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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-01-12
(45)【発行日】2022-01-25
(54)【発明の名称】クロマグロの遺伝的性判別マーカーおよび遺伝的性判別方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20220117BHJP
C12Q 1/6827 20180101ALI20220117BHJP
C12Q 1/6879 20180101ALI20220117BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z ZNA
C12Q1/6827 Z
C12Q1/6879 Z
【請求項の数】
6
(21)【出願番号】P 2017219660
(22)【出願日】2017-11-15
(65)【公開番号】P2019088234
(43)【公開日】2019-06-13
【審査請求日】2020-08-13
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２８年度、農林水産省、国際漁業資源評価調査・情報提供委託事業、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
(73)【特許権者】
【識別番号】501168814
【氏名又は名称】国立研究開発法人水産研究・教育機構
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】特許業務法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】藤原 篤志
(72)【発明者】
【氏名】秋田 鉄也
(72)【発明者】
【氏名】鈴木 伸明
【審査官】長谷川 強
(56)【参考文献】
【文献】Nippon Suisan Gakkaishi, 2011, Vol.77, No.4,p.639-646
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／１１
Ｃ１２Ｑ １／６８２７
Ｃ１２Ｑ １／６８７９
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
クロマグロ被検体のゲノムＤＮＡを含有する試料の、配列番号１で表される塩基配列の５０１番目の塩基、５６１および５６２番目の塩基、５６４番目の塩基、５９５番目の塩基、６４４番目の塩基、７６９番目の塩基、７７０番目の塩基、７８９番目の塩基、１１９８番目の塩基、１２００番目の塩基、１２１３番目の塩基、１２７５番目の塩基、１２８０番目の塩基、１３３８番目の塩基、１３４４番目の塩基、１４１６～１４２３番目の塩基、１４７２番目の塩基、１４９３番目の塩基、１８６６番目の塩基、１８６７番目の塩基、１８９９番目の塩基、１９１３番目の塩基、２５８３番目の塩基、２５８８番目の塩基、２５８９番目の塩基、２６１１番目の塩基、２６２２番目の塩基、２６３４番目の塩基、２６４３番目の塩基、２６８７番目の塩基、２６９３番目の塩基、２７５２番目の塩基、２７５３番目の塩基、２７５６番目の塩基、２８０１番目の塩基、２８１７番目の塩基、２８５５番目の塩基、２８７４番目の塩基、２９０１番目の塩基、３０５７番目の塩基、３０９３番目の塩基、３１３９番目の塩基、３１４６番目の塩基、３１４８番目の塩基、３１９６番目の塩基、３１９９番目の塩基、３２４９番目の塩基、３２５１番目の塩基、３３６８番目の塩基、３４０４番目の塩基、３４０７番目の塩基、３４２６番目の塩基、３４３３番目の塩基、３４４２番目の塩基、３４７０番目の塩基、３４７９番目の塩基、３５４５番目の塩基、３５４６番目の塩基、３７３５番目の塩基、３７５６番目の塩基、３７６９番目の塩基、３７８８番目の塩基、６２５６番目の塩基、６３１２番目の塩基、６４５５番目の塩基、６５８５番目の塩基、６７８１番目の塩基、６８７９番目の塩基、６９３０番目の塩基、６９３３番目の塩基、６９４０番目の塩基、６９４１番目の塩基、６９８７番目の塩基並びに７０１４番目の塩基の位置に存在するＤＮＡ多型からなる群から選択される１以上のＤＮＡ多型を検出する、クロマグロの性判別方法。
【請求項2】
さらに、前記ＤＮＡ多型が下記表に示される雌の遺伝子型を有する場合にクロマグロ被検体が雌であると判別し、前記ＤＮＡ多型が下記表に示される雄の遺伝子型を有する場合にクロマグロ被検体が雄であると判別するものである、請求項１記載の方法。【表1】
【請求項3】
前記ＤＮＡ多型の検出をＰＣＲにより行うものである、請求項１または２記載の方法。
【請求項4】
配列番号１で表される塩基配列の５０１番目の塩基、５６１および５６２番目の塩基、５６４番目の塩基、５９５番目の塩基、６４４番目の塩基、７６９番目の塩基、７７０番目の塩基、７８９番目の塩基、１１９８番目の塩基、１２００番目の塩基、１２１３番目の塩基、１２７５番目の塩基、１２８０番目の塩基、１３３８番目の塩基、１３４４番目の塩基、１４１６～１４２３番目の塩基、１４７２番目の塩基、１４９３番目の塩基、１８６６番目の塩基、１８６７番目の塩基、１８９９番目の塩基、１９１３番目の塩基、２５８３番目の塩基、２５８８番目の塩基、２５８９番目の塩基、２６１１番目の塩基、２６２２番目の塩基、２６３４番目の塩基、２６４３番目の塩基、２６８７番目の塩基、２６９３番目の塩基、２７５２番目の塩基、２７５３番目の塩基、２７５６番目の塩基、２８０１番目の塩基、２８１７番目の塩基、２８５５番目の塩基、２８７４番目の塩基、２９０１番目の塩基、３０５７番目の塩基、３０９３番目の塩基、３１３９番目の塩基、３１４６番目の塩基、３１４８番目の塩基、３１９６番目の塩基、３１９９番目の塩基、３２４９番目の塩基、３２５１番目の塩基、３３６８番目の塩基、３４０４番目の塩基、３４０７番目の塩基、３４２６番目の塩基、３４３３番目の塩基、３４４２番目の塩基、３４７０番目の塩基、３４７９番目の塩基、３５４５番目の塩基、３５４６番目の塩基、３７３５番目の塩基、３７５６番目の塩基、３７６９番目の塩基、３７８８番目の塩基、６２５６番目の塩基、６３１２番目の塩基、６４５５番目の塩基、６５８５番目の塩基、６７８１番目の塩基、６８７９番目の塩基、６９３０番目の塩基、６９３３番目の塩基、６９４０番目の塩基、６９４１番目の塩基、６９８７番目の塩基並びに７０１４番目の塩基の位置に存在するＤＮＡ多型からなる群から選択される１以上のＤＮＡ多型を含む領域を増幅することができる、クロマグロの性判別用プライマー。
【請求項5】
配列番号１で表される塩基配列の５０１番目の塩基、５６１および５６２番目の塩基、５６４番目の塩基、５９５番目の塩基、６４４番目の塩基、７６９番目の塩基、７７０番目の塩基、７８９番目の塩基、１１９８番目の塩基、１２００番目の塩基、１２１３番目の塩基、１２７５番目の塩基、１２８０番目の塩基、１３３８番目の塩基、１３４４番目の塩基、１４１６～１４２３番目の塩基、１４７２番目の塩基、１４９３番目の塩基、１８６６番目の塩基、１８６７番目の塩基、１８９９番目の塩基、１９１３番目の塩基、２５８３番目の塩基、２５８８番目の塩基、２５８９番目の塩基、２６１１番目の塩基、２６２２番目の塩基、２６３４番目の塩基、２６４３番目の塩基、２６８７番目の塩基、２６９３番目の塩基、２７５２番目の塩基、２７５３番目の塩基、２７５６番目の塩基、２８０１番目の塩基、２８１７番目の塩基、２８５５番目の塩基、２８７４番目の塩基、２９０１番目の塩基、３０５７番目の塩基、３０９３番目の塩基、３１３９番目の塩基、３１４６番目の塩基、３１４８番目の塩基、３１９６番目の塩基、３１９９番目の塩基、３２４９番目の塩基、３２５１番目の塩基、３３６８番目の塩基、３４０４番目の塩基、３４０７番目の塩基、３４２６番目の塩基、３４３３番目の塩基、３４４２番目の塩基、３４７０番目の塩基、３４７９番目の塩基、３５４５番目の塩基、３５４６番目の塩基、３７３５番目の塩基、３７５６番目の塩基、３７６９番目の塩基、３７８８番目の塩基、６２５６番目の塩基、６３１２番目の塩基、６４５５番目の塩基、６５８５番目の塩基、６７８１番目の塩基、６８７９番目の塩基、６９３０番目の塩基、６９３３番目の塩基、６９４０番目の塩基、６９４１番目の塩基、６９８７番目の塩基並びに７０１４番目の塩基の位置に存在するＤＮＡ多型からなる群から選択される１以上のＤＮＡ多型を検出することができる、クロマグロの性判別用プローブ。
【請求項6】
請求項４記載のプライマーおよび／または請求項５記載のプローブを含む、クロマグロの性判別用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、クロマグロの性別特異的なＤＮＡ多型を含む遺伝的性判別マーカーおよび当該ＤＮＡ多型を検出するクロマグロの遺伝的性判別方法に関する。
【背景技術】
【0002】
日本は世界最大のマグロ消費国であることから、マグロ類の資源管理や持続的利用に関して国際的な責任を負っている。資源管理施策の立案には、漁獲物や資源調査サンプルから取得された各種の生物情報を必要とし、体長、年齢、種等のデータとともに、性別データは重要な情報の１つである。
【0003】
現在、クロマグロ（Ｔｈｕｎｎｕｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）の性判別は、生殖腺の目視あるいは組織学的切片観察という古典的な手法により行われている。しかし、これらの手法には、１）生殖腺が発達していない稚仔魚および若齢個体、並びに市場流通する内臓処理済み個体の性判別には利用できない、２）検査に労力と時間がかかる、３）個体を生かした状態で性判別することが困難である、という欠点がある。そのため、クロマグロ資源調査サンプルの大部分で性別データが欠損したままとなり、クロマグロ生活史における時間的・空間的な移動・分布と性別との関連性は全く分かっていない。また、近年のマグロ養殖では、天然ヨコワから人工種苗への転換が進められているが、飼育個体を生かした状態で性判別することが困難であるため、養成中の親魚群が産卵に適した性比で構成されているかどうかを調べることも出来ない。このような理由から、クロマグロの簡便で高精度な性判別方法の開発が望まれている。
【0004】
これまでに、継代Ｆ３世代のクロマグロの雄特異的な６塩基のＤＮＡ欠失領域を用いてクロマグロの性判別を行う方法が知られている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【文献】Agawa Y. et al. Identification of male sex-linked DNA sequence of the cultured Pacific Bluefin tuna Thunnus orientalis. Fisheries science. 2015, 81(1), 113-121.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
しかしながら、当該領域を利用したクロマグロの性判別は、特定の経代Ｆ３世代における成功率は９４％と高いものの、天然魚では成功率が３９％と低く、天然魚を含むクロマグロの性判別方法として利用できる十分な精度を有していない。一般に、少数の親から作出された経代群や家系においては、天然集団に殆ど見つからないような低頻度のＤＮＡ多型が偶然広まってしまうことがある。当該領域は、経代飼育の過程において、ごく一部の雄個体が持つＹ染色体上の塩基配列がその子孫である経代群に広まったものであると考えられる。
【0007】
よって、本発明の課題は、簡便で精度の高いクロマグロの遺伝的性判別方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0008】
そこで、本発明者らは、上記課題を解決するために、天然クロマグロ３１個体の全ゲノムリシーケンス解析により塩基配列を網羅的に探索した結果、クロマグロゲノム配列のスキャフォルド６４番中に、性別特異的なＤＮＡ多型を複数見出した。また、当該ＤＮＡ多型の存在する領域は、非特許文献１で用いる領域とは異なる領域であることを見出した。本発明者らは、かかる知見に基づきさらに検討した結果、当該ＤＮＡ多型を用いることで、クロマグロの遺伝的性を簡便にかつ高い精度で判別できることを見出し、本発明を完成した。
【0009】
すなわち、本発明は、次の〔１〕～〔７〕を提供するものである。
〔１〕配列番号１で表される塩基配列の５０１番目の塩基、５６１および５６２番目の塩基、５６４番目の塩基、５９５番目の塩基、６４４番目の塩基、７６９番目の塩基、７７０番目の塩基、７８９番目の塩基、１１９８番目の塩基、１２００番目の塩基、１２１３番目の塩基、１２７５番目の塩基、１２８０番目の塩基、１３３８番目の塩基、１３４４番目の塩基、１４１６～１４２３番目の塩基、１４７２番目の塩基、１４９３番目の塩基、１８６６番目の塩基、１８６７番目の塩基、１８９９番目の塩基、１９１３番目の塩基、２５８３番目の塩基、２５８８番目の塩基、２５８９番目の塩基、２６１１番目の塩基、２６２２番目の塩基、２６３４番目の塩基、２６４３番目の塩基、２６８７番目の塩基、２６９３番目の塩基、２７５２番目の塩基、２７５３番目の塩基、２７５６番目の塩基、２８０１番目の塩基、２８１７番目の塩基、２８５５番目の塩基、２８７４番目の塩基、２９０１番目の塩基、３０５７番目の塩基、３０９３番目の塩基、３１３９番目の塩基、３１４６番目の塩基、３１４８番目の塩基、３１９６番目の塩基、３１９９番目の塩基、３２４９番目の塩基、３２５１番目の塩基、３３６８番目の塩基、３４０４番目の塩基、３４０７番目の塩基、３４２６番目の塩基、３４３３番目の塩基、３４４２番目の塩基、３４７０番目の塩基、３４７９番目の塩基、３５４５番目の塩基、３５４６番目の塩基、３７３５番目の塩基、３７５６番目の塩基、３７６９番目の塩基、３７８８番目の塩基、６２５６番目の塩基、６３１２番目の塩基、６４５５番目の塩基、６５８５番目の塩基、６７８１番目の塩基、６８７９番目の塩基、６９３０番目の塩基、６９３３番目の塩基、６９４０番目の塩基、６９４１番目の塩基、６９８７番目の塩基並びに７０１４番目の塩基の位置に存在するＤＮＡ多型からなる群から選択される１以上のＤＮＡ多型を含む、クロマグロの性判別マーカー。
〔２〕クロマグロ被検体のゲノムＤＮＡを含有する試料の、配列番号１で表される塩基配列の５０１番目の塩基、５６１および５６２番目の塩基、５６４番目の塩基、５９５番目の塩基、６４４番目の塩基、７６９番目の塩基、７７０番目の塩基、７８９番目の塩基、１１９８番目の塩基、１２００番目の塩基、１２１３番目の塩基、１２７５番目の塩基、１２８０番目の塩基、１３３８番目の塩基、１３４４番目の塩基、１４１６～１４２３番目の塩基、１４７２番目の塩基、１４９３番目の塩基、１８６６番目の塩基、１８６７番目の塩基、１８９９番目の塩基、１９１３番目の塩基、２５８３番目の塩基、２５８８番目の塩基、２５８９番目の塩基、２６１１番目の塩基、２６２２番目の塩基、２６３４番目の塩基、２６４３番目の塩基、２６８７番目の塩基、２６９３番目の塩基、２７５２番目の塩基、２７５３番目の塩基、２７５６番目の塩基、２８０１番目の塩基、２８１７番目の塩基、２８５５番目の塩基、２８７４番目の塩基、２９０１番目の塩基、３０５７番目の塩基、３０９３番目の塩基、３１３９番目の塩基、３１４６番目の塩基、３１４８番目の塩基、３１９６番目の塩基、３１９９番目の塩基、３２４９番目の塩基、３２５１番目の塩基、３３６８番目の塩基、３４０４番目の塩基、３４０７番目の塩基、３４２６番目の塩基、３４３３番目の塩基、３４４２番目の塩基、３４７０番目の塩基、３４７９番目の塩基、３５４５番目の塩基、３５４６番目の塩基、３７３５番目の塩基、３７５６番目の塩基、３７６９番目の塩基、３７８８番目の塩基、６２５６番目の塩基、６３１２番目の塩基、６４５５番目の塩基、６５８５番目の塩基、６７８１番目の塩基、６８７９番目の塩基、６９３０番目の塩基、６９３３番目の塩基、６９４０番目の塩基、６９４１番目の塩基、６９８７番目の塩基並びに７０１４番目の塩基の位置に存在するＤＮＡ多型からなる群から選択される１以上のＤＮＡ多型を検出する、クロマグロの性判別方法。
〔３〕さらに、前記ＤＮＡ多型が下記表に示される雌の遺伝子型を有する場合にクロマグロ被検体が雌であると判別し、前記ＤＮＡ多型が下記表に示される雄の遺伝子型を有する場合にクロマグロ被検体が雄であると判別するものである、上記〔２〕記載の方法。
〔１〕配列番号１で表される塩基配列の５０１番目の塩基、５６１および５６２番目の塩基、５６４番目の塩基、５９５番目の塩基、６４４番目の塩基、７６９番目の塩基、７７０番目の塩基、７８９番目の塩基、１１９８番目の塩基、１２００番目の塩基、１２１３番目の塩基、１２７５番目の塩基、１２８０番目の塩基、１３３８番目の塩基、１３４４番目の塩基、１４１６～１４２３番目の塩基、１４７２番目の塩基、１４９３番目の塩基、１８６６番目の塩基、１８６７番目の塩基、１８９９番目の塩基、１９１３番目の塩基、２５８３番目の塩基、２５８８番目の塩基、２５８９番目の塩基、２６１１番目の塩基、２６２２番目の塩基、２６３４番目の塩基、２６４３番目の塩基、２６８７番目の塩基、２６９３番目の塩基、２７５２番目の塩基、２７５３番目の塩基、２７５６番目の塩基、２８０１番目の塩基、２８１７番目の塩基、２８５５番目の塩基、２８７４番目の塩基、２９０１番目の塩基、３０５７番目の塩基、３０９３番目の塩基、３１３９番目の塩基、３１４６番目の塩基、３１４８番目の塩基、３１９６番目の塩基、３１９９番目の塩基、３２４９番目の塩基、３２５１番目の塩基、３３６８番目の塩基、３４０４番目の塩基、３４０７番目の塩基、３４２６番目の塩基、３４３３番目の塩基、３４４２番目の塩基、３４７０番目の塩基、３４７９番目の塩基、３５４５番目の塩基、３５４６番目の塩基、３７３５番目の塩基、３７５６番目の塩基、３７６９番目の塩基、３７８８番目の塩基、６２５６番目の塩基、６３１２番目の塩基、６４５５番目の塩基、６５８５番目の塩基、６７８１番目の塩基、６８７９番目の塩基、６９３０番目の塩基、６９３３番目の塩基、６９４０番目の塩基、６９４１番目の塩基、６９８７番目の塩基並びに７０１４番目の塩基の位置に存在するＤＮＡ多型からなる群から選択される１以上のＤＮＡ多型を含む、クロマグロの性判別マーカー。
〔２〕クロマグロ被検体のゲノムＤＮＡを含有する試料の、配列番号１で表される塩基配列の５０１番目の塩基、５６１および５６２番目の塩基、５６４番目の塩基、５９５番目の塩基、６４４番目の塩基、７６９番目の塩基、７７０番目の塩基、７８９番目の塩基、１１９８番目の塩基、１２００番目の塩基、１２１３番目の塩基、１２７５番目の塩基、１２８０番目の塩基、１３３８番目の塩基、１３４４番目の塩基、１４１６～１４２３番目の塩基、１４７２番目の塩基、１４９３番目の塩基、１８６６番目の塩基、１８６７番目の塩基、１８９９番目の塩基、１９１３番目の塩基、２５８３番目の塩基、２５８８番目の塩基、２５８９番目の塩基、２６１１番目の塩基、２６２２番目の塩基、２６３４番目の塩基、２６４３番目の塩基、２６８７番目の塩基、２６９３番目の塩基、２７５２番目の塩基、２７５３番目の塩基、２７５６番目の塩基、２８０１番目の塩基、２８１７番目の塩基、２８５５番目の塩基、２８７４番目の塩基、２９０１番目の塩基、３０５７番目の塩基、３０９３番目の塩基、３１３９番目の塩基、３１４６番目の塩基、３１４８番目の塩基、３１９６番目の塩基、３１９９番目の塩基、３２４９番目の塩基、３２５１番目の塩基、３３６８番目の塩基、３４０４番目の塩基、３４０７番目の塩基、３４２６番目の塩基、３４３３番目の塩基、３４４２番目の塩基、３４７０番目の塩基、３４７９番目の塩基、３５４５番目の塩基、３５４６番目の塩基、３７３５番目の塩基、３７５６番目の塩基、３７６９番目の塩基、３７８８番目の塩基、６２５６番目の塩基、６３１２番目の塩基、６４５５番目の塩基、６５８５番目の塩基、６７８１番目の塩基、６８７９番目の塩基、６９３０番目の塩基、６９３３番目の塩基、６９４０番目の塩基、６９４１番目の塩基、６９８７番目の塩基並びに７０１４番目の塩基の位置に存在するＤＮＡ多型からなる群から選択される１以上のＤＮＡ多型を検出する、クロマグロの性判別方法。
〔３〕さらに、前記ＤＮＡ多型が下記表に示される雌の遺伝子型を有する場合にクロマグロ被検体が雌であると判別し、前記ＤＮＡ多型が下記表に示される雄の遺伝子型を有する場合にクロマグロ被検体が雄であると判別するものである、上記〔２〕記載の方法。
【0010】
【表1】
【0011】
〔４〕前記ＤＮＡ多型の検出をＰＣＲにより行うものである、〔２〕または〔３〕記載の方法。
〔５〕配列番号１で表される塩基配列の５０１番目の塩基、５６１および５６２番目の塩基、５６４番目の塩基、５９５番目の塩基、６４４番目の塩基、７６９番目の塩基、７７０番目の塩基、７８９番目の塩基、１１９８番目の塩基、１２００番目の塩基、１２１３番目の塩基、１２７５番目の塩基、１２８０番目の塩基、１３３８番目の塩基、１３４４番目の塩基、１４１６～１４２３番目の塩基、１４７２番目の塩基、１４９３番目の塩基、１８６６番目の塩基、１８６７番目の塩基、１８９９番目の塩基、１９１３番目の塩基、２５８３番目の塩基、２５８８番目の塩基、２５８９番目の塩基、２６１１番目の塩基、２６２２番目の塩基、２６３４番目の塩基、２６４３番目の塩基、２６８７番目の塩基、２６９３番目の塩基、２７５２番目の塩基、２７５３番目の塩基、２７５６番目の塩基、２８０１番目の塩基、２８１７番目の塩基、２８５５番目の塩基、２８７４番目の塩基、２９０１番目の塩基、３０５７番目の塩基、３０９３番目の塩基、３１３９番目の塩基、３１４６番目の塩基、３１４８番目の塩基、３１９６番目の塩基、３１９９番目の塩基、３２４９番目の塩基、３２５１番目の塩基、３３６８番目の塩基、３４０４番目の塩基、３４０７番目の塩基、３４２６番目の塩基、３４３３番目の塩基、３４４２番目の塩基、３４７０番目の塩基、３４７９番目の塩基、３５４５番目の塩基、３５４６番目の塩基、３７３５番目の塩基、３７５６番目の塩基、３７６９番目の塩基、３７８８番目の塩基、６２５６番目の塩基、６３１２番目の塩基、６４５５番目の塩基、６５８５番目の塩基、６７８１番目の塩基、６８７９番目の塩基、６９３０番目の塩基、６９３３番目の塩基、６９４０番目の塩基、６９４１番目の塩基、６９８７番目の塩基並びに７０１４番目の塩基の位置に存在するＤＮＡ多型からなる群から選択される１以上のＤＮＡ多型を含む領域を増幅することができる、クロマグロの性判別用プライマー。
〔６〕配列番号１で表される塩基配列の５０１番目の塩基、５６１および５６２番目の塩基、５６４番目の塩基、５９５番目の塩基、６４４番目の塩基、７６９番目の塩基、７７０番目の塩基、７８９番目の塩基、１１９８番目の塩基、１２００番目の塩基、１２１３番目の塩基、１２７５番目の塩基、１２８０番目の塩基、１３３８番目の塩基、１３４４番目の塩基、１４１６～１４２３番目の塩基、１４７２番目の塩基、１４９３番目の塩基、１８６６番目の塩基、１８６７番目の塩基、１８９９番目の塩基、１９１３番目の塩基、２５８３番目の塩基、２５８８番目の塩基、２５８９番目の塩基、２６１１番目の塩基、２６２２番目の塩基、２６３４番目の塩基、２６４３番目の塩基、２６８７番目の塩基、２６９３番目の塩基、２７５２番目の塩基、２７５３番目の塩基、２７５６番目の塩基、２８０１番目の塩基、２８１７番目の塩基、２８５５番目の塩基、２８７４番目の塩基、２９０１番目の塩基、３０５７番目の塩基、３０９３番目の塩基、３１３９番目の塩基、３１４６番目の塩基、３１４８番目の塩基、３１９６番目の塩基、３１９９番目の塩基、３２４９番目の塩基、３２５１番目の塩基、３３６８番目の塩基、３４０４番目の塩基、３４０７番目の塩基、３４２６番目の塩基、３４３３番目の塩基、３４４２番目の塩基、３４７０番目の塩基、３４７９番目の塩基、３５４５番目の塩基、３５４６番目の塩基、３７３５番目の塩基、３７５６番目の塩基、３７６９番目の塩基、３７８８番目の塩基、６２５６番目の塩基、６３１２番目の塩基、６４５５番目の塩基、６５８５番目の塩基、６７８１番目の塩基、６８７９番目の塩基、６９３０番目の塩基、６９３３番目の塩基、６９４０番目の塩基、６９４１番目の塩基、６９８７番目の塩基並びに７０１４番目の塩基の位置に存在するＤＮＡ多型からなる群から選択される１以上のＤＮＡ多型を検出することができる、クロマグロの性判別用プローブ。
〔７〕〔５〕記載のプライマーおよび／または〔６〕記載のプローブを含む、クロマグロの性判別用キット。
〔５〕配列番号１で表される塩基配列の５０１番目の塩基、５６１および５６２番目の塩基、５６４番目の塩基、５９５番目の塩基、６４４番目の塩基、７６９番目の塩基、７７０番目の塩基、７８９番目の塩基、１１９８番目の塩基、１２００番目の塩基、１２１３番目の塩基、１２７５番目の塩基、１２８０番目の塩基、１３３８番目の塩基、１３４４番目の塩基、１４１６～１４２３番目の塩基、１４７２番目の塩基、１４９３番目の塩基、１８６６番目の塩基、１８６７番目の塩基、１８９９番目の塩基、１９１３番目の塩基、２５８３番目の塩基、２５８８番目の塩基、２５８９番目の塩基、２６１１番目の塩基、２６２２番目の塩基、２６３４番目の塩基、２６４３番目の塩基、２６８７番目の塩基、２６９３番目の塩基、２７５２番目の塩基、２７５３番目の塩基、２７５６番目の塩基、２８０１番目の塩基、２８１７番目の塩基、２８５５番目の塩基、２８７４番目の塩基、２９０１番目の塩基、３０５７番目の塩基、３０９３番目の塩基、３１３９番目の塩基、３１４６番目の塩基、３１４８番目の塩基、３１９６番目の塩基、３１９９番目の塩基、３２４９番目の塩基、３２５１番目の塩基、３３６８番目の塩基、３４０４番目の塩基、３４０７番目の塩基、３４２６番目の塩基、３４３３番目の塩基、３４４２番目の塩基、３４７０番目の塩基、３４７９番目の塩基、３５４５番目の塩基、３５４６番目の塩基、３７３５番目の塩基、３７５６番目の塩基、３７６９番目の塩基、３７８８番目の塩基、６２５６番目の塩基、６３１２番目の塩基、６４５５番目の塩基、６５８５番目の塩基、６７８１番目の塩基、６８７９番目の塩基、６９３０番目の塩基、６９３３番目の塩基、６９４０番目の塩基、６９４１番目の塩基、６９８７番目の塩基並びに７０１４番目の塩基の位置に存在するＤＮＡ多型からなる群から選択される１以上のＤＮＡ多型を含む領域を増幅することができる、クロマグロの性判別用プライマー。
〔６〕配列番号１で表される塩基配列の５０１番目の塩基、５６１および５６２番目の塩基、５６４番目の塩基、５９５番目の塩基、６４４番目の塩基、７６９番目の塩基、７７０番目の塩基、７８９番目の塩基、１１９８番目の塩基、１２００番目の塩基、１２１３番目の塩基、１２７５番目の塩基、１２８０番目の塩基、１３３８番目の塩基、１３４４番目の塩基、１４１６～１４２３番目の塩基、１４７２番目の塩基、１４９３番目の塩基、１８６６番目の塩基、１８６７番目の塩基、１８９９番目の塩基、１９１３番目の塩基、２５８３番目の塩基、２５８８番目の塩基、２５８９番目の塩基、２６１１番目の塩基、２６２２番目の塩基、２６３４番目の塩基、２６４３番目の塩基、２６８７番目の塩基、２６９３番目の塩基、２７５２番目の塩基、２７５３番目の塩基、２７５６番目の塩基、２８０１番目の塩基、２８１７番目の塩基、２８５５番目の塩基、２８７４番目の塩基、２９０１番目の塩基、３０５７番目の塩基、３０９３番目の塩基、３１３９番目の塩基、３１４６番目の塩基、３１４８番目の塩基、３１９６番目の塩基、３１９９番目の塩基、３２４９番目の塩基、３２５１番目の塩基、３３６８番目の塩基、３４０４番目の塩基、３４０７番目の塩基、３４２６番目の塩基、３４３３番目の塩基、３４４２番目の塩基、３４７０番目の塩基、３４７９番目の塩基、３５４５番目の塩基、３５４６番目の塩基、３７３５番目の塩基、３７５６番目の塩基、３７６９番目の塩基、３７８８番目の塩基、６２５６番目の塩基、６３１２番目の塩基、６４５５番目の塩基、６５８５番目の塩基、６７８１番目の塩基、６８７９番目の塩基、６９３０番目の塩基、６９３３番目の塩基、６９４０番目の塩基、６９４１番目の塩基、６９８７番目の塩基並びに７０１４番目の塩基の位置に存在するＤＮＡ多型からなる群から選択される１以上のＤＮＡ多型を検出することができる、クロマグロの性判別用プローブ。
〔７〕〔５〕記載のプライマーおよび／または〔６〕記載のプローブを含む、クロマグロの性判別用キット。
【発明の効果】
【0012】
本発明によれば、クロマグロの遺伝的性の判別を可能とするＤＮＡ多型を含む性判別マーカー、当該ＤＮＡ多型を検出するクロマグロの性判別方法、当該方法に利用するプライマー、プローブおよびキットが提供される。本発明によれば、天然魚および養殖魚を含むクロマグロ由来の細胞、組織、体表粘液といった試料を用いて、クロマグロの性別を簡便かつ高い精度で判別することができる。これにより、漁獲物もしくは資源調査サンプルから、または個体を生かしたまま採取したサンプルから、性別データを簡便かつ高い精度で取得できるようになり、クロマグロの生態の解明や人工種苗生産のための親魚養成の計画的な実施に資することができる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】天然クロマグロ３１個体の領域１の塩基配列（配列番号１の１３０９～１４５８番目の塩基からなる配列に相当する塩基配列）のアライメント結果を示す図である。ＲＥＦは、参照配列（配列番号１の１３０９～１４５８番目の塩基からなる配列）を示す。ホモ接合型の個体はコンセンサス配列を、ヘテロ接合型の個体（一部の雌と全ての雄）は対立遺伝子１が参照配列と完全一致するため、対立遺伝子２の塩基配列のみを示す。塩基配列中のドットは、参照配列と同一の塩基を、ハイフンは欠失を示す。塩基配列中の矢印および四角は、雄に特異的または極めて特異性が高い一塩基多型および欠失領域を示す。アライメント下部の黒矢印は、上記一塩基多型および欠失領域に基づいて設計した雄特異的なＹ３＿Ｆ１プライマー（配列番号２）およびＹ３＿Ｒ１プライマー（配列番号３）を示す。白抜き矢印は、雌雄で共通した配列から設計した雌雄共通のＹ３＿ＤＥＬ＿Ｆ２プライマー（配列番号８）およびＹ３＿ＤＥＬ＿Ｒ１プライマー（配列番号９）を示す。
【図2】天然クロマグロ３１個体の領域２の塩基配列（配列番号１の３０５９～３２８８番目の塩基からなる配列に相当する塩基配列）のアライメント結果を示す図である。ＲＥＦは、参照配列（配列番号１の３０５９～３２８８番目の塩基からなる配列）を示す。ホモ接合型の個体はコンセンサス配列を、ヘテロ接合型の個体（一部の雌と全ての雄）は対立遺伝子１が参照配列と完全一致かほぼ同一であるため、対立遺伝子２の塩基配列のみを示す。塩基配列中のドットは、参照配列と同一の塩基を示す。塩基配列中の矢印は、雄に特異的または極めて特異性が高い一塩基多型を示す。アライメント下部の黒矢印は、上記一塩基多型に基づいて設計した雄特異的なＹ２＿Ｆ１プライマー（配列番号６）およびＹ２＿Ｒ２プライマー（配列番号７）を示す。
【図4】領域１の雄特異的欠失領域を対象としたＰＣＲおよびマイクロチップ電気泳動の結果を示す図である。
【図5】領域１の雄特異的欠失領域を対象としたＰＣＲおよびマイクロチップ電気泳動の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0014】
本明細書における塩基配列（ヌクレオチド配列）、核酸などの略号による表示は、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ規定（IUPAC-IUB communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138:9-37, 1984）、「塩基配列またはアミノ酸配列を含む明細書等の作製のためのガイドライン」（特許庁編）などの、当該分野で慣用される記号で記載されている。本明細書において「デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）」は、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖という各１本鎖ＤＮＡを包含する。
【0015】
また、本明細書において、「ヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、核酸と同義であって、ＤＮＡ、およびＲＮＡの両方を含むものとする。当該ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡのいずれもが含まれる。また当該ＲＮＡには、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡおよび合成のＲＮＡのいずれもが含まれる。また、「ヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は２本鎖であっても１本鎖であってもよく、ある配列を有する「ヌクレオチド」（または「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」）といった場合、特に言及しない限り、これに相補的な配列を有する「ヌクレオチド」（または「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」）も包括的に意味するものとする。
【0016】
本明細書において「ＤＮＡ多型」とは、個体間でゲノムＤＮＡ塩基配列上の特定部位の塩基配列が異なり、その頻度が集団の１％以上であるものを指し、具体的には、クロマグロ雌雄間でゲノムＤＮＡ塩基配列上の特定部位の塩基配列が異なるものを指す。当該多型としては置換、欠失、重複、挿入、逆位等が挙げられる。特に、１個の塩基が他の塩基に置換されたことによる多型を一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：ＳＮＰ）という。以下、ＤＮＡ多型の遺伝子型を対立遺伝子１／対立遺伝子２のように表すことがある。例えば、Ａ／Ａのように両対立遺伝子が同じ場合、遺伝子型はホモ接合型であり、Ａ／Ｔのように両対立遺伝子が異なる場合、遺伝子型はヘテロ接合型である。本明細書において「ＤＮＡ多型」は、対立遺伝子１、対立遺伝子２およびそれらの相補鎖のいずれをも含むものである。
【0017】
本明細書において「クロマグロ」は、Ｔｈｕｎｎｕｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓを指す。クロマグロの染色体数は１組２４本であり、ゲノムサイズは約８億塩基対である。このうち、クロマグロゲノム配列のスキャフォルド６４番に含まれる約７．５ｋｂのゲノムＤＮＡの塩基配列を配列番号１に示す。「スキャフォルド」とは、ゲノム解析により得られた多数の断片的な配列を用いてゲノム配列を構築した結果まとめられた配列のことを指す。なお、配列番号１の塩基配列は雌の塩基配列である。配列番号１の４２２番目から３５９５番目、３７３５番目から３７８８番目、６２４０番目から６６４２番目、および６６９８番目から７１９７番目は、それぞれ、組換えが強く抑制された連鎖不平衡ブロックを形成している。本明細書において、配列番号１で表される塩基配列中、１３０９～１４５８番目の塩基からなる配列を領域１、３０５９～３２８８番目の塩基からなる配列を領域２と称する。
【0018】
本発明は、クロマグロのゲノムＤＮＡの配列番号１で表される塩基配列における特定のＤＮＡ多型がクロマグロの遺伝的性と強く相関しており、当該ＤＮＡ多型を性判別マーカーとして検出することによって、クロマグロの遺伝的性を簡便にかつ高精度に判別できるという事実の発見に基づいて完成されている。ここで、「遺伝的性」とは、遺伝によって決まる性別のことをいい、以下、単に「性」あるいは「性別」ともいう。
【0019】
本発明において、クロマグロの性判別の指標として、すなわち性判別マーカーとして用いられるＤＮＡ多型には、以下の表２に示す（１）～（７４）のＤＮＡ多型が含まれる。各ＤＮＡ多型は全て、雌の遺伝子型がホモ接合型であり、雄の遺伝子型がヘテロ接合型である。
【0020】
【表2】
【0021】
性判別マーカーとして用いられるＤＮＡ多型の性判別率は、９３％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは１００％である。ここで、性判別率とは、後記実施例で示す性判別率を指す。具体的には、表２の（１）～（７４）のＤＮＡ多型のうち、（１）、（４）～（１３）、（１５）、（１６）、（２３）～（３１）、（３５）～（４３）、（４５）～（４７）、（４９）、（５４）～（５７）、（５９）～（６３）、（６５）～（６７）および（７１）～（７４）のＤＮＡ多型からなる群より選択される１以上のＤＮＡ多型を性判別マーカーとして用いることが、性判別の精度の観点から好ましい。また、性判別の実施のしやすさの観点からは、（１６）のＤＮＡ多型が好ましい。なお、表２の（１）～（７４）のＤＮＡ多型のうち、（１）～（５８）のＤＮＡ多型、（５９）～（６２）のＤＮＡ多型、（６３）～（６６）のＤＮＡ多型、および（６７）～（７４）のＤＮＡ多型は、それぞれ、連鎖不平衡ブロックに含まれている。本発明においては、上記のＤＮＡ多型のうち、１つのＤＮＡ多型のみを性判別の指標として用いてもよいし、２以上のＤＮＡ多型を組み合わせて性判別の指標として用いてもよい。２以上のＤＮＡ多型を組み合わせて指標として用いることで、性判別の精度はより高まるため好ましい。
【0022】
また、配列番号１で表される塩基配列の部分塩基配列であって、表２の（１）～（７４）のＤＮＡ多型からなる群より選択される１以上のＤＮＡ多型を含む連続する塩基配列からなる部分塩基配列を含むオリゴまたはポリヌクレオチドあるいはその相補鎖を、性判別マーカーとして用いることもできる。このとき、ＤＮＡ多型部位の塩基は、配列番号１で表される塩基配列に含まれる対立遺伝子１の塩基であってもよいし、対立遺伝子２の塩基であってもよく、検出の目的に応じて適宜選択できる。これらのオリゴまたはポリヌクレオチドあるいはそれらの相補鎖の長さ（塩基長）は、クロマグロゲノム上で特異的に認識される長さであればよく、その限りにおいて特に制限されない。通常約１０～１０００塩基であり、好ましくは約２０～５００塩基であり、より好ましくは約２０～１００塩基である。
【0023】
本発明のクロマグロの性判別方法について、以下に詳述する。
本発明の方法は、クロマグロ被検体由来のゲノムＤＮＡを含有する試料において、表２のＤＮＡ多型の１以上を検出するものである。ここで「ＤＮＡ多型の検出」とは、ＤＮＡ多型部位の塩基を検出、同定すること、ＤＮＡ多型部位の雄特異的対立遺伝子を検出すること、および／またはＤＮＡ多型の遺伝子型がホモ接合型であるかヘテロ接合型であるかを検出することを含む。検出結果に応じて、被検体が雌であるか雄であるかを判別する。被検体の性別は、表２に記載の所定のＤＮＡ多型部位で検出される塩基、雄特異的対立遺伝子および／または遺伝子型の情報に基づいて判断できる。例えば、表２の（１）のＤＮＡ多型は、配列番号１で表される塩基配列の５０１番目の塩基に存在する一塩基多型であり、雌の遺伝子型はＡ／Ａのホモ接合型であり、雄の遺伝子型はＡ／Ｔのヘテロ接合型である。配列番号１で表される塩基配列の５０１番目の塩基としてＡのみが検出されれば、試料が由来する被検体は雌であり、ＡおよびＴが検出されれば、被検体は雄であると判別できる。あるいは、当該一塩基多型部位の雄特異的対立遺伝子であるＴアレルが検出されなければ、試料が由来する被検体は雌であり、Ｔアレルが検出されれば、雄であると判別できる。あるいは、当該一塩基多型部位の遺伝子型がＡ／Ａのホモ接合型であれば、試料が由来する被検体は雌であり、Ａ／Ｔのヘテロ接合型であれば、雄であると判別できる。表２の（２）～（７４）のＤＮＡ多型を用いた場合も、表２に基づき、同様に判別できる。
本発明の方法は、クロマグロ被検体由来のゲノムＤＮＡを含有する試料において、表２のＤＮＡ多型の１以上を検出するものである。ここで「ＤＮＡ多型の検出」とは、ＤＮＡ多型部位の塩基を検出、同定すること、ＤＮＡ多型部位の雄特異的対立遺伝子を検出すること、および／またはＤＮＡ多型の遺伝子型がホモ接合型であるかヘテロ接合型であるかを検出することを含む。検出結果に応じて、被検体が雌であるか雄であるかを判別する。被検体の性別は、表２に記載の所定のＤＮＡ多型部位で検出される塩基、雄特異的対立遺伝子および／または遺伝子型の情報に基づいて判断できる。例えば、表２の（１）のＤＮＡ多型は、配列番号１で表される塩基配列の５０１番目の塩基に存在する一塩基多型であり、雌の遺伝子型はＡ／Ａのホモ接合型であり、雄の遺伝子型はＡ／Ｔのヘテロ接合型である。配列番号１で表される塩基配列の５０１番目の塩基としてＡのみが検出されれば、試料が由来する被検体は雌であり、ＡおよびＴが検出されれば、被検体は雄であると判別できる。あるいは、当該一塩基多型部位の雄特異的対立遺伝子であるＴアレルが検出されなければ、試料が由来する被検体は雌であり、Ｔアレルが検出されれば、雄であると判別できる。あるいは、当該一塩基多型部位の遺伝子型がＡ／Ａのホモ接合型であれば、試料が由来する被検体は雌であり、Ａ／Ｔのヘテロ接合型であれば、雄であると判別できる。表２の（２）～（７４）のＤＮＡ多型を用いた場合も、表２に基づき、同様に判別できる。
【0024】
本発明の方法においては、より具体的には、まず、クロマグロ被検体よりＤＮＡを含有する試料を採取する。クロマグロ被検体は、天然魚であってもよいし、養殖魚であってもよい。クロマグロ被検体より採取されるＤＮＡ含有試料としては、特に制限されないが、例えば、各種細胞、組織、これらに由来する培養細胞などを例示できる。また、ヒレ、筋肉、内臓、体表粘液等を例示することができる。次に、必要に応じて当該試料に含まれるゲノムＤＮＡを抽出する。ＤＮＡ含有試料からのゲノムＤＮＡの抽出は、公知の方法を用いて行うことができる。ゲノムＤＮＡの抽出法としては、例えば、フェノール法、ＣＴＡＢ法、アルカリＳＤＳ法等が挙げられる。ゲノムＤＮＡは、粗抽出物をそのまま使用してもよいし、必要に応じて、公知の方法により精製してもよい。ゲノムＤＮＡ抽出のための試薬やキットは市販されており、これを用いてもよい。
【0025】
次いで、性判別の指標として用いられるＤＮＡ多型を検出する。ＤＮＡ多型の検出は、公知の方法を用いて行うことができる。ＤＮＡ多型の検出法としては、例えば、ＰＣＲ－ＳＳＰ、ＰＣＲ－ＳＳＣＰ、ＰＣＲ－ＲＬＦＰ、ＰＣＲ－ＳＳＯ、ＰＣＲ－ＡＳＰ、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法、サイクリングプローブ法、モレキュラービーコン法、ＨＲＭ法、ＤＯＬ法、ＴＤＩ法、ダイレクトシークエンス法、ＳＮａＰｓｈｏｔ、ｄＨＰＬＣ、インベーダー法、Ｓｎｉｐｅｒ法、マイクロアレイ法、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ法などを用いた方法が挙げられる。こうした方法は、当業者に周知である（例えば、野島博編、「ゲノム創薬の最前線」、ｐ４４－５４、羊土社、２００１を参照）。ＤＮＡ多型検出のための試薬やキットも市販されており、これを用いてもよい。ＤＮＡ多型の検出法は、これらに限定されるものではなく、他の公知の方法を利用してもよい。また、これらの方法を単独で用いても、２以上の方法を組み合わせて用いてもよい。
【0026】
本発明の方法において、性判別の指標として用いられるＤＮＡ多型を検出する場合、当該検出のためのプライマー、プローブ等は、当該ＤＮＡ多型を特異的に検出するように設計されることが好ましい。本発明の方法で性判別の指標として用いられるＤＮＡ多型は、全て配列番号１で表される塩基配列上に存在する。当業者は、配列番号１で表される塩基配列および表２のＤＮＡ多型部位の各対立遺伝子の情報に基づき、増幅サイズ、プライマーの塩基長、ＧＣ含有率、Ｔｍ値、検出原理等を考慮して、検出すべきＤＮＡ多型のための適切なプライマーやプローブを設計することができる。
【0027】
本発明のクロマグロの性判別方法は、単独で実施しても、他の性判別方法と組み合わせて行ってもよい。他の性判別方法としては、生殖腺の目視、組織学的切片観察等が挙げられる。
【0028】
後記実施例では、本発明の方法の好適な実施形態の一つとして、ＰＣＲ－ＳＳＰを用いた方法を示す。ＰＣＲ－ＳＳＰは、３’末端が目的のＤＮＡ多型部位となるように設計したプライマーを用いてＰＣＲを行い、プライマーの３’末端が鋳型ＤＮＡと相補的であるか否かによってＰＣＲによる増幅効率に著しい差があることを利用して、当該ＤＮＡ多型を検出する方法である。具体的には、ゲノムＤＮＡを鋳型とし、３’末端が目的のＤＮＡ多型の対立遺伝子の塩基配列となるように設計されたプライマーを用いて、当該ＤＮＡ多型部位を含む約５０～１０００ｂｐ、好ましくは約１００～５００ｂｐの領域をＰＣＲで増幅し、次いで電気泳動を行う。所望のサイズのバンドが見られる場合には、当該対立遺伝子が存在すると判断でき、バンドが見られない場合には、当該対立遺伝子が存在しないと判断することができる。本発明の性判別マーカーは、全て、雌の場合に遺伝子型がホモ接合型であり、雄の場合に遺伝子型がヘテロ接合型であることから、雄特異的な対立遺伝子を検出対象として、所望のサイズのバンドが見られる場合には雄、バンドが見られない場合には雌と判断することができる。このとき、バンドが見られないことがＰＣＲの失敗に起因するものでないと示すため、コントロールとして、雌雄の別なく存在する遺伝子やＤＮＡ配列を同時にＰＣＲ増幅してもよい。このような例として、ミトコンドリアのＣＯＩ遺伝子、ＮＤ４遺伝子等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ＰＣＲ増幅に用いるプライマーは、目的とするＤＮＡ多型に応じて適宜設計され、プライマーの塩基長は、通常１５～５０塩基であり、好ましくは１５～３５塩基である。当該プライマーは、目的のＤＮＡ断片を増幅できる限りにおいて、鋳型のＤＮＡ配列と１～数個、好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～３個のミスマッチを有していてもよい。
【0029】
また、後記実施例では、本発明の方法の好適な実施形態の一つとして、ＰＣＲを用いた方法を示す。当該方法は、目的のＤＮＡ多型が塩基の欠失や挿入である場合に適用でき、目的のＤＮＡ多型を挟むように設計したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅サイズの違いに基づいて当該ＤＮＡ多型を検出する方法である。具体的には、ゲノムＤＮＡを鋳型とし、目的のＤＮＡ多型部位の上流および下流に設計されたプライマーを用いて、当該ＤＮＡ多型部位を含む約５０～１０００ｂｐ、好ましくは約１００～５００ｂｐ、より好ましくは約１００～３００ｂｐの領域をＰＣＲで増幅し、次いで電気泳動を行う。本発明の性判別マーカーは、全て、雌の場合に遺伝子型がホモ接合型であり、雄の場合に遺伝子型がヘテロ接合型であることから、雌雄共通のバンドのみが見られる場合には雌と判別でき、雌雄共通のバンドと当該バンドより欠失あるいは挿入領域に相当する塩基長分が短いあるいは長い雄特異的なバンドが見られる場合には雄と判別できる。ＰＣＲ増幅に用いるプライマーは、目的とするＤＮＡ多型に応じて適宜設計され、プライマーの塩基長は、通常１５～５０塩基であり、好ましくは１５～３５塩基である。当該プライマーは、目的のＤＮＡ断片を増幅できる限りにおいて、鋳型のＤＮＡ配列と１～数個、好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～３個のミスマッチを有していてもよい。
【0030】
本発明の方法は、リアルタイムＰＣＲ検出法、例えばＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法によっても簡便に実施することができる。具体的には、ゲノムＤＮＡ（鋳型）、５’末端が蛍光色素で、３’末端がクエンチャー（消光物質）でそれぞれ標識されたプローブ、当該プローブとハイブリダイズする領域を含むゲノムＤＮＡの部分配列を増幅するように設計されたプライマー、およびＤＮＡポリメラーゼとともにＰＣＲを行う。反応中、プローブは鋳型ＤＮＡとハイブリダイズし、同時にＰＣＲプライマーからの伸長反応が起こる。伸長反応が進むと、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により鋳型ＤＮＡとハイブリダイズしたプローブが切断されるため、プローブの蛍光色素が遊離してクエンチャーの影響を受けなくなり、蛍光が検出される。鋳型の増幅により、蛍光強度は指数関数的に増大する。標識からの蛍光の強度を測定することで、ＤＮＡ多型を検出する。
プライマーおよびプローブは、目的とするＤＮＡ多型に応じて適宜設計される。当該プライマーは、その塩基長が通常約１５～５０塩基であり、好ましくは約１５～３５塩基である。目的のＤＮＡ断片を増幅できる限りにおいて、鋳型のＤＮＡ配列と１～数個、好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～３個のミスマッチを有していてもよい。当該プローブは、その塩基長が通常約１５～５０塩基であり、好ましくは約１５～３５塩基であり、５’末端がＦＩＴＣやＶＩＣなどの蛍光色素で、３’末端がＴＡＭＲＡなどのクエンチャー（消光物質）でそれぞれ標識されている。目的のＤＮＡ多型を含む領域と特異的にハイブリダイズできる限りにおいて、鋳型のＤＮＡ配列と１～数個、好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～３個のミスマッチを有していてもよい。また、目的のＤＮＡ多型のそれぞれの対立遺伝子について、異なるレポーター蛍光色素で標識されたプローブを用いることで、ＤＮＡ多型の両対立遺伝子を１度に検出することもできる。本発明の方法で使用され得るプローブとしては、配列番号１で表される塩基配列の部分配列であって、目的のＤＮＡ多型部位の対立遺伝子の塩基を含み、かつその塩基長が通常約１５～５０塩基であり、好ましくは約１５～３５塩基である塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補鎖が例示される。
プライマーおよびプローブは、目的とするＤＮＡ多型に応じて適宜設計される。当該プライマーは、その塩基長が通常約１５～５０塩基であり、好ましくは約１５～３５塩基である。目的のＤＮＡ断片を増幅できる限りにおいて、鋳型のＤＮＡ配列と１～数個、好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～３個のミスマッチを有していてもよい。当該プローブは、その塩基長が通常約１５～５０塩基であり、好ましくは約１５～３５塩基であり、５’末端がＦＩＴＣやＶＩＣなどの蛍光色素で、３’末端がＴＡＭＲＡなどのクエンチャー（消光物質）でそれぞれ標識されている。目的のＤＮＡ多型を含む領域と特異的にハイブリダイズできる限りにおいて、鋳型のＤＮＡ配列と１～数個、好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～３個のミスマッチを有していてもよい。また、目的のＤＮＡ多型のそれぞれの対立遺伝子について、異なるレポーター蛍光色素で標識されたプローブを用いることで、ＤＮＡ多型の両対立遺伝子を１度に検出することもできる。本発明の方法で使用され得るプローブとしては、配列番号１で表される塩基配列の部分配列であって、目的のＤＮＡ多型部位の対立遺伝子の塩基を含み、かつその塩基長が通常約１５～５０塩基であり、好ましくは約１５～３５塩基である塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補鎖が例示される。
【0031】
本発明は、ＰＣＲ法を採用する本発明判別（検出）方法において用いられるＤＮＡ多型検出用プライマーまたはプローブとしてのオリゴヌクレオチドをも提供する。当該オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ多型を含む特定配列部分を特異的に増幅できるまたはＤＮＡ多型を含む特定配列部分に特異的にハイブリダイズできるものである限り特に制限はない。該オリゴヌクレオチドは配列番号１で表される塩基配列および表２のＤＮＡ多型の各対立遺伝子の情報に基いて常法に従って適宜合成、構築することができる。
【0032】
その合成は、より具体的には通常のホスホルアミダイト法、リン酸トリエステル法などの化学合成法によることもでき、また市販されている自動オリゴヌクレオチド合成装置などを使用して合成することもできる。二本鎖断片は、化学合成した一本鎖生成物とその相補鎖を合成し、両者を適当な条件下でアニーリングさせるか、または適当なプライマー配列とＤＮＡポリメラーゼとを用いて、上記一本鎖生成物に相補鎖を付加させることによって、得ることができる。
【0033】
ＰＣＲで用いられるＤＮＡ増幅用のプライマー対として好適なものは、目的のＤＮＡ多型部位を含む約５０～１０００ｂｐ、好ましくは約１００～５００ｂｐの領域を増幅できるように設計されたオリゴヌクレオチド対である。このようなプライマー対としては、目的のＤＮＡ多型部位を挟むように設計されたオリゴヌクレオチド対や、少なくとも一方のプライマーの３’末端がＤＮＡ多型部位となるように設計されたオリゴヌクレオチド対が例示される。当該プライマーは、通常約１０～５０個、好ましくは約１５～３５塩基の連続した塩基配列を有するものが例示される。
ＤＮＡ多型を検出するためのプローブとして好適なものは、目的のＤＮＡ多型の対立遺伝子を含む約１０～５０塩基、好ましくは約１５～３５塩基の配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその相補鎖が例示される。当該プローブは、５’末端がＦＩＴＣやＶＩＣのような蛍光色素で標識されていてもよく、３’の末端がＴＡＭＲＡのようなクエンチャー物質で標識されていてもよい。また、オリゴヌクレオチド中にＲＮＡ部位を有していてもよい。
ＤＮＡ多型を検出するためのプローブとして好適なものは、目的のＤＮＡ多型の対立遺伝子を含む約１０～５０塩基、好ましくは約１５～３５塩基の配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその相補鎖が例示される。当該プローブは、５’末端がＦＩＴＣやＶＩＣのような蛍光色素で標識されていてもよく、３’の末端がＴＡＭＲＡのようなクエンチャー物質で標識されていてもよい。また、オリゴヌクレオチド中にＲＮＡ部位を有していてもよい。
【0034】
プライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドの好適なものとしては、表２の（１）～（７４）のＤＮＡ多型から選択される１以上のＤＮＡ多型を含む領域を増幅できるプライマーを挙げることができる。その具体例としては、後記実施例に示される配列番号２、３、６および７で示されるフォワードプライマーおよびリバースプライマーを挙げることができる。
また、プローブとしては、表２の（１）～（７４）のＤＮＡ多型から選択される１以上のＤＮＡ多型を検出できるものを挙げることができる。
また、プローブとしては、表２の（１）～（７４）のＤＮＡ多型から選択される１以上のＤＮＡ多型を検出できるものを挙げることができる。
【0035】
本発明判定（検出）方法は、試料中のＤＮＡ多型の検出のための試薬キットを利用することによって、より簡便に実施することができる。本発明はかかる判定用キットをも提供する。
【0036】
本発明キットの一つは、表２の（１）～（７４）のＤＮＡ多型から選択される１以上のＤＮＡ多型を含む領域を増幅できるプライマーおよび／または当該ＤＮＡ多型を検出できるプローブを含む。
【0037】
本発明キットにおける他の成分としては、標識剤、ＰＣＲ法に必須な試薬（例えば、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰなど）を例示することができる。標識剤としては、放射性同位元素、発光物質、蛍光物質などの化学修飾物質などが挙げられ、ＤＮＡ断片自身が予め該標識剤でコンジュゲートされていてもよい。更に当該キットには、測定の実施の便益のために適当な反応希釈液、標準抗体、緩衝液、洗浄剤、反応停止液、制限酵素などが含まれていてもよい。
【実施例】
【0038】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
【0039】
実施例１ クロマグロの性別特異的な塩基配列の同定
天然クロマグロ成魚の雌１６個体および雄１５個体（生殖腺による性判別済み）の全ゲノムリシーケンスデータと新たに作成したクロマグロドラフトゲノム配列を用いて変異解析を実施し、性別特異的な複数のＤＮＡ多型を見出した。当該ＤＮＡ多型が存在するスキャフォルド６４番の約７．５ｋｂのゲノム領域の配列を配列番号１に示す。また、配列番号１で表される塩基配列中の各ＤＮＡ多型の位置、雌の遺伝子型、雄の遺伝子型、性判別率を表３に示す。各ＤＮＡ多型の遺伝子型は、雌においてはホモ接合型であり、雄においてはヘテロ接合型である。性判別率は、データの取得できた個体数における、雌または雄特異的遺伝子型を有する個体数の割合である。各ＤＮＡ多型は、その性判別率が９３．５％以上と高く、性判別マーカーとして有用である。
さらに、スキャフォルド６４番のゲノム配列をＨａｐｌｏｖｉｅｗ（ｖ４．２）を用い、ＬＤ－ｂａｓｅｄ ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ ａｌｇｏｒｉｔｈｍで解析したところ、配列番号１の４２２番目から３５９５番目、３７３５番目から３７８８番目、６２４０番目から６６４２番目、および６６９８番目から７１９７番目の領域が、それぞれ、連鎖不平衡ブロックであることが明らかとなった。
天然クロマグロ成魚の雌１６個体および雄１５個体（生殖腺による性判別済み）の全ゲノムリシーケンスデータと新たに作成したクロマグロドラフトゲノム配列を用いて変異解析を実施し、性別特異的な複数のＤＮＡ多型を見出した。当該ＤＮＡ多型が存在するスキャフォルド６４番の約７．５ｋｂのゲノム領域の配列を配列番号１に示す。また、配列番号１で表される塩基配列中の各ＤＮＡ多型の位置、雌の遺伝子型、雄の遺伝子型、性判別率を表３に示す。各ＤＮＡ多型の遺伝子型は、雌においてはホモ接合型であり、雄においてはヘテロ接合型である。性判別率は、データの取得できた個体数における、雌または雄特異的遺伝子型を有する個体数の割合である。各ＤＮＡ多型は、その性判別率が９３．５％以上と高く、性判別マーカーとして有用である。
さらに、スキャフォルド６４番のゲノム配列をＨａｐｌｏｖｉｅｗ（ｖ４．２）を用い、ＬＤ－ｂａｓｅｄ ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ ａｌｇｏｒｉｔｈｍで解析したところ、配列番号１の４２２番目から３５９５番目、３７３５番目から３７８８番目、６２４０番目から６６４２番目、および６６９８番目から７１９７番目の領域が、それぞれ、連鎖不平衡ブロックであることが明らかとなった。
【0040】
【表3】
【0041】
配列番号１で表される塩基配列中の２領域、具体的には配列番号１で表される塩基配列の１３０９～１４５８番目の塩基（１５０塩基）からなる領域１と、配列番号１で表される塩基配列の３０５９～３２８８番目の塩基（２３０塩基）からなる領域２について、リシーケンス解析に用いた雌１６個体、雄１５個体、計３１個体の塩基配列をアライメントした結果を、それぞれ図１および２に示す。アライメント中の矢印または四角で示される各ＤＮＡ多型は、雄に特異的または極めて特異性の高い変異であることが明らかとなった。
【0042】
実施例２ 雄特異的プライマーを用いたＰＣＲおよびアガロース電気泳動による性判別方法：領域１
領域１には、雄に特異的または極めて特異性の高い変異として、配列番号１で表される塩基配列の１３３８および１３４４番目（領域１の３０および３６番目に相当）の塩基に位置する一塩基多型と、１４１７～１４２３番目（領域１の１０９～１１５番目に相当）の塩基の欠失が存在する。したがって、クロマグロ被検体のゲノムＤＮＡを鋳型とし、これらの変異に基づいて設計した表４に示す雄特異的プライマーであるＹ３＿Ｆ１プライマー（配列番号２）およびＹ３＿Ｒ１プライマー（配列番号３）を用いたＰＣＲ増幅およびゲル電気泳動によって、１１３ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が認められた場合に被検体の遺伝的性は雄であると判定でき、ＤＮＡ断片の増幅が認められなかった場合に被検体の遺伝的性は雌であると判定することができる。ここで、Ｙ３＿Ｆ１プライマーの３’末端および３’末端から７塩基目は一塩基多型の雄特異的対立遺伝子の塩基を有し、Ｙ３＿Ｒ１プライマーは欠失領域の上流および下流の配列を有する。
そこで、天然クロマグロの雌４個体と雄４個体（生殖腺による性判別済み）について、Ｙ３＿Ｆ１プライマーおよびＹ３＿Ｒ１プライマーによるＰＣＲを行い、増幅産物をゲル電気泳動した。陰性対照として、塩基配列を確認済の雌個体を用い、陽性対照として、塩基配列を確認済の雄個体を用いた。また、ネガティブコントロール（ＮＴＣ）として、ＤＮＡなしでＰＣＲを行った。具体的な方法は、以下の通りである。各個体より、筋肉をハサミ等を用いて採取し、ＴＮＥＳ・Ｕｒｅａ ６Ｍ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ＳＤＳ、６Ｍ Ｕｒｅａ）中でプロテアーゼ処理を行い、自動ＤＮＡ抽出装置（Ｍａｘｗｅｌｌ ＲＳＣシステム、Ｍａｘｗｅｌｌ ＲＳＣ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ ｋｉｔ、プロメガ株式会社製）を用いてゲノムＤＮＡを調製した。このゲノムＤＮＡ（最終濃度０．５ｎｇ／μｌ）を鋳型とし、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）とＹ３＿Ｆ１プライマーおよびＹ３＿Ｒ１プライマー（最終濃度各０．４μＭ）を用いて、Ｐｒｏｆｌｅｘ ＰＣＲ システム（アプライドバイオシステムズ製）によりＰＣＲ反応（９８℃１０秒、６０℃１５秒、６８℃１５秒の反応を３５サイクル）を行い、得られたＰＣＲ増幅産物を３％アガロースゲルにアプライし、１００Ｖで２０分間、電気泳動を行った。なお、人為的ミスでＰＣＲ増幅に失敗し、雄個体から１１３ｂｐのＤＮＡ断片が増幅されずに、雌と誤判定されてしまう偽陰性を防止するため、内部陽性対照としてミトコンドリアＤＮＡのＮＤ４遺伝子（２６８ｂｐ）を、表４に示すＮＤ４＿ＦプライマーおよびＮＤ４＿Ｒプライマー（最終濃度各０．０５μＭ）を用いた以外は上述の条件に従って、ＰＣＲにて増幅した。
領域１には、雄に特異的または極めて特異性の高い変異として、配列番号１で表される塩基配列の１３３８および１３４４番目（領域１の３０および３６番目に相当）の塩基に位置する一塩基多型と、１４１７～１４２３番目（領域１の１０９～１１５番目に相当）の塩基の欠失が存在する。したがって、クロマグロ被検体のゲノムＤＮＡを鋳型とし、これらの変異に基づいて設計した表４に示す雄特異的プライマーであるＹ３＿Ｆ１プライマー（配列番号２）およびＹ３＿Ｒ１プライマー（配列番号３）を用いたＰＣＲ増幅およびゲル電気泳動によって、１１３ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が認められた場合に被検体の遺伝的性は雄であると判定でき、ＤＮＡ断片の増幅が認められなかった場合に被検体の遺伝的性は雌であると判定することができる。ここで、Ｙ３＿Ｆ１プライマーの３’末端および３’末端から７塩基目は一塩基多型の雄特異的対立遺伝子の塩基を有し、Ｙ３＿Ｒ１プライマーは欠失領域の上流および下流の配列を有する。
そこで、天然クロマグロの雌４個体と雄４個体（生殖腺による性判別済み）について、Ｙ３＿Ｆ１プライマーおよびＹ３＿Ｒ１プライマーによるＰＣＲを行い、増幅産物をゲル電気泳動した。陰性対照として、塩基配列を確認済の雌個体を用い、陽性対照として、塩基配列を確認済の雄個体を用いた。また、ネガティブコントロール（ＮＴＣ）として、ＤＮＡなしでＰＣＲを行った。具体的な方法は、以下の通りである。各個体より、筋肉をハサミ等を用いて採取し、ＴＮＥＳ・Ｕｒｅａ ６Ｍ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ＳＤＳ、６Ｍ Ｕｒｅａ）中でプロテアーゼ処理を行い、自動ＤＮＡ抽出装置（Ｍａｘｗｅｌｌ ＲＳＣシステム、Ｍａｘｗｅｌｌ ＲＳＣ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ ｋｉｔ、プロメガ株式会社製）を用いてゲノムＤＮＡを調製した。このゲノムＤＮＡ（最終濃度０．５ｎｇ／μｌ）を鋳型とし、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）とＹ３＿Ｆ１プライマーおよびＹ３＿Ｒ１プライマー（最終濃度各０．４μＭ）を用いて、Ｐｒｏｆｌｅｘ ＰＣＲ システム（アプライドバイオシステムズ製）によりＰＣＲ反応（９８℃１０秒、６０℃１５秒、６８℃１５秒の反応を３５サイクル）を行い、得られたＰＣＲ増幅産物を３％アガロースゲルにアプライし、１００Ｖで２０分間、電気泳動を行った。なお、人為的ミスでＰＣＲ増幅に失敗し、雄個体から１１３ｂｐのＤＮＡ断片が増幅されずに、雌と誤判定されてしまう偽陰性を防止するため、内部陽性対照としてミトコンドリアＤＮＡのＮＤ４遺伝子（２６８ｂｐ）を、表４に示すＮＤ４＿ＦプライマーおよびＮＤ４＿Ｒプライマー（最終濃度各０．０５μＭ）を用いた以外は上述の条件に従って、ＰＣＲにて増幅した。
【0043】
【表4】
【0044】
結果を図３ａに示す。１１３ｂｐのＤＮＡ断片は、雌個体（レーン１～４）および陰性対照には認められず、雄個体（レーン５～８）および陽性対照に特異的に認められた。また、内部陽性対照であるＮＤ遺伝子由来の２６８ｂｐの増幅産物は全てのレーンで確認された。これらの結果は、被験体の性判別に成功したことを示している。以上の結果は、天然クロマグロの雌３９個体、雄４８個体（生殖腺による性判別済み）においても再現されたため、領域１に含まれるＤＮＡ多型を指標とするクロマグロの性判別方法が有効であることが明らかとなった。
【0045】
実施例３ 雄特異的プライマーを用いたＰＣＲおよびアガロース電気泳動による性判別方法：領域２
領域２には、雄に特異的または極めて特異性が高い変異として、配列番号１で表される塩基配列の３０９３、３１３９、３１４６、３１４８、３１９６、３１９９、３２４９、３２５１番目（領域２の３５、８１、８８、９０、１３８、１４１、１９１、１９３番目）の塩基に位置する一塩基多型が存在する。したがって、クロマグロ被験体のゲノムＤＮＡを鋳型とし、これらの変異に基づいて設計した表４に示す雄特異的プライマーであるＹ２＿Ｆ１プライマー（配列番号６）およびＹ２＿Ｒ２プライマー（配列番号７）を用いたＰＣＲ増幅およびゲル電気泳動によって、１４３ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が認められた場合に被験体の遺伝的性は雄であると判定でき、ＤＮＡ断片の増幅が認められなかった場合に被験体の遺伝的性は雌であると判定することができる。ここで、Ｙ２＿Ｆ１プライマーの３’末端並びに３’末端から３および１０塩基目は一塩基多型の雄特異的対立遺伝子の塩基を有し、Ｙ２＿Ｒ２プライマーの５’末端から７塩基目は雌雄共通の低頻度多型（Ａ／Ｔ）に対応する塩基Ｗを、３’末端から２および４塩基目は一塩基多型の雄特異的対立遺伝子の塩基を有する。
そこで、天然クロマグロの雌４個体と雄４個体（生殖腺による性判別済み）について、Ｙ２＿Ｆ１プライマーおよびＹ２＿Ｒ２プライマーを用いた以外は実施例２と同様にして、ＰＣＲおよび電気泳動を行った。
領域２には、雄に特異的または極めて特異性が高い変異として、配列番号１で表される塩基配列の３０９３、３１３９、３１４６、３１４８、３１９６、３１９９、３２４９、３２５１番目（領域２の３５、８１、８８、９０、１３８、１４１、１９１、１９３番目）の塩基に位置する一塩基多型が存在する。したがって、クロマグロ被験体のゲノムＤＮＡを鋳型とし、これらの変異に基づいて設計した表４に示す雄特異的プライマーであるＹ２＿Ｆ１プライマー（配列番号６）およびＹ２＿Ｒ２プライマー（配列番号７）を用いたＰＣＲ増幅およびゲル電気泳動によって、１４３ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が認められた場合に被験体の遺伝的性は雄であると判定でき、ＤＮＡ断片の増幅が認められなかった場合に被験体の遺伝的性は雌であると判定することができる。ここで、Ｙ２＿Ｆ１プライマーの３’末端並びに３’末端から３および１０塩基目は一塩基多型の雄特異的対立遺伝子の塩基を有し、Ｙ２＿Ｒ２プライマーの５’末端から７塩基目は雌雄共通の低頻度多型（Ａ／Ｔ）に対応する塩基Ｗを、３’末端から２および４塩基目は一塩基多型の雄特異的対立遺伝子の塩基を有する。
そこで、天然クロマグロの雌４個体と雄４個体（生殖腺による性判別済み）について、Ｙ２＿Ｆ１プライマーおよびＹ２＿Ｒ２プライマーを用いた以外は実施例２と同様にして、ＰＣＲおよび電気泳動を行った。
【0046】
結果を図３ｂに示す。１４３ｂｐのＤＮＡ断片は、雌個体（レーン１～４）および陰性対照には認められず、雄個体（レーン５～８）および陽性対照に特異的に認められた。また、内部陽性対象であるＮＤ遺伝子由来の２６８ｂｐの増幅産物は全てのレーンで確認された。これらの結果は、被験体の性判別に成功したことを示している。以上の結果は、天然クロマグロの雌３９個体、雄４８個体（生殖腺による性判別済み）においても再現されたため、領域２に含まれるＤＮＡ多型を指標とするクロマグロの性判別方法が有効であることが明らかとなった。
【0047】
実施例４ 雄特異的欠失領域を対象としたＰＣＲおよびマイクロチップ電気泳動による性判別方法：領域１
領域１には、雄に特異的な変異として、配列番号１で表される塩基配列の１４１７～１４２３番目（領域１の１０９～１１５番目）の連続７塩基の欠失が存在する。したがって、クロマグロ被験体のゲノムＤＮＡを鋳型とし、この欠失領域を含むＤＮＡ断片を増幅するように設計した表２に示す雌雄共通プライマーであるＹ３＿ＤＥＬ＿Ｆ２プライマー（配列番号８）およびＹ３＿ＤＥＬ＿Ｒ１プライマー（配列番号９）を用いたＰＣＲによって、１４９ｂｐの雌雄共通ＤＮＡ断片のみが認められた場合に被験体の遺伝的性は雌であると判定でき、１４９ｂｐの雌雄共通ＤＮＡ断片と７塩基短い１４２ｂｐの雄特異的欠失型ＤＮＡ断片が認められた場合に被験体の遺伝的性は雄であると判定することができる。
そこで、天然クロマグロの雌４個体と雄４個体（生殖腺による性判別済み）について、Ｙ３＿ＤＥＬ＿Ｆ２プライマーおよびＹ３＿ＤＥＬ＿Ｒ１プライマーを用いたＰＣＲを行い、増幅産物をマイクロチップ電気泳動装置を用いて電気泳動した。マイクロチップ電気泳動は、通常のアガロースゲル電気泳動よりも分解能が高いため、たった７塩基の長さの違うＤＮＡ断片を明確に区別することができる。陰性対照として、塩基配列を確認済の雌個体を用い、陽性対照として、塩基配列を確認済の雄個体を用いた。また、ネガティブコントロール（ＮＴＣ）として、ＤＮＡなしでＰＣＲを行った。具体的な方法は、以下の通りである。各個体より、実施例２と同様にしてゲノムＤＮＡを調製した。このゲノムＤＮＡ（最終濃度０．５ｎｇ／μｌ）を鋳型とし、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）とＹ３＿ＤＥＬ＿Ｆ２プライマーおよびＹ３＿ＤＥＬ＿Ｒ１プライマーを用いて、Ｐｒｏｆｌｅｘ ＰＣＲ システム（アプライドバイオシステムズ製）によりＰＣＲ反応（９８℃１０秒、６０℃１５秒、６８℃１５秒の反応を３５サイクル）を行い、得られたＰＣＲ増幅産物をマイクロチップ電気泳動装置（ＭｕｌｔｉＮＡ ＤＮＡ／ＲＮＡ分析用マイクロチップ電気泳動装置、ＤＮＡ－５００キット、島津製作所製）を用いて電気泳動した。
領域１には、雄に特異的な変異として、配列番号１で表される塩基配列の１４１７～１４２３番目（領域１の１０９～１１５番目）の連続７塩基の欠失が存在する。したがって、クロマグロ被験体のゲノムＤＮＡを鋳型とし、この欠失領域を含むＤＮＡ断片を増幅するように設計した表２に示す雌雄共通プライマーであるＹ３＿ＤＥＬ＿Ｆ２プライマー（配列番号８）およびＹ３＿ＤＥＬ＿Ｒ１プライマー（配列番号９）を用いたＰＣＲによって、１４９ｂｐの雌雄共通ＤＮＡ断片のみが認められた場合に被験体の遺伝的性は雌であると判定でき、１４９ｂｐの雌雄共通ＤＮＡ断片と７塩基短い１４２ｂｐの雄特異的欠失型ＤＮＡ断片が認められた場合に被験体の遺伝的性は雄であると判定することができる。
そこで、天然クロマグロの雌４個体と雄４個体（生殖腺による性判別済み）について、Ｙ３＿ＤＥＬ＿Ｆ２プライマーおよびＹ３＿ＤＥＬ＿Ｒ１プライマーを用いたＰＣＲを行い、増幅産物をマイクロチップ電気泳動装置を用いて電気泳動した。マイクロチップ電気泳動は、通常のアガロースゲル電気泳動よりも分解能が高いため、たった７塩基の長さの違うＤＮＡ断片を明確に区別することができる。陰性対照として、塩基配列を確認済の雌個体を用い、陽性対照として、塩基配列を確認済の雄個体を用いた。また、ネガティブコントロール（ＮＴＣ）として、ＤＮＡなしでＰＣＲを行った。具体的な方法は、以下の通りである。各個体より、実施例２と同様にしてゲノムＤＮＡを調製した。このゲノムＤＮＡ（最終濃度０．５ｎｇ／μｌ）を鋳型とし、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）とＹ３＿ＤＥＬ＿Ｆ２プライマーおよびＹ３＿ＤＥＬ＿Ｒ１プライマーを用いて、Ｐｒｏｆｌｅｘ ＰＣＲ システム（アプライドバイオシステムズ製）によりＰＣＲ反応（９８℃１０秒、６０℃１５秒、６８℃１５秒の反応を３５サイクル）を行い、得られたＰＣＲ増幅産物をマイクロチップ電気泳動装置（ＭｕｌｔｉＮＡ ＤＮＡ／ＲＮＡ分析用マイクロチップ電気泳動装置、ＤＮＡ－５００キット、島津製作所製）を用いて電気泳動した。
【0048】
結果を図４に示す。１４９ｂｐの雌雄共通ＤＮＡ断片は、全検査個体（レーン１～８）、陰性対照および陽性対照に認められた。一方、１４２ｂｐの雄特異的欠失型ＤＮＡ断片は、雄個体（レーン５～８）および陽性対照に特異的に認められた。これらの結果は、被験体の性判別に成功したことを示している。なお、本実施例では、目的とする１４９ｂｐと１４２ｂｐのＤＮＡ断片の他に、約１８０ｂｐのＤＮＡ断片が雄特異的に認められた。このＤＮＡ断片は、上記雌雄共通プライマーによる目的外のＰＣＲ増幅産物であるが、雄特異的かつ安定して認められるＤＮＡ断片であり、性判別において支障はない。以上の結果は、天然クロマグロの雌３９個体、雄４８個体（生殖腺による性判別済み）においても再現されたため、領域１の上記ＤＮＡ多型を指標とするクロマグロの性判別方法が有効であることが明らかとなった。
【0049】
実施例５ 雄特異的欠失領域を対象としたＰＣＲおよびマイクロチップ電気泳動による性判別方法：領域１
養殖クロマグロの雌６個体と雄４個体（生殖腺による性判別済み）について、体表粘液サンプルを用いた以外は実施例４と同様にして、ＰＣＲおよびマイクロチップ電気泳動を行った。体表粘液サンプルは、魚体の体表を綿棒で擦って採取した。体表粘液の付着した綿部のみをＴＮＥＳ・Ｕｒｅａ ６Ｍ溶液中でプロテアーゼ処理を行い、自動ＤＮＡ抽出装置（前述）を用いてゲノムＤＮＡを調製した。
養殖クロマグロの雌６個体と雄４個体（生殖腺による性判別済み）について、体表粘液サンプルを用いた以外は実施例４と同様にして、ＰＣＲおよびマイクロチップ電気泳動を行った。体表粘液サンプルは、魚体の体表を綿棒で擦って採取した。体表粘液の付着した綿部のみをＴＮＥＳ・Ｕｒｅａ ６Ｍ溶液中でプロテアーゼ処理を行い、自動ＤＮＡ抽出装置（前述）を用いてゲノムＤＮＡを調製した。
【0050】
結果を図５に示す。１４９ｂｐの雌雄共通ＤＮＡ断片は、全個体（レーン１～１０）に認められた。一方、１４２ｂｐの雄特異的欠失型ＤＮＡ断片は、雄個体（レーン２、４、８および１０）に特異的に認められた。これらの結果は、被験体の性判別に成功したことを示している。本実施例で用いたクロマグロ個体は、継代Ｆ２世代の養殖魚であることから、領域１の上記ＤＮＡ多型を指標とするクロマグロの性判別方法は、天然魚だけでなく養殖魚でも有効であることが明らかとなった。また、本実施例で用いた試料はクロマグロ個体の体表粘液サンプルであることから、個体より採取したサンプルを用いることで、個体を生かしたままの性判別が可能であることが明らかとなった。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】