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特許7009463細胞、組織、および器官の生存能および機能を向上させるための試薬、組成物、および方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-01-14
(45)【発行日】2022-01-25
(54)【発明の名称】細胞、組織、および器官の生存能および機能を向上させるための試薬、組成物、および方法
(51)【国際特許分類】
A61K 31/165 20060101AFI20220118BHJP
A61K 31/192 20060101ALI20220118BHJP
A61K 31/05 20060101ALI20220118BHJP
A61K 31/12 20060101ALI20220118BHJP
A61K 31/353 20060101ALI20220118BHJP
A61K 31/366 20060101ALI20220118BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20220118BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220118BHJP
C12N 5/02 20060101ALI20220118BHJP
A61L 27/38 20060101ALI20220118BHJP
A61L 27/54 20060101ALI20220118BHJP
【ＦＩ】
A61K31/165
A61K31/192
A61K31/05
A61K31/12
A61K31/353
A61K31/366
A61K35/12
A61P43/00 105
A61P43/00 121
C12N5/02
A61L27/38 300
A61L27/54
【請求項の数】
11
(21)【出願番号】P 2019518343
(86)(22)【出願日】2017-06-15
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2019-08-29
(86)【国際出願番号】 CA2017000151
(87)【国際公開番号】W WO2017214709
(87)【国際公開日】2017-12-21
【審査請求日】2020-06-12
(31)【優先権主張番号】62/350,258
(32)【優先日】2016-06-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】518445654
【氏名又は名称】シャント・デル・サルキシアン
(73)【特許権者】
【識別番号】518445665
【氏名又は名称】ニコラ・ノワジュー
(73)【特許権者】
【識別番号】507013855
【氏名又は名称】ヴァル－シュム・エス・ウ・セ
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】シャント・デル・サルキシアン
(72)【発明者】
【氏名】ニコラ・ノワジュー
【審査官】小川 知宏
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１１／０２１８１４３（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１１／０３１１５０８（ＵＳ，Ａ１）
【文献】British Journal of Pharmacology，2014年，171，5265-5279
【文献】Canadian Journal of Cardiology，2012年，28(5):Suppl，S297，doi:10.1016/j.cjca.2012.07.485
【文献】The Journal of Biological Chemistry，2004年，279(53)，56053-56060
【文献】ACS Chemical Biology，2012年，7，928-937
【文献】Journal of the American Chemical Society，2011年，133，19634-19637
【文献】Trends in Pharmacological Sciences，2015年，36(1)，6-14
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３１／００ － ３１／８０
Ａ６１Ｋ ３５／００ － ３５／７６８
Ａ６１Ｐ １／００ － ４３／００
Ａ６１Ｌ ２７／３８
Ｃ１２Ｎ ５／０２
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ａ）アナログ１、アナログ２、アナログ３、アナログ４、及びジヒドロセラストロールからなる群から選択される１種以上の化合物【化1】
ｂ）ｔｅｒｔ－ブチルヒドロキノン（ｔＢＨＱ）、ビス（２－ヒドロキシベンジリデン）アセトン（２ＨＢＡ）、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）、カルノソール、及びクルクミンから成る群から選択される１種以上の補助剤と、
ｃ）担体または薬学的に許容される担体と、
を含む、
ＶＥＧＦ、ＳＤＦ１、ＨＧＦ、ＨＯ－１、ＨＳＰ、及びＦＧＦ２からなる群から選択される１種以上の遺伝子の発現を促進し、又はＴＮＦαの発現をダウンレギュレートするための、組成物または医薬組成物。
【請求項2】
前記化合物が【化2】
【請求項3】
低酸素誘導細胞死に対する生存能、または低酸素／再酸素化ストレスに対する耐性を増加させるようにまたは保存するように、細胞、細胞調製物、組織、移植片、または器官の状態をモジュレートするｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ方法であって、前記細胞、細胞調製物、組織、移植片、または器官と、
ａ）請求項１又は２に記載の組成物とを接触させることを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ方法。
【請求項4】
低酸素誘導細胞死に対する生存能、または低酸素／再酸素化ストレスに対する耐性を増加させるようにまたは保存するように、細胞、細胞調製物、組織、移植片、または器官の状態をモジュレートするｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ方法であって、
前記細胞、細胞調製物、組織、移植片、または器官と、
ｂ）アナログ１、アナログ２、アナログ３、アナログ４、およびジヒドロセラストロールからなる群から選択される１種以上の化合物、その薬学的に許容可能な塩、立体異性体、もしくは互変異性体と、ｔＢＨＱ、２ＨＢＡ、ＥＧＣＧ、カルノソール、およびクルクミンから成る群から選択される補助剤と、
を含む組合せ物とを接触させることを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ方法。
【請求項5】
低酸素誘導細胞死に対する生存能、または低酸素／再酸素化ストレスに対する耐性を増加させるようにまたは保存するように、細胞、細胞調製物、組織、移植片、または器官の状態をモジュレートするｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ方法であって、
前記細胞、細胞調製物、組織、移植片、または器官と、
ｃ）アナログ１、アナログ２、アナログ３、アナログ４およびジヒドロセラストロールからなる群から選択される１種以上の化合物、その薬学的に許容可能な塩、立体異性体、もしくは互変異性体またはそれらの組合せに接触させた個別細胞調製物、及び、ｔＢＨＱ、２ＨＢＡ、ＥＧＣＧ、カルノソール、及びクルクミンから成る群から選択される補助剤と
を接触させることを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ方法。
【請求項6】
低酸素誘導細胞死に対する生存能、または低酸素／再酸素化ストレスに対する耐性を増加させるようにまたは保存するように、細胞、細胞調製物、組織、移植片、または器官の状態をモジュレートするｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ方法であって、
前記細胞、細胞調製物、組織、移植片、または器官と、
ｄ）アナログ１、アナログ２、アナログ３、アナログ４、ジヒドロセラストロールからなる群から選択される１種以上の化合物、その薬学的に許容可能な塩、立体異性体、もしくは互変異性体またはそれらの組合せに接触させた個別細胞調製物のセクレトーム、及び、ｔＢＨＱ、２ＨＢＡ、ＥＧＣＧ、カルノソール、及びクルクミンから成る群から選択される補助剤と
を接触させることを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ方法。
【請求項7】
前記細胞調製物が、細胞または幹細胞を含み、細胞または幹細胞が、間葉幹細胞、ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ１３３＋細胞もしくは幹細胞、多能性細胞、前駆細胞、もしくは成人分化細胞である、または、細胞調製物、組織、もしくは器官が、哺乳動物における自己移植若しくは同種異系移植予定である、請求項２から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記方法が、凍結前またはコンディショニング、凍結／解凍サイクル、細胞のカプセル化、培養、ならびに精製時に、細胞においてｉｎ ｖｉｔｒｏで実施される、請求項２から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
低酸素/再酸素化ストレス、障害、疾患または損傷から細胞、組織、移植片、または器官を保護する、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ方法であって、前記方法が、前記細胞、組織、移植片、または器官と、請求項１または２に記載の組成物、または前記組成物に接触させた細胞調製物のセクレトームと、を接触させることを含む、方法。
【請求項10】
低酸素/再酸素化ストレスまたは損傷から細胞、組織、移植片、もしくは器官を保護する、または、幹細胞、組織、移植片、または器官の移植時の細胞損傷を低減するｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ方法であって、前記細胞、幹細胞、組織、移植片、または器官と、請求項１または２に記載の組成物、ならびに、前記組成物に接触させた細胞調製物を含む細胞培地とを接触させる工程を含み、前記方法が、幹細胞、組織、移植片、または器官の移植時の細胞損傷を低減するためのものである場合、前記細胞培地は、移植の前、および/もしくは移植中および/もしくは移植後に前記組成物でコンディショニングされている、
方法。
【請求項11】
前記細胞が、幹細胞、分化細胞、前駆細胞、または成体細胞であり、前記細胞、組織、移植片、または器官が、使用前に少なくとも５～１８０分間の継続時間にわたり、前記化合物に接触され、前記化合物が１０－６Ｍ～１０－１０Ｍの濃度で使用され、前記組成物が１種以上の補助剤をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年６月１５日出願の米国仮特許出願第６２／３５０，２５８号明細書（その全内容が参照により本明細書に組み込まれる）に基づく利益を主張する。
本出願は、２０１６年６月１５日出願の米国仮特許出願第６２／３５０，２５８号明細書（その全内容が参照により本明細書に組み込まれる）に基づく利益を主張する。
【0002】
本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏで細胞、細胞調製物、組織、移植片、または器官の状態をモジュレートするための試薬、組成物、および方法を提供する。本発明はまた、細胞の生存能および／もしくは機能を向上させるための、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、もしくはｉｎ ｖｉｖｏで細胞、組織、移植片、もしくは器官を各種損傷から保護するための、試薬、組成物、および方法に関する。試薬および組成物は、セラストロールやセラストロールアナログなどのＨＳＰ９０補因子阻害剤を単独または補助剤（たとえば、ＮＲＦ－２アクチベーター、抗酸化剤など）との組合せのいずれかで含みうる。
【0003】
本発明はとくに、虚血傷害および関連ストレッサー（低酸素症、酸化ストレス、炎症、ショックなど）の治療または予防に関する。本発明はまたとくに、細胞ベースおよび組織ベースの療法（たとえば、再生医学、移植片、移植など）に関する。
【背景技術】
【0004】
過去何十年もの間の心臓学の多くの技術的進歩にもかかわらず、虚血性心疾患は、依然として世界的に罹患および死亡の主な原因となっている。心筋梗塞（ＭＩ）後、虚血心の再灌流を行うと、フリーラジカル産生の大幅増加、炎症細胞浸潤、および局所ｐＨの変化が原因でさらなるストレスが誘発される。心保護手段を所定の位置に配置すれば、最終梗塞サイズを有意に低減可能である。機械技術（冠脈クランピングによる虚血／再灌流（Ｉ／Ｒ）の繰返しショートサイクル）をはじめとする心臓のプレおよびポストコンディショニングが研究されてきたが、最も簡単かつより臨床移行可能な技術は薬理学的コンディショニングであろう。こうした状況では、心保護は、ミトコンドリア透過性遷移孔（ｍＰＴＰ）開口の阻害および酸化ストレスの低下によりＩ／Ｒ誘導細胞死を低減して梗塞領域の低減および心室機能の保持をもたらすことを含むであろう。
【0005】
本出願人らは、Ｈ９ｃ２ラット心筋芽細胞の低酸素培養物およびＭＩのラットモデルでセラストロール（植物トリテルペン）の効果を調べ、エコーカルジオグラフィーおよび組織学的解析により治療有効性を評価した。本出願人は、Ｈ９ｃ２細胞においてセラストロールが何分か以内に反応性酸素種（ＲＯＳ）形成をトリガーし、転写因子である熱ショック因子１（ＨＳＦ１）の核移行を誘導して熱ショック反応（ＨＳＲ）を引き起こすことにより、ＨＳＰ７０さらにはＨＳＰ３２（ヘムオキシゲナーゼ－１、ＨＯ－１）をはじめとする熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）の発現の増加をもたらすことを発見した。セラストロールは、低酸素ストレス下でＨ９ｃ２の生存性を向上させた。またセラストロールにより誘導された主要なエフェクターとしてのＨＳＦ１およびＨＯ－１は、細胞および組織の保護を促進することが機能解析から明らかにされた。ラット虚血心筋において、セラストロール治療を毎日行ったところ、心機能が向上し、かつ１４日目に有害な左心室リモデリングが低減した。セラストロールは、心保護ＨＯ－１の発現をトリガーし、かつ線維症および梗塞サイズを抑制した。梗塞周囲領域では、セラストロールは、筋線維芽細胞およびマクロファージの浸潤を低減するとともに、ＴＧＦ－βおよびコラーゲンのアップレギュレーションを減衰させた。
【0006】
本出願人らは、セラストロール治療が、心筋細胞の生存、傷害および有害なリモデリングの低減を促進して心機能を保持する、ことを初めて報告し、かつセラストロールが、心筋梗塞の治療に有益な影響を及ぼしうる虚血コンディショニングをミミックする新規な強力薬理学的心保護剤になりうる、と結論した（非特許文献１）。
【0007】
本出願人はまた、傷害心筋を再増殖するためにｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｅｘ ｖｉｖｏで幹細胞保護に及ぼすセラストロールの影響を調べた。実際には、各種疾患状態に対する組織工学および再生医学のための新規な治療法として幹細胞移植が提案されてきた。幹細胞ベースの療法は、虚血障害および虚血疾患の前臨床動物モデルで探究され、脳卒中、ＭＩ、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）などの虚血障害の早期臨床試験に使用されてきた。
【0008】
炎症は、ＭＩ後に非常に急速に発生し、かつ常在細胞および循環白血球による高レベルのＲＯＳおよび壊死細胞デブリの検出により引き起こされる。これらの細胞は、傷害組織に向かって移動し、さらにＲＯＳ、タンパク質分解酵素、炎症誘発性および細胞傷害性の拡散性因子を放出し、かつ壊死細胞の貪食および細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分の破壊に関与する。障害細胞組織およびデブリの排除に重要であるが、過剰または慢性になる炎症は、梗塞拡大、有害なリモデリング、および患者のアウトカム不良を招く（非特許文献２）、（非特許文献３）、（非特許文献４）、（非特許文献５）。
【0009】
心筋は一般に非常に限られた再生能しか有していないので、心筋細胞死により空いた空間は、心機能に悪影響を及ぼす線維性瘢痕により置き換えられる。したがって、幹細胞移植などの細胞ベースの治療戦略を用いた心筋再生の促進に関する研究に高い関心が寄せられている。これまでのところ、幹細胞の好影響のほとんどは、病変部位内における幹細胞の分化でも取込みでも細胞融合でもなく既存の組織へのパラクリン作用から生じるように思われる。移植細胞のパラクリンシグナリングは、アポトーシス、炎症、および線維症を低減することにより作用しうるとともに、血管新生および他の修復プロセスの発生を刺激しうる（非特許文献２）、（非特許文献３）。
【0010】
幹細胞療法は、虚血心の治癒を改善し、傷害心筋を再増殖し、かつ心機能を回復する可能性を有する。それは従来の治療の限界を超える治療解決策を提供し、治癒剤を送達することが見込まれる。幹細胞療法に対する非常に大きな期待およびその可能性は十分に理解されており、動物モデルおよび臨床試験、たとえば、心不全治療のための自己ＣＤ１３３＋幹細胞移植片のＩＭＰＡＣＴ－ＣＡＢＧおよびＣＯＭＰＡＲＥ－ＡＭＩでは、実現可能性および安全性が実証されている（非特許文献６）、（非特許文献７）。とはいえ、心血管疾患に対する細胞療法を含む最近の試験では、一貫性のないデータを有するさまざまな結果が得られており、幹細胞の治療有効性を担う機序に関する未解決の問題への関心が再喚起されている。実際には、細胞療法の臨床有効性を低減する最も大きな障害は、とくに虚血組織の移植細胞の生存能および保持の不良である。細胞型にかかわらず、移植の何日か後の虚血心筋で生存しているのは移植細胞の１％未満である（非特許文献８）、（非特許文献９）。
【0011】
本出願人は、セラストロールが迅速かつ強力に内因性細胞保護性を活性化するとともに虚血移植片マイクロ環境をミミックする低酸素条件および酸化条件に対する幹細胞の生存性を向上させることを発見した。本出願人は、細胞の保護および生存に関与するエフェクターおよび重要遺伝子：Ｈｉｆ１ａ、ＨＯ－１（ＨＳＰ３２）、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ７０、およびＶＥＧＦのアップレギュレーションを伴うＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路およびｐ４４／４２ＭＡＰＫ（ＥＲＫ１／２）経路の劇的かつ迅速な活性化、さらには細胞質から核へのＨｓｆ１移行の増加を観察した。本出願人は、セラストロールによる幹細胞のプレコンディショニングが虚血性心血管疾患などの臨床用途の安全かつ効率的な療法でありうると結論した（非特許文献１０）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0012】
【文献】Ｓ．Ｄｅｒ Ｓａｒｋｉｓｓｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２０１４，１７１：５２６５－５２７９
【文献】Ｓｔｅｆｆｅｎｓ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ，（２００９），１０２（２），２４０－２４７．
【文献】Ｊｉａｎｇ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，（２０１０），３（４），４１０－４１６．
【文献】Ｓｕｎ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，（２００９），８１（３），４８２－４９０．
【文献】Ｄｏｂａｃｚｅｗｓｋｉ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ，（２０１０），４８（３），５０４－５１１．
【文献】Ｆｏｒｃｉｌｌｏ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｃａｎａｄｉａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ．２０１３；２９：４４１－７．
【文献】Ｍａｎｓｏｕｒ Ｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｒｅｓ．２０１１；２０１１：３８５１２４．
【文献】Ｐａｇａｎｉ ＦＤ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ．２００３；４１：８７９－８８．
【文献】Ｔｏｍａ Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２００２；１０５：９３－８．
【文献】Ｄｅｒ Ｓａｒｋｉｓｓｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｅ－Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ ｏｆ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｗｉｔｈ Ｃｅｌａｓｔｒｏｌ ｔｏ Ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅｉｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ２０１１；１２４：Ａ１４１９８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0013】
それにもかかわらず、虚血部位に化合物または組成物を投与することによりまたはプレコンディショニングされた細胞を介してｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏの状況で細胞の生存性および機能を向上させるための強力な化合物、組成物、および方法の重要な必要性が依然として存在する。
【0014】
本明細書は、いくつかの文書（その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照する。
【課題を解決するための手段】
【0015】
本発明は、その第１の態様では、熱ショック反応および抗酸化反応を活性化する１種以上の化合物、熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）阻害およびケルヒ様ＥＣＨ関連タンパク質１（ＫＥＡＰ－１）阻害を活性化する１種以上の化合物、熱ショック因子タンパク質１（ＨＳＦ１）経路および核因子（エリスロイド由来２）様２（ＮＲＦ２）経路を活性化する１種以上の化合物、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）および抗酸化剤エフェクターを活性化する１種以上の化合物を含みうる組成物または医薬組成物を提供する。
【0016】
本発明は、より特定の態様では、天然トリテルペン、合成トリテルペンアナログ、および／または補助剤からなる群から選択される１種以上の化合物を含みうる組成物または医薬組成物を提供する。
【0017】
本発明を遂行するために使用しうる化合物としては、たとえば、セラストロール、セラストロールアナログ、ウィタノライドファミリーの化合物もしくはそのアナログ、リモノイドファミリーの化合物（たとえばゲデュニン）もしくはそのアナログ、バルドキソロン／ＣＤＤＯ化合物もしくはそのアナログ（たとえばＣＤＤＯ－メチル）、クルクミノイド（たとえばクルクミン）もしくはそのアナログ、カルノソールもしくはそのアナログ、ｔｅｒｔ－ブチルヒドロキノン（ｔＢＨＱ）もしくはそのアナログ、ビス（２－ヒドロキシベンジリデン）アセトン（２ＨＢＡ）もしくはそのアナログ、アセチレン系三環式ビス（シアノエノン）（ＴＢＥ－３１）もしくはそのアナログ、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）もしくはそのアナログ、ガンボギン酸もしくはそのアナログ、ノボビオシンもしくはそのアナログ、ロニダミンもしくはそのアナログ、アンドログラホリドもしくはそのアナログ、エダラボンもしくはそのアナログ、アスコルビン酸もしくはそのアナログ、またはそれらの任意の組合せが挙げられうる。
【0018】
より特定的には、本発明は、式Ｉ
（式中、
Ｒ１は、たとえば、－Ｈ、－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－ＣＮ、－アリール、アルキル、イミダゾール、－ＯＲａ、－ＮＲｂＲｃ、－（ＣＨ２）ｎＯＨ、および－（ＣＨ２）ｎＮＨ２からなる群から選択しうるし、
Ｒａは、Ｈ、１～６個の炭素原子の置換または非置換の直線状アルキル基、３～６個の炭素原子の置換または非置換の分岐状アルキル基、および保護基からなる群から選択しうるし、
ＲｂおよびＲｃは、－Ｈ、－ＯＨ、－ＯＣＨ３、１～６個の炭素原子の置換（たとえば－ＣＨ２ＣＨ２ＯＨなど）または非置換の直線状アルキル基、３～６個の炭素原子の置換または非置換の分岐状アルキル基、および保護基からなる群から独立して選択しうるし、
ｎは、０、１、２、３、または４でありうるし、
Ｒ２およびＲ３は、－Ｈ、－ＯＲｄ、＝Ｏ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、および－Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘからなる群から独立して選択しうるし、
Ｒｄは、Ｈまたは１～３個の炭素原子の低級アルキル基でありうるし、
Ｒｘは、Ｈまたは１～３個の炭素原子の低級アルキル基でありうるし、
Ｒ４は、－Ｈ、－ＯＨ、および１～３個の炭素原子の低級アルキル基からなる群から選択しうる）
の１種以上の化合物を用いて行いうる。
【化1】
Ｒ１は、たとえば、－Ｈ、－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－ＣＮ、－アリール、アルキル、イミダゾール、－ＯＲａ、－ＮＲｂＲｃ、－（ＣＨ２）ｎＯＨ、および－（ＣＨ２）ｎＮＨ２からなる群から選択しうるし、
Ｒａは、Ｈ、１～６個の炭素原子の置換または非置換の直線状アルキル基、３～６個の炭素原子の置換または非置換の分岐状アルキル基、および保護基からなる群から選択しうるし、
ＲｂおよびＲｃは、－Ｈ、－ＯＨ、－ＯＣＨ３、１～６個の炭素原子の置換（たとえば－ＣＨ２ＣＨ２ＯＨなど）または非置換の直線状アルキル基、３～６個の炭素原子の置換または非置換の分岐状アルキル基、および保護基からなる群から独立して選択しうるし、
ｎは、０、１、２、３、または４でありうるし、
Ｒ２およびＲ３は、－Ｈ、－ＯＲｄ、＝Ｏ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、および－Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘからなる群から独立して選択しうるし、
Ｒｄは、Ｈまたは１～３個の炭素原子の低級アルキル基でありうるし、
Ｒｘは、Ｈまたは１～３個の炭素原子の低級アルキル基でありうるし、
Ｒ４は、－Ｈ、－ＯＨ、および１～３個の炭素原子の低級アルキル基からなる群から選択しうる）
の１種以上の化合物を用いて行いうる。
【0019】
本発明によれば、化合物としては、たとえば、式Ｉａ
（式中、
Ｒ１は、たとえば、－Ｈ、－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－ＣＮ、－アリール、アルキル、イミダゾール、－ＯＲａ、－ＮＲｂＲｃ、－（ＣＨ２）ｎＯＨ、および－（ＣＨ２）ｎＮＨ２からなる群から選択しうるし、
Ｒａは、Ｈ、１～６個の炭素原子の置換または非置換の直線状アルキル基、３～６個の炭素原子の置換または非置換の分岐状アルキル基、および保護基からなる群から選択しうるし、
ＲｂおよびＲｃは、－Ｈ、－ＯＨ、－ＯＣＨ３、１～６個の炭素原子の置換または非置換の直線状アルキル基、３～６個の炭素原子の置換または非置換の分岐状アルキル基、および保護基からなる群から独立して選択しうるし、
ｎは、０、１、２、３、または４でありうるし、
Ｒ２およびＲ３は、－Ｈ、－ＯＲｄ、＝Ｏ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、および－Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘからなる群から独立して選択しうるし、
Ｒｄは、Ｈまたは１～３個の炭素原子の低級アルキル基でありうるし、
Ｒｘは、Ｈまたは１～３個の炭素原子の低級アルキル基でありうるし、
Ｒ４は、－Ｈ、－ＯＨ、および１～３個の炭素原子の低級アルキル基からなる群から選択しうる）
の化合物、その薬学的に許容可能な塩、立体異性体、互変異性体、またはプロドラッグが挙げられうる。
【化2】
Ｒ１は、たとえば、－Ｈ、－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－ＣＮ、－アリール、アルキル、イミダゾール、－ＯＲａ、－ＮＲｂＲｃ、－（ＣＨ２）ｎＯＨ、および－（ＣＨ２）ｎＮＨ２からなる群から選択しうるし、
Ｒａは、Ｈ、１～６個の炭素原子の置換または非置換の直線状アルキル基、３～６個の炭素原子の置換または非置換の分岐状アルキル基、および保護基からなる群から選択しうるし、
ＲｂおよびＲｃは、－Ｈ、－ＯＨ、－ＯＣＨ３、１～６個の炭素原子の置換または非置換の直線状アルキル基、３～６個の炭素原子の置換または非置換の分岐状アルキル基、および保護基からなる群から独立して選択しうるし、
ｎは、０、１、２、３、または４でありうるし、
Ｒ２およびＲ３は、－Ｈ、－ＯＲｄ、＝Ｏ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、および－Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘからなる群から独立して選択しうるし、
Ｒｄは、Ｈまたは１～３個の炭素原子の低級アルキル基でありうるし、
Ｒｘは、Ｈまたは１～３個の炭素原子の低級アルキル基でありうるし、
Ｒ４は、－Ｈ、－ＯＨ、および１～３個の炭素原子の低級アルキル基からなる群から選択しうる）
の化合物、その薬学的に許容可能な塩、立体異性体、互変異性体、またはプロドラッグが挙げられうる。
【0020】
本発明によれば、式ＩまたはＩａの化合物は、Ｒ１が、より特定的には、－ＯＲａおよび－ＮＲｂＲｃからなる群から選択しうる、Ｒａが、Ｈ、１～６個の炭素原子の置換もしくは非置換の直線状アルキル基、３～６個の炭素原子の置換もしくは非置換の分岐状アルキル基、および保護基からなる群から選択しうる、ＲｂおよびＲｃが、－Ｈ、－ＯＨ、－ＯＣＨ３、１～６個の炭素原子の置換もしくは非置換の直線状アルキル基、３～６個の炭素原子の置換もしくは非置換の分岐状アルキル基、および保護基からなる群から独立して選択しうる、Ｒ２およびＲ３が、－Ｈ、－ＯＲｄ、および＝Ｏからなる群から独立して選択しうる、Ｒｄが、Ｈもしくは１～３個の炭素原子の低級アルキル基でありうる、ならびに／またはＲ４が、－ＨもしくはＣＨ３でありうる、ものを包含する。
【0021】
さらに、本発明によれば、式ＩまたはＩａの化合物は、Ｒ１が、より特定的には、－ＯＲａおよび－ＮＲｂＲｃからなる群から選択しうる、Ｒａが、Ｈおよび１～３個の炭素原子の低級アルキル基からなる群から選択しうる、ＲｂおよびＲｃが、－Ｈ、－ＯＨ、および－ＣＨ２ＣＨ２ＯＨからなる群から独立して選択しうる、Ｒ２およびＲ３が、－Ｈ、－ＯＨ、－ＯＣＨ３、および＝Ｏからなる群から独立して選択しうる、ならびに／またはＲ４が、－ＨもしくはＣＨ３でありうる、ものを包含する。
【0022】
そのうえさらに、本発明によれば、式ＩまたはＩａの化合物は、Ｒ１が、より特定的には、－ＯＲａおよび－ＮＲｂＲｃからなる群から選択しうる、Ｒａが、Ｈおよび－ＣＨ３からなる群から選択しうる、ＲｂおよびＲｃが、－Ｈ、－ＯＨ、および－ＣＨ２ＣＨ２ＯＨからなる群から独立して選択しうる、Ｒ２およびＲ３が、－ＯＨおよび＝Ｏからなる群から独立して選択しうる、ならびに／またはＲ４が－Ｈでありうる、ものを包含する。
【0023】
本発明に包含される化合物の例示的な実施形態は、Ｒ１がＮＲｂＲｃである式ＩまたはＩａのものを含む。
【0024】
化合物の例示的な実施形態は、図２３に提供され、たとえば、アナログ１、アナログ２、アナログ３、アナログ４、アナログ５、アナログ６、またはジヒドロセラストロールとして同定されるセラストロールアナログを含みうる。
【0025】
本発明によりとくに企図されるセラストロールアナログとしては、アナログ１、アナログ２、アナログ３、アナログ４、およびジヒドロセラストロールが挙げられる。より特定的には、アナログ１が企図される。
【0026】
いくつかの場合には、セラストロールはとくに、本発明のいくつかの態様から除外しうる。たとえば、心虚血治療または幹細胞保護の方法におけるセラストロール単独の組成物または単独化合物としてのその使用は、文献に開示されている（Ｄｅｒ Ｓａｒｋｉｓｓｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｅ－Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ ｏｆ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｗｉｔｈ Ｃｅｌａｓｔｒｏｌ ｔｏ Ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅｉｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ２０１１；１２４：Ａ１４１９８、Ｓ．Ｄｅｒ Ｓａｒｋｉｓｓｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２０１４，１７１：５２６５－５２７９）。
【0027】
したがって、組成物、方法、および使用がセラストロールを含む場合、それは、好ましくは、セラストロール以外の式Ｉもしくは式Ｉａの化合物でありうるか、あるいは他の化合物、すなわち、式Ｉもしくは式Ｉａの化合物および／または補助剤との組合せで使用しうる。
【0028】
代替的に、本発明は、セラストロールの対応するＲ１、Ｒ２、Ｒ３、もしくはＲ４基のものとは異なる本明細書に定義されるＲ１、Ｒ２、Ｒ３、もしくはＲ４基を有する式Ｉ、式Ｉａの化合物、その薬学的に許容可能な塩、立体異性体、互変異性体、またはプロドラッグを用いて行いうる。
【0029】
本発明の実施形態によれば、補助剤は、たとえば、２ＨＢＡ、アンドログラホリド、アスコルビン酸、カフェストール、カルノソールバルドキソロン－イミダゾール（ＣＤＤＯ－ｉｍ）、カルコン、Ｎ６－［２－［［４－（２，４－ジクロロフェニル）－５－（１Ｈ－イミダゾール－２－イル）－２－ピリミジニル］アミノ］エチル］－３－ニトロ－２，６－ピリジンジアミン（ＣＨＩＲ９８０１４）、コングロバチン、クルクミン、シクロアストラゲノール、１，２－ジチオール－３－チオン（Ｄ３Ｔ）、ドラマピモド、エダラボン、ＥＧＣＧ、ガンボギン酸、ガネテスピブ、ゲデュニン、ＩＱ－１、リモニン、ロニダミン、メラトニン、ベンズアミドテトラヒドロインドロン、Ｎ８８６、アルキルアミノビフェニルアミド、ノボビオシン、ピリドキサール５’－リン酸（Ｐ５’－Ｐ）、ピリチオン、ケルセチン、ラディシコール、レスベラトロール、Ｎ－（２－シアノ－３，１２－ジオキソ－２８－ノルオレアナ－１，９（１１）－ジエン－１７－イル）－２，２－ジフルオロ－プロパンアミドまたはオマベロキソロン（ＲＴＡ－４０８）、４－（４－フルオロフェニル）－２－（４－ヒドロキシフェニル）－５－（４－ピリジル）－１Ｈ－イミダゾール（ＳＢ２０２１９０）、３－（２，４－ジクロロフェニル）－４－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン（ＳＢ２１６７６３）、ＳＮＸ－５４２２（ＰＦ－０４９２９１１３）、ナトリウムブチレート、スルホラン、テトラブロモベンゾトリアゾール（ＴＢＢ）、ｔｅｒｔ－ブチルヒドロキノン（ｔＢＨＱ）、バルプロ酸（ｖａｌｐｏｒｉｃ ａｃｉｄ）、ウィタフェリンＡ、ウィタノライド、エルゴステロール、ルペノン、および任意のかかる補助剤のアナログでありうる。
【0030】
より特定的には、補助剤としては、たとえば、ｔＢＨＱ、カルノソール、クルクミン、２ＨＢＡ、もしくはＥＧＣＧ、またはそれらのアナログが挙げられうる。
【0031】
本発明は、その追加の態様では、たとえば、ａ）単独または１種以上の補助剤との組合せのいずれかで式Ｉ、式Ｉａの１種以上の化合物、その薬学的に許容可能な塩、立体異性体、互変異性体、またはプロドラッグと、ｂ）担体または薬学的に許容可能な担体もしくは賦形剤と、を含みうる組成物または医薬組成物を提供する。
【0032】
本発明は、細胞（単離された細胞）、細胞調製物、組織（単離された組織）、移植片（単離された移植片）、または器官（単離された器官）の状態をモジュレートする方法を提供する。かかるモジュレーションは、生存能、または死、損傷、および／もしくはストレスに対する耐性、さらには機能、を向上させるようにまたは保持するように行いうる。かかるモジュレーションは、細胞死に対する回復力プロファイルを向上させるように、酸化および／もしくは低酸素ストレッサーに対する耐性をより向上させるように、ならびに／または限定されるものではないが熱ショックタンパク質、抗酸化タンパク質、成長因子をはじめとする各種タンパク質の分泌増強および／もしくは細胞老化に関連するペプチドメディエーターの有害発現の低減を含みうるタンパク質発現のプロファイルを向上させるように行いうる。
【0033】
本方法は、細胞、細胞調製物、組織、移植片、または器官と、ａ）式Ｉ、式Ｉａの１種以上の化合物、その薬学的に許容可能な塩、立体異性体、互変異性体、またはプロドラッグを含みうる組成物、ｂ）式Ｉ、式Ｉａの１種以上の化合物、その薬学的に許容可能な塩、立体異性体、互変異性体、またはプロドラッグと補助剤とを含みうる組合せ物、ｃ）式Ｉ、式Ｉａの１種以上の化合物、その薬学的に許容可能な塩、立体異性体、互変異性体、もしくはプロドラッグまたはそれらの組合せ物に接触させるまたは接触させた個別細胞調製物、あるいはｄ）式Ｉ、式Ｉａの１種以上の化合物、その薬学的に許容可能な塩、立体異性体、互変異性体、もしくはプロドラッグまたはそれらの組合せ物に接触させた個別細胞調製物のセクレトームまたは細胞培地と、を接触させることを含みうる。
【0034】
本発明は、追加の態様では、各種病理学的病態（たとえば、虚血、虚血／再灌流、ショック、敗血）または操作手順（たとえば、凍結／解凍サイクル、細胞のカプセル化、拡大、富化、および精製の工程、移植片の調製／製造など）で発生しうる損傷またはストレッサー（たとえば、酸化、低酸素、炎症、熱、浸透圧、機械的作用）から細胞、組織、移植片、または器官を保護する方法を提供する。
【0035】
本方法は、細胞、組織、移植片、または器官と、熱ショック反応および抗酸化反応を活性化する１種以上の化合物、ＨＳＰ９０阻害およびＫＥＡＰ－１阻害の経路を活性化する１種以上の化合物、ＨＳＦ１経路およびＮＲＦ２経路を活性化する１種以上の化合物、ＨＳＰおよび抗酸化剤を活性化する１種以上の化合物を含む組成物と、を接触させることを含みうる。
【0036】
本方法はまた、細胞、組織、移植片、または器官と、天然トリテルペン、合成トリテルペンアナログ、および／または補助剤からなる群から選択される１種以上の化合物を含む組成物と、を接触させることを含みうる。
【0037】
本方法は、より特定的には、細胞、組織、移植片、または器官と、式Ｉ、式Ｉａの１種以上の化合物、その薬学的に許容可能な塩、立体異性体、互変異性体、またはプロドラッグを含む組成物と、を接触させることを含みうる。本発明によれば、本方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｖｏで行いうる。
【0038】
したがって、本発明によれば、本方法は、細胞調製物、組織、または器官で実施されるｅｘ ｖｉｖｏ法でありうる。こうしてコンディショニングされた細胞調製物、組織、または器官は、続いて、必要とする哺乳動物（たとえばヒト哺乳動物）に投与／移植しうる。本方法はまた、必要とする哺乳動物（たとえば、虚血疾患に罹患しているもしくは罹患しやすい、手術もしくは医学的介入を受けている、または細胞および組織の損失を伴う変性疾患を有している哺乳動物）に、組成物、組合せ物、個別細胞調製物、またはセクレトームを投与することにより実施されるｉｎ ｖｉｖｏ法でありうる。
【0039】
変性疾患は、心筋症、肝疾患、たとえば、非アルコール性脂肪肝疾患、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨ）、肝硬変、肺疾患たとえば慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、骨関節炎、膵障害たとえば糖尿病、神経変性たとえばアルツハイマー病、パーキンソン病、認知症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）疾患などを含みうる。
【0040】
組成物、組合せ物、個別細胞調製物、またはセクレトームは、手術または医学的介入の直前、実施時、または直後に投与しうるとともに、たとえば全身的にまたは局所的に投与しうる。
【0041】
本方法はまた、培養下または凍結前に細胞で実施されるｉｎ ｖｉｔｒｏ法でありうる。
【0042】
細胞、細胞調製物、組織、移植片、または器官は、それらの使用前に、たとえば少なくとも５～１８０分間の継続時間にわたり、化合物、組合せ物、個別細胞調製物、またはセクレトームに接触させうる。
【0043】
本発明の実施形態によれば、式Ｉまたは式Ｉａの化合物は、１０－６Ｍ～１０－１０Ｍの濃度で使用しうる。
【0044】
本方法は、化合物、組合せ物、細胞調製物、またはセクレトームを局所的にまたは全身的に投与することを含みうる。たとえば、化合物、組合せ物、またはセクレトームを投与する場合、それらは、全身的に（たとえば静脈内に）または局所的に（たとえば外用として損傷部位に）投与しうる。細胞調製物を投与する場合、それは、好ましくは局所的に（たとえば、虚血が疑われる部位、細胞保護を必要とする部位などに）投与しうる。
【0045】
細胞は、不死化細胞または初代細胞でありうる。細胞は、たとえば、幹細胞、心筋細胞、心筋芽細胞、筋細胞、腎細胞、膵細胞、肝細胞、ニューロン、内皮細胞、上皮細胞でありうる。
【0046】
幹細胞は、胚性、複能性、または多能性の幹細胞でありうる。幹細胞の例示的な実施形態としては、間葉幹細胞、造血幹細胞、誘導多能性幹細胞が挙げられうる。本発明によれば、細胞は非癌細胞である。
【0047】
細胞は、好ましくは、たとえばヒトなどの哺乳動物由来である。細胞は、同種異系幹細胞移植または自己幹細胞移植に好適でありうる。細胞は、供給業者から入手しうるかまたはドナーもしくは宿主から単離しうる。細胞は、特異的な望ましいマーカーに基づいて選択しうる。
【0048】
本発明によれば、本方法は、細胞、組織、移植片、または器官と１種以上の補助剤とをさらに接触させることを含みうる。そのため、細胞、組織、移植片、または器官は、ａ）式Ｉもしくは式Ｉａの化合物（またはその薬学的に許容可能な塩、立体異性体、互変異性体、もしくはプロドラッグ）およびｂ）補助剤の両方を混合一体化して含む組成物に接触させうるか、あるいは化合物および補助剤を交互に添加しうる。
【0049】
細胞、組織、移植片、または器官はまた、式Ｉ、式Ｉａの化合物（またはその薬学的に許容可能な塩、立体異性体、互変異性体、もしくはプロドラッグ）と補助剤とを逐次的に接触させうる。
【0050】
本発明はさらに、その態様では、虚血疾患、たとえば、虚血性心血管疾患、脳卒中、心筋梗塞（ＭＩ）、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）など、または細胞および組織の損失または変性が起こる疾患、たとえば、糖尿病、肝疾患、肺疾患など、を予防または治療する方法を提供する。
【0051】
本方法は、それを必要とする哺乳動物に、熱ショック反応活性化および抗酸化反応活性化を活性化する１種以上の化合物、ＨＳＰ９０阻害およびＫＥＡＰ－１阻害の経路を活性化する１種以上の化合物、ＨＳＦ１活性化およびＮＲＦ２経路を活性化する１種以上の化合物、ＨＳＰおよび抗酸化剤を活性化する１種以上の化合物を含む組成物、またはかかる組成物でコンディショニングされた細胞調製物のセクレトームを、投与することを含みうる。
【0052】
本方法はまた、それを必要とする哺乳動物に、熱ショック反応活性化および抗酸化反応活性化を活性化する１種以上の化合物、ＨＳＰ９０阻害およびＫＥＡＰ－１阻害の経路を活性化する１種以上の化合物、ＨＳＦ１およびＮＲＦ２の経路を活性化する１種以上の化合物、ＨＳＰおよび抗酸化剤を活性化する１種以上の化合物を含む組成物でプレコンディショニングされた幹細胞調製物を、投与することを含みうる。
【0053】
そのほか、本方法は、必要とする哺乳動物に、天然トリテルペン、合成トリテルペンアナログ、および／または補助剤からなる群から選択される１種以上の化合物を含む組成物を、投与することを含みうる。
【0054】
本方法はまた、必要とする哺乳動物に、天然トリテルペン、合成トリテルペンアナログ、および／または補助剤からなる群から選択される１種以上の化合物を含む組成物でプレコンディショニングされた幹細胞調製物を、投与することを含みうる。
【0055】
本方法はまた、必要とする哺乳動物に、本明細書に記載の１種以上の化合物および／または補助剤を含む組成物で処理された幹細胞調製物のセクレトームまたは培養培地を、投与することを含みうる。
【0056】
本方法は、より特定的には、それを必要とする哺乳動物に、ａ）式Ｉ、式Ｉａの１種以上の化合物、その薬学的に許容可能な塩、立体異性体、互変異性体、もしくはプロドラッグを含む組成物、ｂ）式Ｉ、式Ｉａの１種以上の化合物、その薬学的に許容可能な塩、立体異性体、互変異性体、もしくはプロドラッグでプレコンディショニングされた幹細胞調製物、またはｃ）かかる組成物でコンディショニングされた細胞調製物のセクレトームを、投与することを含みうる。
【0057】
本発明によれば、本方法は、ａ）式Ｉ、式Ｉａの化合物、その薬学的に許容可能な塩、立体異性体、互変異性体、もしくはプロドラッグと、ｂ）補助剤と、の組合せを含む組成物の投与、かかる組合せを含む組成物でプレコンディショニングされた幹細胞の投与、またはかかる組合せでコンディショニングされた細胞調製物のセクレトームの投与を包含する。
【0058】
本発明の実施形態によれば、幹細胞調製物は、必要とする哺乳動物から単離された自己幹細胞調製物でありうる。本発明のさらなる実施形態によれば、幹細胞調製物は、哺乳動物ドナーから単離された同種異系幹細胞調製物でありうる。哺乳動物への投与に好適であるために、同種異系幹細胞調製物は、好ましくはＨＬＡ型が一致する。幹細胞調製物はまた、免疫特権性、低免疫原性、または免疫回避性でありうる。
【0059】
本発明はまた、その追加の態様では、熱ショック反応活性化および抗酸化反応活性化を活性化する１種以上の化合物、ＨＳＰ９０阻害およびＫＥＡＰ－１阻害の経路を活性化する１種以上の化合物、ＨＳＦ１活性化およびＮＲＦ２経路を活性化する１種以上の化合物、ＨＳＰ活性化および抗酸化反応活性化を活性化する１種以上の化合物を含む組成物により、あるいはかかる組成物でコンディショニングされた個別細胞調製物のセクレトームにより、プレコンディショニングされた細胞調製物または単離された細胞、組織、移植片、もしくは器官調製物を提供する。
【0060】
本発明は、そのさらなる態様では、天然トリテルペン、合成トリテルペンアナログ、および／または補助剤からなる群から選択される１種以上の化合物を含む組成物でプレコンディショニングされた単離された細胞、組織、移植片、または器官調製物を提供する。
【0061】
より特定的には、本発明は、そのさらなる追加の態様では、式Ｉ、式Ｉａの１種以上の化合物、その薬学的に許容可能な塩、立体異性体、互変異性体、もしくはプロドラッグを含む組成物により、またはかかる組成物でコンディショニングされた個別細胞調製物のセクレトームにより、プレコンディショニングされた細胞調製物または単離された細胞、組織、移植片、または器官調製物を提供する。
【0062】
本発明によれば、単離された細胞、組織、移植片、または器官調製物は、ａ）式Ｉ、式Ｉａの化合物、その薬学的に許容可能な塩、立体異性体、互変異性体、またはプロドラッグと、ｂ）補助剤と、の組合せを含む組成物でプレコンディショニングしうる。
【0063】
本発明によれば、単離された細胞、組織、移植片、または器官調製物は、ａ）式Ｉ、式Ｉａの化合物、その薬学的に許容可能な塩、立体異性体、互変異性体、またはプロドラッグと、ｂ）補助剤と、の組合せを含む組成物でプレコンディショニングされた細胞のセクレトームによりコンディショニングしうる。
【0064】
本発明の実施形態によれば、組成物は、使用前に調製物から洗浄除去しうるか、または調製物の一部として残留しうる。
【0065】
例示的な実施形態によれば、細胞調製物は、幹細胞調製物、たとえば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで処理された幹細胞または以前に全身治療を受けたドナーから採取された幹細胞でありうる。
【0066】
本発明の他の実施形態によれば、細胞調製物は細胞懸濁液でありうる。本発明のさらなる実施形態によれば、細胞調製物は三次元スキャフォールドの形態でありうる。三次元スキャフォールドを得るために、細胞は、細胞凝集体として、マイクロ担体の存在下で、アルギネートマイクロカプセル化物上で、ヒドロゲル（たとえば、熱可逆ヒドロゲル、キトサン系ヒドロゲルなど）中で、自己集合ペプチドで構成されたナノ構造スキャフォールド（Ｍｅｎｇ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．，ＳｐｒｉｎｇｅｒＰｌｕｓ，２０１４，３：８０）中で培養しうる。
【0067】
本発明はさらに、幹細胞、組織、移植片、または器官の移植時の細胞損傷を低減する方法に関する。本方法は、幹細胞、組織、移植片、または器官と、熱ショック反応活性化および抗酸化反応活性化を活性化する１種以上の化合物、ＨＳＰ９０阻害およびＫＥＡＰ－１阻害の経路を活性化する１種以上の化合物、ＨＳＦ１活性化およびＮＲＦ２経路を活性化する１種以上の化合物、ＨＳＰ活性化および抗酸化反応活性化を活性化する１種以上の化合物を含む組成物、またはかかる組成物でコンディショニングされた細胞調製物のセクレトームと、を接触させることを含みうる。
【0068】
本発明はさらに、幹細胞、組織、移植片、または器官の移植時の細胞損傷を低減する方法に関する。本方法は、幹細胞、組織、移植片、または器官と、天然トリテルペン、合成トリテルペンアナログ、および／または補助剤からなる群から選択される１種以上の化合物を含む組成物と、を接触させることを含みうる。
【0069】
より特定的には、本発明はさらに、幹細胞、組織、移植片、または器官の移植時の細胞損傷を低減する方法を提供する。本方法は、移植前および／または移植時および／または移植後に、幹細胞、組織、移植片、または器官と、式Ｉ、式Ｉａの少なくとも１種の化合物、その薬学的に許容可能な塩、立体異性体、互変異性体、またはプロドラッグを含む組成物、またはかかる組成物でコンディショニングされた細胞調製物のセクレトームと、を接触させることを含む。
【0070】
本発明の実施形態によれば、本方法は、ａ）式Ｉ、式Ｉａの化合物、その薬学的に許容可能な塩、立体異性体、互変異性体、またはプロドラッグと、ｂ）補助剤と、の組合せを投与することを含みうる。
【0071】
さらなる態様では、本発明は、細胞、組織、移植片、または器官をストレスまたは損傷から保護するための、熱ショック反応活性化および抗酸化反応活性化を活性化する１種以上の化合物、ＨＳＰ９０阻害およびＫＥＡＰ－１阻害の経路を活性化する１種以上の化合物、ＨＳＦ１活性化およびＮＲＦ２経路を活性化する１種以上の化合物、ＨＳＰ活性化および抗酸化反応活性化を活性化する１種以上の化合物の使用に関する。
【0072】
他のさらなる態様では、本発明は、細胞、組織、移植片、または器官をストレスまたは損傷から保護するための、天然トリテルペン、合成トリテルペンアナログ、および／または補助剤からなる群から選択される１種以上の化合物の使用に関する。
【0073】
より特定の態様では、本発明は、細胞、組織、移植片、または器官をストレスまたは損傷から保護するための、式Ｉ、式Ｉａの１種以上の化合物、その薬学的に許容可能な塩、立体異性体、互変異性体、またはプロドラッグの使用に関する。
【0074】
本発明の追加の態様によれば、本発明は、ａ）式Ｉ、式Ｉａの化合物、その薬学的に許容可能な塩、立体異性体、互変異性体、またはプロドラッグと、ｂ）補助剤と、の組合せの使用に関する。
【0075】
さらなる追加の態様では、本発明は、手術または医学的介入を必要とするまたは細胞ストレスもしくは細胞損傷を受けやすい患者を治療する方法を提供する。
【0076】
本発明の実施形態によれば、本方法は、本明細書に定義される１種以上の化合物を含む組成物を投与することを含みうる。
【0077】
本発明のより特定的な実施形態によれば、本方法は、手術または医学的介入の前および／または実施時に、式Ｉ、式Ｉａの化合物、その薬学的に許容可能な塩、立体異性体、互変異性体、またはプロドラッグを含む組成物を投与することを含みうる。
【0078】
その本発明のさらなる実施形態では、本方法は、ａ）式Ｉ、式Ｉａの化合物、その薬学的に許容可能な塩、立体異性体、互変異性体、またはプロドラッグと、ｂ）補助剤と、の組合せを投与することを含みうる。
【0079】
本発明によれば、組成物は、局所的に、たとえば、手術または医学的介入の部位に投与しうる。本発明の他の実施形態によれば、組成物は全身投与しうる。
【0080】
本発明によれば、化合物または組成物は、必要とする哺乳動物の細胞損傷を受けやすい部位に直接投与しうる。そのため、化合物または組成物は、細胞損傷を予防または治療するために投与しうる。
【0081】
本発明はまた、式Ｉ、式Ｉａの化合物、その薬学的に許容可能な塩、立体異性体、互変異性体、またはプロドラッグを含む第１のバイアルと、細胞を含む第２のバイアルと、を含みうるキットに関する。
【0082】
本発明のさらなる実施形態によれば、キットは、補助剤の入った第３のバイアルを含みうる。本発明の実施形態によれば、細胞は幹細胞でありうる。
【0083】
本発明はまた、異なる成分がプレ混合されているキットに関する。
【0084】
本発明はまた、必要とする哺乳動物に組成物、組合せ物、個別細胞調製物、またはセクレトームをｉｎ ｖｉｖｏ投与するのに好適なデバイスを提供する。デバイスは、たとえば、プレ充填されたシリンジ、または組成物、組合せ物、個別細胞調製物、もしくはセクレトームを収容しうるコンパートメントを有するシリンジでありうる。
【0085】
本発明はまた、細胞、組織の調製に好適なデバイスを提供する。デバイスは、たとえば、組成物、組合せ物、個別細胞調製物、またはセクレトームを収容しうる細胞の選別用または細胞の培養もしくは拡大用のデバイスたとえばバイオリアクターでありうる。
【0086】
本発明の追加の態様はまた、以下の項目１～３１に提供される。
【0087】
１． 細胞死に対する細胞の耐性を向上させる方法であって、ＨＳＦ１経路およびＮＲＦ２経路を活性化する有効量の１種以上の化合物と細胞とを接触させる工程を含む前記方法。
【0088】
２． 細胞死に対する回復力プロファイルが向上した、酸化および／または低酸素ストレッサーに対する耐性がより向上した、ならびに／あるいは熱ショックタンパク質、抗酸化タンパク質、および／もしくは成長因子、抗炎症性サイトカイン、ケモカインの少なくとも１つの分泌増強および／または老化関連タンパク質などの有害ペプチドメディエーターの発現低減を含むタンパク質発現のプロファイルが向上した、コンディショニングされた細胞集団を生成する方法であって、細胞と、ＨＳＦ１経路およびＮＲＦ２経路を活性化する有効量の１種以上の化合物と、を接触させる工程を含む前記方法。
【0089】
３． 移植または輸液された細胞の生存能および保持性を向上させる方法であって、移植または輸液の前および／または後に、細胞と、ＨＳＦ１経路およびＮＲＦ２経路を活性化する有効量の１種以上の化合物と、を接触させる工程を含む前記方法。
【0090】
４． 前記方法が移植または輸液の前にｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞に接触させることを含む、本明細書に示される項目に記載の方法。前記方法がｉｎ ｖｉｖｏで細胞に接触させることを含む、本明細書に示される項目に記載の方法。
【0091】
５． 前記方法が移植または輸液の前／後にｉｎ ｖｉｖｏで細胞に接触させることを含む、本明細書に示される項目に記載の方法。
【0092】
６． 細胞の移植または輸液を必要とする被験体を治療する方法であって、（ａ）移植される細胞と、ＨＳＦ１経路およびＮＲＦ２経路を活性化する有効量の１種以上の化合物と、を接触させることと、（ｂ）前記被験体において（ａ）の細胞を移植または輸液することと、を含む前記方法。
【0093】
７． 移植後に、移植または輸液された細胞と、有効量の前記１種以上の化合物と、を接触させることをさらに含む、本明細書に示される項目に記載の方法。
【0094】
８． 前記被験体が器官または組織の虚血または変性に罹患している、および／または前記器官または組織の虚血が心虚血である、本明細書に示される項目に記載の方法。変性は、膵細胞、心細胞、筋細胞、ニューロン、腎細胞、肝細胞などの損失を含む。
【0095】
１０． 前記被験体が心筋梗塞（ＭＩ）に罹患している、本明細書に示される項目に記載の方法。
【0096】
１１． １種以上の化合物の少なくとも１つがＨＳＰ９０阻害剤である、本明細書に示される項目に記載の方法。
【0097】
１２． ＨＳＰ９０阻害剤がＨＳＰ９０のＮ末端またはＣ末端の阻害剤、より特定的にはＨＳＰ９０補因子阻害剤である、本明細書に示される項目に記載の方法。
【0098】
１３． １種以上の化合物の少なくとも１つがＮＲＦ２誘導活性または抗酸化活性を有する、本明細書に示される項目に記載の方法。
【0099】
１４． 前記１種以上の化合物が、セラストロールもしくはそのアナログ、ウィタノライドファミリーの化合物もしくはそのアナログ、リモノイドファミリーの化合物（たとえばゲデュニン）もしくはそのアナログ、バルドキソロン／ＣＤＤＯ化合物もしくはそのアナログ（たとえばＣＤＤＯ－メチル）、クルクミノイド（たとえばクルクミン）もしくはそのアナログ、カルノソールもしくはそのアナログ、ｔｅｒｔ－ブチルヒドロキノン（ｔＢＨＱ）もしくはそのアナログ、ビス（２－ヒドロキシベンジリデン）アセトン（２ＨＢＡ）もしくはそのアナログ、アセチレン系三環式ビス（シアノエノン）（ＴＢＥ－３１）もしくはそのアナログ、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）もしくはそのアナログ、ガンボギン酸もしくはそのアナログ、ノボビオシンもしくはそのアナログ、ロニダミンもしくはそのアナログ、アンドログラホリドもしくはそのアナログ、エダラボンもしくはそのアナログ、アスコルビン酸もしくはそのアナログ、ガメンダゾールもしくはそのアナログ、スルフォラファンもしくはそのアナログ、スルホキシチオカルバメートアルキン（ＳＴＣＡ）もしくはそのアナログ、またはそれらの任意の組合せを含む、本明細書に示される項目に記載の方法。
【0100】
１５． 前記１種以上の化合物が、（ｉ）（ａ）セラストロールもしくはそのアナログ、および（ｂ）ＥＧＣＧもしくはそのアナログ、（ｉｉ）（ａ）セラストロールもしくはそのアナログ、および（ｂ）ｔＢＨＱもしくはそのアナログ、（ｉｉｉ）（ａ）セラストロールもしくはそのアナログ、および（ｂ）２ＨＢＡもしくはそのアナログ、（ｉｖ）（ａ）セラストロールもしくはそのアナログ、および（ｂ）クルクミンもしくはそのアナログ、（ｖ）（ａ）セラストロールもしくはそのアナログ、および（ｂ）カルノソールもしくはそのアナログ、（ｖｉ）（ａ）ゲデュニンもしくはそのアナログ、および（ｂ）ＥＧＣＧもしくはそのアナログ、または（ｖｉｉ）（ａ）ゲデュニンもしくはそのアナログ、および（ｂ）ｔＢＨＱもしくはそのアナログ、（ｖｉｉｉ）（ａ）ゲデュニンもしくはそのアナログ、および（ｂ）２ＨＢＡもしくはそのアナログ、（ｉｘ）（ａ）ゲデュニンもしくはそのアナログ、および（ｂ）クルクミンもしくはそのアナログ、（ｘ）（ａ）ゲデュニンもしくはそのアナログ、および（ｂ）カルノソールもしくはそのアナログを含む、本明細書に示される項目に記載の方法。
【0101】
１６． 細胞が幹／多能性／前駆細胞または分化細胞である、本明細書に示される項目に記載の方法。
【0102】
１７． 幹／多能性／前駆細胞が間葉幹細胞、ＣＤ３４＋細胞、またはＣＤ１３３＋細胞である、本明細書に示される項目に記載の方法。
【0103】
１８． 細胞が分化細胞である、本明細書に示される項目に記載の方法。
【0104】
１９． 細胞が組織または器官に存在する、本明細書に示される項目に記載の方法。
【0105】
２０． 前記接触させることが、培養培地中への単回用量または複数回用量の１種以上の化合物の添加を含む、本明細書に示される項目に記載の方法。
【0106】
２１． 前記接触させることが、被験体に単回用量または複数回用量の１種以上の化合物を投与することを含む、本明細書に示される項目に記載の方法。
【0107】
２２． 細胞死に対する細胞の耐性の向上ならびに／または移植もしくは輸液された細胞の生存能および保持性の向上に有用でありうる１種以上の化合物を同定する方法であって、（ｉ）細胞と前記１種以上の化合物とを接触させることと、（ｉｉ）前記細胞においてＨＳＦ１経路およびＮＲＦ２経路が活性化されるかを決定することであって、前記経路の活性化が、前記１種以上の化合物が細胞死に対する細胞の耐性の向上および／もしくは接触させた細胞の生存能および保持性の向上に有用でありうる指標となる、ならびに／または前記１種以上の化合物が細胞の機能の向上および／もしくは接触させた細胞のパラクリンセクレトームの改善に有用でありうる指標となる、決定することと、を含む前記方法。
【0108】
２３． 細胞が幹／前駆細胞または分化細胞である、本明細書に示される項目に記載の方法。
【0109】
２４． 幹／前駆細胞が間葉幹細胞、ＣＤ３４＋細胞、またはＣＤ１３３＋細胞である、本明細書に示される項目に記載の方法。
【0110】
２５． 細胞が分化細胞である、本明細書に示される項目に記載の方法。
【0111】
２６． 細胞が組織または器官に存在する、本明細書に示される項目に記載の方法。
【0112】
２７． 前記細胞においてＨＳＦ１およびＮＲＦ２の経路が活性化されるかを決定する工程が、ＨＳＦ１および／またはＮＲＦ２の転写制御下で１つ以上の遺伝子の発現を測定することを含み、前記１つ以上の遺伝子の発現の増加が、ＨＳＦ１および／またはＮＲＦ２の経路が活性化される指標となる、本明細書に示される項目に記載の方法。
【0113】
２８． ＨＳＦ１またはＮＲＦ２の活性化後に発現された前記１つ以上の遺伝子が、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）（たとえば、ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０）、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ、ＮＡＤＰＨ－キノンオキシドレダクターゼ１（ＮＱＯ１）、成長因子（たとえば、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ２、ＨＧＦ、ＩＧＦ）、ヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ１）、スーパーオキシドジスムターゼ１～３（ＳＯＤ１～３）、チオレドキシン（ＴＲＸ）、カタラーゼ（ＣＡＴ）、および／またはグルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）である、本明細書に示される項目に記載の方法。
【0114】
２９． 前記細胞においてＮＲＦ２経路が活性化されるかを決定する工程が、１つ以上の炎症誘発性遺伝子の発現を測定することを含み、前記１つ以上の遺伝子の発現の減少が、ＨＳＦ１および／またはＮＲＦ２の経路が活性化される指標となる、本明細書に示される項目に記載の方法。
【0115】
３０． 前記１つ以上の炎症性遺伝子がＩＬ－１βおよび／またはＴＮＦαである、本明細書に示される項目に記載の方法。
【0116】
３１． 前記方法が、低酸素および／または酸化、低酸素／再酸素化のストレス条件下で前記細胞の死を測定することを含む、本明細書に示される項目に記載の方法。
【0117】
本発明によれば、ＨＳＰ９０阻害剤の代表的な実施形態は、たとえば、セラストロールまたは式Ｉのアナログを含みうる。
【0118】
他の態様では、本発明は、１種以上の保護化合物との組合せでセラストロールまたは式Ｉのアナログを含む組成物に関する。
【0119】
本発明によれば、１種以上の保護化合物は、ＮＲＦ２アクチベーターや抗酸化剤などの補助剤でありうるとともに、たとえば、セラストロール、２ＨＢＡ、アンドログラホリド、アスコルビン酸、カフェストール、カルノソールバルドキソロン－イミダゾール（ＣＤＤＯ－ｉｍ）、カルコン、Ｎ６－［２－［［４－（２，４－ジクロロフェニル）－５－（１Ｈ－イミダゾール－２－イル）－２－ピリミジニル］アミノ］エチル］－３－ニトロ－２，６－ピリジンジアミン（ＣＨＩＲ９８０１４）、コングロバチン、クルクミン、シクロアストラゲノール、１，２－ジチオール－３－チオン（Ｄ３Ｔ）、ドラマピモド、エダラボン、ＥＧＣＧ、ガンボギン酸、ガネテスピブ、ゲデュニン、ＩＱ－１、リモニン、ロニダミン、メラトニンベンズアミドテトラヒドロインドロン、Ｎ８８６、アルキルアミノビフェニルアミド、ノボビオシン、ピリドキサール５’－リン酸（Ｐ５’－Ｐ）、ピリチオン、ケルセチン、ラディシコール、レスベラトロール、Ｎ－（２－シアノ－３，１２－ジオキソ－２８－ノルオレアナ－１，９（１１）－ジエン－１７－イル）－２，２－ジフルオロ－プロパンアミドまたはオマベロキソロン（ＲＴＡ－４０８）、４－（４－フルオロフェニル）－２－（４－ヒドロキシフェニル）－５－（４－ピリジル）－１Ｈ－イミダゾール（ＳＢ２０２１９０）、３－（２，４－ジクロロフェニル）－４－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン（ＳＢ２１６７６３）、ＳＮＸ－５４２２（ＰＦ－０４９２９１１３）、ナトリウムブチレート、スルホラン、テトラブロモベンゾトリアゾール（ＴＢＢ）、ｔｅｒｔ－ブチルヒドロキノン（ｔＢＨＱ）、バルプロ酸（ｖａｌｐｏｒｉｃ ａｃｉｄ）、ウィタフェリンＡ、ウィタノライド、エルゴステロール、ルペノン、および任意のかかる補助剤のアナログを含みうる。
【0120】
さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載の組成物との接触後に向上した特性を有しうる生細胞を含有する細胞調製物に関する。向上した特性としては、向上した機能、細胞保護に関連する遺伝子の発現の増加、向上した生存能、向上した生存性、各種病理学的病態（たとえば、虚血、虚血／再灌流、敗血症性ショック）または操作手順（たとえば、凍結／解凍サイクル、細胞のカプセル化、拡大、富化、および精製の工程、移植片の調製／製造など）で発生しうるストレッサー（たとえば、酸化、低酸素、炎症、熱、浸透圧、機械的作用）による細胞損傷に対する耐性の増加が挙げられうる。
【0121】
細胞調製物は、幹細胞、たとえば、虚血による損傷の予防または修復に好適なものを含みうる。幹細胞は、供給業者から入手しうるか、治療を必要とする個体（すなわち自己）または適合ドナー（すなわち同種異系）から単離しうる。
【0122】
本発明の実施形態によれば、細胞調製物または組織調製物は、本明細書に記載の組成物または試薬でプレコンディショニングしうる。本発明のさらなる実施形態によれば、本明細書に記載の組成物または試薬を含有する細胞調製物は、培地を含みうる。
【0123】
本発明の他の目的、利点、および特徴は、添付の図面を参照して単なる例として与えられたその具体的な実施形態の以下の非制限的な説明を読めば、より明確になるであろう。
【0124】
添付の図面は以下の通りである。
【図面の簡単な説明】
【0125】
【図1】図１は、各種ＨＳＰ９０阻害剤およびセラストロール様化合物の生存能スクリーニング（Ａ、Ｂ）およびレポーターベースのスクリーニング（Ｃ）の例を示す。Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｏｐｅｒｅｔｔａ（登録商標）ハイコンテントスクリーニングシステムは、各種フルオロフォアおよび細胞モルフォロジー変化の検出を可能にする。Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＶｉｃｔｏｒマルチラベルカウンターまたはＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）マルチラベルリーダー（ルミノメーター）は、ルシフェリン代謝の検出を可能にする。それはまた、各種レポーター細胞系を用いてＥＣ５０および最大誘導倍率を定量的に特徴付け可能である。
【図2】図２Ａおよび２Ｂは、セラストロールプレコンディショニングがＭＳＣのｉｎ ｖｉｖｏ生存能／保持性を向上させることを示す。ＭＳＣは、コンディショニング化合物または媒体で６０分間処理した。次いで、細胞を洗浄し、蛍光セルトラッカーで標識し、そしてｔ＝０でラット虚血左後肢に注射した。Ｏｐｔｉｘ（登録商標）を用いて９日目まで移植細胞をｉｎ ｖｉｖｏで撮像した。Ｏｐｔｉｘ ｉｎ ｖｉｖｏイメージングシステムを用いて、ｔ＝０で左四頭筋に注射した３００万ＭＳＣを９日目まで追跡した。（ｌｏｇスケール）。
【図3】図３は、セラストロールプレコンディショニングが幹細胞治療効果を向上させることを示す。セラストロールでプレコンディショニングされたＭＳＣは、レーザードップラースキャニングから分かるように後肢虚血モデルで血流をより効率的に再建する。
【図4】図４は、セラストロール（１０－６Ｍ）処理の１時間後におけるヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）により放出された細胞保護タンパク質、成長／生存因子、および抗酸化タンパク質を示す。コンディショニングされた細胞培地を捕集し、濃縮し、ゲル電気泳動によりタンパク質を分離し、そして質量分析により分析してデータベース検索を介して同定した。
【図6】図６は、ＨＳＰ９０阻害剤（セラストロール、ゲデュニン、ラディシコール）によるラット間葉幹細胞（ｒＭＳＣ）の１時間処理では４８時間低酸素誘導細胞死からｒＭＳＣが保護されるがＮＲＦ２アクチベーター単独（ＥＧＣＧ、ｔＢＨＱ）では保護されないことを示す。ＥＧＣＧはセラストロール媒介保護を増強する。
【図7】図７は、ＨＳＰ９０補因子阻害剤（セラストロール、ゲデュニン高用量）で処理したｒＭＳＣの培地によるＨ９ｃ２の４８時間プレコンディショニングが４８時間低酸素誘導細胞死からＨ９ｃ２を保護することを示す。
【図8A】図８Ａは、ＮＲＦ２活性化化合物（セラストロール、ＥＧＣＧ）によるｒＭＳＣの１時間処理では酸化ストレス誘導死からｒＭＳＣが保護されるがＨＳＦ１アクチベーター（ゲルダナマイシン、ラディシコール）では本質的に保護されないことを示す。ＥＧＣＧはセラストロール誘導保護を増強する。
【図8B】図８Ｂは、２ＨＢＡ、ｔＢＨＱ、またはＥＧＣＧのいずれかと組み合わせたセラストロールによるＨ９ｃ２心筋芽細胞の１時間処理が酸化チャレンジ（１ｍＭ Ｈ２Ｏ２中での１時間インキュベーション）後における細胞の生存能の相乗的向上をもたらすことを示す。
【図9】図９は、ＮＲＦ２アクチベーター（ゲデュニン、ＥＧＣＧ、ｔＢＨＱ）で処理したｒＭＳＣの培地による２４時間プレコンディショニングが酸化ストレス誘導死からＨ９ｃ２細胞を保護することを示す。強力なＨＳＦ１アクチベーター単独（ラディシコール、セラストロール）では保護を示さない。
【図11】図１１は、１時間処理および３時間ウォッシュアウトの後におけるｒＭＳＣ内のＨＳＰ３２（ＨＯ－１）ｍＲＮＡ発現を示す。ＥＧＣＧおよびｔＢＨＱは、セラストロール誘導ＨＳＰ３２発現の相乗的増加をもたらす。
【図13】図１３は、１時間処理および３時間ウォッシュアウトの後におけるヒトＭＳＣ（ｈＭＳＣ）内のＨＳＰ３２（ＨＯ－１）ｍＲＮＡ発現を示す。ＥＧＣＧは、セラストロール誘導ＨＳＰ３２発現の相乗的増加をもたらす。
【図14】図１４は、１時間処理および３時間ウォッシュアウトの後におけるｒＭＳＣ内のＦＧＦ２ｍＲＮＡ発現を示す。ＥＧＣＧおよびｔＢＨＱは、セラストロール誘導ＦＧＦ２発現の相乗的増加をもたらす。ＴＢＨＱとゲデュニンとの組合せはまた、ＦＧＦ２ｍＲＮＡ発現を増加させた。
【図16】図１６は、１時間処理および３時間ウォッシュアウトの後におけるｒＭＳＣ内のカタラーゼ（ＣＡＴ）ｍＲＮＡ発現を示す。ＥＧＣＧおよびｔＢＨＱは、セラストロール誘導ＣＡＴ発現の相乗的増加をもたらす。
【図17】図１７は、１時間処理および３時間ウォッシュアウトの後におけるｒＭＳＣ内のグルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）ｍＲＮＡ発現を示す。ＥＧＣＧおよびｔＢＨＱは、セラストロール誘導ＧＰｘ発現の相乗的増加をもたらす。
【図18】図１８は、１時間処理および３時間ウォッシュアウトの後におけるｒＭＳＣ内のグルタチオンレダクターゼ（ＧＲ）ｍＲＮＡ発現を示す。ＥＧＣＧは、セラストロール誘導ＧＲ発現の相乗的増加をもたらす。ｔＢＨＱは、低用量でのみ相乗効果を示す。
【図19】図１９は、１時間処理および３時間ウォッシュアウトの後におけるｒＭＳＣ内のスーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）ｍＲＮＡ発現を示す。ＥＧＣＧは、セラストロール誘導ＳＯＤ１発現の相乗的増加をもたらす。
【図20】図２０は、１時間処理および３時間ウォッシュアウトの後におけるｒＭＳＣ内のＩＬ－１βｍＲＮＡ発現を示す。セラストロールおよびゲデュニンは、ＥＧＣＧおよびｔＢＨＱにより誘導されるＩＬ－１β発現をダウンレギュレートする。
【図21】図２１は、１時間処理および３時間ウォッシュアウトの後におけるｒＭＳＣ内のＴＮＦαｍＲＮＡ発現を示す。ＥＧＣＧおよびｔＢＨＱは、ＴＮＦαのセラストロール誘導およびゲデュニン誘導ダウンレギュレーションを相乗的に亢進する。
【図22A】図２２Ａは、ｒＭＳＣの生存能および発現の結果の編集マップを示す（チェックマークは活性化レベルを示し、ｘは阻害効果レベルを示し、≠は効果欠如を示し、空のセルは実験を実施しなかったことを示す）。
【図22B】図２２Ｂは、Ｈ９ｃ２細胞のパラクリン生存能の編集マップを示す（チェックマークは活性化レベルを示し、ｘは阻害効果レベルを示し、≠は効果欠如を示し、空のセルは実験を実施しなかったことを示す）。
【図25A】図２５Ａは、セラストロール単独または選択された補助剤との組合せでコンディショニングされたヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）内でリアルタイムＰＣＲによる測定された選択された遺伝子のｍＲＮＡ発現を表す表である。結果は、媒体処理細胞に対する変化倍率として表される。
【図25B】図２５Ｂは、選択されたセラストロールアナログ単独または選択された補助剤との組合せでコンディショニングされたヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）内でリアルタイムＰＣＲによる測定された選択された遺伝子のｍＲＮＡ発現を表す表である。結果は、媒体処理細胞に対する変化倍率として表される。
【図26-1】図２６Ａ～２６Ｃは、リアルタイムＰＣＲにより測定されたヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）内の細胞保護遺伝子のｍＲＮＡ発現に関するセラストロールまたはセラストロールアナログと選択された補助ＮＲＦ２アクチベーターとの共処理の結果を示す。媒体処理細胞と比較してＶＥＧＦ、ＦＧＦ２、ＨＯ１、およびＳＤＦ１遺伝子の発現に関して≧１，５倍の優れた処理組合せのみが保持される。結果は、媒体処理細胞に対する変化倍率として表される。（任意の血管新生指数：（ＶＥＧＦａ＋ＦＧＦ２＋ＳＤＦ１）×２）（Ａ＝相加効果、Ｓ＝相乗効果）。
【図26-3】図２６Ｄは、セラストロール（１μＭ）単独または２ＨＢＡ（１μＭ）との組合せによるヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）の１時間処理ならびに続いて梗塞マイクロ環境で観察されうる正常酸素または低酸素（＜１％Ｏ２）のいずれかおよび低血清（０，２％ＦＢＳ）の条件の２４時間インキュベーションの後における抗酸化剤、成長因子、およびマトリックスリモデリングのｍＲＮＡ遺伝子発現のＴａｑＭａｎパネル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を示す。結果は、媒体処理ｈＭＳＣに対する変化倍率として表される。
【図26-4】図２６Ｅは、セラストロール（１μＭ）単独または補助処理剤（２ＨＢＡ １μＭ、ＥＧＣＧ １０μＭ、またはクルクミン５μＭ）との組合せのいずれかによるＨ９ｃ２心筋芽細胞の１時間処理ならびに続いて梗塞マイクロ環境で観察されうる正常酸素または低酸素（＜１％Ｏ２）のいずれかおよび低血清（０，２％ＦＢＳ）および低グルコースの条件の３時間インキュベーションの後におけるＨＯ－１（上側パネル）およびＶＥＧＦａ（下側パネル）の遺伝子ｍＲＮＡのリアルタイムＰＣＲ発現を示す。結果は、媒体処理Ｈ９ｃ２に対する変化倍率として表される。
【図26-5】図２６Ｆは、セラストロール（１μＭ）および選択された補助化合物（１μＭ）の１時間共処理ならびに続いて梗塞マイクロ環境で観察されうる正常酸素または低酸素（＜１％Ｏ２）のいずれかおよび低い血清（１％ＦＢＳ）の条件の４８時間インキュベーションの後におけるヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）により培養培地中に分泌されたＶＥＧＦａタンパク質含有量の測定結果（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ；Ｂｉｏ Ｐｌｅｘ ２００，Ｂｉｏ Ｒａｄ）を示す。
【図28】図２８は、共焦点顕微鏡法（Ｏｌｙｍｐｕｓ、ＦＶ１０００ＭＰＥ／ＢＫ６１ＷＦ）実験から得られた写真であり、（Ａ）セラストロールを含まないまたは（Ｂ）セラストロール（１μＭ）を含むＨＢＳＳ培地中で一晩コンディショニングされたブタ細動脈を示す。血管セクションは、ＬＩＩＶＥ／ＤＥＡＤキットを用いて染色した。矢印は、媒体を含有する培地中の死細胞および分解内皮層の領域を指し、一方、代表的な血管画像は、セラストロール追加培地を用いて内皮層の生存能および健全性の維持を示す。
【図29A】図２９Ａおよび２９Ｂは、セラストロール（１μＭ）による５～１２０分間刺激および続いて０～２４時間回復を行った異なる細胞型における全細胞抽出物または核および細胞質画分のいずれかのタンパク質発現を示すウェスタンブロットである。
【図29C】図２９Ｃは、６時間低酸素チャレンジ後に０，２５μＭまたは０，５０μＭの濃度のセラストロールまたはラディシコール（Ｒａｄｉｃｉｏｌ）で３０分間プレコンディショニングされたインスリン分泌ＩＮＳ－１細胞の生存能指数を表すヒストグラムである。結果は媒体処理細胞と比較される。
【図31】図３１は、１回のセラストロール（１ｍｇ／ｋｇ）注射がラットの腎臓において６０分以内にＨｓｐ３２（ＨＯ－１）の発現を誘導することを示すウェスタンブロットの写真である（ａを参照されたい）。セラストロールは、腎虚血を起こしているラットの非結紮対照腎臓においてＨｓｐ７０の発現を増加させることから、全身感受性および細胞保護反応の増加が示唆される（ｂを参照されたい）。
【図32】図３２は、低酸素ストレス時、酸化ストレス時、および低酸素／再酸素化ストレス時におけるＨ９ｃ２細胞の生存能に対するセラストロール（供給業者から購入したセラストロール１ｃ、合成アナログを生成するために使用したセラストロール２および３）およびセラストロールアナログの効果をまとめた表である。
【図33-1】図３３Ａ～Ｈは、全心温虚血後の再灌流による媒体（ＤＭＳＯ）処理と比較したＡ、Ｂ）＋／－ｄＰ／ｄｔ、Ｃ）発生圧（最大圧－最低圧）、Ｄ）拡張末期圧（ＥＤＰ）、およびＥ）収縮指数の変化より示されるように、セラストロール（１０－７ｍｏｌ／Ｌ最良用量）およびアナログ１（１０－８ｍｏｌ／Ｌ用量）がＩ／Ｒ誘導収縮期機能不全から心臓を保護したことを示唆する。
【図33-2】Ｆ）冠脈予備血流（ＣＲＦ）は処理で維持され、Ｇ）高感度トロポニンＴ（ＴＮＴ－ｈｓ）放出およびＨ）ＴＴＣ染色により測定される梗塞領域は、Ｉ／Ｒ傷害後の媒体（ＤＭＳＯ）処理心臓と比較してセラストロールおよびアナログの処理群では有意に低減した。
【図34】図３４Ａ～Ｄは、媒体（ＤＭＳＯ）処置動物と比較してＡ）駆出率（ＥＦ）、Ｂ）心拍出量（ＣＯ）、Ｃ）内径短縮率（ＦＳ）、およびＤ）心拍出量（ＳＶ）を維持することによりセラストロール（１ｍｇ／Ｋｇ）およびアナログ１（１ｍｇ／Ｋｇ）がＩ／Ｒ傷害後の心機能を保護することを示唆する。
【発明を実施するための形態】
【0126】
本出願では、本出願人は、セラストロールが、さまざまな損傷から細胞および組織を保護するのに有用でありうるとともに、移植片や器官などの複合組織の一部である細胞の生存性を向上させうることを示した。たとえば、セラストロール単独または補助剤との組合せでプレコンディショニングされた幹細胞は、ストレスおよび／または損傷から細胞を保護するとともに、パラクリンメディエーターおよび成長因子の分泌を刺激して細胞の治療プロファイルを向上させる。
【0127】
本出願人はまた、類似または増加した細胞保護効果を有するセラストロール（Ｃｅｌａｓｔｏｌ）アナログを同定するとともに、セラストロールおよび／またはセラストロールアナログとの併用で相乗的または相加的な細胞保護効果を有するいくつか治療剤の組合せを同定した。
【0128】
細胞保護ＨＰＳのアップレギュレーションをもたらすＨＳＲおよび抗酸化反応の誘導のセラストロール機序は、図３７に模式化される。
【0129】
より特定的には、セラストロールの作用機序は、１）迅速かつ一過性の細胞防衛機序の活性化を含む。より特定的には、セラストロールは、転写因子核因子エリスロイド２関連因子２（ＮＲＦ２）のリプレッサーＫＥＡＰ１の活性をモジュレートすることにより、核へのＮＲＦ２の移行を可能にするとともに、ＡＲＥ（抗酸化反応エレメント）に結合して保護抗酸化メディエーターおよびＨＯ１（ＨＳＰ３２）などの酵素の転写を活性化する。
【0130】
セラストロールの作用機序はまた、２）長期の保護および生存を保証する細胞経路の活性化を含む。すなわち、セラストロールは、ＨＳＰ９０の本質的なコシャペロンすなわちＣｄｃ３７をアンタゴナイズすることにより、ＨＳＦ１をそのシャペロンリプレッサーＨＳＰ９０から解離させる。こうしてＨＳＦ１のリン酸化、三量体化、核移行、およびＨＳＥ（熱ショックエレメント）への結合が起こり、それによりＨＳＰ２７、ＨＳＰ３２、およびＨＳＰ７０をはじめとする細胞保護熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）のｄｅ ｎｏｖｏ転写が誘導される。
【0131】
セラストロールの作用機序は、３）保護シグナリングの誘導／増幅をさらに含みうる。すなわち、セラストロールは、ＲＯＳの産生を刺激することにより上記の機序を活性化しうるとともに、それにより保護シグナリング経路の活性化を引き起こす。
【0132】
本発明の記載に関連した（とくに特許請求の範囲に関連した）「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」という用語ならびに類似の参照語の使用は、とくに本明細書に指定がない限りまたは文脈上明らかな矛盾がない限り、単数形および複数形の両方を包含するものと解釈すべきである。
【0133】
「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（～を含む）」、「ｈａｖｉｎｇ（～を有する）」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（～を含む）」および「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ（～を含有する）」という用語は、とくに断りのない限り、オープンエンドの用語として解釈すべきである（すなわち、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ，ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ（限定されるものではないが、～を含む）」を意味する）。
【0134】
本明細書における値の範囲の列挙は、とくに本明細書に指定がない限り、この範囲内に含まれる個々の各値を個別に参照する簡略表記法として機能することが単に意図され、個々の各値は、あたかも本明細書に個別に列挙されたがごとく本明細書に組み込まれる。範囲内の値のサブセットもすべて、あたかも本明細書に個別に列挙されたがごとく本明細書に組み込まれる。
【0135】
同様に、本明細書では、各種置換基およびこれらの置換基に対して挙げられた各種基を有する一般化学構造は、任意の置換基に対する任意の基の組合せにより得られるあらゆる分子を個別に参照する簡略表記法として機能することが意図される。各個別分子は、あたかも本明細書に個別に列挙されたがごとく本明細書に組み込まれる。さらに、一般化学構造内の分子のサブセットはすべて、および同一の化合物ファミリーに属する構造／分子もすべて、あたかも本明細書に個別に列挙されたがごとく本明細書に組み込まれる。
【0136】
本明細書に開示される実施形態および特徴のいずれの組合せおよび部分的組合せもすべて、本発明に包含される。
【0137】
本明細書では、「ａｂｏｕｔ（約）」という用語はその通常の意味を有する。「ａｂｏｕｔ（約）」という用語は、値がその値を決定するために利用されるデバイスもしくは方法に固有の誤差の変動を含むことまたは列挙された値に近い値、たとえば、列挙された値（もしくは値の範囲）の１０％以内もしくは５％以内の値を包含することを示唆するために用いられる。
【0138】
本明細書に記載の方法はすべて、とくに本明細書に指定がない限りまたは文脈上明らかな矛盾がない限り、任意の好適な順序で実施可能である。
【0139】
本明細書に提供されるいずれの例または例示的表現（たとえば、「ｓｕｃｈ ａｓ（～などの）」）の使用もすべて、単に本発明をより良く例示することが意図されたものであり、とくに特許請求されない限り本発明の範囲に限定を課すものではない。
【0140】
とくに定義がない限り、本明細書で用いられる科学技術用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されているものと同一の意味を有する。
【0141】
本発明は、細胞死に対する細胞の耐性（たとえば、酸化および／または低酸素ストレス誘導死、熱、酸化、Ｈ２Ｏ２、低酸素、カプセル化などをはじめとする他の物理的または化学的または機械的なストレッサーに対する耐性）を向上させる方法を提供する。前記方法は、細胞と、ＨＳＦ１経路およびＮＲＦ２経路を活性化する有効量の１種以上の化合物と、を接触させる工程を含む。本発明は、細胞死に対する細胞の耐性を向上させるためのおよび細胞の機能を向上させるための、ＨＳＦ１経路およびＮＲＦ２経路を活性化する１種以上の化合物の使用を提供する。
【0142】
本発明はまた、移植または輸液された細胞の生存能および保持性を向上させる方法を提供する。前記方法は、移植または輸液の前および／または後に、細胞と、ＨＳＦ１経路およびＮＲＦ２経路を活性化する有効量の１種以上の化合物と、を接触させる工程を含む。
【0143】
本発明はまた、幹細胞の治療プロファイルおよび機能を向上させる方法（移植片マイクロ環境のパラクリン寛解のための、成長因子、抗酸化酵素、熱ショックタンパク質、ケモカイン、および抗炎症性サイトカインをはじめとする有益なタンパク質の活性化）を提供する。前記方法は、幹細胞と、ＨＳＦ１経路およびＮＲＦ２経路を活性化する有効量の１種以上の化合物と、を接触させる工程を含む。
【0144】
本発明はまた、細胞死（たとえば、低酸素および／もしくは酸化および／もしくは低酸素／再酸素化のストレスにより誘導される細胞死）に対する細胞の耐性の向上ならびに／または移植もしくは輸液された細胞の生存能および保持性の向上に有用でありうる１種以上の化合物を同定する方法を提供する。前記方法は、（ｉ）細胞と前記１種以上の化合物とを接触させることと、（ｉｉ）ＨＳＦ１経路およびＮＲＦ２経路が前記細胞において活性化されるかを決定することと、を含み、前記経路の活性化は、前記１種以上の化合物が細胞死に対する細胞の耐性の向上ならびに／または移植もしくは輸液された細胞の生存能および保持性の向上に有用でありうる指標となる。
【0145】
本発明はまた、細胞の移植または輸液を必要とする被験体を治療する方法を提供する。前記方法は、（ａ）移植される細胞と、ＨＳＦ１経路およびＮＲＦ２経路を活性化する有効量の１種以上の化合物と、を接触させることと、（ｂ）前記被験体において（ａ）の細胞を移植または輸液することと、を含む。
【0146】
「熱ショック因子タンパク質１（ＨＳＦ１）経路を活性化する化合物」という表現は、シャペロンリプレッサーＨＳＰ９０複合体からのＨＳＦ１の放出の直接的もしくは間接的な増加および／またはその核への移行の活性化またはその細胞内含有量の増加によりＨＳＦ１媒介転写を増加させることが可能な任意の作用剤（低分子、ペプチド、タンパク質、抗体、オリゴマーなど）を意味する。それは、ＨＳＰ９０のコシャペロン、たとえば、Ｃｄｃ３７およびｐ２３をアンタゴナイズして、ＨＳＦ１の解離／活性化またはＨＳＦ１タンパク質自体をもたらす作用剤を含む。
【0147】
「核因子（エリスロイド由来２）様２（ＮＲＦ２）経路を活性化する化合物」という表現は、リプレッサーのケルヒ様ＥＣＨ関連タンパク質１（ＫＥＡＰ１）からのＮＲＦ２の放出の直接的もしくは間接的な増加および／またはその核への移行の活性化またはその細胞内含有量の増加によりＮＲＦ２媒介転写を増加させることが可能な任意の作用剤（低分子、ペプチド、抗体、オリゴマーなど）を意味する。ＫＥＡＰ１は、ＮＲＦ２との相互作用を媒介する６つのケルヒリピート（残基３２７～３７２、３７３～４２３、４２４～４７０、４７１～５１７、５１８～５６４、および５６５～６１１）を含む。ＮＲＦ２の残基６９～８４、より特定的には残基７６～８４（保存ＥＴＧＥモチーフを包含する）は、ＫＥＡＰ１との相互作用に関与する。ＮＲＦ２経路を活性化する化合物の例としては、セラストロール、ｔＢＨＱ、ＣＤＤＯ、カルノソール、アンドログラホリド、カフェストール、スルフォラファン、クルクミン、ＥＧＣＧ、ピリチオン、レスベラトロール、ゲデュニン、ケルセチン、ビス（２－ヒドロキシベンジリデン）アセトン（２－ＨＢＡ）またはＨＢＢ２、１，２－ジチオール－３－チオン（Ｄ３Ｔ）、アセチレン系三環式ビス（シアノエノン）（ＴＢＥ３１）、アントテコール、ウィタノライド（Ｗｈｉｔａｎｏｌｉｄｅｓ）、およびそれらのアナログまたはアルカロイドのメンバー、キノンおよびキノンメチド、ガンボギン酸、リモノイド、ロテノイド、テルペノイド、フラノイド、カテキン、アルケニル、炭水化物、フラボノイド、または芳香族ファミリーが挙げられる。
【0148】
実施形態では、本方法は、ＨＳＦ１経路およびＮＲＦ２経路の両方を活性化する１種の化合物の使用を含む。他の実施形態では、本方法は、ＨＳＦ１経路およびＮＲＦ２経路を活性化する２種以上の分子、たとえば、ＨＳＦ１経路を活性化する第１の化合物とＮＲＦ２経路を活性化する第２の化合物、またはＨＳＦ１およびＮＲＦ２の経路を活性化する第１の化合物とＮＲＦ２経路のみを活性化する第２の化合物などの使用を含む。
【0149】
実施形態では、１種以上の化合物は、セラストロールもしくはそのアナログ、ウィタノライドファミリーの化合物（たとえば、ウィタノライドＡ、ウィタフェリンＡ）もしくはそのアナログ、リモノイドファミリーの化合物（たとえばゲデュニン）もしくはそのアナログ、クルクミノイド（たとえばクルクミン）もしくはそのアナログ、スルフォラファンもしくはそのアナログ、スルホキシチオカルバメートアルキン（ＳＴＣＡ）もしくはそのアナログ、ノボビオシンもしくはそのアナログ、ロニダミンもしくはそのアナログ、ガメンダゾールもしくはそのアナログ、バルドキソロン／ＣＤＤＯ化合物（たとえば、ＣＤＤＯ－ｉｍ）もしくはそのアナログ、ｔｅｒｔ－ブチルヒドロキノン（ｔＢＨＱ）もしくはそのアナログ、（１Ｅ，４Ｅ）－１，５－ビス（２－ヒドロキシフェニル）－１，４－ペンタジエン－３－オン（ＨＢＢ２）またはそのアナログ、アセチレン系三環式ビス（シアノエノン）（ＴＢＥ－３１）もしくはそのアナログ、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）もしくはそのアナログ、またはそれらの任意の組合せを含む。本明細書で用いられる「アナログ」という用語は、参照化合物の基本構造または骨格構造を有するがＨＳＦ１経路および／またはＮＲＦ２経路の生物学的活性を消失しない１つ以上の修飾（たとえば、結合次数、１つ以上の原子および／または原子団の不在または存在、ならびにそれらの組合せ）を含む化合物を意味する。たとえば、セラストロールアナログ（五環式トリテルペン化合物）は、Ｋｌａｉｃ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２０１２ Ｍａｙ １８；７（５）：９２８－９３７およびＰＣＴ国際公開第２０１５／１４８８０２号パンフレットに記載されている。
【0150】
実施形態では、１種以上の化合物の少なくとも１つは、ＨＳＰ９０阻害剤、ＨＳＰ９０のＮ末端またはＣ末端の阻害剤、好ましくはＨＳＰ９０補因子阻害剤である。
【0151】
実施形態では、１種以上の化合物の少なくとも１つは、ＮＲＦ２誘導活性を有する。
【0152】
実施形態では、単独で使用される化合物の活性と比べて向上した（たとえば相乗的）活性を示す化合物の組合せが使用される。化合物の組合せの例としては、（ｉ）（ａ）セラストロールもしくはそのアナログ、および（ｂ）ＥＧＣＧもしくはそのアナログ、（ｉｉ）（ａ）セラストロールもしくはそのアナログ、および（ｂ）ｔＢＨＱもしくはそのアナログ、（ｉｉｉ）（ａ）ゲデュニンもしくはそのアナログ、および（ｂ）ＥＧＣＧもしくはそのアナログ、（ｉｖ）（ａ）ゲデュニンもしくはそのアナログ、および（ｂ）ｔＢＨＱもしくはそのアナログ、（ｖ）（ａ）セラストロールもしくはそのアナログ、および（ｂ）２ＨＢＡもしくはそのアナログ、（ｖｉ）（ａ）セラストロールもしくはそのアナログ、および（ｂ）クルクミンもしくはそのアナログ、または（ｖｉｉ）ａ）セラストロールもしくはそのアナログ、および（ｂ）カルノソールもしくはそのアナログが挙げられる。
【0153】
本明細書で用いられる場合、「補助剤」という用語は、細胞の生存性、生存能、またはストレスもしくは損傷に対する耐性を向上させうる作用剤を意味する。「補助剤」は、たとえば細胞表現型をモジュレートしうるとともに、抗酸化剤およびＮＲＦ２アクチベーターを含みうる。補助剤としては、たとえば、２ＨＢＡ、アンドログラホリド、アスコルビン酸、カフェストール、カルノソールバルドキソロン－イミダゾール（ＣＤＤＯ－ｉｍ）、カルコン、Ｎ６－［２－［［４－（２，４－ジクロロフェニル）－５－（１Ｈ－イミダゾール－２－イル）－２－ピリミジニル］アミノ］エチル］－３－ニトロ－２，６－ピリジンジアミン（ＣＨＩＲ９８０１４）、コングロバチン、クルクミン、シクロアストラゲノール、１，２－ジチオール－３－チオン（Ｄ３Ｔ）、ドラマピモド、エダラボン、ＥＧＣＧ、ガンボギン酸、ガネテスピブ、ゲデュニン、ＩＱ－１、リモニン、ロニダミド、メラトニン、ベンズアミドテトラヒドロインドロン、Ｎ８８６、アルキルアミノビフェニルアミド、ノボビオシン、ピリドキサール５’－リン酸（Ｐ５’－Ｐ）、ピリチオン、ケルセチン、ラディシコール、レスベラトロール、Ｎ－（２－シアノ－３，１２－ジオキソ－２８－ノルオレアナ－１，９（１１）－ジエン－１７－イル）－２，２－ジフルオロ－プロパンアミドまたはオマベロキソロン（ＲＴＡ－４０８）、４－（４－フルオロフェニル）－２－（４－ヒドロキシフェニル）－５－（４－ピリジル）－１Ｈ－イミダゾール（ＳＢ２０２１９０）、３－（２，４－ジクロロフェニル）－４－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン（ＳＢ２１６７６３）、ＳＮＸ－５４２２（ＰＦ－０４９２９１１３）、ナトリウムブチレート、スルホラン、テトラブロモベンゾトリアゾール（ＴＢＢ）、ｔｅｒｔ－ブチルヒドロキノン（ｔＢＨＱ）、バルプロ酸（ｖａｌｐｏｒｉｃ ａｃｉｄ）、ウィタフェリンＡ、エルゴステロール、ルペノン、および任意のかかる補助剤のアナログが挙げられる。
【0154】
本明細書で用いられる場合、「セクレトーム」という用語は、生物細胞、組織、器官、および生物により分泌される有機分子および／または無機元素を意味する。
【0155】
本明細書で用いられる場合、「細胞の状態をモジュレートする」という表現は、細胞表現型、ある特定の遺伝子の発現パターン、またはある特定のタンパク質の分泌パターンの変化を意味する。
【0156】
本明細書で用いられる１～６個の炭素原子の直線状アルキル基（すなわち、Ｃ１～Ｃ６アルキル）という表現は、直線状または分岐状の部分を有するかつ１～６個の炭素原子を含有する飽和１価炭化水素基を意味する。「分岐状アルキル基」という用語は、１つ以上の第３級または第４級炭素原子を含むアルキル基を意味する。アルキル基は、置換（ＯＨ、ＮＨ２、Ｉ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ）または非置換でありうる。かかる基の例としては、限定されるものではないが、メチル、エチル、プロピル、ｉｓｏ－プロピル、ｎ－ブチル、ｉｓｏ－ブチル、およびｔｅｒｔ－ブチルが挙げられる。
【0157】
本明細書で用いられる場合、「置換」という用語は、基の１つ以上の水素原子が、独立して、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ヒドロキシ、メトキシ、エトキシ、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、シアノ、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルボキシ、クロロメチル、トリクロロメチル、トリフルオロメチル、メトキシエチルなどから選択される置換基で置き換えられた基を意味する。
【0158】
本明細書で用いられる場合、「１～３個の炭素原子の低級アルキル基」という用語は、メチル、エチル、プロピルを意味する。
【0159】
実施形態では、１種以上の化合物は、１種以上の薬学的に許容される担体、賦形剤、および／または希釈剤をさらに含む医薬組成物中に存在する。本明細書で用いられる場合、「薬学的に許容可能」（または「生物学的に許容可能」）とは、ｉｎ ｖｉｖｏで毒性のまたは有害な生物学的作用が不在である（または限られる）ことにより特徴付けられる材料を意味する。それは、過剰な毒性、炎症、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴うことなく、妥当な便益／リスク比に見合って、健全な医学的判断の範囲内で、被験体（たとえば、ヒト、動物）の生物学的流体および／または組織および／または器官に接触させて使用するのに好適な化合物、組成物、および／または投与製剤を意味する。
【0160】
「薬学的に許容される担体、賦形剤、および／または希釈剤」という用語は、医薬組成物の調製に通常使用される添加剤を意味し、たとえば、溶媒、分散媒、生理食塩水溶液、界面活性剤、可溶化剤、滑沢剤、乳化剤、コーティング剤、抗細菌剤および抗真菌剤、キレート化剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、緩衝剤、還元剤、抗酸化剤、等張化剤、吸収遅延剤などを含む（たとえば、Ｒｏｗｅ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ；６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００９を参照されたい）。
【0161】
実施形態では、１種以上の化合物は、細胞移植／組織工学のためのスキャフォールド材料、たとえば、幹細胞用のスキャフォールドとして通常使用されるバイオ材料、ポリマー、および／またはマトリックスとの組合せ／混合を行いうる。
【0162】
１種以上の化合物は、任意の従来の経路を介した投与、たとえば、静脈内、経口、経真皮、腹腔内、皮下、経粘膜、筋肉内、鼻腔内、肺内、非経口、または局所の投与に供すべく製剤化されうる。かかる製剤の調製は、当技術分野で周知である（たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ；２１ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００５を参照されたい）。
【0163】
また、以下の実施例に示されるように、１種以上の化合物で処理された細胞の培地（たとえばセクレトーム）は、死からの保護を付与しうるので、実施形態では、本明細書に記載の方法は、１種以上の化合物の存在下で細胞集団（たとえば、間葉幹細胞、ＣＤ１３３＋細胞、膵細胞、腎細胞、上皮および内皮細胞）を培養することと、前記培養物から培地または上清を捕集することと、前記培地または上清の存在下で細胞を接触させることと、を含む。
【0164】
実施形態では、細胞は、幹／多能性／前駆細胞または分化細胞、たとえば、造血幹細胞（ＨＳＣ）、造血前駆細胞（ＨＰＣ）、多能性前駆細胞（ＭＰＰ）、リンパ球前駆細胞、ミエロイド前駆細胞、間葉幹細胞（ＭＳＣ）、脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）などである。他の実施形態では、細胞は分化細胞である。
【0165】
細胞の出発集団は、好適な細胞を含有する身体または身体の器官から得られうる。捕集された細胞は、当業者に公知の方法により、たとえば、ある特定のマーカー（たとえば、ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋）の発現に基づいて、ある特定の特性を有する細胞を富化しうる。さらに、出発細胞集団は、直接使用しうるか、またはより後の時点で使用するために凍結貯蔵しうる。そのため、最初に、細胞集団を、プラスチック製品への接着または特異的細胞マーカーに基づく細胞のネガティブ選択および／もしくはポジティブ選択を含む富化工程または精製工程に付して、出発細胞集団の提供、たとえば、ＭＳＣが富化された出発細胞集団の提供を行いうる。特異的細胞マーカーに基づいて前記出発細胞集団を単離する方法は、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）技術または特異的細胞表面マーカーと相互作用する抗体もしくはリガンドが結合された固体もしくは不溶性基材を使用しうる。たとえば、抗体を含有する固体基材（たとえば、ビーズカラム、フラスコ、磁気粒子）に細胞を接触させ、そしていずれの非結合細胞も除去する。磁性または常磁性のビーズを含む固体基材を使用する場合、ビーズに結合された細胞は、磁気分離器を用いて容易に単離可能である（たとえば、磁気細胞選別、ＭＡＣＳ（登録商標）、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ（登録商標）のＣｌｉｎｉＭａｃｓ（登録商標）製品系列）。
【0166】
細胞は、たとえば大規模製造用バイオリアクターの通常の培養条件で、細胞の維持、成長、または増殖のいずれかに好適な培地中で培養しうる。細胞集団の培養条件は、さまざまな因子とくに出発細胞集団に依存して異なるであろう。好適な培養培地および条件は、当技術分野で周知である。本発明の方法は、組成に関連して、天然培地、半合成培地、または合成培地で行いうるとともに、形状に関連して、固形培地、半固形培地、または液状培地でありうる。また、細胞培養に使用される任意の栄養培地または規定培地でありうるとともに、１種以上の好適な因子が追加されうる。かかる培地は、典型的には、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン、塩素、アミノ酸、ビタミン、サイトカイン、ホルモン、抗生物質、血清、脂肪酸、糖などを含む。培養時、必要に応じて、他の化学成分または生体成分を単独でまたは組合せで導入しうる。培地に導入されるかかる成分は、ウシ胎仔血清、ヒト血清、ウマ血清、インスリン、トランスフェリン、ラクトフェリン、コレステロール、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、モノチオグリセロール、２－メルカプトエタノール、ウシ血清アルブミン、ナトリウムピルベート、ポリエチレングリコール、各種ビタミン、各種アミノ酸、寒天、アガロース、コラーゲン、メチルセルロース、各種サイトカイン、各種成長因子などでありうる。培地は、化学的規定、血清フリー、および／またはゼノフリーでありうる。
【0167】
１種以上の化合物による処理時または処理後、維持、成長、および／または増殖に好適な条件下で、細胞を培養しうる。
【0168】
上記の効果を媒介するために使用される１種以上の化合物の量は、当業者により決定しうる。実施形態では、濃度は、約１ｎＭ～約１ｍＭ、約１０ｎＭ～１００μＭ、または約１００ｎＭ～約１０μＭである。１０－５Ｍ～１０－１０Ｍ（１μＭ～１０μＭ、５μＭ～１０ｍＭを個別に含む）の濃度もまた、本発明により包含される。
【0169】
実施形態では、上記の接触させることは、培養培地に単回用量または複数回用量の１種以上の化合物を添加することを含む。
【0170】
化合物による処理は、ｉｎ ｖｉｖｏで患者に、および細胞、組織、器官に施しうるとともに、次いで、以上に記載したように捕集しうる。
【0171】
次いで、細胞集団を洗浄して１種以上の化合物および／または細胞培養物の任意の他の成分を取り出し、そして適切な細胞懸濁培地中に再懸濁し、ウォッシュアウトするかまたは短期使用のために接触維持するかまたは凍結保存に好適な培地などの長期貯蔵培地中に維持しうる。
【0172】
細胞、より特定的には幹細胞の移植／輸液が奏効しうる被験体としては、心不全、狭心症、心筋梗塞（たとえば、心臓／心虚血）、不整脈、弁膜性心疾患、心筋／心膜疾患、先天性心疾患（たとえば、心房中隔欠損症、心室中隔欠損症、動脈管開存症、ファロー四徴症）、動脈疾患（たとえば、動脈硬化症、動脈瘤など）、静脈疾患（たとえば、静脈瘤）、重篤な肢または器官虚血（肝虚血など）、変形性関節疾患、骨関節炎、関節リウマチ、骨障害（たとえば、骨炎、骨粗鬆症、骨関節炎、骨肉腫）、皮膚障害（たとえば、乾癬、湿疹、皮膚癌）、角膜疾患（たとえば、円錐角膜、角膜炎）、肝疾患（たとえば、急性および慢性の肝不全、肝炎、尿素サイクル障害をはじめとする遺伝子欠損）、肺疾患（たとえば、ＣＯＰＤ、ＡＲＤＳ、肺炎）、腎疾患（たとえば、ＣＫＤ）、筋骨格傷害、腱炎、全身性疾患（たとえば、敗血症）、癌、障害、ＣＮＳ疾患をはじめとする変性疾患（たとえば、アルツハイマー病、パーキンソン病、認知症、ＡＬＳ）、および脊髄傷害に罹患している被験体が挙げられうる。
【0173】
１種以上の化合物は、上述した疾患／障害／病態の治療に使用される他の療法／薬剤と組み合わせて使用しうる。１種以上の化合物は、任意の従来の剤形で投与または共投与しうる（たとえば、逐次的に、同時に、異なる時間に）。本発明との関連での共投与とは、改善された臨床アウトカムを達成するための協調治療の過程における２種以上の治療剤の投与を意味する。かかる共投与はまた、共延性でありうる。すなわち、時間のオーバーラップ期間中に生じうる。たとえば、１種以上の化合物は、追加の活性剤または療法を施す前、施すと同時、施す前かつ施した後、または施した後に被験体に投与しうる。活性剤（たとえば、１種以上の化合物および追加の活性剤）は、実施形態では、単一の組成物で組合せ／製剤化を行いうるので、同時に投与しうる。
【0174】
任意の好適量の１種以上の化合物またはそれを含む医薬組成物は、被験体に投与しうる。投与量および投与頻度は、投与モードをはじめとする多くの因子に依存するであろう。所与の疾患または病態の予防、治療、または重症度低減を行う場合、１種以上の化合物／組成物の適切な投与量は、治療される疾患または病態のタイプ、疾患または病態の重症度および経過、化合物／組成物が予防または治療のいずれの目的で投与されるか、以前の療法、患者の臨床歴および化合物／組成物に対する反応、ならびに担当医の自由裁量に依存するであろう。化合物／組成物は、好適には、一度にまたは一連の処理にわたり患者に投与される。好ましくは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで用量－反応曲線を決定し、次いで、ヒトで試験する前に有用動物モデルで決定することが望ましい。本発明は、化合物およびそれを含む組成物の投与量を提供する。たとえば、疾患のタイプおよび重症度に依存して、１日当たり約１μｇ／ｋｇ～１０００ｍｇ／ｋｇ体重（ｍｇ／ｋｇ）である。さらに、有効用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、５５ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、７５ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、１２５ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇ、１７５ｍｇ／ｋｇ、または２００ｍｇ／ｋｇでありうるとともに、２５ｍｇ／ｋｇの増分で１０００ｍｇ／ｋｇまで増加させうるか、または上記の値の任意の２つの間の範囲内でありうる。典型的な一日投与量は、以上に挙げた因子に依存して、約１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇの範囲内でありうる。数日間またはそれ以上にわたり繰返し投与を行う場合、病態に依存して、疾患症状の所望の抑制または臨床エンドポイントが得られるまで、治療を継続する。１種以上の化合物は、適切な頻度で、たとえば、１回、１日１回、１週間に２回、毎週、２週間に１回、毎月投与しうる。しかしながら、他の投与レジメンが有用でありうる。この療法の進行状況は、従来の技術およびアッセイにより容易にモニターされる。実際の用量は、各患者に特有の臨床因子に基づいて、担当医が注意深く選択調整しなければならないので、これらは、単なるガイドラインである。最適用量は、当技術分野で公知の方法により決定されるであろう。また、患者の年齢などの因子および他の臨床関連因子により影響されるであろう。それに加えて、患者は、他の疾患または病態に対する投薬を受けうる。
【0175】
同様に、プレコンディショニングされた細胞を患者に投与する場合、輸液される細胞の数は、性別、年齢、体重、疾患または障害のタイプ、障害のステージ、細胞集団中の所望の細胞のパーセント、治療効果を得るのに必要とする細胞の量などの因子を考慮するであろう。特定の一実施形態では、組成物は、静脈内注入により投与され、少なくとも約１×１０４細胞／ｋｇまたは少なくとも約１×１０５細胞／ｋｇ、たとえば、約１×１０４細胞／ｋｇ～約１×１０８細胞／ｋｇ、または約１×１０４細胞／ｋｇ～約１×１０７細胞／ｋｇを含む。
【0176】
本明細書に記載の方法を用いて治療しうる被験体は、限定されるものではないが、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、モルモット、ラット、サル、または他のウシ科動物、ヒツジ科動物、ウマ科動物、イヌ科動物、ネコ科動物、齧歯動物、もしくはネズミ科動物の種、霊長動物をはじめとする哺乳動物、好ましくは男性または女性のヒトである。
【0177】
本明細書に記載の方法の他の用途としては、たとえば、組織、移植片（たとえば、血管移植片）、およびｅｘ ｖｉｖｏ器官灌流（たとえば、肺灌流（ＥＶＬＰ））の保持が挙げられる。
【実施例】
【0178】
本発明を実施するための形態
本発明は、限定されるものではないが以下の実施例によりさらに詳細に例示される。
本発明は、限定されるものではないが以下の実施例によりさらに詳細に例示される。
【0179】
実施例１：細胞コンディショニング剤としてのＨＳＰ９０コシャペロン阻害剤
ｉｎ ｖｉｖｏ細胞生存能を保証可能であるコンディショニング化合物を同定する試みの中で、セラストロールを用いた予備証拠に基づいて、文献およびＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）構造検索オンラインツールを介して同定された構造類似性を有する１２種を超える化合物をスクリーニングした。低酸素ストレスにチャレンジされたヒトＭＳＣの生存能を向上させる化合物の能力を測定した。スクリーニングされた分子は、そのほとんどが天然化合物であり、トリテルペノイド、リモノイド、ウィタノライド、ステロール、イソプレノイド／ジテルペン、およびフラボノイドとして分類可能である。ＨＳＰ９０９のＮＴ領域のＡＴＰ結合ポケットを直接標的とするラディシコール（ＮＴ阻害剤）などの古典的ＨＳＰ９０阻害剤もまた、スクリーニングに加えた。スクリーニングは、低酸素ストレス時の細胞の生存能の向上（図１：Ａ、Ｂ）およびレポーターベースのアッセイから分かるＨＳＰ発現の誘導能（図１Ｃ）に関して化合物のさまざまな有効性を示した。セラストロールと構造類似性を共有するウィタノライドおよびゲデュニンをはじめとする上位にスコア付けされた化合物のいくつかでは、これらの効率的コンディショニング化合物の多くは、ＨＳＰ９０コシャペロン相互作用を標的とするＨＳＰ９０モジュレーターファミリーに属することが、新たな証拠から示される１０ １１ １２。
９Ｒｏｅ ＳＭ．Ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ １９９９ Ｊａｎ ２８；４２（２）：２６０－６．
１０Ｐａｔｗａｒｄｈａｎ Ｃ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１３ Ｍａｒ ８；２８８（１０）：７３１３－２５．
１１Ｓｒｅｅｒａｍｕｌｕ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ．２００９；４８（３２）：５８５３－５．
１２Ｇｕ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇｓ．２０１４ Ｆｅｂ；３２（１）：６８－７４．
ｉｎ ｖｉｖｏ細胞生存能を保証可能であるコンディショニング化合物を同定する試みの中で、セラストロールを用いた予備証拠に基づいて、文献およびＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）構造検索オンラインツールを介して同定された構造類似性を有する１２種を超える化合物をスクリーニングした。低酸素ストレスにチャレンジされたヒトＭＳＣの生存能を向上させる化合物の能力を測定した。スクリーニングされた分子は、そのほとんどが天然化合物であり、トリテルペノイド、リモノイド、ウィタノライド、ステロール、イソプレノイド／ジテルペン、およびフラボノイドとして分類可能である。ＨＳＰ９０９のＮＴ領域のＡＴＰ結合ポケットを直接標的とするラディシコール（ＮＴ阻害剤）などの古典的ＨＳＰ９０阻害剤もまた、スクリーニングに加えた。スクリーニングは、低酸素ストレス時の細胞の生存能の向上（図１：Ａ、Ｂ）およびレポーターベースのアッセイから分かるＨＳＰ発現の誘導能（図１Ｃ）に関して化合物のさまざまな有効性を示した。セラストロールと構造類似性を共有するウィタノライドおよびゲデュニンをはじめとする上位にスコア付けされた化合物のいくつかでは、これらの効率的コンディショニング化合物の多くは、ＨＳＰ９０コシャペロン相互作用を標的とするＨＳＰ９０モジュレーターファミリーに属することが、新たな証拠から示される１０ １１ １２。
９Ｒｏｅ ＳＭ．Ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ １９９９ Ｊａｎ ２８；４２（２）：２６０－６．
１０Ｐａｔｗａｒｄｈａｎ Ｃ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１３ Ｍａｒ ８；２８８（１０）：７３１３－２５．
１１Ｓｒｅｅｒａｍｕｌｕ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ．２００９；４８（３２）：５８５３－５．
１２Ｇｕ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇｓ．２０１４ Ｆｅｂ；３２（１）：６８－７４．
【0180】
実施例２：セラストロールはｉｎ ｖｉｖｏ移植細胞保持性を向上させるとともにパラクリン分泌を増強する
セラストロールは、移植細胞のｉｎ ｖｉｖｏ生存能および保持性を向上させることが、以下に記載の結果から示される。簡潔に述べると、ラットＭＳＣをコンディショニング化合物によりサスペンジョン状態で６０分間処理した。次いで、細胞を洗浄し、蛍光セルトラッカーで標識し、そしてｔ＝０でラット虚血左後肢に注射した。ＡＲＴ製のＯｐｔｉｘ（商標）ＭＸ３分子イメージングシステムを用いて９日目までｉｎ ｖｉｖｏで移植細胞を撮像した（図２：Ａ、Ｂ）。プレ処理幹細胞のｉｎ ｖｉｖｏ生存能および保持性の向上が結果から示され、レーザードップラースキャニングから分かる血流再建の向上傾向が説明される（図３）。ヒトＭＳＣのセラストロール処理は、培養培地中で熱ショックタンパク質（ＨＳＰ９０ａは７，０倍、ＨＳＰ９０ｂは２，２倍、ＨＯ１は２，２倍、ＨＳＰ７０は１，８倍）、成長因子およびサイトカイン（ＭＣＳＦは２４，４倍、ＨＧＦは２，１倍）、ならびに抗酸化反応関連遺伝子（ＧＳＨは２，８倍、ＴＲＸは２，５倍、ＣＡＴは１，７倍）のレベルの増加から分かるように、幹細胞機能を維持および向上させることが、プロテオミクス分析から示される（図４）。
セラストロールは、移植細胞のｉｎ ｖｉｖｏ生存能および保持性を向上させることが、以下に記載の結果から示される。簡潔に述べると、ラットＭＳＣをコンディショニング化合物によりサスペンジョン状態で６０分間処理した。次いで、細胞を洗浄し、蛍光セルトラッカーで標識し、そしてｔ＝０でラット虚血左後肢に注射した。ＡＲＴ製のＯｐｔｉｘ（商標）ＭＸ３分子イメージングシステムを用いて９日目までｉｎ ｖｉｖｏで移植細胞を撮像した（図２：Ａ、Ｂ）。プレ処理幹細胞のｉｎ ｖｉｖｏ生存能および保持性の向上が結果から示され、レーザードップラースキャニングから分かる血流再建の向上傾向が説明される（図３）。ヒトＭＳＣのセラストロール処理は、培養培地中で熱ショックタンパク質（ＨＳＰ９０ａは７，０倍、ＨＳＰ９０ｂは２，２倍、ＨＯ１は２，２倍、ＨＳＰ７０は１，８倍）、成長因子およびサイトカイン（ＭＣＳＦは２４，４倍、ＨＧＦは２，１倍）、ならびに抗酸化反応関連遺伝子（ＧＳＨは２，８倍、ＴＲＸは２，５倍、ＣＡＴは１，７倍）のレベルの増加から分かるように、幹細胞機能を維持および向上させることが、プロテオミクス分析から示される（図４）。
【0181】
簡潔に述べると、セラストロール（１０Ｅ－６Ｍ～１０Ｅ－８Ｍ）または媒体（ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ））のいずれかを含有する低血清培地（αＭＥＭ １×、１％（ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％ペニシリン―ストレプトマイシン（Ｐ－Ｓ））と共にラットＭＳＣを１時間インキュベートした。次いで、培地を吸引し、培地（αＭＥＭ １×、１％ＦＢＳ、１％Ｐ－Ｓ）を３回交換して細胞を洗浄する。細胞をトリプシン処理し、蛍光イメージング（Ｏｐｔｉｘ ＭＸ２）で検出可能にする製造業者のプロトコルに従ってＶｙｂｒａｎｔ ＣＦＤＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色する。次いで、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ ＩＩ ＦＬ自動セルカウンター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて細胞をカウントし、２６Ｇ針およびシリンジを用いて全体積２００μｌ中の生存可能な３００万ＭＳＣをラット虚血後肢モデルの５つの異なる点に注射する。
【0182】
スプラーグ・ドーリーラット（ＣＤ ＣＲＬ：Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を麻酔し（イソフルラン２．５～３．０％（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）、１Ｌ／ｍｉｎ酸素）、ブピバカイン（ｂｕｐｉｖｉｃａｉｎｅ）を大腿（２ｍｇ／ｋｇ ｓｃ ｑｄ）の切開部位に注射する。左総大腿動脈を透明化し、伏在動脈の遠位部およびすべて側副枝および静脈を切除する。鼡径靭帯と膝との間の動脈の近位部および遠位部を切除する。そのため、大腿動脈の枝はいずれも側副枝を形成できない。各動物の右下肢をインタクトな状態に保持し、対照として機能させる。Ｖｉｃｒｙｌ ５－０を用いて創傷を閉じる。動物に塩酸ブプレノルフィン（０．０５ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ． ｂｉｄ ３日間）を投与し、Ｄｉａｍｏｎｄソフトリター上のケージに配置する。外科手順の翌日、ＰＢＳまたは媒体もしくは実験化合物で前処理されたＭＳＣを注射する。動物を麻酔し（イソフルラン２．５～３．０％（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）、１Ｌ／ｍｉｎ酸素）、２６Ｇ針およびシリンジを用いて四頭筋の５つの異なる点に細胞を直接注射する。
【0183】
ＡＲＴ製のＯｐｔｉｘ（商標）ＭＸ３分子イメージングシステムを用いて９日目までｉｎ ｖｉｖｏで移植細胞を撮像し、並行的に、ラットの後肢のドップラースキャニング（Ｍｏｏｒ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を行うことにより、コンディショニングされたｒＭＳＣの移植後、ラット下肢の虚血モデル（ｎ＝３）で血流（膝下）の回復を調べた。
【0184】
セラストロールでコンディショニングされた細胞は、媒体で処理された細胞と比較して、ラット虚血後肢に移植された幹細胞の生存能および保持性を向上させ、かつ罹患肢の血流の漸進的回復（対数パターンに見られる）を改善する。
【0185】
実施例３：幹細胞ファーマコオプティマイザーの同定
幹細胞ファーマコオプティマイザーの同定基準
幹細胞ファーマコオプティマイザーの同定基準は、以下の２つの主要条件を好ましく満たす処理の能力に依拠する。
１． 細胞の処理は、虚血組織で観測される低酸素および／または酸化マイクロ環境においてとくに幹細胞移植との関連でｉｎ ｖｉｖｏ生存能および保持プロファイルの向上を好ましくもたらす。
２． 細胞の処理は、正常な細胞表現型および／または機能の維持をできる限り好ましく可能にする。しかしながら、きわめて望ましいファーマコオプティマイザーはまた、有益または治療的な表現型を促進する細胞機能を向上させうる。組織修復がパラクリン活性を含む幹細胞の場合には、ファーマコオプティマイザーは、有益なタンパク質の分泌増強および／または有害なタンパク質の産生低減を好ましく行いうるとともに、それにより、移植片環境に対して有利なバランスおよび効果が得られる。
幹細胞ファーマコオプティマイザーの同定基準
幹細胞ファーマコオプティマイザーの同定基準は、以下の２つの主要条件を好ましく満たす処理の能力に依拠する。
１． 細胞の処理は、虚血組織で観測される低酸素および／または酸化マイクロ環境においてとくに幹細胞移植との関連でｉｎ ｖｉｖｏ生存能および保持プロファイルの向上を好ましくもたらす。
２． 細胞の処理は、正常な細胞表現型および／または機能の維持をできる限り好ましく可能にする。しかしながら、きわめて望ましいファーマコオプティマイザーはまた、有益または治療的な表現型を促進する細胞機能を向上させうる。組織修復がパラクリン活性を含む幹細胞の場合には、ファーマコオプティマイザーは、有益なタンパク質の分泌増強および／または有害なタンパク質の産生低減を好ましく行いうるとともに、それにより、移植片環境に対して有利なバランスおよび効果が得られる。
【0186】
候補幹細胞ファーマコオプティマイザーの試験方法
第１の主要条件を試験するために、ＭＳＣ（ラットまたはヒトのいずれかの起源）を候補ファーマコオプティマイザーで処理し、洗浄し、虚血移植片マイクロ環境に存在する主要な致死ストレッサーをミミックする低酸素／血清飢餓（＜１％Ｏ２低酸素チャンバー内の低血清培地中に４８～７２時間）または酸化ストレス（０～２ｍＭ Ｈ２Ｏ２でスパイクされた培地中で１時間インキュベーション）に付した。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ生存能／細胞傷害キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））を用いて細胞の生存状態を評価し、Ｈａｒｍｏｎｙ自動解析ソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（商標））を備えたＯｐｅｒｅｔｔａハイコンテントスクリーニング（ＨＣＳ）機器により結果を定量する。
第１の主要条件を試験するために、ＭＳＣ（ラットまたはヒトのいずれかの起源）を候補ファーマコオプティマイザーで処理し、洗浄し、虚血移植片マイクロ環境に存在する主要な致死ストレッサーをミミックする低酸素／血清飢餓（＜１％Ｏ２低酸素チャンバー内の低血清培地中に４８～７２時間）または酸化ストレス（０～２ｍＭ Ｈ２Ｏ２でスパイクされた培地中で１時間インキュベーション）に付した。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ生存能／細胞傷害キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））を用いて細胞の生存状態を評価し、Ｈａｒｍｏｎｙ自動解析ソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（商標））を備えたＯｐｅｒｅｔｔａハイコンテントスクリーニング（ＨＣＳ）機器により結果を定量する。
【0187】
第２の主要条件を試験するために、ＭＳＣを候補ファーマコオプティマイザーで１時間処理し、続いて、３時間のウォッシュアウト時間を設けた。細胞ｍＲＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲにより対象遺伝子の発現を定量した。追加のＭＳＣ培養では、細胞を１時間処理し、洗浄し、低血清培地中で２４時間培養した。次いで、ＭＳＣにより分泌されたパラクリン因子を含有する培地をＨ９ｃ２心筋芽細胞細胞系に接触させて配置した。次いで、Ｈ９ｃ２細胞を低酸素／血清飢餓（＜１％Ｏ２低酸素チャンバー内の低血清培地中に４８時間）または酸化ストレス（０～１ｍＭ Ｈ２Ｏ２でスパイクされた培地中で１時間インキュベーション）に付した。以上に詳述したＬＩＶＥ／ＤＥＡＤアッセイを用いてＨ９ｃ２細胞の生存状態を評価した。
【0188】
コンディショニングされたＭＳＣの保護およびコンディショニングされたＭＳＣ培地でインキュベートしたときにパラクリン機序によりＨ９ｃ２に与えられる保護を担う機序を同定するために、２つの主要な細胞経路、すなわち、ＨＳＰ９０標的化を介する熱ショック経路（ＨＳＦ１活性化）および／または核因子（エリスロイド由来２）様２（ＮＲＦ２）経路を標的とするコンディショニング剤として各種分子を選択した。
【0189】
試験化合物（図５）：
・セラストロール：強力なＨＳＦ１アクチベーター（ＨＳＰ９０補因子阻害）、ＮＲＦ２アクチベーター
・ゲデュニン：ＨＳＦ１アクチベーター（ＨＳＰ９０補因子阻害）、ＮＲＦ２アクチベーター
・ラディシコール：ＨＳＦ１アクチベーター（ＨＳＰ９０古典的ＡＴＰ阻害剤）、ＮＲＦ２活性の報告なし
・ＥＧＣＧ：ＨＳＦ１活性化の報告なし（ＨＳＰ９０－ＣＴ阻害）、ＮＲＦ２アクチベーター
・ｔＢＨＱ：ＨＳＦ１活性化の報告なし、ＮＲＦ２アクチベーター
・セラストロール：強力なＨＳＦ１アクチベーター（ＨＳＰ９０補因子阻害）、ＮＲＦ２アクチベーター
・ゲデュニン：ＨＳＦ１アクチベーター（ＨＳＰ９０補因子阻害）、ＮＲＦ２アクチベーター
・ラディシコール：ＨＳＦ１アクチベーター（ＨＳＰ９０古典的ＡＴＰ阻害剤）、ＮＲＦ２活性の報告なし
・ＥＧＣＧ：ＨＳＦ１活性化の報告なし（ＨＳＰ９０－ＣＴ阻害）、ＮＲＦ２アクチベーター
・ｔＢＨＱ：ＨＳＦ１活性化の報告なし、ＮＲＦ２アクチベーター
【0190】
図６～９に報告されるこれらの実験の結果は、以下のようにまとめうる。
・ＨＳＦ１誘導可能な化合物（セラストロール、ゲデュニン、ラディシコール）は、低酸素誘導死から細胞を保護する（図６）。
・ＨＳＰ９０補因子阻害剤（セラストロール、ゲデュニン）は、パラクリン有効性のメディエーターを生成する（図６、７）。
・ＨＳＰ９０ＮＴ阻害剤（ラディシコール）は、パラクリン有効性のメディエーターを生成しない（図７）。
・ＨＳＰ９０ＣＴ阻害剤（ＥＧＣＧ）は、処理された細胞を低酸素から保護しないが、セラストロール誘導保護に関して相加効果を生じる。（図６）。
・ＮＲＦ２アクチベーター（ＥＧＣＧ、ゲデュニン、セラストロール）は、処理された細胞を酸化ストレス誘導死から保護する。ＥＧＣＧは、セラストロール誘導保護に関して相加効果を生じる（図８）。
・セラストロール以外のＮＲＦ２アクチベーター（ＥＧＣＧ、ｔＢＨＱ、ゲデュニン）は、酸化ストレス誘導死からの保護のためのパラクリンメディエーターを生成する（図９）。
・ＨＳＦ１誘導可能な化合物（セラストロール、ゲデュニン、ラディシコール）は、低酸素誘導死から細胞を保護する（図６）。
・ＨＳＰ９０補因子阻害剤（セラストロール、ゲデュニン）は、パラクリン有効性のメディエーターを生成する（図６、７）。
・ＨＳＰ９０ＮＴ阻害剤（ラディシコール）は、パラクリン有効性のメディエーターを生成しない（図７）。
・ＨＳＰ９０ＣＴ阻害剤（ＥＧＣＧ）は、処理された細胞を低酸素から保護しないが、セラストロール誘導保護に関して相加効果を生じる。（図６）。
・ＮＲＦ２アクチベーター（ＥＧＣＧ、ゲデュニン、セラストロール）は、処理された細胞を酸化ストレス誘導死から保護する。ＥＧＣＧは、セラストロール誘導保護に関して相加効果を生じる（図８）。
・セラストロール以外のＮＲＦ２アクチベーター（ＥＧＣＧ、ｔＢＨＱ、ゲデュニン）は、酸化ストレス誘導死からの保護のためのパラクリンメディエーターを生成する（図９）。
【0191】
まとめると、細胞生存能の向上に最適なファーマココンディショニング処理は、ＨＳＦ１誘導可能なＨＳＰ９０補因子阻害剤の活性（直接的パラクリン効果を介する低酸素誘導死に対する回復力）と抗酸化ＮＲＦ２経路インデューサーの活性（直接的パラクリン効果を介する酸化ストレス誘導死に対する回復力）とを組み合わせたものであることが、これらの結果から実証される。ＥＧＣＧは、セラストロール刺激細胞保護を強化するということが発見された。
【0192】
生存能向上（幹細胞ファーマコオプティマイザー選択の第１の基準）に加えて、発現プロファイルの向上（幹細胞ファーマコオプティマイザー選択の第２の基準）を、ＨＳＰ、成長因子（ＧＦ）、抗酸化タンパク質／酵素、および炎症に関与するサイトカインのｍＲＮＡ発現の定量を介して、評価した。単独および組合せの処理を試験した。
【0193】
試験した組合せ処理－第１の実験：
セラストロール（１μＭ）またはゲデュニン（１μＭ）＋ＥＧＣＧ（１μＭ、１０μＭ）またはＴＢＨＱ（１μＭ、５μＭ）
セラストロール（１μＭ）またはゲデュニン（１μＭ）＋ＥＧＣＧ（１μＭ、１０μＭ）またはＴＢＨＱ（１μＭ、５μＭ）
【0194】
図１０～２１に報告されるこれらの実験の結果は、以下のようにまとめうる。
【0195】
ＨＳＰの発現
・ＥＧＣＧおよびｔＢＨＱは、セラストロール誘導ＨＳＰ７０およびＨＳＰ３２発現の相乗的増加を生じる（図１０、１１）。２つの他のｒＭＳＣ細胞系では、ＥＧＣＧはまた、セラストロール誘導ＨＳＰ７０発現の相乗的増加を生じたが、ｔＢＨＱは、セラストロール誘導変化に効果がなかった。
・ＥＧＣＧは、ヒトＭＳＣにおいてセラストロール誘導ＨＳＰ７０およびＨＳＰ３２発現の相乗的用量依存増加を生じる（図１２、１３）。
・ＥＧＣＧおよびｔＢＨＱは、セラストロール誘導ＨＳＰ７０およびＨＳＰ３２発現の相乗的増加を生じる（図１０、１１）。２つの他のｒＭＳＣ細胞系では、ＥＧＣＧはまた、セラストロール誘導ＨＳＰ７０発現の相乗的増加を生じたが、ｔＢＨＱは、セラストロール誘導変化に効果がなかった。
・ＥＧＣＧは、ヒトＭＳＣにおいてセラストロール誘導ＨＳＰ７０およびＨＳＰ３２発現の相乗的用量依存増加を生じる（図１２、１３）。
【0196】
成長因子（ＧＦ）の発現
・ＥＧＣＧは、ＦＧＦ２およびＶＥＧＦのセラストロール刺激発現を相乗的に増強するが、ＴＢＨＱは、ＦＧＦ２およびＶＥＧＦの両方のセラストロール発現およびゲデュニン発現をそれぞれ増加および減少させる（図１４、１５）。
・ＥＧＣＧは、ＦＧＦ２およびＶＥＧＦのセラストロール刺激発現を相乗的に増強するが、ＴＢＨＱは、ＦＧＦ２およびＶＥＧＦの両方のセラストロール発現およびゲデュニン発現をそれぞれ増加および減少させる（図１４、１５）。
【0197】
抗酸化因子の発現
・ＥＧＣＧは、ＣＡＴ、ＧＰｘ、ＧＲ、およびＳＯＤ１のセラストロール刺激発現を相乗的に増強する（図１６、１７、１８、１９）。
・ｔＢＨＱは、ＣＡＴ、ＧＰｘ、ＧＲのセラストロール刺激発現を相乗的に増強し（低用量ｔＢＨＱ）、ＳＯＤ１発現に効果がない。
・ＥＧＣＧは、ＣＡＴ、ＧＰｘ、ＧＲ、およびＳＯＤ１のセラストロール刺激発現を相乗的に増強する（図１６、１７、１８、１９）。
・ｔＢＨＱは、ＣＡＴ、ＧＰｘ、ＧＲのセラストロール刺激発現を相乗的に増強し（低用量ｔＢＨＱ）、ＳＯＤ１発現に効果がない。
【0198】
炎症性サイトカインの発現
・セラストロールおよびゲデュニンは、ＥＧＣＧおよびｔＢＨＱによるＩＬ１β誘導発現をダウンレギュレートする（図２０）。
・ＥＧＣＧおよびｔＢＨＱは、ＴＮＦαのセラストロールおよびゲデュニン誘導ダウンレギュレーションを増強する（図２１）。
・セラストロールおよびゲデュニンは、ＥＧＣＧおよびｔＢＨＱによるＩＬ１β誘導発現をダウンレギュレートする（図２０）。
・ＥＧＣＧおよびｔＢＨＱは、ＴＮＦαのセラストロールおよびゲデュニン誘導ダウンレギュレーションを増強する（図２１）。
【0199】
まとめると、ＥＧＣＧは、幹細胞機能に有利な因子のセラストロール刺激発現を相乗的に増強することが、これらの結果から示される。理論により拘束されることを望むものではないが、これは、セラストロール効果の向上のために未知のセラストロール機能リプレッサーまたはＨＳＰ９０コンフォメーション安定化がＥＧＣＧにより阻害されることに起因しうる。相乗効果が少なくとも部分的にはＮＲＦ２メディエーターの活性化および／または細胞レドックスバランスの正常化に続いて起こりうることも、除外できない。実際には、ＨＳＰ９０阻害活性をまったく有していないｔＢＨＱは、ＭＳＣの少なくとも１つのラット系でセラストロール刺激発現に対して相乗効果または相加効果を示す。最後に、セラストロールまたはゲデュニンとのＥＧＣＧおよびｔＢＨＱの共処理はさらに、炎症性サイトカインをダウンレギュレートする。
【0200】
生存能および発現の結果の編集を図２２Ａおよび２２Ｂに示す。好適な移植片マイクロ環境を提供する最適なファーマココンディショニング処理は、以下を組み合わせたものであるという証拠が、これらの結果から提供される。
１． 低酸素誘導死に対して細胞生存能を向上させるとともに各種有益なパラクリン因子（ＨＳＰ、ＧＦ、抗酸化分子）の発現増加および炎症性メディエーターの発現低減を促進することが示されたＨＳＰ９０阻害剤効果（ＨＳＦ１誘導可能なＨＳＰ９０補因子阻害）、および
２． 酸化ストレス誘導死に対する耐性を向上させるとともにある特定の有益なパラクリン因子の発現増強（相加的または相乗的）および／または炎症性サイトカインメディエーターのさらなるダウンレギュレーションを行うことが示されたＮＲＦ２活性（潜在的ＨＳＰ９０ＣＴ阻害を有する）
１． 低酸素誘導死に対して細胞生存能を向上させるとともに各種有益なパラクリン因子（ＨＳＰ、ＧＦ、抗酸化分子）の発現増加および炎症性メディエーターの発現低減を促進することが示されたＨＳＰ９０阻害剤効果（ＨＳＦ１誘導可能なＨＳＰ９０補因子阻害）、および
２． 酸化ストレス誘導死に対する耐性を向上させるとともにある特定の有益なパラクリン因子の発現増強（相加的または相乗的）および／または炎症性サイトカインメディエーターのさらなるダウンレギュレーションを行うことが示されたＮＲＦ２活性（潜在的ＨＳＰ９０ＣＴ阻害を有する）
【0201】
興味深いことに、本出願人は、２ＨＢＡ、ｔＢＨＱ、およびＥＧＣＧがまた、セラストロールと組み合わせたとき、酸化ストレス（１ｍＭ Ｈ２Ｏ２中で１時間インキュベーション）によりチャレンジされたＨ９ｃ２心筋芽細胞の生存能を向上させる際に相乗的な向上をもたらすことを見いだした（図８Ｂ）。
【0202】
実施例４：幹細胞ファーマコオプティマイザーとしてのセラストロールアナログの同定
実施例３に記載のものに類似した方法を用いて、本出願人は、図２３で例証されたものを含めていくつかのセラストロールアナログを試験し、幹細胞ファーマコオプティマイザーとして作用する能力を有するいくつかを同定した（図２４、２５Ａ、２５Ｂ、２６Ａ～２６Ｄ）。
実施例３に記載のものに類似した方法を用いて、本出願人は、図２３で例証されたものを含めていくつかのセラストロールアナログを試験し、幹細胞ファーマコオプティマイザーとして作用する能力を有するいくつかを同定した（図２４、２５Ａ、２５Ｂ、２６Ａ～２６Ｄ）。
【0203】
本出願人はまた、セラストロールまたはセラストロールアナログと潜在的補助剤（たとえば、ＮＲＦ－２アクチベーターおよび／または抗酸化剤、図２４）とのいくつかの組合せ処理を試験し、ＨＳＰ、成長因子（ＧＦ）、抗酸化タンパク質／酵素、サイトカイン、マトリックスリモデリングタンパク質の発現に対して相乗効果（Ｓ）または相加効果（Ａ）を有するいくつかの組合せを同定した（図２５Ａ、２５Ｂ、および図２６Ａ～２６Ｄ）。これらのデータから分かるように、アナログ３、アナログ１、ジヒドロセラストロール、およびセラストロールは、最良クラスのＨＳＰ９０阻害剤であり、２ＨＢＡ、ＥＧＣＧ、クルクミン、ｔＢＨＱ、およびカルノソールは、トップクラスの補助剤として同定された。
【0204】
そのほか、セラストロールと２ＨＢＡ、ＥＧＣＧ、ｔＢＨＱ、またはクルクミンとの組合せによるヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）の１時間処理は、４８時間の通常培養後、ＶＥＧＦタンパク質の相加的～相乗的な増加をもたらすが、梗塞マイクロ環境で見られる低酸素条件での同一細胞の４８時間培養は、ＶＥＧＦタンパク質のさらに多くの発現をもたらす（図２６Ｆ）。セラストロールと２ＨＢＡおよびＥＧＣＧ補助剤との組合せにより１時間処理してから正常酸素または低酸素の条件で３時間のウォッシュアウト時間を設けたＨ９ｃ２心筋芽細胞でも、同一の観測結果、すなわち、ＨＯ－１抗酸化剤およびＶＥＧＦａ血管形成因子のｍＲＮＡ発現の増加が本質的に見られる（図２６Ｅ）。
【0205】
実施例５：セラストロールは凍結保存後のｒＭＳＣ生存能を向上させる
適正凍結保存は、凍結保存プロトコルが移植前に許容可能な解凍後生存能（≧７０％）をもたらすことを実証する必要がある細胞処理実験室の重要な側面である。たとえば、凍結保存は、解凍肝細胞の著しい変化を誘導し、その生存能、付着、および機能を損なうことが、研究から実証されている。凍結保存前のセラストロールによるｒＭＳＣの１時間プレコンディショニングは、解凍後ｒＭＳＣ生存能を向上させることが、図２７Ａに提示された結果から示される。
適正凍結保存は、凍結保存プロトコルが移植前に許容可能な解凍後生存能（≧７０％）をもたらすことを実証する必要がある細胞処理実験室の重要な側面である。たとえば、凍結保存は、解凍肝細胞の著しい変化を誘導し、その生存能、付着、および機能を損なうことが、研究から実証されている。凍結保存前のセラストロールによるｒＭＳＣの１時間プレコンディショニングは、解凍後ｒＭＳＣ生存能を向上させることが、図２７Ａに提示された結果から示される。
【0206】
雄ラット（１７５～２００ｇ）後肢（ｈｉｄｌｉｍｂ）骨髄から間葉幹細胞（ＭＳＣ）を単離し、記載のように拡大させる。簡潔に述べると、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）グラジエント遠心分離により骨髄単核細胞（ＢＭＮＣ）を単離し、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）および１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐ－Ｓ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ１５１４０）を有する最少必須培地α１×（αＭＥＭ １×：Ｇｉｂｃｏ１２５７１）中で培養する。４８時間後、非付着細胞を廃棄し、新しい培地で細胞を洗浄する。ポリスチレン表面への優先的付着に基づいて造血細胞からＭＳＣを分離する。ＭＳＣの複分化能は、特異的培養条件および染色を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ脂肪生成および骨形成／軟骨形成分化アッセイにより確認される。免疫表現型の決定は、ＣＤ２９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ９０、ＣＤ１０５（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ，ＵＳＡ）などの表面抗原に対するモノクローナル抗体を用いてマルチパラメーターフローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）により実施する。ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験では、ＭＳＣは第４～第１０継代で使用されよう。
【0207】
細胞生存能プロトコル（凍結／解凍サイクル）
１０％血清培地（αＭＥＭ １×、１０％ＦＢＳ、１％Ｐ－Ｓ）中にＭＳＣを再懸濁させ、マルチチャネルピペットを用いて４０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレート中にプレーティングし、そして３７Ｃでインキュベートする。各実験および対照の条件は、トリプリケートでプレーティングされる。翌日、培地を穏やかに吸引し、セラストロール（１０Ｅ－６Ｍ）または媒体（ＤＭＳＯ）のいずれかを含有する低血清培地（αＭＥＭ １×、１％ＦＢＳ、１％Ｐ－Ｓ）と１時間交換する。次いで、培地を吸引し、培地（αＭＥＭ １×、１％ＦＢＳ、１％Ｐ－Ｓ）を３回交換して細胞を洗浄する。細胞をトリプシン処理し、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ ＩＩ ＦＬ自動セルカウンター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてカウントする。
１０％血清培地（αＭＥＭ １×、１０％ＦＢＳ、１％Ｐ－Ｓ）中にＭＳＣを再懸濁させ、マルチチャネルピペットを用いて４０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレート中にプレーティングし、そして３７Ｃでインキュベートする。各実験および対照の条件は、トリプリケートでプレーティングされる。翌日、培地を穏やかに吸引し、セラストロール（１０Ｅ－６Ｍ）または媒体（ＤＭＳＯ）のいずれかを含有する低血清培地（αＭＥＭ １×、１％ＦＢＳ、１％Ｐ－Ｓ）と１時間交換する。次いで、培地を吸引し、培地（αＭＥＭ １×、１％ＦＢＳ、１％Ｐ－Ｓ）を３回交換して細胞を洗浄する。細胞をトリプシン処理し、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ ＩＩ ＦＬ自動セルカウンター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてカウントする。
【0208】
細胞凍結：以上に記載のトリプシン処理工程およびカウンティング工程の後、細胞を所望の密度でアリコートし、細胞濃厚液にＤＭＳＯを添加し（最終希釈１：１０）、そしてあらかじめラベルが付けられたクライオバイアルに移した。凍結容器内にクライオバイアルを配置し、－８０℃に一晩移行し、その後、－１５０℃に移行する。
【0209】
細胞解凍：あらかじめ加温された培養培地を凍結アリコートの上に注加することにより、凍結細胞を再び加温する。バイアルを遠心し（２００×ｇ、３ｍｉｎ）、上清を吸引し、そしてあらかじめ加温された１０％血清培地（αＭＥＭ １×、１０％ＦＢＳ、１％Ｐ－Ｓ）中に細胞を再懸濁させる。トリパンブルー希釈液を細胞アリコートに添加し、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ ＩＩ ＦＬ自動セルカウンター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて生存能を測定する。
【0210】
実施例６：セラストロールはｉｎ ｖｉｖｏで酸化ストレス誘導死に対する耐性を向上させる
セラストロールの１または２回のいずれかの腹腔内注射（１ｍｇ／ｋｇ、１２時間インターバル）によるスプラーグ・ドーリーラットのｉｎ ｖｉｖｏコンディショニングは、酸化ストレス誘導死（詳細は以下を参照）に耐えるように骨髄細胞を用量依存的にコンディショニングすることが、図２７Ｂに提示された結果から示される。
セラストロールの１または２回のいずれかの腹腔内注射（１ｍｇ／ｋｇ、１２時間インターバル）によるスプラーグ・ドーリーラットのｉｎ ｖｉｖｏコンディショニングは、酸化ストレス誘導死（詳細は以下を参照）に耐えるように骨髄細胞を用量依存的にコンディショニングすることが、図２７Ｂに提示された結果から示される。
【0211】
間葉幹細胞（ＭＳＣ）は実施例５に記載のように単離される。
【0212】
ｉｎ ｖｉｖｏコンディショニング
スプラーグ・ドーリーラット（ＣＤ ＣＲＬ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）に１２時間のインターバルでセラストロール（１ｍｇ／ｋｇ）または媒体の１または２回の腹腔内注射を行う。次いで、ラットを屠殺し、以上に記載のようにＭＳＣを単離した。１０％血清培地（αＭＥＭ １×、１０％ＦＢＳ、１％Ｐ－Ｓ）中に再懸濁させることによりＭＳＣを培養下に配置し、マルチチャネルピペットを用いて４０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレート中にプレーティングし、そして３７Ｃでインキュベートした。各実験および対照の条件は、トリプリケートでプレーティングされる。
スプラーグ・ドーリーラット（ＣＤ ＣＲＬ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）に１２時間のインターバルでセラストロール（１ｍｇ／ｋｇ）または媒体の１または２回の腹腔内注射を行う。次いで、ラットを屠殺し、以上に記載のようにＭＳＣを単離した。１０％血清培地（αＭＥＭ １×、１０％ＦＢＳ、１％Ｐ－Ｓ）中に再懸濁させることによりＭＳＣを培養下に配置し、マルチチャネルピペットを用いて４０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレート中にプレーティングし、そして３７Ｃでインキュベートした。各実験および対照の条件は、トリプリケートでプレーティングされる。
【0213】
次いで、０ｍＭ、０，５ｍＭ、０，７５ｍＭ、または１ｍＭ過酸化水素（ＡＣＰ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｈ７０００）を含有する１％血清培地を用いたインキュベーションにより、細胞に６０分間チャレンジする。次いで、αＭＥＭ １×温培地で細胞を穏やかに２回洗浄し、製造業者のプロトコルに従ってＬＩＶＥ／ＤＥＡＤキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色する。Ｈａｒｍｏｎｙハイコンテントイメージング・解析ソフトウェアのバージョン４．１が動作するハイコンテントスクリーニング（ＨＣＳ）システムＯｐｅｒｅｔｔａ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて、画像をキャプチャーし解析する。セラストロールの１または２回のいずれかの注射によるスプラーグ・ドーリーラットのｉｎ ｖｉｖｏ処理は、酸化ストレス誘導死に耐えるように骨髄細胞を用量依存的にコンディショニングすることが、本明細書に提示された結果から示される。
【0214】
実施例７：セラストロールは内皮層の生存能を維持する
ブタ頸動脈を採取し、閉環および半円開環の構造に切除し、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中または１０Ｅ－６Ｍの最終濃度でセラストロールを含有するＨＢＳＳ中に一晩配置した。製造業者のプロトコルに従ってＬＩＶＥ／ＤＥＡＤキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で頸動脈環を染色した。２０×液浸対物レンズを用いて共焦点顕微鏡法（Ｏｌｙｍｐｕｓ、ＦＶ１０００ＭＰＥ／ＢＫ６１ＷＦ）により組織を撮像した。頸動脈内皮表面のＺスタックも得た。図２８は、セラストロールを用いない陰性対照と比較してセラストロールを用いたときの内皮層の生存能および健全性の保持を示し、矢印は、死細胞および内皮層健全性損失を指している（図２８）。
ブタ頸動脈を採取し、閉環および半円開環の構造に切除し、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中または１０Ｅ－６Ｍの最終濃度でセラストロールを含有するＨＢＳＳ中に一晩配置した。製造業者のプロトコルに従ってＬＩＶＥ／ＤＥＡＤキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で頸動脈環を染色した。２０×液浸対物レンズを用いて共焦点顕微鏡法（Ｏｌｙｍｐｕｓ、ＦＶ１０００ＭＰＥ／ＢＫ６１ＷＦ）により組織を撮像した。頸動脈内皮表面のＺスタックも得た。図２８は、セラストロールを用いない陰性対照と比較してセラストロールを用いたときの内皮層の生存能および健全性の保持を示し、矢印は、死細胞および内皮層健全性損失を指している（図２８）。
【0215】
実施例８：セラストロールは細胞保護メディエーターを誘導する
セラストロールは、各種細胞型で同じように細胞保護メディエーター（生存キナーゼ：ｐＡｋｔ／Ａｋｔ、ｐＥＲＫ／ＥＲＫ、抗酸化ＨＯ１、熱ショック反応タンパク質：ＨＳＦ１、ＨＳＰ７０）およびタンパク質発現動態を誘導する（１０－６Ｍ用量で５～１２０ｍｉｎの試験時間の処理、０～２４時間のいずれかの回復、および続いて１０－６Ｍセラストロールで１時間処理）。図２９Ａおよび２９Ｂは、各種ラットおよびヒト細胞系（Ｈ９ｃ２ラット心筋芽細胞、ヒトおよびラットＭＳＣ、ラット新生仔心筋細胞、ＩＮＳ－１インスリン産生ラットβ細胞系）で実施されたウェスタンブロットおよび生存能アッセイを表す。
セラストロールは、各種細胞型で同じように細胞保護メディエーター（生存キナーゼ：ｐＡｋｔ／Ａｋｔ、ｐＥＲＫ／ＥＲＫ、抗酸化ＨＯ１、熱ショック反応タンパク質：ＨＳＦ１、ＨＳＰ７０）およびタンパク質発現動態を誘導する（１０－６Ｍ用量で５～１２０ｍｉｎの試験時間の処理、０～２４時間のいずれかの回復、および続いて１０－６Ｍセラストロールで１時間処理）。図２９Ａおよび２９Ｂは、各種ラットおよびヒト細胞系（Ｈ９ｃ２ラット心筋芽細胞、ヒトおよびラットＭＳＣ、ラット新生仔心筋細胞、ＩＮＳ－１インスリン産生ラットβ細胞系）で実施されたウェスタンブロットおよび生存能アッセイを表す。
【0216】
より特定的には、１０％ＦＢＳを含有する完全培地（濾過溶液：１ｍＭ Ｎａピルベート＋５０μＭ ｂメルカプトエタノール、１０ｍＭ超高純度Ｈｅｐｅｓ、２ｍＭ Ｌ－グルタミンが追加されたＲＰＭＩ）中でＩＮＳ－１細胞を培養した。細胞をトリプシン処理し（０，２５％トリプシン－ＥＤＴＡ）、１５００ＲＰＭで５分間遠心分離し、１％ＦＢＳが追加された完全ＩＮＳ培地中に再懸濁させる。血球計を用いて細胞をカウントし、９ｍｌの１％ＦＢＳ完全ＩＮＳ培地と、ＤＭＳＯ中に再懸濁させた２，５μｌまたは５，０μｌの１ｍＭ Ｈｓｐ９０阻害剤（セラストロール：Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ７０９５０、ゲルダナマイシン：Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ１３３５５、またはラディシコール：Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ１３０８９）と、を含有するＳａｒｓｔｅｄｔチューブ内に１～２００万細胞を再懸濁させる。同様に対照サンプルを調製するが、Ｈｓｐ９０阻害剤を２，５μｌまたは５，０μｌのいずれかのＤＭＳＯ媒体で置き換える。１％ＦＢＳ完全ＩＮＳ培地を用いて細胞懸濁液の体積を１０ｍｌの最終体積になるように仕上げる。数回反転させて懸濁液を穏やかに混合し、チューブを３７Ｃに３０分間配置する。１５分後、反転を繰り返す。次いで、チューブを１５００ＲＰＭで５分間遠心し、培地を穏やかに吸引し、１２ｍｌの温ＲＰＭＩ溶液で細胞を洗浄する。回転および洗浄サイクルをさらに２回繰り返した後、それぞれ１または２百万細胞を含有するペレットに対して１％ＦＢＳを含有する２，５ｍｌまたは５，０ｍｌの完全ＩＮＳ培地を用いて細胞を再懸濁させる。次いで、マルチチャネルピペットを用いて、それぞれ４０，０００細胞を含有する１００μｌの細胞懸濁液アリコートを９６ウェルプレート中にプレーティングする。各実験および対照条件は、クォドラプルでプレーティングされ、正常酸素または低酸素の条件で６時間インキュベートされる。培養プレートを気密低酸素チャンバー（Ｂｉｌｌｕｐｓ－Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ）内に配置することにより低酸素（＜１％酸素）を達成し、５％ＣＯ２と９５％Ｎ２残部とのガス混合物を用いて１５～２０リットル／ｍｉｎの流量で１０分間フラッシュする。６時間のインキュベーション後、低酸素チャレンジ培養および正常酸素対照培養の培地を９０μｌの１０％ＦＢＳ完全ＩＮＳ培地と交換し、１０μｌのＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ試薬を各ウェルに添加する。６０分間のインキュベーション後、プレートリーダーを用いて蛍光取得により生存能を定量する。
【0217】
セラストロールによるＩＮＳ－１細胞の短時間プレコンディショニングは、致死低酸素ストレスによりチャレンジしたとき、細胞生存能を保護することが、これらのデータから示される（図２９Ｃ）。
【0218】
実施例９：セラストロールはＬＰＳにより誘導される致死的血圧低下からラットをレスキューする
ラットにおける梗塞サイズの減少および心機能の保持に関するセラストロールの効果に加えて、本出願人は、処置ラットにおいて血圧のモジュレーションを観察した。損傷（すなわち、虚血、酸化、炎症、壊死）に対する器官および組織の保持ならびに全身の圧力／灌流の保持に関する本明細書に記載の化合物および組合せ物の潜在能力を考慮すると、これらの病態に関連する器官不全および死亡の割合が高いことから、それらショックモデル（すなわち、敗血性、心原性）で使用することが望ましいであろう。実際に、米国では、年間７５０，０００件を超える重篤な敗血症の症例が２５～３０％の死亡率で診断されており（Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ ２９（７）：１３０３Ｙ１３１０，２００１）、危機的な症状の心機能不全を含めて複数の器官の機能不全が原因とされる（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １１６（７）：７９３Ｙ８０２，２００７）。我々は、ラットにおいて細菌リポ多糖（ＬＰＳ）により誘導される敗血症性ショックモデルまたは内毒素モデルのいずれかの追加を提案する（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．，１９９７；６０（１５）：１２２３－３０）。
ラットにおける梗塞サイズの減少および心機能の保持に関するセラストロールの効果に加えて、本出願人は、処置ラットにおいて血圧のモジュレーションを観察した。損傷（すなわち、虚血、酸化、炎症、壊死）に対する器官および組織の保持ならびに全身の圧力／灌流の保持に関する本明細書に記載の化合物および組合せ物の潜在能力を考慮すると、これらの病態に関連する器官不全および死亡の割合が高いことから、それらショックモデル（すなわち、敗血性、心原性）で使用することが望ましいであろう。実際に、米国では、年間７５０，０００件を超える重篤な敗血症の症例が２５～３０％の死亡率で診断されており（Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ ２９（７）：１３０３Ｙ１３１０，２００１）、危機的な症状の心機能不全を含めて複数の器官の機能不全が原因とされる（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １１６（７）：７９３Ｙ８０２，２００７）。我々は、ラットにおいて細菌リポ多糖（ＬＰＳ）により誘導される敗血症性ショックモデルまたは内毒素モデルのいずれかの追加を提案する（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．，１９９７；６０（１５）：１２２３－３０）。
【0219】
簡潔に述べると、イソフルラン２．５～３．０％（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，Ｉｌｌ．）、１Ｌ／ｍｉｎ酸素でＳＤラットを麻酔し、低体温症を予防するために加熱ブランケット上に配置する。ｇｅｌｃｏ＃２０カニューレを左外頸動脈に挿入し、圧力センサーにリレーする。代替的に、サイズに依存して、カニューレを左大腿動脈に挿入する。ラットを２％イソフルラン、１Ｌ／ｍｉｎ酸素で保持し、基礎圧測定値を収集する。頸静脈を介するＬＰＳ（２０～５０ｍｇ／Ｋｇ）のｉ．ｖ．注射およびセラストロール（１ｍｇ／Ｋｇ）のｉ．ｐ．注射に反応する圧力動態を決定する。動物においてＬＰＳの用量がさまざまでありうるとともに動物の年齢にも依存しうることは、特筆に値する（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｍａｒ １９９６，Ｖｏｌ．６４，ｎｏ．３，ｐ７６９）。我々の実験では、両方のラットに１０ｍｇ／ｋｇでＬＰＳの第１のボーラスを投与した。両方のラットで一過性の血圧（ＢＰ）低下が起こった後、ＢＰは安定化し、ベースライン値を取り戻した。次いで、３００μｌのセラストロール（１ｍｇ／Ｋｇ）または媒体（１０％ＤＭＳＯ、７０％Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ／エタノール（３：１）、２０％ＰＢＳ）のｉ．ｐ．ボーラス注射のいずれかを個別ラットで実施した（図３０の矢印を参照されたい。両方のラットに１０ｍｇ／ｋｇボーラスＬＰＳの再注射を行う前、媒体処置ラットでは致死的血圧低下を生じるが、１回のセラストロール注射を行ったラットでは血圧が維持される（図３０））。
【0220】
実施例１０：セラストロールはラットの腎臓においてＨｓｐ３２（ＨＯ－１）の発現を誘導する
本出願人は以前に、ラット虚血心筋においてセラストロールが心筋細胞の生存、傷害および有害なリモデリングの低減を促進して心機能を保持することを示した。本出願人は、この保護効果が他のタイプの虚血疾患で観察可能であるかを調べた。
本出願人は以前に、ラット虚血心筋においてセラストロールが心筋細胞の生存、傷害および有害なリモデリングの低減を促進して心機能を保持することを示した。本出願人は、この保護効果が他のタイプの虚血疾患で観察可能であるかを調べた。
【0221】
１Ｌ／ｍｉｎの酸素中の２．０％～３．０％のイソフルラン（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でラットを麻酔し、加熱パッド上に仰臥位で配置した。外頸静脈を介して１ｍｇ／ｋｇの用量で媒体溶液またはセラストロール（（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ７０９５０）０，２μＭ濾過滅菌媒体：ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ １５４９３８）（全体積の４％）、ＰＢＳ １×（全体積の９６％）中に再懸濁された５０ｍＭストック溶液）の単回ボーラス注射をラットに行う。ラットを剃毛し、眼軟膏剤を角膜に適用し、胸骨の基底から始めて臍までの３～４ｃｍの切開部位にブピバカイン（２ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）を注射する。開創器を用いて切開部を開状態に維持し、無菌生理食塩水で湿らせたガーゼで腸を包む。左腎臓（ＫＬ）を分離し、血管クリップで腎動脈を閉塞する。腸を腹腔内に再配置し、一時的３－０縫合糸（Ｅｔｈｉｃｏｎ）で皮膚を閉じる。ラットに塩酸ブプレノルフィン（０．０５ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）を投与し、３０分間の虚血の間、１Ｌ／ｍｉｎの酸素中１．０％～２．０％イソフルラン（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に維持し、クリップの除去後に追加の４５分間の再灌流を行う。４０ｍＭ ＫＣｌ追加生理食塩水の灌流によりラットを瀉血し、器官を摘出し、冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ１Ｘ）で濯ぎ、ＰＢＳで緩衝された１０％ホルマリン中に一晩保存し、組織学的／免疫組織学的切片を得るためにパラフィン包埋し、またはウェスタンブロット発現解析のために液体窒素中でスナップ凍結する。
【0222】
セラストロール（１ｍｇ／ｋｇ）の１回の注射でラットの腎臓において６０分以内にＨｓｐ３２（ＨＯ－１）の発現が誘導されることが、本明細書に提示されたウェスタンブロット解析の結果から実証される（図３１）。さらに、セラストロールは、腎虚血を起こしているラット（ＫＲ）の非結紮対照腎臓においてＨｓｐ７０の発現を増加させることから、感受性および細胞保護反応の増加が示唆される。この現象はとくに興味深い。なぜなら、全身神経液性保護メディエーターが発生する可能性があるリモートコンディショニングに類似して臨床介入時に全身細胞保護が付与される可能性があり、潜在的関連合併症（たとえば、外科手順から発生する脳卒中）が低減することが示唆されるからである。
【0223】
実施例１１：細胞生存能ならびにストレスおよび損傷からの保護に対するセラストロールおよびセラストロールアナログの効果
本出願人は、心筋梗塞のラットモデルにおいてＨ９ｃ２ラット心筋芽細胞の低酸素培養に対するセラストロールまたはセラストロールアナログの効果を試験した。セラストロールまたはセラストロールアナログと補助剤との組合せは、同様に試験しうる。
本出願人は、心筋梗塞のラットモデルにおいてＨ９ｃ２ラット心筋芽細胞の低酸素培養に対するセラストロールまたはセラストロールアナログの効果を試験した。セラストロールまたはセラストロールアナログと補助剤との組合せは、同様に試験しうる。
【0224】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験
細胞培養および刺激：
低酸素チャレンジおよび酸化チャレンジに対する生存性に関連して、Ｈ９ｃ２心筋芽細胞を低酸素／血清飢餓（＜１％Ｏ２低酸素チャンバー内の低血清培地中に４８時間）または酸化ストレス（０～１ｍＭ Ｈ２Ｏ２でスパイクされた培地中で１時間インキュベーション）に付す。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤアッセイを用いてＨ９ｃ２細胞の生存状態を評価した。
細胞培養および刺激：
低酸素チャレンジおよび酸化チャレンジに対する生存性に関連して、Ｈ９ｃ２心筋芽細胞を低酸素／血清飢餓（＜１％Ｏ２低酸素チャンバー内の低血清培地中に４８時間）または酸化ストレス（０～１ｍＭ Ｈ２Ｏ２でスパイクされた培地中で１時間インキュベーション）に付す。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤアッセイを用いてＨ９ｃ２細胞の生存状態を評価した。
【0225】
次いで、低酸素／再酸素化チャレンジを実施する。簡潔に述べると、すでに報告したようにラットＨ９ｃ２心筋芽細胞において生存能解析を実施した。低酸素／再酸素化ストレスでは、血清飢餓状態で低酸素条件（＜１％Ｏ２）に配置されたグルコースなしＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で細胞を１８時間培養した。再酸素化（正常酸素条件）時、高グルコース１％ＦＢＳのＤＭＥＭ中でセラストロール（１０－１０～１０－６ｍｏｌ／Ｌ、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）、セラストロールアナログ、または媒体（ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃａｎａｄａ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ、最終濃度＜１％ｖ／ｖ）で細胞を１時間処理し、次いで、高グルコースＤＭＥＭ中で再酸素化をさらに５時間継続した。
【0226】
セラストロール（１μＭ）（供給業者から購入したセラストロール１ｃ、合成アナログを生成するために使用したセラストロール２および３）ならびにセラストロールアナログアナログ３（１μＭ）、アナログ１（１μＭ）、アナログ２（１μＭ）、およびアナログ４（１μＭ）は、低酸素ストレスおよび低酸素／再酸素化ストレスからＨ９ｃ２心筋芽細胞を保護するのに有効であることが、図３２に提示された結果から示される。
【0227】
実施例１２：虚血疾患の治療に使用されるセラストロールおよびセラストロールアナログ
すべてのｅｘ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ実験でルイスラット（２５０～３００ｇ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｓｔ Ｃｏｎｓｔａｎｔ，ＱＣ）を使用した。動物はすべて、実験動物管理使用ガイド（Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）に従って扱った。
すべてのｅｘ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ実験でルイスラット（２５０～３００ｇ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｓｔ Ｃｏｎｓｔａｎｔ，ＱＣ）を使用した。動物はすべて、実験動物管理使用ガイド（Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）に従って扱った。
【0228】
ｅｘ ｖｉｖｏ試験
分離された灌流心臓調製物：
次の群、すなわち、媒体（ｎ＝６）、セラストロールまたはセラストロールアナログ１０－８、１０－７、または１０－６ｍｏｌ／Ｌ（ｎ＝各５）にラットをランダムに帰属した。イソフルラン麻酔下で、ラットにヘパリン（Ｉ．Ｐ、１０００Ｉ．Ｕ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ，Ｄｏｒｖａｌ，ＱＣ）を注入し、心臓を摘出し、氷冷クレブス緩衝液（ｍｍｏｌ／ｌ単位：ＮａＣｌ １１３、ＫＣｌ ４．５、ＮａＨ２ＰＯ４ １．６、ＣａＣｌ２ １．２５、ＭｇＣｌ２＋６Ｈ２Ｏ １、Ｄ－グルコース ５．５、ＮａＨＣＯ３ ２５）にただちに浸漬した。５％ＣＯ２および残部のＯ２でバブリングした３７℃のクレブス緩衝液を用いて、６０～７０ｍｍＨｇの一定大動脈圧でＬａｎｇｅｎｄｏｒｆｆシステム（Ｒａｄｎｏｔｉ，Ｍｏｎｒｏｖｉａ，ＣＡ）により、心臓の逆灌流を行った。圧力トランスデューサーに接続されたラテックスバルーンを左心室（ＬＶ）に挿入し、１５ｍｍＨｇ（ＬＶプレロード）に調整した。心臓を３００ｂｐｍにペース調整し、２０分間安定化させた。
分離された灌流心臓調製物：
次の群、すなわち、媒体（ｎ＝６）、セラストロールまたはセラストロールアナログ１０－８、１０－７、または１０－６ｍｏｌ／Ｌ（ｎ＝各５）にラットをランダムに帰属した。イソフルラン麻酔下で、ラットにヘパリン（Ｉ．Ｐ、１０００Ｉ．Ｕ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ，Ｄｏｒｖａｌ，ＱＣ）を注入し、心臓を摘出し、氷冷クレブス緩衝液（ｍｍｏｌ／ｌ単位：ＮａＣｌ １１３、ＫＣｌ ４．５、ＮａＨ２ＰＯ４ １．６、ＣａＣｌ２ １．２５、ＭｇＣｌ２＋６Ｈ２Ｏ １、Ｄ－グルコース ５．５、ＮａＨＣＯ３ ２５）にただちに浸漬した。５％ＣＯ２および残部のＯ２でバブリングした３７℃のクレブス緩衝液を用いて、６０～７０ｍｍＨｇの一定大動脈圧でＬａｎｇｅｎｄｏｒｆｆシステム（Ｒａｄｎｏｔｉ，Ｍｏｎｒｏｖｉａ，ＣＡ）により、心臓の逆灌流を行った。圧力トランスデューサーに接続されたラテックスバルーンを左心室（ＬＶ）に挿入し、１５ｍｍＨｇ（ＬＶプレロード）に調整した。心臓を３００ｂｐｍにペース調整し、２０分間安定化させた。
【0229】
Ｐｏｗｅｒ ｌａｂ ８／３０ポリグラフ（ＡＤｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｓｐｒｉｎｇｓ，ＣＯ）を用いて心室内圧を連続測定し、ＬａｂＣｈａｒｔ ｐｒｏ ｖ．７．３．７（ＡＤｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて記録および解析を行った。
【0230】
セラストロール、セラストロールアナログ、または媒体（ＤＭＳＯ）が再灌流の開始時に心臓に接触することを保証するために、心臓ペースおよび灌流を３０分間停止することにより達成される全温虚血の誘導時に系をプライムした。セラストロール（１０－８、１０－７、または１０－６ｍｏｌ／Ｌ）または媒体を含むクレブス緩衝液を用いて再灌流を１０分間開始し、次いで、１２０分間の全再灌流時間にわたり継続した（クレブス緩衝液）。
【0231】
安定化の終了時、５分間の再灌流時、次いで、合計６０分間にわたり１５分ごとに、心臓流出液を５分間捕集した。体積を測定し、解析までサンプルを－８０℃に維持した。
【0232】
再灌流の終了時、心臓を横方向にスライスし（１～２ｍｍ）、３７℃のリン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．４（ＴＴＣ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃａｎａｄａ）中の５％２，３，５－トリフェニル－テトラゾリウムクロリドで２０分間染色した１５。スライスを秤量し、次いで、ＡｘｉｏＣａｍ ＥＲｃ ５ｓカメラに結合されたＳｔｅｍｉ ５０８立体顕微鏡を用いて画像を取得し、Ｚｅｎ ２．３イメージングソフトウェア（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｃａｎａｄａ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，ＯＮ）で処理した。ＩｍａｇｅＪ １．５１ｈフリーウェア（ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）を用いて解析を行った。梗塞領域を心臓組織スライスの重量に規格化した。遺伝子およびタンパク質発現のために１スライス／心臓をスナップ凍結した。
【0233】
全心温虚血後の再灌流による媒体（ＤＭＳＯ）処理と比較したＡ、Ｂ）＋／－ｄＰ／ｄｔ、Ｃ）発生圧（最大圧－最低圧）、Ｄ）拡張末期圧（ＥＤＰ）、およびＥ）収縮指数の変化より示されるように、セラストロール（１０－７ｍｏｌ／Ｌ最良用量）およびアナログ１（１０－８ｍｏｌ／Ｌ用量）は、Ｉ／Ｒ誘導収縮期機能不全から心臓を保護することが、図３３Ａ～Ｈに提示された結果から示唆される。Ｆ）冠脈予備血流（ＣＲＦ）は処理で維持され、Ｇ）高感度トロポニンＴ（ＴＮＴ－ｈｓ）放出およびＨ）ＴＴＣ染色により測定される梗塞領域は、Ｉ／Ｒ傷害後の媒体（ＤＭＳＯ）処理心臓と比較してセラストロールおよびアナログの処理群では有意に低減した。
【0234】
ｉｎ ｖｉｖｏ試験
次の群、すなわち、シャム（ｎ＝６）、媒体（ｎ＝８）、セラストロール１ｍｇ／Ｋｇ（ｎ＝６）、またはセラストロールアナログにラットをランダムに帰属した。２％イソフルラン麻酔下で、１２ＭＨｚトランスデューサーを備えたＳｏｎｏｓ ５５００イメージングシステム（Ｐｈｉｌｉｐｓ，Ｐｈｉｌｉｐｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ａｎｄｏｖｅｒ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて、ベースラインエコーカルジオグラフィーを記載のように行った１２。測定結果はすべて、処理を盲検化して同じ経験を積んだ観測者により取得した。各測定に対して、３～５心周期を解析して平均した。
次の群、すなわち、シャム（ｎ＝６）、媒体（ｎ＝８）、セラストロール１ｍｇ／Ｋｇ（ｎ＝６）、またはセラストロールアナログにラットをランダムに帰属した。２％イソフルラン麻酔下で、１２ＭＨｚトランスデューサーを備えたＳｏｎｏｓ ５５００イメージングシステム（Ｐｈｉｌｉｐｓ，Ｐｈｉｌｉｐｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ａｎｄｏｖｅｒ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて、ベースラインエコーカルジオグラフィーを記載のように行った１２。測定結果はすべて、処理を盲検化して同じ経験を積んだ観測者により取得した。各測定に対して、３～５心周期を解析して平均した。
【0235】
エコーカルジオグラフィー後、動物にチューブを挿入し、機械的にベンチレートし、次いで、ブピバカイン２ｍｇ／ｋｇを注射し、そして左胸を開いて心臓を露出させた。５－０絹糸スリップノットを用いて、左前下行枝の閉塞を行った。視覚的ブランチングおよびエレクトロカルジオグラフィー変化により心筋虚血を確認した。シャム動物では、縫合糸で結紮しなかった。３０分後、縫合糸閉塞を解除した。セラストロール、セラストロールアナログ、または媒体は、急性全身送達のために心室内に注射し、次いで、胸部を閉じた。手術の終了時、ブプレノルフィン（０，０５ｍｇ／Ｋｇ ｓｃ）およびカルプロフェン（５ｍｇ／Ｋｇ ｓｃ）を注射した。回復のために動物を２４時間放置し、次いで、第２のエコーカルジオグラフィーを行った。動物を屠殺し、心臓組織をスナップ凍結し、ヘパリン処理されたチューブに血液を採取し、次いで、４℃で遠心分離した。血漿をスナップ凍結で、採取し、解析まで－８０℃に維持した。
【0236】
セラストロール（１ｍｇ／Ｋｇ）およびアナログ１（１ｍｇ／Ｋｇ）は、媒体（ＤＭＳＯ）処置動物と比較してＡ）駆出率（ＥＦ）、Ｂ）心拍出量（ＣＯ）、Ｃ）内径短縮率（ＦＳ）、およびＤ）心拍出量（ＳＶ）を維持することによりＩ／Ｒ傷害後の心機能を保護し、かつセラストロールのこうしたｉｎ ｖｉｖｏ保護効果は、心保護ＨＳＰ７０およびＨＯ－１の組織発現の著しい向上に関連することが、図３４の結果から示唆される。
【0237】
統計解析
データは、平均値±標準誤差または９５％信頼区間のメジアンとして表される。繰返しのない測定の群比較には、ＡＮＯＶＡ検定を使用した。繰返し測定では、線形混合効果モデルを群比較に使用した（ＳＡＳソフトウェア、バージョン９．３のＭＩＸＥＤ手順、ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｒｙ，ＮＣ，ＵＳＡ）。群間差を評価した。指数や比などの非正規分布測定では、測定結果のｌｏｇ変換を使用した。血行動態測定では、２００測定程度／ラット／時間点をモデルで使用したので、それに応じて各単一測定に加重した（すなわち１／２００）。すべての解析で、Ｐ＜０．０５を統計的に有意であるとみなした。
データは、平均値±標準誤差または９５％信頼区間のメジアンとして表される。繰返しのない測定の群比較には、ＡＮＯＶＡ検定を使用した。繰返し測定では、線形混合効果モデルを群比較に使用した（ＳＡＳソフトウェア、バージョン９．３のＭＩＸＥＤ手順、ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｒｙ，ＮＣ，ＵＳＡ）。群間差を評価した。指数や比などの非正規分布測定では、測定結果のｌｏｇ変換を使用した。血行動態測定では、２００測定程度／ラット／時間点をモデルで使用したので、それに応じて各単一測定に加重した（すなわち１／２００）。すべての解析で、Ｐ＜０．０５を統計的に有意であるとみなした。
【0238】
実施例１３：セラストロールおよびセラストロールアナログはＨＳＲおよびＡＲＥエレメントの制御下にある遺伝子の発現をモジュレートする
９６ウェルプレートのＤＭＥＭ １０％ＦＢＳ完全培地中に５，０００細胞／ウェルの密度でＨ９ｃ２ラット心筋芽細胞を播種し、製造業者のプロトコルに従ってリポフェクタミンを用いてＣｉｇｎａｌレポーターアッセイ熱ショック反応および抗酸化反応キット（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｑｉａｇｅｎ）によりトランスフェクトした。翌日、セラストロール、アナログ、および他の各種化合物をＤＭＥＭ １％ＦＢＳ培地中１０Ｅ－５～１０Ｅ－１０Ｍの用量範囲でトリプリケートでウェルに４時間添加し、続いて、３時間のウォッシュアウト時間完全培地を設け、その後、デュアルルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてシグナリング活性を測定した。セラストロール（供給業者から購入したセラストロール１ｃ、合成アナログを生成するために使用したセラストロール２および３）ならびにセラストロールアナログのアナログ１、アナログ３、およびアナログ４は、熱ショック反応エレメント（ＨＳＲ）または抗酸化反応エレメント（ＡＲＥ）により部分的に制御されるレポーター遺伝子の発現を刺激する効力および効率が最高クラスの試験化合物であることが、図３５にまとめられた結果から示される。
９６ウェルプレートのＤＭＥＭ １０％ＦＢＳ完全培地中に５，０００細胞／ウェルの密度でＨ９ｃ２ラット心筋芽細胞を播種し、製造業者のプロトコルに従ってリポフェクタミンを用いてＣｉｇｎａｌレポーターアッセイ熱ショック反応および抗酸化反応キット（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｑｉａｇｅｎ）によりトランスフェクトした。翌日、セラストロール、アナログ、および他の各種化合物をＤＭＥＭ １％ＦＢＳ培地中１０Ｅ－５～１０Ｅ－１０Ｍの用量範囲でトリプリケートでウェルに４時間添加し、続いて、３時間のウォッシュアウト時間完全培地を設け、その後、デュアルルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてシグナリング活性を測定した。セラストロール（供給業者から購入したセラストロール１ｃ、合成アナログを生成するために使用したセラストロール２および３）ならびにセラストロールアナログのアナログ１、アナログ３、およびアナログ４は、熱ショック反応エレメント（ＨＳＲ）または抗酸化反応エレメント（ＡＲＥ）により部分的に制御されるレポーター遺伝子の発現を刺激する効力および効率が最高クラスの試験化合物であることが、図３５にまとめられた結果から示される。
【0239】
本発明をその特定の実施形態により以上で説明してきたが、それは、添付の特許請求の範囲に規定される本発明の趣旨および性質から逸脱することなく変更可能である。特許請求の範囲では、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（～を含む）」という単語は、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ，ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ（限定されるものではないが、～を含む）」という語句と実質的に等価なオープンエンドの用語として用いられる。単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、とくに文脈上明確な規定がない限り、対応する複数形の参照語を含む。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22A】
【図22B】
【図23】
【図24】
【図25A】
【図25B】
【図26-1】
【図26-2】
【図26-3】
【図26-4】
【図26-5】
【図27A】
【図27B】
【図28】
【図29A】
【図29B】
【図29C】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33-1】
【図33-2】
【図34】
【図35】
【図36】
