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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-01-20
(45)【発行日】2022-02-14
(54)【発明の名称】新規な細菌種
(51)【国際特許分類】
C12N 1/20 20060101AFI20220204BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20220204BHJP
A61P 3/04 20060101ALI20220204BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20220204BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20220204BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20220204BHJP
A61P 9/12 20060101ALI20220204BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20220204BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20220204BHJP
A61P 3/06 20060101ALI20220204BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20220204BHJP
A61P 11/06 20060101ALI20220204BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20220204BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20220204BHJP
A61P 25/24 20060101ALI20220204BHJP
A61P 17/02 20060101ALI20220204BHJP
A61P 25/32 20060101ALI20220204BHJP
A61P 25/20 20060101ALI20220204BHJP
A61P 19/08 20060101ALI20220204BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220204BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20220204BHJP
A61K 35/741 20150101ALI20220204BHJP
【ＦＩ】
C12N1/20 A
C12N1/20 E
A61P37/04
A61P3/04
A61P3/10
A61P1/04
A61P9/10
A61P9/12
A61P9/00
A61P1/16
A61P3/06
A61P37/08
A61P11/06
A61P25/16
A61P25/00
A61P25/24
A61P17/02
A61P25/32
A61P25/20
A61P19/08
A61P35/00
A61P31/04
A61K35/741
【請求項の数】
13
(21)【出願番号】P 2019503784
(86)(22)【出願日】2017-04-11
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2019-04-18
(86)【国際出願番号】 EP2017058700
(87)【国際公開番号】W WO2017178496
(87)【国際公開日】2017-10-19
【審査請求日】2020-03-12
(31)【優先権主張番号】16164743.3
(32)【優先日】2016-04-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
【微生物の受託番号】CBS CBS 141023
(73)【特許権者】
【識別番号】515131390
【氏名又は名称】ヴァーヘニンゲン ユニバーシテイト
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】デ ヴォス，ウィレム メインデルト
(72)【発明者】
【氏名】ベルザー，クララ
【審査官】坂崎 恵美子
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１６－５０３４１８（ＪＰ，Ａ）
【文献】INTERNATIONAL JOURNAL OF SYSTEMATIC AND EVOLUTIONARY MICROBIOLOGY，2016年，Vol.66，p.4614-4620
【文献】The ISME Journal，2012年，Vol.6，p.1449-1458
【文献】INTERNATIONAL JOURNAL OF SYSTEMATIC AND EVOLUTIONARY MICROBIOLOGY，2014年，Vol.54, No.5，p.1469-1476
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／２０
Ａ６１Ｋ ３５／７４１
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＣＢＳ１４１０２３として寄託されている菌株であり、唯一の炭素源および窒素源としてのムチンで生育することができ、さらに唯一の炭素源としてのＮ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、グルコース、ラクトース、マルトースまたはガラクトースで生育することができる、単離されたアッカーマンシア・グリカニフィルス菌株。
【請求項2】
請求項１に記載の単離されたアッカーマンシア・グリカニフィルス菌株と、生理学的に許容される担体と、を含む組成物。
【請求項3】
前記アッカーマンシア・グリカニフィルスは凍結乾燥またはマイクロカプセル化された形態で存在する、請求項２に記載の組成物。
【請求項4】
前記アッカーマンシア・グリカニフィルスは１０４～１０１５細胞の範囲の量で存在する、請求項２または３に記載の組成物。
【請求項5】
医薬として使用するための、請求項１に記載の単離されたアッカーマンシア・グリカニフィルス菌株または請求項２～４のいずれかに記載の組成物。
【請求項6】
腸粘膜免疫系機能を促進するのに使用するための、または哺乳類における腸粘膜バリアの物理的完全性を維持、回復および／または増大させるのに使用するための、請求項１に記載の単離されたアッカーマンシア・グリカニフィルス菌株または請求項２～４のいずれかに記載の組成物。
【請求項7】
メタボリックシンドローム、肥満、インスリン欠乏もしくはインスリン抵抗性に関連する障害、２型糖尿病、１型糖尿病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、耐糖能異常、脂質代謝異常、高血糖症、脂質異常症、肥満（体重増加）に関連する免疫系の機能不全、高コレステロール、トリグリセリドの上昇、および腸粘膜バリアの物理的完全性を変える状態からなる群から選択される障害を予防および／または治療するのに使用するための、請求項１に記載の単離されたアッカーマンシア・グリカニフィルス菌株または請求項２～４のいずれかに記載の組成物。
【請求項8】
プロバイオティクスおよび／またはシンバイオティクスとして使用するための、請求項１に記載の単離されたアッカーマンシア・グリカニフィルス菌株または請求項２～４のいずれかに記載の組成物。
【請求項9】
体重減少を促進するのに使用するための、請求項１に記載の単離されたアッカーマンシア・グリカニフィルス菌株または請求項２～４のいずれかに記載の組成物。
【請求項10】
哺乳類の胃腸（ＧＩ）管におけるアッカーマンシア・グリカニフィルスのレベルを増加させ、前記哺乳類のＧＩ管において前記アッカーマンシア・グリカニフィルス菌株の増殖を促進させるのに使用するための、請求項１に記載の単離されたアッカーマンシア・グリカニフィルス菌株または請求項２～４のいずれかに記載の組成物であって、前記単離されたアッカーマンシア・グリカニフィルス菌株が、ビルディングブロックとしてグルコサミンまたはＮ－アセチルグルコサミンなどのグルコサミンの誘導体およびポリフェノール類からなる群から選択される化合物と共に前記哺乳類に投与される、上記単離されたアッカーマンシア・グリカニフィルス菌株または組成物。
【請求項11】
哺乳類の胃腸（ＧＩ）管におけるアッカーマンシア・グリカニフィルスのレベルを増加させ、前記哺乳類のＧＩ管における前記アッカーマンシア・グリカニフィルス菌株の増殖を促進するのに使用するための、請求項１に記載の単離されたアッカーマンシア・グリカニフィルス菌株または請求項２～４のいずれかに記載の組成物と、ビルディングブロックとしてグルコサミンまたはＮ－アセチルグルコサミンなどのグルコサミンの誘導体およびポリフェノール類からなる群から選択される化合物との組み合わせ物。
【請求項12】
請求項１に記載の、美容的に有効な量の単離されたアッカーマンシア・グリカニフィルス菌株を含む美容組成物。
【請求項13】
体重減少を促進するための、請求項１に記載の単離されたアッカーマンシア・グリカニフィルス菌株または請求項１２に記載の美容組成物の美容的利用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、過体重および肥満に関連する代謝性疾患、例えば２型糖尿病および高コレステロールなどの代謝性疾患の予防および／または治療に関する。本発明は哺乳類、例えばヒトまたはペットまたは生産動物における腸粘膜免疫系機能を調節および／または促進し、かつ／または腸粘膜バリアの物理的完全性を維持および／または回復および／または増大させる方法にも関する。
【背景技術】
【0002】
肥満は主に、好ましくない遺伝的背景に対する有害な栄養および身体的習慣の結果である。それは２型糖尿病、心血管疾患、肺高血圧症、睡眠時無呼吸および多くの癌のリスクが高まるなどの深刻な健康への影響を有し、かつ死亡率のリスクの上昇に強く結び付けられている。
【0003】
ヒトの腸管は多種多様な微生物を含み、そのうち細菌が最も多くかつ多様である。全体として、マイクロバイオームはヒトゲノムよりも１００倍以上も多い。従って、腸の微生物叢は代謝全体に寄与する「外面化された器官」としてみなすことができ、食物を栄養やエネルギーに変換する役割を担う。少なくとも１０１４個の細菌からなる共同体は嫌気性細菌によって支配されており、数千の種からなり、現在ではそこから１０００種が培養されている（Ｒａｊｉｌｉｃ Ｓｔｏｊａｎｏｖｉｃ ａｎｄ ｄｅ Ｖｏｓ，２０１４，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ３８：９９６－１０４７）。
【0004】
宿主の代謝における腸の微生物叢の役割についての多くの証拠が存在する。現在のところ腸内細菌の恒常性は、宿主の特性（年齢、性別および遺伝的背景など）、環境条件（ストレス、薬物および消化管手術など）ならびに食事によって決まると考えられている。
【0005】
プレバイオティクスで治療した場合、食事性肥満および糖尿病のマウスは、グルコースおよび脂質代謝の改善、血漿ＬＰＳの減少および腸のバリア機能の改善（例えば、炎症の減少）、腸内分泌Ｌ細胞数の増加ならびにレプチン感受性およびグルコース恒常性の改善を示した（Ｅｖｅｒａｒｄら，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２０１１，ｖｏｌ．６０（１１）：２７７５－８６）。プレバイオティクス治療により、これらのマウスにおける腸内微生物叢の組成はかなり変わり、特にアッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）の存在量がかなり増加した。
【0006】
対照飼料または高脂肪（ＨＦ）飼料を与えたマウスにアッカーマンシア・ムシニフィラ（A. muciniphila）を経口投与すると、食物摂取量を全く変更しなくても食事性代謝性内毒素血症（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｄｏｔｏｘｅｍｉａ）、脂肪症および脂肪組織ＣＤ１１ｃマーカーが正常化されることが分かった（国際公開第２０１４／０７５７４５号）。さらに、アッカーマンシア・ムシニフィラ（A. muciniphila）治療により体重が減少し、かつ体組成（すなわち脂肪量／筋肉量の比）が改善した。ＨＦ飼料条件下では、アッカーマンシア・ムシニフィラ治療は脂質生成に影響を与えることなく脂肪細胞分化および脂質酸化のマーカーのｍＲＮＡ発現を増加させることが分かった。また、アッカーマンシア・ムシニフィラによるコロニー形成により食事性空腹時高血糖が完全に正常化し、かつ治療後にインスリン抵抗指数が同様に低下することも分かった。最後に、アッカーマンシア・ムシニフィラにより腸のバリア機能が高まることが分かった（Ｊ Ｒｅｕｎａｎｅｎら ２０１５， Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８１：３６５５－６２）。我々を病原体および有害な腸成分から保護しているのはこの腸のバリアであり、バリア機能の障害は、ＩＢＳ、ＩＢＤおよび腸の健康に関連する他の疾患を含む各種疾患および障害に関連づけられている。最近では腸のバリアは、腸管内腔を宿主内部から分離し、かつ機械的要素、体液性要素、免疫学的要素、筋肉的要素および神経学的要素からなる機能的実体として定義されている（ＳＣ Ｂｉｓｈｏｆｆら，２０１４，ＢＭＣ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１４：１８９）。故に、腸のバリアの測定可能な特徴として定めることができる腸透過性を改善することは腸の健康に影響を与えるものに寄与する重要な因子である。
【0007】
腸管において有用になるためには、プロバイオティクス細菌は腸管内の適当な位置において活性になるものでなければならない。ヒトおよび他の動物の腸管は複雑な構造を有し、そこでは特にｐＨの違いが甚大である。ヒトの腸管では、管腔内ｐＨは酸性の胃に続く十二指腸では約ｐＨ６であり、小腸においてｐＨ６から回腸終端部におけるｐＨ７．４まで上昇し、盲腸においてｐＨ５．７まで低下し、徐々に増加して直腸においてｐＨ６．７に到達する。いくつかの動物では非常に様々なｐＨが認められ、イヌのｐＨは通常はヒトよりも高く最大ｐＨ７．３であるが、ネコではｐＨ６．６よりも低いことがあり、品種によっても異なる。変化は食事、年齢および疾患によって生じることがある。このｐＨは水素イオン濃度の１０を底とする対数を反映するものであり、故に１単位のｐＨの変化は水素イオン濃度における１０倍の差を表す。それ故に、ヒトならびにペットまたは生産動物における用途の両方のために異なるｐＨ値で作用するプロバイオティクスを有することに関心が寄せられている。
【発明の概要】
【0008】
本発明の目的は、代謝性疾患を予防および／または治療し、かつ／または腸のバリア機能を改善するのに有用である新規なプロバイオティクスを提供することにある。
【0009】
本発明は、好ましくは唯一の炭素源および窒素源としてのムチンで生育することができ、かつ好ましくはさらに唯一の炭素源としてのＮ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、グルコース、ラクトース、マルトースまたはガラクトースで生育することができる単離されたアッカーマンシア・グリカニフィルス（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｇｌｙｃａｎｉｐｈｉｌｕｓ）菌株に関する。一実施形態では、前記菌株はＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（オランダの微生物保存センター）にＣＢＳ１４１０２３として寄託されている菌株またはそれに由来する菌株である。
【0010】
本発明は、本明細書において教示されている単離されたアッカーマンシア・グリカニフィルス菌株および生理学的に許容される担体を含む組成物も提供する。前記組成物は、好ましくはカプセル、錠剤または粉末などの固体剤形の医薬組成物であってもよい。一実施形態では、前記アッカーマンシア・グリカニフィルスは凍結乾燥もしくはマイクロカプセル化された形態で存在する。前記アッカーマンシア・グリカニフィルスは、約１０４～約１０１５細胞の範囲の量で存在してもよい。
【0011】
本発明はさらに、医薬として使用するため、プロバイオティクスおよび／またはシンバイオティクスとして使用するため、あるいは美容品として使用するための本明細書において教示されている単離されたアッカーマンシア・グリカニフィルス菌株または本明細書において教示されている組成物に関する。本明細書において教示されている菌株または組成物は、例えば腸粘膜免疫系機能を促進するため、哺乳類における腸粘膜バリアの物理的完全性を維持、回復および／または増大させるため、体重減少を促進するため、および／またはメタボリックシンドローム、肥満、インスリン欠乏もしくはインスリン抵抗性に関連する障害、２型糖尿病、１型糖尿病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、耐糖能異常、脂質代謝異常、アテローム性動脈硬化症、高血圧症、心臓病、脳卒中、非アルコール性脂肪性肝疾患、アルコール性脂肪性肝疾患、高血糖症、肝臓脂肪症、脂質異常症、肥満（体重増加）に関連する免疫系の機能不全、アレルギー、喘息、自閉症、パーキンソン病、多発性硬化症、神経変性疾患、鬱病、バリア機能の障害に関連する他の疾患、創傷治癒、行動障害、アルコール依存症、心血管疾患、高コレステロール、トリグリセリドの上昇、アテローム性動脈硬化症、睡眠時無呼吸、骨関節炎、胆嚢疾患、癌ならびに食物アレルギー、例えば赤ん坊が未熟児で生まれたことに起因する腸の未成熟、放射線、化学療法および／または毒素への曝露などの腸粘膜バリアの物理的完全性を変える状態、自己免疫不全、栄養不良および敗血症からなる群から選択される障害を予防および／または治療するために使用してもよい。
【0012】
最後の態様では、本発明は、哺乳類、好ましくはヒトの胃腸（ＧＩ）管におけるアッカーマンシア・グリカニフィルスのレベルを増加させるための方法であって、本明細書において教示されている単離されたアッカーマンシア・グリカニフィルス菌株または組成物を前記哺乳類に投与するステップと、ビルディングブロックとしてグルコサミンまたはＮ－アセチルグルコサミンなどのグルコサミンの誘導体を含む化合物およびポリフェノール類からなる群から選択される化合物を前記哺乳類に投与することによって前記哺乳類のＧＩ管において前記アッカーマンシア・グリカニフィルス菌株の増殖を促進させるステップと、を含む方法を提供する。
【0013】
定義
本明細書で使用される「プロバイオティクス」または「プロバイオティクス製品」という用語は、有効量で投与または摂取されると宿主（例えばヒトまたは哺乳類）に健康上の利点を与える腸内細菌などの微生物を指す。好ましくは、プロバイオティクスはプロバイオティクスが宿主の大腸にコロニーを形成することができるように対象に投与された際に活性になるか生存可能でなければならない。但し特定の条件下では、プロバイオティクスによって産生される物質がなお宿主に対してプロバイオティクスすなわち有益な効果を与えるという条件であれば、プロバイオティクスは投与される際に死滅していてもよい。大部分のプロバイオティクスまたはプロバイオティクス製品は乳酸桿菌またはビフィズス菌などの乳酸菌からなる。当業者はプロバイオティクスの分野に精通しており、プロバイオティクス活性を有する乳酸菌を選択する方法を知っている。
本明細書で使用される「プロバイオティクス」または「プロバイオティクス製品」という用語は、有効量で投与または摂取されると宿主（例えばヒトまたは哺乳類）に健康上の利点を与える腸内細菌などの微生物を指す。好ましくは、プロバイオティクスはプロバイオティクスが宿主の大腸にコロニーを形成することができるように対象に投与された際に活性になるか生存可能でなければならない。但し特定の条件下では、プロバイオティクスによって産生される物質がなお宿主に対してプロバイオティクスすなわち有益な効果を与えるという条件であれば、プロバイオティクスは投与される際に死滅していてもよい。大部分のプロバイオティクスまたはプロバイオティクス製品は乳酸桿菌またはビフィズス菌などの乳酸菌からなる。当業者はプロバイオティクスの分野に精通しており、プロバイオティクス活性を有する乳酸菌を選択する方法を知っている。
【0014】
本明細書で言及される「アッカーマンシア・グリカニフィルス」という名前を有する種は、例えばＯｕｗｅｒｋｅｒｋら（２０１６．Ｉｎｔ Ｊ ｏｆ Ｓｙｓｔ Ｅｖｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６６：１－７）において使用されている「アッカーマンシア・グリカニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｇｌｙｃａｎｉｐｈｉｌａ）」という名前を有する種と同じである。従って、これらの名前は同義で使用することができる。
【0015】
本明細書で使用される「プレバイオティクス」または「プレバイオティクス製品」という用語は一般に、それらの宿主の健康に寄与するＧＩ微生物の増殖および／または活性を促進する化合物を指す。プレバイオティクスまたはプレバイオティクス製品は主に発酵性繊維または非消化性炭水化物からなる。プロバイオティクスによるこれらの繊維の発酵は、ＳＣＦＡ（特に酪酸）などの有益な最終産物の産生を促進する。当業者はプレバイオティクスの分野に精通しており、プレバイオティクス活性を有する成分を選択する方法を知っている。
【0016】
本明細書で使用される「シンバイオティクス」または「シンバイオティクス製品」という用語は一般に、プロバイオティクスとプレバイオティクスなどのＧＩ微生物の増殖および／または活性を促進する１種以上の化合物とを組み合わせて１つの製品にした組成物および／または栄養補助食品を指す。シンバイオティクスは、プロバイオティクスの増殖を選択的に刺激し、かつ／またはその代謝を活性化させることによりＧＩ管におけるプロバイオティクスの生存およびコロニー形成を向上させ、このようにして宿主の健康を改善することによって宿主に有利に影響を与える。当業者は、シンバイオティクスに精通しており、組み合わせてシンバイオティクスにすることができる成分を選択する方法を知っている。
【0017】
本明細書で使用される「有益な腸内細菌種」という用語は、哺乳類（例えばヒト）の腸に生息し（すなわち生まれつき存在し）、かつそれが生息している哺乳類のＧＩ、代謝および他の健康に有益な効果（例えば、病原菌種からの保護、酪酸および／または酪酸塩および誘導体などの産生）を与える細菌種を指す。有益な腸内細菌種の非限定的な例としては、乳酸桿菌およびビフィズス菌属の乳酸菌が挙げられる。有益な腸内細菌種の他の非限定的な例としては、アセチルＣｏＡを使用して米国特許出願公開第２０１４／０２４２６５４号、国際公開第２０１４／１５００９４号または国際公開第２０１３０３２３２８Ａ１号に開示されている細菌の菌株などの酪酸および／または酪酸塩およびその誘導体を産生する酪酸産生細菌種が挙げられる。同様に、プロピオン酸塩産生種はプロバイオティクスとしてみなすことができるが、それはプロピオン酸塩が酪酸塩のように体重およびインスリン感受性を制御し、特に調節性Ｔ細胞を介して免疫系にシグナルを送り、かつＦＦＡＲ２受容体を介して神経回路に影響を与えるからである（Ｃａｎｆｏｒａら，２０１５．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １１：５７７－５９１；Ｓｍｉｔｈら，２０１３．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４１：５６９－５７３：Ｅｒｎｙら，２０１５，Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １８：９６５－９７７）。プロピオン酸塩は肝臓での糖新生のための基質であり、脂質およびコレステロール合成に対する阻害効果および炎症および発癌に対する保護効果を有する（Ｈｏｓｓｅｉｎｉら，２０１１．Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｒｅｖｉｅｗｓ ６９：２４５－２５８）。ヒトにおける食事介入により、プロピオン酸塩が満腹感を増加させて食欲を調節し、それにより過体重の成人において体重維持が得られることも分かっている（Ｃｈａｍｂｅｒｓら ２０１５．Ｇｕｔ ６４：１７４４－１７５４）。
【0018】
本明細書で使用される「病原菌種」という用語は、哺乳類（例えばヒト）の腸に生息して（すなわち生まれつき存在し）、かつそれが生息している哺乳類のＧＩ健康に対して有害な作用（例えば感染）を与える細菌を指す。病原菌種のよく知られている非限定的な例は毒素産生クロストリジウム・ディフィシルである。
【0019】
本明細書で使用される「有効量」という用語は、本明細書において教示されている効果を達成するのに必要な量を指す。有効量は当業者によって過度な実験を行うことなく容易に決定することができる。
【0020】
本明細書で使用される「それに由来する菌株」という用語は、出発材料として本明細書において教示されている寄託菌株を使用することによって得られる菌株に関する。それに由来する菌株は、例えば、遺伝子工学、放射線、ＵＶ光、化学処理によって本発明の菌株から得ることができる突然変異菌株であってもよい。あるいは、そのような誘導体または突然変異菌株は、特定の条件への増殖適応に供されて、より迅速な増殖や腸でのより良好な生存などのさらなる利点が誘導体菌株にもたらされる本明細書において教示されている寄託菌株に由来する菌株であってもよい。これらの誘導体または突然変異は本明細書において教示されている寄託菌株と機能的に同等であることが好ましい。本明細書において教示されている好ましい誘導体または突然変異体は、本明細書において教示されている寄託菌株と実質的に同じ活性または機能を有している。これらの誘導体または突然変異体は有利には、寄託菌株を投与した場合と同様に、前記誘導体または突然変異体が投与される哺乳類（例えばヒトまたは他の哺乳類）に実質的に同じ利点を与える。また、これらの誘導体または突然変異菌株は、寄託菌株について本明細書に記載されている同じ特性を有する自然発生的な誘導体または突然変異菌株であってもよい。
【0021】
「消費に適した」または「栄養的に許容される」という用語は、一般にヒト（ならびに他の哺乳類）の消費にとって安全であるとみなされている成分または物質を指す。
【0022】
本明細書で使用される「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語およびそれらの活用形は、前記用語がその用語の後ろにある項目が含まれるが、具体的に言及されていない項目が排除されないことを意味するようにそれらの非限定的な意味で使用される状況を指す。これは、より限定的な動詞「本質的に～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」および「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）」も包含する。
【0023】
不定冠詞「ａ」または「ａｎ」による要素の参照は、その文脈が明らかにその要素の１つおよび１つのみが存在することを要件としない限り、その要素の２つ以上が存在するという可能性を排除しない。従って、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は通常「少なくとも１つ」を意味する。
【0024】
「増加する」および「増加したレベル」という用語ならびに「減少する」および「減少したレベル」という用語は、有意に増加させるか有意に減少させる能力あるいは有意に増加したレベルまたは有意に減少したレベルを指す。一般にレベルは、対照または参照における対応するレベルよりも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％以上または以下などの少なくとも５％でそれぞれ増加または減少する。あるいは、試料中のレベルが対照または参照におけるレベルと比較した場合に統計的に有意に増加または減少している場合に増加または減少していると言ってもよい。
【発明を実施するための形態】
【0025】
細菌
本発明者らは、アミメニシキヘビの腸から新しいアッカーマンシア属種の菌株ＰｙｔＴを単離した。
本発明者らは、アミメニシキヘビの腸から新しいアッカーマンシア属種の菌株ＰｙｔＴを単離した。
【0026】
これは、グラム陰性、非運動性、偏性嫌気性の楕円形をした非胞子形成性細菌である。これは唯一の炭素、エネルギーおよび窒素源のムチンを使用することができ、これはヒト型菌株アッカーマンシア・ムシニフィラＭｕｃＴと共有する特性である。菌株ＰｙｔＴはＮ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、グルコース、ラクトース、マルトースおよびガラクトースなどの限られた数の単糖で生育することができたが、豊富なタンパク質源が提供された場合のみであった。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子シークエンシングに基づく系統発生解析により、菌株ＰｙｔＴはウェルコミクロビウム綱Ｉ、アッカーマンシア科、アッカーマンシア属に属し、かつアッカーマンシア・ムシニフィラＭｕｃＴと最も近い類縁である（９４．４％の配列類似性）ことが分かった。表現型、系統発生および遺伝的特性に基づき、菌株ＰｙｔＴはアッカーマンシア属内の新規な種を表し、その名前として基準株ＰｙｔＴと共にアッカーマンシア・グリカニフィルス新種が提案されている。
【0027】
従って、本発明は２０１６年２月２４日にワーゲニンゲン（Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ）大学によってＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｕｐｐｓａｌａｌａａｎ８、オランダ）に寄託されて寄託番号ＣＢＳ１４１０２３を受けた菌株であるアッカーマンシア・グリカニフィルス菌株、例えば基準株ＰｙｔＴまたはそれに由来している菌株に関する。
【0028】
一実施形態では、前記菌株は唯一の炭素源および窒素源としてのムチンで生育することができる。ムチングリカンは主にガラクトース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミンからなり、アッカーマンシア・グリカニフィルス菌株ＰｙｔＴはこれらの全てを増殖基質として使用することができる。菌株アッカーマンシア・ムシニフィラＭｕｃＴとは対照的に、アッカーマンシア・グリカニフィルス菌株ＰｙｔＴはガラクトースを唯一の炭素源として使用することができ、主にプロピオン酸塩、酢酸塩および少量のコハク酸塩を産生する。
【0029】
アッカーマンシア・グリカニフィルス菌株ＰｙｔＴは最適に増殖することができる幅広いｐＨ範囲を有し、その最適ｐＨはアッカーマンシア・ムシニフィラＭｕｃＴよりも約０．５ｐＨ単位低い。
【0030】
肥満もしくは過体重の対象の腸はアッカーマンシア・ムシニフィラが枯渇しており、アッカーマンシア・ムシニフィラ補充により食物摂取量を全く変更しなくても食事性代謝性内毒素血症、脂肪症および脂肪組織ＣＤ１１ｃマーカーが正常化されることが分かった（国際公開第２０１４／０７５７４５号）。さらに、アッカーマンシア・ムシニフィラ治療により体重が減少し、かつ体組成が（すなわち、脂肪量／筋肉量の比）が改善した。アッカーマンシア・ムシニフィラとのその類似性を考慮すると、アッカーマンシア・グリカニフィルスはアッカーマンシア・ムシニフィラと同様に代謝性疾患を予防および／または治療することができると推測される。同様に、アッカーマンシア・グリカニフィルスはニシキヘビの腸において唯一のアッカーマンシア属種として認められているため、アッカーマンシア・ムシニフィラによって刺激されるバリア機能はアッカーマンシア・グリカニフィルスによって増大されることが期待される。アッカーマンシア・ムシニフィラと同様に、腸のアッカーマンシアのレベルは、アミメニシキヘビの正常なライフサイクルの一部である空腹時に増加する（Ｂｅｌｚｅｒ ａｎｄ ｄｅ Ｖｏｓ，２０１２，ＩＳＭＥ Ｊ ６：１４４９－５８）。
【0031】
一実施形態では、前記菌株はさらに、唯一の炭素源としてのＮ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、グルコース、ラクトース、マルトースまたはガラクトースで生育することができ、特に、トリプトンなどの好適な窒素源の存在下で任意にトレオニンが添加されたＮ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、Ｄ－グルコース、Ｄ－ラクトースまたはＤ－ガラクトースを含む基本培地で、例えば１６ｇ／ｌのトリプトンおよび４ｇ／ｌのトレオニンの存在下でＮ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、Ｄ－グルコース、Ｄ－ラクトースまたはＤ－ガラクトースを含む基本培地で生育することができる。トリプトンはカゼインのタンパク質分解産物であり、ダイズまたはエンドウおよび他の植物タンパク質由来のものなどの他のタンパク質源で置き換えることができる。
【0032】
組成物
本発明は、本明細書において教示されている単離されたアッカーマンシア・グリカニフィルス菌株および生理学的に許容される担体を含む組成物にも関する。
本発明は、本明細書において教示されている単離されたアッカーマンシア・グリカニフィルス菌株および生理学的に許容される担体を含む組成物にも関する。
【0033】
一実施形態では、生理学的に許容される担体は、本明細書において教示されている細菌の菌株を対象（例えば、ヒトおよび／または動物）によって消費されるまで生存可能に維持するのに適した任意の担体であればよい。例えば、この目的に適した許容される担体の非限定的な例としては、周知の生理学的もしくは薬学的担体、緩衝液および賦形剤のいずれかが挙げられる。当然のことながら、好適な生理学的もしくは薬学的担体の選択は、本明細書において教示されている組成物の意図される投与様式（例えば経口）および本組成物の意図される形態（例えば、飲料、ヨーグルト、粉末およびカプセルなど）によって決まる。当業者は、本明細書において教示されている組成物に適した生理学的もしくは薬学的担体を選択する方法を知っている。
【0034】
一実施形態では、本明細書において教示されている組成物は、食品組成物、飼料組成物、飼料用栄養補助食品組成物、食品用栄養補助食品組成物または医薬組成物の形態であってもよい。本組成物は好ましくは、人間、ペットまたは生産動物などの哺乳類による消費に適している。
【0035】
一実施形態では、本組成物は食品または食品用栄養補助食品組成物である。食品または食品用栄養補助食品組成物は、液体、液体飲料（乳飲料および発酵飲料を含む）、ヨーグルト、チーズ、ゲル、ゼラチン、ゼラチンカプセル、粉末、ペースト、圧縮錠剤およびゲルカプセルからなる群から選択されてもよい。好適な実施形態では、本組成物は液体、好ましくは液体飲料（例えば、乳飲料）である。食品または食品用栄養補助食品組成物は、乳製品、好ましくは発酵乳製品、好ましくはヨーグルトまたはヨーグルト飲料であってもよい。
【0036】
一実施形態では、本明細書において教示されている組成物はプロバイオティクス組成物であってもよい。そのようなプロバイオティクス組成物は、本明細書において教示されている単離された腸内細菌の菌株またはそれに由来する菌株のいずれかを含んでいてもよい。
【0037】
一実施形態では、本明細書において教示されている組成物は１種以上のさらなる有益な単離された腸内細菌の菌株をさらに含む。
【0038】
一実施形態では、本明細書において教示されている組成物はシンバイオティクス組成物であってもよい。１種以上のプレバイオティクス成分を本明細書において教示されている組成物に添加して、例えば本明細書において教示されている腸内細菌の菌株の効果（例えば、酪酸および／または酪酸塩またはその誘導体の産生）を高めると有利であり得る。
【0039】
一実施形態では、１種以上のプレバイオティクス成分は、本明細書において教示されている単離された腸内細菌またはそれに由来する菌株の活性を高め、かつ／またはその増殖を刺激するのに適した任意のプレバイオティクス成分であればよい。好適なプレバイオティクス成分の非限定的な例としては、繊維、セロビオース、マルトース、マンノース、サリシン、トレハロース、アミグダリン、アラビノース、メリビオース、ラムノースおよび／またはキシロースが挙げられる。
【0040】
一実施形態では、本明細書において教示されている組成物は、貯蔵中および／または胆汁への曝露中および／または哺乳類（例えば人間）のＧＩ管を通過する間の本明細書において教示されている細菌の菌株またはそれに由来する菌株の生存および／または生存率を促進するのに適した１種以上の成分を含んでいてもよい。そのような成分の非限定的な例としては、胃の通過を可能にする腸溶コーティングおよび制御放出製剤が挙げられる。当業者は、細菌の菌株を生存可能かつ機能的すなわちそれらの意図される機能を行うことができるように維持するのに適した成分を選択する方法を知っている。
【0041】
一実施形態では、本明細書において教示されている組成物は、本明細書において教示されている組成物の栄養価および／または治療効果をさらに高める１種以上の成分をさらに含んでいてもよい。例えば、タンパク質、アミノ酸、酵素、無機塩類、ビタミン類（例えば、チアミンＨＣｌ、リボフラビン、ピリドキシンＨＣｌ、ナイアシン、イノシトール、塩化コリン、パントテン酸カルシウム、ビオチン、葉酸、アスコルビン酸、ビタミンＢ１２、ｐ－アミノ安息香酸、ビタミンＡ酢酸塩、ビタミンＫ、ビタミンＤおよびビタミンＥなど）、糖類および複合糖質類（例えば、水溶性および不水溶性単糖類、二糖類および多糖類）、医薬化合物（例えば、抗生物質）、抗酸化剤、微量元素成分（例えば、コバルト、銅、マンガン、鉄、亜鉛、スズ、ニッケル、クロム、モリブデン、ヨウ素、塩素、シリコン、バナジウム、セレン、カルシウム、マグネシウム、ナトリウムおよびカリウムの化合物など）から選択される１種以上の成分（例えば、栄養成分、獣医薬剤または医薬剤など）を添加すると有利であり得る。当業者は、本明細書において教示されている組成物の栄養価および／または治療効果／薬理効果を高めるのに適した方法および成分に精通している。
【0042】
本明細書において教示されている細菌の菌株は、凍結乾燥された形態、マイクロカプセル化された形態（例えば、Ｓｏｌａｎｋｉら ＢｉｏＭｅｄ Ｒｅｓ．Ｉｎｔ．２０１３，論文ＩＤ６２０７１９によって総説されている）または細菌の菌株の活性および／または生存率を保存する任意の他の形態で本組成物に組み込まれていてもよい。
【0043】
本明細書において教示されている組成物は医薬組成物であってもよい。医薬組成物は、栄養補助食品として使用するためのものであってもよい。医薬組成物は通常、本明細書において教示されている細菌の菌株に加えて薬学的担体を含む。担体は好ましくは不活性な担体である。好ましい形態は意図される投与様式および（治療的）用途によって決まる。薬学的担体は、本明細書において教示されている細菌の菌株の細菌を対象のＧＩ管に送達するのに適した任意の適合可能な非毒性物質であればよい。通常は薬学的に許容されるアジュバント、緩衝剤および分散剤などが添加された例えば滅菌水または不活性固体を担体として使用してもよい。本明細書において教示されている医薬組成物は、液体形態、例えば本明細書において教示されている細菌の菌株の細菌の安定化された懸濁液または固体形態、例えば本明細書において教示されている細菌の菌株の凍結乾燥された細菌の粉末であってもよい。本明細書において教示されている細菌の菌株が凍結乾燥されている場合、ラクトース、トレハロースまたはグリコーゲンなどの凍結保護剤を用いることができる。例えば経口投与の場合、本明細書において教示されている細菌の菌株の細菌を凍結乾燥された細菌を含むカプセル、錠剤および粉末などの固体剤形またはエリキシル剤、シロップおよび懸濁液などの液体剤形で投与することができる。例えば凍結乾燥された形態の本明細書において教示されている細菌の菌株の細菌は、例えばグルコース、ラクトース、スクロース、マンニトール、澱粉、セルロースもしくはセルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、サッカリンナトリウム、滑石および炭酸マグネシウムなどの不活性成分および粉末状担体と共にゼラチンカプセルなどのカプセルでカプセル化することができる。
【0044】
一実施形態では、本明細書において教示されている腸内細菌またはそれに由来する菌株は、例えば約１０４～約１０１５細胞またはコロニー形成単位（ＣＦＵ）の範囲の有効量で本明細書において教示されている組成物中に含まれていてもよい。例えば、本腸内細菌は、約１０６もしくは１０７細胞（またはＣＦＵ）～約１０１４細胞（またはＣＦＵ）、好ましくは約１０８細胞（またはＣＦＵ）～約１０１３細胞（またはＣＦＵ）、好ましくは約１０９細胞（またはＣＦＵ）～約１０１２細胞（またはＣＦＵ）、より好ましくは約１０１０細胞（またはＣＦＵ）～約１０１２細胞（またはＣＦＵ）の量で本組成物に含まれていてもよい。
【0045】
本明細書において教示されている組成物は任意の従来の方法によって製造されていてもよい。
【0046】
本細菌の菌株および本組成物の方法および使用
別の態様では、本発明は医薬として使用するため、食品または食品用栄養補助食品として使用するため、あるいはプロバイオティクスおよび／またはシンバイオティクスとして使用するための本明細書において教示されている細菌の菌株または本明細書において教示されている組成物に関する。
別の態様では、本発明は医薬として使用するため、食品または食品用栄養補助食品として使用するため、あるいはプロバイオティクスおよび／またはシンバイオティクスとして使用するための本明細書において教示されている細菌の菌株または本明細書において教示されている組成物に関する。
【0047】
本発明はさらに、メタボリックシンドローム、肥満、インスリン欠乏もしくはインスリン抵抗性に関連する障害、２型糖尿病、１型糖尿病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、耐糖能異常、脂質代謝異常、アテローム性動脈硬化症、高血圧症、心臓病、脳卒中、非アルコール性脂肪性肝疾患、アルコール性脂肪性肝疾患、高血糖症、肝臓脂肪症、脂質異常症、肥満（体重増加）に関連する免疫系の機能不全、アレルギー、喘息、自閉症、パーキンソン病、多発性硬化症、神経変性疾患、鬱病、バリア機能の障害に関連する他の疾患、創傷治癒、行動障害、アルコール依存症、心血管疾患、高コレステロール、トリグリセリドの上昇、アテローム性動脈硬化症、睡眠時無呼吸、骨関節炎、胆嚢疾患、癌ならびに食物アレルギー、例えば赤ん坊が未熟児で生まれたことに起因する腸の未成熟、放射線、化学療法および／または毒素への曝露などの腸粘膜バリアの物理的完全性を変える状態、自己免疫不全、栄養不良および敗血症からなる群から選択される障害を予防および／または治療するのに使用するため、ならびに哺乳類の腸における抗炎症活性を促進するのに使用するための本明細書において教示されている単離されたアッカーマンシア・グリカニフィルス菌株または本明細書において教示されている組成物に関する。
【0048】
本発明は、本明細書において教示されているアッカーマンシア・グリカニフィルス菌株または本明細書において教示されている組成物を、それを必要とする哺乳類、例えばヒト、に投与するステップを含む、哺乳類、例えばヒトにおける腸粘膜免疫系機能を調節および／または促進し、かつ／または腸粘膜バリアの物理的完全性を維持および／または回復および／または増大させる方法も提供する。
【0049】
一実施形態では、本明細書において教示されている細菌の菌株または本明細書において教示されている組成物は、少なくとも１週間に１回、好ましくは少なくとも１週間に２回、より好ましくは少なくとも１日１回、さらにより好ましくは少なくとも１日２回投与される。
【0050】
一実施形態では、１日当たりに投与されるアッカーマンシア・グリカニフィルスの１日量は約１０４～約１０１５細胞またはコロニー形成単位（ＣＦＵ）の範囲である。例えば、本腸内細菌は、１日当たり約１０６もしくは１０７細胞（またはＣＦＵ）～約１０１４細胞（またはＣＦＵ）、好ましくは１日当たり約１０８細胞（またはＣＦＵ）～約１０１３細胞（またはＣＦＵ）、好ましくは１日当たり約１０９細胞（またはＣＦＵ）～約１０１２細胞（またはＣＦＵ）、より好ましくは１日当たり約１０１０細胞（またはＣＦＵ）～約１０１２細胞（またはＣＦＵ）の量で投与されてもよい。
【0051】
一実施形態では、本明細書において教示されている細菌の菌株または本明細書において教示されている組成物は、過体重の対象または肥満の対象に投与される。一実施形態では、当該対象は代謝性疾患、例えば、過体重および／または肥満に関連する代謝性疾患であると診断されている。別の実施形態では、前記対象は代謝性疾患、例えば過体重および／または肥満に関連する代謝性疾患を発症するリスクがある。例えば、前記リスクは当該対象が過体重または肥満であるという事実に関連していてもよい。代わりまたは追加として、前記リスクは、代謝性疾患、例えば過体重および／または肥満に関連する代謝性疾患に対する素因、例えば家族性素因に一致する。
【0052】
当該対象は、任意の年齢群（例えば、乳幼児、成人、高齢者）および任意の性別（男性および女性）であってもよい。一実施形態では、哺乳類は乳幼児（例えば、新生児、乳児および幼児など）、特に未熟児で生まれた乳幼児である。
【0053】
一実施形態では、対象の腸内微生物叢はアッカーマンシア・ムシニフィラ菌株が枯渇している。例えば、当該対象の腸におけるアッカーマンシア・ムシニフィラの割合は、腸における細菌細胞の総数に対するアッカーマンシア・ムシニフィラの数が１％未満、好ましくは０．５％未満、より好ましくは０．１％未満であってもよい。
【0054】
本発明は、対象における体重減少を促進するためのアッカーマンシア・グリカニフィルスの美容的使用にも関する。
【0055】
従って、本発明は、美容的に有効な量のアッカーマンシア・グリカニフィルスを含む美容組成物および対象における体重減少を促進するためのその使用も提供する。本明細書で使用される「美容的に有効な量」とは、例えば対象における体重減少を誘発するためなどの美容効果を促進するのに必要かつ十分な美容組成物の量を指す。
【0056】
一実施形態では、アッカーマンシア・グリカニフィルスの美容的に有効な量は約１０４～約１０１５細胞またはコロニー形成単位（ＣＦＵ）の範囲である。例えば、本腸内細菌は、１日当たり約１０６もしくは１０７細胞（またはＣＦＵ）～約１０１４細胞（またはＣＦＵ）、好ましくは１日当たり約１０８細胞（またはＣＦＵ）～約１０１３細胞（またはＣＦＵ）、好ましくは１日当たり約１０９細胞（またはＣＦＵ）～約１０１２細胞（またはＣＦＵ）、より好ましくは１日当たり約１０１０細胞（またはＣＦＵ）～約１０１２細胞（またはＣＦＵ）の量で投与されてもよい。
【0057】
一実施形態では、本明細書において教示されている美容組成物は、少なくとも１週間に１回、好ましくは少なくとも１週間に２回、より好ましくは少なくとも１日１回、さらにより好ましくは少なくとも１日２回投与される。
【0058】
本発明は、哺乳類、好ましくはヒトの胃腸管におけるアッカーマンシア・グリカニフィルスのレベルを増加させるための方法であって、
請求項１～４のいずれかに記載の単離されたアッカーマンシア・グリカニフィルス菌株または請求項５～８のいずれかに記載の組成物を前記哺乳類に投与するステップと、
ビルディングブロックとしてグルコサミンまたはＮ－アセチルグルコサミンなどのグルコサミンの誘導体を含む化合物およびポリフェノール類からなる群から選択される化合物を前記哺乳類に投与することによって前記哺乳類のＧＩ管において前記アッカーマンシア・グリカニフィルス菌株の増殖を促進させるステップと、
を含む方法をさらに提供する。
請求項１～４のいずれかに記載の単離されたアッカーマンシア・グリカニフィルス菌株または請求項５～８のいずれかに記載の組成物を前記哺乳類に投与するステップと、
ビルディングブロックとしてグルコサミンまたはＮ－アセチルグルコサミンなどのグルコサミンの誘導体を含む化合物およびポリフェノール類からなる群から選択される化合物を前記哺乳類に投与することによって前記哺乳類のＧＩ管において前記アッカーマンシア・グリカニフィルス菌株の増殖を促進させるステップと、
を含む方法をさらに提供する。
【0059】
グルコサミンまたはグルコサミンの誘導体を含む化合物の非限定的な例はキチンである。ポリフェノール類は、例えば文献（Ａｎｈｅ ＦＦら Ｇｕｔ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ．２０１６年２月 ２２：０．［オンラインで先行公開（Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ）］を参照）に記載されているようにクランベリー、ブドウまたは他の植物由来製品に含まれていてもよい。
【0060】
本発明を以下の実施例によってさらに例示するが、それらに限定されない。上記考察およびこれらの実施例から、当業者は本発明の必須の特性を確認することができ、その教示および範囲から逸脱することなく、それを各種用法および条件に適用するために本発明の各種変更および修飾を行うことができる。従って、本明細書に図示および記載されているものに加えて本発明の各種修飾は、上記説明から当業者には明らかであろう。そのような修飾も添付の特許請求の範囲の範囲内であることが意図されている。
【実施例】
【0061】
材料および方法
【0062】
生物源および培養
バーガーズ動物園（Ｂｕｒｇｅｒｓ’ Ｚｏｏ）（オランダのアルンヘム）に収容されているアミメニシキヘビから得られた新鮮な糞から粘液溶解細菌を単離している間に、ムチン培地として先に記載したように唯一の炭素およぶエネルギー源として０．５％ムチンを含有する嫌気性基本培地を用いて菌株ＰｙｔＴを回収した（Ｄｅｒｒｉｅｎ，Ｖａｕｇｈａｎ，Ｐｌｕｇｇｅ＆ｄｅ Ｖｏｓ，２００４．Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｅｖｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５４：１４６９－１４７６）。比較のためにアッカーマンシア・ムシニフィラＭｕｃＴ（ＣＩＰ１０７９６１Ｔ）を使用した。ムチン培地での限界希釈（ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｔｏ ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ）法と、それに続く、０．８％の寒天（Ａｇａｒ ｎｏｂｌｅ；Ｄｉｆｃｏ社）が添加されたムチン培地からなるムチンプレート上での画線培養、を用いて菌株ＰｙｔＴを単離した。単一のコロニーを選別し、ムチン培地で再増殖させ、純度に到達するまでムチンプレート上で画線培養した。
バーガーズ動物園（Ｂｕｒｇｅｒｓ’ Ｚｏｏ）（オランダのアルンヘム）に収容されているアミメニシキヘビから得られた新鮮な糞から粘液溶解細菌を単離している間に、ムチン培地として先に記載したように唯一の炭素およぶエネルギー源として０．５％ムチンを含有する嫌気性基本培地を用いて菌株ＰｙｔＴを回収した（Ｄｅｒｒｉｅｎ，Ｖａｕｇｈａｎ，Ｐｌｕｇｇｅ＆ｄｅ Ｖｏｓ，２００４．Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｅｖｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５４：１４６９－１４７６）。比較のためにアッカーマンシア・ムシニフィラＭｕｃＴ（ＣＩＰ１０７９６１Ｔ）を使用した。ムチン培地での限界希釈（ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｔｏ ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ）法と、それに続く、０．８％の寒天（Ａｇａｒ ｎｏｂｌｅ；Ｄｉｆｃｏ社）が添加されたムチン培地からなるムチンプレート上での画線培養、を用いて菌株ＰｙｔＴを単離した。単一のコロニーを選別し、ムチン培地で再増殖させ、純度に到達するまでムチンプレート上で画線培養した。
【0063】
遺伝子に基づく方法：系統発生解析およびゲノム解析
クローン化された１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列分析を行って菌株ＰｙｔＴの系統発生学的関係を決定した。グラム陽性ＤＮＡ精製キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ社）を用いてＤＮＡ全体を抽出し、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を汎用プライマー２７Ｆおよび１４９２Ｒを用いるＰＣＲによって増幅させ（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔａｙｌｏｒ＆ＤｅＬｏｎｇ，２０００．Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６６：４６０５－４６１４）、ハイピュアＰＣＲクリーンアップマイクロキット（Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｍｉｃｒｏ ｋｉｔ）（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を用いてＰＣＲ産物を精製した。菌株ＰｙｔＴのほぼ完全な１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を得るために、精製したＰＣＲ産物を製造業者の説明書に従い、ｐＧＥＭ－Ｔ ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて大腸菌ＸＬ１－ｂｌｕｅにおいてクローン化した。プラスミドＤＮＡをＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ キット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて４４個の形質転換体培養物から単離し、インサート隣接Ｔ７およびＳＰ６プロモーター標的プライマー（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いるサンガー配列分析法（ＧＡＴＣによって行われる）のための鋳型として使用した。ＤＮＡ Ｂａｓｅｒを用いて配列をアライメントし、そのアライメントを手で補正して配列を確実に重ね合わせた。全てのクローン化されたインサートが同一の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に由来していることが分かり、１４３９ｂｐの配列が得られた。菌株ＰｙｔＴの１６Ｓ ｒＲＮＡおよびウェルコミクロビウム門の他のメンバーの遺伝子配列をＳＩＮＡアライナー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｒｂ－ｓｉｌｖａ．ｄｅ／ａｌｉｇｎｅｒ／）を用いてアライメントした（Ｐｒｕｅｓｓｅ，Ｐｅｐｌｉｅｓ＆Ｇｌｏｃｋｎｅｒ，２０１２．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２８：１８２３－１８２９）。ＡＲＢを用いて系統樹を再構築した（Ｌｕｄｗｉｇ，Ｓｔｒｕｎｋ，Ｗｅｓｔｒａｍら，２００４．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３２：１３６３－１３７１）。近隣結合法および最大節約法の両方を用いる距離およびクラスター形成を１０００回の反復に基づくブートストラップ値を用いて決定した。
クローン化された１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列分析を行って菌株ＰｙｔＴの系統発生学的関係を決定した。グラム陽性ＤＮＡ精製キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ社）を用いてＤＮＡ全体を抽出し、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を汎用プライマー２７Ｆおよび１４９２Ｒを用いるＰＣＲによって増幅させ（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔａｙｌｏｒ＆ＤｅＬｏｎｇ，２０００．Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６６：４６０５－４６１４）、ハイピュアＰＣＲクリーンアップマイクロキット（Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｍｉｃｒｏ ｋｉｔ）（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を用いてＰＣＲ産物を精製した。菌株ＰｙｔＴのほぼ完全な１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を得るために、精製したＰＣＲ産物を製造業者の説明書に従い、ｐＧＥＭ－Ｔ ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて大腸菌ＸＬ１－ｂｌｕｅにおいてクローン化した。プラスミドＤＮＡをＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ キット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて４４個の形質転換体培養物から単離し、インサート隣接Ｔ７およびＳＰ６プロモーター標的プライマー（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いるサンガー配列分析法（ＧＡＴＣによって行われる）のための鋳型として使用した。ＤＮＡ Ｂａｓｅｒを用いて配列をアライメントし、そのアライメントを手で補正して配列を確実に重ね合わせた。全てのクローン化されたインサートが同一の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に由来していることが分かり、１４３９ｂｐの配列が得られた。菌株ＰｙｔＴの１６Ｓ ｒＲＮＡおよびウェルコミクロビウム門の他のメンバーの遺伝子配列をＳＩＮＡアライナー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｒｂ－ｓｉｌｖａ．ｄｅ／ａｌｉｇｎｅｒ／）を用いてアライメントした（Ｐｒｕｅｓｓｅ，Ｐｅｐｌｉｅｓ＆Ｇｌｏｃｋｎｅｒ，２０１２．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２８：１８２３－１８２９）。ＡＲＢを用いて系統樹を再構築した（Ｌｕｄｗｉｇ，Ｓｔｒｕｎｋ，Ｗｅｓｔｒａｍら，２００４．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３２：１３６３－１３７１）。近隣結合法および最大節約法の両方を用いる距離およびクラスター形成を１０００回の反復に基づくブートストラップ値を用いて決定した。
【0064】
系統発生学的位置をさらに支持し、かつそのゲノムの関係を研究するために菌株ＰｙｔＴの部分的ゲノム配列を決定した。上記のように単離したＤＮＡ全体を使用して、２５０ｂｐのペアエンドリードおよび５００ｂｐのインサートサイズを用いるＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑデスクトップ型シーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）による次世代シークエンシングに供したＭｉＳｅｑライブラリーを準備した。リードはＲａｙ（ｋ－ｍｅｒ１０１）を用いて構築した（Ｂｏｉｓｖｅｒｔ，Ｒａｙｍｏｎｄ，Ｇｏｄｚａｒｉｄｉら，２０１２．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ １３：Ｒ１２２）。
【0065】
アノテーションは、タンパク質をコードするＤＮＡ配列（ＣＤＳ）の予測のためのＰｒｏｄｉｇａｌ ｖ２．５（Ｈｙａｔｔ，Ｃｈｅｎ，Ｌｏｃａｓｃｉｏら，２０１０．ＢＭＣ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １１：１１９）、タンパク質のアノテーションのためのＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎ ５ＲＣ７（Ｈｕｎｔｅｒ，Ｊｏｎｅｓ，Ｍｉｔｃｈｅｌｌら，２０１２．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４０：Ｄ３０６－３１２）、ｔＲＮＡの予測のためのｔＲＮＡｓｃａｎ－ＳＥ ｖ１．３．１（Ｌｏｗｅ＆Ｅｄｄｙ，１９９７．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２５：９５５－９６４）およびｒＲＮＡの予測のためのＲＮＡｍｍｅｒ ｖ１．２（Ｌａｇｅｓｅｎ，Ｈａｌｌｉｎ，Ｒｏｄｌａｎｄら，２００７．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３５：３１００－３１０８）からなる研究室内パイプラインを用いて行った。さらなるタンパク質機能の予測は、ＵｎｉＲｅｆ５０（Ｓｕｚｅｋ，Ｈｕａｎｇ，ＭｃＧａｒｖｅｙら，２００７．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２３：１２８２－１２８８）およびＳｗｉｓｓｐｒｏｔ（ＵｎｉＰｒｏｔ－Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，２０１４）データベース（２０１３年８月にダウンロード）に対するＢＬＡＳＴ同定により得た。その後に、ＰＲＩＡＭバージョン２０１３－０３－０６によりＥＣ番号を追加することによってそのアノテーションをさらに向上させた（Ｃｌａｕｄｅｌ－Ｒｅｎａｒｄ，Ｃｈｅｖａｌｅｔ，Ｆａｒａｕｔら，２００３．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３１：６６３３－６６３９）。非コードＲＮＡは、ＲＦＡＭデータベースのリリース１１．０のｒｆａｍ＿ｓｃａｎ．ｐｌ ｖ１．０４を用いて同定した（Ｂｕｒｇｅ，Ｄａｕｂ，Ｅｂｅｒｈａｒｄｔら，２０１３．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４１：Ｄ２２６－２３２）。
【0066】
ＤＮＡ－ＤＮＡハイブリダイゼーション（ＤＤＨ）実験のために、菌株ＰｙｔＴおよびＭｕｃＴの細胞を増殖させ、静止期に回収し、その後にペレットをＨ２Ｏ：イソプロパノール（１：１）に再懸濁した。その後、Ｌｅｉｂｎｉｚ－Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ＤＳＭ－Ｚ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｆｕｒ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ，ドイツのブラウンシュワイク）により、先に記載したようにＤＤＨ実験を行った（Ｃａｓｈｉｏｎ，Ｈｏｌｄｅｒ－Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＭｃＣｕｌｌｙら，１９７７．Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ８１：４６１－４６６；Ｄｅｌｅｙ，Ｃａｔｔｏｉｒ＆Ｒｅｙｎａｅｒｔ．Ａ，１９７０．Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １２：１３３；Ｈｕｓｓ，Ｆｅｓｔｌ＆Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒ，１９８３．Ｓｙｓｔ Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ４：１８４－１９２）。
【0067】
菌株ＰｙｔＴのゲノムＤＮＡのＧ＋Ｃ含有量の割合は、先に記載したようにＬｅｉｂｎｉｚ－Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ＤＳＭＺによって決定した（Ｃａｓｈｉｏｎ，Ｈｏｌｄｅｒ－Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＭｃＣｕｌｌｙ＆Ｆｒａｎｋｌｉｎ，１９７７．Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ８１：４６１－４６６；Ｍｅｓｂａｈ，Ｐｒｅｍａｃｈａｎｄｒａｎ＆Ｗｈｉｔｍａｎ，１９８９．Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ３９：１５９－１６７，Ｔａｍａｏｋａ＆Ｋｏｍａｇａｔａ，１９８４．ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ ２５：１２５－１２８）。
【0068】
表現型の特性評価：形態、生理機能および化学分類
文献（Ｐｌｕｇｇｅ，Ｚｏｅｔｅｎｄａｌ＆Ｓｔａｍｓ，２０００．Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｅｖｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５０ Ｐｔ ３：１１５５－１１６２）に記載されているとおりにグラム染色を行った。ムチンベースの培地において３７℃で２日間増殖させた細胞を用いて、細胞形態、運動性および胞子形成を位相差顕微鏡によって監視した。墨汁懸濁液によりムチン培地において増殖させた細胞を染色することによってカプセルの存在を決定した。
文献（Ｐｌｕｇｇｅ，Ｚｏｅｔｅｎｄａｌ＆Ｓｔａｍｓ，２０００．Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｅｖｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５０ Ｐｔ ３：１１５５－１１６２）に記載されているとおりにグラム染色を行った。ムチンベースの培地において３７℃で２日間増殖させた細胞を用いて、細胞形態、運動性および胞子形成を位相差顕微鏡によって監視した。墨汁懸濁液によりムチン培地において増殖させた細胞を染色することによってカプセルの存在を決定した。
【0069】
走査電子顕微鏡分析のために、細胞を、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中において２％のグルタルアルデヒド中で室温にて２時間固定し、２％四酸化オスミウムで３０～６０分間後固定した。その後、細胞を段階的アルコール系列（５０％、７０％、９６％および１００％）で脱水し、最後にヘキサメチルジシラザンで処理し、アルミニウムスタブ上にマウントして白金で被覆した。その後に、細胞をＦＥＩ Ｑｕａｎｔａ ２５０ ＦＥＧ走査電子顕微鏡を用いて調べた。
【0070】
３０ｍｌの血清瓶を用いて各菌株について増殖実験を２連で行った。気相は１．５ａｔｍのＮ２／ＣＯ２（８０：２０、ｖ／ｖ）であった。特に明記しない限り、一般的な条件はｐＨが６．５、温度が３７℃であった。分光光度計（Ｕｌｔｒａｓｐｅｃ１０、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて６００ｎｍでの光学濃度（ＯＤ６００）を測定することによって増殖を監視した。Ａｇｉｌｅｎｔ Ｍｅｔａｃａｒｂ ６７Ｈカラムを備えたＴｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｓｐｅｃｔｒａｓｙｓｔｅｍ ＨＰＬＣを用いて短鎖脂肪酸を測定した。
【0071】
最適なｐＨおよび温度は、０．５％ｗ／ｖの雄ブタの胃ムチン（ＩＩＩ型、Ｓｉｇｍａ社）および０．０５％ｗ／ｖのシステインが添加されたブレインハートインフュージョン培地（ＢＨＩ；Ｄｉｆｃｏ社）において２連で測定した。試験した温度は５℃間隔で１０～５５℃であり、０．５ｐＨ単位の間隔のｐＨ３．５～９（ＨＣｌまたはＮａＯＨで調整）および３７℃で増殖を決定した。培養物を少なくとも１ヶ月間インキュベートした。
【0072】
Ｄ－マンノース、Ｄ－グルコース、Ｌ－フコース、Ｄ－フルクトース、Ｄ－ガラクトース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、Ｄ－セロビオースでの生育を、１６ｇ／ｌのトリプトンおよび４ｇ／ｌのトレオニンを添加した先に記載した基本培地中で１０ｍＭの濃度にて２連で試験した（Ｄｅｒｒｉｅｎ，Ｖａｕｇｈａｎ，Ｐｌｕｇｇｅ＆ｄｅ Ｖｏｓ，２００４．Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｅｖｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５４：１４６９－１４７６）。１６ｇ／ｌのトリプトンおよび４ｇ／ｌのトレオニンが添加された先に記載した基本培地（Ｄｅｒｒｉｅｎ，Ｖａｕｇｈａｎ，Ｐｌｕｇｇｅ＆ｄｅ Ｖｏｓ，２００４．Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｅｖｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５４：１４６９－１４７６）を使用してＡＰＩ（登録商標）２０Ａに接種したという１つの変更以外は製造業者の説明書に従い、ＡＰＩ（登録商標）２０Ａ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社、フランス）を用いて、Ｄ－グルコース、Ｄ－マルトース、Ｄ－ラクトース、Ｄ－マンニトール、Ｄ－サッカロース、サリシン、Ｄ－キシロース、Ｌ－アラビノース、グリセリン、Ｄ－セロビオース、Ｄ－マンノース、Ｄ－メレジトース、Ｄ－ラフィノース、Ｄ－ソルビトール、Ｌ－ラムノースおよびＤ－トレハロースでの生育を決定した。その後に、Ｈ２Ｏ２の３％（ｗ／ｖ）溶液との反応によってカタラーゼ活性を決定した。インドールおよびウレアーゼの形成ならびにゼラチンおよびエスクリンの加水分解もＡＰＩ（登録商標）２０Ａ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社、フランス）ストリップを用いて決定した。
【0073】
アンピシリンおよびバンコマイシン（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社、フランスのマルシーレトワール）の両方についてＥｔｅｓｔ法を用いて抗生物質耐性を決定した。４８時間のインキュベーション後に最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を決定した。より詳細には、ムチン培地において菌株ＰｙｔＴを増殖させ、静止期に達した後に、１００ｕｌを０．５％（ｖ／ｖ）の雄ブタの胃ムチン（ＩＩＩ型、Ｓｉｇｍａ社）および０．０５％（ｗ／ｖ）のシステイン－ＨＣＬ（Ｓｉｇｍａ－ＡＬｄｒｉｃｈ社）が添加されたＢＨＩプレートに播種した。プレートを偏性嫌気性条件下で２４～４８時間インキュベートした。グラム陰性嫌気性菌のＭＩＣを解釈するための欧州抗菌薬感受性試験法検討委員会（ＥＵＣＡＳＴ：Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｔｅｓｔｉｎｇ）のブレイクポイント表（バージョン５．０、２０１５－０１－０１から有効）を用いて耐性レベルを決定した。
【0074】
化学分類学的特性評価のために、菌株ＰｙｔＴおよびＭｕｃＴを増殖させ、静止期に回収し、その後に凍結乾燥した。先に記載したようにＬｅｉｂｎｉｚ－Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ＤＳＭＺによって細胞脂肪酸の分析を行った（Ｋａｍｐｆｅｒ＆Ｋｒｏｐｐｅｎｓｔｅｄｔ，１９９６．Ｃａｎ Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ４２：９８９－１００５）。
【0075】
結果
【0076】
系統発生およびゲノム特性
菌株ＰｙｔＴの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子ヌクレオチド配列は１４３７ｂｐの連続的な配列を含んでいた。近隣結合分析後の配列類似性の計算により菌株ＰｙｔＴの最も近い類縁はアッカーマンシア・ムシニフィラＭｕｃＴ（９４．４％）であることが分かった。１６Ｓ ｒＲＮＡの配列類似性は、９７％の現在の種のカットオフ値を十分に下回っている（Ｔｉｎｄａｌｌ，Ｒｏｓｓｅｌｌｏ－Ｍｏｒａ，Ｂｕｓｓｅら，２０１０．Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｅｖｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６０：２４９－２６６）。驚くべきことに、菌株ＰｙｔＴの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列は海洋哺乳類のジュゴンの糞由来の非培養クローン（ＡＢ２６４０８１）に対して９９．７％の類似性を示した。ルブリタレア科、アッカーマンシア科およびウェルコミクロビウム科を含むウェルコミクロビウム門に属する全ての有効に記載されている属の代表とのより低い配列類似性（９０．０％未満）が認められた。
菌株ＰｙｔＴの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子ヌクレオチド配列は１４３７ｂｐの連続的な配列を含んでいた。近隣結合分析後の配列類似性の計算により菌株ＰｙｔＴの最も近い類縁はアッカーマンシア・ムシニフィラＭｕｃＴ（９４．４％）であることが分かった。１６Ｓ ｒＲＮＡの配列類似性は、９７％の現在の種のカットオフ値を十分に下回っている（Ｔｉｎｄａｌｌ，Ｒｏｓｓｅｌｌｏ－Ｍｏｒａ，Ｂｕｓｓｅら，２０１０．Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｅｖｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６０：２４９－２６６）。驚くべきことに、菌株ＰｙｔＴの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列は海洋哺乳類のジュゴンの糞由来の非培養クローン（ＡＢ２６４０８１）に対して９９．７％の類似性を示した。ルブリタレア科、アッカーマンシア科およびウェルコミクロビウム科を含むウェルコミクロビウム門に属する全ての有効に記載されている属の代表とのより低い配列類似性（９０．０％未満）が認められた。
【0077】
菌株ＰｙｔＴはＭｕｃＴ基準株に対して比較的低いＤＤＨ類似性を示した（２８．３％±５．２）。ＧＣ含有量は５８．２モル％であることを決定した。
【0078】
菌株ＰｙｔＴの完全なゲノムを単一分子ＰａｃＢｉｏシークエンシングによって決定し、３，０７４，１２１ｂｐの長さの単一の染色体からなり、ＧＣ含有量が５７．６％であることが分かった。ＰｙｔＴゲノムは菌株ＭｕｃＴのゲノム（２．６６Ｍｂｐ）よりも４００ｋｂ大きい。菌株ＰｙｔＴの計算したＤＮＡのＧ＋Ｃ含有量（％）である５７．６％は実験的に決定した値（５８．２％）と十分に一致しているが、菌株ＭｕｃＴのもの（５６．０％）よりも若干高い。菌株ＭｕｃＴのゲノムの類似性と比較した菌株ＰｙｔＴのゲノムのＢＬＡＳＴ類似性（５ｋｂ超）は８２．０％であった。菌株ＭｕｃＴのゲノムと比較した菌株ＰｙｔＴのゲノムの平均的なヌクレオチド同一性（ＡＮＩ）は７９．７％であった。ＡＮＩはＤＤＨを正確に置き換えることができることが示唆された（Ｇｏｒｉｓ，Ｋｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｉｓ，Ｋｌａｐｐｅｎｂａｃｈら，２００７．Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｅｖｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５７：８１－９１）。現在のデータはウェルコミクロビウム門についてこれを確認しており、ＡＮＩおよびＤＤＨ類似性の両方が十分に７０％ＤＤＨおよび９５％ＡＮＩの現在の種のカットオフを下回っていることを示している。
【0079】
菌株ＰｙｔＴのゲノムは、そのうちの２８種が分泌型であると予測されている５５種のグリコシド加水分解酵素、そのうちの３種が分泌型であると予測されている５種のフコシダーゼ、およびそのうちの６種が分泌型であると予測されている７種のシアリダーゼをコードすることが予測されるため、そのムチン分解能力を反映している。ムチン糖タンパク質を分解するために、それはグリカン鎖の末端に結合させることができる硫酸基を切断する必要がある。菌株ＰｙｔＴはそのうちの９種が分泌型であると予測されている１４種のスルファターゼをコードすることが予測される。ＰｙｔＴゲノムはそれが腸のムチン層の有酸素／無酸素境界において使用することができる好気呼吸の可能性を指し示すチトクロームｂｄ型ユビキノールオキシダーゼおよびＮｉ依存性ヒドロゲナーゼの遺伝子も含む。
【0080】
ムチングリカンは主にガラクトース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミンからなり、菌株ＰｙｔＴはこれらの全てを増殖基質として使用することができる。菌株アッカーマンシア・ムシニフィラＭｕｃＴとは対照的に、菌株ＰｙｔＴはガラクトースを唯一の炭素源として使用すると共に、主にプロピオン酸塩、酢酸塩および少量のコハク酸塩を産生することができる。ガラクトースでの生育は、ムチンでの生育（１６時間未満）と比較して比較的遅い（１週間超）。ゲノム予測では、菌株ＰｙｔＴが標準ルロワール経路酵素のガラクトキナーゼ（ＧａｌＫ）およびＵＤＰ－グルコース４－エピメラーゼ（ＧａｌＥ）のみをコードすることが示唆さした。これらは菌株ＭｕｃＴによってコードされることも予測される（ｖａｎ Ｐａｓｓｅｌ，Ｋａｎｔ，Ｚｏｅｔｅｎｄａｌ，Ｐｌｕｇｇｅ，Ｄｅｒｒｉｅｎ，Ｍａｌｆａｔｔｉ，Ｃｈａｉｎ，Ｗｏｙｋｅ，Ｐａｌｖａ，ｄｅ Ｖｏｓ＆Ｓｍｉｄｔ，２０１１．Ｐｌｏｓ ｏｎｅ ６：ｅ１６８７６）。但し、菌株ＰｙｔＴのゲノムにおいて本発明者らは、ガラクトース結合ドメインを有するタンパク質をコードすることが予測されるそのうちの７種が分泌型である８種の遺伝子を同定することができたが、菌株ＭｕｃＴのゲノムではできなかった。未だ不明のガラクトース代謝経路が菌株ＰｙｔＴにおいて機能し、これらの遺伝子がガラクトースに結合してこれを輸送するための系に関与することができるという可能性が高い。
【0081】
形態
細胞は楕円形であり、かつ非運動性であり、グラム陰性に染色される。単一細胞の長い軸は、ムチンベースの培地で増殖された場合に０．６～１．０μｍである。細胞は単独、対、短鎖および凝集体で生じる。ムチンベースの寒天上で３７℃で４８時間増殖させた際に、菌株ＰｙｔＴは０．７ｍｍの直径を有する小さい白色のコロニーを示した。ＳＥＭにより個々の細菌細胞を接続する糸状構造体の存在が明らかとなった。菌株ＰｙｔＴの細胞は墨汁を排除できたが、これは、カプセルを有する細菌の特徴である。
細胞は楕円形であり、かつ非運動性であり、グラム陰性に染色される。単一細胞の長い軸は、ムチンベースの培地で増殖された場合に０．６～１．０μｍである。細胞は単独、対、短鎖および凝集体で生じる。ムチンベースの寒天上で３７℃で４８時間増殖させた際に、菌株ＰｙｔＴは０．７ｍｍの直径を有する小さい白色のコロニーを示した。ＳＥＭにより個々の細菌細胞を接続する糸状構造体の存在が明らかとなった。菌株ＰｙｔＴの細胞は墨汁を排除できたが、これは、カプセルを有する細菌の特徴である。
【0082】
生理機能
菌株ＰｙｔＴは、還元剤としてのＬ－システインおよび／または硫化物により増殖する偏性嫌気性菌であった。増殖は１５～４０℃およびｐＨ５．０～７．５で生じ、最適な増殖は２５～３０℃およびｐＨ６．０であった。菌株ＭｕｃＴと比較して、菌株ＰｙｔＴは僅かにより低い温度およびｐＨで増殖する（表１）。３０℃のその最適な温度は菌株ＰｙｔＴの生息地に適するが、それはアミメニシキヘビが外温性であり、その体温を調節するために外部熱源に依存し、従ってヒトまたはその被食者となる小さい哺乳類の体温よりも低いからである（Ｗａｎｇ，Ｚａａｒ，Ａｒｖｅｄｓｅｎら，２００２．Ｃｏｍｐ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ａ Ｍｏｌ Ｉｔｅｇｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ １３３：５１９－５２７）。アミメニシキヘビの類縁であるビルマニシキヘビでは、胃腸のｐＨは、空腹時は６．５（胃）～７．６（盲腸）、食後はｐＨ２～３（胃）、７～８（食道、遠位小腸、盲腸および近位大腸）、５～６．７（遠位食道、近位胃および遠位大腸）と様々である（Ｓｅｃｏｒ，Ｂｏｂａｃｋ＆Ｌｉｇｎｏｔ，２００６．Ｉｎｔｅｇｒ Ｃｏｍｐ Ｂｉｏｌ ４６）。これは菌株ＰｙｔＴの最適なｐＨ（約６．０のｐＨ）は遠位大腸のコロニー形成に一致し得ることを示している。
菌株ＰｙｔＴは、還元剤としてのＬ－システインおよび／または硫化物により増殖する偏性嫌気性菌であった。増殖は１５～４０℃およびｐＨ５．０～７．５で生じ、最適な増殖は２５～３０℃およびｐＨ６．０であった。菌株ＭｕｃＴと比較して、菌株ＰｙｔＴは僅かにより低い温度およびｐＨで増殖する（表１）。３０℃のその最適な温度は菌株ＰｙｔＴの生息地に適するが、それはアミメニシキヘビが外温性であり、その体温を調節するために外部熱源に依存し、従ってヒトまたはその被食者となる小さい哺乳類の体温よりも低いからである（Ｗａｎｇ，Ｚａａｒ，Ａｒｖｅｄｓｅｎら，２００２．Ｃｏｍｐ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ａ Ｍｏｌ Ｉｔｅｇｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ １３３：５１９－５２７）。アミメニシキヘビの類縁であるビルマニシキヘビでは、胃腸のｐＨは、空腹時は６．５（胃）～７．６（盲腸）、食後はｐＨ２～３（胃）、７～８（食道、遠位小腸、盲腸および近位大腸）、５～６．７（遠位食道、近位胃および遠位大腸）と様々である（Ｓｅｃｏｒ，Ｂｏｂａｃｋ＆Ｌｉｇｎｏｔ，２００６．Ｉｎｔｅｇｒ Ｃｏｍｐ Ｂｉｏｌ ４６）。これは菌株ＰｙｔＴの最適なｐＨ（約６．０のｐＨ）は遠位大腸のコロニー形成に一致し得ることを示している。
【0083】
ムチン培地において最も良く増殖し、かつムチンを炭素、エネルギーおよび窒素源として使用することができる菌株ＰｙｔＴは、酢酸塩、プロピオン酸塩および１，２－プロパンジオールを形成した。菌株ＰｙｔＴはムチン培地においてビタミン類がなくても増殖することができたが、ブレインハートインフュージョン培地で、ならびに１６ｇ／ｌのトリプトンおよび４ｇ／ｌのトレオニンの存在下で基本培地においてＮ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、Ｄ－グルコース、Ｄ－ラクトースおよびＤ－ガラクトースで、ゆっくりと増殖することもできた。１６ｇ／ｌのトリプトンおよび４ｇ／ｌのトレオニンが添加された基本培地においてＤ－マンノース、Ｌ－フコース、Ｄ－セロビオースまたはＤ－フルクトースでは生育しなかった。
【0084】
１６ｇ／ｌのトリプトンおよび４ｇ／ｌのトレオニンが添加された基本培地を含むＡＰＩ（登録商標）２０Ａ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社、フランス）ストリップを用いた場合、Ｄ－グルコース、Ｄ－マルトースでは菌株ＰｙｔＴの増殖が観察され、Ｄ－ラクトースでは弱い増殖が観察されたが、Ｄ－マンニトール、Ｄ－サッカロース、サリシン、Ｄ－キシロース、Ｌ－アラビノース、グリセリン、Ｄ－セロビオース、Ｄ－マンノース、Ｄ－メレジトース、Ｄ－ラフィノース、Ｄ－ソルビトール、Ｌ－ラムノース、Ｄ－トレハロースでは増殖は観察されなかった。カタラーゼ活性は陽性であった。インドールおよびウレアーゼ形成は陰性であり、ゼラチンおよびエスクリン加水分解は陽性であった。
【0085】
菌株ＰｙｔＴは、ラクトースを唯一の炭素源として使用すると共に主にプロピオン酸塩および酢酸塩を産生することができる。ラクトースでの増殖（Ｔｄ：約４時間）はムチンでの増殖（Ｔｄ：約１時間）よりも遅い。ＨＰＬＣ分析による発酵製品の定量化によりラクトースのグルコースおよびガラクトースへの最初の切断が明らかとなった。その後に、グルコースおよびガラクトースの両方が主にプロピオン酸塩および酢酸塩および少量のコハク酸塩に変換された。アミメニシキヘビは泌乳哺乳類でないため、従って菌株ＰｙｔＴがラクトースを増殖基質として使用することができることは予想外である。但し、ムチン糖タンパク質には数多くのβ４糖分解結合が存在する（Ｌｉｎｄｅｎ，Ｓｕｔｔｏｎ，Ｋａｒｌｓｓｏｎら，２００８．Ｍｕｃｏｓａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １：１８３－１９７）。ラクトースは、グルコースをガラクトースに結合する同様のβ４結合を有する。故に、ムチンを増殖基質として使用するために菌株ＰｙｔＴはこのグリカン結合を分解することができなければならず、故に菌株ＰｙｔＴがムチンの分解のために通常使用する同じ酵素を用いてラクトースを分解することができるということはもっともらしい。
【0086】
Ｅｔｅｓｔ法（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社、フランス）を用いた分析により、菌株ＰｙｔＴがアンピシリン（３２ｕｇ／ｍｌの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）値）およびバンコマイシン（２４ｕｇ／ｍｌのＭＩＣ値）に対して比較的耐性があるが、セファロスポリン系抗生物質、フルオロキノロン系抗生物質、アミノグリコシド系抗生物質、マクロライド系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、メトロニダゾール、クロラムフェニコール、リファンピシンまたはコリスチンなどの全ての他の臨床的に関連する抗生物質に対して感受性があることが分かった。
【0087】
菌株ＰｙｔＴの生理学的特性評価の結果はこの種の記載の箇所にあり、ウェルコミクロビウム綱の他のメンバーと比較して表１に示されている。
【表1】
【0088】
表１－ウェルコミクロビウム科（亜科Ｉ）の他の属の代表と比較したアッカーマンシア属種の基準株の生理学的特性。文献（Ｈｅｄｌｕｎｄ，２０１０．Ｐｈｙｌｕｍ ＸＸＩＩＩ．Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ ｐｈｙｌ．ｎｏｖ．Ｉｎ Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（バージェイ細菌分類便覧）第２版，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，ニューヨーク）から取り出されたデータ。菌株１：アッカーマンシア・グリカノフィルス（Ａ．ｇｌｙｃａｎｏｐｈｉｌｕｓ）Ｐｙｔｔ；菌株２：アッカーマンシア・ムシニフィラＭｕｃＴ；菌株３：ルブリタレア（ルブリタレア・マリナ（Ｒ．ｍａｒｉｎａ）、ルブリタレア・サブリ（Ｒ．ｓａｂｕｌｉ）、ルブリタレア・スポンギアエ（Ｒ．ｓｐｏｎｇｉａｅ）、ルブリタレア・スクアレニファシエンス（Ｒ．ｓｑｕａｌｅｎｉｆａｃｉｅｎｓ）およびルブリタレア・タンゲリナ（Ｒ．ｔａｎｇｅｒｉｎａ）に基づく）；菌株４：プロステコバクター（Ｐｒｏｓｔｈｅｃｏｂａｃｔｅｒ）（プロステコバクター・デボンティイ（Ｐ．ｄｅｂｏｎｔｉｉ）、（プロステコバクター・デジョンゲイイ（Ｐ．ｄｅｊｏｎｇｅｉｉ）、プロステコバクター・フシフォルミス（Ｐ．ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ）およびプロステコバクター・ヴァンネエルヴェニイ（Ｐ．ｖａｎｎｅｅｒｖｅｎｉｉ）に基づく）；菌株５：ウェルコミクロビウム（ウェルコミクロビウム・スピノスム（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｓｐｉｎｏｓｕｍ）に基づく）；＋：陽性；－：陰性；（＋）：弱陽性；†：１６ｇ／ｌのトリプトンおよび４ｇ／ｌのトレオニンの存在下；‡：種によって決まる。全ての菌株は運動性については陰性であり、ビタミン類の要求について陰性である。全ての菌株はアンピシリンに対して感受性がある。
【0089】
アッカーマンシア・グリカノフィルス新種についての記載
アッカーマンシア・グリカノフィルス（ｇｌｙ．ｃａ．ｎｉ’ｐｈｉ．ｌａ． ラテン語（Ｌ．）中性名詞（ｎｅｕｔ．ｎ．）「ｇｌｙｃａｎ」：グリカン（ｇｌｙｃａｎ）から派生；ラテン語（Ｌ．）名詞「ｐｈｉｌｏｓ」：～に好意的である（ｆｒｉｅｎｄｌｙ ｔｏ）；オランダ語（Ｎ．Ｌ．）男性形容詞（ｍ．ａｄｊ．）グリカノフィルスはグリカンを好む（ｇｌｕｃａｎｏｐｈｉｌｕｓ ｇｌｙｃａｎ－ｌｏｖｉｎｇ））。
アッカーマンシア・グリカノフィルス（ｇｌｙ．ｃａ．ｎｉ’ｐｈｉ．ｌａ． ラテン語（Ｌ．）中性名詞（ｎｅｕｔ．ｎ．）「ｇｌｙｃａｎ」：グリカン（ｇｌｙｃａｎ）から派生；ラテン語（Ｌ．）名詞「ｐｈｉｌｏｓ」：～に好意的である（ｆｒｉｅｎｄｌｙ ｔｏ）；オランダ語（Ｎ．Ｌ．）男性形容詞（ｍ．ａｄｊ．）グリカノフィルスはグリカンを好む（ｇｌｕｃａｎｏｐｈｉｌｕｓ ｇｌｙｃａｎ－ｌｏｖｉｎｇ））。
【0090】
細胞は楕円形であり、かつ非運動性であり、グラム陰性に染色される。単一細胞の長い軸は、ムチンベースの培地では０．６～１．０μｍである。細胞は単独、対、短鎖および凝集体で生じる。細胞は糸で覆われている。コロニーは柔らかい寒天ムチン培地において０．７ｍｍの直径で白色に現れる。菌株ＰｙｔＴの細胞はカプセルを有する細菌を特徴とする墨汁を含んでいない。増殖は１５～４０℃およびｐＨ５．０～７．５で生じ、最適な増殖は２５～３０℃およびｐＨ６．０である。偏性嫌気性または微好気性である。胃ムチンおよびブレインハートインフュージョン培地で、ならびに１６ｇ／ｌのトリプトンおよび４ｇ／ｌのトレオニンが添加された基本培地においてＮ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、グルコース、ラクトースおよびガラクトースで、生育することができる。１６ｇ／ｌのトリプトンおよび４ｇ／ｌのトレオニンが添加された基本培地中においてＬ－フコース、Ｄ－セロビオースまたはＤ－フルクトースでは生育しなかった。１６ｇ／ｌのトリプトンおよび４ｇ／ｌのトレオニンが添加された同じ基本培地を含むＡＰＩ（登録商標）２０Ａ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社、フランス）を用いた場合、Ｄ－グルコース、Ｄ－マルトースでは増殖が観察され、Ｄ－ラクトースでは弱い増殖が観察されたが、Ｄ－マンニトール、Ｄ－サッカロース、サリシン、Ｄ－キシロース、Ｌ－アラビノース、グリセリン、Ｄ－セロビオース、Ｄ－マンノース、Ｄ－メレジトース、Ｄ－ラフィノース、Ｄ－ソルビトール、Ｌ－ラムノース、Ｄ－トレハロースでは増殖は観察されなかった。カタラーゼ活性は陽性であった。インドールおよびウレアーゼ形成は陰性であり、ゼラチンおよびエスクリン加水分解は陽性であった。ムチンを唯一の炭素、エネルギーおよび窒素源として使用することができる。増殖はビタミン類がなくても生じる。ＤＮＡのＧ＋Ｃ含有量は５８．２モル％である。主な細胞脂肪酸はアンテイソ－Ｃ１５：０、Ｃ１５：０およびＣ１６：０である。オランダのヴァーヘニンゲンにおいてアミメニシキヘビの糞から単離した。基準株はＰｙｔＴである（＝ＤＳＭ１００７０５＝ＣＩＰ１１０９１３Ｔ）。