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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-01-13
(45)【発行日】2022-02-10
(54)【発明の名称】低温酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡ並びにその調製方法及び応用
(51)【国際特許分類】
C12N 9/50 20060101AFI20220203BHJP
C07K 14/78 20060101ALI20220203BHJP
C12N 15/57 20060101ALN20220203BHJP
C12N 15/81 20060101ALN20220203BHJP
【ＦＩ】
C12N9/50 ZNA
C07K14/78
C12N15/57
C12N15/81 Z
【請求項の数】
3
(21)【出願番号】P 2020141218
(22)【出願日】2020-08-24
(65)【公開番号】P2021177752
(43)【公開日】2021-11-18
【審査請求日】2020-09-03
(31)【優先権主張番号】2020104062801
(32)【優先日】2020-05-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】517322145
【氏名又は名称】中国農業科学院農産品加工研究所
(74)【代理人】
【識別番号】100091683
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼川 俊雄
(74)【代理人】
【識別番号】100179316
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 寛奈
(72)【発明者】
【氏名】郭玉杰
(72)【発明者】
【氏名】張春暉
【審査官】山本 晋也
(56)【参考文献】
【文献】中国特許出願公開第１０８１０３０４８（ＣＮ，Ａ）
【文献】特開２０１１－１９３８７０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開昭５３－１０８１５４（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表平０９－５１０３４７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特公昭４６－０２１７８７（ＪＰ，Ｂ１）
【文献】国際公開第２０１７／０７３７８５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】中国特許出願公開第１１１６４７５８４（ＣＮ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ
Ｃ０７Ｋ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
アミノ酸配列が配列番号１に示す通りであることを特徴とする、酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡ。
【請求項2】
ＤＮＡ配列が配列番号２に示す通りであり、ｃＤＮＡ配列が配列番号４に示す通りであることを特徴とする、請求項１に記載の酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡ。
【請求項3】
骨コラーゲンの抽出に用いることを特徴とする、請求項１に記載の酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡの使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明はバイオテクノロジー分野に関し、より具体的には、低温酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡ並びにその調製方法及び応用に関する。
【背景技術】
【0002】
家畜、家禽の骨には、機能性食品の調製に重要な原料であるコラーゲンが豊富に含まれる。骨コラーゲンの一般的な抽出方法には、酸、アルカリ、酵素法などの工程があり、このうち骨コラーゲンは酵素法による抽出が最も高効率である。骨コラーゲンは酸性溶液中で比較的高い溶解度を有するため、骨コラーゲンの抽出は、通常、低ｐＨ条件下で行う。抽出過程で酸性プロテアーゼを添加して、コラーゲンのテロペプチドの酵素分解を促進することができ、タンパクの架橋度を低下させ、骨コラーゲンの抽出効率を高める。他に、コラーゲンのらせんが熱によりほどけるのを防止するため、骨コラーゲンの抽出は、通常、低温条件下で行われるが；酵素法による抽出過程で通常使用するペプシンは常温プロテアーゼであり、骨コラーゲンの低温抽出過程では抽出率が低いなどの問題が存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
本発明の１つの目的は、少なくとも上記問題を解決し、少なくとも以下に説明する利点を提供することである。
【0004】
本発明のさらなる目的は、骨コラーゲンの抽出率を高めることができる、酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡを提供することである。
【0005】
本発明の別の目的は、酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡの調製方法を提供することである。
【0006】
本発明の他の目的は、骨コラーゲンの抽出における酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡの応用を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明のこれらの目的及びその他の利点を実現するため、酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡのアミノ酸配列は配列番号１に示す通りである。
【0008】
好ましくは、前記酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡのＤＮＡ配列は配列番号２に示す通りであり、前記酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡのｃＤＮＡ配列は配列番号４に示す通りである。
【0009】
好ましくは、前記酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡの調製方法は、以下の工程を含む。
Ｓ１、最初にＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．ＸＴ７の全ＲＮＡ配列を抽出し、逆転写によりＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．ＸＴ７のｃＤＮＡ配列を得る。Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．ＸＴ７のｃＤＮＡ配列をテンプレートとして酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡのｃＤＮＡ配列を増幅させ、その後、酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡのｃＤＮＡ配列をピキア酵母発現ベクターｐＰＩＣ９に接続して、組換え発現ベクターｐＰＩＣ９－ＰｓＡＰＡを得る。
Ｓ２、組換え発現ベクターｐＰＩＣ９－ＰｓＡＰＡを宿主細胞のピキア酵母に形質転換し、組換え菌株を得る。
Ｓ３、組換え菌株を３０℃条件下で２～３ｄ培養し、メタノール誘導下で組換え菌株を発現させて粗酵素液を生成する。
Ｓ４、粗酵素液を濃縮、精製することにより、精製した組換えプロテアーゼＰｓＡＰＡを得る。
Ｓ１、最初にＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．ＸＴ７の全ＲＮＡ配列を抽出し、逆転写によりＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．ＸＴ７のｃＤＮＡ配列を得る。Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．ＸＴ７のｃＤＮＡ配列をテンプレートとして酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡのｃＤＮＡ配列を増幅させ、その後、酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡのｃＤＮＡ配列をピキア酵母発現ベクターｐＰＩＣ９に接続して、組換え発現ベクターｐＰＩＣ９－ＰｓＡＰＡを得る。
Ｓ２、組換え発現ベクターｐＰＩＣ９－ＰｓＡＰＡを宿主細胞のピキア酵母に形質転換し、組換え菌株を得る。
Ｓ３、組換え菌株を３０℃条件下で２～３ｄ培養し、メタノール誘導下で組換え菌株を発現させて粗酵素液を生成する。
Ｓ４、粗酵素液を濃縮、精製することにより、精製した組換えプロテアーゼＰｓＡＰＡを得る。
【0010】
４、工程Ｓ１において、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．ＸＴ７のｃＤＮＡをテンプレートとして酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡのｃＤＮＡ配列を増幅させるのは、具体的に以下の工程：
Ｓ１ａ、酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡの特異的プライマーＰｓＡＰＡ＿ｆヌクレオチド配列をＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＣＡＡ、ＰｓＡＰＡ＿ｒヌクレオチド配列をＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＡＧＣＣＴＧＣＴＴＧＧＣＧＡＡＧＣＣＡＡＧに設計し、設計したＰｓＡＰＡ＿ｆ及びＰｓＡＰＡ＿ｒを北京華大生物有限公司に送って合成する；
Ｓ１ｂ、逆転写して得られたＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．ＸＴ７のｃＤＮＡをテンプレート、ＰｓＡＰＡ＿ｆ、ＰｓＡＰＡ＿ｒをプライマーとしてＰＣＲ増幅を行い、酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡのｃＤＮＡ配列を得る；を含むことを特徴とする、請求項３に記載の酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡの調製方法。
Ｓ１ａ、酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡの特異的プライマーＰｓＡＰＡ＿ｆヌクレオチド配列をＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＣＡＡ、ＰｓＡＰＡ＿ｒヌクレオチド配列をＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＡＧＣＣＴＧＣＴＴＧＧＣＧＡＡＧＣＣＡＡＧに設計し、設計したＰｓＡＰＡ＿ｆ及びＰｓＡＰＡ＿ｒを北京華大生物有限公司に送って合成する；
Ｓ１ｂ、逆転写して得られたＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．ＸＴ７のｃＤＮＡをテンプレート、ＰｓＡＰＡ＿ｆ、ＰｓＡＰＡ＿ｒをプライマーとしてＰＣＲ増幅を行い、酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡのｃＤＮＡ配列を得る；を含むことを特徴とする、請求項３に記載の酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡの調製方法。
【0011】
好ましくは、工程Ｓ１において、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．ＸＴ７のｃＤＮＡ配列をテンプレートとして酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡのｃＤＮＡ配列を増幅させる条件は、９５℃５ｍｉｎ；９４℃３０ｓ、６０℃３０ｓ、７２℃２ｍｉｎ、３５サイクル；７２℃１０ｍｉｎである。
【0012】
好ましくは、前記酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡの応用であり、前記酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡを骨コラーゲンの抽出に用いる応用である。
【発明の効果】
【0013】
本発明は、以下の有益な効果を少なくとも含む。
骨コラーゲンを酵素法で抽出する過程において、本発明で提供する酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡを使用し、骨コラーゲンの抽出率を高めることができる。
骨コラーゲンを酵素法で抽出する過程において、本発明で提供する酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡを使用し、骨コラーゲンの抽出率を高めることができる。
【0014】
本発明のその他の利点、目標及び特徴は、一部を以下の説明により具体的に示し、一部は本発明についての研究及び実践により、当業者に理解される。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【発明を実施するための形態】
【0016】
注：ＰＳＣはペプシン抽出したウシ骨コラーゲンを表し、ＥＳＣは酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡで処理したウシ骨コラーゲンを表す。
【0017】
以下、実施例を組み合わせて本発明をさらに詳細に説明する。当業者は明細書の文章を参照することによって、実施することができる。
【0018】
試験材料及び試薬
１、菌株及びベクター：タンパクの異種発現に用いる人工菌株はピキア酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＳ１１５）であり、生工生物工程（上海）股フン有限公司から購入した。ピキア酵母発現ベクターｐＰＩＣ９及び菌株ＧＳ１１５は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入した。
２、酵素類及びその他の生化学試薬：エンドヌクレアーゼはＴａＫａＲａ社から購入し、リガーゼはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入し、その他はいずれも国産試薬（いずれも生化試剤公司から購入することができる）である。
３、酵素産生培地：１Ｌの脱イオン水中に３０ｇ／Ｌの小麦ふすま、３０ｇ／Ｌのコーンコブ粉末、３０ｇ／Ｌの大豆粕、５ｇ／Ｌの大麦グルカン、５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）ＳＯ４、１ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２ｇ／ＬのＣａＣｌ２を添加し、温度１２１℃、高圧下で２０ｍｉｎ蒸気滅菌処理を行う。
４、大腸菌の培地：１％酵母抽出物、２％ペプトン、１．３４％ＹＮＢ、０．００００４９＜Ｂｉｏｔｉｎ、１％グリセリン（ｖ／ｖ）。
５、ＢＭＧＹ培地：１％酵母抽出物、２％ペプトン、１．３４％ＹＮＢ、０．００００４９＜Ｂｉｏｔｉｎ、１％グリセリン（ｖ／ｖ）。
６、ＢＭＭＹ培地：０．５％メタノールでグリセリンを代替する以外、他の成分はいずれもＢＭＧＹと同じであり、ｐＨは４．０である。
注：以下の実施例で具体的に説明していない分子生物学実験の方法は、いずれも「分子克隆実験指南（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」（第３版）Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋに記載の具体的な方法を参照して行うか、又はキット及び製品の説明書に基づいて行う。
１、菌株及びベクター：タンパクの異種発現に用いる人工菌株はピキア酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＳ１１５）であり、生工生物工程（上海）股フン有限公司から購入した。ピキア酵母発現ベクターｐＰＩＣ９及び菌株ＧＳ１１５は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入した。
２、酵素類及びその他の生化学試薬：エンドヌクレアーゼはＴａＫａＲａ社から購入し、リガーゼはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入し、その他はいずれも国産試薬（いずれも生化試剤公司から購入することができる）である。
３、酵素産生培地：１Ｌの脱イオン水中に３０ｇ／Ｌの小麦ふすま、３０ｇ／Ｌのコーンコブ粉末、３０ｇ／Ｌの大豆粕、５ｇ／Ｌの大麦グルカン、５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）ＳＯ４、１ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２ｇ／ＬのＣａＣｌ２を添加し、温度１２１℃、高圧下で２０ｍｉｎ蒸気滅菌処理を行う。
４、大腸菌の培地：１％酵母抽出物、２％ペプトン、１．３４％ＹＮＢ、０．００００４９＜Ｂｉｏｔｉｎ、１％グリセリン（ｖ／ｖ）。
５、ＢＭＧＹ培地：１％酵母抽出物、２％ペプトン、１．３４％ＹＮＢ、０．００００４９＜Ｂｉｏｔｉｎ、１％グリセリン（ｖ／ｖ）。
６、ＢＭＭＹ培地：０．５％メタノールでグリセリンを代替する以外、他の成分はいずれもＢＭＧＹと同じであり、ｐＨは４．０である。
注：以下の実施例で具体的に説明していない分子生物学実験の方法は、いずれも「分子克隆実験指南（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」（第３版）Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋに記載の具体的な方法を参照して行うか、又はキット及び製品の説明書に基づいて行う。
【0019】
実施例
１、酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡのＤＮＡ配列を得る
Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．ＸＴ７のＤＮＡ配列を抽出し、－２０℃の温度下で保存する。
１、酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡのＤＮＡ配列を得る
Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．ＸＴ７のＤＮＡ配列を抽出し、－２０℃の温度下で保存する。
【0020】
クローニングプライマーＰｓＡＰＡ＿ｆ及びＰｓＡＰＡ＿ｒを設計し、プライマーＰｓＡＰＡ＿ｆ及びＰｓＡＰＡ＿ｒの配列はそれぞれ配列番号５及び配列番号６である。Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．ＸＴ７のＤＮＡ配列をテンプレートとしてＰＣＲ増幅を行い、このうち、増幅条件は９５℃５ｍｉｎ；９４℃３０ｓ、６０℃３０ｓ、７２℃２ｍｉｎ、３５サイクル；７２℃１０ｍｉｎである。約１１００ｂｐのＤＮＡ配列が得られ、該ＤＮＡ配列を回収後、叡博生物技術有限公司に送ってシークエンシングを行う。その遺伝子配列は配列番号２に示され、酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡのＤＮＡ配列であり、対応するアミノ酸配列は配列番号１である。
【0021】
２、酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡのｃＤＮＡ配列を得る
Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．ＸＴ７のＲＮＡ配列を抽出し、さらに逆転写によりＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．ＸＴ７のｃＤＮＡ配列を得る。クローニングプライマーＰｓＡＰＡ＿ｆ及びＰｓＡＰＡ＿ｒを設計し、プライマーＰｓＡＰＡ＿ｆ及びＰｓＡＰＡ＿ｒの配列はそれぞれ配列番号５及び配列番号６である。Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．ＸＴ７のｃＤＮＡ配列をテンプレートとしてＰＣＲ増幅を行い、ｃＤＮＡ配列を増幅させ、増幅させたｃＤＮＡ配列を叡博生物技術有限公司に送ってシークエンシングを行う。その遺伝子配列は配列番号４に示され、これは酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡのｃＤＮＡ配列であり、対応するアミノ酸配列は配列番号１である。
Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．ＸＴ７のＲＮＡ配列を抽出し、さらに逆転写によりＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．ＸＴ７のｃＤＮＡ配列を得る。クローニングプライマーＰｓＡＰＡ＿ｆ及びＰｓＡＰＡ＿ｒを設計し、プライマーＰｓＡＰＡ＿ｆ及びＰｓＡＰＡ＿ｒの配列はそれぞれ配列番号５及び配列番号６である。Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．ＸＴ７のｃＤＮＡ配列をテンプレートとしてＰＣＲ増幅を行い、ｃＤＮＡ配列を増幅させ、増幅させたｃＤＮＡ配列を叡博生物技術有限公司に送ってシークエンシングを行う。その遺伝子配列は配列番号４に示され、これは酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡのｃＤＮＡ配列であり、対応するアミノ酸配列は配列番号１である。
【0022】
酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡのＤＮＡ配列及びＰｓＡＰＡのｃＤＮＡ配列情報を分析すると、酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡのＤＮＡ配列全長は１１７８ｂｐであり、１つのイントロンを含む。イントロンの塩基配列は配列番号３に示す通りであり、ｃＤＮＡ配列の全長は１１２２ｂｐである。ＤＮＡ配列が発現するアミノ酸配列は、ソフトウェアにより、Ｎ端にシグナルペプチド配列が存在しないと予測されるため、酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡのＤＮＡ配列が発現するアミノ酸配列、及びｃＤＮＡ配列が発現するアミノ酸配列は同じで、いずれも配列番号１に示す通りである。Ｂｌａｓｔ比較により、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．ＸＴ７から分離、クローニングして得られたプロテアーゼをエンコードする遺伝子は比較的高い新規性を有することが証明されている。
【0023】
３、組換え菌株の調製
（１）組換え菌株の調製
シークエンシングが正確な酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡのｃＤＮＡをテンプレートとし、それぞれＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ制限酵素切断部位を有するプライマーＰｓＡＰＡ＿ｆ及びＰｓＡＰＡ＿ｒを設計、合成した。プライマーＰｓＡＰＡ＿ｆ及びＰｓＡＰＡ＿ｒの配列はそれぞれ配列番号５及び配列番号６であり、このうち、プライマーＰｓＡＰＡ＿ｆ配列の下線部分はＥｃｏＲＩ制限酵素切断部位であり、プライマーＰｓＡＰＡ＿ｒ配列の下線部分はＮｏｔＩ制限酵素切断部位である。酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡのｃＤＮＡをテンプレートとし、ＰｓＡＰＡ＿ｆ及びＰｓＡＰＡ＿ｒをプライマーとしてＰＣＲ増幅を行い、その後ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩを利用してＰＣＲ産物を酵素切断し、増幅した酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡのｃＤＮＡ配列を得る。増幅した酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡのｃＤＮＡ配列をピキア酵母発現ベクターｐＰＩＣ９に接続し、組換え発現ベクターｐＰＩＣ９－ＰｓＡＰＡを得る。すなわち酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡのｃＤＮＡ配列を上記発現ベクターのシグナルペプチド配列の下流に挿入し、シグナルペプチドと正確なリーディングフレームを形成させ、ピキア酵母発現ベクターｐＰＩＣ９－ＰｓＡＰＡを構築し、その後大腸菌培地中の大腸菌コンピテントセルＴｒａｎｓ１中に形質転換する。陽性の形質転換体のＤＮＡシークエンシングを行い、シークエンシングが正確な形質転換体を大量の組換えプラスミドの調製に用いる。制限エンドヌクレアーゼＢｇｌＩＩを用いて発現プラスミドベクターのＤＮＡ配列を線形化し、ピキア酵母ＧＳ１１５コンピテントセルに電気的形質転換を行い、さらに３０℃の温度下で２～３日間培養する。ＭＤプレートで成長した形質転換体をピックアップし、さらなる発現実験を行うが、具体的な操作はピキア酵母発現操作のマニュアルを参考のこと。さらに同様の方式でＰｓＡＰＡシグナルペプチド配列を含むｃＤＮＡ配列の発現ベクターを構築して形質転換を行う。
（１）組換え菌株の調製
シークエンシングが正確な酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡのｃＤＮＡをテンプレートとし、それぞれＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ制限酵素切断部位を有するプライマーＰｓＡＰＡ＿ｆ及びＰｓＡＰＡ＿ｒを設計、合成した。プライマーＰｓＡＰＡ＿ｆ及びＰｓＡＰＡ＿ｒの配列はそれぞれ配列番号５及び配列番号６であり、このうち、プライマーＰｓＡＰＡ＿ｆ配列の下線部分はＥｃｏＲＩ制限酵素切断部位であり、プライマーＰｓＡＰＡ＿ｒ配列の下線部分はＮｏｔＩ制限酵素切断部位である。酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡのｃＤＮＡをテンプレートとし、ＰｓＡＰＡ＿ｆ及びＰｓＡＰＡ＿ｒをプライマーとしてＰＣＲ増幅を行い、その後ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩを利用してＰＣＲ産物を酵素切断し、増幅した酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡのｃＤＮＡ配列を得る。増幅した酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡのｃＤＮＡ配列をピキア酵母発現ベクターｐＰＩＣ９に接続し、組換え発現ベクターｐＰＩＣ９－ＰｓＡＰＡを得る。すなわち酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡのｃＤＮＡ配列を上記発現ベクターのシグナルペプチド配列の下流に挿入し、シグナルペプチドと正確なリーディングフレームを形成させ、ピキア酵母発現ベクターｐＰＩＣ９－ＰｓＡＰＡを構築し、その後大腸菌培地中の大腸菌コンピテントセルＴｒａｎｓ１中に形質転換する。陽性の形質転換体のＤＮＡシークエンシングを行い、シークエンシングが正確な形質転換体を大量の組換えプラスミドの調製に用いる。制限エンドヌクレアーゼＢｇｌＩＩを用いて発現プラスミドベクターのＤＮＡ配列を線形化し、ピキア酵母ＧＳ１１５コンピテントセルに電気的形質転換を行い、さらに３０℃の温度下で２～３日間培養する。ＭＤプレートで成長した形質転換体をピックアップし、さらなる発現実験を行うが、具体的な操作はピキア酵母発現操作のマニュアルを参考のこと。さらに同様の方式でＰｓＡＰＡシグナルペプチド配列を含むｃＤＮＡ配列の発現ベクターを構築して形質転換を行う。
【0024】
（２）高プロテアーゼ活性形質転換体のスクリーニング
滅菌した爪楊枝を用いて形質転換体が生長したＭＤプレートから複数のシングルコロニーをピックアップし、番号に応じて別のＭＤプレートに植菌する。ＭＤプレートを３０℃のインキュベータで１～２日間培養し、コロニーまで成長させる。番号に応じて、順番にＭＤプレートから形質転換体をピックアップし、３ｍＬのＢＭＧＹ培地を入れた遠沈管中にそれぞれ対応して接種し、温度３０℃、回転速度２２０ｒｐｍの条件下で４８ｈ振とう培養する。４８ｈ振とう培養した菌液を３０００×ｇで１５ｍｉｎ遠心分離して上清を除去し、遠沈管中に０．５％メタノールを含む１ｍＬのＢＭＭＹ培地を添加し、温度３０℃、回転速度２２０ｒｐｍの条件下で誘導培養を行う。４８ｈ誘導培養を行った後、３０００×ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を酵素活性の測定に用い、ここから高プロテアーゼ活性の形質転換体をスクリーニングするが、具体的な操作はピキア酵母発現操作マニュアルを参照のこと。
滅菌した爪楊枝を用いて形質転換体が生長したＭＤプレートから複数のシングルコロニーをピックアップし、番号に応じて別のＭＤプレートに植菌する。ＭＤプレートを３０℃のインキュベータで１～２日間培養し、コロニーまで成長させる。番号に応じて、順番にＭＤプレートから形質転換体をピックアップし、３ｍＬのＢＭＧＹ培地を入れた遠沈管中にそれぞれ対応して接種し、温度３０℃、回転速度２２０ｒｐｍの条件下で４８ｈ振とう培養する。４８ｈ振とう培養した菌液を３０００×ｇで１５ｍｉｎ遠心分離して上清を除去し、遠沈管中に０．５％メタノールを含む１ｍＬのＢＭＭＹ培地を添加し、温度３０℃、回転速度２２０ｒｐｍの条件下で誘導培養を行う。４８ｈ誘導培養を行った後、３０００×ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を酵素活性の測定に用い、ここから高プロテアーゼ活性の形質転換体をスクリーニングするが、具体的な操作はピキア酵母発現操作マニュアルを参照のこと。
【0025】
４、組換えプロテアーゼＰｓＡＰＡの調製
（１）組換え菌株ｐＰＩＣ９－ＰｓＡＰＡの発現
酵素活性が比較的高い形質転換体をスクリーニングし、３００ｍＬのＢＭＧＹ液体培地内に接種し、温度３０℃、回転速度２２０ｒｐｍの条件下で４８ｈ振とう培養する。振とう培養後に５０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を除去してから、菌体に０．５％メタノールを含む１００ｍＬのＢＭＭＹ液体培地を添加し、温度３０℃、回転速度２２０ｒｐｍの条件下で７２ｈ誘導培養を行う。誘導培養の期間、２４ｈごとに１回メタノール溶液を追加してメタノールの損失を補い、メタノール濃度を０．５％前後に保持する。７２ｈ誘導培養した後、１２０００×ｇで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清の発酵液を集めて酵素活性を測定し、さらにＳＤＳ－ＰＡＧＥタンパク質電気泳動により分析する。
（１）組換え菌株ｐＰＩＣ９－ＰｓＡＰＡの発現
酵素活性が比較的高い形質転換体をスクリーニングし、３００ｍＬのＢＭＧＹ液体培地内に接種し、温度３０℃、回転速度２２０ｒｐｍの条件下で４８ｈ振とう培養する。振とう培養後に５０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を除去してから、菌体に０．５％メタノールを含む１００ｍＬのＢＭＭＹ液体培地を添加し、温度３０℃、回転速度２２０ｒｐｍの条件下で７２ｈ誘導培養を行う。誘導培養の期間、２４ｈごとに１回メタノール溶液を追加してメタノールの損失を補い、メタノール濃度を０．５％前後に保持する。７２ｈ誘導培養した後、１２０００×ｇで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清の発酵液を集めて酵素活性を測定し、さらにＳＤＳ－ＰＡＧＥタンパク質電気泳動により分析する。
【0026】
（２）組換えプロテアーゼＰｓＡＰＡを精製して得る
発現した組換え菌株のプロテアーゼ上清液を振とうフラスコに収集して、１０ｋＤａメンブレンにより濃縮し、さらにこの培地を低塩緩衝液で置換し、その後１０ｋＤａ限外ろ過チューブでさらに濃縮する。濃縮物は一定倍数の組換えプロテアーゼＰｓＡＰＡに希釈することができ、さらにイオン交換クロマトグラフィで精製することにより、組換えプロテアーゼＰｓＡＰＡが得られる。具体的に、組換えプロテアーゼＰｓＡＰＡ濃縮液２．０ｍＬを、予め２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で平衡化したＨｉＴｒａｐＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ陰イオンカラムに供し、その後０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌで直線勾配溶出を行う。段階的に収集した溶出液の酵素活性を測定し、さらにタンパク濃度を測定する。
発現した組換え菌株のプロテアーゼ上清液を振とうフラスコに収集して、１０ｋＤａメンブレンにより濃縮し、さらにこの培地を低塩緩衝液で置換し、その後１０ｋＤａ限外ろ過チューブでさらに濃縮する。濃縮物は一定倍数の組換えプロテアーゼＰｓＡＰＡに希釈することができ、さらにイオン交換クロマトグラフィで精製することにより、組換えプロテアーゼＰｓＡＰＡが得られる。具体的に、組換えプロテアーゼＰｓＡＰＡ濃縮液２．０ｍＬを、予め２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で平衡化したＨｉＴｒａｐＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ陰イオンカラムに供し、その後０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌで直線勾配溶出を行う。段階的に収集した溶出液の酵素活性を測定し、さらにタンパク濃度を測定する。
【0027】
５、酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡの一部の性質を分析する
フォリンフェノール試薬による呈色法を用いて、本発明で調製した組換えプロテアーゼＰｓＡＰＡ、すなわち酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡの活性分析を行う。具体的な方法は以下の通りである。酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡを１ｍＬの反応系で１０ｍｉｎ反応させた後、１ｍＬのトリクロロ酢酸（０．４ｍｏｌ／Ｌ）を添加して反応を終了させる。このうち、１ｍＬの反応系のｐＨは３．０、温度は３０℃であり、さらに５００μＬの適当に希釈した酵素液、５００μＬの基質を含む。反応を終了させた後、該反応系を１２０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離し、５００μＬの上清液を吸い取り、２．５ｍＬの炭酸ナトリウム（０．４ｍｏｌ／Ｌ）を添加する。さらに５００μＬのフォリンフェノール試薬を添加し、４０℃の温度下で２０ｍｉｎ呈色させ、冷却後、紫外波長６８０ｎｍの条件下でＯＤ値を測定する。プロテアーゼ活性単位は、一定条件下、１分当たり基質のカゼインを分解して１μｍｏｌのチロシンを生成するのに必要な酵素量を１活性単位（Ｕ）と定義する。
フォリンフェノール試薬による呈色法を用いて、本発明で調製した組換えプロテアーゼＰｓＡＰＡ、すなわち酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡの活性分析を行う。具体的な方法は以下の通りである。酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡを１ｍＬの反応系で１０ｍｉｎ反応させた後、１ｍＬのトリクロロ酢酸（０．４ｍｏｌ／Ｌ）を添加して反応を終了させる。このうち、１ｍＬの反応系のｐＨは３．０、温度は３０℃であり、さらに５００μＬの適当に希釈した酵素液、５００μＬの基質を含む。反応を終了させた後、該反応系を１２０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離し、５００μＬの上清液を吸い取り、２．５ｍＬの炭酸ナトリウム（０．４ｍｏｌ／Ｌ）を添加する。さらに５００μＬのフォリンフェノール試薬を添加し、４０℃の温度下で２０ｍｉｎ呈色させ、冷却後、紫外波長６８０ｎｍの条件下でＯＤ値を測定する。プロテアーゼ活性単位は、一定条件下、１分当たり基質のカゼインを分解して１μｍｏｌのチロシンを生成するのに必要な酵素量を１活性単位（Ｕ）と定義する。
【0028】
（１）酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡの最適ｐＨ及びｐＨ安定性の測定
本発明で精製して得られた組換えプロテアーゼＰｓＡＰＡ、すなわち酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡについて、様々なｐＨ条件下で酵素反応を行い、その最適ｐＨ値を測定する。用いる緩衝液はｐＨが１．０～３．０のグリシン－塩酸緩衝液、ｐＨが３．０～８．０のクエン酸－リン酸水素二ナトリウム系緩衝液、及びｐＨが８．０～１０．０のＴｒｉｓ－ＨＣｌ系緩衝液である。精製して得られた酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡについて、様々なｐＨの緩衝体系において、温度３０℃の条件下で測定した最適ｐＨの結果は図１に示す通りである。つまり温度３０℃の条件下、酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡの最適ｐＨは３．０であり、ｐＨが２．５～３．５の範囲内で、該酵素はその７０％以上の酵素活性を維持することができる。
本発明で精製して得られた組換えプロテアーゼＰｓＡＰＡ、すなわち酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡについて、様々なｐＨ条件下で酵素反応を行い、その最適ｐＨ値を測定する。用いる緩衝液はｐＨが１．０～３．０のグリシン－塩酸緩衝液、ｐＨが３．０～８．０のクエン酸－リン酸水素二ナトリウム系緩衝液、及びｐＨが８．０～１０．０のＴｒｉｓ－ＨＣｌ系緩衝液である。精製して得られた酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡについて、様々なｐＨの緩衝体系において、温度３０℃の条件下で測定した最適ｐＨの結果は図１に示す通りである。つまり温度３０℃の条件下、酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡの最適ｐＨは３．０であり、ｐＨが２．５～３．５の範囲内で、該酵素はその７０％以上の酵素活性を維持することができる。
【0029】
酵素液を様々なｐＨ値の緩衝液中において１０℃下で６０ｍｉｎ処理してから、酵素活性を測定して酵素のｐＨ安定性を研究する。結果は図２に示す通りであり、結果は、酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡはｐＨが３．０～６．０の間で９０％以上の酵素活性を維持することができることを表し、該酵素が酸性条件下で良好なｐＨ安定性を有することを説明している。
【0030】
（２）酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡの最適反応温度及び熱安定性の測定
精製して得られた酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡについて、ｐＨ３．０の条件下で、様々な温度（５～４０℃）における酵素活性を測定する。図３に示す通りであり、つまり該酵素の最適反応温度は３０℃であり、さらに１０℃のときも依然として４０％以上の酵素活性を有する。精製して得られた酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡについて、それぞれ３０℃、３５℃及び４０℃の条件下で様々な時間処理してから、３０℃下で酵素活性の測定を行う。結果は図４に示す通りであり、ＰｓＡＰＡは４０℃条件下で３０ｍｉｎ処理すると、タンパクを完全に失活させることができる。まとめると、該プロテアーゼは低温条件下で高効率のタンパク質加水分解活性を有し、さらに比較的低い熱不活性化温度を有することがわかる。これは、新しく発明したプロテアーゼが食品、医薬などの分野で重要な応用的価値を有することを意味している。
精製して得られた酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡについて、ｐＨ３．０の条件下で、様々な温度（５～４０℃）における酵素活性を測定する。図３に示す通りであり、つまり該酵素の最適反応温度は３０℃であり、さらに１０℃のときも依然として４０％以上の酵素活性を有する。精製して得られた酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡについて、それぞれ３０℃、３５℃及び４０℃の条件下で様々な時間処理してから、３０℃下で酵素活性の測定を行う。結果は図４に示す通りであり、ＰｓＡＰＡは４０℃条件下で３０ｍｉｎ処理すると、タンパクを完全に失活させることができる。まとめると、該プロテアーゼは低温条件下で高効率のタンパク質加水分解活性を有し、さらに比較的低い熱不活性化温度を有することがわかる。これは、新しく発明したプロテアーゼが食品、医薬などの分野で重要な応用的価値を有することを意味している。
【0031】
（３）酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡの触媒特異性
酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡの触媒特性は、アスパラギン酸プロテアーゼファミリーのその他のプロテアーゼと基本的に一致し、主に基質分子中の疎水性アミノ酸残基又は芳香族アミノ酸残基間のペプチド結合、例えばＬｅｕ－Ｔｙｒ、Ｐｈｅ－Ｐｈｅ、Ｐｈｅ－Ｔｙｒなどを切断する。プロテアーゼの活性はＰｅｐｓｔａｔｉｎＡに特異的に阻害されることができ、ＰｅｐｓｔａｔｉｎＡは酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡの触媒ポケットに特異的に結合することができるが、切断はされず、これにより触媒残基の活性を阻害している。したがって、該種の阻害剤は基質類似阻害剤に属する。
酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡの触媒特性は、アスパラギン酸プロテアーゼファミリーのその他のプロテアーゼと基本的に一致し、主に基質分子中の疎水性アミノ酸残基又は芳香族アミノ酸残基間のペプチド結合、例えばＬｅｕ－Ｔｙｒ、Ｐｈｅ－Ｐｈｅ、Ｐｈｅ－Ｔｙｒなどを切断する。プロテアーゼの活性はＰｅｐｓｔａｔｉｎＡに特異的に阻害されることができ、ＰｅｐｓｔａｔｉｎＡは酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡの触媒ポケットに特異的に結合することができるが、切断はされず、これにより触媒残基の活性を阻害している。したがって、該種の阻害剤は基質類似阻害剤に属する。
【0032】
６、ウシ骨コラーゲンの抽出における酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡの応用
ウシ骨コラーゲンの抽出過程：
ウシの骨を破砕した後、０．１ＭＮａＯＨ溶液（ｖ／ｗ）を添加し、８ｈ撹拌して非コラーゲン成分を除去する。その後蒸留水で洗浄してから水を切り、さらに１０％ｎ－ヘキサンを添加し、１２ｈ撹拌して脂肪を除去する。脂肪を除去した後、溶液が中性になるまで蒸留水で繰り返し洗浄してから水を切り、水を切ったウシの骨が得られる。ｐＨ７．４、濃度０．２５ＭのＥＤＴＡ－Ｎａ２溶液を用いて、水を切ったウシの骨に対してカルシウム塩を除去する処理を行い、カルシウム塩を除去したウシの骨が得られる。カルシウム塩を除去したウシの骨を平均して２つに分け、このうちの１つのカルシウム塩を除去したウシの骨に５倍体積（ｖ／ｗ）の０．５Ｍ酢酸溶液及びウシの骨の質量の１．６％倍（ｗ／ｗ）のペプシンを添加し、もう１つには５倍体積（ｖ／ｗ）の０．５Ｍ酢酸溶液及びウシの骨の質量の１．６％倍（ｗ／ｗ）の酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡを添加し、２つの混合物が得られる。各混合物をいずれも２４ｈ撹拌して抽出し、その後２層のガーゼでろ過してウシ骨粗コラーゲンのろ液が得られる。各ろ液中にＮａＣｌを添加してＮａＣｌの終濃度を０．９Ｍ（０．０５ＭＴｒｉｓを含む。ｐＨ７．０）に調整し、撹拌して綿状の沈殿物が析出すると、ＮａＣｌを添加したろ液が得られる。各ＮａＣｌを添加したろ液を、温度４℃、回転速度１００００ｇの条件下で２０ｍｉｎ遠心分離し、沈殿、すなわち塩析後のウシ骨粗コラーゲンを収集する。各塩析後のウシ骨粗コラーゲンを０．５Ｍ酢酸溶液に溶解し、順番に０．１ｍｏｌ／Ｌの酢酸及び超純水を用いてそれぞれ２４ｈ透析し、期間中それぞれ３回液を交換する。得られた透析物を－２０℃の温度下で凍結乾燥させると、ペプシン抽出したウシ骨コラーゲン（ＰＳＣ）及び酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡで処理したウシ骨コラーゲン（ＥＳＣ）が得られる。その後ＰＳＣ及びＥＳＣの抽出率を計算し、さらにＳＤＳ－ＰＡＧＥタンパク電気泳動により分析する。結果はそれぞれ図５及び図６に示す。
ウシ骨コラーゲンの抽出過程：
ウシの骨を破砕した後、０．１ＭＮａＯＨ溶液（ｖ／ｗ）を添加し、８ｈ撹拌して非コラーゲン成分を除去する。その後蒸留水で洗浄してから水を切り、さらに１０％ｎ－ヘキサンを添加し、１２ｈ撹拌して脂肪を除去する。脂肪を除去した後、溶液が中性になるまで蒸留水で繰り返し洗浄してから水を切り、水を切ったウシの骨が得られる。ｐＨ７．４、濃度０．２５ＭのＥＤＴＡ－Ｎａ２溶液を用いて、水を切ったウシの骨に対してカルシウム塩を除去する処理を行い、カルシウム塩を除去したウシの骨が得られる。カルシウム塩を除去したウシの骨を平均して２つに分け、このうちの１つのカルシウム塩を除去したウシの骨に５倍体積（ｖ／ｗ）の０．５Ｍ酢酸溶液及びウシの骨の質量の１．６％倍（ｗ／ｗ）のペプシンを添加し、もう１つには５倍体積（ｖ／ｗ）の０．５Ｍ酢酸溶液及びウシの骨の質量の１．６％倍（ｗ／ｗ）の酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡを添加し、２つの混合物が得られる。各混合物をいずれも２４ｈ撹拌して抽出し、その後２層のガーゼでろ過してウシ骨粗コラーゲンのろ液が得られる。各ろ液中にＮａＣｌを添加してＮａＣｌの終濃度を０．９Ｍ（０．０５ＭＴｒｉｓを含む。ｐＨ７．０）に調整し、撹拌して綿状の沈殿物が析出すると、ＮａＣｌを添加したろ液が得られる。各ＮａＣｌを添加したろ液を、温度４℃、回転速度１００００ｇの条件下で２０ｍｉｎ遠心分離し、沈殿、すなわち塩析後のウシ骨粗コラーゲンを収集する。各塩析後のウシ骨粗コラーゲンを０．５Ｍ酢酸溶液に溶解し、順番に０．１ｍｏｌ／Ｌの酢酸及び超純水を用いてそれぞれ２４ｈ透析し、期間中それぞれ３回液を交換する。得られた透析物を－２０℃の温度下で凍結乾燥させると、ペプシン抽出したウシ骨コラーゲン（ＰＳＣ）及び酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡで処理したウシ骨コラーゲン（ＥＳＣ）が得られる。その後ＰＳＣ及びＥＳＣの抽出率を計算し、さらにＳＤＳ－ＰＡＧＥタンパク電気泳動により分析する。結果はそれぞれ図５及び図６に示す。
【0033】
図５に示すように、ＰＳＣの収率は８．３４±０．２７しかなく、ＥＳＣの収率は１１．９３±０．５３に達する。ペプシンと比較して、酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡ処理は骨コラーゲンの抽出率を明らかに高めた。骨コラーゲンのテロペプチドは分子架橋が容易に生じ、その酸性条件下での溶解度を低下させ、骨コラーゲンの抽出に不利である。酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡ処理はコラーゲンのテロペプチドの酵素分解を触媒することができ、コラーゲンの酸性条件下における溶解度を高め、コラーゲンの収率を高める。ＳＤＳ－ＰＡＧＥタンパク電気泳動による分析は図６に示す通りである。酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡで抽出したコラーゲンのバンドはペプシン抽出したコラーゲンと一致する。これは、酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡが抽出液中のコラーゲン濃度を高めることができるが、その全体構造は破壊しないことを表している。まとめると、酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡは骨コラーゲンの抽出効率を顕著に高めることができ、骨コラーゲンの収率を高める。
【0034】
本発明の実施案を上記のように開示したが、本発明は明細書及び実施方式に列記した利用に限定されず、各種本発明に適した分野に完全に適用することができ、当業者は、他の修正を容易に実現することができる。従って、特許請求の範囲及び同等の範囲による限定を逸脱しない一般的な概念下で、本発明は特定の細部並びにここで提示及び記載した凡例に限定されない。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】