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▶ リパブリック オブ コリア（マネージメント ルーラル デベロップメント アドミニストレーション）の特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-01-06
(45)【発行日】2022-02-04
(54)【発明の名称】新規な粉質胚乳遺伝子、分子マーカー及びその用途
(51)【国際特許分類】
C12N 15/54 20060101AFI20220128BHJP
C12N 15/82 20060101ALI20220128BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220128BHJP
A01H 5/00 20180101ALI20220128BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20220128BHJP
C12Q 1/6827 20180101ALI20220128BHJP
C12Q 1/683 20180101ALI20220128BHJP
C12N 9/12 20060101ALN20220128BHJP
C12N 5/04 20060101ALN20220128BHJP
【ＦＩ】
C12N15/54 ZNA
C12N15/82 Z
C12N5/10
A01H5/00 A
C12N15/11 Z
C12Q1/6827 Z
C12Q1/683 Z
C12N9/12
C12N5/04
【請求項の数】
14
(21)【出願番号】P 2020525962
(86)(22)【出願日】2018-11-09
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-01-28
(86)【国際出願番号】 KR2018013661
(87)【国際公開番号】W WO2019093832
(87)【国際公開日】2019-05-16
【審査請求日】2020-07-03
(31)【優先権主張番号】10-2017-0149236
(32)【優先日】2017-11-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】516373203
【氏名又は名称】リパブリック オブ コリア（マネージメント ルーラル デベロップメント アドミニストレーション）
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】特許業務法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】チュン，ジ ウン
(72)【発明者】
【氏名】クォン，ソン ウォク
(72)【発明者】
【氏名】チャン，セオ ギュ
(72)【発明者】
【氏名】リ，ア リム
【審査官】山本 晋也
(56)【参考文献】
【文献】韓国公開特許第１０－２０１１－００９２１４２（ＫＲ，Ａ）
【文献】Kang HG et al. “White-core endosperm floury endosperm-4 in rice is generated by knockout mutations in the C-type pyruvate orthophosphate dikinase gene (OsPPDKB).” Plant J, 2005 Jun;42(6):901-11, doi: 10.1111/j.1365-313X.2005.02423.x,PMID: 15941402.，2005年06月
【文献】Mo, Young-Jun et al.“Agronomic and genetic analysis of Suweon 542, a rice floury mutant line suitable for dry milling.” Rice (NewYork, N.Y.) vol. 6,1 37. 9 Dec. 2013, doi:10.1186/1939-8433-6-37，2013年12月
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／５４
Ｃ１２Ｎ １５／８２
Ｃ１２Ｎ ５／１０
Ａ０１Ｈ ５／００
Ｃ１２Ｎ １５／１１
Ｃ１２Ｑ １／６８２７
Ｃ１２Ｑ １／６８３
Ｃ１２Ｎ ９／１２
Ｃ１２Ｎ ５／０４
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号２で示される稲の粉質胚乳の形質を決定するｃｙＯｓＰＰＤＫ（cytosolic pyruvate orthophosphate dikinase）遺伝子。
【請求項2】
請求項１に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項3】
請求項１に記載の遺伝子又は請求項２に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項4】
稲の標準ゲノム（IRGSP 1.0）において５番染色体の１９，７２２，２５４ｂｐに対応する位置に存在する一塩基多型（SNP）マーカーを検出することができる製剤を含む、請求項１に記載の遺伝子による粉質胚乳形質判別用組成物。
【請求項5】
前記稲の標準ゲノム（IRGSP 1.0）において５番染色体の１９，７２２，２５４ｂｐに対応する位置に存在するＳＮＰマーカーは、塩基がＡまたはＴである、請求項４に記載の粉質胚乳形質判別用組成物。
【請求項6】
前記一塩基多型を検出することができる製剤は、稲の標準ゲノム（IRGSP 1.0）において５番染色体の１９，７２２，２５４ｂｐに対応する位置の塩基を含む１０個～３００個の連続した核酸配列からなるポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするプローブ；またはこれを増幅することができるプライマーである、請求項４に記載の粉質胚乳形質判別用組成物。
【請求項7】
前記一塩基多型を検出することができる製剤は、配列番号３で示される正方向プライマー及び配列番号４で示される逆方向プライマーからなるプライマーセット；または配列番号５で示される外部正方向プライマー、配列番号６で示される外部逆方向プライマー、配列番号７で示される内部正方向プライマー、及び配列番号８で示される内部逆方向プライマーからなるプライマーセットである、請求項４に記載の粉質胚乳形質判別用組成物。
【請求項8】
請求項４～７のいずれか一項に記載の組成物を含む請求項１に記載の遺伝子による粉質胚乳形質判別用キット。
【請求項9】
稲の標準ゲノム（IRGSP 1.0）において５番染色体の１９，７２２，２５４ｂｐに対応する位置に存在する一塩基多型（SNP）マーカーを確認することを含む請求項１に記載の遺伝子による粉質胚乳形質判別方法。
【請求項10】
前記稲の標準ゲノム（IRGSP 1.0）において５番染色体の１９，７２２，２５４ｂｐに対応する位置に存在する一塩基多型（SNP）は、塩基がＡまたはＴである、請求項９に記載の粉質胚乳形質判別方法。
【請求項11】
前記粉質胚乳形質判別方法は、（ａ）試料から分離されたゲノムＤＮＡを鋳型として、稲の標準ゲノム（IRGSP 1.0）において５番染色体の１９，７２２，２５４ｂｐに対応する位置の塩基を含む１０個～３００個の連続した核酸配列からなるポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするプローブ；またはこれを増幅することができるプライマーと反応させること；及び（ｂ）前記反応物を確認することをさらに含む、請求項９に記載の粉質胚乳形質判別方法。
【請求項12】
前記プライマーは、配列番号３で示される正方向プライマー及び配列番号４で示される逆方向プライマーからなるプライマーセット；または配列番号５で示される外部正方向プライマー、配列番号６で示される外部逆方向プライマー、配列番号７で示される内部正方向プライマー、及び配列番号８で示される内部逆方向プライマーからなるプライマーセットである、請求項１１に記載の粉質胚乳形質判別方法。
【請求項13】
前記粉質胚乳形質判別方法は、前記（ｂ）の反応物に制限酵素を処理することをさらに含む、請求項１１に記載の粉質胚乳形質判別方法。
【請求項14】
前記制限酵素は、Ｈｉｎｆ Ｉである、請求項１３に記載の粉質胚乳形質判別方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、米の粉質胚乳の形質を決定する新規な配列の遺伝子、これを検出するための分子マーカー及びその用途と検出方法に関する。
【背景技術】
【0002】
米は、韓国国内の農業所得の７０％に達する農家の主要な収入源であるが、食生活の欧米化、機能性雑穀類の消費の増加などにより消費量が持続的に減少している。２０１７年度の統計庁の発表によると、国民１人当たりの年間米の消費量は１９７０年の１３６．４ｋｇから２０１６年には６１．９ｋｇに減少し、稲の栽培面積も１９７５年の１２１．８万ｈａから２０１６年には７７．９万ｈａに減少し、生産基盤が脆弱になっている実情である。
【0003】
米と共に主要な食用作物である小麦は、製粉過程を通じて小麦粉が原料として提供され、これを２次加工して食品に生産される。即ち、小麦産業は品種の育成と製粉工程などの「原料産業」と様々な加工品を開発して提供する「食品産業」の区分が明確であり、市場の拡充及び付加価値の創出に対する潜在力が非常に高い作物として評価されている。米の場合、餅類を除いても約３００種にも及ぶ加工食品の形態が存在するが、韓国国内で加工用に消費される米は、生産量の５％にも満たない約２２万トン（輸入１０万、国内生産１２万）に過ぎないのが実情である。ほとんどのメーカーが直接精白米を購入して自主的に米粉を製造して使用するため、米粉の品質が均一でないだけでなく、その売上高は４９兆ウォンに迫る飲料、食料品製造業の売上高比２％（２００６年現在、約１兆ウォン）の水準に過ぎないのが実情である。
【0004】
米は、粒の硬度（穀粒硬度）が非常に高いため、現在、国内で最も一般的に使用される米の製粉方法は、水にふやかして粉砕する湿式製粉方式である。しかし、湿式製粉は１００ｋｇの米粉を製造するのに約５００リットルの米のとぎ汁を発生させ、環境汚染を誘発する問題点を有している。また、米粉を流通させるためには、米粉を殺菌乾燥させる別途の工程を追加しなければならない。このような理由により、湿式製粉方法を用いた米粉の加工コスト（５００～７００ウォン／ｋｇ）は、乾式製粉方法を使用した小麦粉の生産コスト（２００～３００ウォン／ｋｇ）より２倍以上高いのが実情である。最近、大量生産設備が整えられて半湿式製粉技術が部分的に運用されているものの、生産コストの上昇要因が完全には解消されてはいない。
【0005】
競争力を兼ね備えた、高品質の米粉の生産のために製粉方法と共に重要視されることが粉砕された粉末の大きさ（粒度）である。生地や加工品の物理化学的性質が粒度分布によって大きく支配されるので、用途に合うように米粉の粒度をどのように構成して維持するかは非常に重要な問題である。一般的に、米粉の物理性は微細粉であるほど団子の硬度変化が少なく、生地を作るときに、水の吸収率も良くなる。したがって、細かく粉砕された米粉であるほど高品質と認識されて流通価格が高くなる。しかし、生産コストが削減される乾式製粉により微細な粒子を得るためには、米の高い穀粒硬度により機械的な力が大きくなり、損傷した澱粉粒の割合が急激に高くなる。損傷した澱粉粒は、生地の理化学的特性の変化をもたらすため、最終的には、米粉の品質低下を引き起こす。最近、米粉をより微細に粉砕するジェットミル（Jet Mill）、ターボミル（Turbo Mill）などの技術が開発されて検討されているが、初期の設備投資費用及び生産単価の増加などの負担が大きい方である。
【0006】
結論としては、韓国国内で米粉中心の大量の原料供給システムを円滑に構築し、米の加工食品の開発と消費を促進させるためには、１）米粉の生産で発生する汚廃水処理と流通前の乾燥及び殺菌処理などに要されるコストを大幅に削減することができなければならず、２）微細な粒子水準に粉砕しても澱粉粒の損傷を減らす具体的な案が提示されなければならない。生産費を考慮すると、１）工程が簡単で、２）粉砕時間が短く、３）汚廃水の発生がほとんどない乾式製粉方式が有利である。さらに、韓国国内では、小麦の製粉のための乾式製粉設備が相当な規模で備えられているため、生産設備の構築に要されるコストも大幅に削減することができる。
【0007】
このような技術的な背景の下で、粉質胚乳の特性を有する稲の品種の開発及びそのための遺伝的マーカーに対する研究が活発に進められているが（韓国登録特許１０－１２２６４８５（特許文献１））、未だ不十分な実情である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【文献】韓国登録特許１０－１２２６４８５号公報
【非特許文献】
【0009】
【文献】Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)
【文献】Andrew Collins and Xizyi Ke. The Open Bioinformatics Journal, 2012, 55-58.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明は、前記の問題点を解決するためのものであり、本発明の目的は、稲の粉質胚乳の形質を決定する新規な遺伝子、前記遺伝子によりコードされるタンパク質、前記遺伝子による粉質胚乳形質判別用組成物及びキット、そして、それを判別する方法を提供することにある。
【0011】
しかし、本発明が解決しようとする技術的課題は、以上に言及した課題に制限されず、言及されていないもう一つの課題は、以下の記載から当業者に明確に理解することができるだろう。
【課題を解決するための手段】
【0012】
前記のような本発明の目的を達成するために、本発明は、配列番号２で示される稲の粉質胚乳の形質を決定するｃｙＯｓＰＰＤＫ（cytosolic pyruvate orthophosphate dikinase）遺伝子を提供する。
【0013】
本発明は、他の一態様として、前記遺伝子を含む組換えベクターを提供する。
【0014】
本発明は、他の一態様として、前記遺伝子または前記組換えベクターを含む形質転換体を提供する。
【0015】
前記形質転換体は、稲であってもよい。
【0016】
本発明は、他の一態様として、前記遺伝子を含む植物体を提供する。
【0017】
本発明は、他の一態様として、前記遺伝子を含む稲を提供する。
【0018】
本発明は、他の一態様として、稲の標準ゲノム（IRGSP 1.0）において５番染色体の１９，７２２，２５４ｂｐに対応する位置に存在する一塩基多型（SNP）マーカーを検出することができる製剤を含む、前記ｃｙＯｓＰＰＤＫ（cytosolic pyruvate orthophosphate dikinase）遺伝子による粉質胚乳形質判別用組成物を提供する。
【0019】
前記稲の標準ゲノム（IRGSP 1.0）において５番染色体の１９，７２２，２５４ｂｐに対応する位置に存在するＳＮＰマーカーは、塩基がＡまたはＴであってもよい。
【0020】
前記一塩基多型を検出することができる製剤は、稲の標準ゲノム（IRGSP 1.0）において５番染色体の１９，７２２，２５４ｂｐに対応する位置の塩基を含む１０個～３００個の連続した核酸配列からなるポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするプローブ；またはこれを増幅するプライマーであってもよい。
【0021】
前記一塩基多型を検出することができる製剤は、配列番号３で示される正方向プライマー及び配列番号４で示される逆方向プライマーからなるプライマーセット；または配列番号５で示される外部正方向プライマー、配列番号６で示される外部逆方向プライマー、配列番号７で示される内部正方向プライマー、及び配列番号８で示される内部逆方向プライマーからなるプライマーセットであってもよい。
【0022】
本発明は、他の一態様として、前記粉質胚乳形質判別用組成物を含むｃｙＯｓＰＰＤＫ（cytosolic pyruvate orthophosphate dikinase）遺伝子による粉質胚乳形質判別用キットを提供する。
【0023】
本発明は、他の一態様として、稲の標準ゲノム（IRGSP 1.0）において５番染色体の１９，７２２，２５４ｂｐに対応する位置に存在する一塩基多型（SNP）マーカーを確認することを含むｃｙＯｓＰＰＤＫ（cytosolic pyruvate orthophosphate dikinase）遺伝子による粉質胚乳形質判別方法を提供する。
【0024】
前記稲の標準ゲノム（IRGSP 1.0）において５番染色体の１９，７２２，２５４ｂｐに対応する位置に存在する一塩基多型（SNP）は、塩基がＡまたはＴであってもよい。
【0025】
前記粉質胚乳形質判別方法は、（ａ）試料から分離されたゲノムＤＮＡを鋳型として、稲の標準ゲノム（IRGSP 1.0）において５番染色体の１９，７２２，２５４ｂｐに対応する位置の塩基を含む１０個～３００個の連続した核酸配列からなるポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするプローブ；またはこれを増幅することができるプライマーと反応させること；及び（ｂ）前記反応物を確認することをさらに含むことができる。
【0026】
前記プライマーは、配列番号３で示される正方向プライマー及び配列番号４で示される逆方向プライマーからなるプライマーセット；または配列番号５で示される外部正方向プライマー、配列番号６で示される外部逆方向プライマー、配列番号７で示される内部正方向プライマー、及び配列番号８で示される内部逆方向プライマーからなるプライマーセットであってもよい。
【0027】
前記粉質胚乳形質判別方法は、（ｂ）の反応物に制限酵素を処理することをさらに含むことができる。
【0028】
前記制限酵素は、Ｈｉｎｆ Ｉであってもよい。
【0029】
前記粉質胚乳形質判別方法は、（ａ）試料から分離されたゲノムＤＮＡを鋳型として、稲の標準ゲノム（IRGSP 1.0）において５番染色体の１９，７２２，２５４ｂｐに対応する位置の一塩基多型マーカーの多型部位を含む１０個～３００個の連続した核酸配列からなるポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドをプライマーと反応させて増幅させること；及び（ｂ）前記増幅された反応物を確認することをさらに含むことができる。
【0030】
前記粉質胚乳形質判別方法は、（ａ’）の試料から分離されたゲノムＤＮＡを鋳型として、稲の標準ゲノム（IRGSP 1.0）において５番染色体の１９，７２２，２５４ｂｐに対応する位置の塩基を含む１０個～３００個の連続した核酸配列からなるポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするプローブとハイブリダイゼーションさせることをさらに含むことができる。
【発明の効果】
【0031】
本発明によれば、本発明で究明した稲の粉質胚乳の形質を決定する新規な遺伝子は、粉質胚乳の特性を有する植物体の開発に主な目的遺伝子として活用することができ、その一塩基多型（SNP）は、様々な品種の稲において粉質胚乳の形質発現有無を育種段階の初期に簡単かつ正確に判別させるようにする。具体的には、初期の育種系統または個別のＦ2植物の選抜の段階で植物体の粉質胚乳の評価に適用することができ、稲を主原料とする加工製品にも拡張適用することができ、稲を用いた加工産業に活用することができる。
【図面の簡単な説明】
【0032】
【図1a】地図ベースのＦＬＯ４－４変異の複製を示すもので、（Ａ）ＦＬＯ４－４遺伝子座の精密遺伝子地図で分子マーカー及び組換え体の数を示す。２つのＢＡＣクローンが重畳された部分で構成された３３ｋｂ仮想コンティグ（contig）は、参照稲ゲノム（Os-Nipponbare-Reference-IRGSP-1.0）上の二つの重要なマーカーのｅ－Ｌａｎｄｉｎｇｓにより区分して表示される。（Ｂ）ＦＬＯ４－４遺伝子構造及びｃＤＮＡ配列の比較は、エクソン８でＧ→Ａの塩基変異を示し、ここで、野生型のＧｌｙ－４０４がＦＬＯ４－４ではＡｓｐ－４０４に誘導される。白いボックスは翻訳されていない領域を示し、黒いボックスはコーディング領域を示し、実線はイントロンを示す。
【図1b】ナミル稲とＮａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２のＰＰＤＫ１（ＯＳ０５Ｇ０４０５０００－０２）遺伝子の塩基配列を比較することにより、一塩基多型部位を確認した結果である。
【図2】ｄＣＡＰＳ Ｆｉｎｄｅｒ ２．０で探索されたナミル稲、またはＮａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２の一塩基多型部位の増幅のためのｄＣＡＰｓプライマーセット候補群の配列を示した図である。
【図3】本発明に係るｄＣＡＰｓプライマーセットにより増幅される断片の塩基配列及び制限酵素（Ｈｉｎｆ Ｉ）の処理部位を示した図である。
【図4】本発明に係るｄＣＡＰｓプライマーセット及び制限酵素を用いた方法であり、密陽２３号、ナミル稲、及びＮａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２（Ｓ５４２）の電気泳動の結果を示したものである。
【図5】本発明に係るＴｅｔｒａ－ｐｒｉｍｅｒ ＡＲＭＳプライマーセットにより増幅される断片の塩基配列の位置を図式化した図である。
【図6】発明に係るＴｅｔｒａ－ｐｒｉｍｅｒ ＡＲＭＳプライマーセットにより（ａ）増幅される断片の塩基配列、及び（ｂ）密陽２３号、ナミル稲及びＮａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２（Ｓ５４２）の電気泳動の結果を示したものである。
【図7】本発明に係るｄＣＡＰｓプライマーセット及び制限酵素を用いた方法であり、密陽２３号とＮａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２交配後代の電気泳動の結果を示したものである。
【図8】本発明に係るプライマーセット及び制限酵素を用いた方法であり、遺伝的背景が類似したジャポニカ品種の電気泳動の結果を示したものである（１．アンミ、２．アランヒャンチャル、３．白真珠１、４．白玉チャル、５．ボラムチャル、６．ボラムチャン、７．ボラミ、８．宝石、９．宝石チャル、１０．宝石黒チャル、１１．チョンナム、１２．チンドル、１３．秋晴、１４．タボ、１５．タンミ、１６．タンピョン、１７．トレチャン、１８．トダム米、１９．トンジン、２０．トンジン１、２１．トンジンチャル、２２．健康紅米、２３．コンヤン２、２４．コアミ、２５．コアミ２、２６．コアミ４、２７．ヘプム、２８．ハイアミ、２９．ハナム、３０．ハンマウム、３１．黒ジンミ、３２．フクヒャン、３３．黒真珠、３４．フクナム、３５．フクソル、３６．紅真珠、３７．ホプム、３８．黄金ヌリ、３９．ファソン、４０．ファワン、４１．ファヨン、４２．ヒャンナム、４３．ヒョンプム、４４．イルミ、４５．イルプム、４６．赤真珠、４７．赤真珠チャル、４８．黒ヒャンチャル）。
【図9】本発明に係るＴｅｔｒａ－ｐｒｉｍｅｒ ＡＲＭＳプライマーセットを用いた方法であり、密陽２３号とＮａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２交配後代の電気泳動の結果を示したものである。
【図10】本発明に係るＴｅｔｒａ－ｐｒｉｍｅｒ ＡＲＭＳプライマーセットを用いた方法であり、遺伝的背景が類似したジャポニカ品種の電気泳動の結果を示したものである（１．アンミ、２．アランヒャンチャル、３．白真珠１、４．白玉チャル、５．ボラムチャル、６．ボラムチャン、７．ボラミ、８．宝石、９．宝石チャル、１０．宝石黒チャル、１１．チョンナム、１２．チンドル、１３．秋晴、１４．タボ、１５．タンミ、１６．タンピョン、１７．トレチャン、１８．トダム米、１９．トンジン、２０．トンジン１、２１．トンジンチャル、２２．健康紅米、２３．コンヤン２、２４．コアミ、２５．コアミ２、２６．コアミ４、２７．ヘプム、２８．ハイアミ、２９．ハナム、３０．ハンマウム、３１．黒ジンミ、３２．フクヒャン、３３．黒真珠、３４．フクナム、３５．フクソル、３６．紅真珠、３７．ホプム、３８．黄金ヌリ、３９．ファソン、４０．ファワン、４１．ファヨン、４２．ヒャンナム、４３．ヒョンプム、４４．イルミ、４５．イルプム、４６．赤真珠、４７．赤真珠チャル、４８．黒ヒャンチャル）。
【図11】本発明に係るＮａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２（Ｓ５４２）とナミル（Ｎａｍｉｌ）の表現型分析の結果を示す。Ｎａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２とナミルの玄米及び横断面を示す。また、成熟した胚乳の電子顕微鏡視覚化。赤矢印で示されているように、Ｎａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２は、澱粉顆粒で緩く満たされている。黄色のボックス（５００μｍ比率の写真でボックス表示）は、拡大された領域を示す。
【図12】１０ ＤＡＦにナミルとＮａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２間のＦＬＯ４－４発現を分析した結果であり、表示された値は、平均±ＳＤ（ｎ＝３）である。
【発明を実施するための形態】
【0033】
以下、本発明を詳細に説明する。
【0034】
本発明は、稲の粉質胚乳の形質を決定する新規な配列の遺伝子を提供する。前記本発明の新規な配列の遺伝子は、配列番号２で示される稲の粉質胚乳の形質を決定するｃｙＯｓＰＰＤＫ（cytosolic pyruvate orthophosphate dikinase）遺伝子であってもよい。
【0035】
本発明で使用される用語、「粉質胚乳（floury endosperm）」とは、もち稲と同様に白っぽく不透明な外観を有しながら澱粉粒の配列が粗い特性を有する突然変異を称する。米粉の製造には、乾式及び湿式製粉が活用されており、乾式製粉は工程が簡単であるが、損傷した澱粉が増加する問題がある一方、湿式製粉は、加工性は向上するが、水浸と乾燥に要される時間とコストが制限要因として作用する。米の加工産業の活性化に寄与するためには、各用途に適した特性を備えた加工用品種の多様化と製粉性に優れた品種の開発が要求され、このような粉質胚乳の特性は、従来の乾式製粉の問題点を克服する重要な特性の一つである。
【0036】
一方、本発明のＮａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２稲の植物体は、ナミル稲の種子を化学的突然変異の原因であるアジ化ナトリウム（Sodium azide; NaN3）の希釈溶液に浸漬する方法で突然変異を誘発し、これを発芽及び育苗段階を経て植物体（Ｍ１）を展開し、Ｍ１植物体からＭ２種子を収穫し、それからは系統育種法で世代をＭ７まで前進させ、遺伝的に固定された突然変異の系統を確立した系統である。前記Ｎａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２は、既存のナミル稲とアミロース－アミロペクチン含量の組成が類似するが、一般的な稲に比べて穀粒硬度が低く、乾式製粉でも粒子が細かく、澱粉粒の損傷が少ない高品質の米粉を取得することができる特徴がある。ただし、このような品種を育種段階の初期に簡単かつ正確に判別する技術、具体的には、関連する遺伝子マーカーについては知られていなかった。
【0037】
そこで、本発明者らは、Ｎａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２稲品種の塩基配列分析を通じて粉質胚乳の形質を決定する遺伝子を究明し（実験例１）、前記粉質胚乳の形質と密接な関連性を示す一塩基多型の部位を究明した（実験例２）。また、前記一塩基多型の部位をターゲットとするプライマーセットを最初に開発し、本発明に係るプライマーセットを用いた技術がジャポニカ（Japonica）系統稲品種の粉質胚乳の特性を判別するに有用であることを実験的に立証した。
【0038】
本発明の粉質胚乳の特性は、新規な配列のＰＰＤＫ遺伝子により決定される。前記ＰＰＤＫ（Pyruvate orthophosphate dikinase）は、ピルビン酸塩（ｐｙｒｕｖａｔｅ）、ＡＴＰ及びオルトリン酸塩（orthophosphate）を可逆的に転換させ、様々な植物の細胞で多様な機能を遂行することであり、サイトゾル及び葉緑体標的化ＰＰＤＫタンパク質（それぞれ、ｃｙＯｓＰＰＤＫ及びｃｈＯｓＰＰＤＫ）を暗号化する。ｃｈＯｓＰＰＤＫ ｍＲＮＡは光合成機関で構成的に発現され、ｃｙＯｓＰＰＤＫは受粉された後、発達する稲の種子（grain）のみで発現される。通常、稲においてｃｙＯｓＰＰＤＫは、種子の発達時期中、乳熟期に高水準で発現され、受粉後、１０日程度経過してｃｙＯｓＰＰＤＫタンパク質が最高レベルに達すると、ｃｙＯｓＰＰＤＫタンパク質水準と活性がいずれもスレオニル－リン酸化（threonyl-phosphorylation）とタンパク質分解の翻訳後のメカニズムの組み合わせにより急速に下方調節される。日本晴（Nipponbare）稲においてｃｙＯｓＰＰＤＫの全ゲノムは７６５６ｂｐであり、ｃＤＮＡは１９個のエクソンを含み、２６４９ｂｐであり、８８２個のアミノ酸のタンパク質を暗号化する。
【0039】
しかし、本発明のｃｙＯｓＰＰＤＫは、野生型ｃｙＯｓＰＰＤＫ遺伝子に対して変異を含み、これを通じて稲の粉質胚乳の形質を決定する。本発明のｃｙＯｓＰＰＤＫ遺伝子は対立遺伝子で、劣性遺伝子である。本発明の変異遺伝子ｃｙＯｓＰＰＤＫは、乳熟期以降（受粉後１０日以降）、登熟期（grain filling stage）の間に、野生型と比較して高いレベルで発現が維持される特性を有する。
【0040】
特に、本発明のｃｙＯｓＰＰＤＫ遺伝子のエクソン８の部位にＧ→Ａに一塩基多型（SNP）が存在し（対立遺伝子では、ＣからＴに変異）、これにより本発明のｃｙＯｓＰＰＤＫ遺伝子によりコードされたタンパク質のアミノ酸配列においてグリシン（Ｇ、Ｇｌｙ）からアスパラギン酸（Ｄ、Ａｓｐ）への変異が存在する（前記一塩基多型に相応するアミノ酸４０４の位置）。これにより稲の登熟期中にタンパク質の発現及び活性が維持されながら、稲において種子の発達に関与して粉質胚乳の形質を示すようにする。このような側面で、本発明のｃｙＯｓＰＰＤＫは変異ｃｙＯｓＰＰＤＫ遺伝子、変異ｃｙＯｓＰＰＤＫタンパク質または変異ｃｙＯｓＰＰＤＫ ｍＲＮＡを意味するものであってもよい。本発明において粉質胚乳の形質を決定する変異遺伝子はｃｙＯｓＰＰＤＫ、Ｎａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２、ＦＬＯ７またはＦＬＯ４－４と命名され、前記名称は、相互交換的に称されてもよい。
【0041】
本発明のｃｙＯｓＰＰＤＫ遺伝子は、配列番号２で示され、ＧｅｎＢａｎｋに寄託され、登録番号ＭＧ２６７０５８と表示される。
【0042】
本発明のｃｙＯｓＰＰＤＫ遺伝子の位置は、ＲＡＰ－ＤＢ（Rice Annotation Project Database、http://rapdb.dna.affrc.go.jp/viewer/gbrowse/irgsp1/?name=chr02%3A1..105000）を基礎にその位置を示すことができる。本発明のｃｙＯｓＰＰＤＫ遺伝子座は、ＢＡＣクローンＯＳＪＮＢｂ０００６Ｊ１２とＯＪ１１７４＿Ｈ１１の間に存在し、粉質胚乳の特性は変異ｃｙＯｓＰＰＤＫ遺伝子のエクソン８にある一塩基多型（Ｇ→ Ａ）により決定される。
【0043】
前記一塩基多型は、稲の標準ゲノム（IRGSP 1.0）と比較して示すと、稲の標準ゲノム（IRGSP 1.0）において５番染色体の１９，７２２，２５４ｂｐに対応する位置に存在し、これは配列番号１の遺伝子配列において４０５５番目の塩基と相応する位置である。
【0044】
本発明において、用語「遺伝子」とは、形質を決定する因子として遺伝情報の単位を意味するもので、タンパク質を暗号化する核酸分子またはポリヌクレオチドとも称されてもよい。本発明の遺伝子は、前記した配列番号２の塩基配列と実質的な相同性を有する塩基配列を含むことができる。前記の実質的な相同性は、上述した本発明の塩基配列と、任意の他の配列を最大限に対応するようにアラインし、当業界において通常的に利用されるプログラム（例えば、ＤＮＡＳＩＳ及びＣｌｕｓｔａｌＸ）を利用してアラインされた配列を分析した場合に、本発明の遺伝子に存在する一塩基多型を含みながら、少なくとも８０％の相同性、より好ましくは少なくとも９０％の相同性、最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を示す塩基配列を意味する。
【0045】
本発明の他の態様によると、本発明は、前記遺伝子を含む組み換えベクターを提供する。本発明のベクターシステムは、当業界において公知となった様々な方法を通じて構築されることができ、これに対する具体的な方法は、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001）（非特許文献１）に開示されており、この文献は、本明細書に参照として挿入される。
【0046】
本発明のベクターは、典型的にクローニングのためのベクターまたは発現のためのベクターとして構築することができる。また、本発明のベクターは、原核細胞または真核細胞を宿主にして構築されてもよい。
【0047】
本発明において、前記ベクターは、外来遺伝子が導入された植物体内で永久に発現させることができる形質転換用バイナリーベクターであり、プロモーターの下流（downstream）に目的タンパク質をコードする遺伝子を作動可能に連結させて製造されたベクターであってもよい。
【0048】
本発明に係るベクターとしては、タンパク質の発現に使用される従来のベクターを基本骨格とし、本発明のプロモーターを挿入し、前記プロモーターの下流（downstream)側に目的タンパク質をコードする塩基配列（遺伝子）を挿入することにより製造することができる。前記組換えベクターは、目的遺伝子の発現のために、特定のプロモーターを含むことができる。
【0049】
本発明の他の態様によると、本発明は、前記遺伝子またはベクターを含む形質転換体を提供する。
【0050】
本発明における用語「形質転換体」とは、遺伝子工学的な方法で本発明の遺伝子が外来遺伝子として宿主に挿入された以外に、本発明の遺伝子により決定される粉質胚乳の形質を含む子孫個体を育種するために、本発明の遺伝子を含む個体を少なくとも一つと、他の個体を交配して本発明の遺伝子を有するようになった後代系統の個体も含む意味である。
【0051】
本発明の形質転換体を製造するために、当業界において一般的に公知の方法により実施することができる。
【0052】
本発明の好ましい具現例によれば、前記形質転換体は植物体であり、さらに好ましくは稲であってもよい。
【0053】
したがって、このような側面で、本発明は、変異ｃｙＯｓＰＰＤＫ遺伝子；または配列番号２の配列を有する稲を提供することができる。
【0054】
本発明の一具体例において、稲の粉質胚乳の形質を決定する遺伝子が変異ｃｙＯｓＰＰＤＫであり、粉質胚乳の特性は変異ｃｙＯｓＰＰＤＫ遺伝子のエクソン８にある一塩基多型（Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ）により決定されることを確認した。
【0055】
このような側面で、本発明は、他の態様により、本発明の粉質胚乳の形質を決定する新規な配列の遺伝子に対する一塩基多型を提供する。
【0056】
具体的には、稲の標準ゲノム（IRGSP 1.0）の情報に基づいて５番染色体に位置する候補遺伝子ＰＰＤＫ１（Pyruvate、phosphate dikinase1）の転写体の情報を基礎に、ＯＳ０５Ｇ０４０５０００－０２（１９，７１８，５３８－１９，７３７，６０５ｂｐ）の塩基配列に基づいてナミル稲と本発明のＦＬＯ４－４（Ｎａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２）のＰＰＤＫ１内１９，７１８，７８５－１９，７２６，３４０（７，５５６ｂｐ）の塩基配列を分析し、標準のゲノムであるＮｉｐｐｏｎｂａｒｅ（IRGSP 1.0）と比較した結果、ナミル稲とＮａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２との間には１つのＳＮＰが探索され、前記ＳＮＰは、稲の標準ゲノム（IRGSP 1.0）において５番染色体の１９，７２２，２５４ｂｐに対応する位置に存在し、これは配列番号１（ナミル稲由来のポリヌクレオチド配列、ｃｈ５：１９，７２６，３４０－１９，７１８，７８５）または配列番号２の配列において４０５５番目の塩基、配列番号９の４０９３番目の塩基に相応する。
【0057】
より具体的には、前記稲の標準ゲノム（IRGSP 1.0）において５番染色体の１９，７２２，２５４ｂｐに対応する位置に存在するＳＮＰマーカーは塩基がＡであってもよい。より具体的には、前記配列番号１のポリヌクレオチド配列において４０５５番目の位置； 配列番号９のポリヌクレオチド配列において４０９３番目の位置に存在するＧがＡで置換されることであり、これにより、前記遺伝子によりコードされるが、タンパク質の配列においてアミノ酸Ｇｌｙｃｉｎｅ（Ｇｌｙ、Ｇ）がＡｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ（Ａｓｐ、Ｄ）に変異され、粉質胚乳の形質を示すようにする。
【0058】
したがって、前記一塩基多型は、前記配列番号１で示されるポリヌクレオチド配列の４０５５番目の位置のＧがＡまたは配列番号９で示されるポリヌクレオチド配列の４０９３番目の位置のＧがＡであってもよい。
【0059】
本発明で使用される用語、「一塩基多型（Single Nucleotide polymorphism、SNP）」とは、一つの遺伝子座（locus）に、二つ以上の対立遺伝子（allele）が存在する場合を「多型」といい、前記多型部位の中で、単一の塩基のみが異なることを一塩基多型という。また、前記用語、「対立遺伝子（allele）」とは、相同染色体の同一な遺伝子座に存在する一つの遺伝子の様々な形態をいい、ＳＮＰは二種類の対立遺伝子（biallele）を有する。
【0060】
前記本発明の一塩基多型を粉質胚乳の特性を判別するのに使用することができるという側面で、本発明は、他の態様により、稲の標準ゲノム（IRGSP 1.0）において５番染色体の１９，７２２，２５４ｂｐに対応する位置に存在する一塩基多型（SNP）マーカーを検出することができる製剤を含む、請求項１の遺伝子による粉質胚乳形質判別用組成物を提供する。
【0061】
本発明に係る粉質胚乳の特性判別用組成物は、ジャポニカ（Japonica）系統を含むすべての稲の品種の粉質胚乳の特性を判別するために使用することができ、一具現例として、ナミル突然変異後代系統Ｎａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２の粉質胚乳を判別することができるが、これらに限定されるものではない。また、前記組成物は、二つ以上の稲の品種間の交雑による後代系統にも適用することができるだけでなく、前述した稲の品種を主原料として製造された加工生産品も拡張して適用することができる。
【0062】
前記一塩基多型を検出することができる製剤は、稲の標準ゲノム（IRGSP 1.0）において５番染色体の１９，７２２，２５４ｂｐに対応する位置の塩基を含む１０個～３００個の連続した核酸配列からなるポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするプローブ；またはこれを増幅することができるプライマーであってもよい。
【0063】
本発明で使用される用語、「プライマー」とは、短い自由３末端水酸化基（free 3’hydroxyl group）を有する塩基配列で相補的な鋳型（template）と塩基対（base pair）を形成することができ、鋳型鎖のコピーのための出発点としての機能をする短配列を意味する。プライマーの適切な長さは、使用目的に応じて変わり得るが、一般的に１５～３０個の塩基で構成される。プライマー配列は、鋳型と完全に相補的である必要はないが、鋳型とハイブリダイズする程度に十分に相補的でなければならない。前記プライマーは、多型部位を含むＤＮＡ配列にハイブリダイズし、多型部位を含むＤＮＡ断片を増幅させることができる。
【0064】
本発明の目的上、前記プライマーは粉質胚乳の特性と密接な関連性を示す一塩基多型部位を増幅させ、例えば、配列番号３で示される正方向プライマー及び配列番号４で示される逆方向プライマーからなるプライマーセット；または配列番号５で示される外部正方向プライマー、配列番号６で示される外部逆方向プライマー、配列番号７で示される内部正方向プライマー、及び配列番号８で示される内部逆方向プライマーからなるプライマーセットであってもよいが、これらに制限されるものではない。
【0065】
または、前記一塩基多型を検出することができる製剤は、配列番号１または配列番号２で示されるポリヌクレオチド配列の４０５５番目の位置、または配列番号９で示されるポリヌクレオチド配列の４０９３番目の位置に存在する、一塩基多型部位を含む１０個～３００個の連続した核酸配列からなるポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするプローブ；またはこれを増幅するプライマーであってもよい。
【0066】
本発明の一具現例により、前記製剤は、配列番号３で示される正方向プライマー及び配列番号４で示される逆方向プライマーからなるプライマーセット；または配列番号５で示される外部正方向プライマー、配列番号６で示される外部逆方向プライマー、配列番号７で示される内部正方向プライマー、及び配列番号８で示される内部逆方向プライマーからなるプライマーセットであってもよい。
【0067】
または、前記プライマーセットは、好ましくは、配列番号３及び配列番号４で示されるそれぞれの塩基配列と好ましくは８０％以上の配列相同性、より好ましく９０％以上の配列相同性、さらに好ましく９５％以上の配列相同性、最も好ましくは９９％以上の配列相同性を有するいずれか一つの塩基配列からなってもよいが、前述した一塩基多型の部位を増幅させることができれば、制限なく含むことができる。
【0068】
前記プライマーセットは、好ましくは配列番号５～配列番号８で示されるそれぞれの塩基配列と、好ましくは８０％以上の配列相同性、より好ましく９０％以上の配列相同性、さらに好ましくは９５％の以上の配列相同性、最も好ましくは９９％以上の配列相同性を有するいずれか一つの塩基配列からなってもよいが、前述した一塩基多型の部位を増幅させることができれば、制限なく含むことができる。
【0069】
本発明のプライマーまたはプローブは、ホスホロアミダイト固体支持体方法、またはその他の広く公知となった方法を使用して化学的に合成することができる。このような核酸配列は、また、当該分野において公知となった多くの手段を利用して変形させることができる。前記変形の非限定的な例としては、メチル化、キャップ化、天然ヌクレオチド一つ以上の同族体への置換、及びヌクレオチド間の変形、例えば、荷電されない連結体（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミダイト、カルバメートなど）または荷電された連結体（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）への変形がある。
【0070】
また、本発明は、他の態様により、前記粉質胚乳形質判別用組成物を含む稲の粉質胚乳の形質を決定するｃｙＯｓＰＰＤＫ（cytosolic pyruvate orthophosphate dikinase）遺伝子による粉質胚乳形質判別用キットを提供する。
【0071】
本発明に係るキットは、前記組成物以外にも、ＰＣＲ反応を容易に遂行させるＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、及びＰＣＲ緩衝溶液をさらに含むことができ、これだけでなく、ＰＣＲ産物の増幅有無を確認することができる電気泳動の遂行に必要な構成成分、または公知となった品種に対する同定基準表が、本発明のキットにさらに含まれてもよい。また、前記キットは、プローブによる反応を効果的に遂行するための公知の構成をさらに含むことができる。
【0072】
また、本発明は、他の態様により、稲の標準ゲノム（IRGSP 1.0）において５番染色体の１９，７２２，２５４ｂｐに対応する位置に存在する一塩基多型（SNP）マーカーを確認することを含む請求項１の遺伝子による粉質胚乳形質判別方法を提供する。
【0073】
前記一塩基多型は、配列番号１または配列番号２で示されるポリヌクレオチド配列の４０５５番目の位置；または配列番号９で示されるポリヌクレオチド配列の４０９３番目の位置に存在するものであってもよい。
【0074】
本発明の粉質胚乳の特性判別方法は、上述した粉質胚乳特性判別用組成物において記述した構成成分を利用するため、この両者間に共通の内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。
【0075】
前記多型部位の塩基は、試料から分離された核酸試料から、一塩基多型マーカーの多型部位を増幅したり、一塩基多型マーカーを検出することができるプローブとハイブリダイズして多型部位の塩基を確認することができる。
【0076】
例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写増幅（transcription amplification）、自己保持配列複製及び核酸に基づいた配列増幅（ＮＡＳＢＡ）を利用して多型部位を増幅することができる。
【0077】
多型部位の塩基の確認は、シーケンス分析、マイクロアレイ（microarray）によるハイブリダイズ、対立遺伝子特異的なＰＣＲ（allele specific PCR）、ダイナミック対立遺伝子ハイブリダイゼーション（dynamic allele-specific hybridization、DASH）、ＰＣＲ延長分析、ＳＳＣＰ 、ＰＣＲ－ＲＦＬＰ分析、ＴａｑＭａｎ技法、ＳＮＰｌｅｘプラットフォーム（Applied Biosystems）、質量分析法（例えば、SequenomのMassARRAYシステム）、ミニシーケンシング（mini-sequencing）方法、Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘシステム（BioRad）、ＣＥＱ及びＳＮＰｓｔｒｅａｍシステム（Beckman）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｐｒｏｂｅアレイ技術（例えば、Affymetrix GeneChip）、及びＢｅａｄＣｈｉｐ（IlluminaのHumanOmni2.5-8）などを含むが、これに限定されない。例えば、ＳＮＰチップを利用して多型部位の塩基を確認することができる。ＳＮＰチップは、数十万個のＳＮＰの各塩基を一度に確認することができるＤＮＡマイクロアレイの一つを意味する。
【0078】
シーケンス分析は、塩基配列の決定のための通常の方法を使用することができ、自動化された遺伝子分析機器を利用して遂行することができる。また、対立遺伝子特異的ＰＣＲは、ＳＮＰが位置する塩基を３’末端にして考案したプライマーを含むプライマーセットで前記ＳＮＰが位置するＤＮＡ断片を増幅するＰＣＲ方法を意味する。前記方法の原理は、例えば、特定の塩基がＧからＡに置換された場合、前記Ｇを３’末端塩基として含むプライマー及び適当な大きさのＤＮＡ断片を増幅することができる逆方向プライマーを考案してＰＣＲ反応を行う場合、前記ＳＮＰ位置の塩基がＧである場合には、増幅反応が正常に行われて目的とする位置のバンドが観察され、前記塩基がＡで置換された場合には、プライマーは、鋳型ＤＮＡに相補結合することができるが、３’末端の方が相補結合を行わないことにより、増幅反応が適切に行われない点を用いたことである。ＤＡＳＨは、常法で実行することができ、好ましくは、プリンスなどによる方法により行うことができる。
【0079】
ＰＣＲ延長分析は、まず、一塩基多型が位置する塩基を含むＤＮＡ断片をプライマー対で増幅を行った後、反応に添加されたすべてのヌクレオチドを脱リン酸化することにより不活性化させ、これにＳＮＰ特異的延長プライマー、ｄＮＴＰ混合物、ジデオキシヌクレオチド、反応緩衝液及びＤＮＡポリメラーゼを添加してプライマー延長反応を遂行することにより行われる。このとき、延長プライマーは、ＳＮＰが位置する塩基の５’方向にすぐに隣接した塩基を３’末端とし、ｄＮＴＰ混合物には、ジデオキシヌクレオチドと同一な塩基を有する核酸が除外され、前記ジデオキシヌクレオチドはＳＮＰを示す塩基の種類中の一つから選択される。例えば、ＡからＧへの置換がある場合、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、及びＴＴＰの混合物とｄｄＡＴＰを反応に添加する場合、前記置換が起こった塩基においてプライマーは、ＤＮＡポリメラーゼにより延長され、いくつかの塩基が過ぎた後、Ａ塩基が最初に現れる位置においてｄｄＡＴＰによりプライマー延長反応が終結される。もし前記置換が起こらなかったら、その位置で延長反応が終結するため、前記延長されたプライマーの長さを比較することにより、ＳＮＰを示す塩基の種類を判別することができるようになる。
【0080】
このとき、検出方法としては、延長プライマーまたはジデオキシヌクレオチドを蛍光標識した場合には、一般的な塩基配列の決定に使用される遺伝子分析機器（例えば、ＡＢＩ社のＭｏｄｅｌ ３７００など）を使用して蛍光を検出することにより、前記ＳＮＰを検出することができ、無標識の延長プライマー及びジデオキシヌクレオチドを使用する場合には、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ（matrix assisted laser desorption ionization-time of flight）技法を用いて分子量を測定することにより、前記ＳＮＰを検出することができる。
【0081】
本発明の一具現例として、前記粉質胚乳形質判別方法は、（ａ）試料から分離されたゲノムＤＮＡを鋳型として、稲の標準ゲノム（IRGSP 1.0）において５番染色体の１９，７２２，２５４ｂｐに対応する位置の塩基を含む１０個～３００個の連続した核酸配列からなるポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドを増幅することができるプライマーを用いてＰＣＲを行うこと；及び（ｂ）前記ＰＣＲにより増幅された反応物を確認することをさらに含み、試料個体の粉質胚乳の形質有無を判別することができる。前記ＰＣＲ反応物がｃｙＯｓＰＰＤＫ遺伝子を有する個体（Ｎａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２）と同一な結果を示すと、前記試料の植物個体は粉質胚乳特性を有すると言える。
【0082】
または、本発明の他の具現例として、前記粉質胚乳形質判別方法は、（ａ’）試料から分離されたゲノムＤＮＡを鋳型として、稲の標準ゲノム（IRGSP 1.0）において５番染色体の１９，７２２，２５４ｂｐに対応する位置の塩基を含む１０個～３００個の連続した核酸配列からなるポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするプローブで反応させることをさらに含むことができる。
【0083】
前記粉質胚乳形質判別方法は、前記（ｂ）の増幅された産物に制限酵素を処理することをさらに含むことができる。より具体的には、前記制限酵素は、Ｈｉｎｆ Ｉであってもよい。前記制限酵素処理により、ＰＣＲ増幅された反応物が２つ以上の断片に切断された場合、粉質胚乳の特性を有すると分離することができる。しかし、これは、プライマーの設計特性に応じて、制限酵素の種類及びそれに伴う反応様相が変わることがある。
【0084】
本発明の一具現例として、前記（ａ）において一塩基多型を検出することができる製剤は、配列番号３で示される正方向プライマー及び配列番号４で示される逆方向プライマーからなるプライマーセット；または配列番号５で示される外部正方向プライマー、配列番号６で示される外部逆方向プライマー、配列番号７で示される内部正方向プライマー、及び配列番号８で示される内部逆方向プライマーからなるプライマーセットであってもよい。
【0085】
本発明において、試料はジャポニカ（Japonica）系統を含むすべての稲の品種（候補品種）、または、ナミル突然変異後代系統Ｎａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２から得ることができ、これだけでなく、前述した稲の品種を主原料として製造された加工製品からも得ることができる。
【0086】
本発明において、試料から分離されたゲノムＤＮＡは、当業界において通常に使用されるＳＤＳ抽出法、ＣＴＡＢ分離法（Cetyl trimethyl Ammonium Bromide）、または商業的に販売されるＤＮＡ抽出キットを用いて得ることができる。
【0087】
本発明におけるＰＣＲは、ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ、ｑＲＴ－ＰＣＲまたはｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲからなる群から選択されるいずれか一つで遂行することができるが、候補品種または試料内に、前述した一塩基多型部位を増幅することができる方法であれば、制限なく含むことができる。これと共に、前記ＰＣＲ産物に制限酵素を追加で処理することができ、ここで、前記制限酵素は、Ｈｉｎｆ Ｉであってもよいが、これに制限されるものではない。
【0088】
本発明におけるＰＣＲにより増幅された産物を確認する段階は、ＤＮＡチップ、ゲル電気泳動、放射性の測定、蛍光測定、または燐光測定を通じて行うことができるが、これに限定されない。増幅産物を検出する方法の一つとして、ゲル電気泳動を行うことができ、ゲル電気泳動は、増幅産物のサイズに応じてアガロースゲル電気泳動またはアクリルイミドゲル電気泳動を利用することができる。
【0089】
以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかし、下記実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記実施例により、本発明の内容が限定されるものではない。
【実施例】
【0090】
[準備例]実験準備及び方法
準備例１．実験植物体及び材料
ナミル稲及び粉質胚乳の特性を有するＮａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２のＤＮＡは、それぞれの若い葉を採取した後、ＣＴＡＢ（Cetyltrimethyl ammonium bromide）方法（Murray&Thomason、1980）を利用して抽出した。抽出されたＤＮＡは、０．８％ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ電気泳動を通じて確認し、ＮａｎｏＤｒｏｐ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Thermo Fisher Scientific、USA）を用いて定量した後、５ｎｇ／μｌで希釈してＰＣＲに用いた。
準備例１．実験植物体及び材料
ナミル稲及び粉質胚乳の特性を有するＮａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２のＤＮＡは、それぞれの若い葉を採取した後、ＣＴＡＢ（Cetyltrimethyl ammonium bromide）方法（Murray&Thomason、1980）を利用して抽出した。抽出されたＤＮＡは、０．８％ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ電気泳動を通じて確認し、ＮａｎｏＤｒｏｐ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Thermo Fisher Scientific、USA）を用いて定量した後、５ｎｇ／μｌで希釈してＰＣＲに用いた。
【0091】
Ｎａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２／密陽２３のＦ２母集団と親系統は、釜山大学の実験地域で栽培され、粉質胚乳遺伝子の精密遺伝子地図のためにＦ3:4ファミリー群を製造した。メーカーの指示に従ってＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｐｌａｎｔ ＩＩキット（MACHEREY-NAGEL GmbH&Co.KG、Germany）を使用してすべての遺伝子型の新鮮な葉から全ゲノムＤＮＡを抽出した。
【0092】
準備例２．再シーケンシング及び分子マーカーの開発
Ｎａｍｉｌ（ＳＡ）－ｆｌｏ２と密陽２３の全ゲノムは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２５００シーケンスシステムプラットフォーム（Illumina Inc. USA）を使用し、平均７５倍のカバレッジで再シーケンシングされた。ロー（raw）配列リード（read)を稲の標準ゲノム(IRGSP 1.0）に対して整列した（Kawahara et al., 2013）。粉質胚乳に関連する遺伝子地図を作成するために、欠損値（missing value）のないＳＮＰ、対立遺伝子型頻度（MAF:minor allele frequency）＞０．０５、両親配列に対する遺伝子型コール（genotype call）が使用された。標的部位を小さくするために、Ｏｌｉｇｏ７．０ソフトウェアを利用してＳＮＰを選択し、８個の切断増幅された多型配列（CAPS:amplified polymorphic sequence）マーカーを開発した。
Ｎａｍｉｌ（ＳＡ）－ｆｌｏ２と密陽２３の全ゲノムは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２５００シーケンスシステムプラットフォーム（Illumina Inc. USA）を使用し、平均７５倍のカバレッジで再シーケンシングされた。ロー（raw）配列リード（read)を稲の標準ゲノム(IRGSP 1.0）に対して整列した（Kawahara et al., 2013）。粉質胚乳に関連する遺伝子地図を作成するために、欠損値（missing value）のないＳＮＰ、対立遺伝子型頻度（MAF:minor allele frequency）＞０．０５、両親配列に対する遺伝子型コール（genotype call）が使用された。標的部位を小さくするために、Ｏｌｉｇｏ７．０ソフトウェアを利用してＳＮＰを選択し、８個の切断増幅された多型配列（CAPS:amplified polymorphic sequence）マーカーを開発した。
【0093】
準備例３．精巧な粉質胚乳決定遺伝子地図の作成
候補領域を見つけるために、ＲＭ１８６２４とＲＭ１８６３９との間のゲノム領域がヘテロであるＦ２世代をＦ３世代に成長させた。次に、Ｆ３植物体を自己交配させ、Ｆ3:4種子を得た。父母系統と、ランダムに選ばれた９６個のＦ3:4組換え体の皮をむいて、胚乳を肉眼で検査し、８個のＣＡＰＳマーカーで遺伝子型を確認した。当該領域のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と、当該領域における機能性は、ＭＳＵ Ｒｉｃｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｒｉｃｅ．ｐｌａｎｔ ｂｉｏｌｏ ｇｙ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／）に開示されている。
候補領域を見つけるために、ＲＭ１８６２４とＲＭ１８６３９との間のゲノム領域がヘテロであるＦ２世代をＦ３世代に成長させた。次に、Ｆ３植物体を自己交配させ、Ｆ3:4種子を得た。父母系統と、ランダムに選ばれた９６個のＦ3:4組換え体の皮をむいて、胚乳を肉眼で検査し、８個のＣＡＰＳマーカーで遺伝子型を確認した。当該領域のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と、当該領域における機能性は、ＭＳＵ Ｒｉｃｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｒｉｃｅ．ｐｌａｎｔ ｂｉｏｌｏ ｇｙ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／）に開示されている。
【0094】
ＰＣＲは、１０ｎｇのＤＮＡ鋳型、１０ｐｍｏｌの各プライマー、１ｘＰＣＲバッファ［５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、及び１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2］、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、１ｕｎｉｔのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Nurotics、Korea）１ｕｎｉｔを含む２０－μｌ（体積）の溶液で行われた。ＰＣＲは、以下の条件でＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＰＴＣ－１００ ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Waltham、MA、USA）で行った：９４℃で５分間の初期変性、９４℃で３０秒間の変性３６サイクル、５８℃での３０秒間のアニーリング、及び１分間７２℃で伸長と１０分間７２℃で最終伸長。ＰＣＲ産物は、制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で切断された。ＣＡＰＳマトを含むＰＣＲ産物の切断はＷａｔＣｕｔプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗａｔｃｕｔ．ｕｗａｔｅｒｌｏｏ．ｃａ／ｔｅｍｐｌａｔｅ．ｐｈｐ？ａｃｔ＝ｓｎｐ＿ｎｅｗ）を使用して探知された。切断産物は、６Ｍ尿素と１Ｘ ＴＡＥを使用して３％ポリアクリルアミドゲルにおいて８０Ｖで分離され、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｍａｇｅｒ（登録商標）Ｇｅｌ Ｄｏｃ（登録商標）ＸＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Bio-Rad Laboratories、Inc. USA）を使用して視覚化した。
【0095】
準備例４．遺伝子クローニング及び変異位置同定
Ｎａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２とナミル（Ｎａｍｉｌ）においてｃｙＯｓＰＰＤＫのコーディング配列をＣＬＣ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｖｉｅｗｅｒ ７を使用して比較した。変異位置を確認するために、ｄＣＡＰＳ Ｆｉｎｄｅｒ ２．０（ｈｔｔｐ：／／ｈｅｌｉｘ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／ｄｃａｐｓ／）を利用して粉質胚乳変異体Ｎａｍｉｌ（ＳＡ）－ｆｌｏ２でＨｉｎｆＩにおいて制限酵素の位置に入れた。
Ｎａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２とナミル（Ｎａｍｉｌ）においてｃｙＯｓＰＰＤＫのコーディング配列をＣＬＣ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｖｉｅｗｅｒ ７を使用して比較した。変異位置を確認するために、ｄＣＡＰＳ Ｆｉｎｄｅｒ ２．０（ｈｔｔｐ：／／ｈｅｌｉｘ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／ｄｃａｐｓ／）を利用して粉質胚乳変異体Ｎａｍｉｌ（ＳＡ）－ｆｌｏ２でＨｉｎｆＩにおいて制限酵素の位置に入れた。
【0096】
突然変異部位を含有する１６１ｂｐ断片をＮａｍｉｌ（ＳＡ）－ｆｌｏ２及びナミルからプライマーＦ（ＣＣＣＡＧＧＴＧＡＴＧＣＡＧＧＴＧＡＧ；配列番号３２）及びＲ（ＧＣＡＣＡＧＧＴＣＴＴＧＧＡＣＡＴＴＧＣ；配列番号３３）を使用してＰＣＲ増幅させた。ＰＣＲ産物は、５μｌのＰＣＲ産物、１．５μｌの１０Ｘ ＮＥＢｕｆｆｅｒ、０．５μｌＨｉｎｆＩ及び８μｌの超純水を含む１５μｌ（体積）溶液上でＨｉｎｆＩ（New England Biolabs）で切断され、３７℃で２時間培養された。切断産物は、４％アガロースゲルで分離した。ｄＣＡＰＳマーカーはＦ3:4ファミリーと、それぞれの胚乳表現型を有する４８種の韓国系稲品種の同時－分離分析にも使用された。日本晴（Nipponbare）のｃｙＯｓＰＰＤＫ遺伝子配列に基づいて設計されたプライマーを使用して３つの重畳された部分でＣｙＯｓＰＰＤＫ遺伝子の完全なゲノムＤＮＡがクローニングされた。
【0097】
【表1】
【0098】
準備例５．全ＲＮＡ分離及びｑＲＴ－ＰＣＲ分析
ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉキット（QIAGEN、Hilden、Germany）を使用して開花１０日後（ＤＡＦ）、ナミル及びＮａｍｉｌ（ＳＡ）－ｆｌｏ２の米粒から全ＲＮＡを分離した。ＤＮａｓｅ Ｉ（QIAGEN、Hilden、Germany）でゲノムＤＮＡを除去し、ＲＮＡ ｔｏ ｃＤＮＡ ＥｃｏＤｒｙ Ｐｒｅｍｉｘキット（Clontech、Mountain View、CA、USA）を使用して逆転写を行った。
ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉキット（QIAGEN、Hilden、Germany）を使用して開花１０日後（ＤＡＦ）、ナミル及びＮａｍｉｌ（ＳＡ）－ｆｌｏ２の米粒から全ＲＮＡを分離した。ＤＮａｓｅ Ｉ（QIAGEN、Hilden、Germany）でゲノムＤＮＡを除去し、ＲＮＡ ｔｏ ｃＤＮＡ ＥｃｏＤｒｙ Ｐｒｅｍｉｘキット（Clontech、Mountain View、CA、USA）を使用して逆転写を行った。
【0099】
ｑＲＴ－ＰＣＲは、Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ Ｑ装備（QIAGEN、Hilden、Germany）を有するＱｕａｎｔｉＮｏｖａ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＲＴ－ＰＣＲキット（QIAGEN、Hilden、Germany）を使用し、次のＰＣＲ条件で行われた。９５℃で１０分間後、９５℃で１０秒間（４０サイクル）、６０℃で２０秒間。フォールド変化は、ナミルに対して相対的に算出した。フォールド変化は、三回の反復実験の平均±標準偏差を示し、稲のＡｃｔｉｎ １（ＯｓＡＣＴ１；Ｏｓ０３ｇ０７１８１５０）が内部対照群として使用された。ｑＲＴ－ＰＣＲプライマー（ｑＯｓＰＰＤＫＢ）は ＦＬＯ４－４のコーディング配列に基づいて設計され、表１のプライマーを使用した。
【0100】
実験例１．粉質胚乳形質を決定する遺伝子の究明
実験例１－１．粉質胚乳に関連する遺伝子座の地図
準備例において再シーケンスされたＮａｍｉｌ（ＳＡ）－ｆｌｏ２の全ゲノムをインディカ栽培種の密陽２３を参照としてアラインした。すべての標的領域において合計２，６０４個のＳＮＰが確認された。ＲＭ１８６２４とＲＭ１８６３９の間のゲノム配列をテンプレートとして使用し、８個のＣＡＰＳマーカーを設計し（表２）、Ｆ3:4組換えファミリーに由来する６０個の粉質胚乳個体と３６個の正常個体を、遺伝子型分析に使用した。前記組換え体の遺伝子型とそれらの子孫の表現型の間に様々な比較を行った。
実験例１－１．粉質胚乳に関連する遺伝子座の地図
準備例において再シーケンスされたＮａｍｉｌ（ＳＡ）－ｆｌｏ２の全ゲノムをインディカ栽培種の密陽２３を参照としてアラインした。すべての標的領域において合計２，６０４個のＳＮＰが確認された。ＲＭ１８６２４とＲＭ１８６３９の間のゲノム配列をテンプレートとして使用し、８個のＣＡＰＳマーカーを設計し（表２）、Ｆ3:4組換えファミリーに由来する６０個の粉質胚乳個体と３６個の正常個体を、遺伝子型分析に使用した。前記組換え体の遺伝子型とそれらの子孫の表現型の間に様々な比較を行った。
【0101】
【表2】
【0102】
本発明の粉質胚乳に関連する候補遺伝子は、劣性遺伝子により調節されることが確認されたため、もし粉質胚乳個体のＣＡＰＳマーカー遺伝子型が密陽２３または異型接合体遺伝子型と一致すれば、前記ＣＡＰＳマーカー隣接領域は標的遺伝子の位置ではないと判断した。また、野生型胚乳を有する個体の中で、ＣＡＰＳマーカー遺伝子型がＮａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２と同一であれば、当該遺伝子の位置も標的遺伝子の位置ではないと判断した。
【0103】
図１ａ及び図１ｂに示すように、ＣＡＰＳ ５－８に対してヘテロ遺伝子型と粉質胚乳を有する個体；とＣＡＰＳ １－４に対してＮａｍｉｌ（ＳＡ）－ｆｌｏ２遺伝子型と正常胚乳を有する個体が同定された。標的領域をＣＡＰＳ ８マーカーとＲＭ１８６３９と両端を表示した３３ｋｂの領域においてＢＡＣクローンＯＪ１１７４＿Ｈ１１とＯＳＪＮＢｂ０００６Ｊ１２と地図上に表示した。
【0104】
実験例１－２．粉質胚乳に対する候補遺伝子の分析
ＲＡＰ－ＤＢ（Ｒｉｃｅ Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｄａｔａｂａｓｅ、ｈｔｔｐ：／／ｒａｐｄｂ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／ｖｉｅｗｅｒ／ｇｂｒｏｗｓｅ／ｉｒｇｓｐ１／？ｎａｍｅ＝ｃｈｒ０２％３Ａ１．．１０５０００）に基づいて、前記３３ｋｂの領域において４個の遺伝子を標的遺伝子の候補として予測した（図２ａ）。このうち、Ｏｓ０５ｇ０４０４５００が仮説のタンパク質（ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ）を暗号化すること、Ｏｓ０５ｇ０４０４７００はメチル結合タンパク質遺伝子ＭＢＤ１と同様の機能遺伝子であり、Ｏｓ０５ｇ０４０４９０１は保存された仮説のタンパク質をコードし、Ｏｓ０５ｇ０４０５０００はＰＰＤＫ遺伝子であった。
ＲＡＰ－ＤＢ（Ｒｉｃｅ Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｄａｔａｂａｓｅ、ｈｔｔｐ：／／ｒａｐｄｂ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／ｖｉｅｗｅｒ／ｇｂｒｏｗｓｅ／ｉｒｇｓｐ１／？ｎａｍｅ＝ｃｈｒ０２％３Ａ１．．１０５０００）に基づいて、前記３３ｋｂの領域において４個の遺伝子を標的遺伝子の候補として予測した（図２ａ）。このうち、Ｏｓ０５ｇ０４０４５００が仮説のタンパク質（ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ）を暗号化すること、Ｏｓ０５ｇ０４０４７００はメチル結合タンパク質遺伝子ＭＢＤ１と同様の機能遺伝子であり、Ｏｓ０５ｇ０４０４９０１は保存された仮説のタンパク質をコードし、Ｏｓ０５ｇ０４０５０００はＰＰＤＫ遺伝子であった。
【0105】
Ｎａｍｉｌ（ＳＡ）－ｆｌｏ２において４つの候補遺伝子と野生型ＮａｍｉｌのシーケンスにおいてＰＰＤＫのエクソン８からＧ／Ａ ＳＮＰが確認された（図１ｂの（Ｂ））。稲の登熟期に種子からＰＰＤＫの転写体類型を分析するために、Ｎａｍｉｌ（ＳＡ）－ｆｌｏ２とＮａｍｉｌのＰＰＤＫをＰＦ２／ＰＲ３（ｃｙＯｓＰＰＤＫ）とＰＦ３／ＰＲ３（ｃｈＯｓＰＰＤＫ）プライマーの組み合わせ（Kang et al. 2005）と、さらに、表１の３個のプライマー対を用いて配列を確認した。
【0106】
Ｎａｍｉｌ（ＳＡ）－ｆｌｏ２とＮａｍｉｌのｃｙＯｓＰＰＤＫ塩基配列を日本晴（Nipponbare）の塩基配列と比較した結果、Ｎａｍｉｌ（ＳＡ）－ｆｌｏ２間のコーディング領域のＳＮＰを除いては、イントロン領域に９個のＳＮＰ；とイントロン領域及び同質性突然変異を有するコーディング領域の２個のＳＮＰから６個のＩｎＤｅｌ（挿入及び欠失）が探索された。本発明に係る新たな配列の劣性粉質胚乳に関連する遺伝子をＦＬＯｕｒｙ４－４（ＦＬＯ４－４）と命名した。Ｎａｍｉｌ（ＳＡ）－ｆｌｏ２及びＮａｍｉｌのＦＬＯ４－４の全長コーディング配列はＧｅｎＢａｎｋに寄託し、それぞれＭＧ２６７０５８及びＭＧ２６７０５６の登録番号が付与された。
【0107】
【表3】
【0108】
実験例１－３．粉質胚乳に関連する遺伝子の発現特性分析
ｄＣＡＰＳマーカーを使用してＮａｍｉｌ（ＳＡ）－ｆｌｏ２とナミル（Ｎａｍｉｌ）（Mo et al, 2013）の交配による９４個のＦ２試料において粉質稲（grain）の比率変化に対するＦＬＯ４－４遺伝子の影響を確認した。
ｄＣＡＰＳマーカーを使用してＮａｍｉｌ（ＳＡ）－ｆｌｏ２とナミル（Ｎａｍｉｌ）（Mo et al, 2013）の交配による９４個のＦ２試料において粉質稲（grain）の比率変化に対するＦＬＯ４－４遺伝子の影響を確認した。
【0109】
ｑＲＴ－ＰＣＲを使用して登熟期の稲からＦＬＯ４－４の転写体の類型を調査した。Ｎａｍｉｌ（ＳＡ）－ｆｌｏ２においてＦＬＯ４－４の相対的な発現レベルがＮａｍｉｌより遥かに高く（図１１）、これは、ＦＬＯ４－４の発現が登熟と関連があり、米粒の粉質感の違いは ＦＬＯ４－４対立遺伝子から起因することを意味する。このような結果をすべて総合すると、ＦＬＯ４－４が稲から粉質胚乳に原因となる遺伝子座（locus）であることを示唆する。
【0110】
実験例２．粉質胚乳の特性に関連する一塩基多型部位の究明
実験例２－１．ナミル稲とＮａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２のＰＰＤＫ１（ＯＳ０５Ｇ０４０５０００－０２）遺伝子の塩基配列の肥料を通じた一塩基多型部位の究明
稲の標準ゲノム（IRGSP 1.0）の情報を基に、５番染色体に位置する候補遺伝子ＰＰＤＫ１（Ｐｙｒｕｖａｔｅ、ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｋｉｎａｓｅ１）の転写体の情報を確認し、ＯＳ０５Ｇ０４０５０００－０２（１９，７１８，５３８－１９，７３７，６０５ｂｐ， ｈｔｔｐ：／／ｅｎｓｅｍｂｌ．ｇｒａｍｅｎｅ．ｏｒｇ／Ｏｒｙｚａ＿ｓａｔｉｖａ／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ／Ｓｕｍｍａｒｙ？ｄｂ＝ｃｏｒｅ；ｇ＝ＯＳ０５Ｇ０４０５０００；ｍｒ＝５：１９７２５８２８－１９７２５８２９；ｒ＝５：１９７１８０００－１９７３３０１４；ｔ＝ＯＳ０５Ｔ０４０５０００－０２；ｔｌ＝ＦＲｐＭＲＦ４ｓｄ５ｃｊＳＫｗａ－７２１８－３３０４４７１）の塩基配列に基づいてシーケンスプライマー（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｐｒｉｍｅｒ）を合成してナミル稲とＮａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２のＰＰＤＫ１内の１９，７１８，７８５－１９，７２６，３４０（７，５５６ｂｐ）の塩基配列を分析した。具体的には、下記表１のプライマーセットを用いて３つの領域に区分してＤＮＡ断片を増幅し、その後、１７個のシーケンスプライマーを用いて塩基配列の分析を行った。
実験例２－１．ナミル稲とＮａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２のＰＰＤＫ１（ＯＳ０５Ｇ０４０５０００－０２）遺伝子の塩基配列の肥料を通じた一塩基多型部位の究明
稲の標準ゲノム（IRGSP 1.0）の情報を基に、５番染色体に位置する候補遺伝子ＰＰＤＫ１（Ｐｙｒｕｖａｔｅ、ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｋｉｎａｓｅ１）の転写体の情報を確認し、ＯＳ０５Ｇ０４０５０００－０２（１９，７１８，５３８－１９，７３７，６０５ｂｐ， ｈｔｔｐ：／／ｅｎｓｅｍｂｌ．ｇｒａｍｅｎｅ．ｏｒｇ／Ｏｒｙｚａ＿ｓａｔｉｖａ／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ／Ｓｕｍｍａｒｙ？ｄｂ＝ｃｏｒｅ；ｇ＝ＯＳ０５Ｇ０４０５０００；ｍｒ＝５：１９７２５８２８－１９７２５８２９；ｒ＝５：１９７１８０００－１９７３３０１４；ｔ＝ＯＳ０５Ｔ０４０５０００－０２；ｔｌ＝ＦＲｐＭＲＦ４ｓｄ５ｃｊＳＫｗａ－７２１８－３３０４４７１）の塩基配列に基づいてシーケンスプライマー（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｐｒｉｍｅｒ）を合成してナミル稲とＮａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２のＰＰＤＫ１内の１９，７１８，７８５－１９，７２６，３４０（７，５５６ｂｐ）の塩基配列を分析した。具体的には、下記表１のプライマーセットを用いて３つの領域に区分してＤＮＡ断片を増幅し、その後、１７個のシーケンスプライマーを用いて塩基配列の分析を行った。
【0111】
ナミル稲とＮａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２のＰＰＤＫ１内のＯＳ０５Ｇ０４０５０００－０２（reverse strand）の対応領域（７，５５６ｂｐ）に対する塩基配列を分析した結果、下記表２に示すように、標準ゲノムであるＮｉｐｐｏｎｂａｒｅ（IRGSP 1.0）と比較してナミル稲は、６個のＩｎＤｅｌと１１個のＳＮＰが探索され、Ｎａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２は６個のＩｎＤｅｌと１２個のＳＮＰが探索され、ナミル稲とＮａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２間には１個のＳＮＰが探索された。
【0112】
また、前記探索された粉質胚乳の特性に関連するＳＮＰは、図１ｂに示すように、ＩＲＧＳＰ標準ゲノムにおいて１９，７２２，２５４ｂｐに該当する位置として、ナミル稲では「Ｇ」、Ｎａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２では「Ａ」であることを確認することができた。これは、ＯＳ０５Ｇ０４０５０００－０２（reverse strand）のアミノ酸配列においてＧｌｙｃｉｎｅ（Ｇｌｙ、Ｇ）からＡｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ（Ａｓｐ、Ｄ）に変更される変異を誘発することが確認できた。
【0113】
実験例２－２．Ｎａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２の粉質胚乳の特性判別用プライマーセットの製作
イ．ｄＣＡＰｓプライマーセットの製作
前記実施例１で究明したＳＮＰに対してｄＣＡＰＳ Ｆｉｎｄｅｒ ２．０（ｈｔｔｐ：／／ｈｅｌｉｘ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／ｄｃａｐｓ／ｄｃａｐｓ．ｈｔｍｌ）を使用してｄＣＡＰｓプライマーを作製した。探索されたＳＮＰ周辺の６０ｂｐの塩基配列情報を活用し、１ｂｐ ｍｉｓｍａｔｃｈプライマーを探索し、それにより図２に示すように、ｄＣＡＰＳ Ｆｉｎｄｅｒ ２．０によりナミル稲のｆｏｒｗａｒｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅを切断する１４個のプライマー、ナミル稲のｒｅｖｅｒｃｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅを切断する７個のプライマーが確認された。また、Ｎａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２のｆｏｒｗａｒｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅを切断するプライマー４個とＮａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２のｒｅｖｅｒｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅを切断する５個のプライマーが探索された。最終的に、下記表３に示すように、粉質胚乳の特性を有するＮａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２の切断が制限酵素（Ｈｉｎｆ Ｉ）との安定した反応で進められるプライマーセットを選定した。
イ．ｄＣＡＰｓプライマーセットの製作
前記実施例１で究明したＳＮＰに対してｄＣＡＰＳ Ｆｉｎｄｅｒ ２．０（ｈｔｔｐ：／／ｈｅｌｉｘ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／ｄｃａｐｓ／ｄｃａｐｓ．ｈｔｍｌ）を使用してｄＣＡＰｓプライマーを作製した。探索されたＳＮＰ周辺の６０ｂｐの塩基配列情報を活用し、１ｂｐ ｍｉｓｍａｔｃｈプライマーを探索し、それにより図２に示すように、ｄＣＡＰＳ Ｆｉｎｄｅｒ ２．０によりナミル稲のｆｏｒｗａｒｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅを切断する１４個のプライマー、ナミル稲のｒｅｖｅｒｃｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅを切断する７個のプライマーが確認された。また、Ｎａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２のｆｏｒｗａｒｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅを切断するプライマー４個とＮａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２のｒｅｖｅｒｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅを切断する５個のプライマーが探索された。最終的に、下記表３に示すように、粉質胚乳の特性を有するＮａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２の切断が制限酵素（Ｈｉｎｆ Ｉ）との安定した反応で進められるプライマーセットを選定した。
【0114】
【表4】
【0115】
ＰＣＲは、１０ｎｇのＤＮＡと５ｐｍｏｌのｆｏｒｗａｒｄ及びｒｅｖｅｒｓｅプライマー、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘ、１Ｘ ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ ［５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2］及び１ｕｎｉｔのＴａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Nurotics、Korea）を用いて総体積２０ｕｌで実施した。ＰＴＣ－１００（登録商標）ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＵＳＡ）を使用して９５℃で５分間の初期変性後、９５℃で２０秒間、６１℃で３０秒間、７２℃で６０秒間、合計３５回繰り返し、７２℃で１０分間反応させた。
【0116】
一方、制限酵素は、５’．．． ＧＡＧＴＣ ．．．３’部位を切断するＨｉｎｆ Ｉを使用し、図３に示すように、ナミル稲は制限酵素により切断されない一方、Ｎａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２はＳＮＰによりＧＡＧＴＣの配列を有するため、前記制限酵素により切断されるように設計した。制限酵素の処理は、１Ｘ ｅｎｚｙｍｅ ｂｕｆｆｅｒ ［５０ｍＭ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ａｃｅｔａｔｅ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ａｃｅｔａｔｅ、１０ｍＭ Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ａｃｅｔａｔｅ、１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ］、１０ｎｇのＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ、５Ｕ Ｈｉｎｆ Ｉ（ＮＥＢ、ＵＫ）を用いて、総体積１５μｌで実施した。ＰＴＣ－１００TM ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＵＳＡ）を使用して、３７℃で１２０分間反応させた。結果物は、ＦＡ（Flagment analyzer）を利用して電気泳動した後、それにより遺伝子型を判定した。
【0117】
その結果、表５及び図４に示すように、Ｎａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２、ナミル稲、及び標準ゲノム（IRGSP 1.0、Nipponbare）は１６１ｂｐが増幅されたが、前記Ｈｉｎｆ Ｉ制限酵素によりＮａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２は１７、１５４ｂｐの形態に切断され、ナミル稲と標準ゲノム（IRGSP 1.0、Nipponbare）は切断されないことが確認できた。
【0118】
【表5】
【0119】
即ち、このような差異を通じて、ナミル突然変異後代系統の粉質胚乳の特性を効果的に判別可能であることが分かった。
【0120】
ロ．Ｔｅｔｒａ－ｐｒｉｍｅｒ ＡＲＭＳプライマーセットの製作
探索されたＳＮＰに対して制限酵素処理の段階を省略することができるプライマーを製作するために、Ｐｒｉｍｅｒ１（Ｐｒｉｍｅｒ Ｄｅｓｉｇｎ ｆｏｒ Ｔｅｔｒａ－Ｐｒｉｍｅｒ ＡＲＭＳ－ＰＣＲ、ｈｔｔｐ：／／ｐｒｉｍｅｒ１．ｓｏｔｏｎ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｉｍｅｒ１ ．ｈｔｍｌ）サービスを利用してＴｅｔｒａ－Ｐｒｉｍｅｒ ＡＲＭＳ－ＰＣＲプライマーを開発した。前記実施例１で究明したＳＮＰを含む９４０ｂｐの塩基配列の情報とＳＮＰ（Ｇ／Ａ）情報を活用し、（Andrew Collins and Xizyi Ke. The Open Bioinformatics Journal, 2012, 55-58.（非特許文献２））下記表６に示すように、制限酵素の処理なしに、粉質胚乳の特性を有するＮａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２のＳＮＰを判別することができるプライマーセットを選定した。
探索されたＳＮＰに対して制限酵素処理の段階を省略することができるプライマーを製作するために、Ｐｒｉｍｅｒ１（Ｐｒｉｍｅｒ Ｄｅｓｉｇｎ ｆｏｒ Ｔｅｔｒａ－Ｐｒｉｍｅｒ ＡＲＭＳ－ＰＣＲ、ｈｔｔｐ：／／ｐｒｉｍｅｒ１．ｓｏｔｏｎ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｉｍｅｒ１ ．ｈｔｍｌ）サービスを利用してＴｅｔｒａ－Ｐｒｉｍｅｒ ＡＲＭＳ－ＰＣＲプライマーを開発した。前記実施例１で究明したＳＮＰを含む９４０ｂｐの塩基配列の情報とＳＮＰ（Ｇ／Ａ）情報を活用し、（Andrew Collins and Xizyi Ke. The Open Bioinformatics Journal, 2012, 55-58.（非特許文献２））下記表６に示すように、制限酵素の処理なしに、粉質胚乳の特性を有するＮａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２のＳＮＰを判別することができるプライマーセットを選定した。
【0121】
【表6】
【0122】
具体的には、ＦＬＯ２ Ｔｅｔｒａ－Ｐｒｉｍｅｒ ＡＲＭＳ－ＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行う場合、表７及び図５に示すように、Ｇ ａｌｌｅｌｅを有するナミル稲はＦＬＯ２－ｏｕｔｅｒ－ＦとＦＬＯ２ ｏｕｔｅｒ－Ｒにより６３５ｂｐのＰＣＲ断片とＧ ａｌｌｅｌｅに結合するＦＬＯ２－ｉｎｎｅｒ－Ｆ（Ｇ）とＦＬＯ２－ｏｕｔｅｒ－Ｒにより３０７ｂｐの断片を有する一方、Ａ ａｌｌｅｌｅを有するＦＬＯ２は、ＦＬＯ２－ｏｕｔｅｒ－ＦとＦＬＯ２－ｏｕｔｅｒ－Ｒにより６３５ｂｐの断片と、Ａ ａｌｌｅｌｅに結合するＦＬＯ２－ｉｎｎｅｒ－Ｒ（Ａ）とＦＬＯ２－ｏｕｔｅｒ－Ｆにより３６８ｂｐの断片を示すことと予想した。
【0123】
【表7】
【0124】
ＰＣＲは、１０ｎｇのＤＮＡと５ｐｍｏｌの合計４個のプライマー、０．２ ｍＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘ、１Ｘ ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ ［５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2］及び１ｕｎｉｔのＴａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｕｒｏｔｉｃｓ、Ｋｏｒｅａ）を利用して総体積２０ｕｌで実施した。ＰＴＣ－１００（登録商標）ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＵＳＡ）を使用して、９５℃で５分間の初期変性後、９５℃で２０秒間、５９℃で３０秒間、７２℃で６０秒間、合計３５回繰り返し、７２℃で１０分間反応させた。結果物は４％のアガロースゲル（agarose gel）を利用して電気泳動した後、遺伝子型を判定した。
【0125】
その結果、図６に示すように、前記製作されたＦＬＯ２ Ｔｅｔｒａ－Ｐｒｉｍｅｒ ＡＲＭＳ－ＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、Ｎａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２特異的な断片を得ることができた。即ち、このような差異からもナミル突然変異後代系統の粉質胚乳の特性を効果的に判別可能であることが分かった。
【0126】
実験例２－３．Ｎａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２の粉質胚乳の特性判別用プライマーの効果検証
イ．ｄＣＡＰｓプライマーセットの効果検証
Ｎａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２密陽２３号の交配後代Ｆ2個体中、先行研究で報告された５番染色体に関連する部位が異型接合形態である個体から収穫された種子を圃場に展開し、後代分離集団を育成した。収穫した後、種子の胚乳特性を評価し、これらを播種して植物体からＤＮＡを抽出し、遺伝子型の評価に用いた。また、遺伝的背景が類似した集団内で選抜効果を確認するために、韓国国内で育成されたジャポニカ品種４８点のＤＮＡを、国立食糧科学院から分譲を受けて使用した（１．アンミ、２．アランヒャンチャル、３．白真珠１、４．白玉チャル、５．ボラムチャル、６．ボラムチャン、７．ボラミ、８．宝石、９．宝石チャル、１０．宝石黒チャル、１１．チョンナム、１２．チンドル、１３．秋晴、１４．タボ、１５．タンミ、１６．タンピョン、１７．トレチャン、１８．トダム米、１９．トンジン、２０．トンジン１、２１．トンジンチャル、２２．健康紅米、２３．コンヤン２、２４．コアミ、２５．コアミ２ 、２６．コアミ４、２７．ヘプム、２８．ハイアミ、２９．ハナム、３０．ハンマウム、３１．黒ジンミ、３２．フクヒャン、３３．黒真珠、３４．フクナム、３５．フクソル、３６．紅真珠、３７．ホプム、３８．黄金ヌリ、３９．ファソン、４０．ファワン、４１．ファヨン、４２．ヒャンナム、４３．ヒョンプム、４４．イルミ、４５．イルプム、４６．赤真珠、４７．赤真珠チャル、４８．黒ヒャンチャル）。
イ．ｄＣＡＰｓプライマーセットの効果検証
Ｎａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２密陽２３号の交配後代Ｆ2個体中、先行研究で報告された５番染色体に関連する部位が異型接合形態である個体から収穫された種子を圃場に展開し、後代分離集団を育成した。収穫した後、種子の胚乳特性を評価し、これらを播種して植物体からＤＮＡを抽出し、遺伝子型の評価に用いた。また、遺伝的背景が類似した集団内で選抜効果を確認するために、韓国国内で育成されたジャポニカ品種４８点のＤＮＡを、国立食糧科学院から分譲を受けて使用した（１．アンミ、２．アランヒャンチャル、３．白真珠１、４．白玉チャル、５．ボラムチャル、６．ボラムチャン、７．ボラミ、８．宝石、９．宝石チャル、１０．宝石黒チャル、１１．チョンナム、１２．チンドル、１３．秋晴、１４．タボ、１５．タンミ、１６．タンピョン、１７．トレチャン、１８．トダム米、１９．トンジン、２０．トンジン１、２１．トンジンチャル、２２．健康紅米、２３．コンヤン２、２４．コアミ、２５．コアミ２ 、２６．コアミ４、２７．ヘプム、２８．ハイアミ、２９．ハナム、３０．ハンマウム、３１．黒ジンミ、３２．フクヒャン、３３．黒真珠、３４．フクナム、３５．フクソル、３６．紅真珠、３７．ホプム、３８．黄金ヌリ、３９．ファソン、４０．ファワン、４１．ファヨン、４２．ヒャンナム、４３．ヒョンプム、４４．イルミ、４５．イルプム、４６．赤真珠、４７．赤真珠チャル、４８．黒ヒャンチャル）。
【0127】
密陽２３号とＮａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２交配後代Ｆ2:4植物体３８個体に対し、母・父として用いた密陽２３号及びＮａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２と、突然変異の原品種であるナミル稲を比較品種として用いて前記実施例２と同様な条件で分析した。その結果、図７に示すように、制限酵素Ｈｉｎｆ Ｉにより切断されない形態をＡ型と、制限酵素Ｈｉｎｆ Ｉにより１７ｂｐと１５４ｂｐに切断される形態をＢ型と規定したとき、密陽２３号と突然変異の原品種であるナミル稲はＡ型を示し、粉質胚乳であるＮａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２だけＢ型を示した。また、交配後代Ｆ2:4植物体の遺伝子型は、正常胚乳を示した１９個体では、異型接合（ヘテロ）とＡ型の結果を示したところ、Ｆ2:4植物体中の表現型が正常であるものが粉質胚乳に対して優性であることが分かった。併せて、胚乳が粉質特性を示した１９個体の遺伝子型は、すべてＢ型で示されることが確認できた。
【0128】
また、ジャポニカ（japonica）育成品種４８種に対し、母・父として用いた密陽２３号及びＮａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２と、突然変異の原品種であるナミル稲を比較品種として利用して、前記実施例２と同様な条件で分析した。その結果、図８に示すように、粉質胚乳の特性を示すＮａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２のみがＢ型を示し、残りの４７種はすべてＡ型を示すことが確認できた。このような結果から、本発明に係るＳＮＰ及びこれに対するｄＣＡＰｓプライマーは、効果的な粉質形質の判別に適用可能であることが分かった。
【0129】
ロ．Ｔｅｔｒａ－ｐｒｉｍｅｒ ＡＲＭＳプライマーセットの効果検証
Ｎａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２と密陽２３号の交配後代Ｆ２個体中、先行研究で報告された５番染色体に関連する部位が異型接合形態である個体で収穫された種子を圃場に展開し、後代分離集団を育成した。収穫後の種子の胚乳特性を評価し、これらを播種して植物体からＤＮＡを抽出し、遺伝子型の評価に用いた。また、遺伝的背景が類似した集団内で選抜効果を確認するために、韓国国内で育成されたジャポニカ品種４８点（実施例３－１と同一）のＤＮＡを、国立食糧科学院から分譲を受けて使用した。
Ｎａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２と密陽２３号の交配後代Ｆ２個体中、先行研究で報告された５番染色体に関連する部位が異型接合形態である個体で収穫された種子を圃場に展開し、後代分離集団を育成した。収穫後の種子の胚乳特性を評価し、これらを播種して植物体からＤＮＡを抽出し、遺伝子型の評価に用いた。また、遺伝的背景が類似した集団内で選抜効果を確認するために、韓国国内で育成されたジャポニカ品種４８点（実施例３－１と同一）のＤＮＡを、国立食糧科学院から分譲を受けて使用した。
【0130】
Ｎａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２と密陽２３号の交配後代Ｆ2:4植物体３８個体に対し、母・父として用いた密陽２３号及びＮａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２と、突然変異の原品種であるナミル稲を比較品種として利用して、前記実施例２と同様な条件で分析した。その結果、図９に示すように、正常胚乳を示した個体では、密陽２３号ｔｙｐｅ（３０７ｂｐ＋６３５ｂｐ）または異型接合（３０７ｂｐ＋３６８ｂｐ＋６３５ｂｐ）の結果を示し、粉質胚乳の特性を有する個体は、すべてＦＬＯ２ ｔｙｐｅ（３６８ｂｐ＋６３５ｂｐ）の断片を示した。
【0131】
また、ｊａｐｏｎｉｃａ育成品種４８種に対し、母・父として用いた密陽２３号及びＮａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２と、突然変異の原品種であるナミル稲を比較品種として利用して、前記実施例２と同様な条件で分析した。その結果、図１０に示すように、粉質胚乳の特性を示すＮａｍｉｌ（ＳＡ）－ＦＬＯ２のみが３６８ｂｐ＋６３５ｂｐの断片が観察された。このような結果から、本発明に係るＳＮＰ及びこれに対するＴｅｔｒａ－ｐｒｉｍｅｒ ＡＲＭＳプライマーは、効果的な粉質胚乳の形質判別に適用可能であることが分かった。
【0132】
前述した本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明が属する技術分野の通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形態で容易に変形が可能であることを理解することができるはずである。したがって、以上で記述した実施例は、すべての面で例示的なものであり、限定的ではないと理解すべきである。
【図1a】
【図1b】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【配列表】