特許 7005527 網膜錐体細胞の疾患を治療するための遺伝子治療

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-01-07

(45)【発行日】2022-02-04

(54)【発明の名称】網膜錐体細胞の疾患を治療するための遺伝子治療

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/12 20060101AFI20220128BHJP

   C12N 15/79 20060101ALI20220128BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20220128BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20220128BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20220128BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20220128BHJP

   C07K 14/47 20060101ALN20220128BHJP

【ＦＩ】

C12N15/12 ZNA

C12N15/79 Z

C12N15/864 100Z

A61P9/10

A61P27/02

A61K48/00

C07K14/47

【請求項の数】 34

(21)【出願番号】P 2018562720

(86)(22)【出願日】2017-02-23

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2019-02-28

(86)【国際出願番号】 EP2017054229

(87)【国際公開番号】W WO2017144610

(87)【国際公開日】2017-08-31

【審査請求日】2020-02-10

(31)【優先権主張番号】PCT/EP2016/053753

(32)【優先日】2016-02-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】518299541

【氏名又は名称】アイサーブ ゲーエムベーハー

【氏名又は名称原語表記】ＥＹＥＳＥＲＶ ＧＭＢＨ

【住所又は居所原語表記】Ｊａｓｍｉｎｗｅｇ ２３，７２０７６ Ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ Ｇｅｒｍａｎｙ

(74)【代理人】

【識別番号】100077012

【弁理士】

【氏名又は名称】岩谷 龍

(72)【発明者】

【氏名】ミヒャラキス，スティリアノス

(72)【発明者】

【氏名】ビール，マルティン

(72)【発明者】

【氏名】ゼーリガー，マティアス

【審査官】北村 悠美子

(56)【参考文献】

【文献】Molecular Therapy，2015年，Vol.23, No.9, p.1423-1433

【文献】Human Molecular Genetics，2011年，Vol.20, No.16, p.3161-3175

【文献】Molecular Genetics and Genomics，2013年，Vol.288, No.10, p.459-467

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）ヒト網膜アレスチン３遺伝子（ｈＡｒｒ３）プロモーターをコードする核酸、
（ｂ）ヒト錐体環状ヌクレオチド依存性チャネルα３サブユニット（ｈＣＮＧＡ３）またはそのフラグメントをコードする核酸、および
（ｃ）調節エレメントをコードする核酸
を含む導入遺伝子発現カセットを含むポリヌクレオチド。

【請求項2】

前記調節エレメントが、（ｃ１）ヤマネズミ口内炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）をコードする核酸を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項3】

前記ＷＰＲＥが、非発現型のヤマネズミ肝炎ウイルスＸタンパク質（ＷＨＸ）のオープンリーディングフレーム（ＷＨＸ ＯＲＦ）を含む変異ＷＰＲＥ（ＷＰＲＥｍ）である、請求項２に記載のポリヌクレオチド。

【請求項4】

前記調節エレメントが、（ｃ２）ポリアデニル化シグナル（ｐＡ）をコードする核酸を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項5】

前記ｐＡが、ウシ成長ホルモンｐＡ（ＢＧＨ ｐＡ）である、請求項４に記載のポリヌクレオチド。

【請求項6】

前記導入遺伝子発現カセットを挟む逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）をコードする核酸をさらに含む、請求項１～５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項7】

前記ＩＴＲが、ＡＡＶ血清型２型由来のＩＴＲ（ＩＴＲ ＡＡＶ２）である、請求項６に記載のポリヌクレオチド。

【請求項8】

（ａ）－（ｂ）－（ｃ）の順で配置された構成を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項9】

ｈＡｒｒ３プロモーターをコードする前記核酸が、配列番号１のヌクレオチド配列を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項10】

ｈＣＮＧＡ３をコードする前記核酸が、配列番号２のヌクレオチド配列または配列番号３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項11】

ＷＰＲＥｍをコードする前記核酸が、配列番号４のヌクレオチド配列を含む、請求項３～１０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項12】

ＢＧＨ ｐＡをコードする前記核酸が、配列番号５のヌクレオチド配列を含む、請求項５～１１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項13】

Ｌ－ＩＴＲをコードする前記核酸が配列番号６のヌクレオチド配列を含むこと、および／またはＲ－ＩＴＲをコードする前記核酸が配列番号７のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項６～１２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項14】

請求項１～１３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む核酸ベクター。

【請求項15】

全長５，０００ｂｐ以上の骨格をさらに含む環状プラスミドである、請求項１４に記載の核酸ベクター。

【請求項16】

前記骨格に含まれるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が、５個以下である、請求項１５に記載の核酸ベクター。

【請求項17】

前記骨格が、選択マーカーを含む、請求項１５または１６に記載の核酸ベクター。

【請求項18】

前記選択マーカーの５’末端および３’末端が、前記ポリヌクレオチドから距離をおいて離れた位置にある、請求項１７に記載の核酸ベクター。

【請求項19】

前記骨格に含まれる制限酵素認識部位（ＲＥＲＳ）が、１０個以下である、請求項１５～１８のいずれか１項に記載の核酸ベクター。

【請求項20】

前記骨格に含まれるプロモーターが、５個以下である、請求項１５～１９のいずれか１項に記載の核酸ベクター。

【請求項21】

前記骨格が、複製開始点（ＯＲＩ）をさらに含む、請求項１５～２０のいずれか１項に記載の核酸ベクター。

【請求項22】

前記骨格が、配列番号８のヌクレオチド配列を含む、請求項１５～２１のいずれか１項に記載の核酸ベクター。

【請求項23】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項１５～２２のいずれか１項に記載の核酸ベクター。

【請求項24】

前記ＡＡＶベクターのＡＡＶカプシド配列の血清型が、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２３に記載の核酸ベクター。

【請求項25】

請求項１５～２４のいずれか１項に記載の核酸ベクターと薬学的に許容される担体とを含む医薬製剤。

【請求項26】

前記薬学的に許容される担体が、塩類溶液を含み、任意選択で界面活性剤をさらに含む、請求項２５に記載の医薬製剤。

【請求項27】

網膜錐体細胞に影響を及ぼす遺伝子変異、遺伝子置換または遺伝子欠失を伴う疾患の治療に使用するための、請求項２５または２６に記載の医薬製剤。

【請求項28】

前記疾患が、１色覚（ＡＣＨＭ）である、請求項２７に記載の医薬製剤。

【請求項29】

（ａ）請求項１～１３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドおよび／または請求項１４～２４のいずれか１項に記載の核酸ベクターおよび／または請求項２５～２８のいずれか１項に記載の医薬製剤と、
（ｂ）これらを使用するための取扱説明書と
を含むキット。

【請求項30】

請求項１～１３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドをアデノ随伴ウイルスベクターに挿入することを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを作製する方法。

【請求項31】

前記組換えアデノ随伴ウイルスベクターが、請求項１４～２４に記載の核酸ベクターである、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

網膜錐体細胞に影響を及ぼす遺伝子変異、遺伝子置換または遺伝子欠失を伴う疾患を治療する方法であって、このような治療を必要とする対象（但し、ヒトを除く）に請求項１４～２４のいずれか１項に記載の核酸ベクターおよび／または請求項２５～２８のいずれか１項に記載の医薬製剤を投与し、それによって前記対象を治療することを含む方法。

【請求項33】

前記疾患が、１色覚（ＡＣＨＭ）である、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

前記ベクターが、網膜下および／または硝子体内に投与される、請求項３２または請求項３３に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、１色覚などの網膜錐体細胞の疾患を治療するために構成されたポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む核酸ベクター、該核酸ベクターを含む医薬組成物、前記ポリヌクレオチドまたは前記核酸ベクターを含むキット、前記核酸ベクターを作製する方法、および網膜錐体細胞の疾患を治療する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

遺伝性網膜ジストロフィーは、視覚機能障害を引き起こす慢性疾患である。１色覚（ＡＣＨＭ）は、その具体的な形態の１つである。ＡＣＨＭの特徴としては、視力低下、振子様眼振、光過敏（羞明）、狭い範囲の中心暗点、偏心固視、および色識別能力の低下または完全喪失が挙げられる。いわゆる１色覚者とも称されるＡＣＨＭ患者は、３種類の錐体のそれぞれに対応する３つの色覚軸、すなわち第１軸または長波長感受性錐体軸（赤色）、第２軸または中波長感受性錐体軸（緑色）、および第３軸または短波長感受性錐体軸（青色）のすべてにおいて色識別能力に異常が見られる。１色覚者の多くは、３種類の錐体すべての機能が完全に欠如した完全なＡＣＨＭを有する。まれに、不完全なＡＣＨＭを有する患者もおり、不完全なＡＣＨＭでは、１種類以上の錐体が部分的に機能している場合がある。その症状は、完全なＡＣＨＭを有する患者の症状と同様であるが、概して軽度である。

【0003】

ＡＣＨＭは、世界中で４０，０００人の出生に１人の割合で発症すると推定されている。この疾患は、常染色体劣性遺伝形式で遺伝する。受精時に、発端者の同胞が発症する確率は２５％、無症候性保因者となる確率は５０％、発症せず保因者にもならない確率は２５％である。家系内で病因変異が同定されている場合は、リスクのある血縁者を対象とした保因者検査や、高リスク妊娠を対象とした出生前検査が可能である。

【0004】

遺伝性ＡＣＨＭの遺伝子要因は多様である。現在、ＡＣＨＭとの関連が示唆されている遺伝子としては、錐体環状ヌクレオチド依存性チャネルのα３サブユニット（ＣＮＧＡ３）およびβ３サブユニット（ＣＮＧＢ３）、グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）αシグナル伝達活性ポリペプチド２（ＧＮＡＴ２）、ホスホジエステラーゼ６Ｃ（錐体ｃＧＭＰ特異的ホスホジエステラーゼα’サブユニット、ＰＤＥ６Ｃ）、ホスホジエステラーゼ６Ｈ（錐体ｃＧＭＰ特異的スホジエステラーゼγサブユニット、ＰＤＥ６Ｈ）、ならびにＡＦＴ６が挙げられる。

【0005】

欧米で最も多いＡＣＨＭの原因は、ＣＮＧＡ３およびＣＮＧＢ３の２種類の遺伝子で起こる変異である。ＣＮＧＢ３（ＡＣＨＭ１型（ＡＣＨＭ１））の変異は、症例の約５０％で見られ、ＣＮＧＡ３（ＡＣＨＭ２）の変異は、患者の約２８％で見られる。ＣＮＧＡ３の変異は、中国、中東およびアラビア諸国において最も多いＡＣＨＭの原因であり、ＡＣＨＭ症例の最大６０％を占める。ＡＣＨＭと関連がある他の遺伝子、例えばグアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）αシグナル伝達活性ポリペプチド２（ＧＮＡＴ２）、ホスホジエステラーゼ６Ｃ（錐体ｃＧＭＰ特異的ホスホジエステラーゼα’サブユニット、ＰＤＥ６Ｃ）、ホスホジエステラーゼ６Ｈ（錐体ｃＧＭＰ特異的スホジエステラーゼγサブユニット、ＰＤＥ６Ｈ）、ＡＦＴ６などの頻度は、極めて低く、それぞれ１．５％未満である。

【0006】

一般に、ＡＣＨＭの分子病態メカニズムは、変化したｃＧＭＰレベルを適切に制御する能力の欠如か、そのレベルに反応する能力の欠如のいずれかである。ｃＧＭＰは、そのレベルにより環状ヌクレオチド依存性イオンチャネル（ＣＮＧ）の開口を制御しているため、視覚認知に特に重要である。ｃＧＭＰ濃度が低下するとＣＮＧが閉口して過分極が起こり、グルタミン酸塩の放出が停止する。網膜に存在する天然のＣＮＧは、錐体細胞において、３つのαサブユニットと１つのβサブユニットとで構成されており、それぞれのサブユニットはＣＮＧＡ３およびＣＮＧＢ３と称される。

【0007】

ＡＣＨＭのような遺伝性網膜ジストロフィーには、その遺伝的性質ゆえに、現在適用可能な慣用の治療法はない。疾患負荷が非常に大きいことから、臨床専門家は、治療法の確立が求められている疾患の中でもＡＣＨＭを最優先すべき課題としている。

【0008】

現在、ＣＮＧＡ３に関連する１色覚（ＡＣＨＭ２）に適用可能な治療法はない。

【0009】

Ｋｏｍａｒｏｍｙら，Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｒｅｓｃｕｅｓ ｃｏｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ａｃｈｒｏｍａｔｏｐｓｉａ，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９（１３）：２５８１－２５９３（２０１０）にはイヌを用いた試験が記載されており、この試験結果から、ＣＮＧＢ３遺伝子の変異により発症するＡＣＨＭの治療において、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を用いた遺伝子治療を適用することにいくばくかの見込みがあることが示唆されている。このイヌ試験で使用したｒＡＡＶベクターには、２．１ｋｂの錐体の赤オプシンプロモーター（ＰＲ２．１）およびヒトＣＮＧＢ３（ｈＣＮＧＢ３）ｃＤＮＡを含むヒトＣＮＧＢ３（ｈＣＮＧＢ３）発現カセットがパッケージングされている。この試験の限界の１つとして、ＰＲ２．１プロモーターで駆動されるｈＣＮＧＢ３が赤錐体および緑錐体のみで発現したのに対し、内在性のｈＣＮＧＢ３は３種類の錐体（赤錐体、緑錐体および青錐体）すべてで発現することが挙げられる。もう１つの限界は、使用した発現カセットの全長（５，２３０ｂｐ）が、ＡＡＶ粒子の通常のパッケージング容量（＜４．９ｋｂ）をはるかに超えていたことである。容量を超えて過度に詰め込まれたことによってｒＡＡＶ粒子のパッケージング効率が著しく損なわれ、収率が低下し、完全粒子に対する空粒子の比率が高まり、ベクターの感染力も低下したと考えられる。

【0010】

国際公開第２０１２／０９４５６０号には、ＣＮＧＢ３遺伝子の５’－ＮＴＲ部分を含む特定の短いプロモーターとサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーの制御下にあるｈＣＮＧＡ３コード配列を含むｒＡＡＶをベースとしたベクターが記載されている。著者らによれば、この短いプロモーターを用いることにより、ｈＣＮＧＢ３発現カセットがｒＡＡＶの通常のパッケージング容量に収まるため、収率の向上、完全粒子に対する空粒子の比率の低下、およびベクターの感染力の増強などの複数の利点が得られるとされている。しかし、本発明者らは、このような特徴を確認することはできなかった。

【0011】

Ｐａｎｇら，ＡＡＶ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｒｅｓｔｏｒｅｓ ｃｏｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｃｎｇａ３／Ｎｒｌ ｄｏｕｂｌｅ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｏｕｓｅ，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．５４，Ｍｅｅｔｉｎｇ Ａｂｓｔｒａｃｔ，２７２３（２０１３）には、ｈＣＮＧＡ３遺伝子のコード配列を含むｒＡＡＶ５ベクターが記載されている。著者らは、このベクターをＣｎｇａ３／Ｎｒｌ二重ノックアウト（Ｃｎｇａ３／Ｎｒｌ ＤＫＯ）マウスの眼内に注射したところ、処置したマウスの錐体変性が抑止されたと述べている。しかし、本発明者らによれば、この方法における遺伝子置換率は不十分であり、ＡＣＨＭのような遺伝性網膜ジストロフィーを患うヒトの治療として、この方法はさほど有望でない可能性が示唆される。

【0012】

Ｙｅら，Ｃｏｎｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ａｃｈｒｏｍａｔｏｐｓｉａ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｒｅｔｉｎａｌ ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２７，７２－８２（２０１６）には、１．７ｋｂ Ｌ－オプシンプロモーター（ＰＲ１．７）により駆動されるヒトＣＮＧＢ３遺伝子発現ＡＡＶベクターが開示されている。このベクターをＣＮＧＢ３欠損マウスの網膜下に注射することにより、錐体機能が部分的に回復することが記載されている。著者らは、このベクターの臨床適用の可能性を示唆しているが、そのような適用が実際に可能であることはこれまで立証されていない。

【0013】

Ｄｙｋａら，Ｃｏｎｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｍｏｔｏｒ ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｒｅｔｉｎａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ，ｉｎ：Ａｓｈら（Ｅｄ．） ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｔｉｎａｌ Ｄｉｓｅａｓｅｓ－Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ ８７，６９５－７０１（２０１４）には、複数の錐体特異的プロモーターが記載されている。しかし、ＡＣＨＭのような遺伝性網膜ジストロフィーに適した治療方法は提示されていない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0014】

このような背景から、本発明の目的は、これらの限界を打破し、ＡＣＨＭ、特にＡＣＨＭ２などの網膜錐体細胞の疾患の治療の有益なツールとなるポリペプチドおよび核酸ベクターを提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0015】

この目的は、
（ａ）ヒト網膜アレスチン３遺伝子（ｈＡｒｒ３）プロモーターをコードする核酸、
（ｂ）ヒト錐体環状ヌクレオチド依存性チャネルα３サブユニット（ｈＣＮＧＡ３）またはそのフラグメントをコードする核酸、および
（ｃ）調節エレメントをコードする核酸
を含む導入遺伝子発現カセットを含むポリヌクレオチドにより達成される。

【0016】

上記により、本発明の基礎をなす課題は完全に達成される。

【0017】

本発明者らは、本発明のポリヌクレオチドが、ヒト患者に適用可能な、ＡＣＨＭなどの網膜錐体細胞の疾患の治療を可能にする遺伝子ツールの重要な構成要素を具体化したものであることを見出した。

【0018】

本発明者らは、本発明のポリヌクレオチドをベクタープラスミドの構成要素としてＣＮＧＡ３欠損マウスに網膜下注射することにより、ｈＣＮＧＡ３導入遺伝子が錐体光受容体細胞で特異的かつ効率的に発現されることを実験により確認した。また、本発明者らは、生まれつき錐体機能を有していないこのマウスに、錐体を介する視力が付与されることも確認した。

【0019】

この結果は驚くべきものであった。当技術分野において、本発明で提案されるような構造を有するポリヌクレオチドにより、網膜でｈＣＮＧＡ３導入遺伝子の標的発現が可能になることは予想外であった。実際、その逆が予想されていた。当技術分野において、本発明により提供される解決策を明確に否定する教示がなされている。

【0020】

Ｄｙｋａら（上記引用文献）には、ＡＣＨＭの病態と関連があるこのような遺伝子を網膜で発現させる目的で、マウスおよびヒトの錐体アレスチンプロモーターを用いる場合、標的組織への特異性は低いことが記載されている。

【0021】

ＷＯ２０１２／０９４５６０（上記引用文献）では、錐体アレスチンプロモーターの制御下にある網膜ＣＮＧをコードする発現カセットは、視覚機能の回復にほとんど効果がないことが主張されている。

【0022】

同様のことが、Ｋｏｍａｒｏｍｙら（上記引用文献）によっても教示されている。

【0023】

したがって、本発明のポリヌクレオチドがこのような高い特異性と高い選択性を有すること、および視覚機能の回復において有意な生物学的有効性を有することは、当業者にとって自明な事項ではなかった。

【0024】

本発明者らは、霊長動物を用いた実験において、網膜に注射した本発明のポリヌクレオチドが、その場にとどまり、非標的臓器への形質導入をほとんど行わないことを確認している。また、本発明のポリヌクレオチドを網膜に注射した後、この投与したポリヌクレオチドに対する抗薬剤抗体が誘導されないことも確認されている。さらに、本発明のポリヌクレオチドを、適切なｒＡＡＶベクターを介して、ＣＮＧＡ３に関連するＡＣＨＭを有するヒト患者の網膜錐体光受容細胞に首尾よく送達できることも実験により確認されている。これらのことから、本発明のポリヌクレオチドは、ＡＣＨＭなどの網膜錐体細胞の疾患の治療用医薬組成物の活性物質として好適であるという結論が導かれる。

【0025】

本発明において、「ポリヌクレオチド」は、１３以上のヌクレオチドモノマーが共有結合で結合して鎖状に連なった構造を有する生体高分子である。好ましいポリヌクレオチドの一例は、ＤＮＡ分子である。本発明のポリヌクレオチドは、一本鎖であってもよく、二本鎖であってもよいが、好ましい一実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは一本鎖である。

【0026】

「プロモーター」とは、特定の遺伝子の転写を促進するＤＮＡ領域を意味する。転写プロセスの一環として、ＲＮＡポリメラーゼとして知られているＲＮＡを合成する酵素は、遺伝子近傍のＤＮＡに結合する。プロモーターには、特定のＤＮＡ配列と、ＲＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼを動員する転写因子が転写開始時に結合する部位を提供する応答エレメントとが含まれている。

【0027】

ヒト網膜アレスチン３遺伝子（ｈＡｒｒ３）プロモーターとは、ヒト網膜アレスチン３（Ｘアレスチン）の転写を促進するＤＮＡ領域を意味する。ｈＡｒｒ３プロモーターのヌクレオチド配列全体は、Ｌｉら，Ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｃｏｎｅ ａｒｒｅｓｔｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ Ｃｉｓ ｅｌｅｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｄｉｓｔａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｒｅｇｉｏｎ，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４３（５）：１３７５－１３８３（２００２）に開示されている。

【0028】

一実施形態において、このプロモーターのヌクレオチド配列全体が用いられる。本発明の別の一実施形態において、ｈＣＮＧＡ３の標的発現に必要とされる、前記プロモーターの機能的部分のみが用いられる。本発明のさらなる別の一実施形態において、前述のヌクレオチド配列と、別のプロモーターのヌクレオチド配列、イントロン配列または調節エレメント配列とを融合したものが用いられる。

【0029】

「導入遺伝子発現カセット」または「発現カセット」は、核酸ベクターによって標的細胞に送達される複数の遺伝子配列を含む。これらの配列には、目的の遺伝子（例えば、ｈＣＮＧＡ３核酸）、１以上のプロモーターおよび調節エレメントが含まれる。

【0030】

「調節エレメント」は、標的細胞において遺伝子（例えば、ｈＣＮＧＡ３核酸）を効果的に発現させるために必要な調節エレメントであり、よって、導入遺伝子発現カセットに含まれている必要がある。このような配列として、例えば、エンハンサー配列、プラスミドベクターへのＤＮＡフラグメントの挿入を促進するポリリンカー配列、イントロンを除去するスプライシングに関わる配列、またはｍＲＮＡ転写物のポリアデニル化に関わる配列が挙げられる。

【0031】

「核酸」または「核酸分子」は、ヌクレオチドモノマーが連なった鎖状構造を有する分子であり、例えば、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）などが挙げられる。核酸は、例えば、プロモーターをコードしていてもよく、ｈＣＮＧＡ３遺伝子またはそのフラグメントをコードしていてもよく、調節エレメントをコードしていてもよい。核酸分子は、一本鎖であってもよく、二本鎖であってもよい。

【0032】

「ｈＣＮＧＡ３をコードする核酸」とは、ヒトＣＮＧＡ３をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を意味し、本発明の一実施形態においては、ヒトＣＮＧＡ３のフラグメントまたはヒトＣＮＧＡ３の機能的変異体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を意味する。ｈＣＮＧＡ３の「フラグメント」とは、ｈＣＮＧＡ３活性を保持するｈＣＮＧＡ３の断片または一部を意味する。ｈＣＮＧＡ３の「機能的変異体」には、野生型ｈＣＮＧＡ３の機能を著しく低下させたり変化させたりすることのない軽微な変更、例えば、サイレント変異、一塩基変異多型、ミスセンス突然変異およびその他の変異または欠失などを有するｈＣＮＧＡ３変異体が包含される。

【0033】

本発明の「ｈＣＮＧＡ３をコードする核酸」で少なくとも部分的にコードされているｈＣＮＧＡ３のアミノ酸配列は、配列番号３に記載されている。

【0034】

本発明のポリヌクレオチドには、「単離された」ポリヌクレオチドまたは核酸分子、すなわち、当該核酸の天然源に存在する他の核酸分子から分離されたポリヌクレオチドまたは核酸分子が包含される。例えば、ゲノムＤＮＡに関して言えば、「単離された」という用語は、当該ゲノムＤＮＡが本来関連している染色体から分離された核酸分子を包含する。「単離された」核酸分子は、好ましくは、該核酸分子の由来生物のゲノムＤＮＡ内で該核酸分子の両側に本来存在している配列が存在していない状態の核酸分子である。

【0035】

本発明の好ましい一実施形態において、前記調節エレメントは、ｃ１）ヤマネズミ口内炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）をコードする核酸を含む。

【0036】

本発明のポリヌクレオチドのこのさらなる発展形態は、光受容細胞のｈＣＮＧＡ３の発現が著しく増大するという利点を有する。ＷＰＲＥが含まれることにより長期発現が可能になることから、本発明のポリヌクレオチドは、遺伝子治療における使用に好適である。前記ＷＰＲＥは、ヤマネズミ肝炎ウイルスＸオープンリーディングフレーム（ＷＨＸ ＯＲＦ）遺伝子プロモーターと、その３’領域にＷＨＸの始めの６１個のＡＡをコードするオープンリーディングフレームとを含む（Ｚａｎｔａ－Ｂｏｕｓｓｉｆら，Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｕｔａｔｅｄ ＰＲＥ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｌｏｗｉｎｇ ｈｉｇｈ ａｎｄ ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗｈｉｌｅ ａｂｒｏｇａｔｉｎｇ ＷＨＶ－Ｘ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ＷＡＳ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１６（５），６０５－６１９（２００９）を参照）。

【0037】

本発明の別の一実施形態において、本発明のポリヌクレオチドにおける前記ＷＰＲＥは、非発現型のＷＨＸタンパク質のＷＨＸ ＯＲを含む変異ＷＰＲＥ（ＷＰＲＥｍ）である。

【0038】

この場合、発現カセットからのＷＨＸタンパク質の意図しない発現が抑制されるという利点がある。

【0039】

本発明の別の一実施形態において、前記調節エレメントは、（ｃ２）ポリアデニル化シグナル（ｐＡ）をコードする核酸を含む。

【0040】

この場合、本発明のポリヌクレオチドには、ｈＣＮＧＡ３をコードするｍＲＮＡの核外移行、翻訳および安定性にとって重要な調節エレメントが備わっているため、発現効率が向上するという利点がある。

【0041】

本発明のさらなる一実施形態において、前記ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ＢＧＨ ｐＡ）である。

【0042】

本発明者らは、この特定のポリアデニル化シグナルと本発明のポリヌクレオチドの他の遺伝要素とを共に使用することにより、特に良好な結果が得られることを見出した。

【0043】

別の一実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、前記導入遺伝子発現カセットを挟む逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）をコードする核酸をさらに含み、好ましくは、前記発現カセットの第１の末端に前記ｈＡｒｒ３プロモーターに隣接する少なくとも１つのＩＴＲ（Ｌ－ＩＴＲ）と、前記発現カセットの第１の末端の反対側に位置する第２の末端に前記ｐＡに隣接する少なくとも１つのＩＴＲ（Ｒ－ＩＴＲ）とを含む。

【0044】

この場合、製造時の効率的な複製およびパッケージングが可能になるという利点がある。「挟む」とは、ＩＴＲが導入遺伝子発現カセットの両側、すなわち、５’末端と３’末端に位置することを意味する。これにより、ＩＴＲは導入遺伝子発現カセットの外枠を構成する。

【0045】

本発明の一実施形態において、前記ＩＴＲは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型２型由来のＩＴＲ（ＩＴＲ ＡＡＶ２）である。

【0046】

本発明において見出された通り、この特定のＩＴＲは、本発明のポリヌクレオチドに特に好適である。

【0047】

本発明の別の一実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、（ａ）－（ｂ）－（ｃ）、好ましくは（ａ）－（ｂ）－（ｃ１）－（ｃ２）、さらに好ましくは（Ｌ－ＩＴＲ）－（ａ）－（ｂ）－（ｃ１）－（ｃ２）－（Ｒ－ＩＴＲ）の順で配置された構成を含む。

【0048】

上記順序で遺伝要素が配置されていることは、本発明のポリヌクレオチドの発現効率に有益であることが確認されている。

【0049】

本発明の別の一実施形態は、前記ｈＡｒｒ３プロモーターが配列番号１のヌクレオチド配列を含むこと；ｈＣＮＧＡ３をコードする前記核酸が配列番号２のヌクレオチド配列を含むこと；ｈＣＮＧＡ３をコードする前記核酸が配列番号３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むこと；ＷＰＲＥｍをコードする前記核酸が配列番号４のヌクレオチド配列を含むこと；ＢＧＨ ｐＡをコードする前記核酸が配列番号５のヌクレオチド配列を含むこと；Ｌ－ＩＴＲをコードする前記核酸が配列番号６のヌクレオチド配列を含むこと；および／またはＲ－ＩＴＲをコードする前記核酸が配列番号７のヌクレオチド配列を含むこと、を特徴とする。

【0050】

この場合、本発明のポリヌクレオチドの各遺伝要素の特定のヌクレオチド配列により、綿密な構築マニュアルが提供されるという利点がある。このようなマニュアルが提供されることにより、本発明のポリヌクレオチドを、例えば、核酸合成装置を用いて、簡便かつ短時間で合成することが可能になる。

【0051】

本発明の別の主題は、上記した本発明のポリヌクレオチドを含む核酸ベクターである。したがって、本発明のポリヌクレオチドの特徴、利点および特性は、本発明の核酸ベクターにも適用される。

【0052】

好ましい実施形態において、本発明の核酸ベクターは、ウイルスベクターであり、例えば、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ワクシニア／ポックスウイルスまたはヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ））に由来するベクターである。最も好ましい実施形態において、前記ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである（以下を参照）。

【0053】

本発明の一実施形態において、前記核酸ベクターは、全長５，０００ｂｐ以上、好ましくは全長５，５００ｂｐ以上の骨格をさらに含む環状プラスミドである。

【0054】

本発明において、「骨格」という用語は、ベクター分子における、発現カセット以外の部分、逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が存在する場合は、発現カセットとＩＴＲ以外の部分を表す。換言すると、前記ベクターの骨格は、発現カセットまたはＩＴＲの５’末端および３’末端に隣接し、前記ベクターの本発明のポリヌクレオチドを除いた残りの核酸部分を構成している。

【0055】

本発明者らは、骨格を上記のような好ましいサイズにすることによって、前記発現カセットがパッケージングされず骨格が誤ってウイルス粒子にパッケージングされる（逆パッケージング）という現象が最小限に抑えられることを見出した。したがって、このような骨格を有することにより、本質的にｈＣＮＧＡ３のみを標的細胞で確実に発現させることが可能になる。

【0056】

本発明の別の一実施形態において、前記骨格に含まれるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、５個以下、好ましくは４個以下、さらに好ましくは３個以下、さらに好ましくは２個以下、さらに好ましくは１個以下、非常に好ましくは０個である。

【0057】

本発明者らは、前記骨格において、選択マーカーまたは複製開始点（ＯＲＩ）が存在する場合はこれらを除外した前記骨格において、存在するＯＲＦ数を少なくし、可能であればゼロとすべきであることを見出した。この場合、万一逆パッケージングが起こった場合でも、副産物発現の可能性が最小限に抑えられるという利点がある。また、ｒＡＡＶベクターの製造時における副産物発現の可能性も最小限に抑えられる。

【0058】

本発明の核酸ベクターのさらなる別の一実施形態において、前記骨格は、選択マーカー、好ましくは抗生物質耐性をコードする核酸、さらに好ましくはカナマイシン耐性をコードする核酸（ＫａｎＲ）を含む。

【0059】

これにより、本発明の核酸ベクターが組み込まれた細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで選択するための構造的な前提条件が提供される。このような細胞を、本発明のベクターを増幅するために使用してもよい。

【0060】

本発明の別の一実施形態において、前記核酸ベクターの骨格に含まれる前記選択マーカーは、その５’末端および３’末端が、本発明のポリヌクレオチドから距離をおいて離れた位置にあるように、好ましくは本発明のポリヌクレオチドまたは発現カセットから距離をおいてできるだけ離れた位置にあるように、さらに好ましくは本発明のポリヌクレオチドまたは発現カセットから１，０００ｂｐ以上、さらに好ましくは１，５００ｂｐ以上、非常に好ましくは１，９００ｂｐ以上の距離をおいた位置にあるように配置されている。

【0061】

本発明者らが見出した通り、この場合、耐性をコードする核酸（ＫａｎＲ）が、前記発現カセットのＩＴＲおよび調節エレメント（例えば、プロモーター）からできるだけ距離をおいた位置に配置されているという利点がある。

【0062】

本発明の核酸ベクターのさらなる一発展形態において、前記骨格に含まれる制限酵素認識部位（ＲＥＲＳ）は、１０個以下、好ましくは５個以下、さらに好ましくは３個以下、さらに好ましくは２個以下、さらに好ましくは１個以下、非常に好ましくは０個である。

【0063】

この場合、ＤＮＡ増幅に用いる微生物内において、本発明の核酸ベクターの安定性が大幅に向上するという利点がある。

【0064】

本発明の核酸ベクターのさらなる一発展形態において、前記骨格に含まれるプロモーターは、５個以下、好ましくは４個以下、さらに好ましくは３個以下、さらに好ましくは２個以下、さらに好ましくは１個以下、非常に好ましくは０個である。

【0065】

この場合、万一逆パッケージングが起こった場合でも、悪影響を及ぼし得るまたは導入遺伝子に干渉し得る副産物の発現の可能性が最小限に抑えられる。この実施形態においては、「プロモーター」は、選択マーカー（例えば、ＫａｎＲ）の発現に必要なプロモーターを除いたものとして理解される。「プロモーター」としては、適切な原核生物プロモーターとして通常示されるものが挙げられる。

【0066】

本発明の核酸ベクターのさらなる一実施形態において、前記骨格は、複製開始点（ＯＲＩ）、好ましくはｐＵＣ１８ ＯＲＩをさらに含む。

【0067】

この場合、本発明のベクターの複製が可能になる構造的な前提条件が提供される。

【0068】

前記骨格は、唯一のコード配列または情報伝達配列として選択マーカーおよびＯＲＩを含むが、残りのランダム配列には、ＯＲＦ、プロモーター、ＲＥＲＳのいずれも含まないことが好ましい。

【0069】

前記ベクター骨格に含まれるヌクレオチド配列は、添付の配列表の配列番号８に記載されている。

【0070】

好ましい一実施形態において、本発明の核酸ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。

【0071】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の血清型として、現在までに複数の血清型が同定されており、これには、ヒトの１２の血清型（ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１およびＡＡＶ１２）ならびに非ヒト霊長動物の１００を超える血清型が含まれる（Ｈｏｗａｒｔｈら，Ｕｓｉｎｇ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｓ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏｏｌｓ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２６：１－１０（２０１０））。前記ＡＡＶベクターの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）またはカプシド配列の血清型は、任意の公知のヒトまたは非ヒト動物のＡＡＶ血清型から選択されるものであってよい。いくつかの実施形態において、あるＩＴＲ血清型のゲノムが別の血清型のカプシドにパッケージングされるというシュードタイピング法が用いられる。例えば、Ｚｏｌｕｔｕｈｋｉｎら，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｒｏｔｙｐｅ １，２，ａｎｄ ５ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８（２）：１５８－６７（２００２）を参照されたい。

【0072】

任意の種類のＡＡＶを用いることが可能であるが、前記ＡＡＶベクターのＡＡＶカプシド配列および／または逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）の血清型が、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８およびこれらの変異形または組み合わせからなる群から選択されることが好ましい。

【0073】

本発明者らは、ＡＡＶ２サブタイプ、ＡＡＶ５サブタイプおよびＡＡＶ８サブタイプが、本発明の核酸ベクターの作製に特に適していることを見出した。

【0074】

本発明の組換えＡＡＶベクターの製造、精製および特性解析は、当技術分野で公知の様々な方法のうちいずれの方法を用いて行ってもよい。実験室規模の製造方法については、以下の文献を参照されたい：例えば、Ｃｌａｒｋ，Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．６１ｓ：９－１５（２００２）；Ｃｈｏｉら，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｕｓｅ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １６．２５．１－１６．２５．２４（２００７）；Ｇｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ａｓ ａ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｖｅｃｔｏｒ：Ｖｅｃｔｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇｉｎ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ９９：１１９－１４５（２００５）；Ｈｅｉｌｂｒｏｎｎ ａｎｄ Ｗｅｇｅｒ，Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｓｔａｔｕｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ｉｎ Ｍ．Ｓｃｈａｆｅｒ－Ｋｏｒｔｉｎｇ（Ｅｄ．），Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１９７：１４３－１７０（２０１０）；およびＨｏｗａｒｔｈら（上記引用文献）。なお、後述の製造方法は、例示を目的とするものであり本発明を限定するものではない。

【0075】

本発明の別の主題は、先に詳述したような核酸ベクターと、薬学的に許容される担体とを含む医薬製剤に関する。したがって、本発明のポリヌクレオチドおよび核酸ベクターの特徴、利点および特性は、本発明の医薬製剤にも適用される。

【0076】

薬学的に許容される担体は、当技術分野で公知である。例として、Ｒｏｗｅ（Ｅｄ．）（２０１２），Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓを参照する。本発明の医薬製剤は、添加剤をさらに含んでいてもよい。添加剤としては、本発明の核酸ベクターの効果に有利な任意の化合物または組成物が挙げられ、例えば、塩類、結合剤、溶媒、分散剤、補助剤および遺伝子治療法に関連して一般に用いられるその他の物質などが挙げられる。

【0077】

本発明の医薬製剤の一実施形態において、前記薬学的に許容される担体は、塩類溶液、好ましくは滅菌平衡塩類溶液を含み、任意選択で界面活性剤、好ましくは粉末ポロキサマー（Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標） Ｐ １８８ ｍｉｃｒｏ）をさらに含んでいてもよい。

【0078】

本発明者らは、このような特定の製剤を用いることによって、薬物による悪影響および表面のｒＡＡＶ粒子の損失が最小限に抑えられることを見出した。

【0079】

好ましい一実施形態において、本発明の医薬製剤は、網膜錐体細胞に影響を及ぼす遺伝子変異、遺伝子置換または遺伝子欠失を伴う疾患、さらに好ましくは１色覚（ＡＣＨＭ）、特にＡＣＨＭ２型（ＡＣＨＭ２）の治療に使用するために構成されたものである。

【0080】

本発明者らは、先に詳述した本発明のポリヌクレオチドおよび核酸ベクターにより、ＣＮＧＡ３に関連する１色覚の原因療法を初めて可能にする治療ツールを提供する。

【0081】

本発明の別の主題は、（ａ）本発明のポリヌクレオチドおよび／または本発明の核酸および／または本発明の医薬製剤と、（ｂ）これらを使用するための取扱説明書とを含むキットに関する。

【0082】

本発明のさらなる主題は、本発明のポリヌクレオチドをアデノ随伴ウイルスベクターに挿入することを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを作製する方法に関し、前記組換えアデノ随伴ウイルスベクターは、好ましくは本発明の核酸ベクターである。

【0083】

本発明の別の主題は、網膜錐体細胞に影響を及ぼす遺伝子変異、遺伝子置換または遺伝子欠失を伴う疾患を治療する方法であって、このような治療を必要とする対象に本発明の核酸ベクターおよび／または本発明の医薬製剤を投与し、それによって前記対象を治療することを含む方法である。前記疾患は、好ましくはＡＣＨＭであり、さらに好ましくはＡＣＨＭ２型（ＡＣＨＭ２）である。前記ベクターは、好ましくは網膜下および／または硝子体内に投与される。

【0084】

本発明のポリヌクレオチドおよび核酸ベクターの特徴、利点および特性は、本発明のキット、作製方法および治療方法にも適用される。

【0085】

上述した特徴および以下に述べる特徴が、個々の事例で示した組み合わせだけでなく、本発明の範囲から逸脱しない限りは、他の組み合わせまたは単独でも使用可能であることは理解されるであろう。

【0086】

以下に、実施形態により本発明についてさらに説明する。これにより、本発明のさらなる特徴、特性および利点が明らかになるであろう。以下の実施形態は単なる例示であり、本発明の範囲を限定するものではない。特定の実施形態で述べられる特徴は、本発明の全体としての特徴であり、それぞれの特定の実施形態でのみ適用されるものではなく、本発明の任意の実施形態でも単独で適用されうるものである。

【図面の簡単な説明】

【0087】

以下、本発明について、下記の図面および非限定的な実施例を参照することより、さらに詳細に記載し、説明する。

【図1】ｒＡＡＶ．ｈＣＮＧＡ３ベクターゲノムの構造を示した図である。

【図2】ｐｈＡｒｒ３．ｈＣＮＧＡ３．ＷＰＲＥｍシスベクタープラスミドマップの２つの実施形態を示した図である。

【図3】片眼を本発明のベクターで処置したＣＮＧＡ３欠損マウスの代表的なＥＲＧ測定結果である。

【図4】ｒＡＡＶ．ｈＣＮＧＡ３ベクターで処置したＣＮＧＡ３欠損マウス（Ａ３ＫＯ）におけるｈＣＮＧＡ３免疫組織染色の代表的な共焦点画像である。

【図5】ＡＡＶ８．ｈＣＮＧＡ３処置後の最高矯正視力（ＢＣＶＡ）の長期的な推移を示した図である。上部のグラフ（Ａ）は、処置した被験眼のデータを示し、下側のグラフ（Ｂ）は、もう一方の非処置の対照眼のデータを示す。線はそれぞれ、１名の患者を表している。ＢＣＶＡの測定は、一定の照度下、標準化されたＥＤＴＲＳチャートを用いて行った。各患者が正読した文字の絶対数を注射前のベースライン（０）と比較した相対値を、注射後の経過時間（日数）に対してプロットする。注射直後に、ＢＣＶＡはほとんどの患者で低下したが、１８０日後の時点では、すべての患者でＢＣＶＡがベースラインと比べて改善しており、対照眼では見られない明らかな改善傾向が認められる。

【図6】ＡおよびＢ：ＡＡＶ８．ｈＣＮＧＡ３処置後の視覚皮質における代謝活動のピーク値の変化を示した図である（一例）。処置前（６Ａ）の時点では、この１色覚患者は、輝度コントラストパターンには応答したが（左カラム）、等輝度色コントラストパターンには応答しなかった（右カラム＝０）。処置後は、等輝度色シグナル（６Ｂ、右カラム）も、輝度コントラスト刺激後と同等のレベルに達した。ＣおよびＤ：同患者のｆＭＲＩシグナルを刺激提示後の時間軸に沿って分解した図である。灰色の線は、コントラスト刺激に対するシグナル振幅を示し、青色の線は、等輝度色コントラスト刺激に対するシグナル振幅を示す。処置前（Ｃ）の時点では、色刺激によるｆＭＲＩシグナル振幅の上昇は見られないが、処置後（Ｄ）は、シグナル振幅の明らかな上昇が認められる。

【実施例】

【0088】

１．本発明の核酸ベクター
この例示的な実施形態において使用するｒＡＡＶ．ｈＣＮＧＡ３ベクターは、錐体光受容体環状ヌクレオチド依存性（ＣＮＧ）カチオンチャネルのヒトＣＮＧＡ３サブユニットのｃＤＮＡを有する、ＡＡＶをベースとしたハイブリッドベクターである。ｈＣＮＧＡ３ ｃＤＮＡの発現は、錐体特異的なヒトアレスチン３（ｈＡｒｒ３）プロモーターで制御されており、変異ヤマネズミ口内炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）配列により増強されている。このベクターに含まれる発現カセットは、ＡＡＶ血清型２型逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）で挟まれており、組換えゲノムが、ＡＡＶ血清型８型カプシドにパッケージングされ、ＡＡＶ２／８ハイブリッドベクターが産生される。この発現カセットは、以下のエレメントを含む。
－ヒトアレスチン３（ｈＡｒｒ３）遺伝子プロモーター：０．４ｋｂ
－錐体光受容体環状ヌクレオチド依存性カチオンチャネルのヒトＣＮＧＡ３サブユニットｃＤＮＡ：２ｋｂ
－ＷＨＶ－ＸのオープンリーディングフレームのＡＴＧコドンに点突然変異を有するヤマネズミ口内炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）：０．５４ｋｂ
－ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル：０．２ｋｂ
－ＡＡＶ血清型２型逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）：０．１３ｋｂ
ｒＡＡＶ．ｈＣＮＧＡ３ベクターゲノムの構造を図１に示す。

【0089】

２．ｐＧＬ２．ｈＡｒｒ３．ｈＣＮＧＡ３．ＷＰＲＥｍシスベクタープラスミド
例示的な一実施形態において、４０５ｂｐの錐体光受容体特異的なヒト錐体アレスチン（ｈＡｒｒ３）プロモーター［Ｌｉ ｅｔ ａｌ，Ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｃｏｎｅ ａｒｒｅｓｔｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ Ｃｉｓ ｅｌｅｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｄｉｓｔａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｒｅｇｉｏｎ，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ＆ ｖｉｓｕａｌ ｓｃｉｅｎｃｅ，４３（２００２）１３７５－１３８３；およびＣａｒｖａｌｈｏら，Ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ａｎｄ ａｇｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｓｕａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ＣＮＧＢ３－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｃｈｒｏｍａｔｏｐｓｉａ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ，Ｈｕｍａｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０（２０１１）３１６１－３１７５を参照］と、全長（２０８５ｂｐ）ヒトＣＮＧＡ３ ｃＤＮＡ［Ｗｉｓｓｉｎｇｅｒら，Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ａｌｐｈａ－ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ｔｈｅ ｃＧＭＰ－ｇａｔｅｄ ｃｈａｎｎｅｌ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｏｎｅ ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓを参照］とを含む発現カセットを含むｐＧＬ２．ｈＡｒｒ３．ｈＣＮＧＡ３．ＷＰＲＥｍシスベクタープラスミド骨格を用いる。またこの発現カセットは、変異ＷＸＦオープンリーディングフレームを有する５４３ｂｐのヤマネズミ肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）［Ｚａｎｔａ－Ｂｏｕｓｓｉｆら，Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｕｔａｔｅｄ ＰＲＥ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｌｏｗｉｎｇ ｈｉｇｈ ａｎｄ ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗｈｉｌｅ ａｂｒｏｇａｔｉｎｇ ＷＨＶ－Ｘ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ＷＡＳ，Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ，１６（２００９），６０５－６１９］および２０７ｂｐのウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ＢＧＨ ｐＡ）も含む。配列番号８で示されるヌクレオチド配列を有する５５９１ｂｐのベクター骨格にはカナマイシン耐性遺伝子（ＫａｎＲ）が含まれており、ＫａｎＲは、Ｌ－ＩＴＲから１９４３ｂｐ、Ｒ－ＩＴＲから２８５３ｂｐかつｐＵＣ１８ ｏｒｉから２０２４ｂｐの位置に存在する。

【0090】

ｒＡＡＶ．ｈＣＮＧＡ３ベクターは、このシスベクタープラスミドとトランスｐＤＰ８－ＫａｎＲヘルパ－プラスミドの両方をヒト胎児腎臓細胞株２９３（ＨＥＫ２９３）に一過的にトランスフェクションすることにより作製される。細胞溶解液を低速で遠心分離して清澄化し、次いで、塩化セシウム勾配超遠心分離を連続して２回行うことによりベクターを精製し、タンジェンシャルフローろ過工程に供して、濃縮およびバッファー交換を行う。次いで、得られたｒＡＡＶ．ｈＣＮＧＡ３ベクター懸濁液を滅菌ろ過し、製剤としてバイアルに充填する。

【0091】

ｐｈＡｒｒ３．ｈＣＮＧＡ３．ＷＰＲＥｍベクタープラスミドマップの２つの実施形態を図２Ａおよび図２Ｂに示す。

【0092】

３．ｒＡＡＶ．ｈＣＮＧＡ３ベクターによりもたらされる生物活性および導入遺伝子発現
本発明者らは、２週齢Ｃｎｇａ３欠損マウス［Ｂｉｅｌら，Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｌｏｓｓ ｏｆ ｃｏｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｅ ｌａｃｋｉｎｇ ｔｈｅ ｃｙｃｌｉｃ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｇａｔｅｄ ｃｈａｎｎｅｌ ＣＮＧ３，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，９６（１３）：７５５３－７５５７（１９９９）］の網膜下腔にｒＡＡＶ．ｈＣＮＧＡ３ベクターを送達し、生物活性および導入遺伝子発現の有無を確認した。送達方法は、Ｍｉｃｈａｌａｋｉｓら，Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｎｅ ｖｉｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ＣＮＧＡ３－／－ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｌａｃｋ ｏｆ ｃｏｎｅ ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１８ ２０５７－２０６３（２０１０）に記載されているマウス特異的ベクターを用いた方法と同様である。マウスの処置眼（ＴＥ）には網膜下注射を行い、他方の非処置眼（ＵＥ）を対照とした。ベクターの有効性は、注射８週間後に、ｉｎ ｖｉｖｏにおける客観的な機能評価法である網膜電図検査（ＥＲＧ）により評価した。Ｃｎｇａ３欠損マウスは、錐体を介する視力を喪失している。したがって、錐体機能評価に特化したＥＲＧプロトコールは、ＣＮＧＡ３機能の間接的指標として、またｒＡＡＶ．ｈＣＮＧＡ３ベクターの生物活性（ＢＡＡ）を評価をする上でも好適である。

【0093】

代表的な結果については、図３に示す片眼をｒＡＡＶ．ｈＣＮＧＡ３ベクターで処置したＣＮＧＡ３欠損マウスの代表的なＥＲＧ測定結果（処置眼、黒色の記録波形）を参照されたい。非処置の対照眼の記録波形は灰色で示す。（７Ｈｚの暗順応下点滅刺激、５Ｈｚの明順応下点滅刺激および明順応下閃光刺激において）錐体光受容体を介する特定のＥＲＧ成分の上昇が見られ、これらはＣＮＧＡ３欠損マウスでは見られないことから、ｒＡＡＶ．ｈＣＮＧＡ３ベクターによるｈＣＮＧＡ３発現により、生物活性が付与されたことは明らかである。

【0094】

特定のＥＲＧ成分の上昇が見られたことから、ｒＡＡＶ．ｈＣＮＧＡ３ベクターで処置することにより、処置眼で明らかに治療効果が得られたことが分かる。ＥＲＧ測定終了後、マウスを屠殺し、両眼を摘出してｈＣＮＧＡ３導入遺伝子の発現を免疫組織学的に解析（導入遺伝子発現アッセイ、ＴＥＡ）するための処理を行った。この処理として、摘出した組織を固定して凍結包埋した。垂直凍結切片を、マウスＣＮＧＡ３タンパク質およびヒトＣＮＧＡ３タンパク質と結合するラットモノクローナル抗体で染色した。免疫シグナルを、Ｃｙ３標識ロバ抗ラットＩｇＧ二次抗体を用いて検出した。免疫染色した凍結切片の共焦点画像を、Ｌｅｉｃａ ＳＰ８ ＳＭＤ共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いて収集した。この抗ＣＮＧＡ３抗体により、マウスＣｎｇａ３タンパク質も検出されるため、野生型マウスの網膜の錐体光受容体外節では特異的なシグナルが認められるが、Ｃｎｇａ３欠損の網膜ではシグナルは認められない。ｒＡＡＶ．ｈＣＮＧＡ３ベクターで処置した後、処置眼の錐体光受容体外節では、ＣＮＧＡ３に対する明確で特異的なシグナルが認められたが、非処置眼では認められなかった。

【0095】

代表的な結果については、図４に示すｒＡＡＶ．ｈＣＮＧＡ３ベクターで処置したＣＮＧＡ３欠損マウス（Ａ３ＫＯ）におけるｈＣＮＧＡ３の免疫組織染色の代表的な共焦点画像を参照されたい。この抗ＣＮＧＡ３抗体（作業希釈率はすべての実験において１：５０）により、マウスＣｎｇａ３タンパク質も検出されるため、野生型マウスの網膜（左側の２つのパネル）の錐体光受容体外節（写真上部の棒状の構造）では特異的なシグナルが認められるが、非処置のＣＮＧＡ３欠損マウスの網膜（右側の２つのパネル）では特異的なシグナルは認められない。３つ目のパネルでは、ｒＡＡＶ．ｈＣＮＧＡ３ベクターでコードされるｈＣＮＧＡ３タンパク質に対する特異的なシグナルが認められるが、４つ目のパネルに示される非処置のＡ３ＫＯでは認められない。２つ目のパネルは、二次抗体のみで染色した対照染色の結果である。下段のパネルは、ＣＮＧＡ３シグナルと、錐体光受容体に特異的なマーカーであるピーナッツ凝集素および核染色色素Ｈｏｅｃｈｓｔ ４３２２とを重ね合わせた画像である。

【0096】

以上より、ｒＡＡＶ．ｈＣＮＧＡ３ベクターは、ＣＮＧＡ３欠損マウスの錐体光受容体において効率的かつ特異的にｈＣＮＧＡ３導入遺伝子を発現し、生まれつき錐体機能を有していないこのマウスに錐体を介する視力を付与する（生物活性）と結論付けることができる。

【0097】

４．非ヒト霊長動物における網膜下注射後のＡＡＶ８の体内分布および排出
別の試験として、非ヒト霊長動物に臨床グレードの組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を網膜下に単回投与し、投与後のウイルスの分布と排出を調べた。この検討事項は、本発明の遺伝子治療法の環境リスク評価にとって重要である。

【0098】

１８匹の非ヒト霊長動物（Ｍａｃａｃｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）に対して２３Ｇ経毛様体扁平部硝子体切除を行い、これを３群に分けて網膜下注射（高用量：１×１０^１２ベクターゲノム（ｖｇ）、低用量：１×１０^１１ｖｇおよび溶媒のみ）を行った。別の４匹の動物に対しては、手術侵襲の影響を受けた体内分布を模擬的に再現するために、硝子体内注射を行った。剖検時（９１日後）に、処置眼、流入領域リンパ節、唾液腺および脾臓、視神経、脳および脊髄、心臓、肺、肝臓、副腎および生殖腺からそれぞれ組織サンプルを採取した。また、ベクター投与前、ベクター投与から１日後、２日後、３日後、１週間後、４週間後および１３週間後に各動物から血液、尿、涙液および鼻腔液を綿棒で採取し、ＤＮＡ抽出およびｑＰＣＲによるベクターゲノムの定量を行った。

【0099】

処置した網膜および視神経において、ｒＡＡＶ ＤＮＡが用量依存的に検出された。また、高用量群の２匹の動物の視神経交叉で、定量可能レベルのｒＡＡＶ ＤＮＡが検出された。さらに、すべての体液において、ｒＡＡＶ ＤＮＡの一過性の排出が認められた。中でも、高用量群の涙液中の濃度が最も高かった。生殖細胞系の組織では、ＤＮＡは検出されず、ごく少数の個体のリンパ節および脾臓で散発的なシグナルが検出されたものの、その他の組織では不検出であった。処置から２４時間後および７２時間後の血液サンプルでは、定量可能レベルのｒＡＡＶベクターＤＮＡが検出されたが、それ以外の測定時点においては不検出であった。

【0100】

これらのデータは、本発明の臨床実施に関わるデータである。臨床実施に関わる被験者、治験責任医師および規制当局関係者は皆一様に、遺伝子組換え生物の使用に伴う環境リスクを確認することに関心を持っている。体液へのウイルス排出は、用量依存的に生じるようだが、標的外臓器への形質導入はごくわずかであると思われる。

【0101】

５．非ヒト霊長動物の網膜下に投与したＡＡＶ８に対する体液性免疫反応
臨床グレードの組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を非ヒト霊長動物の網膜下に単回投与した際の体液性免疫反応について情報を得ることは、本発明による網膜の遺伝子治療の安全かつ効率的な臨床試験プロトコールの開発において重要な要素である。このため、本発明者らは、ｒＡＡＶ８シュードタイピングウイルスを非ヒト霊長動物（Ｍａｃａｃｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）の網膜下に単回投与し、該動物における抗薬物抗体（ＡＤＡ）の力価を調べた。

【0102】

１８匹のサルを３群に分けて、網膜下注射（高用量：１×１０^１２ベクターゲノム（ｖｇ）、低用量：１×１０^１１ｖｇおよび溶媒のみ）を行い、これと併用して臨床試験シナリオと同等の免疫抑制療法も行った。別の４匹の動物に対しては、例えば、術中合併症後の体内分布を模擬的に再現するために、硝子体内注射を行った。ベースラインサンプルと、ベクター投与から１日後、２日後、３日後、１週間後、４週間後および１３週間後に採取したサンプルとを比較した。

【0103】

１３週間の観察期間中、低用量群のすべての動物において、抗薬物抗体（ＡＤＡ）の力価は一定であった。高用量で網膜下注射を行った群では、経時的に最も大きなばらつきが見られたものの、明確に体液性免疫反応を示すパターンは見られなかった。

【0104】

この試験により、ｈＣＮＧＡ３導入遺伝子の網膜下送達にｒＡＡＶ８の使用を想定している本発明の臨床適用に関わるデータが得られる。臨床グレードベクターおよび外科手術と、免疫抑制療法とを併用する臨床シナリオの模擬実施において、非ヒト霊長動物における抗薬物抗体の誘導は確認されなかった。

【0105】

６．ＣＮＧＡ３に関連する１色覚を有する患者におけるｒＡＡＶ８．ＣＮＧＡ３の送達の成功
この臨床介入試験（ＮＣＴ０２６１０５８２）の目的は、ＣＮＧＡ３に関連する１色覚を有する患者を対象として、本発明によるＡＡＶ８を用いた補充遺伝子治療の安全性評価を行うことである。

【0106】

本発明者らは、３４匹の非ヒト霊長動物（ＮＨＰ）を用いた用量漸増試験において広範な安全性評価を行った後、探索的な用量漸増第Ｉ／ＩＩ相臨床試験の投与量として、１×１０^１０ベクターゲノム（ｖｇ）、５×１０^１０ｖｇおよび１×１０^１１ｖｇを選択した。ＣＮＧＡ３にホモ接合性変異または複合ヘテロ接合性変異を有する合計９名の患者に対して、１×１０^１０ｖｇ（ｎ＝３）、５×１０^１０ｖｇ（ｎ＝３）または１×１０^１１ｖｇ（ｎ＝３）が含まれる０．２ｍＬの平衡塩類溶液を網膜下に単回注射した。これと併用して、手術の１日前からステロイド処置（プレドニゾロン１ｍｇ／ｋｇ／ｄ）も開始した。主要評価項目（使用の安全性）は、臨床検査および最高矯正視力（ＢＣＶＡ）により評価した。

【0107】

ＮＨＰを用いた安全性データによれば、１×１０^１２ｖｇ以下の用量で投与を行った後、試験製剤に関連する変化において投与９０日後まで継続するものはなかった。この臨床試験では、すべての患者において、それぞれ割り当てられた用量（１×１０^１０ｖｇ～１×１０^１１ｖｇ）が安全に投与され、また、網膜剥離、出血または治療不応性炎症などの術中術後合併症の発生も見られなかった。ＢＣＶＡは、処置１４日後には早くもベースラインレベルに達した。網膜色素上皮ならびに光受容体内節および光受容体外節のレベルにおける構造的変化は、手術に起因するものであった（上記参照）。

【0108】

ＮＨＰを用いた安全性試験では、１×１０^１２ｖｇ以下の用量であれば、後遺症を伴うことなく適用可能であることが示されている。この臨床試験は、網膜下にＡＡＶ８を投与する眼科遺伝子治療の初めての臨床適用例であった。この適用において、良好な忍容性が示され、併用して行ったプレドニゾロンによる処置のもとで臨床上明らかな炎症の発生も見られなかった。この適用においては、黄斑剥離が生じたものの、視力は１４日以内にベースラインレベルに達した。

【0109】

７．１色覚患者におけるＡＡＶ８．ｈＣＮＧＡ３の網膜下送達後の安全性
主要評価項目としての安全性は、眼性炎症の有無を調べる臨床検査（スリットランプ、眼底鏡検査、血管造影、視野測定または電気生理検査）により評価した。現段階（試験開始から１５ヶ月経過）において、処置を行ったすべての患者に対して３ヶ月間以上の経過観察を行っており、これまで重篤な有害事象は一切報告されていない。さらに、別の処置を必要とする眼性有害事象も一切認められておらず、後遺症が生じたり解消に至っていない非眼性有害事象も認められていない。総じて、これらの結果は、ＮＨＰを用いた前臨床毒性試験で確認された優れた安全性プロファイルを反映するものである。

【0110】

８．１色覚患者におけるＡＡＶ８．ｈＣＮＧＡ３の網膜下送達後の有効性
この安全性試験の主要目的には当たらないが、今後の有効性試験における評価項目として適切か否かを判断するために、いくつかの有効性評価項目を探索的に選択した。この有効性評価項目には、最大矯正視力、患者報告評価指標などが含まれる。

【0111】

最大矯正視力は、眼科臨床試験において最も重要な評価項目の１つである。この評価項目に関して、本文献の提出時に入手できたすべてのデータにおいて、上記処置による継続的かつ／または実質的な有害作用は認められなかった。手術により視力が一時的に低下することがある（想定内）が、少なくとも６ヶ月間の経過観察を行ったところ、すべての患者で視力の改善が見られ、１２ヶ月間の経過観察においても、すべての患者で継続的な視力の改善が確認されている。この結果は、図５のグラフ（上側のグラフ（Ａ）：処置眼、下側のグラフ（Ｂ）：非処置眼）に示されている。

【0112】

患者報告評価指標は、一般に患者の生活の質にとって重要なパラメータを反映するものであり、そのため、試験プロトコールにおけるその重要性は高まっている。この現在進行中の試験（ＮＣＴ０２６１０５８２）の中間結果によれば、被験患者の大半が、ｒＡＡＶ．ｈＣＮＧＡ３の網膜下注射後、主要な症状の１つであるグレアが急速かつ顕著に改善したことを報告している。またほとんどの被験患者が、文字および数字の認識ならびに注視能力が改善したことを報告している。これらの予備的結果は、３用量群すべてで極めて均等に認められた。

【0113】

全視野刺激法および機能的磁気共鳴画像法（ｆＭＲＩ）を用いて、治療領域および錐体光受容体系で生じた刺激による、視覚皮質の局所的代謝活動を定量化した。それぞれ３名の患者で構成される３群において、錐体機能を局所的に回復させる目的で、被験眼をそれぞれ低用量、中用量または高用量のＡＡＶ８．ｈＣＮＧＡ３で処置する遺伝子治療を行った。ｆＭＲＩは、処置前および処置３ヶ月後に実施した。これにより、各測定時点における視覚皮質および脳全体のネットワークの（再）編成の評価と、正常３色覚者から収集した同様の応答との比較が可能であった。各ｆＭＲＩセッションにおいて、被検者に対して、薄明光下で以下の３種類の視覚刺激実験を行った：ａ）網膜位置マッピング、ｂ）等輝度色コントラスト（１色覚の網膜では分解不可能）と輝度コントラストとの比較、ならびにｃ）低コントラスト（３％）および高コントラスト（５０％）における空間周波数の格子縞（視覚１度あたりの周期：０．３、１および５）。いずれの患者も、処置前のベースライン応答として、等輝度色刺激に対しては応答が非常に弱いか応答がなかった（図６Ａの右側）のに対し、輝度コントラストに対しては、予想された通り、等輝度色刺激よりはるかに大きな応答が見られた（図６Ａの左側の灰色のカラム）。ただし、いずれの応答も、対照群より小さくかつ遅かった。３ヶ月間後、すべてのケースでシグナルの全体的な上昇が確認された。重要なことに、中用量群および高用量群（図６Ｂの右側の青色のカラム）においては、ＭＲＩシグナルの振幅が、輝度コントラスト刺激（図６Ｂの左側の灰色のカラム）に対する応答で見られるシグナル振幅と同等レベルまで達した被検者もいた。図６Ｃ（処置前）および図６Ｄ（処置後）に、図６Ａおよび図６Ｂにそれぞれ対応する同様のデータを示す。これらの図は、ｆＭＲＩシグナルを、刺激の提示後の時間軸（秒）に沿って分解したものである（コントラスト刺激：灰色、等輝度色刺激：青色）。シグナルがピークに達するのは、約１０秒後である。患者（中用量群の代表的な例）。

【0114】

中程度またはそれより高い空間周波数に対する応答が増大することも確認された（図示外）。これらの結果は、錐体機能を喪失している状態では分解不可能な等輝度色刺激で脳が活性化していることを示すとともに、ＡＡＶ８．ｈＣＮＧＡ３遺伝子治療後の脳可塑性を示すものであり、上記の患者（中用量群の代表的な例）において錐体が関与する脳経路を活性化させることができたことを示す初めての証拠を提示するものである。

【0115】

９．核酸配列
以下のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は添付の配列表に記載されている。
ｈＡｒｒ３プロモーターヌクレオチド配列：配列番号１
ｈＣＮＧＡ３ヌクレオチド配列：配列番号２
ｈＣＮＧＡ３アミノ酸配列：配列番号３
ＷＰＲＥｍヌクレオチド配列：配列番号４
ＢＧＨ ｐＡヌクレオチド配列：配列番号５
Ｌ－ＩＴＲヌクレオチド配列：配列番号６
Ｒ－ＩＴＲヌクレオチド配列：配列番号７
ｐＧＬ２．ＫａｎＲベクター骨格ヌクレオチド配列：配列番号８

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

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