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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-01-17
(45)【発行日】2022-01-26
(54)【発明の名称】微小核細胞融合法による目的ＤＮＡを含む動物細胞の作製方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/06 20060101AFI20220119BHJP
C12N 5/071 20100101ALI20220119BHJP
C12N 5/22 20060101ALI20220119BHJP
C12N 15/07 20060101ALI20220119BHJP
【ＦＩ】
C12N15/06
C12N5/071 ZNA
C12N5/22
C12N15/07
【請求項の数】
13
(21)【出願番号】P 2020551235
(86)(22)【出願日】2019-10-10
(86)【国際出願番号】 JP2019040091
(87)【国際公開番号】W WO2020075823
(87)【国際公開日】2020-04-16
【審査請求日】2020-11-19
(31)【優先権主張番号】P 2018191994
(32)【優先日】2018-10-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】504150461
【氏名又は名称】国立大学法人鳥取大学
(73)【特許権者】
【識別番号】516291907
【氏名又は名称】株式会社Ｔｒａｎｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｉｃｓ
(74)【代理人】
【識別番号】110002572
【氏名又は名称】特許業務法人平木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】香月 康宏
(72)【発明者】
【氏名】宇野 愛海
(72)【発明者】
【氏名】押村 光雄
【審査官】中村 勇介
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１１－１７７１４５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１２－５１８０１６（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２００９／１４７６９５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】DOHERTY, AMO et al.，Microcell-mediated chromosome transfer(MMCT): small cells with huge potential，Mammalian Genome，2003年，Vol.14，pp.583-592，ISSN 1432-1777, 特にp.584右欄
【文献】LISKOVYKH, M et al.，Moving toward a higher efficiency of microcell-mediated chromosome transfer，Molecular Therapy－Methods & Clinical Development，2016年，Vol.3, Article 16043，ISSN 2329-0501, 特にAbstract, pp.2-4
【文献】SANTAGUIDA, S et al.，Dissecting the role of MPS1 in chromosome biorientation and the spindle checkpoint through the small molecule inhibitor reversine，The Journal of Cell Biology，2010年，Vol.190, No.1，pp.73-87，ISSN 0021-9525, 特にp.75右欄
【文献】JORDAN, MA et al.，Mitotic Block Induced in HeLa Cells by Low Concentrations of Paclitaxel(Taxol) Results in Abnormal M，Cancer Research，1996年，Vol.56，pp.816-825，ISSN 0099-7013, 特にp.816左欄
【文献】Yuji Nakayama, et al，Recurrent Micronucleation through Cell Cycle Progression in the Presence of Microtubule Inhibitors，CELL STRUCTURE AND FUNCTION，2015年，Vol.40, No.1，p.51-59
【文献】MCNEILL, CA et al.，Genetic manipulation by means of microcell-mediated transfer of normal human chromosomes into recipient mouse cells，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1980年，Vol.77, No.9，pp.5394-5398，ISSN: 0027-8424，特にAbstract
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／００－７／０８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
目的ＤＮＡを含むヒト細胞（但し、癌細胞を除く）からヒト細胞由来微小核細胞を作製するための方法であって、前記ヒト細胞を、リバーシン、パクリタキセル、又はリバーシンとパクリタキセルの混合物からなる群から選択される微小核形成誘導剤を含有する培地中で培養してヒト細胞由来微小核細胞を生成し、並びに、前記目的ＤＮＡを含むヒト細胞由来微小核細胞を回収することを含む、前記方法。
【請求項2】
前記目的ＤＮＡが、正常ヒト染色体である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記目的ＤＮＡが、目的遺伝子を含むヒト人工染色体又は哺乳類人工染色体である、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
目的ＤＮＡを含む非ヒト動物細胞（但し、癌細胞を除く）から非ヒト動物細胞由来微小核細胞を作製するための方法であって、前記非ヒト動物細胞を、リバーシン、パクリタキセル、又はリバーシンとパクリタキセルの混合物からなる群から選択される微小核形成誘導剤を含有する培地中で培養して非ヒト動物細胞由来微小核細胞を生成し、並びに、前記目的ＤＮＡを含む非ヒト動物細胞由来微小核細胞を回収することを含む、前記方法。
【請求項5】
前記非ヒト動物細胞が、齧歯類細胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記齧歯類細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはマウスＡ９細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記目的ＤＮＡが、正常ヒト染色体である、請求項４～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
前記目的ＤＮＡが、目的遺伝子を含むヒト人工染色体又は哺乳類人工染色体である、請求項４～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
目的ＤＮＡを含むヒト細胞又は非ヒト動物細胞を作製するための方法であって、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法によって目的ＤＮＡを含むヒト細胞由来微小核細胞、又は請求項４～８のいずれか１項に記載の方法によって目的ＤＮＡを含む非ヒト動物細胞由来微小核細胞を作製する工程、供与細胞としての前記ヒト細胞由来微小核細胞又は前記非ヒト動物細胞由来微小核細胞と、受容細胞としてのそれぞれヒト細胞又は非ヒト動物細胞とを細胞融合する工程、それによって得られた前記目的ＤＮＡを含むヒト細胞又は非ヒト動物細胞を回収する工程を含む、前記方法。
【請求項10】
前記非ヒト動物細胞が、齧歯類細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記齧歯類細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はマウスＡ９細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記目的ＤＮＡが、正常ヒト染色体である、請求項９に記載の方法。
【請求項13】
前記目的ＤＮＡが、目的遺伝子を含むヒト人工染色体又は哺乳類人工染色体である、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、目的ＤＮＡを含むヒト細胞から、目的ＤＮＡを含むヒト細胞由来微小核細胞を収率よく作製するための方法に関する。
【0002】
本発明はまた、目的ＤＮＡを含む非ヒト動物細胞（例えば齧歯類細胞）から、目的ＤＮＡを含む非ヒト動物細胞由来微小核細胞を収率よく作製するための方法に関する。
【0003】
本発明はまた、本発明の方法によって作製された、供与細胞としての上記目的ＤＮＡを含むヒト細胞由来微小核細胞、又は上記目的ＤＮＡを含む非ヒト動物細胞（例えば齧歯類細胞）由来微小核細胞と、受容細胞としてのそれぞれヒト細胞又は非ヒト動物細胞とを細胞融合して目的ＤＮＡを含むヒト細胞又は非ヒト動物細胞を作製するための方法に関する。
【背景技術】
【0004】
微小核細胞融合法（ＭＭＣＴ（Ｍｉｃｒｏｃｅｌｌ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ））は、供与細胞から作製した微小核細胞を受容細胞と融合させる技術である。これによって、供与細胞内の特定の外来ＤＮＡ（例えば、染色体）を受容細胞に移入させることが可能である。微小核細胞は、通常、供与細胞をコルセミドで処理することによって作製することができる（非特許文献１～３）。
【0005】
従来、ヒト細胞を染色体供与体とするときには、薬剤耐性遺伝子をヒト細胞に導入したのち、微小核形成が可能なマウス由来Ａ９細胞またはハムスター由来ＣＨＯ細胞と細胞融合してＡ９ハイブリッド細胞またはＣＨＯハイブリッド細胞を形成し、さらにコルセミドで処理して微小核を形成し、薬剤選択により微小核細胞を精製する手法が行われている。一方、ヒト細胞を供与細胞としてヒト細胞から微小核細胞を精製し、ヒト細胞株（例えばヒトｉＰＳ細胞）と細胞融合するとき、通常のＭＭＣＴ法では、目的の染色体が導入されたヒト細胞株を容易に得ることは難しい。このため、供与細胞としてＡ９ハイブリッド細胞またはＣＨＯハイブリッド細胞が使用されてきた。
【0006】
ＭＭＣＴ法では染色体を受容細胞に移入することができる。しかし、メガベース（Ｍｂ）サイズの染色体（例えばヒト染色体もしくは染色体断片）を細胞に移入するためのベクターには制限がある。例えばプラスミドでは約２０ｋｂ以下のサイズのポリヌクレオチド、ウイルスベクターでは１５０ｋｂ以下のサイズのポリヌクレオチド、ＢＡＣ／ＰＡＣでは３００ｋｂ以下のサイズのポリヌクレオチド、及びＹＡＣでは約１Ｍｂ未満のサイズのポリヌクレオチドであり、一方、ヒト人工染色体及びマウス人工染色体などの人工染色体では導入される染色体サイズに特に制限はない（非特許文献４）。このため、このような人工染色体には、目的の遺伝子座を含む染色体断片を搭載することができる。
【0007】
上記ヒト人工染色体及びマウス人工染色体は、本発明者らによって最初に開発されたものであり、染色体の由来により呼称が異なり、例えばヒト染色体由来の場合ヒト人工染色体と称し、一方マウス由来の場合マウス人工染色体と称する（特許文献１、２及び３）。
【0008】
ｉＰＳ細胞は、山中伸弥博士（京都大学）によって体細胞から人工的に作製された胚性幹（ＥＳ）細胞に類似した特徴を有する幹細胞であり、無限増殖性と分化多能性を有している（非特許文献５及び６）。ｉＰＳ細胞は、種々の組織の体細胞（幹細胞、前駆細胞又は成熟細胞）に分化することができるため、再生医療への応用が進められているし、また、遺伝性疾患の患者の体細胞から誘導されたｉＰＳ細胞は疾患モデル細胞を形成することから、医薬品開発のために利用されている（非特許文献７）。
【0009】
もしヒト細胞（供与細胞）からヒト細胞（受容細胞、例えばヒトｉＰＳ細胞）に目的ＤＮＡ（例えば染色体、人工染色体など）を容易に導入することができるならば、上記の再生医療や医薬品開発のために大きく貢献することが期待される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0010】
【文献】日本国特許第4997544号公報
【文献】日本国特許第5557217号公報
【文献】日本国特許第4895100号公報
【非特許文献】
【0011】
【文献】M. Katoh et al., BMC Biotechnology 2010, 10:37
【文献】N. Uno et al., Cytotechnology 2013, 65:803-809
【文献】M Hiratsuka et al., BMC Biotechnology 2015, 15:58
【文献】P. Osten et al., Handb Exp Pharmacol 2007, 178:177-202
【文献】K. Takahashi and S. Yamanaka, Cell 2006, 126(4):663-676
【文献】K. Takahashi et al., Cell 2007, 131(5):861-872
【文献】V.K. Singh et al., Frontiers in Cell and Developmental Biology 2015, doi:10.3389/fcell.2015.00002
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0012】
本発明の目的は、ＭＭＣＴ法を使用することによってヒト細胞（供与細胞）からヒト細胞（受容細胞、例えばヒトｉＰＳ細胞）、或いは非ヒト動物細胞（供与細胞）から非ヒト動物細胞（受容細胞、例えばｉＰＳ細胞）に目的ＤＮＡ（例えば、染色体、人工染色体など）を容易に導入するための方法を提供することである。ＭＭＣＴ法に関連して、従来、ヒト細胞（供与細胞）から直接的にヒト細胞由来微小核細胞を作製する手法がなく、上記の通り、マウス由来Ａ９ハイブリッド細胞又はＣＨＯハイブリッド細胞を作製したのち、ヒト細胞（受容細胞）と細胞融合することが通常行われてきた。このような場合、中間宿主であるＣＨＯハイブリッド細胞やＡ９ハイブリッド細胞の異種の細胞質の持ち込み及びウイルス等の感染の危険性がある。
【0013】
上記方法を可能にするために、本発明はさらに、目的ＤＮＡを含むヒト細胞からヒト細胞由来微小核細胞を収率よく作製するための方法を提供することを目的とする。この方法はまた、目的ＤＮＡを含む非ヒト動物細胞から非ヒト動物細胞由来微小核細胞を効率的に作製するために使用可能である。
【課題を解決するための手段】
【0014】
本発明は、以下の特徴を包含する。
（１）目的ＤＮＡを含むヒト細胞（但し、癌細胞を除く）からヒト細胞由来微小核細胞を作製するための方法であって、上記ヒト細胞を、微小管重合阻害剤（但し、コルセミドを除く）、微小管脱重合阻害剤及び紡錘体チェックポイント阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つの微小核形成誘導剤を含有する培地中で培養してヒト細胞由来微小核細胞を生成し、並びに、前記目的ＤＮＡを含むヒト細胞由来微小核細胞を回収することを含む、上記方法。
（２）上記目的ＤＮＡが、正常ヒト染色体である、上記（１）に記載の方法。
（３）上記目的ＤＮＡが、目的遺伝子を含むヒト人工染色体又は哺乳類人工染色体である、上記（１）に記載の方法。
（４）上記微小管重合阻害剤が、コルヒチンとビンクリスチンの混合物である、上記（１）～（３）のいずれかに記載の方法。
（５）上記微小管脱重合阻害剤が、パクリタキセル、ドセタキセル、又はパクリタキセルとドセタキセルの混合物である、上記（１）～（３）のいずれかに記載の方法。
（６）上記紡錘体チェックポイント阻害剤が、リバーシン、ヘスペラジン、又はリバーシンとヘスペラジンの混合物である、上記（１）～（３）のいずれかに記載の方法。
（７）目的ＤＮＡを含む非ヒト動物細胞（但し、癌細胞を除く）から非ヒト動物細胞由来微小核細胞を作製するための方法であって、上記非ヒト動物細胞を、リバーシン、パクリタキセル、又はリバーシンとパクリタキセルの混合物、及びコルヒチンとビンクリスチンの混合物からなる群から選択される少なくとも１つの微小核形成誘導剤を含有する培地中で培養して非ヒト動物細胞由来微小核細胞を生成し、並びに、上記目的ＤＮＡを含む非ヒト動物細胞由来微小核細胞を回収することを含む、上記方法。
（８）上記非ヒト動物細胞が、齧歯類細胞である、上記（７）に記載の方法。
（９）上記齧歯類細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はマウスＡ９細胞である、上記（８）に記載の方法。
（１０）上記目的ＤＮＡが、正常ヒト染色体である、上記（７）～（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）上記目的ＤＮＡが、目的遺伝子を含むヒト人工染色体又は哺乳類人工染色体である、上記（７）～（９）のいずれかに記載の方法。
（１２）目的ＤＮＡを含むヒト細胞又は非ヒト動物細胞を作製するための方法であって、上記（１）～（６）のいずれかに記載の方法によって目的ＤＮＡを含むヒト細胞由来微小核細胞を作製する工程、或いは上記（７）～（１１）のいずれかに記載の方法によって目的ＤＮＡを含む非ヒト動物細胞由来微小核細胞を作製する工程、供与細胞としての上記ヒト細胞由来微小核細胞又は上記非ヒト動物細胞由来微小核細胞と、受容細胞としてのそれぞれヒト細胞又は非ヒト動物細胞とを細胞融合する工程、それによって得られた上記目的ＤＮＡを含むヒト細胞又は非ヒト動物細胞を回収する工程を含む、上記方法。
（１３）前記非ヒト動物細胞が、齧歯類細胞である、上記（１２）に記載の方法。
（１４）前記齧歯類細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はマウスＡ９細胞である、上記（１３）に記載の方法。
（１５）上記目的ＤＮＡが、正常ヒト染色体である、上記（１２）に記載の方法。
（１６）上記目的ＤＮＡが、目的遺伝子を含むヒト人工染色体又は哺乳類人工染色体である、上記（１２）に記載の方法。
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０１８－１９１９９４号の開示内容を包含する。
（１）目的ＤＮＡを含むヒト細胞（但し、癌細胞を除く）からヒト細胞由来微小核細胞を作製するための方法であって、上記ヒト細胞を、微小管重合阻害剤（但し、コルセミドを除く）、微小管脱重合阻害剤及び紡錘体チェックポイント阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つの微小核形成誘導剤を含有する培地中で培養してヒト細胞由来微小核細胞を生成し、並びに、前記目的ＤＮＡを含むヒト細胞由来微小核細胞を回収することを含む、上記方法。
（２）上記目的ＤＮＡが、正常ヒト染色体である、上記（１）に記載の方法。
（３）上記目的ＤＮＡが、目的遺伝子を含むヒト人工染色体又は哺乳類人工染色体である、上記（１）に記載の方法。
（４）上記微小管重合阻害剤が、コルヒチンとビンクリスチンの混合物である、上記（１）～（３）のいずれかに記載の方法。
（５）上記微小管脱重合阻害剤が、パクリタキセル、ドセタキセル、又はパクリタキセルとドセタキセルの混合物である、上記（１）～（３）のいずれかに記載の方法。
（６）上記紡錘体チェックポイント阻害剤が、リバーシン、ヘスペラジン、又はリバーシンとヘスペラジンの混合物である、上記（１）～（３）のいずれかに記載の方法。
（７）目的ＤＮＡを含む非ヒト動物細胞（但し、癌細胞を除く）から非ヒト動物細胞由来微小核細胞を作製するための方法であって、上記非ヒト動物細胞を、リバーシン、パクリタキセル、又はリバーシンとパクリタキセルの混合物、及びコルヒチンとビンクリスチンの混合物からなる群から選択される少なくとも１つの微小核形成誘導剤を含有する培地中で培養して非ヒト動物細胞由来微小核細胞を生成し、並びに、上記目的ＤＮＡを含む非ヒト動物細胞由来微小核細胞を回収することを含む、上記方法。
（８）上記非ヒト動物細胞が、齧歯類細胞である、上記（７）に記載の方法。
（９）上記齧歯類細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はマウスＡ９細胞である、上記（８）に記載の方法。
（１０）上記目的ＤＮＡが、正常ヒト染色体である、上記（７）～（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）上記目的ＤＮＡが、目的遺伝子を含むヒト人工染色体又は哺乳類人工染色体である、上記（７）～（９）のいずれかに記載の方法。
（１２）目的ＤＮＡを含むヒト細胞又は非ヒト動物細胞を作製するための方法であって、上記（１）～（６）のいずれかに記載の方法によって目的ＤＮＡを含むヒト細胞由来微小核細胞を作製する工程、或いは上記（７）～（１１）のいずれかに記載の方法によって目的ＤＮＡを含む非ヒト動物細胞由来微小核細胞を作製する工程、供与細胞としての上記ヒト細胞由来微小核細胞又は上記非ヒト動物細胞由来微小核細胞と、受容細胞としてのそれぞれヒト細胞又は非ヒト動物細胞とを細胞融合する工程、それによって得られた上記目的ＤＮＡを含むヒト細胞又は非ヒト動物細胞を回収する工程を含む、上記方法。
（１３）前記非ヒト動物細胞が、齧歯類細胞である、上記（１２）に記載の方法。
（１４）前記齧歯類細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はマウスＡ９細胞である、上記（１３）に記載の方法。
（１５）上記目的ＤＮＡが、正常ヒト染色体である、上記（１２）に記載の方法。
（１６）上記目的ＤＮＡが、目的遺伝子を含むヒト人工染色体又は哺乳類人工染色体である、上記（１２）に記載の方法。
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０１８－１９１９９４号の開示内容を包含する。
【0015】
本発明により、ヒト細胞又は非ヒト動物細胞（供与細胞）から直接的にヒト細胞由来微小核細胞又は非ヒト動物細胞由来微小核細胞を作製することができるようになり、ＭＭＣＴ法の変法によりヒト細胞又は非ヒト動物細胞（受容細胞）との細胞融合が可能となる。これによって、人工染色体が例えば疾患原因遺伝子或いは治療用遺伝子を含むときには例えばヒトｉＰＳ細胞などのヒト細胞を医薬品開発や再生医療に使用できるという利点がある。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】この図は、供与細胞としての例えばヒト細胞からの微小核細胞融合法（ＭＭＣＴ）による染色体もしくは染色体断片の導入手法の作業手順を示す。図中において示されている目的染色体もしくは染色体断片は薬剤耐性遺伝子を保持している。このヒト細胞に対して化合物処理を行うことにより、微小核形成を誘導し、微小核を遠心分離することにより微小核細胞を作製する。これをさらにフィルターにより精製し、受容細胞としてのヒト細胞と上記微小核細胞との間で微小核細胞融合を行い、目的染色体もしくは染色体断片をヒト細胞内に導入する。目的染色体もしくは染色体断片が導入されたヒト細胞はさらに薬剤選択により薬剤耐性細胞株として選択することができる。また、非ヒト動物細胞についても同様の手順で行うことができる。
【図2】この図は、化合物処理条件の違いによるヒト不死化間葉系幹細胞の微小核形成能の違いの代表例を示す。上段パネルはコルセミド（Ｃｏｌｃｅｍｉｄ）０．０５μｇ／ｍＬで処理した際の細胞観察像を示す。下段パネルはパクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅ）ｌ２０ｎＭおよびリバーシン（Ｒｅｖｅｒｓｉｎｅ）５００ｎＭで処理したときの細胞観察像を示す。左パネルに明視野像、右パネルにＤＡＰＩ像を示す。
【図3】この図は、化合物処理条件の違いによるヒトｉＰＳ細胞の微小核形成能の違いの代表例を示す。上段左パネルはコルセミド（Ｃｏｌｃｅｍｉｄ）０．２５μｇ／ｍＬで処理したときの細胞観察像を示す。上段右パネルはＭＡＳ（コルヒチンおよびビンクリスチンの混合試薬）０．２μｇ／ｍＬで処理したときの細胞観察像を示す。中段及び下段パネルにおいて各種パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）処理濃度条件による微小核形成像を示す。円により微小核形成細胞を示す。
【図4】この図は、化合物処理条件の違いによるＣＨＯ細胞の微小核形成能の違いの代表例を示す。リバーシン（Ｒｅｖｅｒｓｉｎｅ）１５３６ｎＭ処理に加え、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）を３８４ｎＭ、２４ｎＭ、もしくは０ｎＭの濃度で加えた。左パネルに明視野画像、右パネルに赤色蛍光観察画像を示す。赤色蛍光タンパク質は核内局在を示し、核の形態を識別可能である。
【図5】この図は、化合物処理条件の違いによるＣＨＯ細胞の微小核形成能の違いの代表例を示す。パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）３８４ｎＭ処理に加え、リバーシン（Ｒｅｖｅｒｓｉｎｅ）を１５３６ｎＭ、２４ｎＭ、もしくは０ｎＭの濃度で加えた。左パネルに明視野画像、右パネルに赤色蛍光観察画像を示す。赤色蛍光タンパク質は核内局在を示し、核の形態を識別可能である。
【図6】この図は、各化合物処理条件によるマウス線維芽細胞株Ａ９細胞、マウス胎仔由来線維芽細胞初代培養細胞株、ブタ胎仔由来線維芽細胞初代培養細胞株、ニワトリプレＢ細胞ＤＴ４０細胞、ラットＥＳ細胞をパクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）４～４００ｎM及びリバーシン（Ｒｅｖｅｒｓｉｎｅ）０～１５００ｎＭで処理したときの微小核形成能の違いの代表例を示す。上段パネルはマウス線維芽細胞株Ａ９細胞、マウス胎仔由来線維芽細胞初代培養細胞株、ブタ胎仔由来線維芽細胞初代培養細胞株の顕微鏡観察による細胞観察像の代表例示す。下段パネルはＤＡＰＩ染色によるニワトリプレＢ細胞ＤＴ４０細胞、ラットＥＳ細胞の蛍光顕微鏡観察像を示す。
【図7】この図は、微小核細胞融合によりヒト不死化間葉系幹細胞からヒト細胞株ＨＴ１０８０（受容細胞）にＨＡＣベクターを導入した細胞のＦＩＳＨ解析像を示す。赤色と緑色で共染色されたものがＨＡＣベクターである。ヒト１３番、および２１番染色体に対するセントロメアプローブ、ｐ１１－４にて赤色（矢印）に染色している。ｐＣＡＧ－ＥＧＦＰプラスミドベクターにて、ＨＡＣベクター上のＥＧＦＰ遺伝子を緑色（矢頭）に染色している。小窓拡大図はＨＡＣベクターを拡大して示している。
【図8】この図は、微小核細胞融合によりヒトｉＰＳ細胞（供与細胞）からヒト細胞株ＨＴ１０８０（受容細胞）にマウス人工染色体（ＭＡＣ）ベクターを導入した細胞の蛍光顕微鏡像を示す。左パネルは明視野像、右パネルはＧＦＰ蛍光観察像をそれぞれ示す。
【図9】この図は、微小核細胞融合によりヒトｉＰＳ細胞（供与細胞）からヒト細胞株ＨＴ１０８０（受容細胞）にＭＡＣベクターを導入した細胞のＦＩＳＨ解析像を示す。赤色（矢印）と緑色（矢頭）で共染色されたものがＭＡＣベクターである。小窓拡大図はＭＡＣベクターを拡大して示している。
【図10】この図は、パクリタキセル及びリバーシンによる処理とコルセミドによる処理の比較実験での微小核細胞融合によりＣＨＯ細胞（供与細胞）からヒト細胞株ＨＴ１０８０（受容細胞）にＨＡＣベクターを導入したときの平均薬剤耐性コロニー出現数（平均値と誤差範囲）を示す。
【図11】この図は、微小核細胞融合によりヒト不死化間葉系幹細胞からヒト細胞株ＨＴ１０８０ ＨＰＲＴ欠損株にＸ染色体を導入した細胞のＦＩＳＨ解析像を示す。赤色（矢印）で染色されたものがＸ染色体のセントロメアである。ヒトＸ染色体特異的アルファサテライトプローブにて赤色に染色している。対照実験として、Ｘ染色体を導入していないＨＴ１０８０ ＨＰＲＴ欠損株を解析したところ、この細胞株は男性由来細胞であるため、１本のＸ染色体が観察された(左パネル)。一方で、Ｘ染色体導入株においては、２本のＸ染色体が観察された（右パネル）。
【図12】この図は、微小核細胞融合によりヒトｉＰＳ細胞からヒト細胞株ＨＴ１０８０ ＨＰＲＴ欠損株にＸ染色体を導入した細胞のマルチカラーＦＩＳＨ解析像を示す。各染色体特異的色素プローブを用いて、ヒト１～２２番、Ｘ、Ｙ染色体を分染し、示している。青色ラベルされたX染色体を３本観察できた(左パネル)。またX以外の染色体は８番、１８番、Y染色体以外４本ずつ観察されたことから、四倍体細胞であることがわかった。親株のＨＴ１０８０細胞 ＨＰＲＴ欠損株は四倍体であるとき、Ｘ染色体を二本もつことがわかっている。以上のことから、ヒトｉＰＳ細胞由来の外来X染色体がＨＴ１０８０ ＨＰＲＴ欠損株に導入されたことにより３本のＸ染色体が観察された、と示された。
【図13】この図は、ヒトｉＰＳ細胞からＨＴ１０８０ ＨＰＲＴ欠損株に外来Ｘ染色体を導入した細胞株のＨＡＴおよび６-チオグアニン感受性評価試験の結果を示している。ＨＴ１０８０野生型株、ＨＴ１０８０ ＨＰＲＴ欠損株（中列パネル）、外来Ｘ染色体含有ＨＴ１０８０ ＨＰＲＴ欠損株（右列パネル）に対して、ＨＡＴ選抜（上段パネル）および６－チオグアニンを２０μＭ選抜（下段パネル）行った際の顕微鏡観察像を示している。ＨＴ１０８０野生型株は正常ＨＰＲＴ遺伝子を持つため、ＨＡＴ耐性であり、６－チオグアニン感受性であった（図１３左パネル）。ＨＴ１０８０欠損株は、内在Ｘ染色体上の内在ＨＰＲＴ遺伝子は欠損しているため、ＨＡＴ感受性であり、６－チオグアニン非感受性であった（中パネル）。外来Ｘ染色体含有ＨＴ１０８０ ＨＰＲＴ欠損株は、ＨＰＲＴ遺伝子を再獲得しているため、野生型株と同様に、ＨＡＴ耐性であり、６－チオグアニン感受性であった（図１３右パネル）。
【発明を実施するための形態】
【0017】
本発明をさらに詳細に説明する。
１．ヒト細胞由来又は非ヒト動物細胞由来微小核細胞の作製
本発明は、第１の態様において、目的ＤＮＡを含むヒト細胞又は非ヒト動物細胞（但し、癌細胞を除く）からヒト細胞由来微小核細胞又は非ヒト動物細胞由来微小核細胞を作製するための方法であって目的ＤＮＡを含むヒト細胞又は非ヒト動物細胞を、微小管重合阻害剤（但し、コルセミドを除く）、微小管脱重合阻害剤及び紡錘体チェックポイント阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つの微小核形成誘導剤を含有する培地中で培養してヒト細胞由来微小核細胞又は非ヒト動物細胞由来微小核細胞を生成する工程、並びに、目的ＤＮＡを含むヒト細胞由来微小核細胞又は非ヒト動物細胞由来微小核細胞を回収する工程を含む上記方法を提供する。
１．ヒト細胞由来又は非ヒト動物細胞由来微小核細胞の作製
本発明は、第１の態様において、目的ＤＮＡを含むヒト細胞又は非ヒト動物細胞（但し、癌細胞を除く）からヒト細胞由来微小核細胞又は非ヒト動物細胞由来微小核細胞を作製するための方法であって目的ＤＮＡを含むヒト細胞又は非ヒト動物細胞を、微小管重合阻害剤（但し、コルセミドを除く）、微小管脱重合阻害剤及び紡錘体チェックポイント阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つの微小核形成誘導剤を含有する培地中で培養してヒト細胞由来微小核細胞又は非ヒト動物細胞由来微小核細胞を生成する工程、並びに、目的ＤＮＡを含むヒト細胞由来微小核細胞又は非ヒト動物細胞由来微小核細胞を回収する工程を含む上記方法を提供する。
【0018】
以下に各工程について説明する。
はじめに、上記目的ＤＮＡを含むヒト細胞又は非ヒト動物細胞について、以下に説明する。
はじめに、上記目的ＤＮＡを含むヒト細胞又は非ヒト動物細胞について、以下に説明する。
【0019】
上記ヒト細胞又は非ヒト動物細胞は、癌組織由来の細胞株である癌細胞（腫瘍細胞とも称する。）を除く以外は特に制限されないものとし、いずれの細胞も含む。そのようなヒト細胞又は非ヒト動物細胞には、例えば臓器、器官の組織に由来する細胞、幹細胞など、例えばそれらの初代培養細胞、株化細胞、不死化細胞、ＡＴＣＣ寄託細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞などを含むことができる。ヒト細胞又は非ヒト動物細胞の例は、非限定的に、上皮細胞、線維芽細胞、内皮細胞、肝細胞、膵細胞、腎細胞、脳細胞、筋細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、心筋細胞、毛乳頭細胞、神経細胞、組織幹細胞、胚性幹細胞、造血幹細胞などである。
【0020】
上記ヒト細胞又は非ヒト動物細胞の好ましい例は、非限定的に、ｉＰＳ細胞または不死化間葉系幹細胞である。
【0021】
本明細書中の「目的ＤＮＡ」という用語は、使用目的が明確であるＤＮＡであり、ＭＭＣＴ法の使用を考慮すると、例えばヒト由来の染色体もしくは染色体断片、人工染色体などを含む。人工染色体の例はヒト人工染色体及び哺乳類人工染色体（例えばマウス人工染色体、ラット人工染色体など）を含む。目的ＤＮＡは、好ましくは正常ヒト染色体であり、或いは目的遺伝子を含む、ヒト人工染色体又は哺乳類人工染色体であってよい。
【0022】
本明細書中の「目的遺伝子」という用語は、使用目的が明確である有用な遺伝子であり、場合により当該遺伝子は遺伝子座もしくは染色体断片に含まれていてもよい。また、目的遺伝子は、外来遺伝子として上記人工染色体に導入されてもよいし、或いは、予め上記人工染色体に含まれていてもよい。
【0023】
目的遺伝子は、非限定的に、例えば、疾患原因遺伝子、治療用遺伝子、それらの遺伝子を含む染色体断片、細胞分化に必要な遺伝子などを包含し、例えば、サイトカイン類、インターフェロン、インターロイキン、ケモカイン（細胞遊走活性をもつ因子）、顆粒球コロニー刺激因子、腫瘍壊死因子、成長因子（例えば血小板由来生長因子、血管内皮成長因子、肝細胞成長因子、ケラチノサイト増殖因子、神経成長因子、等）、栄養因子（例えば神経栄養因子、脳由来神経栄養因子、等）、エリスロポエチン、血液凝固系タンパク質、血小板産生促進因子、ホルモン類、抗体類（例えば、モノクローナル抗体、ｓｃＦｖなどの組換え抗体、等）、酵素類などのタンパク質をコードする遺伝子もしくはＤＮＡを含むことができる。目的遺伝子はさらに、筋ジストロフィー、血友病、神経変性疾患、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、遺伝性疾患、腫瘍などの疾患に関連する治療用遺伝子もしくはＤＮＡ、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）などの免疫系遺伝子又はＤＮＡを含む。
【0024】
本明細書中「人工染色体」という用語は、ヒト及び齧歯類（例えばマウス、ラットなど）を含む哺乳動物（「哺乳類」ともいう。）由来の染色体のセントロメア、長腕及び、もしあれば、短腕のセントロメア近傍の断片（可能なかぎり遺伝子類が除去されている。）、及び天然もしくは人工テロメアを含む、人工的に作製された染色体由来ベクターを指す。従って、本発明の人工染色体は、従来のベクター系であるウイルス、ＹＡＣ、ＢＡＣ、ＰＡＣ、コスミド、プラスミドなどと異なる。
【0025】
人工染色体には、例えば遺伝子、遺伝子座、染色体断片などの所望の核酸、例えばヒト由来の所望の核酸を挿入する部位が含まれており、この部位に所望の核酸が挿入される。
【0026】
マウス人工染色体については、例えば日本国特許第５５５７２１７号公報、日本国特許第４９９７５４４号公報などに、またヒト人工染色体については、例えば日本国特許第４８９５１００号公報にそれぞれ記載されている。
【0027】
マウス人工染色体の作製に使用するためのマウス染色体は、マウス染色体１～１９、Ｘ及びＹのいずれでもよいが、好ましくは１番～１９番染色体のいずれかである。例えばマウス１１番染色体断片由来の人工染色体ベクターの場合には、上記長腕断片は、非限定的に例えば、該１１番染色体の長腕のＡＬ６７１９６８、或いはＢＸ５７２６４０（ＡＬ６７１９６８よりセントロメア側に位置する。）、ＣＲ９５４１７０（ＡＬ６７１９６８及びＢＸ５７２６４０よりセントロメア側に位置する。）又はＡＬ７１３８７５（ＡＬ６７１９６８よりセントロメア側に位置する。）、よりも遠位の領域が削除された長腕断片からなる。或いは、マウス１５番染色体断片由来のマウス人工染色体の場合、上記長腕断片は、例えば、ＡＣ１２１３０７、ＡＣ１６１７９９などの位置よりも遠位の領域が削除された長腕断片からなる。或いは、マウス１６番染色体断片由来のマウス人工染色体の場合、上記長腕断片は、例えば、ＡＣ１２７６８７、ＡＣ１４０９８２などの位置よりも遠位の領域が削除された長腕断片からなる。
【0028】
ヒト人工染色体の作製に使用するためのヒト染色体は、ヒト染色体１～２２、Ｘ及びＹのいずれでもよいが、好ましくは１番～２２番染色体のいずれかである。或いは、ヒト染色体として、ヒトｉＰＳ細胞由来の染色体を使用することができる。ヒト人工染色体の作製は、例えば特開２０１０－００４８８７号公報、ＷＯ２００８／０１３０６７などに記載されている方法、マウス人工染色体の作製に関する上記文献に記載される手法などを参照することができる。また、ｉＰＳ細胞は相同組換え頻度が高いことから、ヒトｉＰＳ細胞由来の染色体を利用して、ヒト人工染色体を構築することも可能である。
【0029】
人工染色体には、所望の核酸（例えば遺伝子、遺伝子座、染色体断片など）を挿入するための、ｌｏｘＰ（Ｃｒｅリコンビナーゼ認識部位）、ＦＲＴ（Ｆｌｐリコンビナーゼ認識部位）、φＣ３１ａｔｔＢ及びφＣ３１ａｔｔＰ（φＣ３１リコンビナーゼ認識部位）、Ｒ４ａｔｔＢ及びＲ４ａｔｔＰ（Ｒ４リコンビナーゼ認識部位）、ＴＰ９０１－１ａｔｔＢ及びＴＰ９０１－１ａｔｔＰ（ＴＰ９０１－１リコンビナーゼ認識部位）、或いはＢｘｂ１ａｔｔＢ及びＢｘｂ１ａｔｔＰ（Ｂｘｂ１リコンビナーゼ認識部位）などのＤＮＡ配列挿入部位をさらに含むことができる。また、人工染色体は、所望の核酸配列を挿入するための部位を含むことができるため、この部位に、所望の核酸を組み込むことによって、該人工染色体が任意の細胞に導入されたときに該所望の核酸を発現することが可能となる。
【0030】
所望の核酸は、非限定的に、例えば疾患原因遺伝子、治療用遺伝子、それらの遺伝子を含む染色体断片、レポーター遺伝子、マーカー遺伝子などを包含する。
【0031】
本発明の人工染色体における所望の核酸の挿入部位の近傍又は挿入部位の両側には、少なくとも１つのインスレーター配列を存在させることができる。インスレーター配列は、エンハンサーブロッキング効果（すなわち、隣り合う遺伝子が互いに影響を受けない）又は染色体バウンダリー効果（遺伝子発現を保証する領域と遺伝子発現が抑制される領域を隔て区別する）を有する。このような配列には、例えばヒトβグロビンＨＳ１～ＨＳ５、ニワトリβグロビンＨＳ４などが包含されてもよい。
【0032】
上記供与細胞には、上記の所望のＤＮＡが、例えばリポフェクション法などの遺伝子導入技術を用いて供与細胞中のヒト人工染色体、哺乳類人工染色体などの人工染色体上に導入されうる。遺伝子導入後、目的ＤＮＡを含む供与細胞は、例えばＨＡＴ選択法によって検出し回収することができる。
【0033】
ヒト細胞又は非ヒト動物細胞にはさらに、目的の微小核細胞の選択のために、薬剤耐性遺伝子（例えばブラストサイジン（Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ）耐性遺伝子、ネオマイシン（Ｇ４１８）耐性遺伝子など）及び／又は蛍光タンパク質をコードする遺伝子（例えばＧＦＰ、ＤｓＲｅｄなど）を導入することができる。
【0034】
次に、微小核形成誘導剤及び微小核形成について説明する（図１）。
本発明の方法は、目的ＤＮＡを含むヒト細胞又は非ヒト動物細胞を、微小管重合阻害剤（但し、コルセミドを除く）、微小管脱重合阻害剤及び紡錘体チェックポイント阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つの微小核形成誘導剤を含有する培地中で培養することを特徴としている。
本発明の方法は、目的ＤＮＡを含むヒト細胞又は非ヒト動物細胞を、微小管重合阻害剤（但し、コルセミドを除く）、微小管脱重合阻害剤及び紡錘体チェックポイント阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つの微小核形成誘導剤を含有する培地中で培養することを特徴としている。
【0035】
微小管重合阻害剤は、コルセミドを除く以外は、また微小核細胞を形成する限り、特に限定されないものとし、例えば、コルヒチン（Ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ）とビンクリスチン（Ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）の混合物などを含む。
【0036】
微小管脱重合阻害剤は、微小核細胞を形成する限り、特に限定されないものとし、例えば、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、ドセタキセルとパクリタキセルの混合物などを含む。
【0037】
紡錘体チェックポイント阻害剤は、微小核細胞を形成する限り、特に限定されないものとし、例えば、リバーシン（Ｒｅｖｅｒｓｉｎｅ）、ヘスペラジン（Ｈｅｓｐｅｒａｄｉｎ）、リバーシンとヘスペラジンの混合物などを含む。
【0038】
培地中の微小核形成誘導剤の好適濃度は、微小核形成誘導剤の種類により異なり、例えば、リバーシン０．００１ｎＭ～１Ｍ、パクリタキセル０．００１ｎＭ～１Ｍ、又はコルヒチンとビンクリスチン（０．０１：９．９９～９．９９：０．０１（重量））の混合物０．００１ｎＭ～１Ｍであるが、微小核細胞が形成される限り、上記の範囲に限定されないものとする。好ましい微小核形成誘導剤は、リバーシン又は、リバーシンとパクリタキセル混合物である。
【0039】
培地は、動物細胞の培養のために使用される培地であれば制限されない。基本培地は、例えばダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）、ハムＦ－１２培地、ＲＰＭＩ－１６４０培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、それらの混合培地などであり、ヒトｉＰＳ細胞用培地は、霊長類ＥＳ細胞用培地（リプロセル社、日本）などを使用することができる。
【0040】
微小核形成誘導処理方法は、例えば以下の手順で行うことができる。
目的ＤＮＡを含むヒト細胞又は非ヒト動物細胞を供与細胞として、供与細胞を細胞培養フラスコ（例えば底面積２５ｃｍ２）用いて培養し、約７０％コンフルエントになった時点で、上記培養培地を用いて、形成誘導薬剤を加え、２０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）の存在下、３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて１２～９６時間又はそれ以上培養を行う。
目的ＤＮＡを含むヒト細胞又は非ヒト動物細胞を供与細胞として、供与細胞を細胞培養フラスコ（例えば底面積２５ｃｍ２）用いて培養し、約７０％コンフルエントになった時点で、上記培養培地を用いて、形成誘導薬剤を加え、２０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）の存在下、３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて１２～９６時間又はそれ以上培養を行う。
【0041】
最後に、上記培養によって微小核細胞集団を回収し、さらに蛍光陽性や薬剤選択によって目的ＤＮＡを含むヒト細胞由来微小核細胞又は非ヒト動物細胞由来微小核細胞を回収する。
【0042】
微小核細胞の回収は、例えば次のように行うことができる。
微小核形成誘導後、フラスコ内の培地をアスピレートし、そのフラスコの９分目までをサイトカラシンＢで満たす。フラスコを大型高速遠心機（例えばＢＥＣＫＭＡＮ）専用の容器に挿入し、温湯（３４℃）をフラスコが隠れない程度に加え、遠心分離（Ｒｏｒｔｏｒ ＩＤ１０．５００、８，０００ｒｐｍ、１時間、３４℃）する。遠心分離終了後、サイトカラシンＢを回収し、フラスコ内のペレットを、２ｍｌの無血清培地ＤＭＥＭにて１５ｍｌチューブに回収する。８μｍ→５μｍ→３μｍフィルターの順にゆっくりとフィルトレーションした後、それぞれのチューブを遠心分離（１，２００ｒｐｍ、５分、室温）し、上清をアスピレートした後、各チューブのペレットをまとめて５ｍｌの無血清培地ＤＭＥＭに回収、懸濁し、遠心分離（２０００ｒｐｍ、５分）し、微小核細胞を回収する。
微小核形成誘導後、フラスコ内の培地をアスピレートし、そのフラスコの９分目までをサイトカラシンＢで満たす。フラスコを大型高速遠心機（例えばＢＥＣＫＭＡＮ）専用の容器に挿入し、温湯（３４℃）をフラスコが隠れない程度に加え、遠心分離（Ｒｏｒｔｏｒ ＩＤ１０．５００、８，０００ｒｐｍ、１時間、３４℃）する。遠心分離終了後、サイトカラシンＢを回収し、フラスコ内のペレットを、２ｍｌの無血清培地ＤＭＥＭにて１５ｍｌチューブに回収する。８μｍ→５μｍ→３μｍフィルターの順にゆっくりとフィルトレーションした後、それぞれのチューブを遠心分離（１，２００ｒｐｍ、５分、室温）し、上清をアスピレートした後、各チューブのペレットをまとめて５ｍｌの無血清培地ＤＭＥＭに回収、懸濁し、遠心分離（２０００ｒｐｍ、５分）し、微小核細胞を回収する。
【0043】
本発明の上記方法はまた、上記微小核形成誘導剤を用いて目的ＤＮＡを含む非ヒト動物細胞（但し、癌細胞を除く）から非ヒト動物細胞由来微小核細胞を作製するために使用することができる。それゆえ、この方法もまた本発明に包含されるものとする。
具体的には、第２の態様において、目的ＤＮＡを含む非ヒト動物細胞（但し、癌細胞を除く）から非ヒト動物細胞由来微小核細胞を作製するための方法であって、上記非ヒト動物細胞を、リバーシン、パクリタキセル、又はリバーシンとパクリタキセルの混合物、及びコルヒチンとビンクリスチンの混合物からなる群から選択される少なくとも１つの微小核形成誘導剤を含有する培地中で培養して非ヒト動物細胞由来微小核細胞を生成し、並びに、上記目的ＤＮＡを含む非ヒト動物細胞由来微小核細胞を回収することを含む方法が提供される。
具体的には、第２の態様において、目的ＤＮＡを含む非ヒト動物細胞（但し、癌細胞を除く）から非ヒト動物細胞由来微小核細胞を作製するための方法であって、上記非ヒト動物細胞を、リバーシン、パクリタキセル、又はリバーシンとパクリタキセルの混合物、及びコルヒチンとビンクリスチンの混合物からなる群から選択される少なくとも１つの微小核形成誘導剤を含有する培地中で培養して非ヒト動物細胞由来微小核細胞を生成し、並びに、上記目的ＤＮＡを含む非ヒト動物細胞由来微小核細胞を回収することを含む方法が提供される。
【0044】
非ヒト動物細胞は、すべての動物細胞を指し、非限定的に、例えば齧歯類細胞、偶蹄類細胞、奇蹄類細胞、霊長類（ヒトを除く）細胞、イヌ科細胞、ネコ科細胞、鳥類細胞、爬虫類細胞、両生類細胞、昆虫細胞などを含む。好ましい非ヒト動物細胞は、齧歯類細胞である。
【0045】
上記齧歯類細胞は、マウス、ラット、ハムスターなどの動物の臓器、器官の組織に由来する細胞など、例えばそれらの初代培養細胞、株化細胞、ＡＴＣＣ寄託細胞などを含むことができる。齧歯類細胞の例は、非限定的に、上皮細胞、線維芽細胞、内皮細胞、肝細胞、筋細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、心筋細胞、毛乳頭細胞、神経細胞、卵巣細胞などである。
上記齧歯類細胞の好ましい例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはマウス由来Ａ９細胞である。
上記目的ＤＮＡ、微小核形成誘導剤などについては、上記ヒト細胞又は非ヒト動物細胞の説明をここでも引用する。
上記齧歯類細胞の好ましい例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはマウス由来Ａ９細胞である。
上記目的ＤＮＡ、微小核形成誘導剤などについては、上記ヒト細胞又は非ヒト動物細胞の説明をここでも引用する。
【0046】
２．目的ＤＮＡを含むヒト細胞又は非ヒト動物細胞の作製
本発明は、第３の態様において、目的ＤＮＡを含むヒト細胞又は非ヒト動物細胞を作製するための方法であって、上記１．に記載の方法によって目的ＤＮＡを含むヒト細胞からヒト細胞由来微小核細胞、或いは目的ＤＮＡを含む非ヒト動物細胞（但し、癌細胞を除く）から非ヒト動物細胞由来微小核細胞を作製する工程、上記ヒト細胞由来微小核細胞又は非ヒト動物細胞由来微小核細胞と、それぞれヒト細胞又は非ヒト動物細胞とを細胞融合する工程、それによって得られた上記目的ＤＮＡを含むヒト細胞又は非ヒト動物細胞を回収する工程を含む、目的ＤＮＡを含むヒト細胞又は非ヒト動物細胞を作製するための方法を提供する。
本発明は、第３の態様において、目的ＤＮＡを含むヒト細胞又は非ヒト動物細胞を作製するための方法であって、上記１．に記載の方法によって目的ＤＮＡを含むヒト細胞からヒト細胞由来微小核細胞、或いは目的ＤＮＡを含む非ヒト動物細胞（但し、癌細胞を除く）から非ヒト動物細胞由来微小核細胞を作製する工程、上記ヒト細胞由来微小核細胞又は非ヒト動物細胞由来微小核細胞と、それぞれヒト細胞又は非ヒト動物細胞とを細胞融合する工程、それによって得られた上記目的ＤＮＡを含むヒト細胞又は非ヒト動物細胞を回収する工程を含む、目的ＤＮＡを含むヒト細胞又は非ヒト動物細胞を作製するための方法を提供する。
【0047】
以下に、各工程について説明する。
細胞融合の工程は、ＭＭＣＴ（微小核細胞融合）法の変法を用いて、上記１．で作製された目的ＤＮＡを含む微小核細胞と、受容細胞としてのヒト細胞株とをフィーダー細胞非存在下で共培養して細胞融合し、目的ＤＮＡを含むヒト細胞株を作製することを含む。
細胞融合の工程は、ＭＭＣＴ（微小核細胞融合）法の変法を用いて、上記１．で作製された目的ＤＮＡを含む微小核細胞と、受容細胞としてのヒト細胞株とをフィーダー細胞非存在下で共培養して細胞融合し、目的ＤＮＡを含むヒト細胞株を作製することを含む。
【0048】
ヒト細胞又は非ヒト動物細胞は、例えば正常細胞、不死化細胞、胚性幹細胞、体性幹細胞、（例えばヒトもしくは哺乳類体細胞由来）ｉＰＳ細胞などを含むが、目的ＤＮＡの導入が可能なかぎり限定されないものとする。
【0049】
ＭＭＣＴ（微小核細胞融合）法の変法は、微小核細胞の表面にウイスルエンベロープタンパク質を発現させることを含む。そのために、供与細胞である上記ヒト細胞又は非ヒト動物細胞は予め、ウイルスエンベロープタンパク質をコードするＤＮＡで発現可能なように形質転換しておくことができる。
【0050】
ウイスルエンベロープタンパク質は、例えば麻疹ウイルス、白血病ウイルスなどのウイルス由来のエンベロープタンパク質であり、このエンベロープタンパク質には、麻疹ウイルス由来エンベロープタンパク質の場合、例えばヘマグルチニン（Ｈｅｍａｇｌｕｔｉｎｉｎ；Ｈ）タンパク質及びフュージョン（Ｆｕｓｉｏｎ；Ｆ）タンパク質、白血病ウイルス由来エンベロープタンパク質の場合、例えばＳＵタンパク質及びＴＭタンパク質を含むことができる。好ましいウイスルエンベロープタンパク質は、麻疹ウイルス由来エンベロープタンパク質、例えばＨタンパク質及びＦタンパク質である。
【0051】
Ｈタンパク質を遺伝子工学技術により、Ｈタンパク質が特定の受容細胞の表面抗原に結合可能にするように改変を加えることができる。例えば、抗体の抗原認識の最小単位ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｖ（ＳｃＦｖ）、好ましくは抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ１３抗体もしくは抗ＣＤ７１抗体、或いはこれらの抗体のＳｃＦｖをＨタンパク質に融合することで野生型Ｈタンパク質では融合できない細胞種に対しても融合可能となる。または融合能を付与するためにレシピエント細胞に染色体受容細胞に対して、Ｈタンパク質に結合しうるＣＤ４６抗原、ＣＤ１２０（ＳＬＡＭ）抗原を一過的に発現させることで、微小核細胞融合を可能とさせることができる。或いは、Ｈタンパク質にＴａｇペプチド配列を付加することができ、受容細胞に抗Ｈｉｓ ｔａｇ抗体もしくは、抗Ｈタンパク質抗体を発現するよう遺伝子改変を加えることで、融合を引き起こすことができる。
【0052】
上記各エンベロープタンパク質をコードするＤＮＡを含むプラスミド、或いは複数のエンベロープタンパク質をコードするＤＮＡカセットを含むプラスミドを、遺伝子組換え技術によって構築し、これらのプラスミドで供与細胞を形質転換する。上記形質転換細胞を作成する際、自己細胞融合が起きないように、ドナー細胞のＣＤ４６抗原、ＣＤ１２０抗原、あるいはＨタンパク質に融合された抗体ＳｃＦｖと結合する表面抗原を欠損させることで、微小核細胞融合を可能とさせることができる。
【0053】
供与細胞であるヒト細胞又は非ヒト動物細胞にはさらに、目的細胞の選択のために、薬剤耐性遺伝子（例えばＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ耐性遺伝子、ネオマイシン（Ｇ４１８）耐性遺伝子など）及び／又は蛍光タンパク質をコードする遺伝子（例えばＧＦＰ、ＤｓＲｅｄなど）を導入することができる。
【0054】
上記の手法によってウイスルエンベロープタンパク質を細胞表面に発現する、かつ目的ＤＮＡ（例えば人工染色体）を含む供与細胞を作製することができる。
【0055】
受容細胞がヒト細胞又は非ヒト動物細胞である場合には、フィーダーフリー培養法及び、ウイルスエンベロープを用いるＭＭＣＴ法を使用することによって、目的ＤＮＡ（例えばヒト人工染色体、哺乳類人工染色体などの人工染色体）をヒト細胞又は非ヒト動物細胞に導入することができる。
【0056】
ｉＰＳ細胞は、体細胞（例えば、体性幹細胞、前駆細胞、及び／又は、成熟細胞を含む。）に、ある特定の再プログラム化因子（ＤＮＡ又はタンパク質）を導入し、適当な培地にて培養、継代培養することによって約３～５週間でコロニーを生成する。再プログラム化因子は、例えばＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ－Ｍｙｃからなる組み合わせ；Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４からなる組み合わせ；Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ及びＬｉｎ２８からなる組み合わせ；あるいは、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ及びＬｉｎ２８からなる組み合わせなどが知られている（Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｓ．Ｙａｍａｎａｋａ，Ｃｅｌｌ；１２６：６６３－６７６（２００６）；ＷＯ２００７／０６９６６６；Ｍ．Ｎａｋａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：１０１－１０６（２００８）；Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ；１３１：８６１－８７２（２００７）；Ｊ．Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ；３１８：１９１７－１９２０（２００７）；Ｊ．Ｌｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ；Ｒｅｓ．１８，６００－６０３（２００８））。培養例は、マイトマイシンＣ処理したマウス胎仔線維芽細胞株（例えばＳＴＯ）をフィーダー細胞とし、このフィーダー細胞層上でＥＳ細胞用培地を用いて、再プログラム化因子発現ベクター導入体細胞（約１０４～１０５細胞／ｃｍ２）を約３７℃の温度で培養することを含む。このときフィーダー細胞は必ずしも必要ではない（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ；１３１：８６１－８７２（２００７））。基本培地は、例えばダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）、ハムＦ－１２培地、ＲＰＭＩ－１６４０培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、それらの混合培地などであり、ヒトｉＰＳ細胞用培地は、霊長類ＥＳ細胞用培地（リプロセル社）などを使用することができる。
【0057】
フィーダー細胞の非存在下でのｉＰＳ細胞の培養培地は、例えばＳｔｅｍＦｉｔＴＭ ＡＫ０２Ｎ（リプロセル）、ＴｅＳＲＴＭ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ ＸＦ／ＦＦ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭ ＧＷＮＴ）などがあげられる。また培養用基質はＧｅｌｔｒｒｅｘＴＭ ＬＤＥＶ－Ｆｒｅｅ ｈＥＳＣ－ｑｕａｌｉｆｉｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ｉＭａｔｒｉｘＴＭ－５１１（ニッピ）、ｈＥＳ Ｑｕａｌｉｆｉｅｄ ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）などがあげられる。
【0058】
フィーダー細胞の非存在下、上記例示の培地にて、上記１．で作製された、目的ＤＮＡを含むヒト細胞由来微小核細胞又は目的ＤＮＡを含む非ヒト動物（例えば齧歯類）細胞由来微小核細胞と、受容細胞としてのそれぞれヒト細胞又は非ヒト動物細胞とを共培養して細胞融合を行う。その後、例えば薬剤（例えば抗生物質）を含む培地で培養することによって、薬剤耐性（及び蛍光陽性）を指標として目的ＤＮＡを含むヒト細胞又は非ヒト動物細胞を選択することができる。
【0059】
細胞融合のための培養条件は、例えば、培地１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ、温度３７℃、期間２４時間である。或いは、別の培養条件は、例えば、培地Ｓｔｅｍｆｉｔ、基質ｉＭａｔｒｉｘ－５１１ ０．５μｇ／ｍＬでの培養皿コーティング温度３７℃、期間２４時間である。
【実施例】
【0060】
以下の実施例を参照しながら、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は、それらの実施例によって制限されないものとする。
＜実施例１＞
＜実施例１＞
【0061】
動物細胞への微小核形成誘導剤の探索
［Ａ］ヒト不死化間葉系幹細胞への微小核形成誘導剤の探索
微小核形成誘導剤の候補として、細胞分裂阻害剤があげられる。例として、微小管重合阻害剤、微小管脱重合阻害剤（微小管安定化剤）、及びＭ期チェックポイントタンパク阻害剤である。具体例として、微小管重合阻害剤であるコルセミド（Ｃｏｌｃｅｍｉｄ）、ＭＡＳ（コルヒチンおよびビンクリスチンの混合試薬）、微小管脱重合阻害剤であるパクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）を用いて微小核形成効率を比較した。それらに加えてＭ期チェックポイントタンパクであるオーロラキナーゼ（Ａｕｒｏｒａ ｋｉｎａｓｅ）Ａ及びＢの阻害剤であるリバーシン（Ｒｅｖｅｒｓｉｎｅ）の相乗効果を検討した。
［Ａ］ヒト不死化間葉系幹細胞への微小核形成誘導剤の探索
微小核形成誘導剤の候補として、細胞分裂阻害剤があげられる。例として、微小管重合阻害剤、微小管脱重合阻害剤（微小管安定化剤）、及びＭ期チェックポイントタンパク阻害剤である。具体例として、微小管重合阻害剤であるコルセミド（Ｃｏｌｃｅｍｉｄ）、ＭＡＳ（コルヒチンおよびビンクリスチンの混合試薬）、微小管脱重合阻害剤であるパクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）を用いて微小核形成効率を比較した。それらに加えてＭ期チェックポイントタンパクであるオーロラキナーゼ（Ａｕｒｏｒａ ｋｉｎａｓｅ）Ａ及びＢの阻害剤であるリバーシン（Ｒｅｖｅｒｓｉｎｅ）の相乗効果を検討した。
【0062】
［Ａ．１．１］検証用細胞の播種と各種阻害剤での処理
ヒト不死化間葉系幹細胞（ｈｉＭＳＣ:京都大学・戸口田博士より分与）を６穴プレートの各穴に５×１０５個ずつを播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて２４時間培養した。微小核形成誘導試験として、コルセミド（Ｃｏｌｃｅｍｉｄ）（０．０５μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ）、ＭＡＳ（０．１μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．４μｇ／ｍＬ）、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）（０．８ｎＭ、４ｎＭ、２０ｎＭ、１００ｎM、４００ｎM）で処理しつつ、リバーシン（Ｒｅｖｅｒｓｉｎｅ）（添加なし、５００ｎＭ、１０００ｎM、１５００ｎM）の添加、計２６条件を設定し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて４８時間培養した。
ヒト不死化間葉系幹細胞（ｈｉＭＳＣ:京都大学・戸口田博士より分与）を６穴プレートの各穴に５×１０５個ずつを播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて２４時間培養した。微小核形成誘導試験として、コルセミド（Ｃｏｌｃｅｍｉｄ）（０．０５μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ）、ＭＡＳ（０．１μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．４μｇ／ｍＬ）、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）（０．８ｎＭ、４ｎＭ、２０ｎＭ、１００ｎM、４００ｎM）で処理しつつ、リバーシン（Ｒｅｖｅｒｓｉｎｅ）（添加なし、５００ｎＭ、１０００ｎM、１５００ｎM）の添加、計２６条件を設定し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて４８時間培養した。
【0063】
［Ａ．１．２］ＤＡＰＩ染色法による微小核形成効率の観察
微小核形成誘導後に生細胞を観察するため、４％パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、ＤＡＰＩ１μｇ／ｍＬの濃度で１５分間染色した。蛍光顕微鏡を用いて観察し微小核誘形成導率を比較した。各細胞に微小核が形成されているかを観察し、結果を図示した（図２）。この結果から、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）２０ｎＭ、リバーシン（Ｒｅｖｅｒｓｉｎｅ）５００ｎＭで処理した際に最も効率よく微小核が形成されることを見出した。従来のコルセミド（Ｃｏｌｃｅｍｉｄ）のような微小管重合阻害剤ではなく、Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌのような微小管脱重合阻害剤が有効であることを見出した。また、Ｍ期チェックポイント阻害剤であるリバーシン（Ｒｅｖｅｒｓｉｎｅ）の併用が有用であると見出した。
微小核形成誘導後に生細胞を観察するため、４％パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、ＤＡＰＩ１μｇ／ｍＬの濃度で１５分間染色した。蛍光顕微鏡を用いて観察し微小核誘形成導率を比較した。各細胞に微小核が形成されているかを観察し、結果を図示した（図２）。この結果から、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）２０ｎＭ、リバーシン（Ｒｅｖｅｒｓｉｎｅ）５００ｎＭで処理した際に最も効率よく微小核が形成されることを見出した。従来のコルセミド（Ｃｏｌｃｅｍｉｄ）のような微小管重合阻害剤ではなく、Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌのような微小管脱重合阻害剤が有効であることを見出した。また、Ｍ期チェックポイント阻害剤であるリバーシン（Ｒｅｖｅｒｓｉｎｅ）の併用が有用であると見出した。
【0064】
［Ｂ］ヒトｉＰＳ細胞への微小核形成誘導剤の探索
［Ｂ．１．１］ヒトｉＰＳ細胞の培養
ヒトｉＰＳ細胞を予め０．５μｇ／ｃｍ２のＬａｍｉｎｉｎＴＭ－５１１（ニッピ）でコートした６穴プレートに対して、５×１０５個ずつヒトｉＰＳ細胞を播種し、１０μＭ Ｙ－２７６３２を添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて２４時間培養した。微小核形成誘導試験として、コルセミド（Ｃｏｌｃｅｍｉｄ）０．２５μｇ／ｍＬ、ＭＡＳ０．２μｇ／ｍＬもしくはパクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）（２０ｎＭ、４０ｎＭ、６０ｎＭ、１００ｎＭ、４００ｎM）で処理しつつ、リバーシン（Ｒｅｖｅｒｓｉｎｅ）（添加なし、５００ｎＭ、１０００ｎM、１５００ｎM）の添加の計２２条件を設定し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて４８時間培養した。
［Ｂ．１．１］ヒトｉＰＳ細胞の培養
ヒトｉＰＳ細胞を予め０．５μｇ／ｃｍ２のＬａｍｉｎｉｎＴＭ－５１１（ニッピ）でコートした６穴プレートに対して、５×１０５個ずつヒトｉＰＳ細胞を播種し、１０μＭ Ｙ－２７６３２を添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて２４時間培養した。微小核形成誘導試験として、コルセミド（Ｃｏｌｃｅｍｉｄ）０．２５μｇ／ｍＬ、ＭＡＳ０．２μｇ／ｍＬもしくはパクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）（２０ｎＭ、４０ｎＭ、６０ｎＭ、１００ｎＭ、４００ｎM）で処理しつつ、リバーシン（Ｒｅｖｅｒｓｉｎｅ）（添加なし、５００ｎＭ、１０００ｎM、１５００ｎM）の添加の計２２条件を設定し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて４８時間培養した。
【0065】
［Ｂ．１．２］顕微鏡による微小核形成効率の観察
微小核形成誘導後に顕微鏡を用いて観察し微小核誘形成導率を比較した。結果として、コルセミド（Ｃｏｌｃｅｍｉｄ）０．２５μｇ／ｍＬの条件に対してＭＡＳ０．２μｇ／ｍＬの条件において微小核形成誘導が観察された（図３）。さらにパクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）では濃度依存的に微小核形成率の増加が観察された（図３）。また、Ｍ期チェックポイント阻害剤であるＲｅｖｅｒｓｉｎｅの併用が有用であると見出した。
微小核形成誘導後に顕微鏡を用いて観察し微小核誘形成導率を比較した。結果として、コルセミド（Ｃｏｌｃｅｍｉｄ）０．２５μｇ／ｍＬの条件に対してＭＡＳ０．２μｇ／ｍＬの条件において微小核形成誘導が観察された（図３）。さらにパクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）では濃度依存的に微小核形成率の増加が観察された（図３）。また、Ｍ期チェックポイント阻害剤であるＲｅｖｅｒｓｉｎｅの併用が有用であると見出した。
【0066】
［Ｃ］ＣＨＯ細胞への微小核形成誘導剤の効果の検証
［Ｃ．１．１］ＣＨＯ細胞の培養
核内局在を示す赤色蛍光タンパクを発現するＣＨＯ ＭＨＧ＃４ａを９６穴プレートに対して、１×１０４個ずつ播種し、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）（０ｎＭ、９６ｎＭ、１９２ｎＭ、３８４ｎＭ、７６８ｎＭ、１１５２ｎＭ、１５３６ｎＭ、１９２０ｎＭ）および、リバーシン（Ｒｅｖｅｒｓｉｎｅ）（０ｎＭ、１９２ｎＭ、３８４ｎＭ、７６８ｎＭ、１５３６ｎＭ、３０７２ｎＭ、４６０８ｎＭ、６１４４ｎＭ、７６８０ｎＭ、９２１６ｎＭ、１０７５２ｎＭ、１２２８８ｎＭ）を組み合わせた９６条件を振り分け、３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて７２時間培養した。
［Ｃ．１．１］ＣＨＯ細胞の培養
核内局在を示す赤色蛍光タンパクを発現するＣＨＯ ＭＨＧ＃４ａを９６穴プレートに対して、１×１０４個ずつ播種し、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）（０ｎＭ、９６ｎＭ、１９２ｎＭ、３８４ｎＭ、７６８ｎＭ、１１５２ｎＭ、１５３６ｎＭ、１９２０ｎＭ）および、リバーシン（Ｒｅｖｅｒｓｉｎｅ）（０ｎＭ、１９２ｎＭ、３８４ｎＭ、７６８ｎＭ、１５３６ｎＭ、３０７２ｎＭ、４６０８ｎＭ、６１４４ｎＭ、７６８０ｎＭ、９２１６ｎＭ、１０７５２ｎＭ、１２２８８ｎＭ）を組み合わせた９６条件を振り分け、３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて７２時間培養した。
【0067】
［Ｃ．１．２］蛍光顕微鏡による微小核形成効率の観察
微小核形成誘導後に蛍光顕微鏡を用いて観察し微小核誘形成導率を比較した結果の代表例を示す（図４、図５）。結果として、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）およびリバーシン（Ｒｅｖｅｒｓｉｎｅ）では濃度依存的に微小核形成率の増加が観察された。
微小核形成誘導後に蛍光顕微鏡を用いて観察し微小核誘形成導率を比較した結果の代表例を示す（図４、図５）。結果として、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）およびリバーシン（Ｒｅｖｅｒｓｉｎｅ）では濃度依存的に微小核形成率の増加が観察された。
【0068】
［Ｄ］非ヒト動物細胞への微小核形成誘導剤の効果の検証
コルセミド（Ｃｏｌｃｅｍｉｄ）および、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）およびリバーシン（Ｒｅｖｅｒｓｉｎｅ）の非ヒト動物由来細胞への微小核形成誘導について検証した。詳細には、マウス線維芽細胞株Ａ９細胞、マウス胎仔由来線維芽細胞初代培養細胞株、ニワトリプレＢ細胞ＤＴ４０細胞、ラットＥＳ細胞、ブタ胎仔由来線維芽細胞についてコルセミド（Ｃｏｌｃｅｍｉｄ）および、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）およびリバーシン（Ｒｅｖｅｒｓｉｎｅ）にて処理し、顕微鏡観察にて、微小核形成の有無を評価した。
［Ｄ．１．１］検証用細胞の播種と各種阻害剤での処理
マウス線維芽細胞株Ａ９細胞、マウス胎仔由来線維芽細胞初代培養細胞株、ブタ胎仔由来線維芽細胞、ニワトリプレＢ細胞ＤＴ４０細胞、ラットES細胞を２４穴プレートの各穴に１×１０５個ずつを播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて２４時間培養した。微小核形成誘導試験として、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）（４ｎＭ、２５ｎM、１００ｎM、４００ｎＭ）で処理しつつ、リバーシン（Ｒｅｖｅｒｓｉｎｅ）０ｎM、５００ｎM、１０００ｎM、１５００ｎＭの添加の有無についての二群に分け、計２０条件を設定し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて培養しつつ、２４、４８、７２時間時点で顕微鏡観察を行った。
コルセミド（Ｃｏｌｃｅｍｉｄ）および、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）およびリバーシン（Ｒｅｖｅｒｓｉｎｅ）の非ヒト動物由来細胞への微小核形成誘導について検証した。詳細には、マウス線維芽細胞株Ａ９細胞、マウス胎仔由来線維芽細胞初代培養細胞株、ニワトリプレＢ細胞ＤＴ４０細胞、ラットＥＳ細胞、ブタ胎仔由来線維芽細胞についてコルセミド（Ｃｏｌｃｅｍｉｄ）および、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）およびリバーシン（Ｒｅｖｅｒｓｉｎｅ）にて処理し、顕微鏡観察にて、微小核形成の有無を評価した。
［Ｄ．１．１］検証用細胞の播種と各種阻害剤での処理
マウス線維芽細胞株Ａ９細胞、マウス胎仔由来線維芽細胞初代培養細胞株、ブタ胎仔由来線維芽細胞、ニワトリプレＢ細胞ＤＴ４０細胞、ラットES細胞を２４穴プレートの各穴に１×１０５個ずつを播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて２４時間培養した。微小核形成誘導試験として、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）（４ｎＭ、２５ｎM、１００ｎM、４００ｎＭ）で処理しつつ、リバーシン（Ｒｅｖｅｒｓｉｎｅ）０ｎM、５００ｎM、１０００ｎM、１５００ｎＭの添加の有無についての二群に分け、計２０条件を設定し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて培養しつつ、２４、４８、７２時間時点で顕微鏡観察を行った。
【0069】
［Ｄ．１．２］顕微鏡観察による微小核形成効率の観察
顕微鏡を用いて観察し微小核誘形成導率を比較した。マウス線維芽細胞株Ａ９細胞、マウス胎仔由来線維芽細胞初代培養細胞株、ブタ胎仔由来線維芽細胞、に微小核が形成されているかを観察し、明視野画像を取得した（図６上段パネル）。また、明視野では微小核形成像の観察が困難なDT40細胞、ラットES細胞については、細胞を回収し、０．０７５M KClにて室温、１５分間懸濁し、その後、カルノア溶液を用いて固定を行い、スライドガラス上に塗布し、DAPI染色を行った。これを蛍光顕微鏡を用いて観察した（図６下段パネル）。この結果から、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）（４ｎＭ、２５ｎM、１００ｎM、４００ｎＭ）で処理しつつ、リバーシン（Ｒｅｖｅｒｓｉｎｅ）（０ｎM、５００ｎM、１０００ｎM、１５００ｎＭ）で処理した際に、広範な非ヒト動物細胞に微小核形成誘導能を示した。
＜実施例２＞
顕微鏡を用いて観察し微小核誘形成導率を比較した。マウス線維芽細胞株Ａ９細胞、マウス胎仔由来線維芽細胞初代培養細胞株、ブタ胎仔由来線維芽細胞、に微小核が形成されているかを観察し、明視野画像を取得した（図６上段パネル）。また、明視野では微小核形成像の観察が困難なDT40細胞、ラットES細胞については、細胞を回収し、０．０７５M KClにて室温、１５分間懸濁し、その後、カルノア溶液を用いて固定を行い、スライドガラス上に塗布し、DAPI染色を行った。これを蛍光顕微鏡を用いて観察した（図６下段パネル）。この結果から、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）（４ｎＭ、２５ｎM、１００ｎM、４００ｎＭ）で処理しつつ、リバーシン（Ｒｅｖｅｒｓｉｎｅ）（０ｎM、５００ｎM、１０００ｎM、１５００ｎＭ）で処理した際に、広範な非ヒト動物細胞に微小核形成誘導能を示した。
＜実施例２＞
【0070】
ヒト不死化間葉系幹細胞からヒト細胞株ＨＴ１０８０への人工染色体ベクターの導入
［Ａ］薬剤耐性遺伝子で標識されたＨＡＣベクターのＨＴ１０８０への導入
薬剤耐性遺伝子で標識されたＨＡＣベクターを含有するｈｉＭＳＣから薬剤耐性遺伝子で標識されたＨＡＣベクターをヒト細胞であるＨＴ１０８０へ導入する。この際に上記のヒト細胞に微小核形成誘導が効率可能な薬剤処理条件を使用し、微小核細胞融合法によりＨＴ１０８０へ導入した。
［Ａ］薬剤耐性遺伝子で標識されたＨＡＣベクターのＨＴ１０８０への導入
薬剤耐性遺伝子で標識されたＨＡＣベクターを含有するｈｉＭＳＣから薬剤耐性遺伝子で標識されたＨＡＣベクターをヒト細胞であるＨＴ１０８０へ導入する。この際に上記のヒト細胞に微小核形成誘導が効率可能な薬剤処理条件を使用し、微小核細胞融合法によりＨＴ１０８０へ導入した。
【0071】
［Ａ．１．１］微小核細胞融合及び薬剤耐性クローンの単離
供与（「ドナー」ともいう）細胞であるＨＡＣベクター含有ｈｉＭＳＣを細胞培養フラスコ底面積２５ｃｍ２×１２本を用いて培養し７０％コンフルエントになった時点で、微小核形成誘導処理（パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）１ｎＭ～１μＭおよびリバーシン（Ｒｅｖｅｒｓｉｎｅ）１ｎＭ～１μＭ）を３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて４８時間行った。微小核形成誘導が終了したら、フラスコ内の培地（ｍｅｄｉｕｍ）をアスピレートし、そのフラスコの９分目までをサイトカラシンＢで満たした。フラスコを大型高速遠心機（ＢＥＣＫＭＡＮ）専用の容器に挿入し、温湯（３４℃）をフラスコが隠れない程度に加え、遠心分離（Ｒｏｒｔｏｒ ＩＤ１０．５００、８，０００ｒｐｍ、１ｈ、３４℃）をした。遠心分離終了後、サイトカラシンＢを回収し、各フラスコ内のペレットを、それぞれ２ｍｌの無血清培地ＤＭＥＭにて１５ｍｌチューブに回収した。８μｍ→５μｍ→３μｍフィルターの順にゆっくりとフィルトレーションした後、それぞれのチューブを遠心分離（１，２００ｒｐｍ、５分、室温（Ｒ．Ｔ））し、上清をアスピレートした後、各チューブのペレットをまとめて５ｍｌの無血清培地ＤＭＥＭに回収し、懸濁し、遠心分離（２０００ｒｐｍ、５分）し、微小核細胞を回収した。予め前日に受容（「レシピエント」ともいう）細胞ＨＴ１０８０を６ｃｍ直径細胞培養皿に９０％コンフルエントになるように播種したものを用意し、これを無血清培地（ＤＭＥＭ）にて洗浄した。精製した微小核をＰＨＡ－Ｐ（ＳＩＧＭＡ）を含む無血清培養液２ｍｌに再度懸濁し、無血清培養液（ＤＭＥＭ）を除去したＨＴ１０８０上に静かに播種した。培養皿を３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて２０分間静置した。上清を除去し、ＰＥＧ１０００（Ｗａｋｏ、日本）［５ｇのＰＥＧ１０００を無血清ＤＭＥＭ培地に完全に溶解し、ジメチルスルホキシドを１ｍｌ添加して濾過滅菌する。］溶液を１ｍｌで正確に９０秒間融合した。無血清培養液（ＤＭＥＭ）を５ｍｌで３回洗浄し、通常のＨＴ１０８０の培養液５ｍｌで３７℃、一晩インキュベートした。２４時間後１０ｃｍ直径培養皿６枚に再播種した。更に２４時間後、ブラストサイジンＳを８μｇ／ｍｌになるように加え、３～４週間選択培養した。１回の微小核細胞融合で合計３個のＧＦＰ蛍光陽性かつ薬剤耐性コロニーが出現した。これらを単離し増殖させ、以降の解析を行った。
供与（「ドナー」ともいう）細胞であるＨＡＣベクター含有ｈｉＭＳＣを細胞培養フラスコ底面積２５ｃｍ２×１２本を用いて培養し７０％コンフルエントになった時点で、微小核形成誘導処理（パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）１ｎＭ～１μＭおよびリバーシン（Ｒｅｖｅｒｓｉｎｅ）１ｎＭ～１μＭ）を３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて４８時間行った。微小核形成誘導が終了したら、フラスコ内の培地（ｍｅｄｉｕｍ）をアスピレートし、そのフラスコの９分目までをサイトカラシンＢで満たした。フラスコを大型高速遠心機（ＢＥＣＫＭＡＮ）専用の容器に挿入し、温湯（３４℃）をフラスコが隠れない程度に加え、遠心分離（Ｒｏｒｔｏｒ ＩＤ１０．５００、８，０００ｒｐｍ、１ｈ、３４℃）をした。遠心分離終了後、サイトカラシンＢを回収し、各フラスコ内のペレットを、それぞれ２ｍｌの無血清培地ＤＭＥＭにて１５ｍｌチューブに回収した。８μｍ→５μｍ→３μｍフィルターの順にゆっくりとフィルトレーションした後、それぞれのチューブを遠心分離（１，２００ｒｐｍ、５分、室温（Ｒ．Ｔ））し、上清をアスピレートした後、各チューブのペレットをまとめて５ｍｌの無血清培地ＤＭＥＭに回収し、懸濁し、遠心分離（２０００ｒｐｍ、５分）し、微小核細胞を回収した。予め前日に受容（「レシピエント」ともいう）細胞ＨＴ１０８０を６ｃｍ直径細胞培養皿に９０％コンフルエントになるように播種したものを用意し、これを無血清培地（ＤＭＥＭ）にて洗浄した。精製した微小核をＰＨＡ－Ｐ（ＳＩＧＭＡ）を含む無血清培養液２ｍｌに再度懸濁し、無血清培養液（ＤＭＥＭ）を除去したＨＴ１０８０上に静かに播種した。培養皿を３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて２０分間静置した。上清を除去し、ＰＥＧ１０００（Ｗａｋｏ、日本）［５ｇのＰＥＧ１０００を無血清ＤＭＥＭ培地に完全に溶解し、ジメチルスルホキシドを１ｍｌ添加して濾過滅菌する。］溶液を１ｍｌで正確に９０秒間融合した。無血清培養液（ＤＭＥＭ）を５ｍｌで３回洗浄し、通常のＨＴ１０８０の培養液５ｍｌで３７℃、一晩インキュベートした。２４時間後１０ｃｍ直径培養皿６枚に再播種した。更に２４時間後、ブラストサイジンＳを８μｇ／ｍｌになるように加え、３～４週間選択培養した。１回の微小核細胞融合で合計３個のＧＦＰ蛍光陽性かつ薬剤耐性コロニーが出現した。これらを単離し増殖させ、以降の解析を行った。
【0072】
［Ａ．１．２］ＦＩＳＨ解析による薬剤耐性クローンにおけるＨＡＣベクター導入の検証 上記で得られたクローンについてＳｈｉｎｏｈａｒａらの報告（Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０：１１６３－１１７５，２００１）に記された方法でアルフォイド配列を赤色プローブ（矢印）に、ｐＣＸ－ＥＧＦＰベクターを緑色プローブ（矢頭）としたＦＩＳＨ解析を行ったところ解析した３クローンにおいて、ＨＡＣベクターの存在が示された（図７）。
＜実施例３＞
＜実施例３＞
【0073】
ヒトｉＰＳ細胞からヒト細胞株ＨＴ１０８０への人工染色体ベクターの導入
［Ａ］薬剤耐性遺伝子で標識されたＭＡＣベクターのＨＴ１０８０への導入
薬剤耐性遺伝子で標識されたＭＡＣベクターを含有するヒトｉＰＳ細胞から薬剤耐性遺伝子で標識されたＭＡＣベクターをヒト細胞であるＨＴ１０８０へ導入する。この際に上記のヒト細胞に微小核形成誘導が効率可能な薬剤処理条件を使用し、微小核細胞融合法によりＨＴ１０８０へ導入する。
［Ａ］薬剤耐性遺伝子で標識されたＭＡＣベクターのＨＴ１０８０への導入
薬剤耐性遺伝子で標識されたＭＡＣベクターを含有するヒトｉＰＳ細胞から薬剤耐性遺伝子で標識されたＭＡＣベクターをヒト細胞であるＨＴ１０８０へ導入する。この際に上記のヒト細胞に微小核形成誘導が効率可能な薬剤処理条件を使用し、微小核細胞融合法によりＨＴ１０８０へ導入する。
【0074】
［Ａ．１．１］微小核細胞融合及び薬剤耐性クローンの単離
ドナー細胞であるヒトｉＰＳ細胞を予め０．５μｇ／ｃｍ２のＬａｍｉｎｉｎ－５１１でコートした細胞培養フラスコ×１２に播種し、１０μＭ Ｙ－２７６３２を添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて２４時間培養した。その後、通常培養のｉＰＳ培養培地に交換し増殖させ、９０％コンフルエントに到達した際にＭＡＳ０．２μｇ／ｍＬを加え、３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて４８時間培養し、微小核を形成させた。培養液を除去し、予め３７℃で保温したサイトカラシンＢ（１０μｇ／ｍｌ、シグマ）溶液を遠心用フラスコに満たし、３４℃、８０００ｒｐｍ、１時間の遠心を行った。ミクロセルを無血清ＤＭＥＭ培地に懸濁し、８μｍ、５μｍ、３μｍフィルターにて精製した。精製後、２０００ｒｐｍ、１０分間遠心し、無血清ＤＭＥＭ培地５ｍｌに懸濁した。ミクロセルを５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ培地に懸濁し、８μｍ、５μｍ、３μｍフィルターにて精製した。精製後、２０００ｒｐｍ、１０分間遠心した。予め前日にレシピエント細胞ＨＴ１０８０を６ｃｍ直径細胞培養皿に９０％コンフルエントになるように播種したものを用意し、これを無血清培地（ＤＭＥＭ）にて洗浄した。精製した微小核をＰＨＡ－Ｐ（ＳＩＧＭＡ）を含む無血清培養液２ｍｌに再度懸濁し、無血清培養液（ＤＭＥＭ）を除去したＨＴ１０８０上に静かに播種した。培養皿を３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて２０分間静置した。上清を除去し、ＰＥＧ１０００（Ｗａｋｏ）［５ｇのＰＥＧ１０００を無血清ＤＭＥＭ培地に完全に溶解し、ジメチルスルホキシドを１ｍＬ添加して濾過滅菌する。］溶液を１ｍｌで正確に９０秒間融合した。無血清培養液（ＤＭＥＭ）を５ｍｌで３回洗浄し、通常のＨＴ１０８０の培養液５ｍｌで３７℃、一晩インキュベートした。２４時間後１０ｃｍ直径培養皿６枚に再播種した。更に２４時間後、Ｇ４１８を８００μｇ／ｍｌになるように加え、３～４週間選択培養した。１回の微小核細胞融合で合計４個のＧＦＰ蛍光陽性かつ薬剤耐性コロニー（図８）が出現した。これらを単離し増殖させ、以降の解析を行った。
ドナー細胞であるヒトｉＰＳ細胞を予め０．５μｇ／ｃｍ２のＬａｍｉｎｉｎ－５１１でコートした細胞培養フラスコ×１２に播種し、１０μＭ Ｙ－２７６３２を添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて２４時間培養した。その後、通常培養のｉＰＳ培養培地に交換し増殖させ、９０％コンフルエントに到達した際にＭＡＳ０．２μｇ／ｍＬを加え、３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて４８時間培養し、微小核を形成させた。培養液を除去し、予め３７℃で保温したサイトカラシンＢ（１０μｇ／ｍｌ、シグマ）溶液を遠心用フラスコに満たし、３４℃、８０００ｒｐｍ、１時間の遠心を行った。ミクロセルを無血清ＤＭＥＭ培地に懸濁し、８μｍ、５μｍ、３μｍフィルターにて精製した。精製後、２０００ｒｐｍ、１０分間遠心し、無血清ＤＭＥＭ培地５ｍｌに懸濁した。ミクロセルを５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ培地に懸濁し、８μｍ、５μｍ、３μｍフィルターにて精製した。精製後、２０００ｒｐｍ、１０分間遠心した。予め前日にレシピエント細胞ＨＴ１０８０を６ｃｍ直径細胞培養皿に９０％コンフルエントになるように播種したものを用意し、これを無血清培地（ＤＭＥＭ）にて洗浄した。精製した微小核をＰＨＡ－Ｐ（ＳＩＧＭＡ）を含む無血清培養液２ｍｌに再度懸濁し、無血清培養液（ＤＭＥＭ）を除去したＨＴ１０８０上に静かに播種した。培養皿を３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて２０分間静置した。上清を除去し、ＰＥＧ１０００（Ｗａｋｏ）［５ｇのＰＥＧ１０００を無血清ＤＭＥＭ培地に完全に溶解し、ジメチルスルホキシドを１ｍＬ添加して濾過滅菌する。］溶液を１ｍｌで正確に９０秒間融合した。無血清培養液（ＤＭＥＭ）を５ｍｌで３回洗浄し、通常のＨＴ１０８０の培養液５ｍｌで３７℃、一晩インキュベートした。２４時間後１０ｃｍ直径培養皿６枚に再播種した。更に２４時間後、Ｇ４１８を８００μｇ／ｍｌになるように加え、３～４週間選択培養した。１回の微小核細胞融合で合計４個のＧＦＰ蛍光陽性かつ薬剤耐性コロニー（図８）が出現した。これらを単離し増殖させ、以降の解析を行った。
【0075】
［Ａ．１．２］ＦＩＳＨ解析による薬剤耐性クローンにおけるＭＡＣベクター導入の検証 上記で得られたクローンについてＳｈｉｎｏｈａｒａらの報告（Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０：１１６３－１１７５，２００１）に記された方法でｍｏｕｓｅ ｃｏｔ－１配列を赤色プローブ（矢印）に、ｐＣＸ－ＥＧＦＰベクターを緑色プローブ（矢頭）としたＦＩＳＨ解析を行ったところ、解析した４クローンにおいて、ＭＡＣベクターの存在が示された（図９）。
＜実施例４＞
＜実施例４＞
【0076】
ヒトｉＰＳ細胞（男性）からヒトｉＰＳ細胞（女性）へのＸ染色体の導入
［Ａ］実施例３に記載の方法を応用して、ヒトｉＰＳ細胞からヒトｉＰＳ細胞に微小核細胞融合法を用いて内在のヒト染色体を導入する。
［Ａ］実施例３に記載の方法を応用して、ヒトｉＰＳ細胞からヒトｉＰＳ細胞に微小核細胞融合法を用いて内在のヒト染色体を導入する。
【0077】
［Ａ．１．１］微小核細胞融合及び薬剤耐性クローンの単離
ドナー細胞であるＨＦＬ－Ｉ由来（ＲＣＢ０５２１、ＲＩＫＥＮ ＢＲＣ）から山中因子を用いて誘導した男性由来ヒトｉＰＳ細胞（核型：４６，ＸＹ）を予め０．５μｇ／ｃｍ２のＬａｍｉｎｉｎ－５１１でコートした細胞培養フラスコ×１２に播種し、１０μＭＹ－２７６３２を添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて２４時間培養する（非ベクター導入群）。または、上記ｉＰＳ細胞のＣＤ４６を欠損させ、抗ＣＤ９－ＳｃＦｖ融合ＭＶ－Ｈ発現プラスミドベクター１２μｇ及びＭＶ－Ｆ発現プラスミド１２μｇをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いて仕様書に従い導入する（ベクター導入群）。その後、非ベクター導入群、ベクター導入群ともに、通常培養のｉＰＳ培養培地に交換し増殖させ、９０％コンフルエントに到達した際にＭＡＳ０．２μｇ／ｍＬを加え、３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて４８時間培養し、微小核を形成させる。培養液を除去し、予め３７℃で保温したサイトカラシンＢ（１０μｇ／ｍｌ、シグマ）溶液を遠心用フラスコに満たし、３４℃、８，０００ｒｐｍ、１時間の遠心を行う。ミクロセルを無血清ＤＭＥＭ培地に懸濁し、８μｍ、５μｍ、３μｍフィルターにて精製する。精製後、２０００ｒｐｍ、１０分間遠心し、無血清ＤＭＥＭ培地５ｍｌに懸濁する。ミクロセルを５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ培地に懸濁し、８μｍ、５μｍ、３μｍフィルターにて精製する。精製後、２０００ｒｐｍ、１０分間遠心した。予め前日にレシピエント細胞である２０１Ｂ７（ＨＰＳ００６３、ＲＩＫＥＮ ＢＲＣ）由来のＨＰＲＴ遺伝子を欠損させたヒトｉＰＳ細胞（核型：４６，ＸＸ）またはレッシュ・ナイハン症候群患者由来のヒトｉＰＳ細胞（ＪＣＲＢ００７２／ＫＵＲＢ１９９５／ＫＵＲＢ１９９６、ＪＣＲＢまたはＡＴＣＣＴＭ ＣＲＬ－１１１０ＴＭ、ＡＴＣＣなどの患者由来線維芽細胞から誘導したヒトｉＰＳ細胞株）を６ｃｍ直径細胞培養皿に９０％コンフルエントになるように播種したものを用意し、これを無血清培地（ＤＭＥＭ）にて洗浄する。ドナー細胞にベクターを導入しなかった微小核細胞の群は精製した微小核をＰＨＡ－Ｐ（ＳＩＧＭＡ）を含む無血清培養液２ｍｌに再度懸濁し、無血清培養液（ＤＭＥＭ）を除去したヒトｉＰＳ細胞上に静かに播種する。培養皿を３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて２０分間静置する。上清を除去し、ＰＥＧ１０００（Ｗａｋｏ、日本）［５ｇのＰＥＧ１０００を無血清ＤＭＥＭ培地に完全に溶解し、ジメチルスルホキシドを１ｍＬ添加して濾過滅菌する。］溶液を１ｍｌで正確に９０秒間融合する。無血清培養液（ＤＭＥＭ）を５ｍｌで３回洗浄し、通常のヒトｉＰＳ細胞の培養液５ｍｌで３７℃、一晩インキュベートする。ベクターを導入した微小核細胞の群にはヒトｉＰＳ細胞培養用培地で懸濁して、レシピエント細胞を培養しているディッシュに添加し、インキュベートする。ベクター導入群、非導入群ともに、２４時間後１０ｃｍ直径培養皿６枚に再播種する。更に２４時間後、１ｘＨＡＴになるように加え、３～４週間選択培養する。薬剤耐性コロニーを単離し増殖させ、以降の解析を行う。
ドナー細胞であるＨＦＬ－Ｉ由来（ＲＣＢ０５２１、ＲＩＫＥＮ ＢＲＣ）から山中因子を用いて誘導した男性由来ヒトｉＰＳ細胞（核型：４６，ＸＹ）を予め０．５μｇ／ｃｍ２のＬａｍｉｎｉｎ－５１１でコートした細胞培養フラスコ×１２に播種し、１０μＭＹ－２７６３２を添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて２４時間培養する（非ベクター導入群）。または、上記ｉＰＳ細胞のＣＤ４６を欠損させ、抗ＣＤ９－ＳｃＦｖ融合ＭＶ－Ｈ発現プラスミドベクター１２μｇ及びＭＶ－Ｆ発現プラスミド１２μｇをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いて仕様書に従い導入する（ベクター導入群）。その後、非ベクター導入群、ベクター導入群ともに、通常培養のｉＰＳ培養培地に交換し増殖させ、９０％コンフルエントに到達した際にＭＡＳ０．２μｇ／ｍＬを加え、３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて４８時間培養し、微小核を形成させる。培養液を除去し、予め３７℃で保温したサイトカラシンＢ（１０μｇ／ｍｌ、シグマ）溶液を遠心用フラスコに満たし、３４℃、８，０００ｒｐｍ、１時間の遠心を行う。ミクロセルを無血清ＤＭＥＭ培地に懸濁し、８μｍ、５μｍ、３μｍフィルターにて精製する。精製後、２０００ｒｐｍ、１０分間遠心し、無血清ＤＭＥＭ培地５ｍｌに懸濁する。ミクロセルを５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ培地に懸濁し、８μｍ、５μｍ、３μｍフィルターにて精製する。精製後、２０００ｒｐｍ、１０分間遠心した。予め前日にレシピエント細胞である２０１Ｂ７（ＨＰＳ００６３、ＲＩＫＥＮ ＢＲＣ）由来のＨＰＲＴ遺伝子を欠損させたヒトｉＰＳ細胞（核型：４６，ＸＸ）またはレッシュ・ナイハン症候群患者由来のヒトｉＰＳ細胞（ＪＣＲＢ００７２／ＫＵＲＢ１９９５／ＫＵＲＢ１９９６、ＪＣＲＢまたはＡＴＣＣＴＭ ＣＲＬ－１１１０ＴＭ、ＡＴＣＣなどの患者由来線維芽細胞から誘導したヒトｉＰＳ細胞株）を６ｃｍ直径細胞培養皿に９０％コンフルエントになるように播種したものを用意し、これを無血清培地（ＤＭＥＭ）にて洗浄する。ドナー細胞にベクターを導入しなかった微小核細胞の群は精製した微小核をＰＨＡ－Ｐ（ＳＩＧＭＡ）を含む無血清培養液２ｍｌに再度懸濁し、無血清培養液（ＤＭＥＭ）を除去したヒトｉＰＳ細胞上に静かに播種する。培養皿を３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて２０分間静置する。上清を除去し、ＰＥＧ１０００（Ｗａｋｏ、日本）［５ｇのＰＥＧ１０００を無血清ＤＭＥＭ培地に完全に溶解し、ジメチルスルホキシドを１ｍＬ添加して濾過滅菌する。］溶液を１ｍｌで正確に９０秒間融合する。無血清培養液（ＤＭＥＭ）を５ｍｌで３回洗浄し、通常のヒトｉＰＳ細胞の培養液５ｍｌで３７℃、一晩インキュベートする。ベクターを導入した微小核細胞の群にはヒトｉＰＳ細胞培養用培地で懸濁して、レシピエント細胞を培養しているディッシュに添加し、インキュベートする。ベクター導入群、非導入群ともに、２４時間後１０ｃｍ直径培養皿６枚に再播種する。更に２４時間後、１ｘＨＡＴになるように加え、３～４週間選択培養する。薬剤耐性コロニーを単離し増殖させ、以降の解析を行う。
【0078】
［Ａ．１．２］キナクリン・ヘキスト二重染色よる核型解析
上記ＨＡＴ耐性であったクローンについて、キナクリン・ヘキスト二重染色を行う。キナクリン・ヘキスト二重染色したクローンの染色体像を蛍光顕微鏡により観察することで核型：４６，ＸＸの細胞にさらにＸ染色体が導入されていることを確認することができる。
＜実施例５＞
上記ＨＡＴ耐性であったクローンについて、キナクリン・ヘキスト二重染色を行う。キナクリン・ヘキスト二重染色したクローンの染色体像を蛍光顕微鏡により観察することで核型：４６，ＸＸの細胞にさらにＸ染色体が導入されていることを確認することができる。
＜実施例５＞
【0079】
ＣＨＯ細胞へのパクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）およびリバーシン（Ｒｅｖｅｒｓｉｎｅ）処理による微小核形成誘導を介した微小核細胞融合法などによる染色体導入法の効率の改善
［Ａ］薬剤耐性遺伝子で標識されたＨＡＣベクターのＨＴ１０８０への導入
薬剤耐性遺伝子で標識されたＨＡＣベクターを含有するＣＨＯ ＭＨＧ＃４ａから薬剤耐性遺伝子で標識されたＨＡＣベクターをヒト細胞であるＨＴ１０８０へ導入する。この際に上記のヒト細胞に微小核形成誘導が効率可能な薬剤処理条件を使用し、微小核細胞融合法によりＨＴ１０８０へ導入し、出現する薬剤耐性コロニー数を比較する。
［Ａ］薬剤耐性遺伝子で標識されたＨＡＣベクターのＨＴ１０８０への導入
薬剤耐性遺伝子で標識されたＨＡＣベクターを含有するＣＨＯ ＭＨＧ＃４ａから薬剤耐性遺伝子で標識されたＨＡＣベクターをヒト細胞であるＨＴ１０８０へ導入する。この際に上記のヒト細胞に微小核形成誘導が効率可能な薬剤処理条件を使用し、微小核細胞融合法によりＨＴ１０８０へ導入し、出現する薬剤耐性コロニー数を比較する。
【0080】
［Ａ．１．１］微小核細胞融合及び薬剤耐性クローンの単離
ドナー細胞であるＨＡＣベクター含有ＣＨＯ細胞を１０ｃｍ直径培養皿１枚に播種し、９０％コンフルエントにまで培養した。これにＭＶ－Ｈ発現プラスミドベクターおよびＭＶ－Ｆ発現プラスミド１２μｇをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いて仕様書に従い導入した。２４時間後に２５ｃｍ２フラスコ３個にパッセージした翌日から、微小核形成誘導薬剤処理としてコルセミド処理（Ｆ１２／２０％ＦＢＳ／０．１μｇ／ｍＬコルセミド）を４８時間行い、再度培地交換を行い、コルセミド処理（Ｆ１２／２０％ＦＢＳ／０．１μｇ／ｍＬコルセミド）を２４時間行い、微小核を形成させた。もしくはパクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）およびリバーシン（Ｒｉｖｅｒｓｉｎ）処理（Ｆ１２／２０％ＦＢＳ／３８４ｎＭパクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）／１５３６ｎＭパクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ））を４８時間行い、微小核を形成させた。微小核形成誘導薬剤処理後、フラスコ内の培地を取り除き、フラスコの９分目までをサイトカラシンＢで満たした。フラスコを遠沈管にセットし、温湯（３４℃）をフラスコが隠れない程度に加え、ＪＬＡ－１０，５００Ｒｏｔｏｒ（ＢＥＣＫＭＡＮ）で８，０００ｒｐｍ、１時間、３４℃で遠心分離した。遠心分離終了後、サイトカラシンＢを回収除去し、各フラスコ内のペレットを２ｍＬ無血清ＤＭＥＭ培地にて５０ｍＬチューブに回収した。孔径８μｍ、５μｍ、３μｍフィルターの順にフィルトレーションした後、２，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ、室温（ＲＴ）で遠心分離した。遠心分離後、上清を除去し各チューブのペレットをレシピエント細胞培養用培地で懸濁して、レシピエント細胞を培養しているディッシュに添加し、インキュベートした。レシピエント細胞はＨＴ１０８０細胞を、９０％コンフルエントに培養したものを使用した。２４時間後、１０ｃｍ直径培養皿５枚に再播種した。更に２４時間後に、３μｇ／ｍＬブラストサイジンＳにより選択培養を行った。３～４週間選択培養した。出現したコロニー数をカウントし、グラフとして記載した（図１０）。結果として、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）およびリバーシン（Ｒｅｖｅｒｓｉｎｅ）にて処理した群は、コルセミド（Ｃｏｌｃｅｍｉｄ）処理群に対して、１８．３倍のＨＡＣベクター導入効率を示した（図１０）
＜実施例６＞
ドナー細胞であるＨＡＣベクター含有ＣＨＯ細胞を１０ｃｍ直径培養皿１枚に播種し、９０％コンフルエントにまで培養した。これにＭＶ－Ｈ発現プラスミドベクターおよびＭＶ－Ｆ発現プラスミド１２μｇをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いて仕様書に従い導入した。２４時間後に２５ｃｍ２フラスコ３個にパッセージした翌日から、微小核形成誘導薬剤処理としてコルセミド処理（Ｆ１２／２０％ＦＢＳ／０．１μｇ／ｍＬコルセミド）を４８時間行い、再度培地交換を行い、コルセミド処理（Ｆ１２／２０％ＦＢＳ／０．１μｇ／ｍＬコルセミド）を２４時間行い、微小核を形成させた。もしくはパクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）およびリバーシン（Ｒｉｖｅｒｓｉｎ）処理（Ｆ１２／２０％ＦＢＳ／３８４ｎＭパクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）／１５３６ｎＭパクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ））を４８時間行い、微小核を形成させた。微小核形成誘導薬剤処理後、フラスコ内の培地を取り除き、フラスコの９分目までをサイトカラシンＢで満たした。フラスコを遠沈管にセットし、温湯（３４℃）をフラスコが隠れない程度に加え、ＪＬＡ－１０，５００Ｒｏｔｏｒ（ＢＥＣＫＭＡＮ）で８，０００ｒｐｍ、１時間、３４℃で遠心分離した。遠心分離終了後、サイトカラシンＢを回収除去し、各フラスコ内のペレットを２ｍＬ無血清ＤＭＥＭ培地にて５０ｍＬチューブに回収した。孔径８μｍ、５μｍ、３μｍフィルターの順にフィルトレーションした後、２，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ、室温（ＲＴ）で遠心分離した。遠心分離後、上清を除去し各チューブのペレットをレシピエント細胞培養用培地で懸濁して、レシピエント細胞を培養しているディッシュに添加し、インキュベートした。レシピエント細胞はＨＴ１０８０細胞を、９０％コンフルエントに培養したものを使用した。２４時間後、１０ｃｍ直径培養皿５枚に再播種した。更に２４時間後に、３μｇ／ｍＬブラストサイジンＳにより選択培養を行った。３～４週間選択培養した。出現したコロニー数をカウントし、グラフとして記載した（図１０）。結果として、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）およびリバーシン（Ｒｅｖｅｒｓｉｎｅ）にて処理した群は、コルセミド（Ｃｏｌｃｅｍｉｄ）処理群に対して、１８．３倍のＨＡＣベクター導入効率を示した（図１０）
＜実施例６＞
【0081】
ヒト不死化間葉系幹細胞からヒト細胞株ＨＴ１０８０へのヒトＸ染色体の導入
［Ａ］実施例２に記載された方法を用いて、ヒト不死化間葉系幹細胞からヒトＨＴ１０８０へ内在のＸ染色体を導入した。この際に上記のヒト細胞に微小核形成誘導が効率可能な薬剤処理条件を使用し、微小核細胞融合法によりＨＴ１０８０へ導入した。
［Ａ］実施例２に記載された方法を用いて、ヒト不死化間葉系幹細胞からヒトＨＴ１０８０へ内在のＸ染色体を導入した。この際に上記のヒト細胞に微小核形成誘導が効率可能な薬剤処理条件を使用し、微小核細胞融合法によりＨＴ１０８０へ導入した。
【0082】
［Ａ．１．１］微小核細胞融合及び薬剤耐性クローンの単離
供与細胞であるｈｉＭＳＣを、Ｐｏｌｙ－Ｌ－Ｌｙｓｉｎｅ（５０μｇ／ｍＬ）にて１時間コーティングした細胞培養フラスコ底面積２５ｃｍ２×１２本を用いて培養し、７０％コンフルエントになった時点で、微小核形成誘導処理（パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）１ｎＭ～１μＭおよびリバーシン（Ｒｅｖｅｒｓｉｎｅ）１ｎＭ～１μＭ）を３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて４８時間行った。微小核形成誘導が終了したら、フラスコ内の培地をアスピレートし、そのフラスコの９分目までをサイトカラシンＢで満たした。フラスコを大型高速遠心機（ＢＥＣＫＭＡＮ）専用の容器に挿入し、温湯（３４℃）をフラスコが隠れない程度に加え、遠心分離（Ｒｏｒｔｏｒ ＩＤ１０．５００、８，０００ｒｐｍ、１ｈ、３４℃）をした。遠心分離終了後、サイトカラシンＢを回収し、各フラスコ内のペレットを、それぞれ２ｍｌの無血清培地ＤＭＥＭにて１５ｍｌチューブに回収した。８μｍ→５μｍ→３μｍフィルターの順にゆっくりとフィルトレーションした後、それぞれのチューブを遠心分離（１，２００ｒｐｍ、５分、室温（Ｒ．Ｔ））し、上清をアスピレートした後、各チューブのペレットをまとめて５ｍｌの無血清培地ＤＭＥＭに回収し、懸濁し、遠心分離（２０００ｒｐｍ、５分）し、微小核細胞を回収した。予め前日に受容細胞ＨＴ１０８０ ＨＰＲＴ欠損株を６ｃｍ直径細胞培養皿に９０％コンフルエントになるように播種したものを用意し、これを無血清培地（ＤＭＥＭ）にて洗浄した。精製した微小核をＰＨＡ－Ｐ（ＳＩＧＭＡ）を含む無血清培養液２ｍｌに再度懸濁し、無血清培養液（ＤＭＥＭ）を除去したＨＴ１０８０上に静かに播種した。培養皿を３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて２０分間静置した。上清を除去し、ＰＥＧ１０００（Ｗａｋｏ、日本）［５ｇのＰＥＧ１０００を無血清ＤＭＥＭ培地に完全に溶解し、ジメチルスルホキシドを１ｍｌ添加して濾過滅菌する。］溶液を１ｍｌで正確に９０秒間融合した。無血清培養液（ＤＭＥＭ）を５ｍｌで３回洗浄し、通常のＨＴ１０８０の培養液５ｍｌで３７℃、一晩インキュベートした。２４時間後１０ｃｍ直径培養皿６枚に再播種した。更に２４時間後、５０×ＨＡＴサプリメント（Ｓｉｇｍａ）を１×ＨＡＴ濃度になるように加え、３～４週間選択培養した。１回の微小核細胞融合で合計３個のＧＦＰ蛍光陽性かつ薬剤耐性コロニーが出現した。これらを単離し増殖させ、以降の解析を行った。
供与細胞であるｈｉＭＳＣを、Ｐｏｌｙ－Ｌ－Ｌｙｓｉｎｅ（５０μｇ／ｍＬ）にて１時間コーティングした細胞培養フラスコ底面積２５ｃｍ２×１２本を用いて培養し、７０％コンフルエントになった時点で、微小核形成誘導処理（パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）１ｎＭ～１μＭおよびリバーシン（Ｒｅｖｅｒｓｉｎｅ）１ｎＭ～１μＭ）を３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて４８時間行った。微小核形成誘導が終了したら、フラスコ内の培地をアスピレートし、そのフラスコの９分目までをサイトカラシンＢで満たした。フラスコを大型高速遠心機（ＢＥＣＫＭＡＮ）専用の容器に挿入し、温湯（３４℃）をフラスコが隠れない程度に加え、遠心分離（Ｒｏｒｔｏｒ ＩＤ１０．５００、８，０００ｒｐｍ、１ｈ、３４℃）をした。遠心分離終了後、サイトカラシンＢを回収し、各フラスコ内のペレットを、それぞれ２ｍｌの無血清培地ＤＭＥＭにて１５ｍｌチューブに回収した。８μｍ→５μｍ→３μｍフィルターの順にゆっくりとフィルトレーションした後、それぞれのチューブを遠心分離（１，２００ｒｐｍ、５分、室温（Ｒ．Ｔ））し、上清をアスピレートした後、各チューブのペレットをまとめて５ｍｌの無血清培地ＤＭＥＭに回収し、懸濁し、遠心分離（２０００ｒｐｍ、５分）し、微小核細胞を回収した。予め前日に受容細胞ＨＴ１０８０ ＨＰＲＴ欠損株を６ｃｍ直径細胞培養皿に９０％コンフルエントになるように播種したものを用意し、これを無血清培地（ＤＭＥＭ）にて洗浄した。精製した微小核をＰＨＡ－Ｐ（ＳＩＧＭＡ）を含む無血清培養液２ｍｌに再度懸濁し、無血清培養液（ＤＭＥＭ）を除去したＨＴ１０８０上に静かに播種した。培養皿を３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて２０分間静置した。上清を除去し、ＰＥＧ１０００（Ｗａｋｏ、日本）［５ｇのＰＥＧ１０００を無血清ＤＭＥＭ培地に完全に溶解し、ジメチルスルホキシドを１ｍｌ添加して濾過滅菌する。］溶液を１ｍｌで正確に９０秒間融合した。無血清培養液（ＤＭＥＭ）を５ｍｌで３回洗浄し、通常のＨＴ１０８０の培養液５ｍｌで３７℃、一晩インキュベートした。２４時間後１０ｃｍ直径培養皿６枚に再播種した。更に２４時間後、５０×ＨＡＴサプリメント（Ｓｉｇｍａ）を１×ＨＡＴ濃度になるように加え、３～４週間選択培養した。１回の微小核細胞融合で合計３個のＧＦＰ蛍光陽性かつ薬剤耐性コロニーが出現した。これらを単離し増殖させ、以降の解析を行った。
【0083】
［Ａ．１．２］ＦＩＳＨ解析による薬剤耐性クローンにおけるＸ染色体導入の検証
上記で得られた薬剤耐性クローンについてＳｈｉｎｏｈａｒａらの報告（Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０：１１６３－１１７５，２００１）に記された方法で、Ｘ染色体を検出するプローブとして、下記のプライマーを用いてＸ染色体特異的ａｌｐｈａ－ｓａｔｅｌｌｉｔｅを増幅し、赤色プローブを作製し、使用した。
ＤＸＺ１ ＣｈｒＸ ａｌｐｈａ－ｓａｔｅｌｌｉｔｅ Ｆ：５'－ＡＴＡＡＴＴＴＣＣＣＡＴＡＡＣＴＡＡＡＣＡＣＡ－３'（配列番号１）
ＤＸＺ１ ＣｈｒＸ ａｌｐｈａ－ｓａｔｅｌｌｉｔｅ Ｒ：５'－ＴＧＴＧＡＡＧＡＴＡＡＡＧＧＡＡＡＡＧＧＣＴＴ－３'（配列番号２）
対照実験として、Ｘ染色体を導入していない、ＨＴ１０８０ ＨＰＲＴ欠損株および、獲得した薬剤耐性クローンに行った。ＨＴ１０８０ ＨＰＲＴ欠損株は男性由来細胞であるため、Ｘ染色体が１本のみが含有されていると示された（図１１、左パネル）。一方で、獲得した薬剤耐性クローンでは、２本のＸ染色体が含有されていること示された（図１１、右パネル）。
上記で得られた薬剤耐性クローンについてＳｈｉｎｏｈａｒａらの報告（Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１０：１１６３－１１７５，２００１）に記された方法で、Ｘ染色体を検出するプローブとして、下記のプライマーを用いてＸ染色体特異的ａｌｐｈａ－ｓａｔｅｌｌｉｔｅを増幅し、赤色プローブを作製し、使用した。
ＤＸＺ１ ＣｈｒＸ ａｌｐｈａ－ｓａｔｅｌｌｉｔｅ Ｆ：５'－ＡＴＡＡＴＴＴＣＣＣＡＴＡＡＣＴＡＡＡＣＡＣＡ－３'（配列番号１）
ＤＸＺ１ ＣｈｒＸ ａｌｐｈａ－ｓａｔｅｌｌｉｔｅ Ｒ：５'－ＴＧＴＧＡＡＧＡＴＡＡＡＧＧＡＡＡＡＧＧＣＴＴ－３'（配列番号２）
対照実験として、Ｘ染色体を導入していない、ＨＴ１０８０ ＨＰＲＴ欠損株および、獲得した薬剤耐性クローンに行った。ＨＴ１０８０ ＨＰＲＴ欠損株は男性由来細胞であるため、Ｘ染色体が１本のみが含有されていると示された（図１１、左パネル）。一方で、獲得した薬剤耐性クローンでは、２本のＸ染色体が含有されていること示された（図１１、右パネル）。
【0084】
＜実施例７＞
ヒトｉＰＳ細胞（女性）からヒト細胞株ＨＴ１０８０HPRT欠損株へのヒトＸ染色体の導入
ヒトｉＰＳ細胞（女性）からヒト細胞株ＨＴ１０８０HPRT欠損株へのヒトＸ染色体の導入
【0085】
［Ａ］実施例３に記載の方法を応用して、ヒトｉＰＳ細胞からヒト細胞株ＨＴ１０８０ ＨＰＲＴ欠損株に微小核細胞融合法を用いて内在のヒト染色体を導入した。
【0086】
［Ａ．１．１］微小核細胞融合及び薬剤耐性クローンの単離
ドナー細胞である女性由来ヒトｉＰＳ細胞株２０１Ｂ７（ＲＣＢ、ＨＰＳ００６３）（核型：４６，ＸＸ）を予め０．５μｇ／ｃｍ２のＬａｍｉｎｉｎ－５１１でコートした細胞培養フラスコ×１２に播種し、１０μＭ Ｙ－２７６３２を添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて２４時間培養したその後、通常培養のｉＰＳ培養培地に交換し増殖させ、９０％コンフルエントに到達した際にＰａｃｌｉｔａｘｅｌ２０ｎＭ、Ｒｅｖｅｒｓｉｎｅ５００ｎＭ、３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて４８時間培養し、微小核を形成させた。培養液を除去し、予め３７℃で保温したサイトカラシンＢ（１０μｇ／ｍｌ、シグマ）溶液を遠心用フラスコに満たし、３４℃、８，０００ｒｐｍ、１時間の遠心を行った。ミクロセルを無血清ＤＭＥＭ培地に懸濁し、８μｍ、５μｍ、３μｍフィルターにて精製する。精製後、２０００ｒｐｍ、１０分間遠心し、無血清ＤＭＥＭ培地５ｍｌに懸濁する。ミクロセルを５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ培地に懸濁し、８μｍ、５μｍ、３μｍフィルターにて精製した。精製後、２０００ｒｐｍ、１０分間遠心した。予め前日にレシピエント細胞であるＨＰＲＴ遺伝子を欠損させた６－チオグアニン耐性ＨＴ１０８０細胞を６ｃｍ直径細胞培養皿に９０％コンフルエントになるように播種したものを用意し、これを無血清培地（ＤＭＥＭ）にて洗浄する。精製した微小核をＰＨＡ－Ｐ（ＳＩＧＭＡ）を含む無血清培養液２ｍｌに再度懸濁し、無血清培養液（ＤＭＥＭ）を除去したヒトｉＰＳ細胞上に静かに播種する。培養皿を３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて２０分間静置した。上清を除去し、ＰＥＧ１０００（Ｗａｋｏ）［５ｇのＰＥＧ１０００を無血清ＤＭＥＭ培地に完全に溶解し、ジメチルスルホキシドを１ｍＬ添加して濾過滅菌する。］溶液を１ｍｌで正確に９０秒間融合した。無血清培養液（ＤＭＥＭ）を５ｍｌで３回洗浄し、通常の培養液５ｍｌで３７℃、一晩インキュベートした。２４時間後１０ｃｍ直径培養皿６枚に再播種した。更に２４時間後、１×ＨＡＴになるように加え、３～４週間選択培養した。薬剤耐性コロニーを単離し増殖させ、以降の解析を行った。
ドナー細胞である女性由来ヒトｉＰＳ細胞株２０１Ｂ７（ＲＣＢ、ＨＰＳ００６３）（核型：４６，ＸＸ）を予め０．５μｇ／ｃｍ２のＬａｍｉｎｉｎ－５１１でコートした細胞培養フラスコ×１２に播種し、１０μＭ Ｙ－２７６３２を添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて２４時間培養したその後、通常培養のｉＰＳ培養培地に交換し増殖させ、９０％コンフルエントに到達した際にＰａｃｌｉｔａｘｅｌ２０ｎＭ、Ｒｅｖｅｒｓｉｎｅ５００ｎＭ、３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて４８時間培養し、微小核を形成させた。培養液を除去し、予め３７℃で保温したサイトカラシンＢ（１０μｇ／ｍｌ、シグマ）溶液を遠心用フラスコに満たし、３４℃、８，０００ｒｐｍ、１時間の遠心を行った。ミクロセルを無血清ＤＭＥＭ培地に懸濁し、８μｍ、５μｍ、３μｍフィルターにて精製する。精製後、２０００ｒｐｍ、１０分間遠心し、無血清ＤＭＥＭ培地５ｍｌに懸濁する。ミクロセルを５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ培地に懸濁し、８μｍ、５μｍ、３μｍフィルターにて精製した。精製後、２０００ｒｐｍ、１０分間遠心した。予め前日にレシピエント細胞であるＨＰＲＴ遺伝子を欠損させた６－チオグアニン耐性ＨＴ１０８０細胞を６ｃｍ直径細胞培養皿に９０％コンフルエントになるように播種したものを用意し、これを無血清培地（ＤＭＥＭ）にて洗浄する。精製した微小核をＰＨＡ－Ｐ（ＳＩＧＭＡ）を含む無血清培養液２ｍｌに再度懸濁し、無血清培養液（ＤＭＥＭ）を除去したヒトｉＰＳ細胞上に静かに播種する。培養皿を３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて２０分間静置した。上清を除去し、ＰＥＧ１０００（Ｗａｋｏ）［５ｇのＰＥＧ１０００を無血清ＤＭＥＭ培地に完全に溶解し、ジメチルスルホキシドを１ｍＬ添加して濾過滅菌する。］溶液を１ｍｌで正確に９０秒間融合した。無血清培養液（ＤＭＥＭ）を５ｍｌで３回洗浄し、通常の培養液５ｍｌで３７℃、一晩インキュベートした。２４時間後１０ｃｍ直径培養皿６枚に再播種した。更に２４時間後、１×ＨＡＴになるように加え、３～４週間選択培養した。薬剤耐性コロニーを単離し増殖させ、以降の解析を行った。
【0087】
［Ａ．１．２］マルチカラーＦＩＳＨ解析
上記ＨＡＴ耐性であったクローンについて、マルチカラーＦＩＳＨ解析を行った。マルチカラーＦＩＳＨ試薬（ＭｅｔａＳｙｓｔｅｍｓ）にて染色した染色体像を蛍光顕微鏡により観察した。結果として、ＨＴ１０８０の通常核型では、二倍体の場合、Ｘ染色体一本を含有し、四倍体の場合、Ｘ染色体二本を含有するが、得られたクローンは四倍体でありながら、Ｘ染色体三本を含有していた。このことから、外来Ｘ染色体一本が導入されていることを確認できた（図１２）。
上記ＨＡＴ耐性であったクローンについて、マルチカラーＦＩＳＨ解析を行った。マルチカラーＦＩＳＨ試薬（ＭｅｔａＳｙｓｔｅｍｓ）にて染色した染色体像を蛍光顕微鏡により観察した。結果として、ＨＴ１０８０の通常核型では、二倍体の場合、Ｘ染色体一本を含有し、四倍体の場合、Ｘ染色体二本を含有するが、得られたクローンは四倍体でありながら、Ｘ染色体三本を含有していた。このことから、外来Ｘ染色体一本が導入されていることを確認できた（図１２）。
【0088】
［Ｂ．１．１］外来Ｘ染色体導入細胞株のＨＡＴおよび６-チオグアニン感受性評価試験
取得したＨＡＴ耐性細胞について、１×１０４細胞を６ｗｅｌｌプレートの１ウェルに播種し、翌日から６－チオグアニン（６ＴＧ）を２０μＭの濃度で、１２０時間処理し、６－チオグアニン耐性能を評価した。ＨＴ１０８０野生型株はＸ染色体上に正常ＨＰＲＴ遺伝子を持つことにより、ＨＡＴ耐性であり、６－チオグアニンを代謝し、細胞毒性を示した（図１３左パネル）。ＨＴ１０８０ ＨＰＲＴ欠損株については、内在Ｘ染色体上の内在ＨＰＲＴ遺伝子を欠損しているため、６－チオグアニンによる細胞障害活性を示さず、６－チオグアニン非感受性であった。一方で、１×ＨＡＴ処理により細胞増殖が停止し、ＨＡＴ感受性を示した。（図１３中パネル）ＨＴ１０８０ ＨＰＲＴ欠損株に外来正常Ｘ染色体を導入し取得した、外来Ｘ染色体含有ＨＴ１０８０ ＨＰＲＴ欠損細胞株においては、ＨＴ１０８０ 野生型株と同様に、６－チオグアニンによる細胞障害活性が認められ、一方でＨＡＴ耐性であった（図１３右パネル）。これらのことからヒトｉＰＳ細胞からＨＴ１０８０細胞へ正常ＨＰＲＴ遺伝子を保持するヒトｉＰＳ細胞由来Ｘ染色体を導入できたと示された。
取得したＨＡＴ耐性細胞について、１×１０４細胞を６ｗｅｌｌプレートの１ウェルに播種し、翌日から６－チオグアニン（６ＴＧ）を２０μＭの濃度で、１２０時間処理し、６－チオグアニン耐性能を評価した。ＨＴ１０８０野生型株はＸ染色体上に正常ＨＰＲＴ遺伝子を持つことにより、ＨＡＴ耐性であり、６－チオグアニンを代謝し、細胞毒性を示した（図１３左パネル）。ＨＴ１０８０ ＨＰＲＴ欠損株については、内在Ｘ染色体上の内在ＨＰＲＴ遺伝子を欠損しているため、６－チオグアニンによる細胞障害活性を示さず、６－チオグアニン非感受性であった。一方で、１×ＨＡＴ処理により細胞増殖が停止し、ＨＡＴ感受性を示した。（図１３中パネル）ＨＴ１０８０ ＨＰＲＴ欠損株に外来正常Ｘ染色体を導入し取得した、外来Ｘ染色体含有ＨＴ１０８０ ＨＰＲＴ欠損細胞株においては、ＨＴ１０８０ 野生型株と同様に、６－チオグアニンによる細胞障害活性が認められ、一方でＨＡＴ耐性であった（図１３右パネル）。これらのことからヒトｉＰＳ細胞からＨＴ１０８０細胞へ正常ＨＰＲＴ遺伝子を保持するヒトｉＰＳ細胞由来Ｘ染色体を導入できたと示された。
【産業上の利用可能性】
【0089】
本発明は、目的ＤＮＡを含むヒト細胞又は非ヒト動物細胞（例えば齧歯類細胞）（供与細胞）からヒト細胞又は非ヒト動物細胞（受容細胞）に目的ＤＮＡを直接的に導入するための技術を提供するため、例えばヒトｉＰＳ細胞などのヒト細胞を利用した再生医療や医薬品開発に有用である。
【配列表フリーテキスト】
【0090】
配列番号1：プライマー
配列番号２：プライマー
配列番号２：プライマー
【0091】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図1】
【図2】
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