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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-01-12
(45)【発行日】2022-02-10
(54)【発明の名称】シクロデキストリン及びブデソニド誘導体組成物ならびに方法
(51)【国際特許分類】
A61K 31/58 20060101AFI20220203BHJP
A61K 47/61 20170101ALI20220203BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20220203BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20220203BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20220203BHJP
A61K 9/10 20060101ALI20220203BHJP
A61K 31/724 20060101ALN20220203BHJP
【ＦＩ】
A61K31/58
A61K47/61
A61P11/00
A61P29/00
A61K9/08
A61K9/10
A61K31/724
【請求項の数】
12
(21)【出願番号】P 2020032976
(22)【出願日】2020-02-28
(62)【分割の表示】P 2017501502の分割
【原出願日】2015-03-30
(65)【公開番号】P2020100658
(43)【公開日】2020-07-02
【審査請求日】2020-03-26
(31)【優先権主張番号】61/972,209
(32)【優先日】2014-03-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】14162158.1
(32)【優先日】2014-03-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】500029925
【氏名又は名称】ユニベルシテ・ド・リエージュ
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＤＥ ＬＩＥＧＥ
【住所又は居所原語表記】Ａｖｅｎｕｅ Ｐｒｅ－Ａｉｌｙ，４，Ｂ－４０３１ Ａｎｇｌｅｕｒ，Ｂｅｌｇｉｕｍ
(73)【特許権者】
【識別番号】516290874
【氏名又は名称】マエ，ポール
(74)【代理人】
【識別番号】110001656
【氏名又は名称】特許業務法人谷川国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】マエ，ポール
(72)【発明者】
【氏名】カタルド，ディディエ
(72)【発明者】
【氏名】エブラール，ブリジット
(72)【発明者】
【氏名】デュフール，ジル
(72)【発明者】
【氏名】ド・トゥリオ，パスカル
【審査官】福山 則明
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１７－５０９７０９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００７－５１７０６７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００７－５１７０６８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００９－５４２６４９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００９－５２６８６０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００８－５１５８４７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００８－５０６６７４（ＪＰ，Ａ）
【文献】欧州特許出願公開第０１８９４５５９（ＥＰ，Ａ１）
【文献】特表２００９－５３７５６９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００９－５２０８２３（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２００７／０２４９５７２（ＵＳ，Ａ１）
【文献】国際公開第２００７／０９５３３９（ＷＯ，Ａ２）
【文献】日呼吸会誌，2004年，Vol. 42, No. 8，pp. 700-704
【文献】高野 泰宏，学位論文「炎症性肺疾患における好中球浸潤抑制作用を有する新規ビタミンＤ３誘導体の創薬研究」，千葉大学大学院薬学研究院，2013年，第１－７６頁
【文献】COPD FRONTIER，2007年，Vol. 6, No. 1，pp. 26-28
【文献】Powder Technology，2014年04月02日，Vol. 260，pp. 36-41
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３１／００－３１／８０
Ａ６１Ｋ ９／００－ ９／７２
Ａ６１Ｋ ４７／００－４７／６９
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン及びブデソニドを含む、肺炎症性疾患患者の肺組織中のインターロイキン１３（ＩＬ１３）又はインターロイキン１７（ＩＬ１７）を減少させるための組成物。
【請求項2】
前記組成物は１日当たり５０～２００ｍｃｇの範囲で投与される、請求項１記載の組成物。
【請求項3】
前記ブデソニドと前記ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンのモル比が１：１～１：１００である、請求項１又は２記載の組成物。
【請求項4】
前記組成物が溶液または懸濁液中に存在する、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項5】
前記組成物が微粉化粉末である、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項6】
１００μｇ／ｍｌのブデソニド及び２０ｍＭのヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項7】
２５０μｇ／ｍｌのブデソニド及び２０ｍＭのヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項8】
１００μｇ／ｍｌのブデソニド及び１０ｍＭのヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項9】
２５０μｇ／ｍｌのブデソニド及び１０ｍＭのヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項10】
前記ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンが、１：１の化学量論比でブデソニドとの複合体を形成する、請求項１～９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項11】
前記肺組織中のＣＸＣＬ－１レベルを減少させる際に使用するための、請求項１～１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項12】
前記肺炎症性疾患が慢性閉塞性疾患である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
米国特許のための本出願は、２０１４年３月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／９７２，２０９号、表題「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ ｗｉｔｈ Ｂｕｄｅｓｏｎｉｄｅ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ」、及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｅ ｄｅ Ｌｉｅｇｅによって寄託され、公開番号ＥＰ１４１６２１５８．１を割り当てられた欧州出願第ＥＰ１４１３２１５８ ＢＥ号 ２８．０３．２０１４、表題「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ ｗｉｔｈ ｂｕｄｅｓｏｎｉｄｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｎｄ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ」に関連し、また参照により、本明細書に完全に記載されているかのように、その全体を本明細書に組み込む。
米国特許のための本出願は、２０１４年３月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／９７２，２０９号、表題「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ ｗｉｔｈ Ｂｕｄｅｓｏｎｉｄｅ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ」、及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｅ ｄｅ Ｌｉｅｇｅによって寄託され、公開番号ＥＰ１４１６２１５８．１を割り当てられた欧州出願第ＥＰ１４１３２１５８ ＢＥ号 ２８．０３．２０１４、表題「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ ｗｉｔｈ ｂｕｄｅｓｏｎｉｄｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｎｄ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ」に関連し、また参照により、本明細書に完全に記載されているかのように、その全体を本明細書に組み込む。
【0002】
本発明は、肺炎症性疾患の治療及び／または予防のためにシクロデキストリン化合物及びブデソニド誘導体を用いて調合される新規かつ有用な薬学的組成物に関する。本発明はまた、溶液中のＨＰ－β－ＣＤの検出及び定量化のための新規かつ有用な分析技術にも関する。より具体的には、本発明は、液体製剤のためのいずれの抽出または分離ステップも用いることなく、薬学的製剤中のシクロデキストリンを直接的に検出及び定量化するための有効な１Ｈ ＮＭＲ分析の使用に関する。
【背景技術】
【0003】
肺炎症性疾患（ＰＩＤ）は、完全に可逆性ではない気流制限によって特徴付けられる病態である。気流制限は、例えば、有害な粒子（直径２．５マイクロメートル以下の、タバコ及び煙霧中に見られるもの等の微粒子）に対する肺の異常な炎症反応を伴う。
【0004】
肺炎症性疾患は、炎症性の喘息（すなわち、重症の喘息）、慢性閉塞性疾患（ＣＯＰＤ）、例えば、慢性気管支炎、閉塞性細気管支炎、肺気腫、肺線維症、嚢胞性線維症等を含む。
【0005】
ＰＩＤ患者には、プロテアーゼ及び酸化体（活性酸素種）の繰り返し生成によって気道構造の進行性破壊をもたらす著しい好中球性炎症が気管支壁に認められる。現在までのところ、市販の治療薬は、ＰＩＤ患者においてこの好中球性炎症を十分に軽減または予防することができていない。特に、吸入または経口ステロイドが好中球性炎症に対して有効性を示さないということは周知である。例えば、Ｓ．Ｃｕｌｐｉｔｔらによって実施された研究（ＣＯＰＤ患者において行われた）Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．１６０：１６３５－１６３９（１９９９）において、ＣＯＰＤ関連性の好中球性炎症における高用量吸入ステロイド、及び好中球（ヒトでは主にＩＬ－８）に対する走化性物質の有効性の欠如が報告されている。
【0006】
ＰＩＤ患者における現在のステロイド治療の無効性を考慮すると、ＰＩＤ患者において好中球性炎症を十分に軽減または予防するための効果的なステロイド治療の必要性が存在する。
【発明の概要】
【0007】
手短に述べると、本発明は、肺炎症性疾患の治療処置及び／または予防のような処置を必要とする宿主哺乳動物における肺炎症性疾患の治療処置及び／または予防に効果的な使用のための新規かつ有用な薬学的組成物の発見を通して、ＰＩＤ患者における現在のステロイド療法の使用に関連する上記欠点及び短所を克服する。
【0008】
一般的に、本発明は、肺炎症性疾患の治療及び／または予防のためにシクロデキストリン化合物及びブデソニド誘導体を用いて調合される新規かつ有用な薬学的組成物に関する。本発明はまた、溶液中のＨＰ－β－ＣＤの検出及び定量化のための新規かつ有用な分析技術にも関する。より具体的には、本発明は、液体製剤のためのいずれの抽出または分離ステップも用いることなく、薬学的製剤中のシクロデキストリンを直接的に検出及び定量化するための有効な１Ｈ ＮＭＲ分析の使用に関する。
【0009】
本発明の新規組成物及び方法は、シクロデキストリン化合物及び式（Ｉ）のブデソニド誘導体を用いて調合される組成物を含み、
【0010】
【化1】
「Ｒ３」、「Ｒ４」、「Ｒ５」、及び「Ｒ６」は、各々独立して、水素、ヒドロキシル部分、Ｃ１－５－アルコキシ、Ｃ１－５－アルコキシカルボニル、ヒドロキシカルボニル、任意選択的にハロゲン原子で単置換もしくは多置換されたＣ１－５－アルキルカルボニル、Ｃ１－５－アルキルカルボニルオキシ、Ｃ３－８－シクロアルキルカルボニルオキシ、Ｃ１－５アルキルチオ、Ｃ１－５アルキルスルホニル、Ｃ１－５－アルキルスルフィニル、フラン、フランカルボニルオキシ、任意選択的にハロゲン原子で単置換もしくは多置換されたＣ１－５－アルキチオカルボニル、またはプロピオニルオキシメチルカルボニルを表し；
「Ｒ４」及び「Ｒ５」は、任意選択的に一緒になって３～５個の原子の炭化水素環を形成し、２つの炭素原子は、任意選択的に酸素原子によって置換され、環は、任意選択的にＣ１－５－アルキル基によって置換される。例えば、肺炎症性疾患の治療処置及び／または予防処置のような処置を必要とする宿主哺乳動物における肺炎症性疾患の治療処置及び／または予防処置における使用のための、２個の炭素原子が酸素原子によって置換され、任意選択的にプロピル基等のアルキル基によって置換された、３～５個の原子のビス－オキシ炭化水素環；あるいは、薬学的に許容される酸もしくは塩基とのその塩、またはそのラセミ混合物もしくは任意の互変異性形態を含む任意の光学異性体もしくは光学異性体の混合物である。
【0011】
「Ｃ１－５－アルキル」は、本明細書で使用される場合、１～５個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖の飽和または不飽和の炭化水素基、例えば、メチル、プロピル、ブチル、イソペンチル、１－メチルブチル、１，２－ジメチルブチル、２－エチルブチル等を意味する。
【0012】
「Ｃ３－８－シクロアルキル」は、本明細書で使用される場合、３個以上の炭素、好ましくは３～８個の炭素原子を環に有する、飽和または部分不飽和のヒドロカルビル基を意味する。シクロアルキル基の例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル等である。
【0013】
Ｃ１－５－アルキルオキシとも示される「Ｃ１－５－アルコキシ」は、本明細書で使用される場合、エーテル酸素からその自由原子価結合を有し、かつ１～５個の炭素原子を有する、エーテル酸素を介して結合されたＣ１－５－アルキル基を含む直鎖または分岐鎖の一価の置換基、例えば、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシ、イソプロポキシ、ブチルオキシ、ｓｅｃ－ブチルオキシ、ｔｅｒ－ブチルオキシ、２－メチルブトキシ、ペンチルオキシ等を意味する。
【0014】
「Ｃ１－５－アルコキシ－Ｃ１－５－アルキル」は、本明細書で使用される場合、酸素原子によって中断された２～１０個の炭素原子、例えば、－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ３、－Ｃ Ｈ２Ｃ Ｈ２Ｏ－Ｃ Ｈ３、－Ｃ Ｈ２－Ｏ－Ｃ Ｈ２Ｃ Ｈ３、－Ｃ Ｈ２－Ｏ－ＣＨ（Ｃ Ｈ３）２、－Ｃ Ｈ２Ｃ Ｈ２－Ｏ－ＣＨ（Ｃ Ｈ３）２、－ＣＨ（Ｃ Ｈ３）Ｃ Ｈ２－Ｏ－Ｃ Ｈ３等を意味する。
【0015】
「Ｃ１－５－アルキルチオ」は、単独でまたは組み合わせて、本明細書で使用される場合、硫黄原子からその自由原子価結合を有し、かつ１～５個の炭素原子を有する、二価の硫黄原子を介して結合されたＣ１－５－アルキル基を含む直鎖または分岐鎖の一価の置換基、例えば、メチルチオ、エチルチオ、プロピルチオ、イソプロピルチオ、ブチルチオ、ペンチルチオ、３－メチルペンチルチオ等を指す。
【0016】
「Ｃ１－５－アルキルスルホニル」は、本明細書で使用される場合、スルホニル基（－Ｓ（＝Ｏ）２－）を介して結合されたＣ１－５－アルキル基を含む一価の置換基、例えば、メチルスルホニル、エチルスルホニル、プロピルスルホニル、イソプロピルスルホニル、ブチルスルホニル、ペンチルスルホニル、２－メチルペンチルスルホニル等を指す。
【0017】
「Ｃ１－５－アルキルスルフィニル」は、本明細書で使用される場合、スルフィニル基（－Ｓ（＝Ｏ））を介して結合されたＣ１－５－アルキル基を含む一価の置換基、例えば、メチルスルフィニル、エチルスルフィニル、プロピルスルフィニル、イソプロピルスルフィニル、ｔｅｒｔ－ブチルスルフィニル、ペンチルスルフィニル、２－エチルブチルスルフィニル等を指す。
【0018】
「フラン」は、本明細書で使用される場合、以下を意味する。
【0019】
【化2】
【0020】
「フランカルボニルオキシ」は、本明細書で使用される場合、以下を意味する。
【0021】
【化3】
【0022】
「ハロゲン」は、本明細書で使用される場合、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素を意味する。
【0023】
「Ｒ４」及び「Ｒ５」は、任意選択的に一緒になって３～５個の原子の炭化水素環を形成してもよく、その内の２個の炭素原子は、任意選択的に酸素原子によって置換されてもよく、環は、任意選択的にＣ１－５アルキル基で置換されてもよく、例えば、その内の２個の炭素原子が酸素原子で置換されてもよく、また任意選択的にアルキル基、例えば１，３－ジオキソラン－２－イル）プロピルで置換されてもよい、３～５個の原子のビスオキシ炭化水素環、または
【0024】
【化4】
【0025】
本発明による好ましいブデソニド誘導体は、これ以降に示されるように、Ｒ３またはＲ４にそれぞれフランカルボニルオキシ基を有し、一般式（Ｉ）によって表されるフロ酸モメタゾンまたはフロ酸フルチカゾンである。
【0026】
【化5】
【0027】
フロ酸モメタゾンはＰｆｉｚｅｒ及びＭｅｒｃｋから市販されており、フロ酸フルチカゾンはＧＳＫから市販されている。
【0028】
本発明による他の好ましいブデソニド誘導体は、以下のように、Ｒ４に少なくともプロピルカルボニルオキシ基またはプロピオネート基を有し、一般式（Ｉ）によって表されるプロピオン酸フルチカゾンまたはジプロピオン酸ベクロメタゾンである。
【0029】
【化6】
【0030】
プロピオン酸フルチカゾンは、Ｆｌｉｘｏｔｉｄｅの商品名でＧＳＫから市販されており、ジプロピオン酸ベクロメタゾンは、ＱＶＡＲ、Ｅｃｏｂｅｃ、及びＢｅｃｌｏｐｈａｒの商品名でＵＣＢ、ＳＡＮＤＯＺ、ＴＥＶＡ、及びＣＨＩＥＳＩから市販されている。
【0031】
本発明によれば、最も好ましいブデソニド誘導体はブデソニドである。ブデソニドは、副腎皮質ステロイドであり、一般式（Ｉ）によって表される。
【0032】
【化7】
【0033】
ブデソニドはまた、ブチルアルデヒドを有する（Ｒ，Ｓ）－１１（３，１６ａ，１７，２１－テトラヒドロキシプレグナ－１，４－ジエン－３，２０－ジオン環状１６，１７－アセタール、または１６，１７－（ブチリデンビス（オキシ））－１１，２１－ジヒドロキシ－、（１１－β，１６－α）－プレグナ－１，４－ジエン－３，２０－ジオンとも称される。ブデソニドの化学式、分子量、及びＣＡＳ番号は、それぞれ、Ｃ２５Ｈ３４０６、ＭＷ：４３０．５、及び５１３３３－２２－３である。
【0034】
ブデソニドは、２つのジアステレオマー２２Ｒ及び２２Ｓの混合物からなるラセミ体であり、２つの異性体（２２Ｒ及び２２Ｓ）の混合物として商業的に提供されている。
【0035】
溶液としてのブデソニドの市販製剤は、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ ＬＰ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｄｅｌ．）によって、Ｐｕｌｍｉｃｏｒｔ Ｒｅｓｐｕｌｅｓ（登録商標）、Ｒｈｉｎｏｃｏｒｔ（登録商標）Ａｑｕａ、Ｒｈｉｎｏｃｏｒｔ（登録商標）の商品名で、またＮａｓａｌ Ｉｎｈａｌｅｒ及びＰｕｌｍｉｃｏｒｔ（登録商標）Ｔｕｒｂｕｈａｌｅｒの商品名で粉末として、及びそのジェネリック名で提供されている。粉末形態のブデソニド（原材料）は、Ｉｎｄｉｓ（Ｂｅｌｇｉｕｍ）によって提供されている。
【0036】
ベタメタゾンもまた、本発明によって企図される。ブデソニドと同様に、ベタメタゾンは副腎皮質ステロイドであり、以下のような一般式によって表される。
【0037】
【化8】
【0038】
ベタメタゾンのＩＵＰＡＣ名は、（８Ｓ，９Ｒ，１０Ｓ，１１Ｓ，１３Ｓ，１４Ｓ，１６Ｓ，１７Ｒ）－９－フルオロ－１１，１７－ジヒドロキシ－１７－（２－ヒドロキシアセチル）－１０，１３，１６－トリメチル－６，７，８，１１，１２，１４，１５，１６－オクタヒドロシクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－オンである。ブデソニドの化学式、分子量、及びＣＡＳ ＩＤ番号は、それぞれ、Ｃ２２Ｈ２９ＦＯ５、３９２．４６１０６３ｇ／ｍｏｌ、及び３７８－４４－９である。
【0039】
ベタメタゾンの代替の化学名は、セレストン、リンデロンベタメタゾン、及びフルベニソロンを含む。
【0040】
フルチカゾンは、本発明によって企図される別の副腎皮質ステロイドであり、以下のような一般式によって表される。
【0041】
【化9】
【0042】
フルチカゾンのＩＵＰＡＣ名は、（６α，１１β，１６α，１７α）－６，９－ジフルオロ－１７－｛［（フルオロ－メチル）チオ］カルボニル｝－１１－ヒドロキシ－１６－メチル－３－オキソアンドロスタ－１，４－ジエン－１７－イル２－フランカルボキシレートである。フルチカゾンの化学式、分子量、及びＣＡＳ ＩＤ番号は、それぞれ、Ｃ２７Ｈ２９Ｆ３Ｏ６Ｓ、５３８．５７６ｇ／ｍｏｌ、及び８０４７４－１４－２である。
【0043】
シクロデキストリンは、デンプンから細菌分解によって生成される環状オリゴ糖であることが知られている。シクロデキストリンは、６、７、または８個のα－Ｄ－グルコピラノシド単位からなり、それに応じてα、β、またはγシクロデキストリンと称される。
【0044】
【化10】
【0045】
本発明によるシクロデキストリン化合物は、シクロデキストリン自体、「Ｒ」がメチル、エチル、プロピル、もしくはブチルであるアルキル－シクロデキストリン（Ｒ－ＣＤ）；カルボキシアルキル－シクロデキストリン（ＣＲ－ＣＤ）、エーテル化シクロデキストリン（ＲＯ－ＣＤ）、ヒドロキシアルキル－シクロデキストリン（ＨＲ－ＣＤ）、グルコシル－シクロデキストリン、ジ及びトリグリセリド－シクロデキストリン、またはそれらの組み合わせ及びそれらの薬学的に許容される塩を含むが、これらは、約２５℃で少なくとも約０．５ｇｒ／１００ｍｌの量で水溶性である。
【0046】
本発明において好ましく使用される水溶性シクロデキストリン化合物は、少なくともＢ－シクロデキストリンの水溶性（約１．８５ｇ／１００ｍｌ）を有するシクロデキストリン化合物を指す。そのような水溶性シクロデキストリン化合物の例は、ヒドロキシプロピルシクロデキストリン、マルトシルシクロデキストリン、及びそれらの塩を含む。特に、ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン、マルトシル－β－シクロデキストリン、及びそれらの誘導体が好ましい。
【0047】
本発明による他の好ましいシクロデキストリン化合物は、メチルシクロデキストリン（シクロデキストリンのメチル化生成物）、例えば、２－Ｏ－メチルβ－シクロデキストリン；ジメチルシクロデキストリン（ＤＩＭＥＢ）（好ましくは２位及び６位で置換される）、トリメチルシクロデキストリン（好ましくは２位、３位、及び６位で置換される）、「ランダムメチル化」シクロデキストリン（ＲＡＭＥＢまたはＲＭ）（好ましくは２位、３位、及び６位でランダムに置換されるが、グルコピラノース単位によって１．７位から１．９位に多くのメチルを有する）、ヒドロキシプロピルシクロデキストリン（ＨＰＣＤ）、好ましくは、主に２位及び３位でランダムに置換されたヒドロキシプロピル化シクロデキストリン（ＨＰ－βＣＤ、ＨＰ－γＣＤ）、ヒドロキシエチル－シクロデキストリン、カルボキシメチルエチルシクロデキストリン、エチルシクロデキストリン、ヒドロキシル基の炭化水素鎖をグラフト化することによって得られ、ナノ粒子を形成することができる両親媒性シクロデキストリン、コレステロールシクロデキストリン、及びＣｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｄ．Ｂｒｕｃｋ Ｅｄ，Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ－Ｅｎａｂｌｉｎｇ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ；ｔｈｅｉｒ ｐｒｅｓｅｎｔ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｕｓｅ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｄ．Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｖｏｌｕｍｅ １４，Ｉｓｓｕｅ １ ｐ１－１１４（１９９７）（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるように、（スペーサーアームで）モノアミノ化シクロデキストリンをグラフト化することによって得られるトリグリセリド－シクロデキストリンを含む。
【0048】
本発明による最も好ましいシクロデキストリン化合物は、グルコピラノース単位上にグラフト化された化学官能基を任意選択的に有するβ－シクロデキストリン、例えば、ヒドロキシプロピル－βシクロデキストリン（ＨＰβＣＤ）、－βシクロデキストリン（ＳＢＥβＣＤ）、ランダムメチル化－βシクロデキストリン（ＲＭβＣＤ）、ジメチル－βシクロデキストリン（ＤＩＭＥβＣＤ）、トリメチル－βシクロデキストリン（ＴＲＩＭＥβＣＤ）、ヒドロキシブチル－βシクロデキストリン（ＨＢβＣＤ）、グルコシルβシクロデキストリン、マルトシルβシクロデキストリン２－Ｏ－メチルβシクロデキストリン（Ｃｒｙｓｍｅｂ）、ならびにそれらの薬学的に許容される塩、及びそれらの任意の組み合わせを含む。
【0049】
本発明による好ましいシクロデキストリンは、ヒドロキシプロピル－βシクロデキストリン（これ以前またはこれ以降、ＨＰ－β－ＣＤまたはＨＰＢＣＤとも称される）である。
【0050】
本発明によるシクロデキストリン化合物は、「Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊ Ｓｚｅｊｔｌｉ，Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ １９９８，ｐｐ１－７８」（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載される方法等の周知のデンプンの酵素分解と、その後の適切な化学基のグラフト化によって生成される。それらはＲｏｑｕｅｔｔｅ（Ｆｒａｎｃｅ）から市販されている。
【0051】
最も好ましい薬学的組成物は、約１－１～約１－１００、好ましくは約１：７５、及び最も好ましくは約１：５０のモル比でブデソニド誘導体及びシクロデキストリン化合物を含む。ブデソニド／ヒドロキシプロピル－βシクロデキストリンの濃度比は、好ましくは約１：５０のモル比である。
【0052】
シクロデキストリン化合物及びブデソニド誘導体を含む本発明による薬学的組成物は、粉末形態の過剰なブデソニド誘導体を、溶液中の適切な量のシクロデキストリンに加えることによって調製され得る。シクロデキストリン溶液は、水または水－アルコールまたはアルコール系の溶液、例えばエタノールである。ブデソニド誘導体及びシクロデキストリン化合物は、室温で連続撹拌下で混合される。過剰な量のブデソニド誘導体は、濾過によって除去される。
【0053】
両方の構成成分は、結果として生じるブデソニド誘導体とシクロデキストリンとの混合物を約１：１５００～約１：２の重量濃度比、好ましくは１：６０の比で得るように重み付けされている。
【0054】
次いで、液体混合物は、微粒子化された乾燥粉末を生成するために、当該技術分野で周知の適切な技術によって噴霧化する間に乾燥させることができる。そのような場合、薬学的組成物は、薬学的に許容される賦形剤、例えば、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マンニトール、ポリオール、ロイシン誘導体等の担体等も含むことができる。
【0055】
また液体混合物は、溶液としての薬学的組成物を生成するように、混合ステップの溶液中のシクロデキストリンの濃度の１つと同じ濃度で等張緩衝液中のシクロデキストリンに加えられてもよい。
【0056】
溶液としての薬学的組成物はまた、等張緩衝液、防腐剤、溶媒または粘度調整剤、及び補助物質等の周知の薬学的に許容される賦形剤も含有し得る。適切な等張緩衝液系は、ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏ．ｌｏｎｚａ．ｃｏｍ／ｕｐｌｏａｄｓ／ｔｘ＿ｍｗａｘｍａｒｋｅｔｉｎｇｍａｔｅｒｉａｌ／Ｌｏｎｚａ＿ＢｅｎｃｈＧｕｉｄｅｓ＿Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ＿Ｂｕｆｆｅｒｅｄ＿Ｓａｌｉｎｅ＿ＰＢＳ．ｐｄｆに報告されるように、リン酸ナトリウム（ＰＢＳ）、酢酸ナトリウム、またはホウ酸ナトリウムに基づいている。
【0057】
防腐剤は、使用中に薬学的組成物の微生物汚染を防止するために含まれてもよい。好適な防腐剤は、例えば、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、メチルパラベン、プロピルパラベン、フェニルエチルアルコール、ソルビン酸である。そのような防腐剤は、典型的には約０．０１～約１重量／体積％の量で使用される。
【0058】
好適な補助物質及び薬学的に許容される塩は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ ｅｄ．，１９８０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ｏｓｌｏらによる編集）（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【0059】
典型的には、組成物を等張性にするために適切な量の薬学的に許容される塩が本発明の薬学的組成物に使用される。薬学的に許容される物質の例は、生理食塩水、リンゲル液、及びデキストロース溶液を含む。本発明によれば、溶液のｐＨは、好ましくは約５～約８、より好ましくは７～約７．５である。
【0060】
本発明による薬学的組成物は、肺炎症性疾患、好ましくは慢性閉塞性肺疾患、例えば、慢性気管支炎、閉塞性細気管支炎、肺気腫、肺線維症、嚢胞性線維症等、また最も好ましくはタバコ誘発性の慢性閉塞性肺疾患及び嚢胞性線維症疾患の治療を必要とする宿主哺乳動物におけるそれらの治療及び／または予防に有用である。
【0061】
本発明の薬学的組成物は、経口、非経口、または局所剤形、特に、エアロゾルまたは鼻腔吸入投与のための投与形態、局所投与形態に製剤化され得る。本発明の薬学的組成物は、溶液、懸濁液として、微粉化粉末混合物等として送達され得る。さらに、本発明の薬学的組成物は、例えば、ネブライザー、定量吸入器、もしくは乾燥粉末吸入器、またはそのような局所投与のために設計された任意の他のデバイスによって投与され得る。
【0062】
本発明による薬学的組成物は、約０．０５～約１０００ｍｃｇの範囲、好ましくは約０．１～約５００ｍｃｇ、特に、１日当たり約５０～約２００ｍｃｇの範囲の分子用量として投与されてもよい。
【0063】
本発明によって企図される好ましい薬学的組成物は、溶液中にブデソニド及びシクロデキストリン、最も好ましくはブデソニド及びＨＰ－β－シクロデキストリンを含む。
【0064】
本発明によって企図される最も好ましい薬学的組成物は、等張緩衝液中約２０ｍＭのＨＰ－β－シクロデキストリンの溶液中に約１００μｇ／ｍｌのブデソニドの濃度で、溶液としてブデソニド及びシクロデキストリンを含有する。
【0065】
本発明による薬学的組成物中のシクロデキストリン化合物とブデソニド誘導体との組み合わせは、好ましくは、約１：１または約２：１の化学量論比のブデソニド誘導体－シクロデキストリン化合物の複合体である。ブデソニド及びＨＰ－β－シクロデキストリンの複合体は、約１：１の化学量論比である。
【0066】
本発明はさらに、以下を対象とする。
【0067】
（１）炎症性疾患の治療処置及び／または予防処置のような処置を必要とする宿主哺乳動物における肺炎症性疾患の治療処置及び／または予防処置における使用のための、シクロデキストリン化合物及び式Ｉのブデソニド誘導体を含む薬学的組成物であって、
【0068】
【化11】
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は、各々独立して、水素、ヒドロキシル、Ｃ１－５－アルコキシ、Ｃ１－５－アルコキシカルボニル、ヒドロキシカルボニル、任意選択的にハロゲン原子で単置換または多置換されたＣ１－５－アルキルカルボニル、Ｃ１－５－アルキルカルボニルオキシ、Ｃ３－８－シクロアルキルカルボニルオキシ、Ｃ１－５アルキルチオ、Ｃ１－５アルキルスルホニル、Ｃ１－５－アルキルスルフィニル、フラン、フランカルボニルオキシ、任意選択的にハロゲン原子で単置換または多置換されたＣ１－５－アルキチオカルボニルを表し；
Ｒ４及びＲ５は、任意選択的に一緒になって３～５個の原子の炭化水素環を形成し、２つの炭素原子は、任意選択的に酸素原子によって置換され、環は、Ｃ１－５アルキル基によって任意選択的に置換される、薬学的組成物、あるいは、薬学的に許容される酸もしくは塩基とのその塩、またはそのラセミ混合物もしくは任意の互変異性形態を含む任意の光学異性体もしくは光学異性体の混合物。
【0069】
（２）ブデソニド誘導体／及びシクロデキストリン化合物は、約１：１５００～約１：２の重量濃度比である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【0070】
（３）ブデソニド誘導体／及びシクロデキストリン化合物は、約１：６０の重量濃度比である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【0071】
（４）ブデソニド誘導体は、フロ酸モメタゾン、フルチカゾン、フロ酸フルチカゾン、プロピオン酸フルチカゾン、ベタメタゾン、プロピオン酸ベタメタゾン、ベクロメタゾン、ブデソニド、またはそれらの組み合わせ及びそれらの薬学的に許容される塩もしくはエステルからなる群から選択される、請求項１～３に記載の薬学的組成物。
【0072】
（５）ブデソニド誘導体を含み、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ６は水素であり、Ｒ３はヒドロキシエタノン基であり、Ｒ４はＲ５と一緒になって１，３－ジオキソラン－２－イル）プロピルまたは
【0073】
【化12】
【0074】
（６）ブデソニド誘導体を含み、式中、Ｒ１は水素であり、Ｒ２はＣｌであり、Ｒ３はフランカルボキシルであり、Ｒ４はクロロメチルカルボニルであり、Ｒ５及びＲ６は水素（フロ酸モメタゾン）である、請求項１～４のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【0075】
（７）ブデソニド誘導体を含み、式中、Ｒ１及びＲ２はＦｌｕｏｒであり、Ｒ３はフルオロメチルチオカルボニルであり、Ｒ４はフランカルボキシルであり、Ｒ５及びＲ６は水素（フロ酸フルチカゾン）である、請求項１～４のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【0076】
（８）ブデソニド誘導体を含み、式中、Ｒ１及びＲ２はＦｌｕｏｒであり、Ｒ３はフルオロメチルチオカルボニルであり、Ｒ４はプロピルカルボキシルであり、Ｒ５及びＲ６は水素（プロピオン酸フルチカゾン）である、請求項１～４のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【0077】
（９）ブデソニド誘導体を含み、式中、Ｒ２は塩素であり、Ｒ１、Ｒ５、及びＲ６は水素であり、Ｒ３はプロピオニルオキシメチルカルボニルであり、Ｒ４はプロピルカルボニルオキシ基
【0078】
【化13】
【0079】
（１０）ブデソニド誘導体は、シクロデキストリン化合物と一緒になって約１：１の化学量論比で複合体を形成する、請求項１～９のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【0080】
（１１）シクロデキストリン化合物は、少なくとも約１．８５ｇ／１００ｍｌの水溶性を有する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組成物。
【0081】
（１２）シクロデキストリン化合物は、β－シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル－βシクロデキストリン、ランダムメチル化－βシクロデキストリン、ジメチル－βシクロデキストリン、トリメチル－βシクロデキストリン、ヒドロキシプロピルβ－シクロデキストリン、ヒドロキシブチルβシクロデキストリン、グルコシル－βシクロデキストリン、マルトシル－βシクロデキストリン、２－Ｏ－メチル－βシクロデキストリン、またはそれらの組み合わせ及びそれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の組成物。
【0082】
（１３）シクロデキストリン化合物は、ヒドロキシプロピルβ－シクロデキストリンである、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組成物。
【0083】
（１４）肺炎症性疾患は、慢性閉塞性疾患である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の組成物。
【0084】
（１５）肺炎症性疾患の予防処置のための方法であって、そのような処置を必要とする患者に対する有効量の請求項１～１４のいずれか一項に記載の組成物の投与を含む、方法。
【0085】
（１６）肺炎症性疾患の治療処置のための方法であって、そのような処置を必要とする患者に対する有効量の請求項１～１４のいずれか一項に記載の組成物の投与を含む、方法。
【0086】
（１７）シクロデキストリン化合物及びブデソニド誘導体は、約０．１ｍｇ及び約２５ｍｇ／用量の名目投与量でそれぞれ投与される、請求項１５または１６に記載の処置の方法。
【0087】
（１８）肺炎症性疾患の治療を必要とする患者において、肺炎症性疾患を治療するための吸入システムであって、請求項１～１４に記載の薬学的組成物を含む、吸入システム。
【0088】
（１９）約２５０μｇ／ｍｌのブデソニド及び約２０ｍＭのＨＰ－β－ＣＤを含む、薬学的組成物。
【0089】
（２０）約１００μｇ／ｍｌのブデソニド及び約２０ｍＭのＨＰ－β－ＣＤを含む、薬学的組成物。
【0090】
（２１）約２５０μｇ／ｍｌのブデソニド及び約１０ｍＭのＨＰ－β－ＣＤを含む、薬学的組成物。
【0091】
（２２）約１００μｇ／ｍｌのブデソニド及び約１０ｍＭのＨＰ－β－ＣＤを含む、薬学的組成物。
【0092】
（２３）約１００μｇ／ｍｌのフルチカゾン及び約１０ｍＭのＨＰ－β－ＣＤを含む、薬学的組成物。
【0093】
（２４）約４０μｇ／ｍｌのフルチカゾン及び約１０ｍＭのＨＰ－β－ＣＤを含む、薬学的組成物。
【0094】
（２５）約４０μｇ／ｍｌのベクロメタゾン及び約１０ｍＭのＨＰ－β－ＣＤを含む、薬学的組成物。
【0095】
（２６）薬学的組成物は、溶液である、請求項１９～２５に記載の薬学的組成物。
【0096】
（２７）溶液は、約５～約８のｐＨを有する、請求項２６に記載の薬学的組成物。
【0097】
（２８）溶液は、約７～約７．５のｐＨを有する、請求項２６に記載の薬学的組成物。
【0098】
（２９）薬学的組成物は、溶液であり、溶液は、粉末を生成するために噴霧乾燥される、請求項２６に記載の薬学的組成物。
【0099】
（３０）粉末は、約３ミクロンの粒子を含む、請求項２９に記載の薬学的組成物。
【0100】
（３１）ブデソニド誘導体を約０．０５～約１０００ｍｃｇの範囲の分子用量で送達するようにブデソニド誘導体及びシクロデキストリンを含む、薬学的組成物。
【0101】
（３２）ブデソニド誘導体を約０．１～約５００ｍｃｇの範囲の分子用量で送達するようにブデソニド誘導体及びシクロデキストリンを含む、薬学的組成物。
【0102】
（３３）ブデソニド誘導体を１日当たり約５０～約２００ｍｃｇの範囲の分子用量で送達するようにブデソニド誘導体及びシクロデキストリンを含む、薬学的組成物。
【0103】
（３４）ブデノシド誘導体はブデノシドであり、シクロデキストリン化合物はＨＰ－β－ＣＤである、請求項３１～３３に記載の薬学的組成物。
【0104】
（３５）ブデノシド誘導体はベタメタゾンであり、シクロデキストリン化合物はＨＰ－β－ＣＤである、請求項３１～３３に記載の薬学的組成物。
【0105】
（３６）ブデノシド誘導体はフルチカゾンであり、シクロデキストリン化合物はＨＰ－β－ＣＤである、請求項３１～３３に記載の薬学的組成物。
【0106】
（３７）ブデノシド誘導体はベクロメタゾンであり、シクロデキストリン化合物はＨＰ－β－ＣＤである、請求項３１～３３に記載の薬学的組成物。
【0107】
（３８）約１：１～約２：１の化学量論比のブデソニド誘導体及びシクロデキストリン化合物の複合体を含む、薬学的組成物。
【0108】
（３９）約１：１の化学量論比のブデソニド誘導体及びシクロデキストリン化合物の複合体を含む、薬学的組成物。
【0109】
（４０）ブデノシド誘導体はブデノシドであり、シクロデキストリン化合物はＨＰ－β－ＣＤである、請求項３８～３９に記載の薬学的組成物。
【0110】
（４１）ブデノシド誘導体はフルチカゾンであり、シクロデキストリン化合物はＨＰ－β－ＣＤである、請求項３８～３９に記載の薬学的組成物。
【0111】
（４２）ブデノシド誘導体はベクロメタゾンであり、シクロデキストリン化合物はＨＰ－β－ＣＤである、請求項３８～３９に記載の薬学的組成物。
【0112】
（４３）肺炎症性疾患の治療を必要とする宿主哺乳動物において、肺炎症性疾患を治療する方法であって、
請求項１～１４、１９～４２、及び５８のいずれか一項に記載の薬学的組成物を宿主哺乳動物に投与することを含む、方法。
請求項１～１４、１９～４２、及び５８のいずれか一項に記載の薬学的組成物を宿主哺乳動物に投与することを含む、方法。
【0113】
（４４）肺組織中の炎症細胞を減少させる治療を必要とする宿主哺乳動物において、肺組織中の炎症細胞を減少させる方法であって、
請求項１～１４、１９～４２、及び５８のいずれか一項に記載の薬学的組成物を宿主哺乳動物に投与することを含む、方法。
請求項１～１４、１９～４２、及び５８のいずれか一項に記載の薬学的組成物を宿主哺乳動物に投与することを含む、方法。
【0114】
（４５）肺組織中のオゾン誘発性ＫＣ産生を低下させる治療を必要とする宿主哺乳動物において、肺組織中のオゾン誘発性ＫＣ産生を低下させる方法であって、
請求項１～１４、１９～４２、及び５８のいずれか一項に記載の薬学的組成物を宿主哺乳動物に投与することを含む、方法。
請求項１～１４、１９～４２、及び５８のいずれか一項に記載の薬学的組成物を宿主哺乳動物に投与することを含む、方法。
【0115】
（４６）アレルゲン曝露後に肺組織中のＩＬ１３を減少させる治療を必要とする宿主哺乳動物において、肺組織中のＩＬ１３を減少させる方法であって、
請求項１～１４、１９～４２、及び５８のいずれか一項に記載の薬学的組成物を宿主哺乳動物に投与することを含む、方法。
請求項１～１４、１９～４２、及び５８のいずれか一項に記載の薬学的組成物を宿主哺乳動物に投与することを含む、方法。
【0116】
（４７）気管支過敏症を軽減する治療を必要とする宿主哺乳動物において、気管支過敏症を軽減する方法であって、
請求項１～１４、１９～４２、及び５８のいずれか一項に記載の薬学的組成物を宿主哺乳動物に投与することを含む、方法。
請求項１～１４、１９～４２、及び５８のいずれか一項に記載の薬学的組成物を宿主哺乳動物に投与することを含む、方法。
【0117】
（４８）ＩＬ１７レベルを減少させる治療を必要とする宿主哺乳動物において、ＩＬ１７レベルを減少させる方法であって、
請求項１～１４、１９～４２、及び５８のいずれか一項に記載の薬学的組成物を宿主哺乳動物に投与することを含む、方法。
請求項１～１４、１９～４２、及び５８のいずれか一項に記載の薬学的組成物を宿主哺乳動物に投与することを含む、方法。
【0118】
（４９）ＣＸＣＬ－１レベルを減少させる治療を必要とする宿主哺乳動物において、ＣＸＣＬ－１レベルを減少させる方法であって、
請求項１～１４、１９～４２、及び５８のいずれか一項に記載の薬学的組成物を宿主哺乳動物に投与することを含む、方法。
請求項１～１４、１９～４２、及び５８のいずれか一項に記載の薬学的組成物を宿主哺乳動物に投与することを含む、方法。
【0119】
（５０）タバコ煙曝露後に肺組織中の好中球を減少させる治療を必要とする宿主哺乳動物において、肺組織中の好中球を減少させる方法であって、
請求項１～１４、１９～４２、及び５８のいずれか一項に記載の薬学的組成物を宿主哺乳動物に投与することを含む、方法。
請求項１～１４、１９～４２、及び５８のいずれか一項に記載の薬学的組成物を宿主哺乳動物に投与することを含む、方法。
【0120】
（５１）組成物に対していずれの分離または抽出ステップも用いずに、活性成分及びＨＰ－β－ＣＤを含有する組成物中のＨＰ－β－ＣＤを検出及び定量化するための方法であって、ＨＰ－β－ＣＤは、その上にヒドロキシプロピル基を含有し、方法は、
組成物中のＨＰ－β－ＣＤを検出及び定量化するために、ＨＰ－β－ＣＤに対してヒドロキシプロピル基の１Ｈ ＮＭＲ分析を使用することを含む、方法。
組成物中のＨＰ－β－ＣＤを検出及び定量化するために、ＨＰ－β－ＣＤに対してヒドロキシプロピル基の１Ｈ ＮＭＲ分析を使用することを含む、方法。
【0121】
（５２）組成物は、溶液である、請求項５１に記載の方法。
【0122】
（５３）活性成分は、ブデノシド誘導体である、請求項５１または５２に記載の方法。
【0123】
（５４）ブデノシド誘導体は、ブデソニドである、請求項５１または５２に記載の方法。
【0124】
（５５）ブデノシド誘導体は、フルチカゾンである、請求項５１または５２に記載の方法。
【0125】
（５６）ブデノシド誘導体は、ベクロメタゾンである、請求項５１または５２に記載の方法。
【0126】
（５７）ブデノシド誘導体は、ベタメタゾンである、請求項５１または５２に記載の方法。
【0127】
（５８）ブデノシド誘導体は、ベタメタゾンであり、シクロデキストリン化合物は、ＨＰ－β－ＣＤである、請求項３８～３９に記載の薬学的組成物。
【0128】
以下の実施例、参考文献、及び図は、本発明の理解を助けるために提供される。本発明から逸脱することなく、記載される手順に変更を加えることができることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【0129】
上記及び他の本発明の目的、利点、及び特徴、ならびにそれらが達成される様式は、下記の図及び例を考慮するとより容易に明らかになるであろう。
【0130】
【図1】漸増濃度のＨＰ－β－シクロデキストリン（ＨＰβＣＤ）を用いた、水溶液中のブデソニドの溶解度図に関する。
【図2】気道閉塞及び炎症のモデルに関する：組織診で測定された気管支周囲炎症スコア。
【図3】肺タンパク質抽出物中で測定されたＩＬ１３レベルに関する。
【図4】ＣＯＰＤモデルに関する：組織診で測定された気管支周囲炎症スコア。
【図5】気道反応性測定に関する：プラセボまたは治療を受けた後のマウスにおいてエンハンスドポーズ（Ｐｅｎｈ）を測定した。
【図6】オゾン曝露マウスの肺タンパク質抽出物におけるＩＬ１７のＥＬＩＳＡ測定に関する。
【図7】オゾン曝露マウスの肺タンパク質抽出物におけるＩＬ１３のＥＬＩＳＡ測定に関する。
【図8】オゾン曝露マウスの肺タンパク質抽出物におけるＫＣ（ＣＸＬ１）のＥＬＩＳＡ測定に関する。
【図9】ブデソニド－シクロデキストリンがＢＡＬＦ好中球の割合に与える影響に関する。
【図10】ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン単独の基準１Ｈ－ＲＭＮスペクトル（図１０ｂ）と比較した、ブデソニド－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン複合体の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルによるブデソニド誘導体及びシクロデキストリンを含む包接複合体の図である（図１０ａ）。
【図11】ブデソニド－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン複合体の１Ｄ－ＣＯＳＹ－ＮＭＲスペクトルによるブデソニド誘導体及びシクロデキストリンを含む包接複合体の図である。
【図12】ＨＰ－β－ＣＤの化学構造に関する。
【図13】水中のＨＰ－β－ＣＤ（δ０．６～１．５）の１Ｈ ＮＭＲスペクトルに関する。
【図14】重み付け（１／Ｘ）した二次回帰を考慮することによって得られた正確度プロファイルに関する。
【図15】プラセボ、ブデソニド懸濁液、及びヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン－ブデソニド複合体で処理したＬＰＳ曝露動物からのＢＡＬＦ中の好中球カウントの測定である。
【図16】ＬＰＳ曝露マウスにおける炎症スコアの測定である。
【図17】ＬＰＳ曝露マウスにおける炎症スコアの測定である。
【図18】プラセボ、Ｃｒｙｓｍｅｂ－ジプロピオン酸ベタメタゾン複合体、及びベタメタゾン１００μｇ／ｍｌ懸濁液で処理したＬＰＳ曝露動物からのＢＡＬＦ中の好中球カウント（％）の測定である。
【図19】プラセボ、Ｃｒｙｓｍｅｂ－ジプロピオン酸ベタメタゾン複合体、及びベタメタゾン懸濁液で処理したＬＰＳ曝露動物からのＢＡＬＦ中の好中球カウントの測定である。
【図20】プラセボ、ジプロピオン酸ベタメタゾン、または２つの濃度のジプロピオン酸ベタメタゾン－Ｃｒｙｓｍｅｂ複合体で処理したＬＰＳ曝露マウスにおける炎症スコアの測定である。
【図21】プラセボ、プロピオン酸フルチカゾン懸濁液、及びヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン－プロピオン酸フルチカゾン複合体で処理したＬＰＳ曝露動物からのＢＡＬＦ中の好中球カウントの測定である。
【0131】
本発明を例証するために本発明の種々の実施形態の例を次に提供するが、それは本発明を限定することを意図するものではない。別途指定のない限り、部及び割合は重量によるものとする。
【0132】
実施例１
溶液としてのＨＰβ－シクロデキストリンとブデソニドとの薬学的組成物
ブデソニドはＩｎｄｉｓ（Ｂｅｌｇｉｕｍ）から購入し、ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンはＲｏｑｕｅｔｔｅ（Ｆｒａｎｃｅ）から購入する。約２５０μｇ／ｍｌの市販のブデソニド懸濁液（Ｐｕｌｍｉｃｏｒｔ（登録商標））は、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ（Ｓｗｅｄｅｎ）から購入する。
溶液としてのＨＰβ－シクロデキストリンとブデソニドとの薬学的組成物
ブデソニドはＩｎｄｉｓ（Ｂｅｌｇｉｕｍ）から購入し、ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンはＲｏｑｕｅｔｔｅ（Ｆｒａｎｃｅ）から購入する。約２５０μｇ／ｍｌの市販のブデソニド懸濁液（Ｐｕｌｍｉｃｏｒｔ（登録商標））は、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ（Ｓｗｅｄｅｎ）から購入する。
【0133】
図１において、粉末形態の過剰なブデソニドを、水中で約５、約１０、約２５、約５０、及び約１００ｍＭの正確な濃度のシクロデキストリン溶液に加えることによって溶液としての薬学的組成物を調製する（カールフィッシャー滴定装置を使用してモル濃度を算出することにより、シクロデキストリンの計算量及び正確に計測した量を含水量に対して補正する）。混合プロセスは、約３５０ｒｐｍの連続撹拌下、室温で約２４時間かかる。得られた混合物を０．２２μｍフィルタユニットを用いて濾過することにより、過剰な量のブデソニドを除去する。溶液中のブデソニド濃度を有効なＨＰＬＣ法により確認し、次いで、インビボ試験に必要なブデソニド濃度に達するようにＰＢＳ－シクロデキストリン溶液（以前と同じ約５、約１０、約２５、約５０、及び約１００ｍＭの正確な濃度）で混合物を希釈する。
【0134】
そのような濃度、例えば、約１００μｇ／ｍｌまたは約２５０μｇ／ｍｌでは、ブデソニドは水／ＰＢＳ中で溶解するため、薬学的組成物は澄んだ透明な吸入液に見える。
【0135】
実施例１ａ：約１００μｇ／ｍｌのブデソニド及び約１０ｍＭのＨＰ－β－ＣＤ
吸入液のための好ましい薬学的製剤は、約１００μｇ／ｍｌのブデソニド及び約１０ｍＭのヒドロキシプロピルβシクロデキストリンを含む。約０．６９７９ｇのＨＰ－β－ＣＤ（５％水）（その含水量に対して補正した）を５０ｍｌの精製した発熱物質不含水（または滅菌ＰＢＳ）に溶解させ、過剰なブデソニドを加え、約３５０ｒｐｍで約２４時間室温で撹拌することによって溶液を調製する。０．２２μｍフィルタユニットを通した濾過によって過剰なブデソニドを除去し、得られた溶液を有効なＨＰＬＣ法により分注する。次いで、約１００μｇ／ｍｌのブデソニド濃度に達するように、得られた溶液を約１０ｍＭのＨＰ－β－ＣＤ溶液（ＰＢＳ中または水中）で希釈する。等張性は、ＮａＣｌを加えることによって達成される。好ましくは、最終溶液は、０．２２μｍポリプロピレン膜を通した濾過によって、または蒸気滅菌プロセスによって滅菌される。
吸入液のための好ましい薬学的製剤は、約１００μｇ／ｍｌのブデソニド及び約１０ｍＭのヒドロキシプロピルβシクロデキストリンを含む。約０．６９７９ｇのＨＰ－β－ＣＤ（５％水）（その含水量に対して補正した）を５０ｍｌの精製した発熱物質不含水（または滅菌ＰＢＳ）に溶解させ、過剰なブデソニドを加え、約３５０ｒｐｍで約２４時間室温で撹拌することによって溶液を調製する。０．２２μｍフィルタユニットを通した濾過によって過剰なブデソニドを除去し、得られた溶液を有効なＨＰＬＣ法により分注する。次いで、約１００μｇ／ｍｌのブデソニド濃度に達するように、得られた溶液を約１０ｍＭのＨＰ－β－ＣＤ溶液（ＰＢＳ中または水中）で希釈する。等張性は、ＮａＣｌを加えることによって達成される。好ましくは、最終溶液は、０．２２μｍポリプロピレン膜を通した濾過によって、または蒸気滅菌プロセスによって滅菌される。
【0136】
実施例１ｂ：約１００μｇ／ｍｌのブデソニド及び約２０ｍＭのＨＰ－β－ＣＤ
吸入液のための第２の好ましい薬学的製剤は、約１００μｇ／ｍｌのブデソニド及び約２０ｍＭのヒドロキシプロピルβシクロデキストリンを含む。約１．３９５８ｇのＨＰ－β－ＣＤ（約５％水）（その含水量に対して補正した）を約５０ｍｌの精製した発熱物質不含水（または滅菌ＰＢＳ）に溶解させ、過剰なブデソニドを加え、約３５０ｒｐｍで約２４時間撹拌することによって溶液を調製する。０．２２μｍフィルタユニットを通した濾過によって過剰なブデソニドを除去し、得られた溶液を有効なＨＰＬＣ法により分注する。次いで、約１００μｇ／ｍｌのブデソニド濃度に達するように、得られた溶液を約２０ｍＭのＨＰ－β－ＣＤ溶液（ＰＢＳ中または水中）で希釈する。等張性は、ＮａＣｌを加えることによって達成される。好ましくは、最終溶液は、０．２２μｍポリプロピレン膜を通した濾過によって、または蒸気滅菌プロセスによって滅菌される。
吸入液のための第２の好ましい薬学的製剤は、約１００μｇ／ｍｌのブデソニド及び約２０ｍＭのヒドロキシプロピルβシクロデキストリンを含む。約１．３９５８ｇのＨＰ－β－ＣＤ（約５％水）（その含水量に対して補正した）を約５０ｍｌの精製した発熱物質不含水（または滅菌ＰＢＳ）に溶解させ、過剰なブデソニドを加え、約３５０ｒｐｍで約２４時間撹拌することによって溶液を調製する。０．２２μｍフィルタユニットを通した濾過によって過剰なブデソニドを除去し、得られた溶液を有効なＨＰＬＣ法により分注する。次いで、約１００μｇ／ｍｌのブデソニド濃度に達するように、得られた溶液を約２０ｍＭのＨＰ－β－ＣＤ溶液（ＰＢＳ中または水中）で希釈する。等張性は、ＮａＣｌを加えることによって達成される。好ましくは、最終溶液は、０．２２μｍポリプロピレン膜を通した濾過によって、または蒸気滅菌プロセスによって滅菌される。
【0137】
実施例１ｃ：約２５０μｇ／ｍｌのブデソニド及び約２０ｍＭのＨＰ－β－ＣＤ
吸入液のための第３の好ましい薬学的製剤は、約２５０μｇ／ｍｌのブデソニド及び約２０ｍＭのヒドロキシプロピルβシクロデキストリンを含む。約１．３９５８ｇのＨＰ－β－ＣＤ（約５％水）（その含水量に対して補正した）を約５０ｍｌの精製した発熱物質不含水（または滅菌ＰＢＳ）に溶解させ、過剰なブデソニドを加え、約３５０ｒｐｍで約２４時間撹拌することによって溶液を調製する。０．２２μｍフィルタユニットを通した濾過によって過剰なブデソニドを除去し、得られた溶液を有効なＨＰＬＣ法により分注する。次いで、約２５０μｇ／ｍｌのブデソニド濃度に達するように、得られた溶液を約２０ｍＭのＨＰ－β－ＣＤ溶液（ＰＢＳ中または水中）で希釈する。等張性は、ＮａＣｌを加えることによって達成される。好ましくは、最終溶液は、０．２２μｍポリプロピレン膜を通した濾過によって、または蒸気滅菌プロセスによって滅菌される。
吸入液のための第３の好ましい薬学的製剤は、約２５０μｇ／ｍｌのブデソニド及び約２０ｍＭのヒドロキシプロピルβシクロデキストリンを含む。約１．３９５８ｇのＨＰ－β－ＣＤ（約５％水）（その含水量に対して補正した）を約５０ｍｌの精製した発熱物質不含水（または滅菌ＰＢＳ）に溶解させ、過剰なブデソニドを加え、約３５０ｒｐｍで約２４時間撹拌することによって溶液を調製する。０．２２μｍフィルタユニットを通した濾過によって過剰なブデソニドを除去し、得られた溶液を有効なＨＰＬＣ法により分注する。次いで、約２５０μｇ／ｍｌのブデソニド濃度に達するように、得られた溶液を約２０ｍＭのＨＰ－β－ＣＤ溶液（ＰＢＳ中または水中）で希釈する。等張性は、ＮａＣｌを加えることによって達成される。好ましくは、最終溶液は、０．２２μｍポリプロピレン膜を通した濾過によって、または蒸気滅菌プロセスによって滅菌される。
【0138】
実施例１ｄ：約１００μｇ／ｍｌのフルチカゾン及び約１０ｍＭのＨＰ－β－ＣＤ
吸入液のための第４の好ましい薬学的製剤は、約１００μｇ／ｍｌのフルチカゾン及び約１０ｍＭのヒドロキシプロピルβシクロデキストリンを含む。約０．６９７９ｇのＨＰ－β－ＣＤ（約５％水）（その含水量に対して補正した）を約５０ｍｌの精製した発熱物質不含水（または滅菌ＰＢＳ）に溶解させ、過剰なフルチカゾンを加え、約３５０ｒｐｍで約２４時間室温で撹拌することによって溶液を調製する。０．２２μｍフィルタユニットを通した濾過によって過剰なフルチカゾンを除去し、得られた溶液を有効なＨＰＬＣ法により分注する。次いで、約１００μｇ／ｍｌのフルチカゾン濃度に達するように、得られた溶液を約１０ｍＭのＨＰ－β－ＣＤ溶液（ＰＢＳ中または水中）で希釈する。等張性は、ＮａＣｌを加えることによって達成される。好ましくは、最終溶液は、０．２２μｍポリプロピレン膜を通した濾過によって、または蒸気滅菌プロセスによって滅菌される。
吸入液のための第４の好ましい薬学的製剤は、約１００μｇ／ｍｌのフルチカゾン及び約１０ｍＭのヒドロキシプロピルβシクロデキストリンを含む。約０．６９７９ｇのＨＰ－β－ＣＤ（約５％水）（その含水量に対して補正した）を約５０ｍｌの精製した発熱物質不含水（または滅菌ＰＢＳ）に溶解させ、過剰なフルチカゾンを加え、約３５０ｒｐｍで約２４時間室温で撹拌することによって溶液を調製する。０．２２μｍフィルタユニットを通した濾過によって過剰なフルチカゾンを除去し、得られた溶液を有効なＨＰＬＣ法により分注する。次いで、約１００μｇ／ｍｌのフルチカゾン濃度に達するように、得られた溶液を約１０ｍＭのＨＰ－β－ＣＤ溶液（ＰＢＳ中または水中）で希釈する。等張性は、ＮａＣｌを加えることによって達成される。好ましくは、最終溶液は、０．２２μｍポリプロピレン膜を通した濾過によって、または蒸気滅菌プロセスによって滅菌される。
【0139】
実施例１ｅ：約４０μｇ／ｍｌのフルチカゾン及び約１０ｍＭのＨＰ－β－ＣＤ
吸入液のための第５の好ましい薬学的製剤は、約４０μｇ／ｍｌのフルチカゾン及び約１０ｍＭのヒドロキシプロピルβシクロデキストリンを含む。約０．６９７９ｇのＨＰ－β－ＣＤ（約５％水）（その含水量に対して補正した）を約５０ｍｌの精製した発熱物質不含水（または滅菌ＰＢＳ）に溶解させ、過剰なフルチカゾンを加え、約３５０ｒｐｍで約２４時間室温で撹拌することによって溶液を調製する。０．２２μｍフィルタユニットを通した濾過によって過剰なフルチカゾンを除去し、得られた溶液を有効なＨＰＬＣ法により分注する。次いで、約４０μｇ／ｍｌのフルチカゾン濃度に達するように、得られた溶液を約１０ｍＭのＨＰ－β－ＣＤ溶液（ＰＢＳ中または水中）で希釈する。等張性は、ＮａＣｌを加えることによって達成される。好ましくは、最終溶液は、０．２２μｍポリプロピレン膜を通した濾過によって、または蒸気滅菌プロセスによって滅菌される。
吸入液のための第５の好ましい薬学的製剤は、約４０μｇ／ｍｌのフルチカゾン及び約１０ｍＭのヒドロキシプロピルβシクロデキストリンを含む。約０．６９７９ｇのＨＰ－β－ＣＤ（約５％水）（その含水量に対して補正した）を約５０ｍｌの精製した発熱物質不含水（または滅菌ＰＢＳ）に溶解させ、過剰なフルチカゾンを加え、約３５０ｒｐｍで約２４時間室温で撹拌することによって溶液を調製する。０．２２μｍフィルタユニットを通した濾過によって過剰なフルチカゾンを除去し、得られた溶液を有効なＨＰＬＣ法により分注する。次いで、約４０μｇ／ｍｌのフルチカゾン濃度に達するように、得られた溶液を約１０ｍＭのＨＰ－β－ＣＤ溶液（ＰＢＳ中または水中）で希釈する。等張性は、ＮａＣｌを加えることによって達成される。好ましくは、最終溶液は、０．２２μｍポリプロピレン膜を通した濾過によって、または蒸気滅菌プロセスによって滅菌される。
【0140】
実施例１ｆ：４０μｇ／ｍｌのベルコメタゾン及び約１０ｍＭのＨＰ－β－ＣＤ
吸入液のための第７の好ましい薬学的製剤は、約４０μｇ／ｍｌのベクロメタゾン及び約１０ｍＭのヒドロキシプロピルβシクロデキストリンを含む。約０．６９７９ｇのＨＰ－β－ＣＤ（約５％）（その含水量に対して補正した）を約５０ｍｌの精製した発熱物質不含水（または滅菌ＰＢＳ）に溶解させ、過剰なベクロメタゾンを加え、約３５０ｒｐｍで約２４時間室温で撹拌することによって溶液を調製する。０．２２μｍフィルタユニットを通した濾過によって過剰なベクロメタゾンを除去し、得られた溶液を有効なＨＰＬＣ法により分注する。次いで、約４０μｇ／ｍｌのベクロメタゾン濃度に達するように、得られた溶液を約１０ｍＭのＨＰ－β－ＣＤ溶液（ＰＢＳ中または水中）で希釈する。等張性は、ＮａＣｌを加えることによって達成される。好ましくは、最終溶液は、０．２２μｍポリプロピレン膜を通した濾過によって、または蒸気滅菌プロセスによって滅菌される。
吸入液のための第７の好ましい薬学的製剤は、約４０μｇ／ｍｌのベクロメタゾン及び約１０ｍＭのヒドロキシプロピルβシクロデキストリンを含む。約０．６９７９ｇのＨＰ－β－ＣＤ（約５％）（その含水量に対して補正した）を約５０ｍｌの精製した発熱物質不含水（または滅菌ＰＢＳ）に溶解させ、過剰なベクロメタゾンを加え、約３５０ｒｐｍで約２４時間室温で撹拌することによって溶液を調製する。０．２２μｍフィルタユニットを通した濾過によって過剰なベクロメタゾンを除去し、得られた溶液を有効なＨＰＬＣ法により分注する。次いで、約４０μｇ／ｍｌのベクロメタゾン濃度に達するように、得られた溶液を約１０ｍＭのＨＰ－β－ＣＤ溶液（ＰＢＳ中または水中）で希釈する。等張性は、ＮａＣｌを加えることによって達成される。好ましくは、最終溶液は、０．２２μｍポリプロピレン膜を通した濾過によって、または蒸気滅菌プロセスによって滅菌される。
【0141】
実施例２
粉末形態のフルチカゾンとＨＰ－β－シクロデキストリンとの薬学的組成物
吸入液のための好ましい薬学的製剤は、ＥＣＩＣからの約４０μｇ／ｍｌのフルチカゾン及び約１０ｍＭのヒドロキシプロピルβシクロデキストリンを含む。約０．６９７９ｇのＨＰ－β－ＣＤ（約５％水）（その含水量に対して補正した）を約５０ｍｌの精製した発熱物質不含水に溶解させ、過剰なフルチカゾンを加え、約３５０ｒｐｍで約２４時間撹拌することによって溶液を調製する。０．２２μｍフィルタユニットを通した濾過によって過剰なフルチカゾンを除去し、得られた溶液を有効なＨＰＬＣ法により分注する。次いで、約４０μｇ／ｍｌのフルチカゾン濃度に達するように、得られた溶液を約１０ｍＭのＨＰ－β－ＣＤ溶液で希釈する。最適化条件において、ＰｒｏＣｅｐｔ噴霧乾燥器－冷却器を用いて最終溶液を噴霧乾燥し、約３ミクロンの粒子を有する妥当な粉末収率（約＞９０％）を得る。噴霧乾燥の技術は、当業者に周知である。噴霧乾燥器－冷却器及びその乾燥プロセスは、Ｐｒｏｃｅｐｔデータシートまたは（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｃｅｐｔ．ｂｅ／ｓｐｒａｙ－ｄｒｙｅｒ－ｃｈｉｌｌｅｒ）（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に報告されている。
粉末形態のフルチカゾンとＨＰ－β－シクロデキストリンとの薬学的組成物
吸入液のための好ましい薬学的製剤は、ＥＣＩＣからの約４０μｇ／ｍｌのフルチカゾン及び約１０ｍＭのヒドロキシプロピルβシクロデキストリンを含む。約０．６９７９ｇのＨＰ－β－ＣＤ（約５％水）（その含水量に対して補正した）を約５０ｍｌの精製した発熱物質不含水に溶解させ、過剰なフルチカゾンを加え、約３５０ｒｐｍで約２４時間撹拌することによって溶液を調製する。０．２２μｍフィルタユニットを通した濾過によって過剰なフルチカゾンを除去し、得られた溶液を有効なＨＰＬＣ法により分注する。次いで、約４０μｇ／ｍｌのフルチカゾン濃度に達するように、得られた溶液を約１０ｍＭのＨＰ－β－ＣＤ溶液で希釈する。最適化条件において、ＰｒｏＣｅｐｔ噴霧乾燥器－冷却器を用いて最終溶液を噴霧乾燥し、約３ミクロンの粒子を有する妥当な粉末収率（約＞９０％）を得る。噴霧乾燥の技術は、当業者に周知である。噴霧乾燥器－冷却器及びその乾燥プロセスは、Ｐｒｏｃｅｐｔデータシートまたは（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｃｅｐｔ．ｂｅ／ｓｐｒａｙ－ｄｒｙｅｒ－ｃｈｉｌｌｅｒ）（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に報告されている。
【0142】
実施例３
気道閉塞及び炎症のモデルにおける実施例１の薬学的組成物の評価
３ａ：感作、アレルゲン曝露、及び処理プロトコル
気道閉塞及び炎症のモデルにおける実施例１の薬学的組成物の評価
３ａ：感作、アレルゲン曝露、及び処理プロトコル
【0143】
【化14】
【0144】
気道炎症の調節を調査するために、０日目（Ｄ０）及び７日目（Ｄ７）に、水酸化アルミニウム（ＡｌｕｍＩｎｊｅｃｔ；Ｐｅｒｂｉｏ，Ｅｒｅｍｂｏｄｅｇｅｍ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）中に乳化した約１０μｇの卵白アルブミン（ＯＶＡ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｃｈｎｅｌｌｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の腹腔内注射により約６～約８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを感作する。その後、２１日目～２５日目に、超音波ネブライザー（Ｄｅｖｉｌｂｉｓｓ ２０００）によって発生させた約１％ＯＶＡのエアロゾルを毎日約３０分間吸入することによってマウスをアレルゲンに曝露する。１８日目～２４日目に、マウスを約５０μｌの鼻腔内滴下注入に供し、Ｃａｔａｌｄｏ ｅｔ ａｌ．：Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６１（２）：４９１－４９８（２００２）（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）によって以前に報告されたように、２６日目に屠殺する。プラセボマウスにはＰＢＳを鼻腔内注入する。
【0145】
材料及び方法
６～８週齢の雄マウスＣ５７Ｂ１／６をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｋｏｌｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入し、我々の施設で飼育する。全ての動物実験手順は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｅｇｅの倫理委員会によって承認されている。飼料及び水は自由に摂取させる。
６～８週齢の雄マウスＣ５７Ｂ１／６をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｋｏｌｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入し、我々の施設で飼育する。全ての動物実験手順は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｅｇｅの倫理委員会によって承認されている。飼料及び水は自由に摂取させる。
【0146】
材料
リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）はＬｏｎｚａ（Ｖｅｒｖｉｅｒｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）から購入し、ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（ヒドロキシプロピル基による置換度：０．６２）はＲｏｑｕｅｔｔｅ（Ｆｒａｎｃｅ）から購入し、ブデソニドはＩｎｄｉｓ（Ｂｅｌｇｉｕｍ）から購入し、２５０μｇ／ｍｌの市販のブデソニド懸濁液（Ｐｕｌｍｉｃｏｒｔ（登録商標））はＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ（Ｓｗｅｄｅｎ）から購入する。メタコリンはＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｇｅｒｍａｎｙ）からである。マウスへの投与のために、上記実施例１ａに従ってヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（約２０ｍＭ）をブデソニド（約２５０μｇ／ｍｌ）及びブデソニド懸濁液（約２５０μｇ／ｍｌ）と混合する。全ての他の材料は分析グレードである。滅菌した非発熱性及び等張性のシクロデキストリン誘導体－副腎皮質ステロイド溶液を種々の濃度で調製する。吸入用の滅菌水（＜約０．５ＵＳＰ単位のエンドトキシン／ｍｌ）のためのＬｉｍｕｌｕｓ Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ（ＬＡＬ）を使用して、ＦＤＡのエンドトキシン試験法のガイドライン３５ ２０１２に従って溶液を試験する。
リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）はＬｏｎｚａ（Ｖｅｒｖｉｅｒｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）から購入し、ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（ヒドロキシプロピル基による置換度：０．６２）はＲｏｑｕｅｔｔｅ（Ｆｒａｎｃｅ）から購入し、ブデソニドはＩｎｄｉｓ（Ｂｅｌｇｉｕｍ）から購入し、２５０μｇ／ｍｌの市販のブデソニド懸濁液（Ｐｕｌｍｉｃｏｒｔ（登録商標））はＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ（Ｓｗｅｄｅｎ）から購入する。メタコリンはＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｇｅｒｍａｎｙ）からである。マウスへの投与のために、上記実施例１ａに従ってヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（約２０ｍＭ）をブデソニド（約２５０μｇ／ｍｌ）及びブデソニド懸濁液（約２５０μｇ／ｍｌ）と混合する。全ての他の材料は分析グレードである。滅菌した非発熱性及び等張性のシクロデキストリン誘導体－副腎皮質ステロイド溶液を種々の濃度で調製する。吸入用の滅菌水（＜約０．５ＵＳＰ単位のエンドトキシン／ｍｌ）のためのＬｉｍｕｌｕｓ Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ（ＬＡＬ）を使用して、ＦＤＡのエンドトキシン試験法のガイドライン３５ ２０１２に従って溶液を試験する。
【0147】
気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）
気道反応性評価の直後及び最後のアレルゲン曝露の約２４時間後にマウスを屠殺し、Ｃａｔａｌｄｏ ＤＤ，Ｔｏｕｒｎｏｙ ＫＧ，Ｖｅｒｍａｅｌｅｎ Ｋ ｅｔ ａｌ．：Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１６１（２）：４９１－４９８（２００２）（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）によって以前に記載されたように、４×約１ｍｌのＰＢＳ－ＥＤＴＡ（約０．０５ｍＭ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して気管支肺胞洗浄を行う。
気道反応性評価の直後及び最後のアレルゲン曝露の約２４時間後にマウスを屠殺し、Ｃａｔａｌｄｏ ＤＤ，Ｔｏｕｒｎｏｙ ＫＧ，Ｖｅｒｍａｅｌｅｎ Ｋ ｅｔ ａｌ．：Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１６１（２）：４９１－４９８（２００２）（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）によって以前に記載されたように、４×約１ｍｌのＰＢＳ－ＥＤＴＡ（約０．０５ｍＭ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して気管支肺胞洗浄を行う。
【0148】
タンパク質評価のためにＢＡＬＦ上清が収集され、細胞分画算定のために細胞が用いられる。ヘマトキシリン－エオジン（Ｄｉｆｆ－Ｑｕｉｃｋ、Ｄａｄｅ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）で染色した後、細胞遠心分離調製物に対して形態学的基準に基づく細胞分画算定を行う。細胞は、穏やかに手で吸引することにより回収する。気管支肺胞液（ＢＡＬＦ）の遠心分離（約４℃で、約１２００ｒｐｍで約１０分間）後、タンパク質評価のために上清を約－８０℃で凍結し、細胞ペレットを約１ｍｌのＰＢＳ－ＥＤＴＡ（約０．０５ｍＭ）中に再懸濁した。Ｄｉｆｆ－Ｑｕｉｃｋ（Ｄａｄｅ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）で染色した後、細胞遠心分離調製物（Ｃｙｔｏｓｐｉｎ）に対して細胞分画算定を行う。
【0149】
肺組織診及び組織プロセシング
ＢＡＬ後、胸郭を開いて、左主気管支をクランプする。左肺を切除し、タンパク質抽出のために－８０℃で直ちに凍結する。右肺に約４％のパラホルムアルデヒド４ｍｌを注入し、パラフィンに包埋し、組織診に用いる。厚さ約５μｍの切片をパラフィンから切断し、ヘマトキシリン－エオジンで染色する。Ｃａｔａｌｄｏ ＤＤ，Ｔｏｕｒｎｏｙ ＫＧ，Ｖｅｒｍａｅｌｅｎ Ｋ ｅｔ ａｌ．：Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１６１（２）：４９１－４９８（２００２）によって以前に記載されたように、気管支周囲の炎症細胞の定量化によって算出されるスコアにより気管支周囲の炎症の程度を推定する。炎症が検出不能な場合は値を０と見なし、時々炎症細胞が存在する場合は値を１、ほとんどの気管支が炎症細胞の薄い層（約１～約５個の細胞）によって取り囲まれている場合は値を２、またほとんどの気管支が炎症細胞の厚い層（＞約５個の細胞）によって取り囲まれている場合は値を３と見なす。マウス１匹当たり６～８個の無作為に選択された組織切片がスコア化されるため、炎症スコアは平均値として表され、群間で比較され得る。
ＢＡＬ後、胸郭を開いて、左主気管支をクランプする。左肺を切除し、タンパク質抽出のために－８０℃で直ちに凍結する。右肺に約４％のパラホルムアルデヒド４ｍｌを注入し、パラフィンに包埋し、組織診に用いる。厚さ約５μｍの切片をパラフィンから切断し、ヘマトキシリン－エオジンで染色する。Ｃａｔａｌｄｏ ＤＤ，Ｔｏｕｒｎｏｙ ＫＧ，Ｖｅｒｍａｅｌｅｎ Ｋ ｅｔ ａｌ．：Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１６１（２）：４９１－４９８（２００２）によって以前に記載されたように、気管支周囲の炎症細胞の定量化によって算出されるスコアにより気管支周囲の炎症の程度を推定する。炎症が検出不能な場合は値を０と見なし、時々炎症細胞が存在する場合は値を１、ほとんどの気管支が炎症細胞の薄い層（約１～約５個の細胞）によって取り囲まれている場合は値を２、またほとんどの気管支が炎症細胞の厚い層（＞約５個の細胞）によって取り囲まれている場合は値を３と見なす。マウス１匹当たり６～８個の無作為に選択された組織切片がスコア化されるため、炎症スコアは平均値として表され、群間で比較され得る。
【0150】
前述のように、左肺を切除して約－８０℃で直ちに凍結し、次いで、Ｍｉｋｒｏ－Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ（Ｂｒａｕｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｇｍｂｈ Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して液体Ｎ２中で破砕し、均質な粉末を形成する。この破砕した肺組織を、タンパク質抽出のために、約２Ｍの尿素、約１ＭのＮａＣｌ、及び約５０ｍＭのトリス（約ｐＨ７．５）を含有する溶液中で約４℃で一晩インキュベートし、その後、約１６ ０００×ｇで約１５分間遠心分離する。
【0151】
製造者の指示に従って、ＥＬＩＳＡ（ｄｕｏｓｅｔ ｋｉｔ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｂｉｎｇｄｏｎ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）により非プール肺タンパク質試料中のＩＬ１３レベルを測定する。
【0152】
気管性反応性測定
ケタミン（約１０ｍｇ／ｍｌ、Ｍｅｒｉａｌ、Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）とキシラジン（約１ｍｇ／ｍｌ、ＶＭＤ、Ａｒｅｎｄｏｎｋ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）の混合物の腹腔内注射（約２００μｌ）によってマウスを麻酔する。２０ゲージのポリエチレンカテーテルを気管に挿入し、漏出及び脱落を避けるためにカテーテルの周りに連結することによって気管切開術を行う。１分当たり約２５０呼吸及び約１０ｍｌ／ｋｇの１回換気量でｆｌｅｘｉＶｅｎｔ（登録商標）小動物用人工呼吸器（ＳＣＩＲＥＱ、Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｃａｎａｄａ）を用いてマウスの換気を行う。呼気終末陽圧換気は約２ｈＰａに設定する。機械的換気の約２分後に測定を開始する。次いで、気管チューブに約１Ｈｚの正弦波振動を加え、多重線形回帰により気道の動的抵抗、弾性、及びコンプライアンスの算出が可能となる。約０．５～約１９．６Ｈｚに及ぶ周波数の約８秒の強制振動信号からなる第２の操作は、組織減衰、組織弾性、及び組織ヒステリシス性を評価するためにインピーダンスの測定を可能にする。ベースライン肺機能の測定後、生理食塩水エアロゾル（ＰＢＳ）、続いて漸増用量（約３、約６、約９、約１２ｇ／ｌ）のメタコリン（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ａｓｓｅ Ｒｅｌｅｇｅｍ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を含有するエアロゾルにマウスを曝露する。エアロゾルは、超音波ネブライザー（ＳＹＳＴ’ＡＭ，ＬＳ ２０００、Ｄｕｐｏｎｔ Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｒｈｏｄｅ－Ｓａｉｎｔ－Ｇｅｎｅｓｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）によって発生させ、製造者の指示に従って、医療用空気のバイアス流を用いてｆｌｅｘｉＶｅｎｔ（登録商標）の吸気ラインに送達させる。各エアロゾルは、約２分間で送達され、前述の測定期間は各エアロゾルの後に１分間隔で行われる。メタコリン負荷後の平均気道抵抗は、曝露中に測定される主なパラメータである。
ケタミン（約１０ｍｇ／ｍｌ、Ｍｅｒｉａｌ、Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）とキシラジン（約１ｍｇ／ｍｌ、ＶＭＤ、Ａｒｅｎｄｏｎｋ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）の混合物の腹腔内注射（約２００μｌ）によってマウスを麻酔する。２０ゲージのポリエチレンカテーテルを気管に挿入し、漏出及び脱落を避けるためにカテーテルの周りに連結することによって気管切開術を行う。１分当たり約２５０呼吸及び約１０ｍｌ／ｋｇの１回換気量でｆｌｅｘｉＶｅｎｔ（登録商標）小動物用人工呼吸器（ＳＣＩＲＥＱ、Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｃａｎａｄａ）を用いてマウスの換気を行う。呼気終末陽圧換気は約２ｈＰａに設定する。機械的換気の約２分後に測定を開始する。次いで、気管チューブに約１Ｈｚの正弦波振動を加え、多重線形回帰により気道の動的抵抗、弾性、及びコンプライアンスの算出が可能となる。約０．５～約１９．６Ｈｚに及ぶ周波数の約８秒の強制振動信号からなる第２の操作は、組織減衰、組織弾性、及び組織ヒステリシス性を評価するためにインピーダンスの測定を可能にする。ベースライン肺機能の測定後、生理食塩水エアロゾル（ＰＢＳ）、続いて漸増用量（約３、約６、約９、約１２ｇ／ｌ）のメタコリン（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ａｓｓｅ Ｒｅｌｅｇｅｍ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を含有するエアロゾルにマウスを曝露する。エアロゾルは、超音波ネブライザー（ＳＹＳＴ’ＡＭ，ＬＳ ２０００、Ｄｕｐｏｎｔ Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｒｈｏｄｅ－Ｓａｉｎｔ－Ｇｅｎｅｓｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）によって発生させ、製造者の指示に従って、医療用空気のバイアス流を用いてｆｌｅｘｉＶｅｎｔ（登録商標）の吸気ラインに送達させる。各エアロゾルは、約２分間で送達され、前述の測定期間は各エアロゾルの後に１分間隔で行われる。メタコリン負荷後の平均気道抵抗は、曝露中に測定される主なパラメータである。
【0153】
統計学的分析
肺組織診レベルの結果を平均＋／－ＳＥＭとして表し、一元配置分散分析、続いてチューキー試験後解析を用いて群間の比較を行う。試験は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５を使用して行われる。有意水準：α＝約０．０５（９５％信頼性区間）。
肺組織診レベルの結果を平均＋／－ＳＥＭとして表し、一元配置分散分析、続いてチューキー試験後解析を用いて群間の比較を行う。試験は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５を使用して行われる。有意水準：α＝約０．０５（９５％信頼性区間）。
【0154】
薬理学的結果
図２は、プラセボ、約１００μｇ／ｍｌのブデソニド、実施例１ａによる薬学的組成物、及び約２５０μｇ／ｍｌのブデソニドを用いた組織診で測定された気管支周囲炎症スコアを示す。
図２は、プラセボ、約１００μｇ／ｍｌのブデソニド、実施例１ａによる薬学的組成物、及び約２５０μｇ／ｍｌのブデソニドを用いた組織診で測定された気管支周囲炎症スコアを示す。
【0155】
卵白アルブミン曝露マウス（プラセボ）は、肺組織中の炎症細胞数の有意な増加を示す。約１００μｇ／ｍｌのブデソニド及び約１０ｍＭのＨＰ－β－ＣＤの複合体への曝露は、プラセボと比較して炎症細胞数の有意な減少を引き起こし、示す。ブデソニド（約１００μｇ／ｍｌ）－ＨＰ－β－ＣＤ（約１０ｍＭ）複合体は、より高い濃度（約２５０μｇ／ｍｌ）のブデソニド単独の場合と同じ炎症の減少を引き起こし、同じ濃度（約１００μｇ／ｍｌ）のブデソニド単独の場合よりも有意に有効である。
【0156】
図３は、肺タンパク質抽出物中で測定されたＩＬ１３レベルを示す。
【0157】
Ｍｉｋｒｏ－Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ（Ｂｒａｕｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｇｍｂｈ Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して肺を破砕する。破砕した肺組織を、タンパク質抽出のために、約１Ｍの尿素を含有する溶液中で約４℃で一晩インキュベートする。ＥＬＩＳＡ試験のために上清を約－８０℃で保存する。
【0158】
マウスは、約２５０μｇ／ｍｌのブデソニドで処理された場合、約２５０μｇ／ｍｌのブデソニド－約１０ｍＭのシクロデキストリンの複合体で処理したマウスと比較して、アレルゲン曝露後にそれらの肺組織中により高いレベルのＩＬ１３を示す。約１００μｇ／ｍｌのブデソニドで処理したマウスは、同様に、約１００μｇ／ｍｌのブデソニド－約１０ｍＭのシクロデキストリンで処理したマウスよりも高いＩＬ１３レベルを示す。
【0159】
実施例４
ＣＯＰＤモデルにおける実施例１ａ、実施例１ｂ、及び実施例１ｃの薬学的組成物の評価
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を模倣するために２つの異なるマウスモデルを用いる。第１のモデルにおいて、高反応性の酸化体大気汚染物質である高濃度のオゾン（Ｏ３）にＣ５７ＢＬ／６マウスを曝露する。動物モデルにおいて吸入されたＯ３は、気道炎症（好中球細胞による）及び反応性亢進の原因となる。タバコがＣＯＰＤの主な推進要因であることが知られているため、第２のモデルは、タバコ煙を使用している。またタバコ煙曝露は、好中球細胞によって媒介される気道炎症も引き起こす。）オゾン及びタバコは、酸化ストレスの強力な誘導因子であり、このストレスが長期試験において観察されるような慢性炎症を引き起こし得る。
ＣＯＰＤモデルにおける実施例１ａ、実施例１ｂ、及び実施例１ｃの薬学的組成物の評価
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を模倣するために２つの異なるマウスモデルを用いる。第１のモデルにおいて、高反応性の酸化体大気汚染物質である高濃度のオゾン（Ｏ３）にＣ５７ＢＬ／６マウスを曝露する。動物モデルにおいて吸入されたＯ３は、気道炎症（好中球細胞による）及び反応性亢進の原因となる。タバコがＣＯＰＤの主な推進要因であることが知られているため、第２のモデルは、タバコ煙を使用している。またタバコ煙曝露は、好中球細胞によって媒介される気道炎症も引き起こす。）オゾン及びタバコは、酸化ストレスの強力な誘導因子であり、このストレスが長期試験において観察されるような慢性炎症を引き起こし得る。
【0160】
４．Ａ オゾンモデル
オゾン曝露及び処理プロトコル
これ以降、オゾン曝露下の実験の模式図を報告する。
オゾン曝露及び処理プロトコル
これ以降、オゾン曝露下の実験の模式図を報告する。
【0161】
【化15】
【0162】
この模式図では、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、高濃度のオゾン（約２ｐｐｍ）に約３時間の間曝露する前に、最初に前処理として約５０１μｌの鼻腔内注入によって処理し（０日目～１日目）、その後、約３時間前に約５０１μｌの治療薬を鼻腔内注入する（２日目～４日目）。５日目にマウスを屠殺する。プラセボマウスにはＰＢＳを注入する。
【0163】
気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）分析、肺組織診、気管支反応性測定、及び統計学的分析は、実施例１に以前に記載したものと同じである（気道炎症及び反応性亢進）。製造者の指示に従って、ＥＬＩＳＡ（ｄｕｏｓｅｔ ｋｉｔ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｂｉｎｇｄｏｎ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）により非プール肺タンパク質試料中のＩＬ１７及びＫＣ（ＣＸＣＬ１）レベルを測定する。
【0164】
薬理学的結果
図４は、プラセボ、実施例１ａによる組成物、及び約２５０μｇ／ｍｌのブデソニドについて組織診で測定された気管支周囲炎症スコアを示す。
図４は、プラセボ、実施例１ａによる組成物、及び約２５０μｇ／ｍｌのブデソニドについて組織診で測定された気管支周囲炎症スコアを示す。
【0165】
オゾン曝露マウス（プラセボ）は、他の群と比較して、肺組織中の炎症細胞数の有意な増加を示す。約１００μｇ／ｍｌのブデソニド及び１０ｍＭのＨＰ－β－ＣＤを含む複合体への曝露は、プラセボと比較した場合に、炎症細胞数の有意な減少を引き起こす。ブデソニド（約１００μｇ／ｍｌ）－ＨＰ－β－ＣＤ（約１０ｍＭ）の複合体は、より高い濃度（約２５０μｇ／ｍｌ）のブデソニド単独の場合と同じ炎症の減少を引き起こす。
【0166】
図５は、気道反応性測定を示す：プラセボまたは実施例１ａに従って調製した薬学的組成物を用いた処理を受けた後のマウスにおいてエンハンスドポーズ（Ｐｅｎｈ）を測定する。
【0167】
他の群と比較した場合、オゾン曝露は、メタコリン負荷を受けたマウスにおいて、予想された気管支過敏症の有意な増悪を誘導する。プラセボ群と比較した場合、約１００μｇ／ｍｌのブデソニド及び１０ｍＭのＨＰ－β－ＣＤを含む複合体は、約４８ｇ／Ｌのメタコリンで気管支過敏症の有意な軽減を引き起こす。ブデソニド（約１００μｇ／ｍｌ）－ＨＰ－β－ＣＤ（１０ｍＭ）複合体は、より高い濃度（約２５０μｇ／ｍｌ）のブデソニド単独の場合と同じ気管支過敏症の軽減を引き起こす。
【0168】
図６は、オゾン曝露マウスの肺タンパク質抽出物におけるＩＬ１７のＥＬＩＳＡ測定である。
【0169】
ＨＰＢＣＤ及びブデソニドを単独でまたは組み合わせて用いた異なる処理を比較する。薬学的組成物は、同じＰＢＳ緩衝液中に、組み合わせ混合物（ブデソニド－ＨＰＢＣＤ）として、または各活性化合物を単独で用いて（約２５０μｇ／ｍｌのブデソニドまたは約１０ｍＭのＨＰＢＣＤ）、実施例１ａに従って調製する。
【0170】
ブデソニド処理群（約２５０μｇ／ｍｌ）と比較した場合、約２５０μｇ／ｍｌまたは約１００μｇ／ｍｌまたは約１０μｇ／ｍｌのブデソニド及び１０ｍＭのＨＰ－β－ＣＤを含む複合体は、ＩＬ１７レベルの有意な減少を引き起こす。
【0171】
ＩＬ１７レベルは、オゾン曝露後に増加したことから、オゾン誘発性の好中球炎症の病態形成に関与する可能性がある。これは、吸入によって与えられたブデソニド－シクロデキストリン複合体がオゾン誘発性のＩＬ１７レベルを減少させることができるという最初の証拠である。
【0172】
図７は、オゾン曝露マウスの肺タンパク質抽出物におけるＩＬ１３のＥＬＩＳＡ測定を示す。
【0173】
ＨＰＢＣＤ及びブデソニドを単独でまたは組み合わせて用いた異なる処理を比較する。薬学的組成物は、同じＰＢＳ緩衝液中に、組み合わせ混合物（ブデソニド－ＨＰＢＣＤ）として、または各活性化合物を単独で用いて（約２５０μｇ／ｍｌのブデソニドまたは約１０ｍＭのＨＰＢＣＤ）、実施例１ａに従って調製する。
【0174】
ブデソニド処理群（約２５０μｇ／ｍｌ）と比較した場合、約２５０μｇ／ｍｌまたは約１００μｇ／ｍｌまたは約１０μｇ／ｍｌのブデソニド及び約１０ｍＭのＨＰ－β－ＣＤを含む複合体は、ＩＬ１７レベルの減少を引き起こす。
【0175】
ＩＬ１３は、オゾン曝露後に調節されること、及びオゾン曝露に続く気道機能不全に関与すること以前に示されている。例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｓ．，Ｎａｔｈ Ｐ，Ｌｅｕｎｇ Ｓ，ｅｔ ａｌ．：Ｅｕｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｊ．３２（３）：５７１－８（Ｓｅｐ．２００８）（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。ブデソニドを含む化合物の吸入によってオゾン誘発性ＩＬ１３レベルが有意に減少されることが示されたのは、これが初めてである。ブデソニド処理群（約２５０μｇ／ｍｌ）と比較した場合、約２５０μｇ／ｍｌまたは約１００μｇ／ｍｌまたは約１０μｇ／ｍｌのブデソニド及び約１０ｍＭのＨＰ－β－ＣＤを含む複合体は、ＩＬ１３レベルの減少を引き起こす。このように、ブデソニド－シクロデキストリン複合体の吸入は、吸入された約２５０μｇ／ｍｌのブデソニドと比較してＩＬ１３レベルを減少させる。
【0176】
図８は、オゾン曝露マウスの肺タンパク質抽出物におけるＫＣ（ＣＸＣＬ１）のＥＬＩＳＡ測定を示す。
【0177】
ＨＰＢＣＤ及びブデソニドを単独でまたは組み合わせて用いた異なる吸入処置を比較する。薬学的組成物は、同じＰＢＳ緩衝液中に、組み合わせ混合物（ブデソニド－ＨＰＢＣＤ）として、または各活性化合物を単独で用いて（約２５０μｇ／ｍｌのブデソニドまたは約１０ｍＭのＨＰＢＣＤ）、実施例１ａに従って調製する。
【0178】
ブデソニド処理群（約２５０μｇ／ｍｌ）と比較した場合、約２５０μｇ／ｍｌまたは約１００μｇ／ｍｌのブデソニド及び約１０ｍＭのＨＰ－β－ＣＤを含む複合体は、ＫＣレベルの減少を引き起こす。
【0179】
これは、刺激物質または酸化体への曝露後に気管支壁の好中球において重要な役割を果たすサイトカインであるＣＸＣＬ－１が、吸入されたブデソニド誘導体によって減少され得るという最初の証拠である。これは、オゾン誘発性ＫＣ産生を減少させる唯一のブデソニド－シクロデキストリン複合体である。
【0180】
４．Ｂ タバコ煙曝露モデル
タバコ曝露及び処理プロトコル
Ｉｎｅｘｐｏｓｅ（登録商標）システム（Ｓｃｉｒｅｑ、Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｃａｎａｄａ）を使用して、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを６週間の間、１週間に５日１０本のタバコに曝露する。６週間の間、１週間に５日約５０μｌの鼻腔内注入によりマウスを処理する。４３日目にマウスを屠殺する。偽曝露マウスとも称されるプラセボマウスには、ＰＢＳを注入する。
タバコ曝露及び処理プロトコル
Ｉｎｅｘｐｏｓｅ（登録商標）システム（Ｓｃｉｒｅｑ、Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｃａｎａｄａ）を使用して、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを６週間の間、１週間に５日１０本のタバコに曝露する。６週間の間、１週間に５日約５０μｌの鼻腔内注入によりマウスを処理する。４３日目にマウスを屠殺する。偽曝露マウスとも称されるプラセボマウスには、ＰＢＳを注入する。
【0181】
気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）分析は、実施例３に以前に記載したものと同じである（気道閉塞及び炎症のモデル）。
【0182】
統計学的分析
気管支肺胞洗浄液中の炎症細胞数の結果を平均＋／－ＳＥＭとして表し、マン・ホイットニーの検定を用いて群間の比較を行う。試験は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５を使用して行われる。Ｐ価＜０．０５を有意であると見なす。
気管支肺胞洗浄液中の炎症細胞数の結果を平均＋／－ＳＥＭとして表し、マン・ホイットニーの検定を用いて群間の比較を行う。試験は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５を使用して行われる。Ｐ価＜０．０５を有意であると見なす。
【0183】
薬理学的結果
この実験では、約５００μｇ／ｍｌのブデソニド単独の溶液と比較するために、
・約１００μｇ／ｍｌのブデソニド及び約２０ｍＭのヒドロキシプロピルβシクロデキストリン（実施例１ｂ）
・約２５０μｇ／ｍｌのブデソニド及び約２０ｍＭのヒドロキシプロピルβシクロデキストリン（実施例１ｃ）
を含む特定の吸入液として、実施例１ｂ及び１ｃによる薬学的組成物が使用される。
この実験では、約５００μｇ／ｍｌのブデソニド単独の溶液と比較するために、
・約１００μｇ／ｍｌのブデソニド及び約２０ｍＭのヒドロキシプロピルβシクロデキストリン（実施例１ｂ）
・約２５０μｇ／ｍｌのブデソニド及び約２０ｍＭのヒドロキシプロピルβシクロデキストリン（実施例１ｃ）
を含む特定の吸入液として、実施例１ｂ及び１ｃによる薬学的組成物が使用される。
【0184】
図９は、ブデソニド－シクロデキストリン混合物がＢＡＬＦの好中球の割合に与える影響を示す。
【0185】
【表1】
【0186】
タバコ煙曝露マウスは、偽曝露マウスと比較して、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中の好中球数の有意な増加を示す。全ての試験濃度のブデソニド－ＨＰ－β－ＣＤ（約２０ｍＭ）複合体への曝露が、タバコ煙曝露マウスと比較した場合、好中球数の有意な減少を引き起こす。全てのブデソニド－ＨＰ－β－ＣＤ（約２０ｍＭ）複合体が、より高い濃度（約５００μｇ／ｍｌ）のブデソニド単独の場合よりも大きな減少を引き起こす。ブデソニド単独では、処理マウスのＢＡＬＦ中の炎症レベルを減少させるのに有意に効率的ではない。
【0187】
実施例５
ブデソニド誘導体－シクロデキストリン複合体
ＨＰ－β－ＣＤ炭水化物は発色団を含有しないため、ＵＶ検出は実行不可能である。これまで、薬剤水溶液中のＨＰ－β－ＣＤの定量化に関する技術は記載されていない。ＣＤと薬物との間の相互作用を理解するため、及び置換グルコピラノース単位の数を評価するため（モル置換）に核磁気共鳴分光法が広く用いられていることから、水中のＨＰ－β－ＣＤの検出及び定量化のために１Ｈ核磁気共鳴分析が適用される。
ブデソニド誘導体－シクロデキストリン複合体
ＨＰ－β－ＣＤ炭水化物は発色団を含有しないため、ＵＶ検出は実行不可能である。これまで、薬剤水溶液中のＨＰ－β－ＣＤの定量化に関する技術は記載されていない。ＣＤと薬物との間の相互作用を理解するため、及び置換グルコピラノース単位の数を評価するため（モル置換）に核磁気共鳴分光法が広く用いられていることから、水中のＨＰ－β－ＣＤの検出及び定量化のために１Ｈ核磁気共鳴分析が適用される。
【0188】
材料
ＨＰ－β－ＣＤ（モル置換＝０．６４）は、Ｒｏｑｕｅｔｔｅ（Ｆｒａｎｃｅ）からご厚意で寄付されたものである。トリメチルシリル－３－プロピオン酸－ｄ４（ＴＭＳＰ）及び重水（約９９．９６％ Ｄ）は、Ｅｕｒｉｓｏｔｏｐ（Ｇｉｆ－ｓｕｒ－Ｙｖｅｔｔｅ，Ｆｒａｎｃｅ）から購入する。マレイン酸は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから入手する。
ＨＰ－β－ＣＤ（モル置換＝０．６４）は、Ｒｏｑｕｅｔｔｅ（Ｆｒａｎｃｅ）からご厚意で寄付されたものである。トリメチルシリル－３－プロピオン酸－ｄ４（ＴＭＳＰ）及び重水（約９９．９６％ Ｄ）は、Ｅｕｒｉｓｏｔｏｐ（Ｇｉｆ－ｓｕｒ－Ｙｖｅｔｔｅ，Ｆｒａｎｃｅ）から購入する。マレイン酸は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから入手する。
【0189】
試料の調製
検証プロセスのために、ＨＰ－β－ＣＤの標準溶液をＭｉｌｌｉ－Ｑ（登録商標）水中に希釈し、約０．０５ｍｇ／ｍｌ～約５ｍｇ／ｍｌの範囲内で６つの濃度レベルの較正標準を得る。これらの溶液の約５００μｌで、ＮＭＲ分析のために約１００μｌのＤ２０緩衝液、約１００μｌのマレイン酸（約５ｍＭ）、及び約１０μｌのＴＭＳＰを加える。
検証プロセスのために、ＨＰ－β－ＣＤの標準溶液をＭｉｌｌｉ－Ｑ（登録商標）水中に希釈し、約０．０５ｍｇ／ｍｌ～約５ｍｇ／ｍｌの範囲内で６つの濃度レベルの較正標準を得る。これらの溶液の約５００μｌで、ＮＭＲ分析のために約１００μｌのＤ２０緩衝液、約１００μｌのマレイン酸（約５ｍＭ）、及び約１０μｌのＴＭＳＰを加える。
【0190】
等張緩衝液がＤ２Ｏに置き換えられたことを除いて、実施例１ａに従って好ましい薬学的組成物であるブデソニド－ＨＰ－β－ＣＤを調製する。
【0191】
ＮＭＲ測定
プロトン信号取得のために、約５００．１３ＭＨｚで動作するＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ分光計において、約２９８ＫでＤ２Ｏ中のブデソニドＨＰ－β－ＣＤを記録する。この機器は、Ｚ勾配付きの５ｍｍ ＴＣＩクライオプローブを装備している。水信号を最小限に抑えるために１Ｄ ＮＯＥＳＹ－ｐｒｅｓａｔシーケンス（６４走査）を用いる。定量化のためにマレイン酸を内部標準として使用し、ゼロ較正のためにＴＭＳＰを使用する。
プロトン信号取得のために、約５００．１３ＭＨｚで動作するＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ分光計において、約２９８ＫでＤ２Ｏ中のブデソニドＨＰ－β－ＣＤを記録する。この機器は、Ｚ勾配付きの５ｍｍ ＴＣＩクライオプローブを装備している。水信号を最小限に抑えるために１Ｄ ＮＯＥＳＹ－ｐｒｅｓａｔシーケンス（６４走査）を用いる。定量化のためにマレイン酸を内部標準として使用し、ゼロ較正のためにＴＭＳＰを使用する。
【0192】
ＨＰ－β－ＣＤを特異的に検出するために、ヒドロキシプロピル基に焦点が置かれる。よって、メチル基からの二重線のピーク面積は約１．１ｐｐｍで測定されるが、これはヒドロキシプロピル基の一部である（図１０Ｂ）。この特異的ピークはまた、ＨＰ－β－ＣＤがブデソニドの存在下にある場合にも定量化することができる。約１．１ｐｐｍのピークは、依然として定量化可能であり、ブデソニドを含まない場合と同じ面積を維持した（図１０Ａ）。約５．２ｐｐｍのピークを含む他のピークも、ＨＰ－β－ＣＤの定量化のために用いられ得る。
【0193】
方法の検証
方法の検証は、一連の３つの実験に対して行われる。以下の基準を検査する：選択性、特異性（（３－シクロデキストリンと比較）、応答関数（較正曲線）、直線性、精度（繰り返し精度及び中間精度）、忠実度、検出限界（ＬＯＤ）、定量限界（ＬＯＱ）、マトリックス効果、及び正確度。総合誤差は、検証プロセスの決定基準として用いられる。許容限界を約＋／－７．５％に設定し、これらの限界内で将来の結果を得るための最小確率をβ＝約９５％（β－予想限界）に設定する。したがって、上記範囲内でこの技術の正当性が認められる。
方法の検証は、一連の３つの実験に対して行われる。以下の基準を検査する：選択性、特異性（（３－シクロデキストリンと比較）、応答関数（較正曲線）、直線性、精度（繰り返し精度及び中間精度）、忠実度、検出限界（ＬＯＤ）、定量限界（ＬＯＱ）、マトリックス効果、及び正確度。総合誤差は、検証プロセスの決定基準として用いられる。許容限界を約＋／－７．５％に設定し、これらの限界内で将来の結果を得るための最小確率をβ＝約９５％（β－予想限界）に設定する。したがって、上記範囲内でこの技術の正当性が認められる。
【0194】
図１１は、ＨＰ－β－ＣＤ－ブデソニド複合体の１Ｄ－ＣＯＳＹスペクトルを示す。
【0195】
Ｋ．Ａ．Ｃｏｎｎｏｒｓ：Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９７：１３２５－１３５７（１９９７）（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）によれば、ＨＰ－β－ＣＤからのＨ－３及びＨ－５プロトンがシクロデキストリン空洞内に位置することは周知であり、これらのプロトンとの相関関係から、ブデソニドまたはブデソニドの一部がＨＰ－β－ＣＤ内に包まれることが示唆される。
【0196】
実際、２つの相関点（約７．４～７．５ｐｐｍ及び約５．８～６．１ｐｐｍ）は、ブデソニド芳香環とＨ－５ ＨＰ－β－ＣＤプロトンとの間の相互作用を示しており、包含によって水溶性複合体がもたらされることが示唆される。
【0197】
実施例６
品質管理のためのツールとして１Ｈ 核磁気共鳴分光法を用いた溶液中の２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンの検出及び定量化
シクロデキストリン（ＣＤ）は、疎水性空洞を含む切断された円錐状構造を形成する、結合したａ－１，４－グルコピラノース単位から構成される環状オリゴ糖である。最も使用されている天然のシクロデキストリンは、６、７、または８個のグルコピラノース単位で構成され、それぞれ、α－、β－、及びｙ－シクロデキストリンと一般的に称される。毒性を減少させ、かつ水溶性を高めるために、いくつかの誘導体が開発されている。それらの中でも、２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（ＨＰ－β－ＣＤ）（図１２）は、水溶性の包接複合体を形成することによって疎水性薬物の水溶性、安定性、及び生物学的利用能を高めるために、薬学的製剤に広く使用されている。
品質管理のためのツールとして１Ｈ 核磁気共鳴分光法を用いた溶液中の２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンの検出及び定量化
シクロデキストリン（ＣＤ）は、疎水性空洞を含む切断された円錐状構造を形成する、結合したａ－１，４－グルコピラノース単位から構成される環状オリゴ糖である。最も使用されている天然のシクロデキストリンは、６、７、または８個のグルコピラノース単位で構成され、それぞれ、α－、β－、及びｙ－シクロデキストリンと一般的に称される。毒性を減少させ、かつ水溶性を高めるために、いくつかの誘導体が開発されている。それらの中でも、２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（ＨＰ－β－ＣＤ）（図１２）は、水溶性の包接複合体を形成することによって疎水性薬物の水溶性、安定性、及び生物学的利用能を高めるために、薬学的製剤に広く使用されている。
【0198】
ＵＳＰ及びＥＰのガイドラインによれば、薬学的賦形剤の特性評価及び定量化の方法が定義されているはずである。ＨＰ－β－ＣＤ炭水化物が発色団を含有しないことを考慮すると、ＵＶ検出は実行不可能である。したがって、ＣＤの定量化に関するいくつかの技術が記載されているが、それらのいずれも薬剤水溶液中のＨＰ－β－ＣＤの定量化のためには開発されていない。ＣＤと薬物との間の相互作用を理解するため、及び置換グルコピラノース単位の数を評価するため（モル置換）に核磁気共鳴分光法が広く用いられていることから、本試験では、水中のＨＰ－β－ＣＤの検出及び定量化のために１Ｈ核磁気共鳴分析が適用される。
【0199】
実験方法
材料
ＨＰ－β－ＣＤ（モル置換＝０．６４）は、Ｒｏｑｕｅｔｔｅ（Ｆｒａｎｃｅ）からご厚意で寄付されたものである。トリメチルシリル－３－プロピオン酸－ｄ４（ＴＭＳＰ）及び重水（約９９．９６％ Ｄ）は、Ｅｕｒｉｓｏｔｏｐ（Ｇｉｆ－ｓｕｒ－Ｙｖｅｔｔｅ，Ｆｒａｎｃｅ）から購入する。マレイン酸は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから入手する。統計学的分析は、ｅ－ｎｏｖａｌソフトウェア（Ａｒｌｅｎｄａ、Ｌｉｅｇｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を使用して行われる。
材料
ＨＰ－β－ＣＤ（モル置換＝０．６４）は、Ｒｏｑｕｅｔｔｅ（Ｆｒａｎｃｅ）からご厚意で寄付されたものである。トリメチルシリル－３－プロピオン酸－ｄ４（ＴＭＳＰ）及び重水（約９９．９６％ Ｄ）は、Ｅｕｒｉｓｏｔｏｐ（Ｇｉｆ－ｓｕｒ－Ｙｖｅｔｔｅ，Ｆｒａｎｃｅ）から購入する。マレイン酸は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから入手する。統計学的分析は、ｅ－ｎｏｖａｌソフトウェア（Ａｒｌｅｎｄａ、Ｌｉｅｇｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を使用して行われる。
【0200】
試料の調製
検証プロセスのために、ＨＰ－β－ＣＤの標準溶液をＭｉｌｌｉ－Ｑ（登録商標）水中に希釈し、約０．０５ｍｇ／ｍｌ～約５ｍｇ／ｍｌの範囲内の６つの濃度レベルの較正標準を得た。これらの溶液の約５００μｌで、ＮＭＲ分析のために約１００μｌのＤ２０緩衝液、約１００μｌのマレイン酸（約５ｍＭ）、及び約１０μｌのＴＭＳＰを加えた。
検証プロセスのために、ＨＰ－β－ＣＤの標準溶液をＭｉｌｌｉ－Ｑ（登録商標）水中に希釈し、約０．０５ｍｇ／ｍｌ～約５ｍｇ／ｍｌの範囲内の６つの濃度レベルの較正標準を得た。これらの溶液の約５００μｌで、ＮＭＲ分析のために約１００μｌのＤ２０緩衝液、約１００μｌのマレイン酸（約５ｍＭ）、及び約１０μｌのＴＭＳＰを加えた。
【0201】
ＮＭＲ測定
プロトン信号取得のために、約５００．１３ＭＨｚで動作するＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ分光計において、約２９８Ｋで全ての試料を記録する。この機器は、Ｚ勾配付きの５ｍｍ ＴＣＩクライオプローブを装備している。水信号を最小限に抑えるために１Ｄ ＮＯＥＳＹ－ｐｒｅｓａｔシーケンス（６４走査）を用いる。定量化のためにマレイン酸を内部標準として使用し、ゼロ較正のためにＴＭＳＰを使用する。
プロトン信号取得のために、約５００．１３ＭＨｚで動作するＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ分光計において、約２９８Ｋで全ての試料を記録する。この機器は、Ｚ勾配付きの５ｍｍ ＴＣＩクライオプローブを装備している。水信号を最小限に抑えるために１Ｄ ＮＯＥＳＹ－ｐｒｅｓａｔシーケンス（６４走査）を用いる。定量化のためにマレイン酸を内部標準として使用し、ゼロ較正のためにＴＭＳＰを使用する。
【0202】
結果及び考察
水中のＨＰ－β－ＣＤの検出及び定量化（１Ｈ－ＮＭＲ）
ＨＰ－β－ＣＤを特異的に検出するために、ヒドロキシプロピル基に焦点が置かれる。よって、約１．１ｐｐｍのメチル基から二重線のピーク面積が測定されるが、これはヒドロキシプロピル基の一部である（図１３）。この特異的ピークはまた、ＨＰ－β－ＣＤが水溶液中に単独で存在しない場合にも定量化することができる。実際、シクロデキストリン中に含まれるＨＰ－β－ＣＤ及び副腎皮質ステロイドを含む溶液が実現されており、約１．１ｐｐｍのピークは依然として定量化可能であり、副腎皮質ステロイドを含まない場合と同じ面積を維持した。
水中のＨＰ－β－ＣＤの検出及び定量化（１Ｈ－ＮＭＲ）
ＨＰ－β－ＣＤを特異的に検出するために、ヒドロキシプロピル基に焦点が置かれる。よって、約１．１ｐｐｍのメチル基から二重線のピーク面積が測定されるが、これはヒドロキシプロピル基の一部である（図１３）。この特異的ピークはまた、ＨＰ－β－ＣＤが水溶液中に単独で存在しない場合にも定量化することができる。実際、シクロデキストリン中に含まれるＨＰ－β－ＣＤ及び副腎皮質ステロイドを含む溶液が実現されており、約１．１ｐｐｍのピークは依然として定量化可能であり、副腎皮質ステロイドを含まない場合と同じ面積を維持した。
【0203】
方法の検証
方法の検証は、一連の３つの実験に対して行われる。以下の基準を検査する：選択性、特異性（β－シクロデキストリンと比較）、応答関数（較正曲線）、直線性、精度（繰り返し精度及び中間精度）、忠実度、検出限界（ＬＯＤ）、定量限界（ＬＯＱ）、マトリックス効果、及び正確度（図３）。総合誤差は、検証プロセスの決定基準として用いられる。許容限界を約＋／－７．５％に設定し、これらの限界内で将来の結果を得るための最小確率をβ＝約９５％（β－予想限界）に設定する。
方法の検証は、一連の３つの実験に対して行われる。以下の基準を検査する：選択性、特異性（β－シクロデキストリンと比較）、応答関数（較正曲線）、直線性、精度（繰り返し精度及び中間精度）、忠実度、検出限界（ＬＯＤ）、定量限界（ＬＯＱ）、マトリックス効果、及び正確度（図３）。総合誤差は、検証プロセスの決定基準として用いられる。許容限界を約＋／－７．５％に設定し、これらの限界内で将来の結果を得るための最小確率をβ＝約９５％（β－予想限界）に設定する。
【0204】
図１４に示すように、緑色の点によって表される逆算された濃度の相対誤差は、相対バイアス（赤色の線）の周りに広がっており、破線によって表されるβ期待許容限界間に含まれる。したがって、上記範囲内でこの技術の正当性が認められる。
【0205】
この試験において、初めて、溶液中のＨＰ－β－ＣＤの検出及び定量化のための新規かつ有用な分析技術が開発された。この技術は、非経口溶液等の薬剤溶液としての投薬に用いることができる。この方法は、迅速さ及び容易さの少なくとも２つの主な利点を提示する。実際、ＮＭＲ測定は、わずか約８分しかかからず、試料の調製は、水信号を抑制し、ヒドロキシプロピルのピーク面積を定量化するために、単純な分子の添加を必要とするのみである。したがって、測定は、いずれの抽出または分離ステップも用いることなく、（活性成分を含有する）薬剤溶液中で直接実現することができる。
【0206】
実施例７
ブデソニドがＬＰＳ／ＣＯＰＤ動物モデルに与える影響
材料及び方法
マウス
６～８週齢の雄Ｃ５７Ｂ１／６をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｋｏｌｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入し、我々の施設で飼育する。全ての動物実験及び手順は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｅｇｅの倫理委員会によって承認されている。飼料及び水は自由に摂取させる。
ブデソニドがＬＰＳ／ＣＯＰＤ動物モデルに与える影響
材料及び方法
マウス
６～８週齢の雄Ｃ５７Ｂ１／６をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｋｏｌｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入し、我々の施設で飼育する。全ての動物実験及び手順は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｅｇｅの倫理委員会によって承認されている。飼料及び水は自由に摂取させる。
【0207】
材料
ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏ．ｌｏｎｚａ．ｃｏｍｉｔｉｐｌｏａｄｓ／ｔｘ＿ｗａｘｍａｒｋｅｔｉｎｇｍａｔｅｒｉａｌ／Ｌｏｎｚａ＿ＢｅｎｃｈＧｕｉｄｅｓ＿Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ＿Ｂｕｆｆｅｒｅｄ＿Ｓａｌｉｎｅ＿ＰＢＳ．ｐｄｆに報告されるように、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）は、Ｌｏｎｚａ（Ｖｅｒｖｉｅｒｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）から購入し、ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンはＲｏｑｕｅｔｔｅ（Ｆｒａｎｃｅ）から購入し、ブデソニドはＩｎｄｉｓ（Ｂｅｌｇｉｕｍ）から購入し、約２５０μｇ／ｍｌの市販のブデソニド懸濁液（Ｐｕｌｍｉｃｏｒｔ（登録商標））はＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ（Ｓｗｅｄｅｎ）から購入する。マウスへの投与のために、ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（約２０ｍＭ）と、ブデソニド（約２５０μｇ／ｍｌ）及び市販製剤としてのブデソニド懸濁液（約２５０μｇ／ｍｌ）との複合体を形成する。
ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏ．ｌｏｎｚａ．ｃｏｍｉｔｉｐｌｏａｄｓ／ｔｘ＿ｗａｘｍａｒｋｅｔｉｎｇｍａｔｅｒｉａｌ／Ｌｏｎｚａ＿ＢｅｎｃｈＧｕｉｄｅｓ＿Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ＿Ｂｕｆｆｅｒｅｄ＿Ｓａｌｉｎｅ＿ＰＢＳ．ｐｄｆに報告されるように、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）は、Ｌｏｎｚａ（Ｖｅｒｖｉｅｒｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）から購入し、ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンはＲｏｑｕｅｔｔｅ（Ｆｒａｎｃｅ）から購入し、ブデソニドはＩｎｄｉｓ（Ｂｅｌｇｉｕｍ）から購入し、約２５０μｇ／ｍｌの市販のブデソニド懸濁液（Ｐｕｌｍｉｃｏｒｔ（登録商標））はＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ（Ｓｗｅｄｅｎ）から購入する。マウスへの投与のために、ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（約２０ｍＭ）と、ブデソニド（約２５０μｇ／ｍｌ）及び市販製剤としてのブデソニド懸濁液（約２５０μｇ／ｍｌ）との複合体を形成する。
【0208】
リポ多糖（ＬＰＳ）曝露アッセイ及びシクロデキストリン－ブデソニド処理
毎日の注入前に、約２．５％イソフルラン／酸素の混合物でマウス（ｎ＝７／群）を麻酔する。０、１、２、３日目に、約５０μｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（プラセボ群）、または約５０μｌのヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン－ブデソニド複合体、または約５０μｌの市販のブデソニド懸濁液（約２５０μｇ／ｍｌ）（Ｐｕｌｍｉｃｏｒｔ（登録商標））をマウスに注入する。４日目にマウスを屠殺する。１日目及び３日目に２回、処理投与の６時間後にＬＰＳ（約１μｇ／１００μｌＰＢＳ、大腸菌由来の超高純度リポ多糖（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ））をマウスの気管内に注入する。
毎日の注入前に、約２．５％イソフルラン／酸素の混合物でマウス（ｎ＝７／群）を麻酔する。０、１、２、３日目に、約５０μｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（プラセボ群）、または約５０μｌのヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン－ブデソニド複合体、または約５０μｌの市販のブデソニド懸濁液（約２５０μｇ／ｍｌ）（Ｐｕｌｍｉｃｏｒｔ（登録商標））をマウスに注入する。４日目にマウスを屠殺する。１日目及び３日目に２回、処理投与の６時間後にＬＰＳ（約１μｇ／１００μｌＰＢＳ、大腸菌由来の超高純度リポ多糖（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ））をマウスの気管内に注入する。
【0209】
肺細胞診及び組織診
実験プロトコルの終了時に、動物を屠殺し、４×１ｍｌのＰＢＳ－ＥＤＴＡ溶液（約０．０５ｍＭ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の気管内注入により気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を行う。タンパク質評価のためにＢＡＬＦ上清が収集され、細胞分画算定のために細胞が用いられる。ヘマトキシリン－エオジン（Ｄｉｆｆ－Ｑｕｉｃｋ、Ｄａｄｅ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）で染色した後、細胞遠心分離調製物に対して形態学的基準に基づく細胞分画算定を行う。
実験プロトコルの終了時に、動物を屠殺し、４×１ｍｌのＰＢＳ－ＥＤＴＡ溶液（約０．０５ｍＭ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の気管内注入により気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を行う。タンパク質評価のためにＢＡＬＦ上清が収集され、細胞分画算定のために細胞が用いられる。ヘマトキシリン－エオジン（Ｄｉｆｆ－Ｑｕｉｃｋ、Ｄａｄｅ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）で染色した後、細胞遠心分離調製物に対して形態学的基準に基づく細胞分画算定を行う。
【0210】
ＢＡＬＦ後、左主気管支をクランプし、左肺を切除して約８０℃で保存する。右肺に約４％のパラホルムアルデヒドを約２５ｃｍの圧力で注入し、パラフィンに包埋する。約５μｍの６つの切片を無差別に収集し、切断してヘマトキシリン－エオジン（Ｈ．Ｅ）で染色する。後続の各切片を前の切片から約５０μｍ離間させる。Ｈａｍａｍａｔｓｕ ｎａｎｏｚｏｏｍｅｒ ＨＴ ２．０を使用してスライドを走査し、前述の炎症スコアシステムを適用することにより、デジタル化したスライド上で炎症を定量化する。例えば、Ｃａｔａｌｄｏ ｅｔ ａｌ．：Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ（２００２）（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【0211】
結果
気管支肺胞洗浄細胞診
動物実験からのＢＡＬＦ中で測定された好中球の数は、ブデソニド懸濁液及びヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン－ブデソニド複合体による処理後に、プラセボ処理動物と比較して有意に減少した。図１５を参照されたい。
気管支肺胞洗浄細胞診
動物実験からのＢＡＬＦ中で測定された好中球の数は、ブデソニド懸濁液及びヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン－ブデソニド複合体による処理後に、プラセボ処理動物と比較して有意に減少した。図１５を参照されたい。
【0212】
肺実質における炎症の測定
驚いたことに、ＬＰＳに曝露し、ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン－ブデソニド複合体で処理した動物は、プラセボ及びブデソニド懸濁液で処理した動物と比較して、ＬＰＳ誘導性の炎症の有意な軽減を示す。図１６を参照されたい。
驚いたことに、ＬＰＳに曝露し、ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン－ブデソニド複合体で処理した動物は、プラセボ及びブデソニド懸濁液で処理した動物と比較して、ＬＰＳ誘導性の炎症の有意な軽減を示す。図１６を参照されたい。
【0213】
実施例８
ジプロピオン酸ベタメタゾン（微粒子化出発材料）
溶液を、ＰＢＳ緩衝液中の約２０ｍＭのＣｒｙｓｍｅｂ溶液として調製する。約５．０８ｇのＣｒｙｓｍｅｂをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）緩衝液中に溶解させる。
ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏ．ｌｏｎｚａ．ｃｏｍｉｎｐｌｏａｄｓ／ｔｘ＿ｍｗａｘｍａｒｋｅｔｉｎｇｒｎａｔｅｒｉａｌ／Ｌｏｎｚａ＿ＢｅｎｃｈＧｕｉｄｅｓ＿Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ＿Ｂｕｆｆｅｒｅｄ＿Ｓａｌｉｎｅ＿ＰＢＳ．ｐｄｆ（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に報告されるように、ＰＢＳはＬｏｎｚａ（Ｖｅｒｖｉｅｒｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）から購入する。
ジプロピオン酸ベタメタゾン（微粒子化出発材料）
溶液を、ＰＢＳ緩衝液中の約２０ｍＭのＣｒｙｓｍｅｂ溶液として調製する。約５．０８ｇのＣｒｙｓｍｅｂをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）緩衝液中に溶解させる。
ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏ．ｌｏｎｚａ．ｃｏｍｉｎｐｌｏａｄｓ／ｔｘ＿ｍｗａｘｍａｒｋｅｔｉｎｇｒｎａｔｅｒｉａｌ／Ｌｏｎｚａ＿ＢｅｎｃｈＧｕｉｄｅｓ＿Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ＿Ｂｕｆｆｅｒｅｄ＿Ｓａｌｉｎｅ＿ＰＢＳ．ｐｄｆ（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に報告されるように、ＰＢＳはＬｏｎｚａ（Ｖｅｒｖｉｅｒｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）から購入する。
【0214】
約２５～約３０ｍｇのジプロピオン酸ベタメタゾン（過度）を加えて溶液を飽和させ、約２５℃で約４８時間穏やかに混合する。
【0215】
０．２２ミクロンを通して飽和溶液を濾過し、有効なＨＰＬＣ法により濾液中のジプロピオン酸ベタメタゾン含有量をアッセイする。
【0216】
調製されたジプロピオン酸ベタメタゾン溶液の濃度は、約１４７ｇ／ｍｌである。
【0217】
実施例８ａ：１００μｇ／ｍｌのジプロピオン酸ベタメタゾン溶液
上で調製したような、約３４ｍｌの１４７μｇ／ｍｌの溶液を、約２０ｍＭのＣｒｙｓｍｅｂ ＰＢＳ溶液で約５０ｍｌに希釈する（ＨＰＬＣアッセイ＝約９９．００μｇ／ｍｌ）。
上で調製したような、約３４ｍｌの１４７μｇ／ｍｌの溶液を、約２０ｍＭのＣｒｙｓｍｅｂ ＰＢＳ溶液で約５０ｍｌに希釈する（ＨＰＬＣアッセイ＝約９９．００μｇ／ｍｌ）。
【0218】
層流下で０．２２μ濾過に溶液を通すことにより希釈溶液を滅菌する。滅菌されたジプロピオン酸ベタメタゾン溶液の濃度は、約１００μｇ／ｍｌである。
【0219】
実施例８ｂ：５０μｇ／ｍｌのジプロピオン酸ベタメタゾン溶液
上で調製したような、約１７ｍｌの１４７μｇ／ｍｌの溶液を、約２０ｍＭのＣｒｙｓｍｅｂ ＰＢＳ溶液で約５０ｍｌに希釈する（ＨＰＬＣアッセイ＝約４９．６４μｇ／ｍｌ）。
上で調製したような、約１７ｍｌの１４７μｇ／ｍｌの溶液を、約２０ｍＭのＣｒｙｓｍｅｂ ＰＢＳ溶液で約５０ｍｌに希釈する（ＨＰＬＣアッセイ＝約４９．６４μｇ／ｍｌ）。
【0220】
層流下で０．２２μ濾過に溶液を通すことにより溶液を滅菌する。滅菌されたジプロピオン酸ベタメタゾン溶液の濃度は、約５０μｇ／ｍｌである。
【0221】
実施例８ｃ：基準懸濁液
市販のジプロピオン酸ベタメタゾンは存在しないため、以下のレシピに従って基準ジプロピオン酸ベタメタゾン溶液を調製する。
市販のジプロピオン酸ベタメタゾンは存在しないため、以下のレシピに従って基準ジプロピオン酸ベタメタゾン溶液を調製する。
【0222】
【表2】
注）ジプロピオン酸ベタメタゾンはオートクレーブ下で分解するため、調製物は使用前に調製されるべきである。
【0223】
実施例９
プロピオン酸フルチカゾン（微粒子化出発材料）
ＨＰβＣＤ及びＣｒｙｓｍｅｂの両方が、以下の調製方法に従ってプロピオン酸フルチカゾン（ＦＰ）を可溶化することが可能である。
プロピオン酸フルチカゾン（微粒子化出発材料）
ＨＰβＣＤ及びＣｒｙｓｍｅｂの両方が、以下の調製方法に従ってプロピオン酸フルチカゾン（ＦＰ）を可溶化することが可能である。
【0224】
実施例９ａ：共蒸発させた中間生成物
約１．５ｇのＨＰβＣＤを１００ｍｌの純粋なエタノールに溶解させる。その後、約２５ｍｇのプロピオン酸フルチカゾンを５０ｍｇの純粋なエタノールに溶解させる。いったん溶解してから溶を合わせ、真空下で乾燥するまで蒸発させる。
約１．５ｇのＨＰβＣＤを１００ｍｌの純粋なエタノールに溶解させる。その後、約２５ｍｇのプロピオン酸フルチカゾンを５０ｍｇの純粋なエタノールに溶解させる。いったん溶解してから溶を合わせ、真空下で乾燥するまで蒸発させる。
【0225】
実施例９ｂ：２５０ｐｇ／ｍｌのプロピオン酸フルチカゾン溶液
実施例８ａにおいて上で調製したような、共蒸発物を約１００ｍｌのＰＢＳ緩衝液中に分散させて懸濁液を作製する。懸濁液をオートクレーブにより滅菌し、濃度約２５０μｇ／ｍｌのＦＰ及び約１０ｍＭのＨＰβＣＤを有するＦＰ溶液を生成する（ＨＰＬＣアッセイＦＰ、約２３８μｇ／ｍｌ）。
実施例８ａにおいて上で調製したような、共蒸発物を約１００ｍｌのＰＢＳ緩衝液中に分散させて懸濁液を作製する。懸濁液をオートクレーブにより滅菌し、濃度約２５０μｇ／ｍｌのＦＰ及び約１０ｍＭのＨＰβＣＤを有するＦＰ溶液を生成する（ＨＰＬＣアッセイＦＰ、約２３８μｇ／ｍｌ）。
【0226】
実施例９ｃ：１００μｇ／ｍｌのプロピオン酸フルチカゾン溶液
実施例８ｂにおいて上で調製したような、２５０μｇ／ｍｌの溶液を、約１０ｍＭのＨＰβＣＤ溶液で希釈する（ＰＢＳ中、約８．４ｍｌの２３８μｇ／ｍｌ＋約１１．６ｍｌのＨＰβＣＤ）。懸濁液をオートクレーブにより滅菌し、濃度約１００μｇ／ｍｌのＦＰ及び約１０ｍＭのＨＰβＣＤを有するＦＰ溶液を生成する。
実施例８ｂにおいて上で調製したような、２５０μｇ／ｍｌの溶液を、約１０ｍＭのＨＰβＣＤ溶液で希釈する（ＰＢＳ中、約８．４ｍｌの２３８μｇ／ｍｌ＋約１１．６ｍｌのＨＰβＣＤ）。懸濁液をオートクレーブにより滅菌し、濃度約１００μｇ／ｍｌのＦＰ及び約１０ｍＭのＨＰβＣＤを有するＦＰ溶液を生成する。
【0227】
実施例９ｄ：５０μｇ／ｍｌのプロピオン酸フルチカゾン溶液
実施例８ｂにおいて上で調製したような、２５０μｇ／ｍｌの溶液を、約１０ｍＭのＨＰβＣＤ溶液で希釈する（ＰＢＳ中、約４．２ｍｌの約２３８μｇ／ｍｌ＋約１５．６ｍｌのＨＰβＣＤ）。懸濁液をオートクレーブにより滅菌し、濃度約５０μｇ／ｍｌのＦＰ及び約１０ｍＭのＨＰβＣＤを有するＦＰ溶液を生成する。
実施例８ｂにおいて上で調製したような、２５０μｇ／ｍｌの溶液を、約１０ｍＭのＨＰβＣＤ溶液で希釈する（ＰＢＳ中、約４．２ｍｌの約２３８μｇ／ｍｌ＋約１５．６ｍｌのＨＰβＣＤ）。懸濁液をオートクレーブにより滅菌し、濃度約５０μｇ／ｍｌのＦＰ及び約１０ｍＭのＨＰβＣＤを有するＦＰ溶液を生成する。
【0228】
実施例９の基準生成物は、Ｆｌｉｘｏｔｉｄｅ懸濁液である。
【0229】
実施例１０
ジプロピオン酸ベタメタゾンがＬＰＳ／ＣＯＰＤ動物モデルに与える影響
材料及び方法
マウス
６～８週齢の雄Ｃ５７Ｂ１／６をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ （Ｋｏｌｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入し、我々の施設で飼育する。全ての動物実験及び手順は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｅｇｅの倫理委員会によって承認されている。飼料及び水は自由に摂取させる。
ジプロピオン酸ベタメタゾンがＬＰＳ／ＣＯＰＤ動物モデルに与える影響
材料及び方法
マウス
６～８週齢の雄Ｃ５７Ｂ１／６をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ （Ｋｏｌｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入し、我々の施設で飼育する。全ての動物実験及び手順は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｅｇｅの倫理委員会によって承認されている。飼料及び水は自由に摂取させる。
【0230】
材料
ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏ．ｌｏｎｚａ．ｃｏｍ／ｕｐｌｏａｄｓ／ｔｘ＿ｍｗａｘｍａｒｋｅｔｉｎｇｒｎａｔｅｌｉａｌ／Ｌｏｎｚａ＿ＢｅｎｃｈＧｕｉｄｅｓ＿Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ＿Ｂｕｆｆｅｒｅｄ＿Ｓａｌｉｎｅ＿ＰＢＳ．ｐｄｆに報告されるように、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）はＬｏｎｚａ（Ｖｅｒｖｉｅｒｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）から購入し、ｃｒｙｓｍｅｂはＲｏｑｕｅｔｔｅ（Ｆｒａｎｃｅ）から購入し、ジプロピオン酸ベタメタゾンはＡＣＩＣ（Ｃａｎａｄａ）から購入し、ｔｗｅｅｎ ８０はＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈを通してＩＣＩから購入する。マウスへの投与のために、実施例８の下で生成された生成物を試験する。
ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏ．ｌｏｎｚａ．ｃｏｍ／ｕｐｌｏａｄｓ／ｔｘ＿ｍｗａｘｍａｒｋｅｔｉｎｇｒｎａｔｅｌｉａｌ／Ｌｏｎｚａ＿ＢｅｎｃｈＧｕｉｄｅｓ＿Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ＿Ｂｕｆｆｅｒｅｄ＿Ｓａｌｉｎｅ＿ＰＢＳ．ｐｄｆに報告されるように、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）はＬｏｎｚａ（Ｖｅｒｖｉｅｒｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）から購入し、ｃｒｙｓｍｅｂはＲｏｑｕｅｔｔｅ（Ｆｒａｎｃｅ）から購入し、ジプロピオン酸ベタメタゾンはＡＣＩＣ（Ｃａｎａｄａ）から購入し、ｔｗｅｅｎ ８０はＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈを通してＩＣＩから購入する。マウスへの投与のために、実施例８の下で生成された生成物を試験する。
【0231】
リポ多糖（ＬＰＳ）曝露アッセイ及びシクロデキストリン－ジプロピオン酸ベタメタゾン処理
毎日の注入前に、約２．５％イソフルラン／酸素の混合物でマウス（ｎ＝１０／群）を麻酔する。０、１、２、３日目に、実施例８に従って調製されたように、約５０μｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（プラセボ群）、または約５０μｌのＣｒｙｓｍｅｂ－ジプロピオン酸ベタメタゾン複合体、または約５０μｌのベタメタゾン懸濁液をマウスに注入する。４日目にマウスを屠殺する。１日目及び３日目に２回、処理投与の６時間後にＬＰＳ（約１μｇ／１００μｌＰＢＳ、大腸菌由来の超高純度リポ多糖（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ））をマウスの気管内に注入する。
毎日の注入前に、約２．５％イソフルラン／酸素の混合物でマウス（ｎ＝１０／群）を麻酔する。０、１、２、３日目に、実施例８に従って調製されたように、約５０μｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（プラセボ群）、または約５０μｌのＣｒｙｓｍｅｂ－ジプロピオン酸ベタメタゾン複合体、または約５０μｌのベタメタゾン懸濁液をマウスに注入する。４日目にマウスを屠殺する。１日目及び３日目に２回、処理投与の６時間後にＬＰＳ（約１μｇ／１００μｌＰＢＳ、大腸菌由来の超高純度リポ多糖（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ））をマウスの気管内に注入する。
【0232】
肺細胞診及び組織診
実験プロトコルの終了時に、動物を屠殺し、４×１ｍｌのＰＢＳ－ＥＤＴＡ ０．０５ｍＭ溶液（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の気管内注入により気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を行う。タンパク質評価のためにＢＡＬＦ上清が収集され、細胞分画算定のために細胞が用いられる。ヘマトキシリン－エオジン（Ｄｉｆｆ－Ｑｕｉｃｋ、Ｄａｄｅ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）で染色した後、細胞遠心分離調製物に対して形態学的基準に基づく細胞分画算定を行う。
実験プロトコルの終了時に、動物を屠殺し、４×１ｍｌのＰＢＳ－ＥＤＴＡ ０．０５ｍＭ溶液（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の気管内注入により気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を行う。タンパク質評価のためにＢＡＬＦ上清が収集され、細胞分画算定のために細胞が用いられる。ヘマトキシリン－エオジン（Ｄｉｆｆ－Ｑｕｉｃｋ、Ｄａｄｅ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）で染色した後、細胞遠心分離調製物に対して形態学的基準に基づく細胞分画算定を行う。
【0233】
ＢＡＬＦ後、左主気管支をクランプし、左肺を切除して－８０℃で保存する。右肺に約４％のパラホルムアルデヒドを約２５ｃｍの圧力で注入し、パラフィンに包埋する。約５μｍの６つの切片を無差別に収集し、切断してヘマトキシリン－エオジン（Ｈ．Ｅ）で染色する。後続の各切片を前の切片から約５０μｍ離間させる。Ｈａｍａｍａｔｓｕ ｎａｎｏｚｏｏｍｅｒ ＨＴ ２．０を使用してスライドを走査し、前述の炎症スコアシステムを適用することにより、デジタル化したスライド上で炎症を定量化する。例えば、Ｃａｔａｌｄｏ ｅｔ ａｌ．：Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ（２００２）（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【0234】
結果
気管支肺胞洗浄細胞診
動物実験からのＢＡＬＦ中で測定された好中球の数は、ジプロピオン酸ベタメタゾン懸濁液及びＣｒｙｓｍｅｂ－ジプロピオン酸ベタメタゾン複合体による処理後に、プラセボ処理動物と比較して減少するが、有意ではない。図１８及び図１９を参照されたい。
気管支肺胞洗浄細胞診
動物実験からのＢＡＬＦ中で測定された好中球の数は、ジプロピオン酸ベタメタゾン懸濁液及びＣｒｙｓｍｅｂ－ジプロピオン酸ベタメタゾン複合体による処理後に、プラセボ処理動物と比較して減少するが、有意ではない。図１８及び図１９を参照されたい。
【0235】
肺実質における炎症の測
驚いたことに、ＬＰＳに曝露し、Ｃｒｙｓｍｅｂ－ジプロピオン酸ベタメタゾン複合体（約１００μｇ／ｍｌ）で処理した動物は、プラセボ及びベタメタゾン（約１００μｇ／ｍｌ）懸濁液で処理した動物と比較して、ＬＰＳ誘導性の炎症の有意な軽減を示す。図１７を参照されたい。
驚いたことに、ＬＰＳに曝露し、Ｃｒｙｓｍｅｂ－ジプロピオン酸ベタメタゾン複合体（約１００μｇ／ｍｌ）で処理した動物は、プラセボ及びベタメタゾン（約１００μｇ／ｍｌ）懸濁液で処理した動物と比較して、ＬＰＳ誘導性の炎症の有意な軽減を示す。図１７を参照されたい。
【0236】
また、ＬＰＳに曝露し、約５０及び約１００μｇ／ｍｌのＣｒｙｓｍｅｂ－ジプロピオン酸ベタメタゾン複合体ならびに約５０μｇ／ｍｌのベタメタゾン懸濁液で処理した動物は、プラセボ処理動物と比較してＬＰＳ誘導性の炎症の有意な軽減を示す。フルチカゾン基準物質（約１００μｇ／ｍｌ）もまた、プラセボと比べて軽減効果を示すが、有意ではない。また、約１００μｇ／ｍｌのＣｒｙｓｍｅｂ－ジプロピオン酸ベタメタゾン複合体は、約１００μｇ／ｍｌのフルチカゾン基準物質の炎症スコアと比較した場合、炎症を有意に軽減する。図２０を参照されたい。
【0237】
実施例１１
プロピオン酸フルチカゾンがＬＰＳ／ＣＯＰＤ動物モデルに与える影響
材料及び方法
マウス
６～８週齢の雄Ｃ５７Ｂ１／６をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｋｏｌｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入し、我々の施設で飼育する。全ての動物実験及び手順は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｅｇｅの倫理委員会によって承認されている。飼料及び水は自由に摂取させる。
プロピオン酸フルチカゾンがＬＰＳ／ＣＯＰＤ動物モデルに与える影響
材料及び方法
マウス
６～８週齢の雄Ｃ５７Ｂ１／６をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｋｏｌｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入し、我々の施設で飼育する。全ての動物実験及び手順は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｅｇｅの倫理委員会によって承認されている。飼料及び水は自由に摂取させる。
【0238】
材料
ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｌｏｎｚａ．ｃｏｍｌｕｐｌｏａｄｓ／ｔｘ＿ｍｗａｘｍａｒｋｅｔｉｎｇｍａｔｅｒｉａｌ／Ｌｏｎｚａ＿ＢｅｎｃｈＧｕｉｄｅｓ＿Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ＿Ｂｕｆｆｅｒｅｄ＿Ｓａｌｉｎｅ＿ＰＢＳ．ｐｄｆに報告されるように、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）はＬｏｎｚａ（Ｖｅｒｖｉｅｒｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）から購入し、ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンはＲｏｑｕｅｔｔｅ（Ｆｒａｎｃｅ）から購入し、プロピオン酸フルチカゾンはＡＣＩＣ（Ｃａｎａｄａ）から購入し、市販のプロピオン酸フルチカゾン懸濁液（約２５０μｇ／ｍｌ）（Ｐｕｌｍｉｃｏｒｔ（登録商標））はＧｌａｘｏ ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ（ＵＫ）から購入する。マウスへの投与のために、ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（約１０ｍＭ）と、実施例９によるプロピオン酸フルチカゾン（約２５０μｇ／ｍｌ）及び市販製剤としてのプロピオン酸フルチカゾン懸濁液（約２５０μｇ／ｍｌ）との複合体を形成する。
ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｌｏｎｚａ．ｃｏｍｌｕｐｌｏａｄｓ／ｔｘ＿ｍｗａｘｍａｒｋｅｔｉｎｇｍａｔｅｒｉａｌ／Ｌｏｎｚａ＿ＢｅｎｃｈＧｕｉｄｅｓ＿Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ＿Ｂｕｆｆｅｒｅｄ＿Ｓａｌｉｎｅ＿ＰＢＳ．ｐｄｆに報告されるように、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）はＬｏｎｚａ（Ｖｅｒｖｉｅｒｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）から購入し、ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンはＲｏｑｕｅｔｔｅ（Ｆｒａｎｃｅ）から購入し、プロピオン酸フルチカゾンはＡＣＩＣ（Ｃａｎａｄａ）から購入し、市販のプロピオン酸フルチカゾン懸濁液（約２５０μｇ／ｍｌ）（Ｐｕｌｍｉｃｏｒｔ（登録商標））はＧｌａｘｏ ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ（ＵＫ）から購入する。マウスへの投与のために、ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（約１０ｍＭ）と、実施例９によるプロピオン酸フルチカゾン（約２５０μｇ／ｍｌ）及び市販製剤としてのプロピオン酸フルチカゾン懸濁液（約２５０μｇ／ｍｌ）との複合体を形成する。
【0239】
リポ多糖（ＬＰＳ）曝露アッセイ及びシクロデキストリン－プロピオン酸フルチカゾン処理
毎日の注入前に、約２．５％イソフルラン／酸素の混合物でマウス（ｎ＝１０／群）を麻酔する。０、１、２、３日目に、約５０μｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（プラセボ群）、または約５０μｌのヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン－プロピオン酸フルチカゾン複合体、または約５０μｌの市販のプロピオン酸フルチカゾン懸濁液（約２５０μｇ／ｍｌ）（Ｆｌｉｘｏｔｉｄｅ（登録商標））をマウスに注入する。４日目にマウスを屠殺する。１日目及び３日目に２回、処理投与の６時間後にＬＰＳ（約１μｇ／１００μｌＰＢＳ、大腸菌由来の超高純度リポ多糖（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ））をマウスの気管内に注入する。
毎日の注入前に、約２．５％イソフルラン／酸素の混合物でマウス（ｎ＝１０／群）を麻酔する。０、１、２、３日目に、約５０μｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（プラセボ群）、または約５０μｌのヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン－プロピオン酸フルチカゾン複合体、または約５０μｌの市販のプロピオン酸フルチカゾン懸濁液（約２５０μｇ／ｍｌ）（Ｆｌｉｘｏｔｉｄｅ（登録商標））をマウスに注入する。４日目にマウスを屠殺する。１日目及び３日目に２回、処理投与の６時間後にＬＰＳ（約１μｇ／１００μｌＰＢＳ、大腸菌由来の超高純度リポ多糖（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ））をマウスの気管内に注入する。
【0240】
肺細胞診及び組織診
実験プロトコルの終了時に、動物を屠殺し、４×１ｍｌのＰＢＳ－ＥＤＴＡ ０．０５ｍＭ溶液（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の気管内注入により気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を行う。タンパク質評価のためにＢＡＬＦ上清が収集され、細胞分画算定のために細胞が用いられる。ヘマトキシリン－エオジン（Ｄｉｆｆ－Ｑｕｉｃｋ、Ｄａｄｅ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）で染色した後、細胞遠心分離調製物に対して形態学的基準に基づく細胞分画算定を行う。
実験プロトコルの終了時に、動物を屠殺し、４×１ｍｌのＰＢＳ－ＥＤＴＡ ０．０５ｍＭ溶液（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の気管内注入により気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を行う。タンパク質評価のためにＢＡＬＦ上清が収集され、細胞分画算定のために細胞が用いられる。ヘマトキシリン－エオジン（Ｄｉｆｆ－Ｑｕｉｃｋ、Ｄａｄｅ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）で染色した後、細胞遠心分離調製物に対して形態学的基準に基づく細胞分画算定を行う。
【0241】
ＢＡＬＦ後、左主気管支をクランプし、左肺を切除して－８０℃で保存する。右肺に約４％のパラホルムアルデヒドを約２５ｃｍの圧力で注入し、パラフィンに包埋する。約５μｍの６つの切片を無差別に収集し、切断してヘマトキシリン－エオジン（Ｈ．Ｅ）で染色する。後続の各切片を前の切片から約５０μｍ離間させる。Ｈａｍａｍａｔｓｕ ｎａｎｏｚｏｏｍｅｒ ＨＴ ２．０を使用してスライドを走査し、前述の炎症スコアシステムを適用することにより、デジタル化したスライド上で炎症を定量化する。例えば、Ｃａｔａｌｄｏ ｅｔ ａｌ．：Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ（２００２）（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【0242】
結果
気管支肺胞洗浄細胞診
動物実験からのＢＡＬＦ中で測定された好中球の数は、ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン－プロピオン酸フルチカゾン複合体（約２５０μｇ／ｍｌ）による処理後に、プラセボ処理動物と比較して驚くほど有意に減少した。プロピオン酸フルチカゾン懸濁液（約２５０μｇ／ｍｌ）の場合、好中球数は、プラセボと比較して減少するが、有意ではない。図２１を参照されたい。
気管支肺胞洗浄細胞診
動物実験からのＢＡＬＦ中で測定された好中球の数は、ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン－プロピオン酸フルチカゾン複合体（約２５０μｇ／ｍｌ）による処理後に、プラセボ処理動物と比較して驚くほど有意に減少した。プロピオン酸フルチカゾン懸濁液（約２５０μｇ／ｍｌ）の場合、好中球数は、プラセボと比較して減少するが、有意ではない。図２１を参照されたい。
【0243】
刊行物
Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｇ．Ｖｏｇｔ ａｎｄ Ｍａｒｋ Ｓｔｒｏｈｍｅｉｅｒ："２Ｄ Ｓｏｌｉｄ－Ｓｔａｔｅ ＮＭＲ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ－Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ"，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ．９：３３５７－３３７４（２０１２）．
Ａｇｉｉｅｒｏｓ，Ｍ．，Ｃａｍｐａｎｅｒｏ，Ｍ．Ａ．，Ｉｒａｃｈｅ，Ｊ．Ｍ．："Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎｓ ａｎｄ Ｇａｎｔｒｅｚ ｂｙ ＨＰＬＣ ｗｉｔｈ ｅｖａｐｏｒａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ"，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．３９：４９５－５０２（２００５）．
Ｔｈｏｒｓｔｅｉｎｎ Ｌｏｆｔｓｓｏｎ ａｎｄ Ｍａｒｃｕｓ Ｅ．Ｂｒｅｗｓｔｅｒ："Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎｓ： ｂａｓｉｃ ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ"，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６２：１６０７－１６２１ （２０１０）．
Ｓｚｅｍａｎ，Ｊ．，Ｇｅｒｌｏｃｚｙ，Ａ．，Ｃｓａｂａｉ，Ｋ．，Ｓｚｅｊｔｌｉ，Ｊ．，Ｋｉｓ，Ｇ．Ｌ．，Ｓｕ，Ｐ．，Ｃｈａｕ，Ｒ．Ｙ．，Ｊａｃｏｂｅｒ，Ａ．："Ｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ２－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ－γ－ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｌｕｉｄｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ"．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ．７７４：１５７－１６４（２００２）．
Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｇ．Ｖｏｇｔ ａｎｄ Ｍａｒｋ Ｓｔｒｏｈｍｅｉｅｒ："２Ｄ Ｓｏｌｉｄ－Ｓｔａｔｅ ＮＭＲ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ－Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ"，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ．９：３３５７－３３７４（２０１２）．
Ａｇｉｉｅｒｏｓ，Ｍ．，Ｃａｍｐａｎｅｒｏ，Ｍ．Ａ．，Ｉｒａｃｈｅ，Ｊ．Ｍ．："Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎｓ ａｎｄ Ｇａｎｔｒｅｚ ｂｙ ＨＰＬＣ ｗｉｔｈ ｅｖａｐｏｒａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ"，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．３９：４９５－５０２（２００５）．
Ｔｈｏｒｓｔｅｉｎｎ Ｌｏｆｔｓｓｏｎ ａｎｄ Ｍａｒｃｕｓ Ｅ．Ｂｒｅｗｓｔｅｒ："Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎｓ： ｂａｓｉｃ ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ"，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６２：１６０７－１６２１ （２０１０）．
Ｓｚｅｍａｎ，Ｊ．，Ｇｅｒｌｏｃｚｙ，Ａ．，Ｃｓａｂａｉ，Ｋ．，Ｓｚｅｊｔｌｉ，Ｊ．，Ｋｉｓ，Ｇ．Ｌ．，Ｓｕ，Ｐ．，Ｃｈａｕ，Ｒ．Ｙ．，Ｊａｃｏｂｅｒ，Ａ．："Ｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ２－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ－γ－ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｌｕｉｄｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ"．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ．７７４：１５７－１６４（２００２）．
【0244】
本明細書に引用される全ての刊行物の完全な開示は、各々が個々に、完全に本明細書に記載され、かつ組み込まれたかのように、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【0245】
本発明に対する種々の修正例及び変形例は、本発明の範囲及び主旨から逸脱することなく、当業者に明白となるであろう。例示的な実施形態及び実施例は、例として提供されるに過ぎず、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。本発明の範囲は、以下に記載される請求項によってのみ限定される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
