

一態様において、本発明は、キモトリプシノーゲンおよびトリプシノーゲンを１：１超であるが、４：１未満の重量比において投与することができるという驚くべき知見に基づく。驚くべきことに、広範な腫瘍細胞の有意な増殖阻害がトリプシノーゲンに対して４倍以上の重量のキモトリプシノーゲンを必要とせずに観察される。従来の刊行物は、６：１のキモトリプシノーゲンおよびトリプシノーゲンの重量比が最適であることを示唆しているが、本発明者らは目下、驚くべきことに、癌細胞増殖に対する有意な阻害効果が、トリプシノーゲンに対してかなり少量で存在するキモトリプシノーゲンを用いて達成されることを同定した。

【0064】

別の態様において、本発明は、キモトリプシノーゲンおよびトリプシノーゲンが線維肉腫に対して有効であるという知見に基づく。

【0065】

キモトリプシノーゲン（本明細書において「Ｃ」と略記することができる）は、タンパク質を以下のアミノ酸：チロシン、トリプトファン、フェニルアラニンおよびロイシンにおいて優先的に開裂する酵素キモトリプシンの前酵素形態である。キモトリプシンは、キモトリプシンＡ、キモトリプシンＢ（例として、Ｂ１およびＢ２形態を）、キモトリプシンＣ、α－キマロフト（ｃｈｙｍａｒ ｏｐｈｔｈ）、アバザイム（ａｖａｚｙｍｅ）、キマール（ｃｈｙｍａｒ）、キモテスト（ｃｈｙｍｏｔｅｓｔ）、エンゼオン（ｅｎｚｅｏｎ）、クイマール（ｑｕｉｍａｒ）、クイモトラーゼ（ｑｕｉｍｏｔｒａｓｅ）、α－キマール、α－キモトリプシンＡ、α－キモトリプシンと称することができ、またはそれらを含む。キモトリプシンＣは、ブタキモトリプシノーゲンＣから、またはプロカルボキシペプチダーゼＡのウシサブユニットＩＩから形成され得、タンパク質を以下のアミノ酸：チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン、ロイシン、メチオニン、グルタミン、およびアスパラギンにおいて優先的に開裂する。キモトリプシノーゲンとしては、キモトリプシノーゲンＢ１およびキモトリプシノーゲンＢ２が挙げられる。

【0066】

トリプシノーゲン（本明細書において「Ｔ」と略記することができる）は、タンパク質をアルギニンおよびリジンにおいて優先的に開裂するトリプシンの前酵素形態である。トリプシンは、α－トリプシン、β－トリプシン、コクナーゼ、パレンザイム（ｐａｒｅｎｚｙｍｅ）、パレンジモール（ｐａｒｅｎｚｙｍｏｌ）、トリプタール（ｔｒｙｐｔａｒ）、トリピュア（ｔｒｙｐｕｒｅ）、疑似トリプシン、トリプターゼ、トリプセリム（ｔｒｉｐｃｅｌｌｉｍ）、精子受容体ヒドロラーゼβ－トリプシンと称することができ、またはそれらを含み、トリプシノーゲンから１つのペプチド結合の開裂により形成され得る。さらなるペプチド結合開裂は、αおよび他のアイソフォームを産生する。複数のカチオン性およびアニオン性トリプシンは、多くの脊椎動物の膵臓から、および下等種、例として、ザリガニ、昆虫（コクナーゼ）および微生物（ストレプトマイシン生産菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）から単離することができる。消化の間の正常のプロセスにおいて、不活性トリプシノーゲンは腸内粘膜中に存在するエンテロペプチダーゼにより活性化され、セリンプロテアーゼであり、次いで塩基性アミノ酸／タンパク質のカルボキシル側上でペプチド結合を開裂するように作用する酵素トリプシンを形成する。

【0067】

本発明の任意の態様において使用されるトリプシノーゲンおよびキモトリプシノーゲンは、単離、精製、実質的に精製された組換え体または合成物であり得る。

【0068】

前酵素トリプシノーゲンおよびキモトリプシノーゲンは、キモトリプシンクラス３．４．２１．１もしくは３．４．２１．２またはクラス３．４．２１．４からのトリプシンから選択され、または任意の他の好適な資源（国際生化学・分子生物学連合の命名法委員会（Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）の分類に従ってグループ化されたクラス）から選択される酵素の前駆体であり得る。これらの酵素は市販されており、ヒト、ウシまたはブタ起源のものであり得る。

【0069】

本発明は、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｋｇ以上のヒト体重および１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８ｍ^２以上の体表面積に基づき本明細書において言及されるｍｇ／ｋｇの全ての量についてのヒト変換を含む。具体的には、ヒト投与についての１ｋｇ当たりの量、および計算方法は、実施例５において言及される。

【0070】

挙げられるとおり、前酵素形態は、インサイチューで活性型になる酵素の不活性化形態を本質的に提供する（例えば、インビボまたはインビトロ活性化）。例えば、前酵素の活性化（前酵素の活性酵素への変換）は、腫瘍細胞の表面との接触時に生じ得る。前酵素トリプシノーゲンおよびキモトリプシノーゲンは、腫瘍細胞との接触時で、および健常細胞との非接触時に酵素トリプシンおよびキモトリプシンに選択的に活性されることが考えられている。前酵素の使用は、活性酵素のインサイチューでの提供に伴う課題、例えば、目的とする腫瘍細胞標的への到達前の不所望な反応または酵素の不活性化を低減させる。

【0071】

腫瘍細胞に関連して、プロテアーゼ酵素は、細胞壁のペプチド鎖中に存在するアミド結合を開裂することにより悪性細胞の細胞壁を分解するように作用し得る（タンパク質分解）。非悪性細胞中に存在し、細胞壁の分解における酵素の効果を阻害または低減させるプロテアーゼ阻害物質は、悪性腫瘍細胞中では不存在であることも理解されている。タンパク質分解活性を提供することに加え、プロテアーゼ前酵素は、腫瘍細胞中でのβ－カテニンおよびＥ－カドヘリンの発現を上方調節し得る。細胞間接着は、細胞表面におけるβ－カテニンおよびＥ－カドヘリン間の複合体形成または結合により促進され、したがって、β－カテニンおよびＥ－カドヘリンの発現の増加は細胞間接着の向上をもたらし、それにより腫瘍細胞の転移の低減をもたらす。プロテアーゼ前酵素は、他の細胞活性、例えば、増加した免疫認識または分化の増加も提供し得る。

【0072】

重大な有害事象、体験または反応は任意の好ましくない医療上の出来事であり、それは、任意の用量において死亡をもたらし、生命を脅かし（対象が即死リスクを負う）、対象／対象の入院もしくは入院期間の延長を要求し、長期的もしくは重大な障害、無能力をもたらし、または先天異常／出生異常である。

【0073】

臨床的に観察可能な有害事象は、医薬品を投与された対象または臨床試験対象における任意の好ましくない医療上の出来事である。臨床的に観察可能な有害事象は、本明細書、特に実施例に記載の事象または観察のいずれか１つを含み得る。典型的には、観察の期間は、投与後約１週間、投与後約１日間、または好ましくは、投与後約１時間である。観察の期間は、用量の投与間の時間であり得る。

【0074】

「治療すること」または「治療」は、目的が癌またはその拡散（転移）を予防、改善、低減または減速（減弱）させる治療的治療および予防的または防止的措置の両方を指す。

【0075】

本発明の任意の方法において、以下の効果の１つ以上：悪性腫瘍の再発の低減、悪性腫瘍の転移の低減、腫瘍の数またはサイズの低減、腫瘍細胞の分化、細胞間接着を促進するための悪性腫瘍中でのβ－カテニンおよびＥ－カドヘリンの発現、ならびに転移の低減、免疫認識を妨げる腫瘍細胞能の低減を観察することができる。

【0076】

「予防すること」、「予防」、「予防的」または「防止的」は、病態、疾患、障害、または表現型、例として、異常または症状の発生の回避、またはその妨害、それからの防御、またはその発生の保護を指す。予防が必要とされる対象は、病態を発症する傾向があり得る。

【0077】

用語「改善する」または「改善」は、病態、疾患、障害、または表現型、例として、異常または症状の減少、低減または排除を指す。治療が必要とされる対象は、既に病態を有し得、または病態を有する傾向があり得、または病態を予防すべき者であり得る。

【0078】

「対象」は、哺乳動物を含む。哺乳動物は、ヒトであり得、または家畜、動物園用動物、もしくはコンパニオンアニマルであり得る。特に、本発明の方法は、ヒトの医学的治療に好適である一方、それらは、獣医的治療、例として、コンパニオンアニマル、例えば、イヌおよびネコ、ならびに家畜、例えば、ウマ、ウシおよびヒツジ、または動物園用動物、例えば、ネコ科、イヌ科、ウシ科、および有蹄動物の治療にも適用可能であることが特に企図される。対象は、癌または他の障害に罹患していてもよく、癌にも他の障害にも罹患していなくてもよい（すなわち、検出可能な疾患を有さない）。

【0079】

ヒト対象の典型的な体重は、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５または１１０ｋｇ以上であり得る。

【0080】

用語「治療有効量」は、癌またはその拡散（転移）を治療し、予防し、または改善し得る組成物、または組成物中の薬剤もしくは化合物の量を指す。治療有効量は、癌の治療に関して実験的および定型的に決定することができ、平均余命の増加をもたらす。

【0081】

本明細書において使用される「投与するために適合されている」は、トリプシノーゲンおよびキモトリプシノーゲンを単回投与または複数回投与において規定の量または濃度において投与する能力を有する組成物を指す。

【0082】

本明細書に記載の本発明の方法は、新生物および関連病態、癌、腫瘍、悪性および転移性病態の治療を含む。本発明の方法または医薬組成物により治療することができる固形腫瘍および転移に関連する組織および器官としては、限定されるものではないが、胆管、膀胱、血液、脳、乳房、子宮頸部、結腸、子宮内膜、食道、頭部、頸部、腎臓、咽頭、肝臓、肺、髄質、メラニン、卵巣、膵臓、前立腺、直腸、腎、網膜、皮膚、胃、精巣、甲状腺、尿路、および子宮が挙げられる。

【0083】

本発明の方法および医薬組成物は、以下のタイプの癌および転移性癌腫：膵臓癌、食道癌、結腸癌、腸癌、前立腺癌、卵巣癌、胃癌、乳癌、悪性黒色腫または肺癌の治療に有用である。好ましくは、癌は、膵臓癌、結腸癌または卵巣癌である。より好ましくは、癌は、膵臓癌である。癌腫の転移潜在性は、低度、中程度または高度であり得る。

【0084】

本発明の方法および医薬組成物は、例えば、腫瘍細胞アポトーシス、細胞間接着、分化および免疫原性（免疫系による標的化および除去）を増加させることにより癌を治療する多重効果アプローチを提供し得る。したがって、免疫系を抑制し、または損傷させ得るいかなる他の治療も不存在下で治療を実施することが有益である。

【0085】

本発明の方法または使用には、増殖性障害（例えば、腫瘍）の治療または予防に指向される他の慣用の抗癌治療アプローチを補充することができる。例えば、このような方法は、防止的癌予防、術後の癌再発および転移の予防において、ならびに他の慣用の癌療法のアジュバントとして使用することができる。

【0086】

本発明の医薬組成物は、例えば、慣用の固体または液体ビヒクルまたは希釈剤、ならびに所望の投与方式に適切なタイプの医薬添加剤（例えば、賦形剤、結合剤、保存剤、安定剤、着香剤など）を技術、例えば、医薬配合物の分野において周知のものに従って用いることにより配合することができる。

【0087】

本発明の医薬組成物は、任意の好適な手段により、例えば、経口投与で、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤もしくは散剤の形態で；舌下投与で；バッカル投与で；非経口投与で、例えば、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、もしくは嚢内注射もしくは注入技術（例えば、滅菌注射水または非水性液剤もしくは懸濁液として）により；経鼻投与で、例えば、吸入スプレーにより；局所投与で、クリーム剤もしくは軟膏剤の形態で；または直腸投与で、例えば、坐剤の形態で；非毒性の薬学的に許容可能なビヒクルまたは希釈剤を含有する投薬単位配合物で投与することができる。これらは、例えば、即時放出または徐放に好適な形態で、例えば、デバイス、例えば、皮下インプラント、カプセル化スフェロイドまたは浸透圧ポンプの使用により投与することができる。

【0088】

霊長類、例えば、ヒトに加え、種々の他の哺乳動物を第１０の態様の方法に従って治療することができる。例えば、哺乳動物、例として、限定されるものではないが、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、モルモット、ラットまたは他のウシ科、ヒツジ科、ウマ科、イヌ科、ネコ科、げっ歯類もしくはネズミ種を治療することができる。

【0089】

本明細書において使用される用語「薬学的に許容可能な」は、そのレシピエントに有害でない担体、希釈剤または賦形剤を意味する。

【0090】

用語「の投与」およびまたは「投与すること」は、治療が必要とされる個体への提供を意味すると理解されるべきである。

【0091】

治療が必要とされる個体は、本明細書に記載の癌のいずれか１つを有し、またはそれを発症するリスクがあると診断された個体であり得る。

【0092】

本発明の医薬組成物、およびその製剤または配合物は、組成物の構成成分、すなわち、キモトリプシノーゲンおよびトリプシノーゲンを一緒に混合することにより調製することができる。混合は、連続的または同時に実施することができる。

【0093】

本発明の医薬組成物は、単位剤形で利便的に提供することができ、薬学の分野において周知の方法のいずれかにより調製することができる。全ての方法は、活性剤およびプロテアーゼ前酵素を、１つ以上のアクセサリー成分を構成する担体と会合させるステップを含む。一般に、医薬組成物は、活性剤およびプロテアーゼ前酵素を液体担体または微粉固体担体またはその両方と均等および緊密に会合させ、次いで必要な場合、生成物を所望の配合物に成形することにより調製される。活性剤およびプロテアーゼ前酵素は、単回または反復投与後に疾患のプロセスまたは状態に対する所望の効果を産生するために十分な量の単位剤形で提供される。

【0094】

本発明の医薬組成物は、例えば、錠剤、トローチ剤、ロゼンジ剤、水性もしくは油性懸濁液、分散性散剤または顆粒剤、エマルション、硬もしくは軟カプセル剤、またはシロップ剤もしくはエリキシル剤としての経口使用に好適な形態であり得る。経口使用が意図される組成物は、医薬組成物の製造の分野に公知の任意の方法に従って調製することができ、そのような組成物は、薬学的に洗練され、口当たりが良い製剤を提供するために甘味剤、着香剤、着色剤および保存剤からなる群から選択される１つ以上の薬剤を含有し得る。錠剤は、第１および第２の態様のプロテアーゼ前酵素および活性剤を、錠剤の製造に好適な非毒性の薬学的に許容可能な賦形剤との混合物で含有する。これらの賦形剤は、例えば、不活性希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウム；顆粒および崩壊剤、例えば、コーンスターチ、またはアルギン酸；結合剤、例えば、デンプン、ゼラチンまたはアカシア、および滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクであり得る。錠剤は、未被覆であり得、またはそれらは、胃腸管中での崩壊および吸収を遅延させ、それにより長期間にわたる持続作用を提供するための公知の技術により被覆されていてよい。例えば、時間遅延材料、例えば、グリセリルモノステアレートまたはグリセリルジアステアレートを用いることができる。これらは、制御放出のための浸透圧治療錠剤を形成するために被覆されていてもよい。

【0095】

経口使用のための配合物は、第１および第２の態様のプロテアーゼ前酵素および活性剤が不活性固体希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムもしくはカオリンと混合される硬ゼラチンカプセル剤として、または第１および第２の態様のプロテアーゼ前酵素および活性剤が水もしくは油性媒体、例えば、ピーナッツ油、流動パラフィン、もしくはオリーブ油と混合される軟ゼラチンカプセル剤として提供することもできる。

【0096】

水性懸濁液は、活性剤およびプロテアーゼ前酵素を、水性懸濁液の製造に好適な賦形剤との混合物で含有する。このような賦形剤は、懸濁化剤、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシ－プロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニル－ピロリドン、ｎ－メチル－ピロリドン、トラガカントゴムおよびアカシアゴムであり、分散剤または湿潤剤は、天然存在ホスファチド、例えば、レシチン、またはアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物、例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン、またはエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、またはエチレンオキシドと、脂肪酸およびヘキシトールに由来する部分エステルとの縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート、またはエチレンオキシドと、脂肪酸および無水ヘキシトールに由来する部分エステルとの縮合生成物、例えば、ポリエチレンソルビタンモノオレエートであり得る。水性懸濁液は、１つ以上の保存剤、例えば、エチル、またはｎ－プロピル、ｐ－ヒドロキシベンゾエート、１つ以上の着色剤、１つ以上の着香剤、および１つ以上の甘味剤、例えば、スクロースまたはサッカリンも含有し得る。

【0097】

油性懸濁液は、活性剤およびプロテアーゼ前酵素を植物油、例えば、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油もしくはヤシ油中で、または鉱油、例えば、流動パラフィン中で懸濁させることにより配合することができる。油性懸濁液は、増粘剤、例えば、蜜蝋、硬パラフィンまたはセチルアルコールを含有し得る。甘味剤、例えば、上記のもの、および着香剤を添加して口当たりが良い経口製剤を提供することができる。これらは、酸化防止剤、例えば、アスコルビン酸の添加により保存することができる。

【0098】

水の添加による水性懸濁液の調製に好適な分散性散剤および顆粒剤は、第１および第２の態様のプロテアーゼ前酵素および活性剤を、分散剤または湿潤剤、懸濁化剤および１つ以上の保存剤との混合物で提供する。好適な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤は、既に上記のものにより例示される。追加の賦形剤、例えば、甘味剤、着香剤および着色剤も存在し得る。

【0099】

本発明の医薬組成物は、水中油型エマルションの形態でもあり得る。油相は、植物油、例えば、オリーブ油もしくはラッカセイ油、または鉱油、例えば、流動パラフィンまたはそれらの混合物であり得る。好適な乳化剤は、天然存在ゴム、例えば、アカシアゴムまたはトラガカントゴム、天然存在ホスファチド、例えば、ダイズ、レシチン、および脂肪酸および無水ヘキシトールに由来するエステルまたは部分エステル、例えば、ソルビタンモノオレエート、および前記部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートであり得る。エマルションは、甘味剤および着香剤も含有し得る。

【0100】

シロップ剤およびエリキシル剤は、甘味剤、例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトールおよびスクロースと配合することができる。これらは、粘滑剤、保存剤ならびに着香剤および着色剤も含有し得る。

【0101】

本発明の医薬組成物は、無菌注射水性または油性懸濁液の形態であり得る。この懸濁液は、上記の好適な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を使用して公知の技術に従って配合することができる。第１および第２の態様の医薬組成物は、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒中の滅菌注射溶液または懸濁液であり得、例えば、１，３－ブタンジオール中溶液としてもよい。用いることができる許容可能なビヒクルおよび溶媒には、水、リンガー液および等張塩化ナトリウム溶液がある。さらに、滅菌固定油が、溶媒または懸濁化媒体として慣用的に用いられる。この目的のため、任意の無刺激固定油、例として、合成モノまたはジグリセリドを用いることができる。さらに、脂肪酸、例えば、オレイン酸が注射剤の調製において使用される。

【0102】

特定の実施形態において、本発明の医薬組成物は、薬物の直腸投与のための坐剤として配合される。これらの配合物は、第１および第２の態様のプロテアーゼ前酵素および活性剤を、常温において固体であるが、直腸温度において液体であり、したがって、直腸中で融解して薬物を放出する好適な無刺激賦形剤と混合することにより調製することができる。このような材料としては、ココアバターおよびポリエチレングリコールが挙げられる。直腸投与は、酵素の経口投与に関連する胃腸管中での腸内肝臓ファーストパス効果を排除するために使用することができる。

【0103】

本発明の医薬組成物は、リポソーム中で配合することもできる。当分野において公知のとおり、リポソームは、一般に、リン脂質または他の脂質物質に由来する。リポソームは、水性媒体中で分散される単層または多層水和液晶により形成される。リポソームを形成し得る任意の非毒性の生理学的に許容可能で代謝可能な脂質を使用することができる。リポソーム配合物は、安定剤、保存剤、賦形剤などを含有し得る。好ましい脂質は、リン脂質およびホスファチジルコリン、天然物および合成物の両方である。リポソームを形成する方法は、当分野において公知である。

【0104】

本発明の医薬組成物は、投与についての説明書と一緒に容器、パック、または分注器中に含めることができる。医薬組成物のプロテアーゼ前酵素および活性剤、ならびに場合により、追加の活性剤は、本明細書に記載の本発明の使用または方法において同時または異なる時間において別個にまたは一緒に摂取すべき容器、パック、または分注器中で離隔された構成成分として提供することができる。

【0105】

本明細書に開示および定義される本発明は、本文または図面に挙げられ、またはそれらから明らかな個々の特徴部の２つ以上の全ての代替組合せに及ぶことが理解される。これらの異なる組合せの全てが、本発明の種々の代替態様を構成する。

【実施例】

【0106】

実施例１

【0107】

【表1】

【0108】

細胞培養
以下の表は、全てのＩＣ_５０測定および組合せアッセイにおいて使用される増殖条件およびウェル当たりの細胞の初回細胞播種密度を示す。細胞を９５％の空気／５％のＣＯ_２が補給された加湿細胞培養インキュベーター中で３７℃において培養した。

【0109】

【表2】

【0110】

以下の全ての細胞系は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）から調達した：７８６－０、ＡＣＨＮ、ＢＴ－４７４、ＤＡＯＹ、ＤＵ１４５、Ｇ－３６１、ＨＣＴ１１６、ＨＣＴ－１５、Ｈｅｐ３Ｂ２．１－７、ＨＬ－６０、ＨＴ－１０８０、ＨＴ－２９、ＭＣＦ－７、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＥＳ－ＳＡ、ＮＣＩ－Ｈ４６０、ＮＣＩ－Ｈ８２、ＰＣ－３、ＳＫ－ＯＶ－３、Ｕ－８７ＭＧ。

【0111】

Ａ２７８０細胞系は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ）（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）から調達した。

【0112】

Ｃ８１６１．９細胞系は、Ｇａｖｉｎ Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ博士研究室（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｅｒｓｈｅｙ，ＰＡ，ＵＳＡ）から調達した。

【0113】

ＨｕＨ－７細胞系は、Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（ＪＣＲＢ）細胞バンク（大阪、日本）から調達した。

【0114】

ＳＮＢ－１９及びＲａｊｉ細胞系は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＤＳＭＺ）（Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から調達した。

【0115】

全ての細胞系を第１０継代までアッセイにおいて利用した。

【0116】

試験品

【0117】

【表3】

【0118】

【表4】

【0119】

試験品配合
トリプシノーゲンおよびキモトリプシノーゲンを適切な細胞培養培地中で直接溶解させ、細胞に直ちに添加した。

【0120】

細胞増殖アッセイ
細胞系は複数の腫瘍タイプに相当し、以下のものが含まれる：脳腫瘍についてＤＡＯＹ、ＳＮＢ－１９およびＵ８７－ＭＧ；乳房腫瘍についてＢＴ－４７４、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１およびＭＣＦ－７；結腸腫瘍についてＨＣＴ１１６、ＨＣＴ－１５およびＨＴ－２９；線維肉腫についてＨＴ－１０８０；腎腫瘍についてＡＣＨＮおよび７８６－Ｏ；白血病についてＨＬ－６０およびＲａｊｉ；肝腫瘍についてＨｅｐ３Ｂ２．１－７およびＨｕＨ－７；肺腫瘍についてＮＣＩ－Ｈ４６０およびＮＣＩ－Ｈ８２；黒色腫についてＣ８１６１．９およびＧ－３６１；前立腺腫瘍についてＰＣ－３およびＤＵ１４５；卵巣腫瘍についてＡ２７８０およびＳＫ－ＯＶ－３；ならびに子宮腫瘍についてＭＥＳ－ＳＡ。

【0121】

組合せアッセイのため、試験品を細胞に播種２４時間後に添加した。試験品濃度はそれぞれの細胞系についてトリプリケートで試験した。試験品の添加７２時間後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｂｌｕｅ（登録商標）アッセイを全てのプレートに対して実施した。

【0122】

組合せアッセイにおいて使用されるトリプシノーゲンの濃度は、単一試験品実験から計算されたＩＣ_５０に基づいた。それぞれの個々の細胞系についてのトリプシノーゲンの濃度により、キモトリプシノーゲンの濃度を以下の比：１：１、１：２、１：４、１：６および１：８（トリプシノーゲン：キモトリプシノーゲン）において決定した。対照は、増殖培地のみおよび未処理細胞と増殖培地（未処理対照）からなるものであった。

【0123】

使用されるアッセイ対照は、ビヒクルとしてのリン酸緩衝生理食塩水対照および陽性対照としてのＴｒｉｔｏｎ－ｘ１００に対するビヒクルとしての増殖培地対照および増殖培地のみ（バックグラウンド）であった。バックグラウンド減算は、ＩＣ_５０値の測定について実施しなかった。

【0124】

ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｂｌｕｅ（登録商標）アッセイ
試験品含有培地中での細胞のインキュベーション後、１０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｂｌｕｅ（登録商標）をそれぞれのウェルに添加し、次いで細胞と最大６時間インキュベートした。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｇｅｍｉｎｉ ＸＰＳ蛍光光度計（５６０ｎｍ励起、５９０ｎｍ蛍光）を使用して蛍光を計測した。全てのデータを記録し、解釈のためにＭｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｅｘｃｅｌスプレッドシートに入力した。

【0125】

計算
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｂｌｕｅ（登録商標）アッセイから回収されたデータを、ＩＣ_５０測定のために用量応答曲線としてプロットした。相対蛍光単位（ＲＦＵ）を化合物濃度に対してプロットした。これらのプロットにおいて、Ｘ軸（化合物濃度）を対数スケールで表した。ＩＣ_５０濃度は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン６．０ｅＭａｃ ＯＳＸ版（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を使用して可変傾斜曲線フィッティングアルゴリズムを介してそれぞれの化合物について最大阻害濃度（ＩＣ）の半数（５０％）として計算した。

【0126】

組合せ試験のため、薬物相互作用係数（ＣＤＩ）を以下の式：

【数1】

（式中、ＴＣは、トリプシノーゲンおよびキモトリプシノーゲンの組合せの増殖阻害であり、Ｔは、単一剤トリプシノーゲンの増殖阻害であり、Ｃは、単一剤キモトリプシノーゲンの増殖阻害である）に従って計算した。１未満のＣＤＩ値はトリプシノーゲンおよびキモトリプシノーゲンの薬物相乗作用を示す一方、１超の値はそれらの拮抗相互作用を示す。

【0127】

実施例２
ヒト癌におけるトリプシノーゲンおよびキモトリプシノーゲンによる細胞増殖阻害
キモトリプシノーゲン（Ｃ）およびトリプシノーゲン（Ｔ）の組合せによる処理は、図１～１８および表１～１８に記載の細胞系についてのＣＤＩに基づき１：１超であり、４：１未満の比において１：１と比較して大きな増殖阻害を実証した。試験された全ての細胞系におけるそれぞれの組合せについてのＣＤＩ値を図および表に示す。

【0128】

さらに、１：１超であるが、４：１未満の比について観察された肝腫瘍細胞の増殖阻害は、４：１、６：１および８：１の比に等しかった。

【0129】

さらに、線維肉腫細胞の増殖阻害は、２：１、４：１、６：１および８：１を含む試験された全ての比において有意であった。キモトリプシノーゲンおよびトリプシノーゲンは、１：１超の試験された全ての比、すなわち、２：１、４：１、６：１および８：１において増殖阻害に対して有意な相乗効果を示した。

【0130】

以下の表１～１８は、３つのレプリケートの平均蛍光（相対蛍光単位－ＲＦＵ）、標本平均の標準誤差（ＳＥＭ）、増殖阻害（１＝増殖阻害なし、１未満＝増殖阻害）およびＣＤＩ（薬物相互作用係数－１未満のＣＤＩ値はトリプシノーゲンおよびキモトリプシノーゲンの薬物相乗作用を示す一方、１超の値はそれらの拮抗相互作用を示す）を示す。

【0131】

【表5】

【0132】

【表6】

【0133】

【表7】

【0134】

【表8】

【0135】

【表9】

【0136】

【表10】

【0137】

【表11】

【0138】

【表12】

【0139】

【表13】

【0140】

【表14】

【0141】

【表15】

【0142】

【表16】

【0143】

【表17】

【0144】

【表18】

【0145】

【表19】

【0146】

【表20】

【0147】

【表21】

【0148】

【表22】

【0149】

本明細書において開示および定義される本発明は、本文または図面から言及され、または明らかな個々の特徴部の２つ以上の全ての代替の組合せに及ぶことが理解される。それらの異なる組合せの全ては、本発明の種々の代替態様を構成する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】