特許 7012301 薬物検出システム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-01-20

(45)【発行日】2022-02-14

(54)【発明の名称】薬物検出システム

(51)【国際特許分類】

   G01N 21/76 20060101AFI20220204BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20220204BHJP

【ＦＩ】

G01N21/76

G01N33/50 Z

【請求項の数】 8

(21)【出願番号】P 2017174488

(22)【出願日】2017-09-12

(65)【公開番号】P2019049501

(43)【公開日】2019-03-28

【審査請求日】2020-08-19

(73)【特許権者】

【識別番号】399133707

【氏名又は名称】株式会社八光電機

(73)【特許権者】

【識別番号】504180239

【氏名又は名称】国立大学法人信州大学

(72)【発明者】

【氏名】金 継業

(72)【発明者】

【氏名】高橋 史樹

(72)【発明者】

【氏名】ロイド テイ サー トン

(72)【発明者】

【氏名】柴田 路子

(72)【発明者】

【氏名】原 哲史

【審査官】伊藤 裕美

(56)【参考文献】

【文献】特表２００２－５２５５７７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００４－５１５２３１（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２００６／１３４８７０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開２００６－３２２９４３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開平０６－２１３８６７（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２００６／０００３３８２（ＵＳ，Ａ１）

【文献】高橋 史樹 ほか，電位変調法を利用した電気化学発光によるメタンフェタミンの高感度検出法の開発と応用，日本法科学技術学会第２２回学術集会講演要旨集，2016年10月26日，第21巻 別冊，第42頁(B-08)

【文献】高橋史樹 ，ＥＣＬ原理を利用した迅速・簡便な覚せい剤スクリーニング検査法の開発，科学研究費助成事業 研究成果報告書，https://kaken.nii.ac.jp/ja/file/KAKENHI-PROJECT-15H06243/15H06243seika.pdf

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ２１／００－２１／８３

Ｇ０１Ｎ ３３／４８－３３／９８

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

試料と接触した電極に、周波数が７５～１５０Ｈｚの範囲の連続正弦波を掃引電位として印加する手段と、
前記掃引電位が印加された前記試料から得られる発光シグナルと前記掃引電位の交流サイクルとを同時に取得する手段と、
前記取得した前記発光シグナルと前記交流サイクルとを用いて演算処理し、前記発光シグナルの交流成分を抽出する手段と、
前記交流成分を、メタンフェタミンのパターンと照会し、前記メタンフェタミンを検出する手段と、
を備えることを特徴とする薬物検出システム。

【請求項2】

前記試料が、尿、唾液、血液から選択される試料であることを特徴とする請求項１記載の薬物検出システム。

【請求項3】

前記発光シグナルから、ノイズ成分を除去する手段と、をさらに備えることを特徴とする請求項１－２のいずれか１項記載の薬物検出システム。

【請求項4】

前記連続正弦波の振幅が、２０～１００ｍＶの範囲であることを特徴とする、請求項１－３のいずれか１項記載の薬物検出システム。

【請求項5】

試料と接触した電極に、周波数が７５～１５０Ｈｚの範囲の連続正弦波を掃引電位として印加する工程と、
前記掃引電位が印加された前記試料から得られる発光シグナルと前記掃引電位の交流サイクルとを同時に取得する工程と、
前記取得した前記発光シグナルと前記交流サイクルとを用いて演算処理し、前記発光シグナルの交流成分を抽出する工程と、
前記交流成分を、メタンフェタミンのパターンと照会し、前記メタンフェタミンを検出する工程と、
を備えることを特徴とする薬物検出方法。

【請求項6】

前記試料が、尿、唾液、血液から選択される試料であることを特徴とする請求項５記載の薬物検出方法。

【請求項7】

前記発光シグナルから、ノイズ成分を除去する手段と、をさらに備えることを特徴とする請求項５－６のいずれか１項記載の薬物検出方法。

【請求項8】

前記連続正弦波の振幅が、２０～１００ｍＶの範囲であることを特徴とする、請求項５－７のいずれか１項記載の薬物検出方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、薬物検出システムに関し、詳しくは、電気化学発光を用いて検出対象となる薬物を他の物質と区別して検出する薬物検出システムに関する。

【背景技術】

【0002】

依存性が高く、人間の健康に害をなす不法薬物の濫用は世界的に深刻な課題となっており、とりわけ、アンフェタミン類の薬物は不眠及び食欲不振を誘発する強力な中枢神経系興奮薬（覚醒剤）として認識され取締りの対象となっている。そして、国内に流通するほとんどの覚醒剤は、その主成分がメタンフェタミン（以下「ＭＡ」という。）であることから尿、血液、唾液など生体試料に含まれるＭＡ及びその代謝物であるアンフェタミンを正確に検出することが取締りにおける重要事項となっている。

【0003】

ＭＡの検出には、従来から多くの方法が提案されており、代表的なものとしては、質量分析と組み合わせたガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動法クロマトグラフィー、蛍光光度分析などの機器分析装置を用いた検出方法がある。これらは、高い選択性と感度を有する検出手段ではあるが、前処理及び分析に時間やコストがかかること、また、計測器が大掛りとなることから不法薬物摘発の現場での分析には適用できない。

【0004】

一方、摘発など現場でのＭＡ識別の方法としては、トライエージ（登録商標 権利者：アリーア・サン・ディエゴ・インコーポレイテッド）など尿中乱用薬物検出のためのキットを使用したイムノアッセイ（免役分析法）が用いられているが、これらの検査キットは比較的高価であるという問題があった。また、ＭＡをより安価に検出できる方法として、マルキス試薬・シモン試薬による化学反応による変色を利用した方法が用いられているが、比較的選択性が低いという欠点があった。そのため、より正確にＭＡを検出するための検出原理の異なる方法の開発が求められてきた。

【0005】

そこで、現場での適用と高い選択性 が期待される生物学的試料中の薬物検出手法として電気化学発光（以下、「ＥＣＬ」という。）法が検討されている。
ＥＣＬは、電極反応によって生じた発光化学種が、後続の化学反応によって励起状態となり、発光する現象で（非特許文献１、２）、これを薬物の検出手段として用いることで次のような特長が得られるとされている。（非特許文献２－４）。
・蛍光分光法のような励起光源が不要であることで光源からのバックグランド信号が小さくなる。
・発光が電極反応をトリガーとして引き起こされるため、化学発光に比べてその発光場所や発光時間を容易に制御できる。
・装置が小型であるため、各種現場における、その場での分析が可能となる。
・尿や血液などの半透明な生体試料でも検出器の構成を工夫することで分析が行える。

【0006】

そうした中、本発明者らにより電極電位を直線的に掃引しながらＥＣＬ強度を測定する電位掃引法を用いたＥＣＬによる薬物の検出方法が提案された。そして、この文献のなかで、ＭＡと構造（図２参照）が類似しており、前記したシモン試薬で擬陽性を示すことでＭＡとの同定を困難とする薬剤であって、β２受容体刺激薬に分類され気管支拡張薬として適法に処方されるメトキシフェナミン（以下、ＭＰという。）（図３参照）との区別の将来性が示された。（非引用文献５）

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0007】

【文献】Electrogenerated Chemiluminescence; Dekker: New York, US, 2004.

【文献】Miao, W. Chemical Reviews 2008, 108, 2506-2553.

【文献】Jin, J.; Muroga, M.; Takahashi, F.; Nakamura, T. Bioelectrochemistry 2010, 79, 147-151.

【文献】Takahashi, F.; Jin, J. Analytical and Bioanalytical Chemistry 2009, 393, 1669-1675.

【文献】Fumiki,T.;Saki,N.;Hirosuke,T.;Jiye,J.;Teruo,H. In 54th Annual meeting of the International Association of Forensic Toxicologists :Brisbane, Australia,2016,p249

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

前述のとおり、ＥＣＬ測定による薬物検出は、検出薬物によっては生体試料中の薬物を高い選択性でスクリーニングすることができ、また、比較的小さなシステムに納めることもできることで現場における薬物検出に適合できる可能性を示している。

【0009】

また、非引用文献５によると、ＥＣＬプローブとして一般的なRu(bpy)32+（トリス（２，２－ビピリジン）ルテニウム（ll））を発光種とし、電位掃引法を用いてＥＣＬ測定を行うことにより、生体試料中のＭＡは特定の電圧（１．２Ｖ）に唯ひとつの発光ピークが観測されること、一方、前記したＭＰではＭＡと同一の電圧（１．２Ｖ）のピークとそれより高い電圧（１．４５Ｖ）での２つのピークが観測されることが見出され、このＥＣＬプロフィールの相違を利用することで、該ＥＣＬ測定によりＭＡを選択的にスクリーニングする将来性が示されている。しかし、同時に、この方法では、絶対的なＥＬＣ強度が低いことで、ＭＡとＭＰとのＥＣＬプロフィールの差を明確に区別することは難しく、特に生体試料中のＭＡ濃度が低いレベルであるときは区別が困難であることも示されており、ＭＡ検出において生体試料中にＭＰのような類似する性質をもつ検出妨害物質が含まれる場合には、目的薬物の検出を行う際に悪影響があるといった問題が残されていた。

【0010】

そこで、本発明はＥＣＬを用いた薬物検出の際に、バックグランドノイズを低減させ、観測されるＥＣＬ信号を増幅して該ＥＣＬ強度を強くすることで、薬物を選択的にスクリーニング可能な薬物検出システムを提供することを課題とした。

【0011】

また、構造の類似などによりＥＣＬプロフィールが類似する薬物があっても、また、試料中の濃度が低く検出が困難な薬物であっても、測定されるＥＣＬプロフィールを変えることにより、誤検出を防止し、目的とする検出薬物を特定することができる薬物検出システムを提供することを課題とした。

【課題を解決するための手段】

【0012】

本発明に係る薬物検出システムは、試料と接触した電極に、周波数が７５～１５０Ｈｚの範囲の連続正弦波を掃引電位として印加する手段と、前記掃引電位が印加された前記試料から得られる発光シグナルと、前記掃引電位の交流サイクルとを同時に取得する手段と、前記取得した前記発光シグナルと、前記交流サイクルとを用いて演算処理し、前記発光シグナルの交流成分を抽出する手段と、前記交流成分を、メタンフェタミンのパターンと比較し、前記メタンフェタミンを検出する手段と、を備える。

【0013】

本発明に係る薬物検出システムにおいて用いる、連続正弦波として周期的に変調する掃引電位は、例えば、電極に電位掃引を行う際、掃引する直流電位に連続正弦波の交流電位を重畳することで発生が可能である。連続正弦波として周期的に変調する掃引電位を発生させる方法としては、直流電位を出力するポテンショスタットと、交流電位を出力するファンクションジェネレーターとを直列に接続して構成する方法が例示可能である。また、前記ポテンショスタットと、前記ファンクションジェネレーターの機能とが一体化した電気化学アナライザーによって構成しても良い。

【0014】

本発明に係る薬物検出システムにおいて用いる、発光シグナルの交流成分を抽出する方法としては、例えば、ロックインアンプを用いて、発光シグナルと同時に取得された掃引電位の交流サイクルを参照周波数として、交流成分を抽出する方法が例示可能である。この際、ロックインアンプに内蔵されたローパスフィルタにより、ノイズ成分を除去すると、検出の精度を向上させることが可能となり、好適である。

【0015】

本発明に係る薬物検出システムにおいて、検出対象の薬物としては、メタンフェタミンまたはその代謝物が例示可能であり、この場合、検出に用いる試料としては、尿、唾液、血液から選択される試料が例示可能である。

【0016】

（作用）
ＥＣＬの発光強度は、該発光に関わる化学反応が起こる速度と関係していることが示唆され、対象の化学種によって、掃引速度（電極に印加される電位の変化する速度）とＥＣＬ強度が変化する。そして、本手段の直流電位に交流電位を重畳することにより、電位掃引の間に早い交流電位変化が起こるため、見た目の掃引速度を一時的に大きくすることができる。即ち、検出薬物により発光の原因となる化学反応が起こる速度の違いによって、交流波の電位変化にＥＣＬ反応が追従できず、起こるはずの直流電圧で発光反応が起こらないなどＥＣＬプロフィールの変化が観測できる。

【0017】

ファンクションジェネレーターにより発生させた関数をポテンショスタットと直列に接続すること、あるいは、その機能を持たせた電気化学アナライザーにより所望の直流と交流を重畳した信号を出力することができる。

【0018】

ロックインアンプのローパスフィルタによりノイズを除去すると共に、重畳される交流サイクルとＥＣＬ信号の測定データを同期させて同時に取り込むことで、ロックインアンプは該同期信号から自動的に交流サイクルの１サイクルの最大値と最小値の差を演算し、該１サイクルの最大値と最小値の差を、数サイクル分、または、時間、ロックインアンプで積算して移動平均してアナログ信号として出力することができる。
もしくは、その機能を持たせた電気化学アナライザーをパソコンに接続して演算プログラムを組むことでも実現できる。

【0019】

ロックインアンプまたはパソコン上における演算による信号処理によって、観測されるＥＣＬの交流成分に対応する信号を抽出して検出できることから本測定法によるＥＣＬ応答中のノイズ成分を劇的に低減することができる。

【0020】

本発明に係る薬物検出システムにおいて、検出対象の薬物をＭＡとした場合、連続正弦波の周波数としては、７５～１５０Ｈｚであると望ましく、１００Ｈｚであると更に望ましい。周波数が過度に低く設定した場合、検出対象となるＭＡのＥＣＬ強度がピークとなる電圧において、ＭＰのＥＣＬも比較的強く観測され、その峻別が困難になるおそれがあり、また逆に、周波数が高すぎた場合には、ＭＡ及びＭＰのＥＣＬ強度がピークとなる電圧において、ＭＡ、ＭＰ共にＥＣＬ強度が徐々に減少していく傾向となり、検出に支障が出るおそれがある。

【0021】

本発明に係る薬物検出システムにおいて、検出対象の薬物をＭＡとした場合、連続正弦波の振幅としては、２０～１００ｍＶであると望ましく、５０ｍＶであると更に望ましい。本発明による分析では、振幅が１０ｍＶから２００ｍＶの範囲では、ＭＡのＥＣＬ強度は振幅の大きさに応じて強くなる傾向を示しており、振幅が小さ過ぎると、ＥＣＬ強度が小さくなり分析が困難となる。また逆に、振幅を大きく設定し過ぎると、測定されるＥＣＬの電位の幅が大きくなっていくためＭＰのＥＣＬのピークと重なり、峻別が困難となる懸念が生じる。

【発明の効果】

【0022】

本発明の手段及び作用によると、ＥＣＬによる薬物検出の際にバッググランドノイズが低減されることで、測定される発光信号を増幅することができ、結果、ＥＣＬ強度の相対的な強度を高めることができることにより、検出薬物を選択的にスクリーニングすることができる。

【0023】

また、ＭＡとＭＰのように構造が類似するなどによりＥＣＬプロフィールが近く識別が困難な薬物であっても、また、試料中の濃度が低い薬物であっても電位掃引中に重畳する交流サイクルの周波数等を適当に設定することで、ＥＣＬプロフィールを変えることができ、結果、識別を可能とすることができる。
このように、明確な識別が可能となることで、目的とする検出薬物を大掛りなクロマトグラフー等の装置を用いることなく、一度の測定で特定薬物をスクリーニングできるＥＣＬを用いた薬物の検出システムを提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0024】

【図1】本発明の実施の形態のＥＣＬ測定のための装置システムを示す模式図。

【図2】従来の電位掃引を用いたＥＣＬ測定の結果を示すチャート。

【図3】ＭＡの発光スキームを示す化学反応式。

【図4】ＭＰの発光スキームを示す化学反応式。

【図5】本発明の形態の電位掃引を用いたＥＣＬ測定の結果を示すチャート。

【図6】前記形態で重畳する交流の周波数とＥＣＬ強度の相関を示すグラフ。

【図7】前記形態で重畳する交流の振幅とＥＣＬ強度の相関を示すグラフ。

【図8】前記形態のＭＡ濃度とＥＣＬ強度の相関を示すグラフ。

【発明を実施するための形態】

【0025】

本発明のＥＣＬを用いた薬物検出システムの実施の形態として、該システムによる前述のＭＡとＭＰを例とした検出試験について詳細に説明する。

【0026】

本形態を説明する前に、従来のＭＡとＭＰの電位掃引ＥＣＬについて説明する。図２は、従来の電位掃引ＥＣＬによる測定結果を示しており、上段が電極に掃引する電位プロフィール２１、中段がＭＡの掃引電位（横軸）に対するＥＣＬ発光（縦軸）の結果を示すグラフ２２、下段がＭＰにおける同様のグラフ２３を示している。尚、測定条件は、後述する本発明の形態のシステムによる測定と同様となる、１０μＭのＭＡ（図２の中段（ａ）のとき）あるいはＭＰ（図２の下段（ｂ）のとき）が存在するリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ；ｐＨ９．０）に１００μＭの発光種となるRu(bpy)32+を含む検出液が用いられ、ＤＣ電位掃引２０ｍＶ／ｓ；ＡＣ周波数１００Ｈｚ；ＡＣ振幅５０ｍＶ；ＰＭＴ電圧５００Ｖとして測定された。
また、図３、図４は、ＭＡ及びＭＰと発光種となるRu(bpy)32+のＥＣＬの際の化学反応を示しており、図３がＭＡ、図４がＭＰの反応式である。

【0027】

従来の電位掃引の電位プロフィール２１（図２の上段）は直流のみによる掃引で時間と共に連続して上昇する。ＥＣＬ測定の結果は、ＭＡのＥＣＬ測定では、１．２Ｖに約６００ａ．ｕ．の唯ひとつのピークが観測された。一方、ＭＰのＥＣＬ測定は、１．２Ｖと１．４５Ｖに２つの５００ａ．ｕ．程度のピークが観測され、両方とも５０ａ．ｕ．程度のバックグランドノイズ２４が観測されている。

【0028】

ＥＣＬ測定結果において、ＥＣＬ発光は１．０５Ｖから観測され、ピークはRu(bpy)32+からRu(bpy)33+への酸化電位とほぼ一致する１．２Ｖで観測された。これは、ＭＡとＭＰが類似の二級アミン骨格を有しており、脱プロトンによりアミン群から電子生成される比較的安定的な中間ラジカルをもつためと考えられる。（図３、図４の反応式（１）、（５）参照）

【0029】

そして、発光種である*Ru(bpy)32+は、電気化学的に生成されたRu(bpy)33+（反応式（２）参照）と前記ＭＡ及びＭＰの中間ラジカルの電子交換反応により生成され（反応式（３）、（６））参照）、*Ru(bpy)32+がRu(bpy)32+に戻る際に発光が観測される。（反応式（４）参照）

【0030】

一方、ＭＰでは１．４５Ｖで第二のピークが観測される。これは、ベンジルカチオンラジカルが、比較的高い電位で電気化学的酸化によって発生し、メトキシ基のベンゼン環への電子寄与効果により安定する。これによりＭＰの電気化学的酸化による中間ラジカルは、ＭＡよりも長く存続する。（反応式（７）（８）参照）

【0031】

前述の結果から１．４５Ｖでのピークの違いによる電位掃引ＥＣＬ測定によりＭＡとＭＰを区別可能であることが示されるが、特に、試料溶液中のＭＰ濃度が低い場合などでは、１．２ＶのＥＣＬ信号から完全に切り離すことができず、１．４５ＶのＥＣＬ挙動に由来する高感度の測定は困難であった。

【0032】

次に本実施の形態のシステムによるＭＡ及びＭＰの交流を重畳させての電位掃引ＥＣＬ測定の試験について説明する。
本測定に用いられる生体由来の試料は、ＭＡの標準液を添加した健常なヒトの尿を用い、発光種となるプローブは、ＥＣＬ測定に一般的に用いられるRu(bpy)32+が用いられた。

【0033】

図１は、本形態のシステムによるＥＣＬ測定のための試験装置の模式図である。
本試験装置では、交流信号を重畳するためのファンクションジェネレーター１１と直流電流を出力するポテンショスタット１２を直列に接続して、電位掃引される間、交流信号の微小正弦波を直流に重畳し、変調された電位をＥＣＬセル１３内の電極に印加する。尚、電極への電圧供給は、該ファンクションジェネレーター１１とポテンショスタット１２の機能を一体化した電気化学アナライザーなど電位掃引の間、前記のような電位変調が可能なものであればどの様なシステムを用いても良い。

【0034】

また、ＥＣＬの測定は、暗箱１４内の微小電解ガラスセル中で行い、電極は、グラッシーカーボン作用電極、銀／塩化銀参照電極、及び、白金対極を用いた一般的な３電極方式が用いられ、電極表面からの微弱発光であるＥＣＬは、作用電極から１．０ｍｍ離して向き合う形で設置する信号増幅器ユニットを備えた光電子倍増管１５で検出した。

【0035】

また、ロックインアンプ１６をファンクションジェネレーター１１と光電子倍増管１５に接続して、電極に印加される重畳された周期的な交流電圧の正弦波と、観測されるＥＣＬの発光信号を同期して同時に取り込んだ。そして、観測された発光信号は、プレアンプ１７、ロックインアンプ１６により増幅し、同時に観測されるポテンショスタット１２からの電流信号と共にＡ／Ｄコンバーター１８に入りデジタル化されてコンピューター１９に出力される構成とした。また、ロックインアンプ１６はバッググランドノイズ除去のためのローパスフィルタとしての機能も果たしている。

【0036】

本試験における検出液は次のように調整された。
ＭＡ塩酸塩（大日本住友製薬社製）を添加した尿５．０ ｍＬを試験管に分取し、０．１ moldm-3の水酸化ナトリウム水溶液０．５ ｍＬを添加してアルカリ性とした。

【0037】

この溶液に１．０ｍＬの酢酸エチルを添加し、１０分間振とう機で攪拌した。その後、２０００ ｘ ｇの遠心分離機を用いて、１０分間遠心及び分離を行い、尿と酢酸エチルとを相分離させることで、尿資料中のＭＡを、酢酸エチルに抽出させた。

【0038】

抽出後の酢酸エチルを０．１０ ｍＬ分取し、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）でｐＨを調整した１．０ mmoldm-3のRu(bpy)32+水溶液０．５０ ｍＬ、メタノール０．３０ ｍＬ、を添加し、混合溶媒を調製した。

【0039】

図５は、本形態による交流を重畳し電位変調した電位掃引ＥＣＬの測定結果を示しており、上段が電極に掃引する電位プロフィール５１、中段がＭＡの掃引電位に対するＥＣＬ発光を示すグラフ５２、下段がＭＰでの同様のグラフ５３を示している。尚、測定条件は、それぞれ１０μＭのＭＡ（図５中段（ａ）のとき）及びＭＰ（図５下段（ｂ）のとき）が存在するリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ；ｐＨ９．０）に１００μＭのRu(bpy)32+を含む検出液が用いられ、ＤＣ電位掃引率２０ｍＶ／ｓ；ＡＣ周波数１００Ｈｚ；ＡＣ振幅５０ｍＶ；ＰＭＴ電圧５００Ｖで測定された。

【0040】

本例の電位プロフィール５１（図の上段）は直流に微小な交流が重畳され周期的な正弦波と共に上昇するものとなる。ＥＣＬ測定の結果は、ＭＡのＥＣＬ測定では、前記従来よりも低い電圧の１．１５Ｖで約４５００ａ.ｕ.の唯一のピークが観測される。ＭＰでは従来観測された１．２Ｖのピークがほぼ消され弱いピークとなり、１．４５Ｖに３０００ａ.ｕ.程度の強いピークが観測される。そして、全体として相対的なバックグランドノイズ５４が低減され、また、振れ幅も小さなものとなっている。

【0041】

このように、従来のＥＣＬ測定では２つのピークをもつＭＰのＥＣＬプロフィールの内、ＭＡと重なる１．２Ｖでのピークを無くし、かつ、絶対的な強度を大きく（本例においては、ＭＡで約６００ａ．ｕ．から約４５００ａ.ｕ.）することができ、ＭＡとＭＰのＥＣＬプロフィールを明確に区別することができる。これにより、他の分析を必要とすることなく、１回のＥＣＬ測定によりＭＡを擬陽性なしに検出することができる。

【0042】

ここで、本形態でのＥＣＬ測定で生じたＭＡとＭＰ間のＥＣＬプロフィールの差について説明する。ロックインアンプに取り込まれるＥＣＬ信号と、ファンクションジェネレーターから出力される交流信号とを同期して取り込むことにより、交流電位の印加によって生じるＥＣＬ応答のみを検出することができる。また、他のノイズ成分はロックインアンプ中のローパスフィルタによって除去されるため、高感度の目的成分が達成できる。なお、ロックインアンプによる信号処理はパソコンによる演算によっても、同等の処理及び解析を行うことができる。

【0043】

また、ＭＰのＥＣＬプロフィールにおいて１．２Ｖのピークがほぼ消失するのは、ＭＡ及びＭＰとRu(bpy)32+の化学反応速度に起因する。
図６は、変調する交流の周波数の違いによるＭＡ及びＭＰのＥＣＬ強度の相関を示し、（Ａ）が１．１５Ｖ、（Ｂ）が１．４５Ｖのグラフを示す。尚、本測定の条件はそれぞれ１００μＭのＭＡ（ａ）あるいはＭＰ（ｂ）が存在するリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ；ｐＨ９．０）に１００μＭのRu(bpy)32+を含む検出液が用いられ、ＤＣ電位掃引速度２０ｍＶ／ｓ；ＡＣ振幅５０ｍＶで測定された。

【0044】

１．１５Ｖと１．４５Ｖでの重畳する周波数に対するＥＣＬ強度の依存は、１．１５Ｖでは、５Ｈｚ～２００Ｈｚの間でＭＡに強く安定したＥＣＬ信号が観測され、後は徐々に低下する。一方、ＭＰのＥＬＣ強度は、変調周波数を増加させると急速に減少し、周波数が１００Ｈｚではわずかしか観測されない。これは、ＥＣＬ強度の変調周波数への依存は化学反応速度と関係しているためで、前述の通り反応式（３）の反応速度は比較的早いため、ＭＡでは交流周波数が高い場合でもＥＣＬ反応が追い付いており、ＥＣＬ信号が検出できると考えられる。一方、ＭＰの場合では反応式（６）の反応速度が遅いため、ＥＣＬ反応が早い交流電位の変化に追いつかず、見た目上、交流電位の印加によるＥＣＬ信号の変化が観測できず、１．１５Ｖでは発光が起こらないと考えられる。

【0045】

これに対して、１．４５ＶのＥＣＬはＭＰのみで観測された。ＥＣＬ強度は変調周波数５Ｈｚ～１００Ｈｚで比較的安定して観測される。これは、反応式（８）の反応速度が速いことに起因する。

【0046】

この結果は、ＭＡとＭＰの選択的検出が変調したＥＣＬ測定によりできることを示している。また、変調する交流の周波数として１００Ｈｚが適当であることを示している。ここで、変調周波数が１００Ｈｚから小さくなっていくと１．１５ＨｚでＭＰのＥＣＬが観測されてしまい、一方、大きくなっていくと、１．１５ＶでＥＣＬ強度が徐々に低下し、１．４５ＶでのＥＣＬ強度も小さくなることも示された。

【0047】

図７は、ＭＡについての変調する交流の振幅の違いによるＥＣＬ強度の相関を示しており、大きなグラフは振幅の違いによる電位掃引中のＥＣＬ強度のチャート（１０ｍＶ（７１）、２０ｍＶ（７２）、５０ｍＶ（７３)、１００ｍＶ（７４））、小さなグラフ（７５）は１．１５Ｖにおける振幅とＥＣＬ強度の相関を示すグラフである。尚、本測定の条件はそれぞれ、１００μＭのＭＡが存在するリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ；ｐＨ９．０）に１００μＭのRu(bpy)32+を含む検出液が用いられ、ＤＣ電位掃引速度は２０ｍＶ／ｓ；ＡＣ周波数は１００Ｈｚとし手測定した。

【0048】

ＥＣＬ強度は、グラフに示すとおり１００ｍＶまでＡＣ振幅の増加により劇的に増加し、１００ｍＶを超えると段階的に増加する。また、ＡＣ振幅を大きくすると、電位－ＥＣＬ曲線のピークの幅が広がる結果となった。例えば１００ｍＶ（７４）に設定すると、０．９Ｖから１．４５Ｖ程度までＥＣＬ信号が観測されてしまう。よって、ＡＣ振幅を大きく設定しすぎるとＭＡとＭＰとの識別を困難なものとなる懸念がある。また、小さく設定しすぎるとＥＣＬの絶対強度が低いため、ＭＡ検出のために５０ｍＶを適当な振幅として選定した。

【0049】

図８は、ＭＡ濃度に対するＥＣＬ強度の相関を示すグラフで、大きなグラフが濃度の違いによる変調された電位掃引によるＥＣＬ強度のチャート（０ｎｍ（８１）、１００ｎｍ（８２）、５００ｎｍ（８３）、１０００ｎｍ（８４）、２５００ｎｍ（８５））で、小さなグラフがＭＡ濃度とＥＣＬ強度の相関を示すグラフ８６である。尚、本測定の条件は、ＤＣ電位掃引速度；２０ｍＶ／ｓ；ＡＣ振幅；５０ｍＶ、周波数；１００Ｈｚで測定された。また、試料は健常者の尿にＭＡを添加したものが用いられた。

【0050】

１．１５ＶのピークのＥＣＬ強度は、０．１０μＭ～２．５μＭでＭＡ濃度と比例する直線状を示す良好な相関関係を示した。本試験結果では、ｒ2＝０．９９８であった。また、ＭＡの検出限界は５ｍｌの尿サンプルで０．０５０μＭ（７．５ｎｇ／ｍｌ）であった。

【0051】

前記実施の形態は一例であり、ＭＡの他にも本発明の変調された電位掃引によるＥＣＬにより様々な物質の選択的な検出が可能となる。

【符号の説明】

【0052】

１１． ファンクションジェネレーター
１２． ポテンショスタット
１３． ＥＣＬセル
１４． 暗箱
１５． 光電子倍増管
１６． ロックインアンプ
１７． プリアンプ
１８． Ａ／Ｄコンバーター
１９． パソコン

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】