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特許7011605高血糖症によって引き起こされる線維性疾患の処置における使用のためのｍｉＲＮＡを含有する薬学的担体
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-01-18
(45)【発行日】2022-01-26
(54)【発明の名称】高血糖症によって引き起こされる線維性疾患の処置における使用のためのｍｉＲＮＡを含有する薬学的担体
(51)【国際特許分類】
A61K 48/00 20060101AFI20220119BHJP
A61K 9/14 20060101ALI20220119BHJP
A61K 9/50 20060101ALI20220119BHJP
A61K 9/51 20060101ALI20220119BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20220119BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20220119BHJP
A61K 35/28 20150101ALI20220119BHJP
A61K 35/407 20150101ALI20220119BHJP
A61K 35/545 20150101ALI20220119BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20220119BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20220119BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20220119BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20220119BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20220119BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20220119BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220119BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20220119BHJP
C12N 15/88 20060101ALI20220119BHJP
【ＦＩ】
A61K48/00
A61K9/14
A61K9/50
A61K9/51
A61K31/7105
A61K35/12
A61K35/28
A61K35/407
A61K35/545
A61P1/16
A61P3/10
A61P9/00
A61P9/10
A61P13/12
A61P27/02
A61P43/00 105
C12N15/113 Z
C12N15/88 Z
【請求項の数】
10
(21)【出願番号】P 2018558118
(86)(22)【出願日】2017-05-04
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2019-06-06
(86)【国際出願番号】 EP2017060612
(87)【国際公開番号】W WO2017191234
(87)【国際公開日】2017-11-09
【審査請求日】2020-04-23
(31)【優先権主張番号】16168546.6
(32)【優先日】2016-05-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】518361044
【氏名又は名称】ユニシテ エーファウ アクチェンゲゼルシャフト
(74)【代理人】
【識別番号】100094569
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 伸一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100088694
【弁理士】
【氏名又は名称】弟子丸 健
(74)【代理人】
【識別番号】100103610
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100084663
【氏名又は名称】箱田 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100093300
【弁理士】
【氏名又は名称】浅井 賢治
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100123777
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 さつき
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(74)【代理人】
【識別番号】100136249
【弁理士】
【氏名又は名称】星野 貴光
(72)【発明者】
【氏名】ブリッツィ マリア フェリーチェ
(72)【発明者】
【氏名】カムッシ ジョヴァンニ
【審査官】菊池 美香
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１５－５２９４５０（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１７／０４７８００（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ４８／００
Ａ６１Ｋ ９／１４
Ａ６１Ｋ ９／５０
Ａ６１Ｋ ９／５１
Ａ６１Ｋ ３１／７１０５
Ａ６１Ｋ ３５／１２
Ａ６１Ｋ ３５／２８
Ａ６１Ｋ ３５／４０７
Ａ６１Ｋ ３５／５４５
Ａ６１Ｐ １／１６
Ａ６１Ｐ ３／１０
Ａ６１Ｐ ９／００
Ａ６１Ｐ ９／１０
Ａ６１Ｐ １３／１２
Ａ６１Ｐ ２７／０２
Ａ６１Ｐ ４３／００
Ｃ１２Ｎ １５／１１３
Ｃ１２Ｎ １５／８８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
マイクロＲＮＡであるｍｉＲ２２２を担持する薬学的に許容可能な担体を含む、高血糖症によって引き起こされる線維性疾患の処置における使用のための組成物。
【請求項2】
薬学的に許容可能な担体が、マイクロＲＮＡであるｍｉＲ１００をさらに担持する、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
薬学的に許容可能な担体がマイクロ粒子またはナノ粒子であり、１種または複数のマイクロＲＮＡが、マイクロ粒子もしくはナノ粒子の内部に含有されているか、またはマイクロ粒子もしくはナノ粒子の表面に付着している、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項4】
薬学的に許容可能な担体が細胞外小胞（ＥＶ）である、請求項１から３のいずれかに記載の組成物。
【請求項5】
薬学的に許容可能な担体が、幹細胞に由来する細胞外小胞（ＥＶ）である、請求項１から５のいずれかに記載の組成物。
【請求項6】
細胞外小胞（ＥＶ）が成体幹細胞に由来する、請求項５に記載の組成物。
【請求項7】
細胞外小胞（ＥＶ）が、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、非卵形ヒト肝臓前駆細胞（ＨＬＳＣ）または脂肪幹細胞（ＡＳＣ）に由来する、請求項６に記載の組成物。
【請求項8】
細胞外小胞（ＥＶ）が、天然に存在するＥＶであるか、またはｍｉＲ２２２を含有するように操作されており、ｍｉＲ１００を含有するように操作されていてもよいＥＶである、請求項４から７のいずれかに記載の組成物。
【請求項9】
細胞外小胞（ＥＶ）が、ｍｉＲ２２２およびｍｉＲ１００を含有するように操作されている、請求項８に記載の組成物。
【請求項10】
線維性疾患が、糖尿病性腎症、腎線維症、心筋症、非アルコール性脂肪肝、特にＮＡＳＨ、および糖尿病網膜症からなる群から選択される、請求項１から９のいずれかに記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、線維性疾患の新規な治療的処置に関する。より詳細には、本発明は、高血糖症によって引き起こされる線維性疾患の処置における、幹細胞由来の細胞外小胞（ＥＶ）のような薬学的担体の使用に関する。糖尿病性腎症のような線維性腎臓疾患に焦点が当てられる。
【背景技術】
【0002】
線維症はしばしば、組織傷害に続いて観察される。高血糖症によって誘導される線維症は、糖尿病患者において見出される特別なタイプの線維症である。腎臓はしばしば、そのような線維性疾患の影響を受ける。
糖尿病は、西洋世界において慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）を主として駆動するものであり、新たな症例の約５０％を占める。糖尿病患者のほぼ４０％が糖尿病性腎症（ＤＮ）を発症し、そのためこれは、都市化された国における末期腎不全（ＥＳＲＤ）の主要な原因となっている。ＣＫＤを有する患者は、末期腎不全についてだけでなく、心血管疾患および死亡についてのリスクも増加している。より良好なＤＮ管理のための新規な標的が緊急に同定される必要があるが、それは、厳密な血糖制御および種々の治療的アプローチの適用にもかかわらず、ＥＳＲＤが発症し得るからである。
初期ＤＮの重要な病理学的特徴は、糸球体上皮細胞の損傷／欠損およびメサンギウム細胞（ＭＣ）肥大を含む。それに続く腎間質内における筋線維芽前駆細胞集団の拡張、および増加した細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質合成は、糸球体基底膜肥厚および尿細管間質性線維症をもたらす。
ＤＮにおける腎臓の構造的変化は、糸球体細胞および尿細管細胞の両方における初期の増殖速度、および、メサンギウム細胞の大きさの漸進的な増加をもたらすＩＶ型コラーゲンおよびフィブロネクチンのような細胞外マトリックスタンパク質の後期蓄積によって特徴付けられる。
糖尿病は、西洋世界において慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）を主として駆動するものであり、新たな症例の約５０％を占める。糖尿病患者のほぼ４０％が糖尿病性腎症（ＤＮ）を発症し、そのためこれは、都市化された国における末期腎不全（ＥＳＲＤ）の主要な原因となっている。ＣＫＤを有する患者は、末期腎不全についてだけでなく、心血管疾患および死亡についてのリスクも増加している。より良好なＤＮ管理のための新規な標的が緊急に同定される必要があるが、それは、厳密な血糖制御および種々の治療的アプローチの適用にもかかわらず、ＥＳＲＤが発症し得るからである。
初期ＤＮの重要な病理学的特徴は、糸球体上皮細胞の損傷／欠損およびメサンギウム細胞（ＭＣ）肥大を含む。それに続く腎間質内における筋線維芽前駆細胞集団の拡張、および増加した細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質合成は、糸球体基底膜肥厚および尿細管間質性線維症をもたらす。
ＤＮにおける腎臓の構造的変化は、糸球体細胞および尿細管細胞の両方における初期の増殖速度、および、メサンギウム細胞の大きさの漸進的な増加をもたらすＩＶ型コラーゲンおよびフィブロネクチンのような細胞外マトリックスタンパク質の後期蓄積によって特徴付けられる。
【0003】
ｍｉＲの役割は、ＤＮを含む異なる病理学的状況における線維化過程に寄与することが報告されている。ｍｉＲ２１は、メサンギウム細胞の拡張において特に興味を引いている。ｍｉＲ２１が、２型糖尿病患者からの尿においても増加することが、近年報告されている。異なるｍｉＲ２１の標的が、コラーゲン産生および線維症に寄与することが報告されている。Ａｋｔ－ｍＴＯＲ経路の活性化をもたらすＰＴＥＮ上方制御が、この過程に主に寄与しているように見える。実のところ、先行技術において、ｍｉＲ２１への干渉が、ＤＮの前臨床モデルにおける腎臓の組織学的異常を回復することが示された。ｍｉＲ遺伝子は、他の遺伝子と同様に、転写因子によって制御し得る。このことに関し、ｍｉＲ－２１は、Ｊｕｒｋａｔ細胞に加えて乳腺細胞においても、プロラクチンに応答するＳＴＡＴ５標的遺伝子として記載されている。一方で、ＳＴＡＴ５それ自体は、ｍｉＲ２２２およびｍｉＲ２２３を含む異なるｍｉＲによって制御され得るものであり、このことは、このシナリオが極めて複雑であることを示唆している。
臨床的および実験的腎臓学者は、ＣＤＫの転帰を改善するために、異なる分野において仕事をしている。特に、インビボおよびインビトロモデルを使用する本質的研究は、現在、ＣＫＤのＥＳＲＤへの進行に関与する主要な経路についての分子的基盤を明らかにすること、および腎線維症を抑制するための新規な治療的アプローチを発見することを目指している。
臨床的および実験的腎臓学者は、ＣＤＫの転帰を改善するために、異なる分野において仕事をしている。特に、インビボおよびインビトロモデルを使用する本質的研究は、現在、ＣＫＤのＥＳＲＤへの進行に関与する主要な経路についての分子的基盤を明らかにすること、および腎線維症を抑制するための新規な治療的アプローチを発見することを目指している。
【0004】
異なる起源のＭＳＣが、現在、再生医療において最も広く研究されている幹細胞である。そもそもＭＳＣは、傷害された組織にホーミングし、生着して、ここでＭＳＣは分化して、損傷した細胞を置換すると考えられていたが、現在では、ＭＳＣが栄養媒介物質を放出する能力から、ＭＳＣ移植のプラスの影響が生じることが実証された。いくつかの研究は、細胞外ＲＮＡ（ｅｘＲＮＡ）トランスポーターに注目しており、エキソソームおよび微小小胞体を含む小胞の形態において、これらが体液中に存在し得ることを示している。これらの小胞は別個の生体発生を有するが、重複する特徴および生物学的活性を共有するため、「細胞外小胞」（ＥＶ）という包括的な用語を使用することが提案されている。ＥＶは近年、よく保存されている進化的な細胞間コミュニケーション機構として、増大する注目を集めている。特に、幹細胞由来ＥＶは、再生医療において全身的または局所的に投与された場合、機能的ＲＮＡ、ｍｉＲ、脂質、およびタンパク質の水平伝播を介して、細胞の効果を模倣し得ることが見出されている。異なる幹細胞起源から回収されたＥＶは、それらの内包物を完全にまたは部分的に共有することができる。さらに、ｍｉＲまたはタンパク質の濃縮を、それらの起源に依存して検出することができる。
一般的な幹細胞由来ＥＶの機能は、種々の病理学的条件における近年の研究の話題となってが、これらがどのような機構で、高グルコースへの応答におけるように損傷のきっかけから細胞を保護するかは、部分的に検討されているのみである。
ＷＯ２０１１／１４３４９９は、腎幹細胞およびその細胞外小胞（ＥＶ）が線維症の処置において有効であることを記載している。
ＷＯ２０１５／０５２５２６は、線維症の処置のための神経幹細胞からの微小粒子（すなわち細胞外小胞、ＥＶ）の効果を記載している。
一般的な幹細胞由来ＥＶの機能は、種々の病理学的条件における近年の研究の話題となってが、これらがどのような機構で、高グルコースへの応答におけるように損傷のきっかけから細胞を保護するかは、部分的に検討されているのみである。
ＷＯ２０１１／１４３４９９は、腎幹細胞およびその細胞外小胞（ＥＶ）が線維症の処置において有効であることを記載している。
ＷＯ２０１５／０５２５２６は、線維症の処置のための神経幹細胞からの微小粒子（すなわち細胞外小胞、ＥＶ）の効果を記載している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
高血糖症によって引き起こされる線維症に対する新規な治療的アプローチを探索するために、本発明者らは、異なる幹細胞起源から放出されたＥＶの、ＨＧ誘導性コラーゲン産生（ここで「ＨＧ」は「高グルコース」を表す）に対する効果を解析し、ＳＴＡＴ５Ａ ｍｉＲ２１、ｍｉＲ２２２、ｍｉＲ１００およびＴＧＦβ発現に対するそれらの効果に対して、特に注意が払われている。特に、糖尿病性腎症および腎線維症の処置が解析されている。
【0006】
本詳細な説明の実験の部において詳細に説明されるとおり、本発明者らの研究の結果は、種々のタイプの幹細胞から放出されたＥＶが、メサンギウム細胞を、ＨＧ誘導性コラーゲン産生から保護することを示した。特に、本発明者らは、ＥＶが、ｍｉＲ２２２と名付けられたマイクロＲＮＡを伝播することによってＳＴＡＴ５の発現を制御し、これはその後、ｍｉＲ２１、ＴＧＦｂ１の発現およびマトリックスタンパク質合成を制御することに注目した。さらに、本発明者らは、ＥＶが、レシピエント細胞におけるｍｉＲ２１およびｍｉＲ１００の間のバランスにおける変化を駆動することによって、コラーゲン産生の抑制にも間接的に寄与し得ることを見出した。これらの結果は、種々の幹細胞から放出されたＥＶが、関連する機構を伝播して、ＨＧに媒介された損傷からメサンギウム細胞を保護することができることを示している。
【0007】
したがって、本発明の第一の態様は、高血糖症によって引き起こされる線維性疾患、特に糖尿病性腎症および／または腎線維症の処置における使用のための、ｍｉＲ２２２を担持する薬学的に許容可能な担体である。高血糖症によって引き起こされる他の線維性疾患、たとえば心筋症、非アルコール性脂肪肝（ＢａｎおよびＴｗｉｇｇ、２００９年）、特にＮＡＳＨ（非アルコール性脂肪性肝炎）、および糖尿病網膜症の処置も想定される。
本発明の好ましい実施形態によれば、薬学的に許容可能な担体は、マイクロＲＮＡである「ｍｉＲ１００」を含む。
本発明の好ましい実施形態によれば、薬学的に許容可能な担体は、マイクロＲＮＡである「ｍｉＲ１００」を含む。
【0008】
ｍｉＲ２２２およびｍｉＲ１００は、それ自体は既知のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）であり、これらの特徴および配列は、たとえばｍｉＲＢａｓｅと名付けられたデータベースにおいて、それぞれＭＩ００００２９９およびＭＩ００００１０２の受託番号の下に見出され得る。
【0009】
薬学的効果は、薬学的担体に含有されたｍｉＲＮＡに帰すことができる。標的細胞に対するｍｉＲＮＡのあらゆる効率的なトランスフェクションが、高血糖症によって引き起こされる線維性疾患の処置における効果的な使用のために想定される。ｍｉＲＮＡの効率的なトランスフェクションは、好ましくはマイクロ粒子またはナノ粒子の形態の、適切な薬学的担体を必要とする。そのような担体は市販されているものであり、アルギネートベース（ＧＥＭ、Ｇｌｏｂａｌ Ｃｅｌｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）、デキストランベース（Ｃｙｔｏｄｅｘ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、コラーゲンベース（Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ、Ｐｅｒｃｅｌｌ）、およびポリスチレンベース（ＳｏｌｏＨｉｌｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）のマイクロ担体を含む。
【0010】
別の方法として、ｍｉＲＮＡのための薬学的担体は、ウイルスベクターであってもよい。ウイルスベースのシステムは、通常、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＶＶ）を、たとえばＮｉｎｇｎｉｎｇ Ｙａｎｇにおいて開示されているように送達ベクターとして使用する。An overview of viral and nonviral delivery systems for microRNA. Int J Pharm Investig. 2015 Oct-Dec; 5(4): 179-181。したがって、ｍｉＲＮＡのための適切な担体の選択および使用は、十分に当業者の能力の範囲内にある。
ｍｉＲＮＡのためのさらに一層好ましい薬学的担体は、リポソームまたは細胞外小胞（ＥＶ）のような小胞である。細胞由来微小小胞体またはエキソソームのような細胞外小胞が、最も好ましい薬学的担体である。
したがって、本発明の別の好ましい実施形態によれば、薬学的に許容可能な担体は、幹細胞に、好ましくは成体幹細胞に、より好ましくは、たとえば骨髄間質幹細胞、または脂肪幹細胞（ＡＳＣ）、または非卵形ヒト肝臓前駆細胞（ＨＬＳＣ）のような間葉系幹細胞（ＭＳＣ）に由来する細胞外小胞（ＥＶ）である。ＨＬＳＣおよびそれを得る方法は、ＷＯ２００６１２６２１９として公開された国際特許出願において開示されている。
ｍｉＲＮＡのためのさらに一層好ましい薬学的担体は、リポソームまたは細胞外小胞（ＥＶ）のような小胞である。細胞由来微小小胞体またはエキソソームのような細胞外小胞が、最も好ましい薬学的担体である。
したがって、本発明の別の好ましい実施形態によれば、薬学的に許容可能な担体は、幹細胞に、好ましくは成体幹細胞に、より好ましくは、たとえば骨髄間質幹細胞、または脂肪幹細胞（ＡＳＣ）、または非卵形ヒト肝臓前駆細胞（ＨＬＳＣ）のような間葉系幹細胞（ＭＳＣ）に由来する細胞外小胞（ＥＶ）である。ＨＬＳＣおよびそれを得る方法は、ＷＯ２００６１２６２１９として公開された国際特許出願において開示されている。
【0011】
本発明のさらなる態様は、高血糖症によって引き起こされる線維性疾患、好ましくは糖尿病性腎症、腎線維症、心筋症もしくは非アルコール性脂肪肝、特にＮＡＳＨ、または糖尿病網膜症の処置における使用のための、幹細胞の馴化培地から、好ましくは成体幹細胞の馴化培地から、より好ましくは間葉系幹細胞（ＭＳＣ）またはヒト肝臓幹細胞（ＨＬＳＣ）の馴化培地から、単離された細胞外小胞の組成物である。特許請求される組成物の細胞外小胞は、好ましくはマイクロＲＮＡであるｍｉＲ２２２を含有し、マイクロＲＮＡであるｍｉＲＮＡ１００を含有してもよい。
本発明による使用のための細胞外小胞（ＥＶ）は、天然に存在するＥＶであるか、またはその代わりに天然に存在する細胞外小胞（ＥＶ）と比較して顕著に多い量のｍｉＲ２２２またはｍｉＲ１００を含有するように操作されているＥＶであって、単離された細胞外小胞に対してｅｘ ｖｉｖｏでｍｉＲ２２２またはｍｉＲ１００を負荷（load）することによって得られるＥＶである。
本発明による使用のための細胞外小胞（ＥＶ）は、天然に存在するＥＶであるか、またはその代わりに天然に存在する細胞外小胞（ＥＶ）と比較して顕著に多い量のｍｉＲ２２２またはｍｉＲ１００を含有するように操作されているＥＶであって、単離された細胞外小胞に対してｅｘ ｖｉｖｏでｍｉＲ２２２またはｍｉＲ１００を負荷（load）することによって得られるＥＶである。
【0012】
ＥＰ２０１０６６３として公開された欧州特許出願は、当業者に対し、特定のｍｉＲＮＡを含むＥＶをどのように操作するかに関する指示を提供する。小胞またはエキソソーム内にＲＮＡを導入する当業者に既知の技術は、トランスフェクションまたは共インキュベーションである。既知のトランスフェクション方法は、たとえばエレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、ウイルス性および非ウイルス性ベクターによるトランスフェクション、磁気アシスト（ｍａｇｎｅｔ ａｓｓｉｓｔｅｄ）トランスフェクションおよびソノポレーションである。結果として、ｅｘ ｖｉｖｏでｍｉＲ２２２またはｍｉＲ１００が導入されている操作されたＥＶが、本発明の別の態様である。
この後の実験の部においてさらに詳細に説明されるとおり、天然に存在する細胞外小胞（ＥＶ）と比較して顕著に多い量のｍｉＲ２２２またはｍｉＲ１００を評価する適切な方法は、ｑＰＣＲデータ解析のΔΔＣＴ法である。
相対値として表すと、負荷効率、すなわち、本発明の操作されたＥＶに存在する標的分子（すなわちｍｉＲ２２２またはｍｉＲ１００のいずれか）の、天然の量と比較した量は、少なくとも２倍である。あるいは、負荷効率は、１個のＥＶあたりの負荷された標的分子の数として、絶対的な値で表してもよい。この値は、天然の量よりも多い、標的分子約１×１０3個～約１×１０5個／ＥＶの範囲であってよいことが想定される。
この後の実験の部においてさらに詳細に説明されるとおり、天然に存在する細胞外小胞（ＥＶ）と比較して顕著に多い量のｍｉＲ２２２またはｍｉＲ１００を評価する適切な方法は、ｑＰＣＲデータ解析のΔΔＣＴ法である。
相対値として表すと、負荷効率、すなわち、本発明の操作されたＥＶに存在する標的分子（すなわちｍｉＲ２２２またはｍｉＲ１００のいずれか）の、天然の量と比較した量は、少なくとも２倍である。あるいは、負荷効率は、１個のＥＶあたりの負荷された標的分子の数として、絶対的な値で表してもよい。この値は、天然の量よりも多い、標的分子約１×１０3個～約１×１０5個／ＥＶの範囲であってよいことが想定される。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】図１Ａに示されるように、ＨＧはＭＣの増殖において有意な増加を促進するが、これは細胞数によって、およびサイクリンＤ１含量によって示されるとおりである（図１Ｂ）。老化ＭＣの数において変化は検出されなかった（図１Ｃ）。ＭＣコラーゲン産生は、糸球体損傷の特徴である。そこで、ＨＧで刺激されたＭＣにおいて、コラーゲン産生を評価した。細胞の総溶解物および上清の両方に対するウェスタンブロット解析は、低グルコース処理された（ｔｒｅａｄｅｄ）細胞と比較した場合に、ＩＶ型コラーゲン産生において有意な増加を示した（図１ＤおよびＥ）。コラーゲン産生における増加は、線維性分泌性表現型へのＭＣの転換を示している。ＭＣによって既にほとんど産生されていなかったＴＧＦβは、ＨＧ処理によってさらに増加した（図１Ｆ）。糖尿病性腎症に関与するよく知られたｍｉＲＮＡであるｍｉＲ２１は、メサンギウム細胞マトリックスの拡張を誘導することが知られている。これと一致して、ＨＧ処理がｍｉＲ２１発現を誘導することが見出された（図１Ｇ）。このシグナル伝達経路の関与を検討した。本発明者らは、ＨＧで処理されたＭＣにおいてさえ、高レベルのｍＴＯＲを検出することができたことを見出した（図１Ｈ）。
【図2】図２Ａに示されるように、ＥＶはＭＣ増殖に干渉しなかった。しかし、コラーゲン産生を評価した場合、ＭＳＣおよびＨＬＳＣから回収されたＥＶは、コラーゲン産生を有意に減少させた（図２ＢおよびＣ）。これと一致して、ｍｉＲ２１（図２Ｄ）、ｍＴＯＲ（図２Ｅ～Ｆ）およびＴＧＦβの発現の下方制御が検出された（図２Ｇ～Ｈ）。
【図3】図３Ａに示されるように、ＳＴＡＴ５ＡはＨＧ処理に応答して活性化を経験したが、その効果はＥＶ処理によって抑制された（図３Ｂ～Ｃ）。これらの実験条件において減少したＳＴＡＴ５Ａ発現が検出されたという観察は、ＥＶの内包物がその発現を制御し得る可能性を強く示唆している。この可能性を検討するために、ΔＮＳＴＡＴ５Ａ構築物をＭＣにトランスフェクションし（図３Ｄ）、ｍｉＲ２１発現を解析した。図３Ｅにおいて報告されるように、ＳＴＡＴ５Ａ活性化の抑制は、ＨＧ処理されたＭＣにおけるｍｉＲ２１の下方制御をもたらした。これと一致して、これらの実験条件においてコラーゲン産生を解析した場合、その発現はほぼ完全に抑制されたことが見出された。興味深いことに、ＳＴＡＴ５Ａシグナル伝達経路の抑制が、ＨＧ媒介性ＴＧＦβ発現を、同様に防止することもまた、実証された（図３Ｆ）。
【図4】図４Ａに示されるように、ｍｉＲ２２２は、ＨＧ処理に際して下方制御されるが、一方でＥＶ処理に際して増加する。この効果が、ＭＣ内へのＥＶ－ｍｉＲ２２２内容物の放出に依存するということは、アマニチンと、ＲＮＡｓｅで前処理したかまたはしていないＥＶとの存在下で行われた実験によって実証された（図４Ｂ）。これらの結果をさらに確認するために、ｐｒｅｍｉＲ２２２をトランスフェクションし、ＨＧ条件において培養したＭＣを使用して、機能獲得実験を行った。予想どおり、ｍｉＲ２２２の過剰発現は、ＨＧ処理されたＭＣにおいて、ＳＴＡＴ５Ａ含量に加えてｍｉＲ２１の細胞内含量、ＴＧＦβ発現およびコラーゲン産生の劇的な減少をもたらした（図４Ｄ～Ｆ）。
【図5】図５Ａに示されるように、ｍｉＲ１００のＭＣにおける含量はＨＧ処理に際して増加した一方で、ＥＶ処理後は、その含量における変化を検出することはできなかった。しかし、細胞内ｍｉＲのバランスは特定の生物学的応答を指向させ得るため、本発明者らは、ＥＶ処理に伴って減少したｍｉＲ２１の細胞内含量が、ｍｉＲ１００の転写後活性のためによい働きをし得るという仮説を立てた。この仮説を確認するために、ｐｒｅｍｉＲ１００を使用する機能獲得実験を、ＨＧ処理したＭＣにおいて行った。実際、図５Ｂにおいて報告されたデータは、ｍｉＲ１００発現がｍｉＲ２１と比べて多い場合、これはｍＴＯＲ下方制御によって媒介されるシグナル伝達を駆動することができ、このことが、ＭＣのＴＧＦβ発現およびコラーゲン産生の抑制をもたらすことを実証する（図５Ｃ～Ｄ）。再び、ｍｉＲ１００の過剰発現は、ＬＧ培養されたＭＣに対して影響を及ぼさなかった（図５Ｃ～Ｄ）。
【発明を実施するための形態】
【0014】
以下の実験の部は、ＭＳＣおよびＨＬＳＣに由来するＥＶを用いて本発明者らが実施した実験を開示するが、例としてのみ提供されるのであって、添付した特許請求の範囲によって決定される本発明の範囲を限定することが意図されるものではない。
【0015】
本発明者らによって得られた結果は、メサンギウム細胞において、ＨＧが、ＴＧＦβの発現、およびＳＴＡＴ５Ａ媒介経路を介したコラーゲンの産生を駆動することを実証した。ΔＮＳＴＡＴ５構築物を、ＨＧ中で培養したメサンギウム細胞において発現させることにより、本発明者らは、ＳＴＡＴ５Ａの活性化がｍｉＲ２１発現を制御することを実証した。本発明者らはさらに、ＭＳＣおよびＨＬＳＣから放出されたＥＶが、ＨＧ誘導性コラーゲン産生からメサンギウム細胞を保護することを示している。特に、本発明者らは、ＥＶが、ｍｉＲ２２２をメサンギウム細胞に伝播することによってＳＴＡＴ５Ａの発現を制御し、これがその後、ｍｉＲ２１含量、ＴＧＦβ発現およびマトリックスタンパク質合成を制御することに注目している。これらの結果はさらに、ＨＧ条件中で培養したメサンギウム細胞においてｍｉＲ２２２を過剰発現させることによって確認された。さらに、ｍｉＲ１００の過剰発現により、本発明者らは、レシピエント細胞中のｍｉＲ２１およびｍｉＲ１００の間のバランスにおける変化であって、ＥＶ内包物の伝播からもたらされるものが、ｍＴＯＲの下方制御、ならびにＴＧＦβ発現およびコラーゲン産生の両方の障害をもたらすことを実証した。興味深いことに、これらの効果は、ＨＧ培養された細胞においてのみ検出された。
【0016】
（例１）
材料および方法
細胞培養
ヒトメサンギウム細胞（ＭＣ）は、１．０ｇ／ｌのＤ－グルコースを含むＤＭＥＭ（低グルコース、ＬＧ）または２５ｍＭのＤ－グルコースのＤＭＥＭ（高グルコース、ＨＧ）中で培養した。ＭＣはまた、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含まないＤＭＥＭ ＬＧおよびＨＧ中でＭＳＣ由来またはＨＬＳＣ由来ＥＶの存在下、２４時間培養した。すべての実験条件において、同じ数のＥＶを使用して、ＭＣを刺激した（７０００個のＥＶ／標的細胞）。
材料および方法
細胞培養
ヒトメサンギウム細胞（ＭＣ）は、１．０ｇ／ｌのＤ－グルコースを含むＤＭＥＭ（低グルコース、ＬＧ）または２５ｍＭのＤ－グルコースのＤＭＥＭ（高グルコース、ＨＧ）中で培養した。ＭＣはまた、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含まないＤＭＥＭ ＬＧおよびＨＧ中でＭＳＣ由来またはＨＬＳＣ由来ＥＶの存在下、２４時間培養した。すべての実験条件において、同じ数のＥＶを使用して、ＭＣを刺激した（７０００個のＥＶ／標的細胞）。
【0017】
ＭＳＣ由来およびＨＬＳＣ由来ＥＶの単離および定量
上清からＥＶを回収するために、ＭＳＣおよびＨＬＳＣを、ウシ胎児血清を含まないＥｎｄｏＧＲＯ培地中で２４時間培養した。３０００ｇで３０分間遠心分離してデブリを除去した後、無細胞上清を、１００００および１０００００ｇの分画超遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｏｐｔｉｍａ Ｌ－９０Ｋ ｕｌｔｒａｃｅｔｒｉｆｕｇｅ； Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）に４℃で３時間供した。ＥＶは、新鮮なまま使用したか、または１％ＤＭＳＯを供給されたＤＭＥＭ中の再懸濁後、－８０℃で保存した（Ｄｅｒｅｇｉｂｕｓ、２００７年）かのいずれかであった。凍結したＥＶを洗浄し、１００ｋｇの超遠心分離によってペレット化して、細胞実験の前にＤＭＳＯを除去した。新鮮なＥＶおよび保存したＥＶの間に生物学的活性の差は観察されなかった。ＥＶにおけるタンパク質含量は、ブラッドフォード法を使用して定量した（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）。Ｌｉｍｕｌｕｓアメボサイトアッセイ（濃度＜０．１ｎｇ／ｍｌ）（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して、可能性のあるあらゆる汚染を試験した。ＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＬＭ１０（ＮａｎｏＳｉｇｈｔ Ｌｔｄ、Ｍｉｎｔｏｎ Ｐａｒｋ ＵＫ）を使用して、ＥＶのサイズ分布解析を行った。サンプルにおける粒子はレーザー光源を使用して照明し、カメラによって散乱光を捕捉して、ナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）を使用して解析した。ＮＴＡは、ブラウン運動および拡散係数（Ｄｔ）に従って、自動的に粒子を追跡およびサイズ分類した。
細胞増殖
ＥＶ有りまたは無しのＬＧ条件およびＨＧ条件の両方における細胞増殖を、３人の異なる操作者による直接細胞計数によってアッセイした。
上清からＥＶを回収するために、ＭＳＣおよびＨＬＳＣを、ウシ胎児血清を含まないＥｎｄｏＧＲＯ培地中で２４時間培養した。３０００ｇで３０分間遠心分離してデブリを除去した後、無細胞上清を、１００００および１０００００ｇの分画超遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｏｐｔｉｍａ Ｌ－９０Ｋ ｕｌｔｒａｃｅｔｒｉｆｕｇｅ； Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）に４℃で３時間供した。ＥＶは、新鮮なまま使用したか、または１％ＤＭＳＯを供給されたＤＭＥＭ中の再懸濁後、－８０℃で保存した（Ｄｅｒｅｇｉｂｕｓ、２００７年）かのいずれかであった。凍結したＥＶを洗浄し、１００ｋｇの超遠心分離によってペレット化して、細胞実験の前にＤＭＳＯを除去した。新鮮なＥＶおよび保存したＥＶの間に生物学的活性の差は観察されなかった。ＥＶにおけるタンパク質含量は、ブラッドフォード法を使用して定量した（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）。Ｌｉｍｕｌｕｓアメボサイトアッセイ（濃度＜０．１ｎｇ／ｍｌ）（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して、可能性のあるあらゆる汚染を試験した。ＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＬＭ１０（ＮａｎｏＳｉｇｈｔ Ｌｔｄ、Ｍｉｎｔｏｎ Ｐａｒｋ ＵＫ）を使用して、ＥＶのサイズ分布解析を行った。サンプルにおける粒子はレーザー光源を使用して照明し、カメラによって散乱光を捕捉して、ナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）を使用して解析した。ＮＴＡは、ブラウン運動および拡散係数（Ｄｔ）に従って、自動的に粒子を追跡およびサイズ分類した。
細胞増殖
ＥＶ有りまたは無しのＬＧ条件およびＨＧ条件の両方における細胞増殖を、３人の異なる操作者による直接細胞計数によってアッセイした。
【0018】
ウェスタンブロット解析
以前の報告（Ｏｌｇａｓｉ、２０１４年）の通り、ＭＣを溶解しタンパク質濃度を得た。以前の報告（Ｏｌｇａｓｉ、２０１４年）の通り、５０μｇのタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、ニトロセルロースメンブレンにトランスファーし、処理した。デンシトメトリー解析を使用して、アクチンに対して標準化されたタンパク質レベルの誘導倍率における差を算出した。値は相対量として報告される。
以前の報告（Ｏｌｇａｓｉ、２０１４年）の通り、ＭＣを溶解しタンパク質濃度を得た。以前の報告（Ｏｌｇａｓｉ、２０１４年）の通り、５０μｇのタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、ニトロセルロースメンブレンにトランスファーし、処理した。デンシトメトリー解析を使用して、アクチンに対して標準化されたタンパク質レベルの誘導倍率における差を算出した。値は相対量として報告される。
【0019】
ＲＮＡ単離および定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）
総ＲＮＡは、ＭＣから、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者の指示に従って使用して単離した。ＲＮＡを分光光度的に定量した（Ｎａｎｏｄｒｏｐ ＮＤ－１０００、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ、ＵＳＡ）。その後、細胞からのＲＮＡを、ｍｉＲ－２２２に特異的なＴａｑＭａｎ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ＲＴキット、またはｍｉＲ－２１およびｍｉＲ－１００に特異的なＳｙｂｅｒ Ｇｒｅｅｎ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ＲＴキットを使用して逆転写した。こうして、ＲＮＡは、ＴａｑＭａｎ／Ｓｙｂｅｒ ｍｉｃｒｏＲＮＡアッセイキットおよびＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用するｑＲＴ－ＰＣＲに供された。ｍｉＲ発現は、低分子核ＲＮＡであるＲＮＵ６Ｂに対して標準化した。
総ＲＮＡは、ＭＣから、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者の指示に従って使用して単離した。ＲＮＡを分光光度的に定量した（Ｎａｎｏｄｒｏｐ ＮＤ－１０００、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ、ＵＳＡ）。その後、細胞からのＲＮＡを、ｍｉＲ－２２２に特異的なＴａｑＭａｎ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ＲＴキット、またはｍｉＲ－２１およびｍｉＲ－１００に特異的なＳｙｂｅｒ Ｇｒｅｅｎ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ＲＴキットを使用して逆転写した。こうして、ＲＮＡは、ＴａｑＭａｎ／Ｓｙｂｅｒ ｍｉｃｒｏＲＮＡアッセイキットおよびＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用するｑＲＴ－ＰＣＲに供された。ｍｉＲ発現は、低分子核ＲＮＡであるＲＮＵ６Ｂに対して標準化した。
【0020】
ｐｒｅｍｉＲ－１００およびｐｒｅｍｉＲ－２２２によるＭＣのトランスフェクション
ｐｒｅ－ｍｉＲ陰性対照またはｐｒｅ－ｍｉＲ１００およびｐｒｅｍｉＲ－２２２前駆物質（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のいずれかを、製造者の指示に従ってトランスフェクションされたメサンギウム細胞において、機能獲得実験を行った。その後、これらのサンプルにおける細胞溶解から抽出されたすべてのタンパク質をウェスタンブロットに供し、すべてのＲＮＡをＲＴ－ＰＣＲによって解析した。
ｐｒｅ－ｍｉＲ陰性対照またはｐｒｅ－ｍｉＲ１００およびｐｒｅｍｉＲ－２２２前駆物質（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のいずれかを、製造者の指示に従ってトランスフェクションされたメサンギウム細胞において、機能獲得実験を行った。その後、これらのサンプルにおける細胞溶解から抽出されたすべてのタンパク質をウェスタンブロットに供し、すべてのＲＮＡをＲＴ－ＰＣＲによって解析した。
【0021】
ＥＶからＭＣへのｍｉＲの伝播
ＥＶからＭＣへのｍｉＲ－２２２の伝播を解析するために、Ｙｕａｎによって以前記載されたように（Ｙｕａｎ、２００９年）、ｍｉＲ伝播実験を実施した。５×１０5個の細胞／ウェルのＭＣを、転写阻害剤であるα－アマニチン（Ｌｅｅ、２００４年）と共に、ＲＮＡｓｅで前処理したかまたはしていないＥＶの非存在下または存在下においてインキュベートした。上記のように処理したＭＣからの総ＲＮＡを、ｍｉＲ発現についてｑＲＴ－ＰＣＲに供した。ｍｉＲ伝播の間接的な基準として、本発明者らは、ＲＮＡｓｅで前処理したかまたはしていないＥＶの非存在下または存在下におけるα－アマニチン処理された細胞の間で、Ｃｔ値における差を決定し；正の値は標的細胞内へのｍｉＲの伝播を示した。シグナルが検出されなかった場合は、４０というＣｔ値がサンプルに割り当てられた。
ドミナントネガティブ（ΔＮ）ＳＴＡＴ５Ａ構築物のトランスフェクション。
選択された実験において、ＨＧの存在下または非存在下において４８時間にわたって培養されたＭＣに、ΔＮＳＴＡＴ５構築物を一過的にトランスフェクションした（Ｄｅｆｉｌｉｐｐｉ、２００５年、Ｚｅｏｌｉ、２００８年）。その後、細胞を処理して、ウェスタンブロット解析または総ＲＮＡ単離のための細胞抽出物を得て、ｍｉＲ２１発現を評価した。
老化アッセイ
老化アッセイ。老化は、以前記載されたように（Ｔｏｇｌｉａｔｔｏ、２０１０年）別様に培養されたＮ－ＡＳＣの酸性β－ガラクトシダーゼ活性を測定することによって評価した。
ＥＶからＭＣへのｍｉＲ－２２２の伝播を解析するために、Ｙｕａｎによって以前記載されたように（Ｙｕａｎ、２００９年）、ｍｉＲ伝播実験を実施した。５×１０5個の細胞／ウェルのＭＣを、転写阻害剤であるα－アマニチン（Ｌｅｅ、２００４年）と共に、ＲＮＡｓｅで前処理したかまたはしていないＥＶの非存在下または存在下においてインキュベートした。上記のように処理したＭＣからの総ＲＮＡを、ｍｉＲ発現についてｑＲＴ－ＰＣＲに供した。ｍｉＲ伝播の間接的な基準として、本発明者らは、ＲＮＡｓｅで前処理したかまたはしていないＥＶの非存在下または存在下におけるα－アマニチン処理された細胞の間で、Ｃｔ値における差を決定し；正の値は標的細胞内へのｍｉＲの伝播を示した。シグナルが検出されなかった場合は、４０というＣｔ値がサンプルに割り当てられた。
ドミナントネガティブ（ΔＮ）ＳＴＡＴ５Ａ構築物のトランスフェクション。
選択された実験において、ＨＧの存在下または非存在下において４８時間にわたって培養されたＭＣに、ΔＮＳＴＡＴ５構築物を一過的にトランスフェクションした（Ｄｅｆｉｌｉｐｐｉ、２００５年、Ｚｅｏｌｉ、２００８年）。その後、細胞を処理して、ウェスタンブロット解析または総ＲＮＡ単離のための細胞抽出物を得て、ｍｉＲ２１発現を評価した。
老化アッセイ
老化アッセイ。老化は、以前記載されたように（Ｔｏｇｌｉａｔｔｏ、２０１０年）別様に培養されたＮ－ＡＳＣの酸性β－ガラクトシダーゼ活性を測定することによって評価した。
【0022】
統計解析
すべてのデータは、平均またはパーセンテージ±ｓ．ｅ．ｍとして表す。ダゴスティーノ－ピアソン検定を使用して正規性を検定した。患者および対照におけるバイオメトリック測定に関するデータ、インビトロ血管新生、遊走、接着および老化アッセイに関するデータ、ｍｉＲ発現、細胞増殖、機能欠損および機能獲得実験に関するデータ、ならびに最後にウェスタンブロットについてのデンシトメトリー解析に関するデータを、２群比較についてはスチューデントのｔ検定を使用し、一元配置分散分析を使用して解析し、その後にテューキーの多重比較検定を、３群について行った。三つ組みで行った３回の実験が、実験群間における９０％検定力を、両側仮説で０．０５の確率水準と共に保証する最小のサンプルサイズであった。統計的有意性のためのカットオフは、Ｐ＜０．０５（*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００１）に設定した。すべての統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍのバージョン５．０４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｌａｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して実施した。
すべてのデータは、平均またはパーセンテージ±ｓ．ｅ．ｍとして表す。ダゴスティーノ－ピアソン検定を使用して正規性を検定した。患者および対照におけるバイオメトリック測定に関するデータ、インビトロ血管新生、遊走、接着および老化アッセイに関するデータ、ｍｉＲ発現、細胞増殖、機能欠損および機能獲得実験に関するデータ、ならびに最後にウェスタンブロットについてのデンシトメトリー解析に関するデータを、２群比較についてはスチューデントのｔ検定を使用し、一元配置分散分析を使用して解析し、その後にテューキーの多重比較検定を、３群について行った。三つ組みで行った３回の実験が、実験群間における９０％検定力を、両側仮説で０．０５の確率水準と共に保証する最小のサンプルサイズであった。統計的有意性のためのカットオフは、Ｐ＜０．０５（*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００１）に設定した。すべての統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍのバージョン５．０４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｌａｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して実施した。
【0023】
結果
短期間高グルコース刺激は、メサンギウム細胞（ＭＣ）増殖、ＩＶ型コラーゲン産生およびｍｉＲ２１発現を誘導する。
急性高血糖症媒介性メサンギウム細胞損傷を模倣するために、ＭＣを高グルコース培地（２５ｍＭ）中で４８時間にわたって培養した。増殖および老化を解析した。図１Ａに示されるように、ＨＧはＭＣの増殖において有意な増加を促進するが、これは細胞数によって、およびサイクリンＤ１含量によって示されるとおりである（図１Ｂ）。老化ＭＣの数において変化は検出されなかった（図１Ｃ）。ＭＣコラーゲン産生は、糸球体損傷の特徴である。そこで、ＨＧで刺激されたＭＣにおいて、コラーゲン産生を評価した。細胞の総溶解物および上清の両方に対するウェスタンブロット解析は、低グルコース処理された（ｔｒｅａｄｅｄ）細胞と比較した場合に、ＩＶ型コラーゲン産生において有意な増加を示した（図１ＤおよびＥ）。コラーゲン産生における増加は、線維性分泌性表現型へのＭＣの転換を示している。ＭＣによって既にほとんど産生されていなかったＴＧＦβは、ＨＧ処理によってさらに増加した（図１Ｆ）。糖尿病性腎症に関与するよく知られたｍｉＲＮＡであるｍｉＲ２１は、メサンギウム細胞マトリックスの拡張を誘導することが知られている。これと一致して、ＨＧ処理がｍｉＲ２１発現を誘導することが見出された（図１Ｇ）。このシグナル伝達経路の関与を検討した。本発明者らは、ＨＧで処理されたＭＣにおいてさえ、高レベルのｍＴＯＲを検出することができたことを見出した（図１Ｈ）。
短期間高グルコース刺激は、メサンギウム細胞（ＭＣ）増殖、ＩＶ型コラーゲン産生およびｍｉＲ２１発現を誘導する。
急性高血糖症媒介性メサンギウム細胞損傷を模倣するために、ＭＣを高グルコース培地（２５ｍＭ）中で４８時間にわたって培養した。増殖および老化を解析した。図１Ａに示されるように、ＨＧはＭＣの増殖において有意な増加を促進するが、これは細胞数によって、およびサイクリンＤ１含量によって示されるとおりである（図１Ｂ）。老化ＭＣの数において変化は検出されなかった（図１Ｃ）。ＭＣコラーゲン産生は、糸球体損傷の特徴である。そこで、ＨＧで刺激されたＭＣにおいて、コラーゲン産生を評価した。細胞の総溶解物および上清の両方に対するウェスタンブロット解析は、低グルコース処理された（ｔｒｅａｄｅｄ）細胞と比較した場合に、ＩＶ型コラーゲン産生において有意な増加を示した（図１ＤおよびＥ）。コラーゲン産生における増加は、線維性分泌性表現型へのＭＣの転換を示している。ＭＣによって既にほとんど産生されていなかったＴＧＦβは、ＨＧ処理によってさらに増加した（図１Ｆ）。糖尿病性腎症に関与するよく知られたｍｉＲＮＡであるｍｉＲ２１は、メサンギウム細胞マトリックスの拡張を誘導することが知られている。これと一致して、ＨＧ処理がｍｉＲ２１発現を誘導することが見出された（図１Ｇ）。このシグナル伝達経路の関与を検討した。本発明者らは、ＨＧで処理されたＭＣにおいてさえ、高レベルのｍＴＯＲを検出することができたことを見出した（図１Ｈ）。
【0024】
ＭＳＣおよびＨＬＳＣからのＥＶは、ＭＣにおけるコラーゲン産生およびｍｉＲ２１発現を抑制する
ＥＶを、ＭＳＣ、およびＨＬＳＣから回収し、ＭＣ増殖およびコラーゲン産生に関してアッセイした。こうして、ＬＧまたはＨＧ濃度において４８時間にわたって培養されたＭＣは血清飢餓状態であり、１８時間にわたってＥＶ処理に供した。図２Ａに示されるように、ＥＶはＭＣ増殖に干渉しなかった。しかし、コラーゲン産生を評価した場合、ＭＳＣおよびＨＬＳＣから回収されたＥＶは、コラーゲン産生を有意に減少させた（図２ＢおよびＣ）。これと一致して、ｍｉＲ２１（図２Ｄ）、ｍＴＯＲ（図２Ｅ～Ｆ）およびＴＧＦβの発現の下方制御が検出された（図２Ｇ～Ｈ）。
ＥＶを、ＭＳＣ、およびＨＬＳＣから回収し、ＭＣ増殖およびコラーゲン産生に関してアッセイした。こうして、ＬＧまたはＨＧ濃度において４８時間にわたって培養されたＭＣは血清飢餓状態であり、１８時間にわたってＥＶ処理に供した。図２Ａに示されるように、ＥＶはＭＣ増殖に干渉しなかった。しかし、コラーゲン産生を評価した場合、ＭＳＣおよびＨＬＳＣから回収されたＥＶは、コラーゲン産生を有意に減少させた（図２ＢおよびＣ）。これと一致して、ｍｉＲ２１（図２Ｄ）、ｍＴＯＲ（図２Ｅ～Ｆ）およびＴＧＦβの発現の下方制御が検出された（図２Ｇ～Ｈ）。
【0025】
ＭＳＣおよびＨＬＳＣ由来ＥＶは、ＨＧに供されたＭＣにおいてＳＴＡＴ５Ａ発現を制御する
ＭＳＣおよびＨＬＳＣに由来するＥＶがｍｉＲ２１発現に影響するという観察は、ＳＴＡＴ５Ａがこの制御に関与し得るかどうかを本発明者らが検討するよう導いた。この目的のために、ＥＶの存在下または非存在下においてＨＧで処理されたＭＣを、ＳＴＡＴ５Ａ活性化について解析した。図３Ａに示されるように、ＳＴＡＴ５ＡはＨＧ処理に応答して活性化を経験したが、その効果はＥＶ処理によって抑制された（図３Ｂ～Ｃ）。これらの実験条件において減少したＳＴＡＴ５Ａ発現が検出されたという観察は、ＥＶの内包物がその発現を制御し得る可能性を強く示唆している。この可能性を検討するために、ΔＮＳＴＡＴ５Ａ構築物をＭＣにトランスフェクションし（図３Ｄ）、ｍｉＲ２１発現を解析した。図３Ｅにおいて報告されるように、ＳＴＡＴ５Ａ活性化の抑制は、ＨＧ処理されたＭＣにおけるｍｉＲ２１の下方制御をもたらした。これと一致して、これらの実験条件においてコラーゲン産生を解析した場合、その発現はほぼ完全に抑制されたことが見出された。興味深いことに、ＳＴＡＴ５Ａシグナル伝達経路の抑制が、ＨＧ媒介性ＴＧＦβ発現を、同様に防止することもまた、実証された（図３Ｆ）。
ＭＳＣおよびＨＬＳＣに由来するＥＶがｍｉＲ２１発現に影響するという観察は、ＳＴＡＴ５Ａがこの制御に関与し得るかどうかを本発明者らが検討するよう導いた。この目的のために、ＥＶの存在下または非存在下においてＨＧで処理されたＭＣを、ＳＴＡＴ５Ａ活性化について解析した。図３Ａに示されるように、ＳＴＡＴ５ＡはＨＧ処理に応答して活性化を経験したが、その効果はＥＶ処理によって抑制された（図３Ｂ～Ｃ）。これらの実験条件において減少したＳＴＡＴ５Ａ発現が検出されたという観察は、ＥＶの内包物がその発現を制御し得る可能性を強く示唆している。この可能性を検討するために、ΔＮＳＴＡＴ５Ａ構築物をＭＣにトランスフェクションし（図３Ｄ）、ｍｉＲ２１発現を解析した。図３Ｅにおいて報告されるように、ＳＴＡＴ５Ａ活性化の抑制は、ＨＧ処理されたＭＣにおけるｍｉＲ２１の下方制御をもたらした。これと一致して、これらの実験条件においてコラーゲン産生を解析した場合、その発現はほぼ完全に抑制されたことが見出された。興味深いことに、ＳＴＡＴ５Ａシグナル伝達経路の抑制が、ＨＧ媒介性ＴＧＦβ発現を、同様に防止することもまた、実証された（図３Ｆ）。
【0026】
ＥＶのｍｉＲ内包物は、ＳＴＡＴ５Ａ発現を制御する
ＭＳＣおよびＨＬＳＣのＥＶのｍｉＲ発現解析（ｍｉｒｎｏｍｉｃ）が、以前報告されている（Ｃｏｌｌｉｎｏ、２０１０年）。本発明者らは、そのような細胞起源からのＥＶにおいて発現するｍｉＲが、ＨＧによって活性化されるシグナル伝達経路の制御に関連し得るかどうかを検討した。それらの中でも、ｍｉＲ２２２が含められる。ｍｉＲ２２２は、ＳＴＡＴ５Ａの直接的な転写後制御因子として報告されている。したがって、ｍｉＲ２２２の発現を、ＥＶで処理されたＨＧ培養されたＭＣにおいて評価した。図４Ａに示されるように、ｍｉＲ２２２は、ＨＧ処理に際して下方制御されるが、一方でＥＶ処理に際して増加する。この効果が、ＭＣ内へのＥＶ－ｍｉＲ２２２内容物の放出に依存するということは、アマニチンと、ＲＮＡｓｅで前処理したかまたはしていないＥＶとの存在下で行われた実験によって実証された（図４Ｂ）。これらの結果をさらに確認するために、ｐｒｅｍｉＲ２２２をトランスフェクションし、ＨＧ条件において培養したＭＣを使用して、機能獲得実験を行った。予想どおり、ｍｉＲ２２２の過剰発現は、ＨＧ処理されたＭＣにおいて、ＳＴＡＴ５Ａ含量に加えてｍｉＲ２１の細胞内含量、ＴＧＦβ発現およびコラーゲン産生の劇的な減少をもたらした（図４Ｄ～Ｆ）。より重要なことには、そのような事象は、ＬＧ培養されたＭＣにおいては生じなかったのであるが、これは特定のシグナル伝達経路が、高血糖環境によって誘導されることを示している。
ＭＳＣおよびＨＬＳＣのＥＶのｍｉＲ発現解析（ｍｉｒｎｏｍｉｃ）が、以前報告されている（Ｃｏｌｌｉｎｏ、２０１０年）。本発明者らは、そのような細胞起源からのＥＶにおいて発現するｍｉＲが、ＨＧによって活性化されるシグナル伝達経路の制御に関連し得るかどうかを検討した。それらの中でも、ｍｉＲ２２２が含められる。ｍｉＲ２２２は、ＳＴＡＴ５Ａの直接的な転写後制御因子として報告されている。したがって、ｍｉＲ２２２の発現を、ＥＶで処理されたＨＧ培養されたＭＣにおいて評価した。図４Ａに示されるように、ｍｉＲ２２２は、ＨＧ処理に際して下方制御されるが、一方でＥＶ処理に際して増加する。この効果が、ＭＣ内へのＥＶ－ｍｉＲ２２２内容物の放出に依存するということは、アマニチンと、ＲＮＡｓｅで前処理したかまたはしていないＥＶとの存在下で行われた実験によって実証された（図４Ｂ）。これらの結果をさらに確認するために、ｐｒｅｍｉＲ２２２をトランスフェクションし、ＨＧ条件において培養したＭＣを使用して、機能獲得実験を行った。予想どおり、ｍｉＲ２２２の過剰発現は、ＨＧ処理されたＭＣにおいて、ＳＴＡＴ５Ａ含量に加えてｍｉＲ２１の細胞内含量、ＴＧＦβ発現およびコラーゲン産生の劇的な減少をもたらした（図４Ｄ～Ｆ）。より重要なことには、そのような事象は、ＬＧ培養されたＭＣにおいては生じなかったのであるが、これは特定のシグナル伝達経路が、高血糖環境によって誘導されることを示している。
【0027】
ＥＶ媒介性ｍｉＲ２１下方制御は、コラーゲン産生の抑制に寄与するｍｉＲ１００の転写後活性を促進することができる
本発明者らは、ｍｉＲ１００もまたＥＶ媒介性効果に寄与することができるかどうかを検討した。まず、ｍｉＲ１００発現を、ＥＶ処理に供したＭＣにおいて評価した。図５Ａに示されるように、ｍｉＲ１００のＭＣにおける含量はＨＧ処理に際して増加した一方で、ＥＶ処理後は、その含量における変化を検出することはできなかった。しかし、細胞内ｍｉＲのバランスは特定の生物学的応答を指向させ得るため、本発明者らは、ＥＶ処理に伴って減少したｍｉＲ２１の細胞内含量が、ｍｉＲ１００の転写後活性のためによい働きをし得るという仮説を立てた。この仮説を確認するために、ｐｒｅｍｉＲ１００を使用する機能獲得実験を、ＨＧ処理したＭＣにおいて行った。実際、図５Ｂにおいて報告されたデータは、ｍｉＲ１００発現がｍｉＲ２１と比べて多い場合、これはｍＴＯＲ下方制御によって媒介されるシグナル伝達を駆動することができ、このことが、ＭＣのＴＧＦβ発現およびコラーゲン産生の抑制をもたらすことを実証する（図５Ｃ～Ｄ）。再び、ｍｉＲ１００の過剰発現は、ＬＧ培養されたＭＣに対して影響を及ぼさなかった（図５Ｃ～Ｄ）。総合すると、これらのデータは、ＥＶ処理に伴うレシピエント細胞へのｍｉＲ含量の微調整が、それらの治癒特性にも寄与し得ることを示している。
本発明者らは、ｍｉＲ１００もまたＥＶ媒介性効果に寄与することができるかどうかを検討した。まず、ｍｉＲ１００発現を、ＥＶ処理に供したＭＣにおいて評価した。図５Ａに示されるように、ｍｉＲ１００のＭＣにおける含量はＨＧ処理に際して増加した一方で、ＥＶ処理後は、その含量における変化を検出することはできなかった。しかし、細胞内ｍｉＲのバランスは特定の生物学的応答を指向させ得るため、本発明者らは、ＥＶ処理に伴って減少したｍｉＲ２１の細胞内含量が、ｍｉＲ１００の転写後活性のためによい働きをし得るという仮説を立てた。この仮説を確認するために、ｐｒｅｍｉＲ１００を使用する機能獲得実験を、ＨＧ処理したＭＣにおいて行った。実際、図５Ｂにおいて報告されたデータは、ｍｉＲ１００発現がｍｉＲ２１と比べて多い場合、これはｍＴＯＲ下方制御によって媒介されるシグナル伝達を駆動することができ、このことが、ＭＣのＴＧＦβ発現およびコラーゲン産生の抑制をもたらすことを実証する（図５Ｃ～Ｄ）。再び、ｍｉＲ１００の過剰発現は、ＬＧ培養されたＭＣに対して影響を及ぼさなかった（図５Ｃ～Ｄ）。総合すると、これらのデータは、ＥＶ処理に伴うレシピエント細胞へのｍｉＲ含量の微調整が、それらの治癒特性にも寄与し得ることを示している。
【0028】
（例２）
糖尿病性腎症のインビボモデル：幹細胞由来ＥＶ（ＳＣ－ＥＶ）による処理
異なる幹細胞起源または血清から放出されたＥＶが、実験的糖尿病性腎症における損傷に干渉し得るかどうかを検討するために、実験的研究を実施した。この目的のために、マウスをストレプトゾトシン（ＳＴＺ）処置に供して（連続する４日間にわたって３５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）、高血糖症の動物モデルを作出した。ゼロ時点（Ｔ０）における糖尿病の発症後、糖尿病マウスを、１週に１回のＥＶ処置（各１×１０10個）に５回供した（Ｔ７、Ｔ１４、Ｔ２１およびＴ２８）。糖尿病の発症から１ヶ月後（Ｔ３０、エンドポイント）に、以下のパラメータを測定した：血糖、体重、尿中アルブミン／クレアチニン比、尿中ｐＨ、血漿クレアチニン（ＣＲＥＡ）。さらに、腎臓を以下の組織学的解析に供した：糸球体および間質の線維症、糸球体面積、ボーマン腔、尿細管損傷。得られた結果を図６～８に説明するが、これは以下のマウス群の各々について得られた結果を示している：１０匹の健康なマウス；１５匹の糖尿病マウス（ＤＮ）；１０匹のＭＳＣ－ＥＶ処置したマウス；１０匹の血清ＥＶ処置したマウス；１０匹のＡＳＣ－ＥＶ処置したマウス、および６匹のＨＬＳＣ－ＥＶ処置したマウス。
糖尿病性腎症のインビボモデル：幹細胞由来ＥＶ（ＳＣ－ＥＶ）による処理
異なる幹細胞起源または血清から放出されたＥＶが、実験的糖尿病性腎症における損傷に干渉し得るかどうかを検討するために、実験的研究を実施した。この目的のために、マウスをストレプトゾトシン（ＳＴＺ）処置に供して（連続する４日間にわたって３５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）、高血糖症の動物モデルを作出した。ゼロ時点（Ｔ０）における糖尿病の発症後、糖尿病マウスを、１週に１回のＥＶ処置（各１×１０10個）に５回供した（Ｔ７、Ｔ１４、Ｔ２１およびＴ２８）。糖尿病の発症から１ヶ月後（Ｔ３０、エンドポイント）に、以下のパラメータを測定した：血糖、体重、尿中アルブミン／クレアチニン比、尿中ｐＨ、血漿クレアチニン（ＣＲＥＡ）。さらに、腎臓を以下の組織学的解析に供した：糸球体および間質の線維症、糸球体面積、ボーマン腔、尿細管損傷。得られた結果を図６～８に説明するが、これは以下のマウス群の各々について得られた結果を示している：１０匹の健康なマウス；１５匹の糖尿病マウス（ＤＮ）；１０匹のＭＳＣ－ＥＶ処置したマウス；１０匹の血清ＥＶ処置したマウス；１０匹のＡＳＣ－ＥＶ処置したマウス、および６匹のＨＬＳＣ－ＥＶ処置したマウス。
【0029】
図６は、血漿クレアチニンが糖尿病マウスにおいて増加したこと、および血漿クレアチニンにおける有意な減少が、すべての起源のＥＶによって処置されたマウスにおいて生じたことを示す。図７は、糸球体内および間質腔におけるコラーゲンの沈着の減少という点での有意な改善が、ＥＶで処置された糖尿病マウスにおいて生じたことを示す。図８は、試験されたすべてのＥＶによる処置が、糖尿病マウスと比較して、尿細管損傷における関連する改善をもたらしたことを示す。すべてのデータは平均±ＳＥＭで表される。*ｐ＜０．０５、対ＤＮ、**ｐ＜０．００１対ＤＮ。さらに、すべての起源のＥＶについて、ＡＣＲにおける有意な減少およびｐＨ値における有意な復元が示された。
【0030】
（例３）
幹細胞のトランスフェクションによるｍｉＲＮＡを含む細胞外小胞の濃縮：ＥＶ操作のための方法
幹細胞由来ＥＶにおけるｍｉＲＮＡ含量を濃縮するために、Ｎｅｏｎトランスフェクションシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者の指示に従って使用するエレクトロポレーションによって、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）がトランスフェクションされた。１×１０6個のＭＳＣを濃縮するために、天然に存在するＭＳＣには存在しないミミック、すなわちｃｅｌ－ｍｉＲ－３９を６００ｐｍｏｌ使用し、ＭＳＣは、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加し、抗生物質を含まない完全培地に播種した。陰性対照として、スクランブルミミックを使用した（ＳＣＲ）。
次の日に培地を交換し、トランスフェクションされた細胞を、ＲＰＭＩ有り、ＦＣＳ無しで一晩インキュベートした。上清を回収し、２，０００ｇにおいて１５分間遠心分離して細胞デブリおよびアポトーシス小体を除去し、その後、３ｋＤａの分子量カットオフを備えた超遠心ユニット（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－ＰＬ ３、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、４℃で濃縮した。ＥＶを含有している濃縮培地（ＣＭ）に１％のジメチルスルホキシドを添加し、使用時まで－８０℃で維持した。
幹細胞のトランスフェクションによるｍｉＲＮＡを含む細胞外小胞の濃縮：ＥＶ操作のための方法
幹細胞由来ＥＶにおけるｍｉＲＮＡ含量を濃縮するために、Ｎｅｏｎトランスフェクションシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者の指示に従って使用するエレクトロポレーションによって、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）がトランスフェクションされた。１×１０6個のＭＳＣを濃縮するために、天然に存在するＭＳＣには存在しないミミック、すなわちｃｅｌ－ｍｉＲ－３９を６００ｐｍｏｌ使用し、ＭＳＣは、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加し、抗生物質を含まない完全培地に播種した。陰性対照として、スクランブルミミックを使用した（ＳＣＲ）。
次の日に培地を交換し、トランスフェクションされた細胞を、ＲＰＭＩ有り、ＦＣＳ無しで一晩インキュベートした。上清を回収し、２，０００ｇにおいて１５分間遠心分離して細胞デブリおよびアポトーシス小体を除去し、その後、３ｋＤａの分子量カットオフを備えた超遠心ユニット（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－ＰＬ ３、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、４℃で濃縮した。ＥＶを含有している濃縮培地（ＣＭ）に１％のジメチルスルホキシドを添加し、使用時まで－８０℃で維持した。
【0031】
ＥＶを含有している濃縮培地を、ＰＥＧを使用して４℃で一晩沈殿させることによって、ＲＮＡ解析を実施した。ＥＶペレットを１ＸのＰＢＳで２回洗浄し、ＲＮＡ／ＤＮＡ／Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｋｉｔ（Ｎｏｒｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｋ）を使用してＲＮＡを抽出した。ＲＮＡサンプルを逆転写し、ｍｉＳｃｒｉｐｔ ＰＣＲシステム（Ｑｉａｇｅｎ）によって定量的リアルタイムＰＣＲを行った。ＲＮＵ６ＢまたはＲＮＵ４８を、ハウスキーピング対照（ＣＴＬ）として使用した。標的無し（ｃｅｌ－ｍｉＲ－３９）およびスクランブル無しでエレクトロポレーションに供されたＭＳＣからのＥＶもまた、さらなる対照（ＥＰ）として使用した。
図９は得られた結果を示すが、これはＲＱ（相対量）および倍率変化によって表され、ｑＰＣＲデータ解析の比較法またはΔΔＣT法を適用して、負荷効率を算出することによって得られたものである。
図９は得られた結果を示すが、これはＲＱ（相対量）および倍率変化によって表され、ｑＰＣＲデータ解析の比較法またはΔΔＣT法を適用して、負荷効率を算出することによって得られたものである。
【0032】
ｑＰＣＲデータ解析の比較法またはΔΔＣT法において、２つの異なる実験のＲＮＡサンプルから得られたＣT値は、ハウスキーピング遺伝子に対して直接的に標準化し、その後、比較する。まず、目的の遺伝子およびハウスキーピング遺伝子におけるＣT値の間における差（ΔＣT）を、各実験サンプルについて算出する。その後、実験サンプルおよび対照サンプルの間のΔＣT値における差であるΔΔＣT（すなわち較正）を算出する。
２つのサンプルの間の、目的の遺伝子の発現における倍率変化は、したがって、以下である。
ＲＱ＝２-ΔΔCt
課題の実験において、ＲＱは以下のように算出した：
ΔＣT＝ＣT標的－ＣT参照 （ＣT＝サイクル閾値）
ここで標的はｃｅｌ－ｍｉＲ－３９であり、参照はハウスキーピング対照（ＲＮＵ６ＢまたはＲＮＵ４８）である。
ΔΔＣT＝ΔＣT試験サンプル－ΔＣT較正サンプル、ここで較正サンプルは未処理の細胞に由来するＥＶであり、試験サンプルは、処理した細胞に由来するＥＶである。
２つのサンプルの間の、目的の遺伝子の発現における倍率変化は、したがって、以下である。
ＲＱ＝２-ΔΔCt
課題の実験において、ＲＱは以下のように算出した：
ΔＣT＝ＣT標的－ＣT参照 （ＣT＝サイクル閾値）
ここで標的はｃｅｌ－ｍｉＲ－３９であり、参照はハウスキーピング対照（ＲＮＵ６ＢまたはＲＮＵ４８）である。
ΔΔＣT＝ΔＣT試験サンプル－ΔＣT較正サンプル、ここで較正サンプルは未処理の細胞に由来するＥＶであり、試験サンプルは、処理した細胞に由来するＥＶである。
【0033】
図９は、エレクトロポレーションによって、ＭＳＣにｍｉＲＮＡ分子を効果的に負荷することができ、標的ｍｉＲＮＡ分子は、ＭＳＣそれ自体にも、負荷されたＭＳＣに由来するＥＶにも存在することを示す。ＥＶに負荷された標的ｍｉＲＮＡの量は、ＭＳＣに負荷された標的ｍｉＲＮＡの量のおよそ１００分の１である。
したがって、負荷された標的分子数／ＥＶとして表される負荷効率の合理的な推定は、１×１０3～１×１０5の範囲内に含まれる。
この範囲の上限は、およそ１０4～１０5の範囲の負荷効率を示すＦｕｈｒｍａｎｎら（２０１４年）の図５ａに基づき、種々のタイプのｍｉＲＮＡによるＭＳＣのトランスフェクションに際して得られたＥＶ粒子のＮＴＡ数に基づいている。
したがって、負荷された標的分子数／ＥＶとして表される負荷効率の合理的な推定は、１×１０3～１×１０5の範囲内に含まれる。
この範囲の上限は、およそ１０4～１０5の範囲の負荷効率を示すＦｕｈｒｍａｎｎら（２０１４年）の図５ａに基づき、種々のタイプのｍｉＲＮＡによるＭＳＣのトランスフェクションに際して得られたＥＶ粒子のＮＴＡ数に基づいている。
【0034】
参考文献
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕高血糖症によって引き起こされる線維性疾患の処置における使用のための、マイクロＲＮＡであるｍｉＲ２２２を担持する薬学的に許容可能な担体。
〔２〕マイクロＲＮＡであるｍｉＲ１００をさらに担持する、前記〔１〕に記載の使用のための薬学的に許容可能な担体。
〔３〕薬学的に許容可能な担体がマイクロ粒子またはナノ粒子であり、１種または複数のマイクロＲＮＡが、マイクロ粒子もしくはナノ粒子の内部に含有されているか、またはマイクロ粒子もしくはナノ粒子の表面に付着している、前記〔１〕または〔２〕に記載の使用のための薬学的に許容可能な担体。
〔４〕薬学的に許容可能な担体が細胞外小胞（ＥＶ）である、前記〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の使用のための薬学的に許容可能な担体。
〔５〕薬学的に許容可能な担体が、幹細胞に由来する細胞外小胞（ＥＶ）である、前記〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の使用のための薬学的に許容可能な担体。
〔６〕細胞外小胞（ＥＶ）が成体幹細胞に由来する、前記〔５〕に記載の使用のための薬学的に許容可能な担体。
〔７〕細胞外小胞（ＥＶ）が、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、非卵形ヒト肝臓前駆細胞（ＨＬＳＣ）または脂肪幹細胞（ＡＳＣ）に由来する、前記〔６〕に記載の使用のための薬学的に許容可能な担体。
〔８〕細胞外小胞（ＥＶ）が、天然に存在するＥＶであるか、またはｍｉＲ２２２を含有するように操作されており、ｍｉＲ１００を含有するように操作されていてもよいＥＶである、前記〔４〕から〔７〕のいずれかに記載の使用のための薬学的に許容可能な担体。
〔９〕細胞外小胞（ＥＶ）が、ｍｉＲ２２２およびｍｉＲ１００を含有するように操作されている、前記〔８〕に記載の使用のための薬学的に許容可能な担体。
〔１０〕線維性疾患が、糖尿病性腎症、腎線維症、心筋症、非アルコール性脂肪肝、特にＮＡＳＨ、および糖尿病網膜症からなる群から選択される、前記〔１〕から〔９〕のいずれかに記載の使用のための薬学的に許容可能な担体。
〔１１〕天然に存在する細胞外小胞（ＥＶ）と比較して顕著に多い量のｍｉＲ２２２またはｍｉＲ１００を含有する操作された細胞外小胞（ＥＶ）であって、単離された細胞外小胞に対してｅｘ ｖｉｖｏでｍｉＲ２２２またはｍｉＲ１００を負荷することによって得られる、操作された細胞外小胞（ＥＶ）。
〔１２〕天然に存在する細胞外小胞（ＥＶ）に存在する量よりも多い、分子１×１０ 3 ～×１０ 5 個／ＥＶの間に含まれる量のｍｉＲ２２２またはｍｉＲ１００を含有する、前記〔１１〕に記載の操作された細胞外小胞（ＥＶ）。
〔１３〕ｑＰＣＲデータ解析のΔΔＣ T 法によって測定されると、天然に存在する細胞外小胞（ＥＶ）に存在する量の少なくとも２倍である量のｍｉＲ２２２またはｍｉＲ１００を含有する、前記〔１１〕に記載の操作された細胞外小胞（ＥＶ）。
〔１４〕細胞外小胞が幹細胞または体液から単離されたものである、前記〔１１〕から〔１３〕のいずれかに記載の操作された細胞外小胞（ＥＶ）。
〔１５〕幹細胞が成体幹細胞である、前記〔１４〕に記載の操作された細胞外小胞（ＥＶ）。
〔１６〕ｍｉＲ２２２またはｍｉＲ１００が、ＥＶ内に、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、ウイルス性および非ウイルス性ベクターによるトランスフェクション、磁気アシストトランスフェクション、共インキュベーションおよびソノポレーションからなる群から選択されるトランスフェクション方法によって導入されている、前記〔１１〕から〔１５〕のいずれかに記載の操作された細胞外小胞（ＥＶ）。
〔１７〕高血糖症によって引き起こされる線維性疾患の処置における使用のための、幹細胞の馴化培地から単離された細胞外小胞（ＥＶ）の混合物を含む組成物。
〔１８〕幹細胞が成体幹細胞である、前記〔１７〕に記載の組成物。
〔１９〕成体幹細胞が、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、非卵形ヒト肝臓前駆細胞（ＨＬＳＣ）または脂肪幹細胞（ＡＳＣ）である、前記〔１８〕に記載の組成物。
〔２０〕線維性疾患が、糖尿病性腎症、腎線維症、心筋症および非アルコール性脂肪肝からなる群から選択される、前記〔１７〕から〔１９〕のいずれかに記載の組成物。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕高血糖症によって引き起こされる線維性疾患の処置における使用のための、マイクロＲＮＡであるｍｉＲ２２２を担持する薬学的に許容可能な担体。
〔２〕マイクロＲＮＡであるｍｉＲ１００をさらに担持する、前記〔１〕に記載の使用のための薬学的に許容可能な担体。
〔３〕薬学的に許容可能な担体がマイクロ粒子またはナノ粒子であり、１種または複数のマイクロＲＮＡが、マイクロ粒子もしくはナノ粒子の内部に含有されているか、またはマイクロ粒子もしくはナノ粒子の表面に付着している、前記〔１〕または〔２〕に記載の使用のための薬学的に許容可能な担体。
〔４〕薬学的に許容可能な担体が細胞外小胞（ＥＶ）である、前記〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の使用のための薬学的に許容可能な担体。
〔５〕薬学的に許容可能な担体が、幹細胞に由来する細胞外小胞（ＥＶ）である、前記〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の使用のための薬学的に許容可能な担体。
〔６〕細胞外小胞（ＥＶ）が成体幹細胞に由来する、前記〔５〕に記載の使用のための薬学的に許容可能な担体。
〔７〕細胞外小胞（ＥＶ）が、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、非卵形ヒト肝臓前駆細胞（ＨＬＳＣ）または脂肪幹細胞（ＡＳＣ）に由来する、前記〔６〕に記載の使用のための薬学的に許容可能な担体。
〔８〕細胞外小胞（ＥＶ）が、天然に存在するＥＶであるか、またはｍｉＲ２２２を含有するように操作されており、ｍｉＲ１００を含有するように操作されていてもよいＥＶである、前記〔４〕から〔７〕のいずれかに記載の使用のための薬学的に許容可能な担体。
〔９〕細胞外小胞（ＥＶ）が、ｍｉＲ２２２およびｍｉＲ１００を含有するように操作されている、前記〔８〕に記載の使用のための薬学的に許容可能な担体。
〔１０〕線維性疾患が、糖尿病性腎症、腎線維症、心筋症、非アルコール性脂肪肝、特にＮＡＳＨ、および糖尿病網膜症からなる群から選択される、前記〔１〕から〔９〕のいずれかに記載の使用のための薬学的に許容可能な担体。
〔１１〕天然に存在する細胞外小胞（ＥＶ）と比較して顕著に多い量のｍｉＲ２２２またはｍｉＲ１００を含有する操作された細胞外小胞（ＥＶ）であって、単離された細胞外小胞に対してｅｘ ｖｉｖｏでｍｉＲ２２２またはｍｉＲ１００を負荷することによって得られる、操作された細胞外小胞（ＥＶ）。
〔１２〕天然に存在する細胞外小胞（ＥＶ）に存在する量よりも多い、分子１×１０ 3 ～×１０ 5 個／ＥＶの間に含まれる量のｍｉＲ２２２またはｍｉＲ１００を含有する、前記〔１１〕に記載の操作された細胞外小胞（ＥＶ）。
〔１３〕ｑＰＣＲデータ解析のΔΔＣ T 法によって測定されると、天然に存在する細胞外小胞（ＥＶ）に存在する量の少なくとも２倍である量のｍｉＲ２２２またはｍｉＲ１００を含有する、前記〔１１〕に記載の操作された細胞外小胞（ＥＶ）。
〔１４〕細胞外小胞が幹細胞または体液から単離されたものである、前記〔１１〕から〔１３〕のいずれかに記載の操作された細胞外小胞（ＥＶ）。
〔１５〕幹細胞が成体幹細胞である、前記〔１４〕に記載の操作された細胞外小胞（ＥＶ）。
〔１６〕ｍｉＲ２２２またはｍｉＲ１００が、ＥＶ内に、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、ウイルス性および非ウイルス性ベクターによるトランスフェクション、磁気アシストトランスフェクション、共インキュベーションおよびソノポレーションからなる群から選択されるトランスフェクション方法によって導入されている、前記〔１１〕から〔１５〕のいずれかに記載の操作された細胞外小胞（ＥＶ）。
〔１７〕高血糖症によって引き起こされる線維性疾患の処置における使用のための、幹細胞の馴化培地から単離された細胞外小胞（ＥＶ）の混合物を含む組成物。
〔１８〕幹細胞が成体幹細胞である、前記〔１７〕に記載の組成物。
〔１９〕成体幹細胞が、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、非卵形ヒト肝臓前駆細胞（ＨＬＳＣ）または脂肪幹細胞（ＡＳＣ）である、前記〔１８〕に記載の組成物。
〔２０〕線維性疾患が、糖尿病性腎症、腎線維症、心筋症および非アルコール性脂肪肝からなる群から選択される、前記〔１７〕から〔１９〕のいずれかに記載の組成物。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図1F】
【図1G】
【図1H】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図2G】
【図2H】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図3F】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図4F】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
