特許 7006988 冬虫夏草菌の発芽胞子の生成促進におけるメチルファルネシルエステルの用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-01-11

(45)【発行日】2022-01-24

(54)【発明の名称】冬虫夏草菌の発芽胞子の生成促進におけるメチルファルネシルエステルの用途

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/38 20060101AFI20220117BHJP

   C12N 1/36 20060101ALI20220117BHJP

   C12N 1/14 20060101ALI20220117BHJP

【ＦＩ】

C12N1/38

C12N1/36

C12N1/14 B

【請求項の数】 10

(21)【出願番号】P 2020195688

(22)【出願日】2020-11-26

(65)【公開番号】P2021132637

(43)【公開日】2021-09-13

【審査請求日】2020-11-26

(31)【優先権主張番号】202010111983.1

(32)【優先日】2020-02-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】516168849

【氏名又は名称】広東省科学院動物研究所

(74)【代理人】

【識別番号】100095407

【弁理士】

【氏名又は名称】木村 満

(74)【代理人】

【識別番号】100132883

【弁理士】

【氏名又は名称】森川 泰司

(74)【代理人】

【識別番号】100148633

【弁理士】

【氏名又は名称】桜田 圭

(74)【代理人】

【識別番号】100147924

【弁理士】

【氏名又は名称】美恵 英樹

(72)【発明者】

【氏名】劉 桂清

(72)【発明者】

【氏名】曹 莉

(72)【発明者】

【氏名】韓 日畴

【審査官】佐久 敬

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１４－３９３２（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００１－６９８５０（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開平９－３２７２３２（ＪＰ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１０３９８１１０５（ＣＮ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１０４３９６５７２（ＣＮ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１０４０２５９００（ＣＮ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１０３２９９８２１（ＣＮ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１０１６２７７００（ＣＮ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１０１２１５５２７（ＣＮ，Ａ）

【文献】韓国公開特許第１０－２００６－００５７２３９（ＫＲ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

冬虫夏草菌の発芽胞子の生成促進におけるメチルファルネシルエステルの使用。

【請求項2】

冬虫夏草菌を接種した培養培地に前記メチルファルネシルエステルを添加して培養することを特徴とする、請求項１に記載の使用。

【請求項3】

液体培養培地中の前記メチルファルネシルエステルの濃度が１０ｍｇ／Ｌ～１ｇ／Ｌであることを特徴とする、請求項２に記載の使用。

【請求項4】

冬虫夏草菌の発芽胞子の数を増やすための調製物の調製におけるメチルファルネシルエステルの使用。

【請求項5】

冬虫夏草菌をメチルファルネシルエステルを添加した培養培地に接種し、培養して、冬虫夏草菌の発芽胞子を得ることを特徴とする、冬虫夏草菌の発芽胞子の数を増やすための方法。

【請求項6】

前記培養培地は、液体培養培地であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記液体培養培地中の前記メチルファルネシルエステルの濃度が１０ｍｇ／Ｌ～１ｇ／Ｌであることを特徴とする、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記冬虫夏草菌は、接種母液として冬虫夏草菌を接種した菌塊を３０日間培養した培養液であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。

【請求項9】

前記培養培地は、１５０ｍＬあたり３０ｇのジャガイモ、１．５ｇのペプトン、３ｇのマルトース、０．０８ｇの硫酸マグネシウム、０．２５ｇのリン酸二水素カリウム、３ｍｇのビタミンＢ_１を含み、残りは水であることを特徴とする、請求項５、６または７に記載の方法。

【請求項10】

前記培養の培養条件は、１２±２℃、１００ｒｐｍ、暗所培養であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、真菌培養の技術分野に関し、具体的には、冬虫夏草菌（Ｃｏｒｄｙ ｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓＳａｃｃ）の発芽胞子の生成促進におけるメチルファルネシルエステルの用途に関する。

【背景技術】

【0002】

シネンシストウチュウカソウ（Ｏｐｈｉｏｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）は中国の伝統的で貴重な漢方薬であり、ジンセン、鹿の角とともに中国医学の３つの宝物として知られている。シネンシストウチュウカソウは、ヘピアリダエＨｅｐｉａｌｉｄａｅ幼虫に冬虫夏草菌（中華Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ、中国Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍとも呼ばれる）が感染することによって形成された、死んだ昆虫と真菌の複合体である。シネンシストウチュウカソウの天然資源は非常に限られて、シネンシストウチュウカソウの人工培養は、この希少な生物資源とその生息地の生態環境を保護し、人々と市場の発展のニーズを満たすためである。

【0003】

１９７０年代後半から、中国は冬虫夏草菌の人工培養技術を開始し、冬虫夏草菌のアナモルフィック菌の発酵・培養を通じて、例えば、冬虫夏草菌の発酵の菌糸体から作られた「コーブリンカプセル」など、多くの代替製品が開発・生産され、中国の重要な新薬と見なされてきた。また、青海チベット高原の生態環境をシミュレートすることにより、低高度環境で、ヘピアリダエの幼虫に冬虫夏草菌が感染することによるシネンシストウチュウカソウの人工培養も近年成功した。研究によると、冬虫夏草菌は、ヘピアリダエの幼虫の血液腔に発芽胞子の形で存在する。体表感染と比較すると、ヘピアリダエの幼虫の血液腔に発芽胞子を注射することにより、ヘピアリダエ幼虫の体表面への付着と体壁への貫通が減少するため、シネンシストウチュウカソウの人工培養周期が短縮され、そして、高濃度の発芽胞子の注射により、ヘピアリダエの血液腔で発芽胞子の増殖時間を短縮できる。したがって、感染用の発芽胞子をどのように入手するかは、シネンシストウチュウカソウの人工培養で解決すべき緊急の問題であり、この問題を解決することは、シネンシストウチュウカソウの人工培養コストを節約するのに有益である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

上記の問題を解決するために、本発明の目的は、冬虫夏草菌の発芽胞子の生成促進におけるメチルファルネシルエステルの用途を提供することである。冬虫夏草菌の培養培地にメチルファルネシルエステルを添加することにより、培養液中の冬虫夏草菌の発芽胞子の数を増加させることができ、シネンシストウチュウカソウの人工培養産業に重要な技術的サポートを提供する。

【課題を解決するための手段】

【0005】

メチルファルネシルエステル(ＣＡＳ:１０４８５-７０-８)は、その構造式は次の通りである。

【化1】

【0006】

本発明は、実験を通じて、冬虫夏草菌の培養培地にメチルファルネシルエステルを添加することにより、冬虫夏草菌の発芽胞子の数を増加させることができる。

【0007】

従って、本発明の第１の目的は、冬虫夏草菌の発芽胞子の生成促進におけるメチルファルネシルエステルの用途を提供することである。

【0008】

その用途は、冬虫夏草菌を接種した培養培地にメチルファルネシルエステルを添加して培養することである。

【0009】

メチルファルネシルエステルは、液体培養培地中の濃度が１０ｍｇ／Ｌ～１ｇ／Ｌである。

【0010】

本発明の第２の目的は、冬虫夏草菌の発芽胞子の数を増やすための調製物の調製におけるメチルファルネシルエステルの用途を提供することである。

【0011】

本発明の第３の目的は、冬虫夏草菌の発芽胞子の数を増やすための培養方法を提供し、メチルファルネシルエステルを添加した培養培地に冬虫夏草菌を接種し培養して、冬虫夏草菌の発芽胞子を得る。

【0012】

培養培地は、液体培養培地であることが好ましい。

【0013】

メチルファルネシルエステルは、液体培養培地中の濃度が１０ｍｇ／Ｌ～１ｇ／Ｌである。

【0014】

冬虫夏草菌は、接種母液として冬虫夏草菌を接種した菌塊を３０日間培養した培養液である。

【0015】

液体培養培地は、１５０ｍＬあたり、３０ｇのジャガイモ、１．５ｇのペプトン、３ｇのマルトース、０．０８ｇの硫酸マグネシウム、０．２５ｇのリン酸二水素カリウム、３ｍｇのビタミンＢ_１、を含み、残りは水であることが好ましい。

【0016】

培養条件は、１２±２℃、１００ｒｐｍ、暗所培養であることが好ましい。

【発明の効果】

【0017】

本発明は、昆虫－細菌結合によるシネンシストウチュウカソウの人工培養過程において、感染用の多数の発芽胞子を迅速に取得する問題を解決するために、冬虫夏草菌の培養培地にメチルファルネシルエステルを添加し、冬虫夏草菌に発芽胞子を効率的に生成させ、メチルファルネシルエステルを添加した培養培地中に冬虫夏草菌を接種した母液を添加し３０日間培養した後生成された発芽胞子の数は、未添加群の２．３５～５．５６倍であり、４５日間培養した後の発芽胞子の数は、未添加群の４４．４～７９．２倍である。本発明によれば、ヘピアリダエに対する注射感染による人工培養の昆虫－細菌結合シネンシストウチュウカソウの発芽胞子をより効率的に得ることができ、シネンシストウチュウカソウの人工培養の時間を短縮し、人工培養コストを節約する。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】本発明の接種培養によって得られた冬虫夏草菌の発芽胞子（４００×）を示す。

【図2】本発明の冬虫夏草菌の液体培養である。

【発明を実施するための形態】

【0019】

以下、実施例を参照して本発明をさらに説明するが、本発明はこれに限定されない。

【0020】

以下の実施例では、接種母液として冬虫夏草菌を接種した菌塊を３０ｄ培養した後の培養液である。

【0021】

接種母液は、次のように調製される。
１５０ｍＬ液体培養培地に１ｃｍ^２角の冬虫夏草菌の気中菌糸塊を接種し、１００ｒｐｍで１２±２℃の培養室で、３０日間暗所培養して得られた冬虫夏草菌培養液を接種母液とし、接種母液に少量の発芽胞子（濃度１５個／ｍＬ）を含有する。１５０ｍＬ液体培養培地は、ジャガイモ３０ｇの煮沸濾過液（皮をむいたジャガイモ３０ｇを秤量し、適量の水を加えて２０分間煮沸し、濾過して、ジャガイモ３０ｇの煮沸濾過液を調製）、１．５ｇのペプトン、３ｇのマルトース、０．０８ｇの硫酸マグネシウム、０．２５ｇのリン酸二水素カリウム、３ｍｇのビタミンＢ_１を２５０ｍＬのフラスコに入れ、水を加えて容量を１５０ｍＬにし、オートクレーブし、１２±２℃の培養室で予冷する。

【0022】

実施例１：
冬虫夏草菌の液体培養培地の調製：ジャガイモ３０ｇの煮沸濾過液（皮をむいたジャガイモ３０ｇを秤量し、適量の水を加えて２０分間煮沸し、濾過して、ジャガイモ３０ｇの煮沸濾過液を調製）、１．５ｇのペプトン、３ｇのマルトース、０．０８ｇの硫酸マグネシウム、０．２５ｇのリン酸二水素カリウム、３ｍｇのビタミンＢ_１を２５０ｍＬフラスコに入れ、水を加えて容量を１５０ｍＬにし、オートクレーブし、１２±２℃の培養室で予冷した。

【0023】

予冷した培養培地に３７．５ｍｇメチルファルネシルエステル（最終濃度２５０ｍｇ／Ｌ、対照としてメチルファルネシルエステルを含まない）を添加し、各ボルトの培養培地に１ｍＬの接種母液を接種し、各ボルトの培養培地に約１５個の発芽胞子が含まれ、フラスコを回転数１００ｒｐｍのシェーカーに置き、１２±２℃で、暗所条件で３０日間培養した後、１ｍＬの培養菌液（図２）を取り出し、血球計算器でカウントされた発芽胞子の数が３．８８×１０^６個／ｍＬに達し、メチルファルネシルエステル未添加群の４．８５倍であった。４５日間培養した後、１ｍＬの培養菌液を取り出し、血球計算器でカウントされた発芽胞子の数が３．５５×１０^８個／ｍＬに達し、メチルファルネシルエステル未添加群の７１倍であった。培養菌液を顕微鏡で観察すると、発芽胞子がはっきりと見え、具体的には図１に示す。

【0024】

実施例２：
冬虫夏草菌の液体培養培地の調製：ジャガイモ３０ｇの煮沸濾過液（皮をむいたジャガイモ３０ｇを秤量し、適量の水を加えて２０分間煮沸し、濾過して、ジャガイモ３０ｇの煮沸濾過液を調製）、１．５ｇのペプトン、３ｇのマルトース、０．０８ｇの硫酸マグネシウム、０．２５ｇのリン酸二水素カリウム、３ｍｇのビタミンＢ_１を２５０ｍＬフラスコに入れ、水を加えて容量を１５０ｍＬにし、オートクレーブし、１２±２℃の培養室で予冷した。

【0025】

予冷した培養培地に１８．７５ｍｇメチルファルネシルエステル（最終濃度１２５ｍｇ／Ｌ、対照としてメチルファルネシルエステルを含まない）を添加し、各ボルト培養培地に１ｍＬの接種母液を接種し、各ボルトの培養培地に約１５個の発芽胞子が含まれ、フラスコを回転数１００ｒｐｍのシェーカーに置き、１２±２℃で、暗所条件で３０日間培養した後、１ｍＬの培養菌液を取り出し、血球計算器でカウントされた発芽胞子の数が３．０２×１０^６個／ｍＬに達し、メチルファルネシルエステル未添加群の３．７８倍であった。４５日間培養した後、１ｍＬ培養菌液を取り出し、血球計算器でカウントされた発芽胞子の数が２．８９×１０^８個／ｍＬに達し、メチルファルネシルエステル未添加群の５７．８倍であった。

【0026】

実施例３：
冬虫夏草菌の液体培養培地の調製：ジャガイモ３０ｇの煮沸濾過液（皮をむいたジャガイモ３０ｇを秤量し、適量の水を加えて２０分間煮沸し、濾過して、ジャガイモ３０ｇの煮沸濾過液を調製）、１．５ｇのペプトン、３ｇのマルトース、０．０８ｇの硫酸マグネシウム、０．２５ｇのリン酸二水素カリウム、３ｍｇのビタミンＢ_１を２５０ｍＬフラスコに入れ、水を加えて容量を１５０ｍＬにし、オートクレーブし、１２±２℃の培養室で予冷した。

【0027】

予冷した培養培地中に１５０ｍｇメチルファルネシルエステル（最終濃度１ｇ／Ｌ、対照としてメチルファルネシルエステルを含まない）を添加し、各ボルトの培養培地に１ｍＬの接種母液を接種し、各ボルトの培養培地に約１５個の発芽胞子が含まれ、フラスコを回転数１００ｒｐｍのシェーカーに置き、１２±２℃で、暗所条件で３０日間培養した後、１ｍＬ培養菌液を取り出し、血球計算器でカウントされた発芽胞子の数が４．４５×１０^６個／ｍＬに達し、メチルファルネシルエステル未添加群の５．５６倍であった。４５日間培養した後、１ｍＬ培養菌液を取り出し、血球計算器でカウントされた発芽胞子の数が３．９６×１０^８個／ｍＬに達し、メチルファルネシルエステル未添加群の７９．２倍であった。

【0028】

実施例４：
冬虫夏草菌の液体培養培地の調製：ジャガイモ３０ｇの煮沸濾過液（皮をむいたジャガイモ３０ｇを秤量し、適量の水を加えて２０分間煮沸し、濾過して、ジャガイモ３０ｇの煮沸濾過液を調製）、１．５ｇのペプトン、３ｇのマルトース、０．０８ｇの硫酸マグネシウム、０．２５ｇのリン酸二水素カリウム、３ｍｇのビタミンＢ_１を２５０ｍＬフラスコに入れ、水を加えて容量を１５０ｍＬにし、オートクレーブし、１２±２℃の培養室で予冷した。

【0029】

予冷した培養培地に１．５ｍｇメチルファルネシルエステル（最終濃度１０ｍｇ／Ｌ、対照としてメチルファルネシルエステルを含まない）、各ボルトの培養培地に１ｍＬ接種母液を接種し、各ボルトの培養培地に約１５個の発芽胞子が含まれ、フラスコを回転数１００ｒｐｍのシェーカーに置き、１２±２℃で、暗所条件で３０日間培養した後、１ｍＬ培養菌液を取り出し、血球計算器でカウントされた発芽胞子の数が１．８８×１０^６個／ｍＬに達し、メチルファルネシルエステル未添加群の２．３５倍であった。４５日間培養した後、１ｍＬ培養菌液を取り出し、血球計算器でカウントされた発芽胞子の数が２．２２×１０^８個／ｍＬに達し、メチルファルネシルエステル未添加群の４４．４倍であった。

【0030】

対照例１：
冬虫夏草菌の液体培養培地の調製：ジャガイモ３０ｇの煮沸濾過液（皮をむいたジャガイモ３０ｇを秤量し、適量の水を加えて２０分間煮沸し、濾過して、ジャガイモ３０ｇの煮沸濾過液を調製）、１．５ｇのペプトン、３ｇのマルトース、０．０８ｇの硫酸マグネシウム、０．２５ｇのリン酸二水素カリウム、３ｍｇのビタミンＢ_１を２５０ｍＬフラスコに入れ、水を加えて容量を１５０ｍＬにし、オートクレーブし、１２±２℃の培養室で予冷した。

【0031】

各ボルトに予冷した培養培地に１ｍＬの接種母液を接種し、各ボルトの培養培地に約１５個の発芽胞子が含まれ、フラスコを回転数１００ｒｐｍのシェーカーに置き、１２±２℃で、暗所条件で３０日間培養した後、１ｍＬの培養菌液を取り出し、血球計算器でカウントされた発芽胞子の数が８×１０^５個／ｍＬに達した。４５日間培養した後、１ｍＬの培養菌液を取り出し、血球計算器でカウントされた発芽胞子の数が５×１０^６個／ｍＬに達した。

【0032】

対照例２：
冬虫夏草菌の液体培養培地の調製：ジャガイモ３０ｇの煮沸濾過液（皮をむいたジャガイモ３０ｇを秤量し、適量の水を加えて２０分間煮沸し、濾過して、ジャガイモ３０ｇの煮沸濾過液を調製）、１．５ｇのペプトン、３ｇのマルトース、０．０８ｇの硫酸マグネシウム、０．２５ｇのリン酸二水素カリウム、３ｍｇのビタミンＢ_１を２５０ｍＬフラスコに入れ、水を加えて容量を１５０ｍＬにし、オートクレーブし、１２±２℃の培養室で予冷した。

【0033】

各ボルトに予冷した培養培地に１ｍＬの接種母液を接種し、各ボルトの培養培地に約１５個の発芽胞子が含まれ、フラスコを回転数１００ｒｐｍのシェーカーに置き、１２±２℃で、暗所条件で３０日間培養した後、１ｍＬ培養菌液を取り出し、血球計算器でカウントされた発芽胞子の数が７．７５×１０^５個／ｍＬに達した。４５日間培養した後、１ｍＬ培養菌液を取り出し、血球計算器でカウントされた発芽胞子の数が４．８８×１０^６個／ｍＬに達した。

【0034】

対照例３：
冬虫夏草菌の液体培養培地の調製：ジャガイモ３０ｇの煮沸濾過液（皮をむいたジャガイモ３０ｇを秤量し、適量の水を加えて２０分間煮沸し、濾過して、ジャガイモ３０ｇの煮沸濾過液を調製）、１．５ｇのペプトン、３ｇのマルトース、０．０８ｇの硫酸マグネシウム、０．２５ｇのリン酸二水素カリウム、３ｍｇのビタミンＢ_１を２５０ｍＬフラスコに入れ、水を加えて容量を１５０ｍＬにし、オートクレーブし、１２±２℃の培養室で予冷した。

【0035】

各ボルトに予冷した培養培地に１ｍＬの接種母液を接種し、各ボルトの培養培地に約１５個の発芽胞子が含まれ、フラスコを回転数１００ｒｐｍのシェーカーに置き、１２±２℃で、暗所条件で３０日間培養した後、１ｍＬの培養菌液を取り出し、血球計算器でカウントされた発芽胞子の数が７．２２×１０^５個／ｍＬに達した。４５日間培養した後、１ｍＬ培養菌液を取り出し、血球計算器でカウントされた発芽胞子の数が４．９３×１０^６個／ｍＬに達した。

【0036】

（付記）
（付記１）
冬虫夏草菌の発芽胞子の生成促進におけるメチルファルネシルエステルの使用。

【0037】

（付記２）
冬虫夏草菌を接種した培養培地に前記メチルファルネシルエステルを添加して培養することを特徴とする、付記１に記載の使用。

【0038】

（付記３）
液体培養培地中の前記メチルファルネシルエステルの濃度が１０ｍｇ／Ｌ～１ｇ／Ｌであることを特徴とする、付記２に記載の使用。

【0039】

（付記４）
冬虫夏草菌の発芽胞子の数を増やすための調製物の調製におけるメチルファルネシルエステルの使用。

【0040】

（付記５）
冬虫夏草菌をメチルファルネシルエステルを添加した培養培地に接種し、培養して、冬虫夏草菌の発芽胞子を得ることを特徴とする、冬虫夏草菌の発芽胞子の数を増やすための方法。

【0041】

（付記６）
前記培養培地は、液体培養培地であることを特徴とする、付記５に記載の方法。

【0042】

（付記７）
前記液体培養培地中の前記メチルファルネシルエステルの濃度が１０ｍｇ／Ｌ～１ｇ／Ｌであることを特徴とする、付記６に記載の方法。

【0043】

（付記８）
前記冬虫夏草菌は、接種母液として冬虫夏草菌を接種した菌塊を３０日間培養した培養液であることを特徴とする、付記５に記載の方法。

【0044】

（付記９）
前記培養培地は、１５０ｍＬあたり３０ｇのジャガイモ、１．５ｇのペプトン、３ｇのマルトース、０．０８ｇの硫酸マグネシウム、０．２５ｇのリン酸二水素カリウム、３ｍｇのビタミンＢ_１を含み、残りは水であることを特徴とする、付記５、６または７に記載の方法。

【0045】

（付記１０）
前記培養の培養条件は、１２±２℃、１００ｒｐｍ、暗所培養であることを特徴とする、付記５に記載の方法。

【図1】

【図2】