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特許7012363がん患者におけるＦＳＴＬ１阻害剤による治療効果を予測するためのバイオマーカー
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-01-20
(45)【発行日】2022-01-28
(54)【発明の名称】がん患者におけるＦＳＴＬ１阻害剤による治療効果を予測するためのバイオマーカー
(51)【国際特許分類】
G01N 33/68 20060101AFI20220121BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20220121BHJP
G01N 33/574 20060101ALI20220121BHJP
C07K 14/82 20060101ALI20220121BHJP
C12Q 1/06 20060101ALI20220121BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20220121BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20220121BHJP
C07K 16/32 20060101ALI20220121BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20220121BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220121BHJP
【ＦＩ】
G01N33/68
G01N33/53 Y
G01N33/574 A
C07K14/82
C12Q1/06
C07K14/705
C07K16/28
C07K16/32
A61K45/00
A61P35/00
【請求項の数】
13
(21)【出願番号】P 2018531930
(86)(22)【出願日】2017-08-01
(86)【国際出願番号】 JP2017027916
(87)【国際公開番号】W WO2018025869
(87)【国際公開日】2018-02-08
【審査請求日】2020-06-05
(31)【優先権主張番号】P 2016151552
(32)【優先日】2016-08-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】500101243
【氏名又は名称】株式会社ファーマフーズ
(74)【代理人】
【識別番号】100077012
【弁理士】
【氏名又は名称】岩谷 龍
(72)【発明者】
【氏名】工藤 千恵
(72)【発明者】
【氏名】豊浦 雅義
(72)【発明者】
【氏名】石田 有希子
(72)【発明者】
【氏名】庄屋 雄二
【審査官】三木 隆
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２００９／０２８４１１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１２／１３３０４７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０１５－１１１１５５（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１５／０２９０２８９（ＵＳ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１６／１３３０５９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】KUDO-SAITO Chie， Targeting FSTL1 Prevents Tumor Bone Metastasis and Consequent Immune Dysfunction，Cancer Res，2013年10月15日，Vol.73 No.20，Page.6185-6193
【文献】OUCHI Noriyuki，DIP2A Functions as a FSTL1 Receptor，J Biol Chem，2010年03月05日，Vol.285 No.10，Page.7127-7134
【文献】TANAKA Masao，DIP2 disco-interacting protein 2 homolog A (Drosophila) is a candidate receptor for follistatin-rela，FEBS J，2010年10月，Vol.277 No.20，Page.4278-4289
【文献】佐藤工，抗癌療法としての免疫チェックポイント阻害剤の効果予測因子の同定，聖マリアンナ医科大学雑誌，2016年03月，Vol.43 No.4，Page.237-243
【文献】工藤千恵，抗FSTL1抗体による効果的な骨転移阻害，日本がん転移学会学術集会・総会プログラム抄録集，2015年，Vol.24th，Page.63 W6-2
【文献】BAE Kieun，FSTL1 inhibition induces mitotic cell death associated with up-regulated cleaved Mcl-1 and c-Jun in，日本癌学会学術総会抄録集，2014年，Vol.73rd，Page.P-3106
【文献】HENNMI Marina，小児がん治療においてFSTL1阻害が有用である可能性，日本癌学会学術総会抄録集，2016年，Vol.75th，Page.ROMBUNNO.J-1006
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ３３／６８
Ｇ０１Ｎ ３３／５３
Ｇ０１Ｎ ３３／５７４
Ｃ０７Ｋ １４／８２
Ｃ１２Ｑ １／０６
Ｃ０７Ｋ １４／７０５
Ｃ０７Ｋ １６／２８
Ｃ０７Ｋ １６／３２
Ａ６１Ｋ ４５／００
Ａ６１Ｐ ３５／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
がん患者におけるＦＳＴＬ１阻害剤による奏功性の判定を補助する方法であって、（１）患者から採取した試料におけるＦＳＴＬ１およびＤＩＰ２Ａの発現レベルを測定する工程、
（２）測定値を基準値と比較する工程、および
（３）測定値が基準値より高い患者を選択する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項2】
試料が、患者のがん細胞を含む試料または患者の血液である請求項１に記載の方法。
【請求項3】
患者のがん細胞を含む試料が、生検がん組織または切除手術で得られたがん組織である請求項２に記載の方法。
【請求項4】
工程（１）において、生検がん組織または切除手術で得られたがん組織におけるＦＳＴＬ１およびＤＩＰ２Ａの発現レベルと、血中ＦＳＴＬ１濃度を測定することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項5】
工程（１）において、発現レベルを免疫組織化学的に測定することを特徴とする請求項１～４のいずれかに記載の方法。
【請求項6】
がん患者に対するＦＳＴＬ１阻害剤の投与開始の判定を補助する方法であって、（１）患者から採取した試料におけるＦＳＴＬ１およびＤＩＰ２Ａの発現レベルを測定する工程、
（２）測定値を基準値と比較する工程、および
（３）測定値が基準値より高い患者を選択する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項7】
試料が、患者のがん細胞を含む試料または患者の血液である請求項６に記載の方法。
【請求項8】
患者のがん細胞を含む試料が、生検がん組織または切除手術で得られたがん組織である請求項７に記載の方法。
【請求項9】
工程（１）において、生検がん組織または切除手術で得られたがん組織におけるＦＳＴＬ１およびＤＩＰ２Ａの発現レベルと、血中ＦＳＴＬ１濃度を測定することを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項10】
工程（１）において、生検がん組織または切除手術で得られたがん組織におけるＦＳＴＬ１およびＤＩＰ２Ａの発現レベルと、血中ＤＩＰ２Ａ可溶型濃度を測定することを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項11】
工程（１）において、発現レベルを免疫組織化学的に測定することを特徴とする請求項６～１０のいずれかに記載の方法。
【請求項12】
がん患者におけるＦＳＴＬ１阻害剤による治療効果を予測するためのキットであって、患者から採取した試料中のＦＳＴＬ１およびＤＩＰ２Ａの発現レベルを測定するための試薬を含むキット。
【請求項13】
前記試薬が、抗ＦＳＴＬ１抗体、抗ＤＩＰ２Ａ抗体、ＦＳＴＬ１のＲＴ－ＰＣＲ用プライマーセットおよびＤＩＰ２ＡのＲＴ－ＰＣＲ用プライマーセットから選択される１種又は２種以上を含む請求項１２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、がん患者におけるＦＳＴＬ１阻害剤による治療効果を予測する方法、がん患者に対するＦＳＴＬ１阻害剤の投与開始を決定する方法、およびがん患者におけるＦＳＴＬ１阻害剤による治療効果を予測するためのキットに関するものである。
【背景技術】
【0002】
コンパニオン診断は、医薬品の効果や副作用に関与するバイオマーカーを医薬品の投薬前に検査し、医薬品に対する患者個人の反応性を治療前に予測することで、最適な投薬を補助することを目的とする。検査法に制限はなく、遺伝子異常検査、遺伝子発現検査、タンパク質や代謝物質などの組織検査や血液成分検査などが用いられる。世界中の製薬企業で新規医薬品の開発と同時に、バイオマーカーによるコンパニオン診断法の開発が行われている。がん分野では、免疫チェックポイント阻害剤によるがん免疫療法、がんワクチン療法などの革新的な治療法の開発が進展しており、特定の医薬品の有効性や副作用発現の個人差を把握し、投薬妥当性や投薬量決定を補助する適切なコンパニオン診断法の確立は、今後も新規抗がん剤研究開発の益々重要な課題である。
【0003】
がんが悪化する原因として免疫抑制が知られるようになり、免疫抑制を解除するとがんの効果的な治療につながるとして、免疫チェックポイント阻害剤などによるがん免疫療法の研究開発が大きく進展している。特許文献１では、免疫抑制に関与する分子の一つとしてＦＳＴＬ１（Follistatin-like Protein 1）が同定され、ＦＳＴＬ１の阻害剤が有用な抗がん剤となり得るとの報告がなされた。これまでの研究により、ＦＳＴＬ１は、がん細胞およびがん関連の間葉系幹細胞（mesenchymal stem cell、以下「ＭＳＣ」と記す）から分泌され、オートクラインにＭＳＣに作用し、ＭＳＣの増殖を促進し、Ｔ細胞免疫制御系を介して免疫抑制を誘導し、癌悪化の原因となること、さらに、ＦＳＴＬ１は癌細胞の転移性、特に骨転移性獲得も誘導することが明らかになっている（非特許文献１）。
【0004】
ＦＳＴＬ１は主に関節炎の関節マトリクスにおいて分泌され、このＦＳＴＬ１分泌はＩＬ－１βにより促進されること、およびＦＳＴＬ１が全身型若年性関節リウマチの有用なバイオマーカーになり得ることが報告されており（非特許文献２）、若年性関節リウマチや川崎病等の炎症性疾患のバイオマーカーとしてのＦＳＴＬ１が特許出願されている（特許文献２および３）。
【0005】
ＦＳＴＬ１は、細胞膜を介する各種受容体（ＦＳＴＬ１受容体）に結合し、種々の生理作用に影響している（非特許文献３）。なかでも、ＤＩＰ２Ａ（disco-interacting protein 2 homolog A）は、各種組織の内皮細胞膜に存在するＦＳＴＬ１受容体であり（非特許文献４）、ヒトのタンパク質発現情報データベース（Human Protein Atlas）によれば、正常組織では、平滑筋、女性生殖器、消化管など一部の組織で発現が見られ、がん組織では、大腸がん、乳がん、前立腺がん、肺ガン、肝ガンなどで検出されている。
【0006】
がん治療の課題のひとつは、発見された腫瘍について、転移性の高い悪性腫瘍かどうかを生検で鑑別し、原発巣ばかりでなく、転移の有無や可能性も踏まえて、適切な治療方針を決定することである。ＦＳＴＬ１阻害剤である抗ＦＳＴＬ１抗体は、免疫破綻を誘導するＭＳＣを阻害するばかりでなく、癌細胞の転移を阻害することから、転移しやすい悪性腫瘍に対する効果的な抗がん剤となることが期待されている。さらに、抗ＦＳＴＬ１抗体によるがん治療薬開発に伴い、抗ＦＳＴＬ１抗体による治療の有効性等のコンパニオン診断に有用なバイオマーカーの開発が強く望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【文献】国際公開第２００９／０２８４１１号
【文献】国際公開第２００９／０９７４２４号
【文献】国際公開第２０１２／０１９０９９号
【非特許文献】
【0008】
【文献】Chie Kudo-Saito et al. Targeting FSTL1 Prevents Tumor Bone Metastasis and Consequent Immune Dysfunction. Cancer Rec. 2013 Oct 15; 73 (20): 6185-93.
【文献】David C. Wilson et al. Follistatin-like-protein-1 is a mesenchyme-derived inflammatory protein and may represent a biomarker for systemic-onset juvenile rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 2010 August ; 62(8): 2510-2516.
【文献】M. Sylva et al. Follistatin-like 1 in Vertebrate Development. Birth Defects Research (Part C) 99:61-69 (2013)
【文献】Ouchi N, Asaumi Y, Ohashi K et al. DIP2A functions as a FSTL1 receptor, J Biol Chem, 2010; 285: 7127-7134.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明は、ＦＳＴＬ１阻害剤による治療効果が期待できるがん患者を選択するためのコンパニオン診断に有用なバイオマーカーを見出し、がん患者におけるＦＳＴＬ１阻害剤による治療効果を予測する方法、がん患者に対するＦＳＴＬ１阻害剤の投与開始を決定する方法、およびがん患者におけるＦＳＴＬ１阻害剤による治療効果を予測するためのキットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明は、上記の課題を解決するために以下の各発明を包含する。
［１］がん患者におけるＦＳＴＬ１阻害剤による治療効果を予測する方法であって、
（１）患者から採取した試料におけるＦＳＴＬ１および／またはＤＩＰ２Ａの発現レベルを測定する工程、
（２）測定値を基準値と比較する工程、および
（３）測定値が基準値より高い場合に治療効果が期待できると判定する工程、
を含むことを特徴とする方法。
［２］工程（１）において、ＦＳＴＬ１とＤＩＰ２Ａの両方の発現レベルを測定することを特徴とする前記［１］に記載の方法。
［３］試料が、患者のがん細胞を含む試料または患者の血液である前記［１］または［２］に記載の方法。
［４］患者のがん細胞を含む試料が、生検がん組織または切除手術で得られたがん組織である前記［３］に記載の方法。
［５］工程（１）において、生検がん組織または切除手術で得られたがん組織におけるＦＳＴＬ１および／またはＤＩＰ２Ａの発現レベルと、血中ＦＳＴＬ１濃度を測定することを特徴とする前記［１］に記載の方法。
［６］工程（１）において、発現レベルを免疫組織化学的に測定することを特徴とする前記［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］がん患者に対するＦＳＴＬ１阻害剤の投与開始を決定する方法であって、
（１）患者から採取した試料におけるＦＳＴＬ１および／またはＤＩＰ２Ａの発現レベルを測定する工程、
（２）測定値を基準値と比較する工程、および
（３’）測定値が基準値より高い場合にＦＳＴＬ１阻害剤の投与開始を決定する工程、
を含むことを特徴とする方法。
［８］工程（１）において、ＦＳＴＬ１とＤＩＰ２Ａの両方の発現レベルを測定することを特徴とする前記［７］に記載の方法。
［９］試料が、患者のがん細胞を含む試料または患者の血液である前記［７］または［８］に記載の方法。
［１０］患者のがん細胞を含む試料が、生検がん組織または切除手術で得られたがん組織である前記［９］に記載の方法。
［１１］工程（１）において、生検がん組織または切除手術で得られたがん組織におけるＦＳＴＬ１および／またはＤＩＰ２Ａの発現レベルと、血中ＦＳＴＬ１濃度を測定することを特徴とする前記［７］に記載の方法。
［１２］工程（１）において、生検がん組織または切除手術で得られたがん組織におけるＦＳＴＬ１および／またはＤＩＰ２Ａの発現レベルと、血中ＤＩＰ２Ａ可溶型濃度を測定することを特徴とする前記［７］に記載の方法。
［１３］工程（１）において、発現レベルを免疫組織化学的に測定することを特徴とする前記［７］～［１２］のいずれかに記載の方法。
［１４］がん患者におけるＦＳＴＬ１阻害剤による治療効果を予測するためのキットであって、患者から採取した試料中のＦＳＴＬ１および／またはＤＩＰ２Ａの発現レベルを測定するための試薬を含むキット。
［１５］前記試薬が、抗ＦＳＴＬ１抗体、抗ＤＩＰ２Ａ抗体、ＦＳＴＬ１のＲＴ－ＰＣＲ用プライマーセットおよびＤＩＰ２ＡのＲＴ－ＰＣＲ用プライマーセットから選択される１種又は２種以上を含む前記［１４］に記載のキット。
［１］がん患者におけるＦＳＴＬ１阻害剤による治療効果を予測する方法であって、
（１）患者から採取した試料におけるＦＳＴＬ１および／またはＤＩＰ２Ａの発現レベルを測定する工程、
（２）測定値を基準値と比較する工程、および
（３）測定値が基準値より高い場合に治療効果が期待できると判定する工程、
を含むことを特徴とする方法。
［２］工程（１）において、ＦＳＴＬ１とＤＩＰ２Ａの両方の発現レベルを測定することを特徴とする前記［１］に記載の方法。
［３］試料が、患者のがん細胞を含む試料または患者の血液である前記［１］または［２］に記載の方法。
［４］患者のがん細胞を含む試料が、生検がん組織または切除手術で得られたがん組織である前記［３］に記載の方法。
［５］工程（１）において、生検がん組織または切除手術で得られたがん組織におけるＦＳＴＬ１および／またはＤＩＰ２Ａの発現レベルと、血中ＦＳＴＬ１濃度を測定することを特徴とする前記［１］に記載の方法。
［６］工程（１）において、発現レベルを免疫組織化学的に測定することを特徴とする前記［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］がん患者に対するＦＳＴＬ１阻害剤の投与開始を決定する方法であって、
（１）患者から採取した試料におけるＦＳＴＬ１および／またはＤＩＰ２Ａの発現レベルを測定する工程、
（２）測定値を基準値と比較する工程、および
（３’）測定値が基準値より高い場合にＦＳＴＬ１阻害剤の投与開始を決定する工程、
を含むことを特徴とする方法。
［８］工程（１）において、ＦＳＴＬ１とＤＩＰ２Ａの両方の発現レベルを測定することを特徴とする前記［７］に記載の方法。
［９］試料が、患者のがん細胞を含む試料または患者の血液である前記［７］または［８］に記載の方法。
［１０］患者のがん細胞を含む試料が、生検がん組織または切除手術で得られたがん組織である前記［９］に記載の方法。
［１１］工程（１）において、生検がん組織または切除手術で得られたがん組織におけるＦＳＴＬ１および／またはＤＩＰ２Ａの発現レベルと、血中ＦＳＴＬ１濃度を測定することを特徴とする前記［７］に記載の方法。
［１２］工程（１）において、生検がん組織または切除手術で得られたがん組織におけるＦＳＴＬ１および／またはＤＩＰ２Ａの発現レベルと、血中ＤＩＰ２Ａ可溶型濃度を測定することを特徴とする前記［７］に記載の方法。
［１３］工程（１）において、発現レベルを免疫組織化学的に測定することを特徴とする前記［７］～［１２］のいずれかに記載の方法。
［１４］がん患者におけるＦＳＴＬ１阻害剤による治療効果を予測するためのキットであって、患者から採取した試料中のＦＳＴＬ１および／またはＤＩＰ２Ａの発現レベルを測定するための試薬を含むキット。
［１５］前記試薬が、抗ＦＳＴＬ１抗体、抗ＤＩＰ２Ａ抗体、ＦＳＴＬ１のＲＴ－ＰＣＲ用プライマーセットおよびＤＩＰ２ＡのＲＴ－ＰＣＲ用プライマーセットから選択される１種又は２種以上を含む前記［１４］に記載のキット。
【0011】
本発明はまた、以下の態様も包含する。
［１６］がん患者におけるＦＳＴＬ１阻害剤による治療効果を予測するための、ＦＳＴＬ１および／またはＤＩＰ２Ａの使用。
［１７］がん患者に対するＦＳＴＬ１阻害剤の投与開始を決定するための、ＦＳＴＬ１および／またはＤＩＰ２Ａの使用。
［１８］がん患者から採取した試料におけるＦＳＴＬ１および／またはＤＩＰ２Ａの発現レベルを測定することを特徴とする、がんに対するＦＳＴＬ１阻害剤の治療効果に関する情報を提供する方法。
［１９］がん患者から採取した試料におけるＦＳＴＬ１および／またはＤＩＰ２Ａの発現レベルを測定することを特徴とする、前記がん患者にＦＳＴＬ１阻害剤投与を開始する時期の情報を提供する方法。
［１６］がん患者におけるＦＳＴＬ１阻害剤による治療効果を予測するための、ＦＳＴＬ１および／またはＤＩＰ２Ａの使用。
［１７］がん患者に対するＦＳＴＬ１阻害剤の投与開始を決定するための、ＦＳＴＬ１および／またはＤＩＰ２Ａの使用。
［１８］がん患者から採取した試料におけるＦＳＴＬ１および／またはＤＩＰ２Ａの発現レベルを測定することを特徴とする、がんに対するＦＳＴＬ１阻害剤の治療効果に関する情報を提供する方法。
［１９］がん患者から採取した試料におけるＦＳＴＬ１および／またはＤＩＰ２Ａの発現レベルを測定することを特徴とする、前記がん患者にＦＳＴＬ１阻害剤投与を開始する時期の情報を提供する方法。
【発明の効果】
【0012】
本発明により、がん患者におけるＦＳＴＬ１阻害剤による治療効果を予測する方法、がん患者に対するＦＳＴＬ１阻害剤の投与開始を決定する方法、およびがん患者におけるＦＳＴＬ１阻害剤による治療効果を予測するためのキットを提供することができる。
【0013】
また、本発明により、がん患者におけるＦＳＴＬ１阻害剤による治療効果を予測することが可能になることから、ひいては、がん関連疾患における治療効果も予測することが可能になる。がん関連疾患としては、がんになる可能性の高い疾患やがんを増悪する疾患であり、例えば、肥満、糖尿病、リウマチなどが挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】ヒト膵がん細胞株Ｐａｎｃ１の空ベクター導入細胞株（Panc1-mock）、ヒト膵がん細胞株Ｐａｎｃ１のＳｎａｉｌ強制発現細胞株（Panc1-snail+）、ヒト乳がん低転移性細胞株ＭＣＦ７およびヒト乳がん高骨転移性細胞株ＭＤＡ２３１におけるＦＳＴＬ１とＤＩＰ２Ａの発現を免疫組織蛍光染色により解析した結果を示す図である。
【図2】マウスメラノーマＢ１６－Ｆ１０の空ベクター導入細胞株（F10-mock）、マウスメラノーマＢ１６－Ｆ１０のＳｎａｉｌ強制発現細胞株（F10-snail+）、マウス大腸がん細胞株ＣＴ２６およびマウス肺がん細胞株３ＬＬにおけるＦＳＴＬ１とＤＩＰ２Ａの発現を免疫組織蛍光染色により解析した結果を示す図である。
【図3】マウスメラノーマＢ１６－Ｆ１０のＳｎａｉｌ強制発現細胞移植骨転移モデルに抗ＦＳＴＬ１抗体を投与し、皮下腫瘍増殖に対する阻害効果を評価した結果を示す図である。
【図4】マウスメラノーマＢ１６－Ｆ１０のＳｎａｉｌ強制発現細胞移植骨転移モデルに抗ＦＳＴＬ１抗体を投与し、骨転移に対する効果（左）、ＭＳＣ増加に対する効果（中央）および体重減少に対する抑制効果（右）を評価した結果を示す図である。
【図5】マウス大腸がんＣＴ２６細胞移植骨転移モデルに抗ＦＳＴＬ１抗体を投与し、皮下腫瘍増殖に対する阻害効果を評価した結果を示す図である。
【図6】マウス大腸がんＣＴ２６細胞移植骨転移モデルに抗ＦＳＴＬ１抗体を投与し、肺転移に対する抑制効果を評価した結果を示す図である。
【図7】マウス肺がん３ＬＬ細胞移植骨転移モデルに抗ＦＳＴＬ１抗体を投与し、皮下腫瘍増殖に対する阻害効果を評価した結果を示す図である。
【図8】マウス肺がん３ＬＬ細胞移植骨転移モデルに抗ＦＳＴＬ１抗体を投与し、体重減少に対する抑制効果を評価した結果を示す図である。
【図9】乳がん、肝がん、膀胱がん、卵巣がん、膵がん、前立腺がんの患者由来の組織切片におけるＦＳＴＬ１とＤＩＰ２Ａの発現レベルを免疫組織蛍光染色およびピクセルカウントにより解析した結果を示す図である。
【図10】乳がん、肝がん、膀胱がん、卵巣がん、膵がん、前立腺がんの患者由来の組織切片におけるＦＳＴＬ１発現レベルとＤＩＰ２Ａ発現レベルの相関を解析した結果を示す図である。
【図11】乳がん、肝がん、膀胱がん、卵巣がん、膵がん、前立腺がんの患者由来の組織切片におけるＦＳＴＬ１発現レベル、ＤＩＰ２Ａ発現レベルおよびＦＳＴＬ１／ＤＩＰ２Ａ共発現レベルを、がんの進行ステージ別に解析した結果を示す図である。
【図12】進行期メラノーマ患者由来の腫瘍組織におけるＦＳＴＬ１とＤＩＰ２Ａの発現レベルを免疫組織蛍光染色およびピクセルカウントにより解析した結果を示す図である。
【図13】進行期メラノーマ患者由来の腫瘍組織におけるＦＳＴＬ１発現レベルとＤＩＰ２Ａ発現レベルの相関を解析した結果を示す図である。
【図14】各種末期がん患者（ステージＩＶ）の血清中のＦＳＴＬ１濃度を測定した結果を示す図である。
【図15】マウス骨肉腫細胞移植モデルに抗ＦＳＴＬ１抗体を投与し、腫瘍増殖に対する阻害効果を評価した結果を示す図である。
【図16】マウス骨肉腫細胞移植モデルに抗ＦＳＴＬ１抗体を投与し、血清中のＦＳＴＬ１濃度を測定した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0015】
本発明者らは、高転移ヒトがん細胞株および低転移ヒトがん細胞株におけるＦＳＴＬ１とＤＩＰ２Ａの発現を解析した結果、高転移ヒトがん細胞株においてはＦＳＴＬ１とＤＩＰ２Ａのいずれもが強く発現していることを見出した。したがって、高転移性のがんを検出するためのバイオマーカーとして、ＦＳＴＬ１および／またはＤＩＰ２Ａの発現を指標とすることができることを見出した。また、抗ＦＳＴＬ１抗体が担がんマウスモデルにおいて奏功することが確認されているマウスがん細胞株（Ｂ１６－Ｆ１０、ＣＴ２６および３ＬＬ）においても、ＦＳＴＬ１とＤＩＰ２Ａの両方が強く発現していることが確認された。したがって、ＦＳＴＬ１とＤＩＰ２Ａのいずれか又は両方を高発現する、がんを発症しているがん患者に対して、抗ＦＳＴＬ１抗体による治療効果が期待できると考えられた。さらに、各種がん患者の血清中ＦＳＴＬ１濃度を測定したところ、末期の皮膚がん患者、特にメラノーマ患者の血清中ＦＳＴＬ１濃度が高いことが示された。これらの知見から、がん患者のがん組織におけるＤＩＰ２Ａ発現レベルおよびＦＳＴＬ１発現レベル、ならびに血清ＦＳＴＬ１濃度ががん患者におけるＦＳＴＬ１阻害剤による治療効果を予測し、ＦＳＴＬ１阻害剤による治療効果が期待できるがん患者を選択するためのコンパニオン診断に有用なバイオマーカーであることが明らかになった。
【0016】
〔がん患者におけるＦＳＴＬ１阻害剤による治療効果を予測する方法〕
本発明は、がん患者におけるＦＳＴＬ１阻害剤による治療効果を予測する方法を提供する。本発明の治療効果予測方法は、以下の工程（１）～（３）を含むものであればよい。
（１）患者から採取した試料におけるＦＳＴＬ１および／またはＤＩＰ２Ａの発現レベルを測定する工程
（２）測定値を基準値と比較する工程
（３）測定値が基準値より高い場合に治療効果が期待できると判定する工程
本発明の治療効果予測方法は、本発明の目的を達成できる限り、上記工程（１）～（３）以外の工程を含んでいてもよく、その内容は限定されない。
本発明は、がん患者におけるＦＳＴＬ１阻害剤による治療効果を予測する方法を提供する。本発明の治療効果予測方法は、以下の工程（１）～（３）を含むものであればよい。
（１）患者から採取した試料におけるＦＳＴＬ１および／またはＤＩＰ２Ａの発現レベルを測定する工程
（２）測定値を基準値と比較する工程
（３）測定値が基準値より高い場合に治療効果が期待できると判定する工程
本発明の治療効果予測方法は、本発明の目的を達成できる限り、上記工程（１）～（３）以外の工程を含んでいてもよく、その内容は限定されない。
【0017】
治療効果を予測する対象のがん患者のがんの種類は特に限定されず、皮膚がん、大腸がん、乳がん、リンパ腫、肺がん、前立腺がん、腎がん、頭頸部がん、食道がん、胃がん、膵がん、肝臓がん、胆道がん、脾臓がん、膀胱がん、子宮がん、卵巣がん、精巣がん、甲状腺がん、脳中枢神経腫瘍、肉腫、白血病、多発性骨髄腫などが挙げられる。好ましくは、皮膚がん（特にメラノーマ）、大腸がん、乳がん、肺がん、肝がん、膀胱がん、卵巣がんおよび膵がんである。
【0018】
ＦＳＴＬ１阻害剤は、ＦＳＴＬ１の生物活性を低下させるものであればよく、例えばＦＳＴＬ１の発現を阻害する物質、ＦＳＴＬ１とその受容体との結合を阻害する物質などが挙げられる。ＦＳＴＬ１の発現を阻害する物質としては、例えばＦＳＴＬ１の発現を阻害する核酸が挙げられる。このような核酸としては、例えばＦＳＴＬ１遺伝子のｓｉＲＮＡ（short interfering RNA）、ｓｈＲＮＡ（short hairpin RNA）、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどが挙げられる。ＦＳＴＬ１とその受容体との結合を阻害する物質としては、ＦＳＴＬ１と特異的に結合する抗体（抗ＦＳＴＬ１抗体）もしくはペプチド、またはＦＳＴＬ１の受容体と特異的に結合する抗体もしくはペプチドなどが挙げられる。好ましくはＦＳＴＬ１とその受容体との結合を阻害する物質であり、より好ましくは抗ＦＳＴＬ１抗体である。
【0019】
工程（１）では、患者から採取した試料におけるＦＳＴＬ１および／またはＤＩＰ２Ａの発現レベルを測定する。患者から採取した試料はＦＳＴＬ１の発現レベルまたはＤＩＰ２Ａの発現レベルが測定できる試料であれば特に限定されない。例えば、生検または手術により得られた組織；血液、組織液、リンパ液、骨髄、脳脊髄液、膿、粘液、鼻水、喀痰、尿、糞便、腹水、胸水等の体液類；鼻腔、気管支、皮膚、各種臓器、骨等を洗浄した後の洗浄液；透析排液などが挙げられる。好ましくは、がん細胞を含む試料または血液である。がん細胞を含む試料としては、生検がん組織または切除手術で得られたがん組織が好ましい。また、工程（１）においてＦＳＴＬ１とＤＩＰ２Ａの両方の発現レベルを測定する場合、ＦＳＴＬ１の発現レベルを測定する試料とＤＩＰ２Ａの発現レベルを測定する試料は、同一であっても異なるものであっても、発現レベルが測定できる試料であれば特に限定されない。例えば、ＦＳＴＬ１の発現レベルを測定する試料ががん細胞を含む血液であって、ＤＩＰ２Ａの発現レベルを測定する試料が生検がん組織または切除手術で得られたがん組織である態様が挙げられる。
【0020】
工程（１）では、ＦＳＴＬ１の発現レベルのみを測定してもよく、ＤＩＰ２Ａの発現レベルのみを測定してもよいが、ＦＳＴＬ１とＤＩＰ２Ａの両方の発現レベルを測定することが好ましい。両者の発現レベルを組み合わせて判断することにより、がん患者におけるＦＳＴＬ１阻害剤による治療効果の予測精度が向上することが確認されている。また、ＦＳＴＬ１は分泌タンパク質であるため、血中ＦＳＴＬ１濃度によってＦＳＴＬ１の発現レベルを評価することができる。したがって、ＦＳＴＬ１の発現レベルを測定する態様としては、がん細胞（がん組織）を含む試料におけるＦＳＴＬ１の発現レベルのみを測定してもよく、血中ＦＳＴＬ１濃度のみを測定してもよく、両方を測定してもよい。好ましくは、がん細胞（がん組織）を含む試料におけるＦＳＴＬ１の発現レベルと血中ＦＳＴＬ１濃度の両方を測定することである。なお、本明細書において、ＦＳＴＬ１および／またはＤＩＰ２Ａの発現レベルを測定するとは、ＦＳＴＬ１およびＤＩＰ２Ａそのもののレベルを測定する態様であっても、それらの可溶型レベルを測定する態様であってもよい。よって、工程（１）の態様としては、ＦＳＴＬ１の発現レベルのみを測定する態様、血中ＦＳＴＬ１濃度のみを測定する態様、ＤＩＰ２Ａの発現レベルのみを測定する態様；ＦＳＴＬ１の発現レベルと血中ＦＳＴＬ１濃度の両方を測定する態様、ＦＳＴＬ１の発現レベルとＤＩＰ２Ａの発現レベルを測定する態様、血中ＦＳＴＬ１濃度とＤＩＰ２Ａの発現レベルを測定する態様；ＦＳＴＬ１の発現レベルとＤＩＰ２Ａの発現レベルと血中ＦＳＴＬ１濃度の３種を測定する態様、ＦＳＴＬ１の発現レベルとＤＩＰ２Ａの発現レベルと血中ＤＩＰ２Ａ可溶型濃度の３種を測定する態様が挙げられる。
【0021】
がん細胞を含む試料における発現レベルを測定する方法は特に限定されず、試料中の標的タンパク質量を測定する方法、試料中の標的タンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡ（標的ｍＲＮＡ）量を測定する方法、免疫組織化学的手法を用いて発現レベルを測定する方法などを好適に用いることができる。がん細胞を含む試料としては、生検がん組織または切除手術で得られたがん組織を用いることが好ましい。例えば標的タンパク質量の測定は、公知の方法で試料からタンパク質を抽出し、ウエスタンブロット法、ＥＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法などの公知のタンパク質測定方法を用いて行うことができる。また、標的ｍＲＮＡ量の測定は、公知の方法で試料からＲＮＡを抽出し、ノーザンブロット法、ＲＴ－ＰＣＲ法、定量ＲＴ－ＰＣＲ法、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイなどの公知のｍＲＮＡ量測定方法を用いて行うことができる。好ましくは、ＲＴ－ＰＣＲ法または定量ＲＴ－ＰＣＲ法であり、より好ましくは定量ＲＴ－ＰＣＲ法である。
【0022】
免疫組織化学的手法を用いて標的タンパク質の発現レベルを測定する場合、定法に従って組織標本を作製し、標的タンパク質に特異的に結合する抗体を用いて免疫染色を行う方法を好適に用いることができる。試料は、生検がん組織または切除手術で得られたがん組織を用いることが好ましい。免疫染色は、蛍光抗体法、酵素抗体法、金属標識抗体法のいずれの方法を用いてもよいが、蛍光抗体法が好ましい。蛍光抗体法は直接法で行ってもよく、間接法で行ってもよい。蛍光抗体法で標的タンパク質を染色した場合、標本上の抗体の蛍光強度が標的タンパク質の発現レベルを示す。蛍光強度は、市販のピクセルカウンター等を用いて測定することができる。したがって、抗ＦＳＴＬ１抗体を用いた免疫染色によりＦＳＴＬ１の発現レベルを測定することができ、抗ＤＩＰ２Ａ抗体を用いた免疫染色によりＤＩＰ２Ａの発現レベルを測定することができる。また、１つの標本において、ＦＳＴＬ１とＤＩＰ２Ａを異なる蛍光物質で標識された抗体を用いてそれぞれ蛍光免疫染色することもできる（二重染色）。組織標本における標的ｍＲＮＡ量の測定には、ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｉｄｉｚａｔｉｏｎ法を用いることができる。
【0023】
血中ＦＳＴＬ１濃度の測定は、例えば、患者から採取した血液から血清を分離し、血清中のＦＳＴＬ１濃度をＥＬＩＳＡ法などの公知の方法を用いて定量することができる。血中ＦＳＴＬ１濃度は、転移性が高いがんに罹患し、かつ進行度が進んだ患者において高値を示すことが確認されている。それゆえ、血中ＦＳＴＬ１濃度の測定値を組み合わせて判定を行うことにより、転移巣におけるＦＳＴＬ１阻害剤治療効果を予測することが期待できる。具体的には、例えば、原発巣を全部切除したがん患者において、切除したがん組織のＦＳＴＬ１および／またはＤＩＰ２Ａの発現レベルが高く、かつ血中ＦＳＴＬ１濃度も高い場合は、原発巣がすでに切除されていても転移巣に対するＦＳＴＬ１阻害剤による治療効果を予測することが期待できる。したがって、ＦＳＴＬ１および／またはＤＩＰ２Ａの発現レベルと血中ＦＳＴＬ１濃度を組み合わせて評価することにより、がん患者におけるＦＳＴＬ１阻害剤による治療効果の予測精度がさらに向上すると考えられる。
【0024】
ヒトＦＳＴＬ１およびヒトＤＩＰ２Ａのアミノ酸配列およびコードする遺伝子の塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋなどの公知のデータベースから取得することができる。ヒトＦＳＴＬ１をコードする遺伝子の塩基配列のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＭ＿００７０８５であり、ヒトＦＳＴＬ１のアミノ酸配列のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＰ＿００９０１６である。また、ヒトＤＩＰ２Ａをコードする遺伝子の塩基配列のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＭ＿０１５１５１であり、ヒトＤＩＰ２Ａのアミノ酸配列のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＰ＿０５５９６６である。得られた塩基配列情報に基づいて、ＲＴ－ＰＣＲ用のプライマーセットを設計することができる。
【0025】
工程（２）では、工程（１）で得られたＦＳＴＬ１および／またはＤＩＰ２Ａの発現レベルの測定値をそれぞれの基準値と比較する。基準値には、工程（１）で同時に測定した健常者試料におけるＦＳＴＬ１および／またはＤＩＰ２Ａの発現レベルの測定値を用いることができる。また、健常者試料におけるＦＳＴＬ１および／またはＤＩＰ２Ａの発現レベルの蓄積された測定値（健常者蓄積データ）に基づいて任意の基準値を設定してもよい。よって、本明細書における基準値としては、健常者試料におけるＦＳＴＬ１および／またはＤＩＰ２Ａの発現レベルを同時に測定した測定値あるいは蓄積された測定値であってもよく、健常者の血中ＦＳＴＬ１濃度を同時に測定した測定値あるいは蓄積された測定値であってもよい。好ましくは、健常者蓄積データに基づいて設定された基準値を用いることである。健常者は、慢性疾患に罹患していない成人が好ましく性別は問わない。高齢でないこと（例えば２０代～４０代）がより好ましい。また、健常者試料としては、工程（１）で用いた患者から採取した試料と同様にして健常者から採取した試料であることが好ましい。
【0026】
工程（３）では、工程（１）で得られたＦＳＴＬ１および／またはＤＩＰ２Ａの発現レベルの測定値が基準値より高い場合に、当該がん患者はＦＳＴＬ１阻害剤による治療効果が期待できると判定する。例えば、血中ＦＳＴＬ１濃度の場合は、測定値が基準値より５倍以上高い場合に治療効果が期待できると判定することが好ましく、測定値が基準値より１０倍以上高い場合に治療効果が期待できると判定することがより好ましい。例えば、がん細胞（がん組織）を含む試料におけるＦＳＴＬ１またはＤＩＰ２ＡのｍＲＮＡレベルの場合は、測定値が基準値より１．５倍以上高い場合に治療効果が期待できると判定することが好ましく、測定値が基準値より２倍以上高い場合に治療効果が期待できると判定することがより好ましい。例えば、がん細胞（がん組織）を含む試料におけるＦＳＴＬ１またはＤＩＰ２Ａの発現レベルを免疫組織蛍光染色における蛍光強度で評価する場合は、ピクセルカウンターで測定した数値が基準値より３倍以上高い場合に治療効果が期待できると判定することが好ましく、基準値より６倍以上高い場合に治療効果が期待できると判定することがより好ましい。よって、本発明の治療効果予測方法とは、工程（３）での治療効果が期待できるとの判定に基づくものであり、ここで、「（ＦＳＴＬ１阻害剤による）治療効果が期待できる」とは、がんをＦＳＴＬ１阻害剤によって治療できる可能性が有ることを意味し、測定値が基準値より高いことが明確であれば、その可能性をより正確に判断することを含む。してみれば、本発明の治療効果予測方法とは、試料提供者に、ＦＳＴＬ１阻害剤によるがん治療が有効な方法であるか否かの情報を提供する方法でもあり、例えば、測定値が基準値より高いことが明確な場合に、ＦＳＴＬ１阻害剤の投与が有効な方法であるとの情報の正確性が高くなるものである。また、試料提供者が原発巣を切除した患者である場合には、提供された試料におけるＦＳＴＬ１および／またはＤＩＰ２Ａの発現レベルを測定することで、転移の早期発見やＦＳＴＬ１阻害剤による早期治療についての情報を提供することができる。さらには、ＦＳＴＬ１および／またはＤＩＰ２Ａは、初期のがんにおいて有意に発現が増強することから、ＦＳＴＬ１阻害剤による治療効果が期待できる初期のがん患者を精度高く選択することも可能となる。また、本発明では、試料提供者の抗がん剤投与前後の試料を用いることで、投与後の試料におけるＦＳＴＬ１および／またはＤＩＰ２Ａの発現レベルが投与前の試料より高いようであれば、ＦＳＴＬ１阻害剤によって治療できる可能性が有ると判断することが可能となり、ひいては投与した抗がん剤の治療有効性も評価することが可能となる。
【0027】
また、がん細胞（がん組織）を含む試料におけるＦＳＴＬ１の発現レベル、がん細胞（がん組織）を含む試料におけるＤＩＰ２Ａの発現レベル、および血中ＦＳＴＬ１濃度から選ばれる２つ以上を測定した場合においては、少なくとも１つの測定値が基準値より高い場合に当該がん患者はＦＳＴＬ１阻害剤による治療効果が期待できると判定することができるが、２つの測定値が基準値より高い患者はより高い治療効果が期待でき、３つの測定値が基準値より高い患者はさらに高い治療効果が期待できる。即ち、少なくとも１つの測定値が基準値より高い患者はがんをＦＳＴＬ１阻害剤によって治療できる可能性が有り、２つの測定値が基準値より高い患者はがんをＦＳＴＬ１阻害剤によって治療できる可能性がより高く、３つの測定値が基準値より高い患者はがんをＦＳＴＬ１阻害剤によって治療できる可能性がさらに高いものである。よって、本発明は、数多ある抗がん剤の中から、当該患者が罹患するがん治療に最適な抗がん剤としてＦＳＴＬ１阻害剤を選択する指標を提供するものでもある。
【0028】
〔がん患者に対するＦＳＴＬ１阻害剤の投与開始を決定する方法〕
本発明は、がん患者に対するＦＳＴＬ１阻害剤の投与開始を決定する方法を提供する。本発明の投与開始決定方法は、以下の工程（１）、（２）および（３’）を含むものであればよい。
（１）患者から採取した試料におけるＦＳＴＬ１および／またはＤＩＰ２Ａの発現レベルを測定する工程
（２）測定値を基準値と比較する工程
（３’）測定値が基準値より高い場合にＦＳＴＬ１阻害剤の投与開始を決定する工程
本発明は、がん患者に対するＦＳＴＬ１阻害剤の投与開始を決定する方法を提供する。本発明の投与開始決定方法は、以下の工程（１）、（２）および（３’）を含むものであればよい。
（１）患者から採取した試料におけるＦＳＴＬ１および／またはＤＩＰ２Ａの発現レベルを測定する工程
（２）測定値を基準値と比較する工程
（３’）測定値が基準値より高い場合にＦＳＴＬ１阻害剤の投与開始を決定する工程
【0029】
本発明の投与開始決定方法は、工程（３’）において測定値が基準値より高いと判定した場合、可能な限り速やかにＦＳＴＬ１阻害剤の投与を開始することが好ましく、直ちにＦＳＴＬ１阻害剤の投与を開始することがより好ましい。本発明の投与開始決定方法は、上記本発明の治療効果予測方法と実質的に同様にして実施することができる。したがって、重複を避けるため、本発明の投与開始決定方法の説明を省略する。
【0030】
〔キット〕
本発明は、がん患者におけるＦＳＴＬ１阻害剤による治療効果を予測するためのキットを提供する。本発明のキットは、ＦＳＴＬ１および／またはＤＩＰ２Ａの発現レベルを測定することから、ＦＳＴＬ１の発現レベルを測定するための試薬、ＤＩＰ２Ａの発現レベルを測定するための試薬のいずれか又は両者を含むものであればよく、好ましくはＤＩＰ２Ａの発現レベルを測定するための試薬を含むものであればよい。ＤＩＰ２Ａの発現レベルを測定するための試薬としては、例えば、抗ＤＩＰ２Ａ抗体およびＤＩＰ２ＡのＲＴ－ＰＣＲ用プライマーセットが挙げられる。本発明のキットは、これらの一方または両方を含むことが好ましい。抗ＤＩＰ２Ａ抗体は免疫組織染色に使用することができ、プライマーセットはＤＩＰ２Ａ ｍＲＮＡの定量に使用することができる。
本発明は、がん患者におけるＦＳＴＬ１阻害剤による治療効果を予測するためのキットを提供する。本発明のキットは、ＦＳＴＬ１および／またはＤＩＰ２Ａの発現レベルを測定することから、ＦＳＴＬ１の発現レベルを測定するための試薬、ＤＩＰ２Ａの発現レベルを測定するための試薬のいずれか又は両者を含むものであればよく、好ましくはＤＩＰ２Ａの発現レベルを測定するための試薬を含むものであればよい。ＤＩＰ２Ａの発現レベルを測定するための試薬としては、例えば、抗ＤＩＰ２Ａ抗体およびＤＩＰ２ＡのＲＴ－ＰＣＲ用プライマーセットが挙げられる。本発明のキットは、これらの一方または両方を含むことが好ましい。抗ＤＩＰ２Ａ抗体は免疫組織染色に使用することができ、プライマーセットはＤＩＰ２Ａ ｍＲＮＡの定量に使用することができる。
【0031】
本発明のキットに抗ＤＩＰ２Ａ抗体を含む場合には、これ以外に二次抗体、ブロッキング用試薬、洗浄用バッファー、取扱説明書等を含むことが好ましい。本発明のキットにＤＩＰ２ＡのＲＴ－ＰＣＲ用プライマーセットを含む場合は、これ以外に、ＤＮＡ合成酵素、ＤＮＡ合成酵素の基質となるヌクレオチド、増幅用反応液、反応用チューブ、試料調製用試薬類、取扱説明書等を含むことが好ましい。
【0032】
本発明のキットには、さらに、がん細胞またはがん組織におけるＦＳＴＬ１の発現レベルを測定するための試薬および／または血中ＦＳＴＬ１濃度を測定するための試薬を含むことが好ましい。このような試薬としては、抗ＦＳＴＬ１抗体およびＦＳＴＬ１のＲＴ－ＰＣＲ用プライマーセットが挙げられる。本発明のキットは、上記ＤＩＰ２Ａの発現レベルを測定するための試薬に加えて、これらの一方または両方を含むことが好ましい。抗ＤＩＰ２Ａ抗体は免疫組織染色および血中ＦＳＴＬ１濃度の測定に使用することができ、プライマーセットはＤＩＰ２Ａ ｍＲＮＡの定量に使用することができる。
【0033】
本発明のキットは、上記本発明のがん患者に対するＦＳＴＬ１阻害剤の投与開始を決定する方法の実施にも、好適に用いることができる。したがって、本発明のキットは、がん患者に対するＦＳＴＬ１阻害剤の投与開始を決定するためのキットと換言することができる。
【実施例】
【0034】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【0035】
〔実施例１：高転移ヒトがん細胞株および低転移ヒトがん細胞株におけるＦＳＴＬ１とＤＩＰ２Ａの発現解析〕
（１）実験方法
ＰＥ標識ＦＳＴＬ１抗体と、ＤＩＰ２Ａ抗体（Santa Cruz；FITC標識二次抗体を併用）を用いて、以下の４種のヒト腫瘍細胞株を免疫染色し、ＦＳＴＬ１とＤＩＰ２Ａの発現の有無および発現分布を免疫組織化学的に解析した。
１．ヒト膵がん細胞株Ｐａｎｃ１の空ベクター導入細胞株（Panc1-mock）
２．ヒト膵がん細胞株Ｐａｎｃ１のＳｎａｉｌ強制発現細胞株（Panc1-snail+）
３．ヒト乳がん低転移性細胞株ＭＣＦ７
４．ヒト乳がん高骨転移性細胞株ＭＤＡ２３１
（１）実験方法
ＰＥ標識ＦＳＴＬ１抗体と、ＤＩＰ２Ａ抗体（Santa Cruz；FITC標識二次抗体を併用）を用いて、以下の４種のヒト腫瘍細胞株を免疫染色し、ＦＳＴＬ１とＤＩＰ２Ａの発現の有無および発現分布を免疫組織化学的に解析した。
１．ヒト膵がん細胞株Ｐａｎｃ１の空ベクター導入細胞株（Panc1-mock）
２．ヒト膵がん細胞株Ｐａｎｃ１のＳｎａｉｌ強制発現細胞株（Panc1-snail+）
３．ヒト乳がん低転移性細胞株ＭＣＦ７
４．ヒト乳がん高骨転移性細胞株ＭＤＡ２３１
【0036】
まず、マイクロスライドチャンバー（日本ジェネティクス社、品番ib-80821）を用いて、２×１０４個／３００μＬ／ｗｅｌｌの腫瘍細胞を１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地で播種・培養し、その２日後に培養上清を捨て、細胞内に存在するＦＳＴＬ１を染色するためにＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（BD Pharmingen社、品番554714）を加え、室温で２０分間処理して細胞膜の透過性を高めた。これを捨てた後、ＢＤ Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（BD Pharmingen社、品番554723）で希釈した１μｇ／ｍＬの抗ＤＩＰ２Ａ抗体（Santa Cruz社、品番sc-67556）を２００μＬ／ｗｅｌｌ加え、室温で１時間反応させた。その後、抗体液を捨ててＰＢＳを加えて細胞を洗浄し、そこにＢＤ Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで希釈した１μｇ／ｍＬのＰＥ標識ＦＳＴＬ１抗体（抗ＦＳＴＬ１抗体をDOJINDO社のR-Phycoerythrin Labeling Kit - NH2、品番LK23 を用いてPE標識した抗体）を２００μＬ／ｗｅｌｌ加え、室温で１時間反応させた。その後、抗体液を捨ててＰＢＳを加えて細胞を洗浄し、そこに４％ＰＦＡ／ＰＢＳを２００μＬ／ｗｅｌｌ加えて室温で１５分間処理して細胞を固定し、これを捨てて、２００μＬ／ｗｅｌｌのＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（Vector Laboratories社、品番H-1000）を入れて封入した。染色した細胞は、共焦点レーザスキャン顕微鏡（Carl Zeiss社、品番LSM700）下で観察し、写真を撮影した。
【0037】
（２）結果
図１にＤＡＰＩ核染色を除いたＦＳＴＬ１とＤＩＰ２Ａの二重染色像を示した。Ｐａｎｃ１－ｍｏｃｋ（上段左）では、ＤＩＰ２Ａ陽性細胞がわずかに含まれていたが、ＦＳＴＬ１は一部の細胞の核内でかすかな染色が観察されただけであった。一方、Ｐａｎｃ１－Ｓｎａｉｌ＋（上段右）では、ほぼ全ての細胞でＦＳＴＬ１とＤＩＰ２Ａの両方が強陽性を示した。ＤＩＰ２Ａは、基本的には細胞膜上に発現していたが、核周辺部にＦＳＴＬ１とともに集積しており、これが一部の細胞では核内でも観察された。これは、細胞外に分泌されたＦＳＴＬ１がＤＩＰ２Ａに結合し、細胞内に取り込まれて核周辺に移行したと推測され、ＤＩＰ２Ａを介したシグナル伝達上、極めて重要な現象と考えられる。
図１にＤＡＰＩ核染色を除いたＦＳＴＬ１とＤＩＰ２Ａの二重染色像を示した。Ｐａｎｃ１－ｍｏｃｋ（上段左）では、ＤＩＰ２Ａ陽性細胞がわずかに含まれていたが、ＦＳＴＬ１は一部の細胞の核内でかすかな染色が観察されただけであった。一方、Ｐａｎｃ１－Ｓｎａｉｌ＋（上段右）では、ほぼ全ての細胞でＦＳＴＬ１とＤＩＰ２Ａの両方が強陽性を示した。ＤＩＰ２Ａは、基本的には細胞膜上に発現していたが、核周辺部にＦＳＴＬ１とともに集積しており、これが一部の細胞では核内でも観察された。これは、細胞外に分泌されたＦＳＴＬ１がＤＩＰ２Ａに結合し、細胞内に取り込まれて核周辺に移行したと推測され、ＤＩＰ２Ａを介したシグナル伝達上、極めて重要な現象と考えられる。
【0038】
一方、低転移性のＭＣＦ７（下段左）では、一部の細胞の核内でＦＳＴＬ１がわずかに陽性を示したが、ＤＩＰ２Ａはほとんど観察されなかった。一方、高骨転移性のＭＤＡ２３１（下段右）では、Ｐａｎｃ１のＳｎａｉｌ強制発現細胞株より若干弱いものの、ほぼ全ての細胞でＦＳＴＬ１とＤＩＰ２Ａの両方が強陽性を示した。ただし、ＦＳＴＬ１とＤＩＰ２Ａの二重染色分子は核周辺部に集積していたものの、Ｐａｎｃ１のＳｎａｉｌ強制発現細胞株のように核の片側で濃厚な染色パターンを示すのではなく、核の片側あるいは周辺にまんべんなく散在するドット状を呈した。この理由は、Ｐａｎｃ１のＳｎａｉｌ強制発現細胞株に比べてＭＤＡ２３１のＦＳＴＬ１産生量が少ないためと推測される。
【0039】
以上の結果から、ＦＳＴＬ１とＤＩＰ２Ａは、共に高発現することが高増殖性や高転移性を特徴とするがんの悪性形質（または難治性形質）、例えば、骨転移性を含めた転移性を制御する上で重要であることが示唆された。
【0040】
〔実施例２：担がんモデルで抗ＦＳＴＬ１抗体が奏功するマウスがん細胞株のＦＳＴＬ１とＤＩＰ２Ａの発現解析〕
（１）実験方法
インビボ薬効評価（参考例参照）で使用している以下の４種のマウス腫瘍細胞株におけるＦＳＴＬ１とＤＩＰ２Ａの発現を免疫組織化学的に解析した。
１．マウスメラノーマＢ１６－Ｆ１０の空ベクター導入細胞株（F10-mock）
２．マウスメラノーマＢ１６－Ｆ１０のＳｎａｉｌ強制発現細胞株（F10-snail+）
３．マウス大腸がん細胞株ＣＴ２６
４．マウス肺がん細胞株３ＬＬ
実施例１と同じＰＥ標識ＦＳＴＬ１抗体とＤＩＰ２Ａ抗体（Santa Cruz；FITC標識二次抗体を併用）を用い、実施例１と同じ方法で免疫染色および観察を行った。
（１）実験方法
インビボ薬効評価（参考例参照）で使用している以下の４種のマウス腫瘍細胞株におけるＦＳＴＬ１とＤＩＰ２Ａの発現を免疫組織化学的に解析した。
１．マウスメラノーマＢ１６－Ｆ１０の空ベクター導入細胞株（F10-mock）
２．マウスメラノーマＢ１６－Ｆ１０のＳｎａｉｌ強制発現細胞株（F10-snail+）
３．マウス大腸がん細胞株ＣＴ２６
４．マウス肺がん細胞株３ＬＬ
実施例１と同じＰＥ標識ＦＳＴＬ１抗体とＤＩＰ２Ａ抗体（Santa Cruz；FITC標識二次抗体を併用）を用い、実施例１と同じ方法で免疫染色および観察を行った。
【0041】
（２）結果
結果を図２に示した。Ｆ１０－ｍｏｃｋには、ごく低いレベルのＤＩＰ２Ａと核近傍にＦＳＴＬ１を発現する細胞が少数存在することが観察された。一方、Ｆ１０－Ｓｎａｉｌ＋では、全ての細胞でＦＳＴＬ１とＤＩＰ２Ａの両方が高発現していることが観察された。また、ＣＴ２６と３ＬＬにもＦＳＴＬ１とＤＩＰ２Ａの両方が高発現していることを今回初めて確認した。特に、３ＬＬの細胞質内は、ＦＳＴＬ１と結合して細胞内に取り込まれたと考えられるＤＩＰ２Ａで満たされており、ＤＩＰ２Ａ下流のシグナル伝達系が活性化していると推測された。
結果を図２に示した。Ｆ１０－ｍｏｃｋには、ごく低いレベルのＤＩＰ２Ａと核近傍にＦＳＴＬ１を発現する細胞が少数存在することが観察された。一方、Ｆ１０－Ｓｎａｉｌ＋では、全ての細胞でＦＳＴＬ１とＤＩＰ２Ａの両方が高発現していることが観察された。また、ＣＴ２６と３ＬＬにもＦＳＴＬ１とＤＩＰ２Ａの両方が高発現していることを今回初めて確認した。特に、３ＬＬの細胞質内は、ＦＳＴＬ１と結合して細胞内に取り込まれたと考えられるＤＩＰ２Ａで満たされており、ＤＩＰ２Ａ下流のシグナル伝達系が活性化していると推測された。
【0042】
〔参考例１：マウスメラノーマＢ１６－Ｆ１０のＳｎａｉｌ強制発現細胞移植骨転移モデルを用いた抗ＦＳＴＬ１抗体の薬効評価〕
（１）実験方法
マウスメラノーマＢ１６－Ｆ１０のＳｎａｉｌ強制発現細胞をＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスの皮下および静脈内に移植した骨転移モデルを用いて、抗腫瘍効果および免疫抑制解除効果を解析した。
（１－１）実験群(n=5)
1. No treatment (0.9% NaCl as a sham)
2. Control IgG (anti-DNP)
3. Anti-FSTL1 Clone #6-55
4. Anti-FSTL1 Clone #7-34
5. Anti-FSTL1 Clone #8-1
（１－２）実験手順
Ｓｎａｉｌ陽性腫瘍細胞をマウスの皮下および静脈内へ移植すると、様々な臓器の他、骨髄に優位に転移し、これが骨髄を起点とした間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の増加を招いて全身的に強く抗腫瘍免疫の誘導が抑制されてしまうことが知られている（Cancer Research 73:6185,2013）。そこで、ＧＦＰ遺伝子とマウスＳｎａｉｌ遺伝子を導入して強制発現させたＧＦＰ陽性Ｓｎａｉｌ陽性Ｂ１６－Ｆ１０腫瘍細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスの皮下に５×１０５個、および尾静脈内に１×１０５個移植し（Day0）、その５日後（Day5）および１０日後（Day10）に生理食塩水で１ｍｇ／ｍＬに調製した抗ＦＳＴＬ１抗体（＃6-55、＃7-34、＃8-1）またはそのアイソタイプであるマウスＩｇＧ（抗ＤＮＰ抗体）をコントロール抗体として１０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内投与した。無処置群には生理食塩水を腹腔内投与した。細胞移植１４日後（Day14）に各種免疫学的アッセイを行った。細胞移植７、１１、１４日後に皮下腫瘍径を測定して腫瘍体積を算出し、皮下腫瘍増殖に対する阻害効果を評価した。アッセイとしては、骨髄細胞中のＧＦＰ陽性Ｓｎａｉｌ陽性Ｂ１６－Ｆ１０腫瘍細胞数の測定、骨髄細胞中のＣＤ４５陰性細胞数の測定および体重測定を行った。
（１）実験方法
マウスメラノーマＢ１６－Ｆ１０のＳｎａｉｌ強制発現細胞をＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスの皮下および静脈内に移植した骨転移モデルを用いて、抗腫瘍効果および免疫抑制解除効果を解析した。
（１－１）実験群(n=5)
1. No treatment (0.9% NaCl as a sham)
2. Control IgG (anti-DNP)
3. Anti-FSTL1 Clone #6-55
4. Anti-FSTL1 Clone #7-34
5. Anti-FSTL1 Clone #8-1
（１－２）実験手順
Ｓｎａｉｌ陽性腫瘍細胞をマウスの皮下および静脈内へ移植すると、様々な臓器の他、骨髄に優位に転移し、これが骨髄を起点とした間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の増加を招いて全身的に強く抗腫瘍免疫の誘導が抑制されてしまうことが知られている（Cancer Research 73:6185,2013）。そこで、ＧＦＰ遺伝子とマウスＳｎａｉｌ遺伝子を導入して強制発現させたＧＦＰ陽性Ｓｎａｉｌ陽性Ｂ１６－Ｆ１０腫瘍細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスの皮下に５×１０５個、および尾静脈内に１×１０５個移植し（Day0）、その５日後（Day5）および１０日後（Day10）に生理食塩水で１ｍｇ／ｍＬに調製した抗ＦＳＴＬ１抗体（＃6-55、＃7-34、＃8-1）またはそのアイソタイプであるマウスＩｇＧ（抗ＤＮＰ抗体）をコントロール抗体として１０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内投与した。無処置群には生理食塩水を腹腔内投与した。細胞移植１４日後（Day14）に各種免疫学的アッセイを行った。細胞移植７、１１、１４日後に皮下腫瘍径を測定して腫瘍体積を算出し、皮下腫瘍増殖に対する阻害効果を評価した。アッセイとしては、骨髄細胞中のＧＦＰ陽性Ｓｎａｉｌ陽性Ｂ１６－Ｆ１０腫瘍細胞数の測定、骨髄細胞中のＣＤ４５陰性細胞数の測定および体重測定を行った。
【0043】
（２）結果
図３に抗ＦＳＴＬ１抗体による抗腫瘍効果の結果を示した。使用した３種類の抗ＦＳＴＬ１抗体のいずれも、コントロール抗体に対して有意に皮下腫瘍の増殖を抑制した。なお、図中、括弧内の数値は無処置群と比較した場合のＰ値であり、横線のところに示した数値は、横線の一端がある群と他端がある群間で細胞移植１４日後に比較した場合のＰ値を示す。
図４に骨転移に対する効果（左：骨髄中のＧＦＰ陽性Ｓｎａｉｌ陽性Ｂ１６－Ｆ１０腫瘍細胞数）の結果、ＭＳＣ増加に対する効果（中央：骨髄中のＣＤ４５陰性細胞数）の結果、体重減少に対する効果（右）を示した。抗ＦＳＴＬ１抗体の#6-55および#8-1は、体重減少抑制効果を示した。また、３種類の抗ＦＳＴＬ１抗体のいずれもＭＳＣを減少させ、骨転移抑制効果を示した。
図３に抗ＦＳＴＬ１抗体による抗腫瘍効果の結果を示した。使用した３種類の抗ＦＳＴＬ１抗体のいずれも、コントロール抗体に対して有意に皮下腫瘍の増殖を抑制した。なお、図中、括弧内の数値は無処置群と比較した場合のＰ値であり、横線のところに示した数値は、横線の一端がある群と他端がある群間で細胞移植１４日後に比較した場合のＰ値を示す。
図４に骨転移に対する効果（左：骨髄中のＧＦＰ陽性Ｓｎａｉｌ陽性Ｂ１６－Ｆ１０腫瘍細胞数）の結果、ＭＳＣ増加に対する効果（中央：骨髄中のＣＤ４５陰性細胞数）の結果、体重減少に対する効果（右）を示した。抗ＦＳＴＬ１抗体の#6-55および#8-1は、体重減少抑制効果を示した。また、３種類の抗ＦＳＴＬ１抗体のいずれもＭＳＣを減少させ、骨転移抑制効果を示した。
【0044】
〔参考例２：マウス大腸がんＣＴ２６細胞移植肺転移モデルを用いた抗ＦＳＴＬ１抗体の薬効評価〕
（１）実験方法
マウス大腸がんＣＴ２６細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下および静脈内に移植した骨転移モデルを用いて、抗腫瘍効果および抗転移効果を解析した。抗ＦＳＴＬ１抗体としてクローン#6-55を用いた。実験は参考例１と同じ手順で行った。評価は、皮下腫瘍増殖と肺転移について行った。肺転移の評価は肺における腫瘍結節数を肉眼的に計数した。
（１）実験方法
マウス大腸がんＣＴ２６細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下および静脈内に移植した骨転移モデルを用いて、抗腫瘍効果および抗転移効果を解析した。抗ＦＳＴＬ１抗体としてクローン#6-55を用いた。実験は参考例１と同じ手順で行った。評価は、皮下腫瘍増殖と肺転移について行った。肺転移の評価は肺における腫瘍結節数を肉眼的に計数した。
【0045】
（２）結果
図５に抗腫瘍効果の結果を示し、図６に抗転移効果の結果を示した。抗ＦＳＴＬ１抗体（#6-55）はＣＴ２６皮下腫瘍の増殖および肺転移を極めて強く抑制した。具体的には５匹中３匹のマウスで固形腫瘍は消失し、肺転移結節数も極わずかであった（コントロール抗体群の平均結節数１４個に対して抗ＦＳＴＬ１抗体群の結節数は０～３個）。なお、図５中、横線のところに示した数値は、横線の一端がある群と他端がある群間で細胞移植１４日後に比較した場合のＰ値を示す。
図５に抗腫瘍効果の結果を示し、図６に抗転移効果の結果を示した。抗ＦＳＴＬ１抗体（#6-55）はＣＴ２６皮下腫瘍の増殖および肺転移を極めて強く抑制した。具体的には５匹中３匹のマウスで固形腫瘍は消失し、肺転移結節数も極わずかであった（コントロール抗体群の平均結節数１４個に対して抗ＦＳＴＬ１抗体群の結節数は０～３個）。なお、図５中、横線のところに示した数値は、横線の一端がある群と他端がある群間で細胞移植１４日後に比較した場合のＰ値を示す。
【0046】
〔参考例３：マウス肺がん３ＬＬ細胞移植肺転移モデルを用いた抗ＦＳＴＬ１抗体の薬効評価〕
（１）実験方法
マウス肺がん３ＬＬ細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下および静脈内に移植した骨転移モデルを用いて、抗腫瘍効果および抗転移効果を解析した。抗ＦＳＴＬ１抗体としてクローン#6-55を用いた。実験は参考例１と同じ手順で行った。評価は、皮下腫瘍増殖と体重について行った。また、腫瘍臓器への転移の有無を肉眼的に観察した。
（１）実験方法
マウス肺がん３ＬＬ細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下および静脈内に移植した骨転移モデルを用いて、抗腫瘍効果および抗転移効果を解析した。抗ＦＳＴＬ１抗体としてクローン#6-55を用いた。実験は参考例１と同じ手順で行った。評価は、皮下腫瘍増殖と体重について行った。また、腫瘍臓器への転移の有無を肉眼的に観察した。
【0047】
（２）結果
図７に抗腫瘍効果の結果を示し、図８に体重減少に対する効果の結果を示した。抗ＦＳＴＬ１抗体（#6-55）は３ＬＬ皮下腫瘍の増殖を強く抑制した。具体的には５匹中２匹のマウスで固形腫瘍は消失した。また、いずれの臓器においても肉眼的に転移は観察されなかった。抗ＦＳＴＬ１抗体群では体重減少や痩せ、毛羽立ちなどは一切観察されず、全マウスが元気であった。
図７に抗腫瘍効果の結果を示し、図８に体重減少に対する効果の結果を示した。抗ＦＳＴＬ１抗体（#6-55）は３ＬＬ皮下腫瘍の増殖を強く抑制した。具体的には５匹中２匹のマウスで固形腫瘍は消失した。また、いずれの臓器においても肉眼的に転移は観察されなかった。抗ＦＳＴＬ１抗体群では体重減少や痩せ、毛羽立ちなどは一切観察されず、全マウスが元気であった。
【0048】
実施例２および参考例１、２、３の結果から、ＦＳＴＬ１およびＤＩＰ２Ａを高発現しているマウスがん細胞を移植したマウスモデルに対して、抗ＦＳＴＬ１抗体は抗腫瘍効果を有することが確認できた。実施例１において、転移性の高いヒトがん細胞にはＦＳＴＬ１とＤＩＰ２Ａの両方が高発現していることが確認されたことから、このようなＦＳＴＬ１およびＤＩＰ２Ａを高発現するがんを発症しているがん患者に対して、抗ＦＳＴＬ１抗体は治療効果を有することが期待できる。
【0049】
〔実施例３：様々ながん種の患者由来腫瘍組織のＦＳＴＬ１とＤＩＰ２Ａの発現解析〕
（１）実験方法
抗ＦＳＴＬ１抗体の適用がん種を検討するために、市販の様々ながん種の患者由来腫瘍組織切片（下記参照）を用いて、ＦＳＴＬ１とＤＩＰ２Ａの発現レベルを免疫組織化学的に解析した。組織切片は、キシレンおよびエタノールを用いて脱パラフィン処置後、抗原を賦活化させるために０．１％トリプシンで３７℃３０分間処理し、その後、非特異的な染色を抑止するために２０％ＩｍｍｕｎｏＢｌｏｃｋ（DS Pharma社、品番CTKN001）で室温１５分間処置した。その後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで希釈した５μｇ／ｍＬの抗ＤＩＰ２Ａ抗体液（Santa Cruz社、品番sc-67556）で切片全体をカバーし、４℃で２４時間、湿潤箱内で反応させた。その後ＰＢＳで切片を十分に洗浄し、そこに１％ＢＳＡ／ＰＢＳで希釈した５μｇ／ｍＬのＰＥ標識ＦＳＴＬ１抗体液（抗ＦＳＴＬ１抗体をDOJINDO社のR-Phycoerythrin Labeling Kit - NH2、品番LK23 を用いてPE標識した抗体）で切片全体をカバーし、４℃で２４時間、湿潤箱内で反応させた。その後、エタノールおよびキシレンで脱水・固定し、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（Vector Laboratories社、品番H-1000）で切片を封入し、共焦点レーザスキャン顕微鏡（Carl Zeiss社、品番LSM700）下で観察した。ＦＳＴＬ１とＤＩＰ２Ａの発現レベルは、顕微鏡に内蔵された蛍光強度自動測定機能を活用してピクセルカウントを計測して解析した。
＜パラフィン切片セット（Super Bio Chips社）＞
ＭＢ４（Human common cancers-2）：乳がん、肝がん、膀胱がん、卵巣がん、膵がん、前立腺がん（ｎ＝９～１０）
（１）実験方法
抗ＦＳＴＬ１抗体の適用がん種を検討するために、市販の様々ながん種の患者由来腫瘍組織切片（下記参照）を用いて、ＦＳＴＬ１とＤＩＰ２Ａの発現レベルを免疫組織化学的に解析した。組織切片は、キシレンおよびエタノールを用いて脱パラフィン処置後、抗原を賦活化させるために０．１％トリプシンで３７℃３０分間処理し、その後、非特異的な染色を抑止するために２０％ＩｍｍｕｎｏＢｌｏｃｋ（DS Pharma社、品番CTKN001）で室温１５分間処置した。その後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで希釈した５μｇ／ｍＬの抗ＤＩＰ２Ａ抗体液（Santa Cruz社、品番sc-67556）で切片全体をカバーし、４℃で２４時間、湿潤箱内で反応させた。その後ＰＢＳで切片を十分に洗浄し、そこに１％ＢＳＡ／ＰＢＳで希釈した５μｇ／ｍＬのＰＥ標識ＦＳＴＬ１抗体液（抗ＦＳＴＬ１抗体をDOJINDO社のR-Phycoerythrin Labeling Kit - NH2、品番LK23 を用いてPE標識した抗体）で切片全体をカバーし、４℃で２４時間、湿潤箱内で反応させた。その後、エタノールおよびキシレンで脱水・固定し、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（Vector Laboratories社、品番H-1000）で切片を封入し、共焦点レーザスキャン顕微鏡（Carl Zeiss社、品番LSM700）下で観察した。ＦＳＴＬ１とＤＩＰ２Ａの発現レベルは、顕微鏡に内蔵された蛍光強度自動測定機能を活用してピクセルカウントを計測して解析した。
＜パラフィン切片セット（Super Bio Chips社）＞
ＭＢ４（Human common cancers-2）：乳がん、肝がん、膀胱がん、卵巣がん、膵がん、前立腺がん（ｎ＝９～１０）
【0050】
（２）結果
結果を表１、図９および図１０に示した。ステージＩ－ＩＶの乳がん、肝がん、膀胱がん、卵巣がん、膵がん、前立腺がんの６がん種についてＦＳＴＬ１（ＰＥ／Ｒｅｄ染色）とＤＩＰ２Ａ（ＦＩＴＣ／Ｇｒｅｅｎ染色）の発現を解析したところ、ＦＳＴＬ１の発現は、肝がん、乳がん、膀胱がん、卵巣がん、膵がん、前立腺がんの順に高かった。一方、ＤＩＰ２Ａの発現は、乳がん、肝がん、膵がん、卵巣がん、前立腺がん、膀胱がんの順に高かった。ＦＳＴＬ１とＤＩＰ２Ａの両方の発現が比較的高い４種（乳がん、肝がん、卵巣がん、膵がん）では、ＦＳＴＬ１／ＤＩＰ２Ａ共陽性の小型なＳｎａｉｌ－ｉｎｄｕｃｅｄ ＭＳＣ（ｓＭＳＣ）様細胞が多数浸潤していたほか、卵巣がんおよび膵がんではＦＳＴＬ１／ＤＩＰ２Ａ共陽性の大型のがん幹細胞（ＣＳＣ）様の腫瘍細胞も多数増加していた。縦軸にＦＳＴＬ１発現レベルと横軸にＤＩＰ２Ａ発現レベルをとり、各腫瘍組織における発現の相関性を確かめたところ、乳がん、肝がん、膀胱がん、卵巣がん、膵がんの間に統計学的に有意な相関性が観察された（図１０）。以上の結果から、少なくとも肝がん、乳がん、膀胱がん、卵巣がんおよび膵がんには、抗ＦＳＴＬ１抗体治療が適用できる可能性が示唆された。
結果を表１、図９および図１０に示した。ステージＩ－ＩＶの乳がん、肝がん、膀胱がん、卵巣がん、膵がん、前立腺がんの６がん種についてＦＳＴＬ１（ＰＥ／Ｒｅｄ染色）とＤＩＰ２Ａ（ＦＩＴＣ／Ｇｒｅｅｎ染色）の発現を解析したところ、ＦＳＴＬ１の発現は、肝がん、乳がん、膀胱がん、卵巣がん、膵がん、前立腺がんの順に高かった。一方、ＤＩＰ２Ａの発現は、乳がん、肝がん、膵がん、卵巣がん、前立腺がん、膀胱がんの順に高かった。ＦＳＴＬ１とＤＩＰ２Ａの両方の発現が比較的高い４種（乳がん、肝がん、卵巣がん、膵がん）では、ＦＳＴＬ１／ＤＩＰ２Ａ共陽性の小型なＳｎａｉｌ－ｉｎｄｕｃｅｄ ＭＳＣ（ｓＭＳＣ）様細胞が多数浸潤していたほか、卵巣がんおよび膵がんではＦＳＴＬ１／ＤＩＰ２Ａ共陽性の大型のがん幹細胞（ＣＳＣ）様の腫瘍細胞も多数増加していた。縦軸にＦＳＴＬ１発現レベルと横軸にＤＩＰ２Ａ発現レベルをとり、各腫瘍組織における発現の相関性を確かめたところ、乳がん、肝がん、膀胱がん、卵巣がん、膵がんの間に統計学的に有意な相関性が観察された（図１０）。以上の結果から、少なくとも肝がん、乳がん、膀胱がん、卵巣がんおよび膵がんには、抗ＦＳＴＬ１抗体治療が適用できる可能性が示唆された。
【0051】
【表1】
【0052】
さらに、上記６がん種におけるＦＳＴＬ１とＤＩＰ２Ａの発現レベルを進行ステージ（ステージＩ－ＩＶ）別に解析した結果を図１１に示した。図中、黒丸（●）は各ステージにおける発現レベルの平均値、白抜丸（○）は各個体値を示す。この解析結果から、ＦＳＴＬ１およびＤＩＰ２Ａともに、ステージＩ～ＩＩＩで発現が増強されており、ＦＳＴＬ１は特にステージＩで増強されていることが明らかとなった。また、ステージＩでは、他のステージに比べてＦＳＴＬ１とＤＩＰ２Ａを同時に発現する共発現性が有意に増強されて見られ、両分子ががん転移を制御していることから、まさにがん細胞は離脱しようとする原発巣でＦＳＴＬ１とＤＩＰ２Ａの発現を増強し、がんの進展や転移を促進していると推測される。この結果から、ＦＳＴＬ１とＤＩＰ２Ａの発現、特に両分子の共発現とその相関性を検出することが、がん転移の早期発見や早期治療に結び付く可能性が臨床レベルで示唆された。
【0053】
〔実施例４：進行期メラノーマ患者由来の腫瘍組織におけるＦＳＴＬ１とＤＩＰ２Ａの発現解析〕
（１）実験方法
進行期メラノーマ患者由来の腫瘍組織として、原発腫瘍組織および転移腫瘍組織を含む切片セット（Human malignant melanoma、品番ＣＫ２）をSuper Bio Chip社より購入し、実施例３と同じ方法でＦＳＴＬ１とＤＩＰ２Ａの免疫染色を行い、ピクセルカウントを測定して発現強度を解析した。
（１）実験方法
進行期メラノーマ患者由来の腫瘍組織として、原発腫瘍組織および転移腫瘍組織を含む切片セット（Human malignant melanoma、品番ＣＫ２）をSuper Bio Chip社より購入し、実施例３と同じ方法でＦＳＴＬ１とＤＩＰ２Ａの免疫染色を行い、ピクセルカウントを測定して発現強度を解析した。
【0054】
（２）結果
結果を図１２および図１３に示した。図１２のピクセルカウント数からわかるように、原発腫瘍組織および転移腫瘍組織（主にリンパ節）における両分子の発現レベルに統計学的有意差はなかったが、原発巣で比較的高い傾向にあった。一方、縦軸にＦＳＴＬ１発現レベルと横軸にＤＩＰ２Ａ発現レベルを用いた図から、転移腫瘍組織と異なり、原発腫瘍組織ではＦＳＴＬ１／ＤＩＰ２Ａ共発現の発現様式が多く見られ、ＦＳＴＬ１とＤＩＰ２Ａとの間に相関性が見られた。つまり、上記実施例３でも考察したように、原発巣におけるＦＳＴＬ１とＤＩＰ２Ａの発現やその相関性を検出することが、がん転移の早期発見や早期治療に結び付く可能性が示唆された。
結果を図１２および図１３に示した。図１２のピクセルカウント数からわかるように、原発腫瘍組織および転移腫瘍組織（主にリンパ節）における両分子の発現レベルに統計学的有意差はなかったが、原発巣で比較的高い傾向にあった。一方、縦軸にＦＳＴＬ１発現レベルと横軸にＤＩＰ２Ａ発現レベルを用いた図から、転移腫瘍組織と異なり、原発腫瘍組織ではＦＳＴＬ１／ＤＩＰ２Ａ共発現の発現様式が多く見られ、ＦＳＴＬ１とＤＩＰ２Ａとの間に相関性が見られた。つまり、上記実施例３でも考察したように、原発巣におけるＦＳＴＬ１とＤＩＰ２Ａの発現やその相関性を検出することが、がん転移の早期発見や早期治療に結び付く可能性が示唆された。
【0055】
また、図１３は原発巣におけるＦＳＴＬ１とＤＩＰ２Ａの発現レベルを種々の分類で解析したものであるが、年齢や性別、患者生存月数などでは有意な相関は認められなかった。ただし、ＤＩＰ２Ａを全体の平均値以上に高発現する患者の場合には生存期間が短く（低発現４１．０ヶ月ｖｓ高発現３４．０ヶ月；Ｐ＝０．３１０３）、ＤＩＰ２Ａを平均値以上に高発現し、かつＦＳＴＬ１も同時に高発現する患者はさらに生存期間が短くなる傾向が観察された（Ｆ高発現２１．８ヶ月ｖｓＦ低発現３９．４ヶ月；Ｐ＝０．１６０８）。一方、図１３に示したように、全患者の平均生存月数「３８ヶ月間」を基準にグループ分けして原発巣におけるＦＳＴＬ１とＤＩＰ２Ａの発現を比較すると、ＦＳＴＬ１発現レベルに差が見られなかったものの、ＤＩＰ２Ａ発現（短期生存者１７４０８ｖｓ長期生存者７９３８）ならびにＦＳＴＬ１とＤＩＰ２Ａの共発現（短期生存者７６３５ｖｓ長期生存者３２８８）のレベルが短期生存患者では増強されていることが分かった。また、ＦＳＴＬ１発現とＤＩＰ２Ａ発現との相関性は男性患者でのみ見られ、平均生存月数「３６ヶ月間」を基準にしてグループ分けした場合にも、短期生存男性患者でのみ両分子の発現が相関することが分かった。以上の結果から、メラノーマ患者においては、ＦＳＴＬ１とＤＩＰ２Ａの両方の発現レベルが患者の予後、特に、男性患者の予後を規定する因子となる可能性が示唆された。
【0056】
〔実施例５：各種がん患者の血清中ＦＳＴＬ１濃度測定〕
（１）実験方法
各種（皮膚がん、肺がん、卵巣がん、大腸がん、前立腺がん、乳がん）末期がん患者（ステージＩＶ）の血清を購入し（ProMedDx社）、血清中のＦＳＴＬ１濃度を、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ Ｈｕｍａｎ ＦＳＴＬ１（R&D Systems社、Cat# DY1694）を使用して測定した。測定は製品のプロトコールに従って行った。
（１）実験方法
各種（皮膚がん、肺がん、卵巣がん、大腸がん、前立腺がん、乳がん）末期がん患者（ステージＩＶ）の血清を購入し（ProMedDx社）、血清中のＦＳＴＬ１濃度を、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ Ｈｕｍａｎ ＦＳＴＬ１（R&D Systems社、Cat# DY1694）を使用して測定した。測定は製品のプロトコールに従って行った。
【0057】
（２）結果
結果を図１４に示した。図中黒丸（●）は、各がん患者の血清中ＦＳＴＬ１濃度の平均値を示す。各種末期がん患者の血清中のＦＳＴＬ１濃度は、皮膚がん、肺がん、卵巣がん、大腸がん、前立腺がん、乳がんの順で高かった。末期がん患者では一般に転移を起こしている可能性が高く、特にメラノーマなどの皮膚がんの末期患者は転移の頻度が高いことが知られている。皮膚がんの患者の血清中ＦＳＴＬ１濃度の平均値は７７．７ｎｇ/ｍＬであり、うち２名はメラノーマ患者で、うち１名の患者の血清中ＦＳＴＬ１濃度は２８５．９ｎｇ／ｍＬと高かった。正常人の血清中ＦＳＴＬ１濃度はおおよそ１０ｎｇ／ｍＬ以下であることが報告されているが（Arthritis Res Ther. 2011 Feb）、メラノーマ患者血清中のＦＳＴＬ１濃度は平均で７７．７ｎｇ/ｍＬであったことから、明らかに正常人との違いを識別できる。この結果から、血清中のＦＳＴＬ１濃度が高い患者に対して、抗ＦＳＴＬ１抗体治療が奏功する可能性が期待できることが示唆された。
結果を図１４に示した。図中黒丸（●）は、各がん患者の血清中ＦＳＴＬ１濃度の平均値を示す。各種末期がん患者の血清中のＦＳＴＬ１濃度は、皮膚がん、肺がん、卵巣がん、大腸がん、前立腺がん、乳がんの順で高かった。末期がん患者では一般に転移を起こしている可能性が高く、特にメラノーマなどの皮膚がんの末期患者は転移の頻度が高いことが知られている。皮膚がんの患者の血清中ＦＳＴＬ１濃度の平均値は７７．７ｎｇ/ｍＬであり、うち２名はメラノーマ患者で、うち１名の患者の血清中ＦＳＴＬ１濃度は２８５．９ｎｇ／ｍＬと高かった。正常人の血清中ＦＳＴＬ１濃度はおおよそ１０ｎｇ／ｍＬ以下であることが報告されているが（Arthritis Res Ther. 2011 Feb）、メラノーマ患者血清中のＦＳＴＬ１濃度は平均で７７．７ｎｇ/ｍＬであったことから、明らかに正常人との違いを識別できる。この結果から、血清中のＦＳＴＬ１濃度が高い患者に対して、抗ＦＳＴＬ１抗体治療が奏功する可能性が期待できることが示唆された。
【0058】
〔実施例６：マウス骨肉腫細胞移植モデルを用いた抗ＦＳＴＬ１抗体の薬効評価〕
（１）実験方法
マウス骨肉腫細胞株であるＮＨＯＳ細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下に移植したモデルを用いて、抗腫瘍効果を解析した。抗ＦＳＴＬ１抗体としてクローン#6-55を用いた。実験は、抗体の投与日がＮＨＯＳ細胞移植後の７日後である以外は参考例１と同じ手順で行った。評価は、皮下腫瘍増殖と血清中のＦＳＴＬ１濃度について行った。血清中のＦＳＴＬ１濃度測定は発明者らが予め取得した抗ＦＳＴＬ１抗体２種を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ系を用いて測定した。具体的には、５μｇ／ｍＬの#6-55抗体を５０μＬプレートに添加し、終夜４℃で固相化した。ブロッキング後、洗浄を行い、各サンプルを添加し室温で２時間インキュベートした。洗浄後、ビオチン標識した#33抗体を室温で１時間反応させた。洗浄後、ストレプトアビジン-PolyHRP80複合体を１０００倍希釈で添加し、遮光して室温で３０分反応させた。洗浄後、発色基質を加え３０分反応させた後、吸光度を測定した。
（１）実験方法
マウス骨肉腫細胞株であるＮＨＯＳ細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下に移植したモデルを用いて、抗腫瘍効果を解析した。抗ＦＳＴＬ１抗体としてクローン#6-55を用いた。実験は、抗体の投与日がＮＨＯＳ細胞移植後の７日後である以外は参考例１と同じ手順で行った。評価は、皮下腫瘍増殖と血清中のＦＳＴＬ１濃度について行った。血清中のＦＳＴＬ１濃度測定は発明者らが予め取得した抗ＦＳＴＬ１抗体２種を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ系を用いて測定した。具体的には、５μｇ／ｍＬの#6-55抗体を５０μＬプレートに添加し、終夜４℃で固相化した。ブロッキング後、洗浄を行い、各サンプルを添加し室温で２時間インキュベートした。洗浄後、ビオチン標識した#33抗体を室温で１時間反応させた。洗浄後、ストレプトアビジン-PolyHRP80複合体を１０００倍希釈で添加し、遮光して室温で３０分反応させた。洗浄後、発色基質を加え３０分反応させた後、吸光度を測定した。
【0059】
（２）結果
図１５に抗腫瘍効果の結果を示し、図１６に血清中のＦＳＴＬ１濃度測定の結果を示した。抗ＦＳＴＬ１抗体（#6-55）は皮下腫瘍の増殖を抑制し、血清中のＦＳＴＬ１濃度も低下して抗腫瘍効果を支持するものであった。このことから、抗ＦＳＴＬ１抗体が骨肉腫に対しても奏功する可能性が示唆された。
図１５に抗腫瘍効果の結果を示し、図１６に血清中のＦＳＴＬ１濃度測定の結果を示した。抗ＦＳＴＬ１抗体（#6-55）は皮下腫瘍の増殖を抑制し、血清中のＦＳＴＬ１濃度も低下して抗腫瘍効果を支持するものであった。このことから、抗ＦＳＴＬ１抗体が骨肉腫に対しても奏功する可能性が示唆された。
【0060】
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】