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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-01-24
(45)【発行日】2022-02-01
(54)【発明の名称】卵巣癌ワクチン
(51)【国際特許分類】
   A61K 39/00 20060101AFI20220125BHJP
   A61K 39/39 20060101ALI20220125BHJP
   A61P 35/00 20060101ALI20220125BHJP
   A61P 15/00 20060101ALI20220125BHJP
   A61P 35/04 20060101ALI20220125BHJP
   A61P 37/04 20060101ALI20220125BHJP
   C07K 14/72 20060101ALN20220125BHJP
   A61K 45/00 20060101ALN20220125BHJP
【FI】
A61K39/00 H
A61K39/39
A61P35/00
A61P15/00
A61P35/04
A61P37/04
C07K14/72 ZNA
A61K45/00
【請求項の数】 17
(21)【出願番号】P 2018511702
(86)(22)【出願日】2016-09-02
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2018-09-13
(86)【国際出願番号】 US2016050159
(87)【国際公開番号】W WO2017040969
(87)【国際公開日】2017-03-09
【審査請求日】2019-08-30
(31)【優先権主張番号】62/213,286
(32)【優先日】2015-09-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】500064708
【氏名又は名称】ザ クリーブランド クリニック ファウンデーション
(74)【代理人】
【識別番号】100100158
【弁理士】
【氏名又は名称】鮫島 睦
(74)【代理人】
【識別番号】100122301
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史
(74)【代理人】
【識別番号】100157956
【弁理士】
【氏名又は名称】稲井 史生
(74)【代理人】
【識別番号】100170520
【弁理士】
【氏名又は名称】笹倉 真奈美
(72)【発明者】
【氏名】ビンセント・ケイ・トゥーイ
(72)【発明者】
【氏名】スパルナ・マズムダー
(72)【発明者】
【氏名】ジャスティン・エム・ジョンソン
【審査官】六笠 紀子
(56)【参考文献】
【文献】特表2015-506341(JP,A)
【文献】特表2004-521609(JP,A)
【文献】特表2005-533488(JP,A)
【文献】特表2014-517685(JP,A)
【文献】国際公開第2015/114142(WO,A1)
【文献】特表2015-516374(JP,A)
【文献】国際公開第2014/153636(WO,A1)
【文献】特開2014-076992(JP,A)
【文献】Cancer Immunology Immunotherapy,1998年,47(3),p.131-142
【文献】mAbs,2014年,6(5),p.1314-1326
【文献】Biochem. J.,2004年,379,p.785-793
【文献】mAbs,2014年,6(5),p.1314-1326
(58)【調査した分野】(Int.Cl.,DB名)
A61K 39/00-39/44
A61K 38/00-38/58
UniProt/GeneSeq
JSTPlus/JMEDPlus/JST7580(JDreamIII)
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒト女性対象における卵巣癌腫瘍の治療または予防に使用するための、抗ミュラー管ホルモンII型受容体(AMHR2ポリペプチドを含む免疫原性組成物であって、前記対象への投与のためのものであり、前記AMHR2ポリペプチドが、ヒトAMHR2の細胞外ドメインをむ、免疫原性組成物。
【請求項2】
アジュバントを含む、請求項1に記載の免疫原性組成物。
【請求項3】
前記アジュバントが、アジュバント65、α-GalCer、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、リン酸カルシウム、β-グルカンペプチド、CpG DNA、GM-CSF、GPI-0100、IFA、IFN-γ、IL-17、リピドA、リポ多糖、リポバント(Lipovant)、モンタナイド(Montanide)、N-アセチル-ムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミン、Pam3CSK4、ポリ-IC、クイルA(quil A)、トレハロースジミコレートおよびザイモサンからなる群から選択される、請求項に記載の免疫原性組成物。
【請求項4】
前記アジュバントが、1型/17型混合型免疫応答を誘発するものである、請求項に記載の免疫原性組成物。
【請求項5】
前記腫瘍が、原発性卵巣癌腫瘍である、請求項1~のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
【請求項6】
前記腫瘍が、転移性卵巣癌腫瘍である、請求項1~のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
【請求項7】
前記卵巣癌腫瘍が、卵巣上皮癌(EOC)腫瘍である、請求項1~のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
【請求項8】
前記免疫原性組成物の投与が、前記対象におけるAMHR2を発現する細胞に対するT細胞免疫応答を誘発する、請求項1~のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
【請求項9】
前記免疫原性組成物の投与が、前記対象におけるAMHR2を発現する細胞に対するB細胞免疫応答を誘発する、請求項1~のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
【請求項10】
前記対象への複数回用量における投与のためである、請求項1~のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
【請求項11】
前記対象が、卵巣癌腫瘍の少なくとも一部を除去するための外科手術を受けたことがある、請求項1~10のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
【請求項12】
アジュバントがリポ多糖である、請求項に記載の免疫原性組成物。
【請求項13】
卵巣癌腫瘍がAMHR2を発現している、請求項1に記載の免疫原性組成物。
【請求項14】
免疫原性組成物が、ヒト女性対象における原発性卵巣癌腫瘍の予防に用いられる、請求項1に記載の免疫原性組成物。
【請求項15】
ヒト女性対象がゲノムにBRCA1またはBRCA2変異を含む、請求項14に記載の免疫原性組成物。
【請求項16】
ヒト女性対象が卵巣癌の家族歴を有する、請求項14に記載の免疫原性組成物。
【請求項17】
ヒト女性対象が閉経後のヒト女性である、請求項14に記載の免疫原性組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、2015年9月2日に出願された米国仮特許出願第62/213,286号に対する優先権の利益を主張する。
【背景技術】
【0002】
卵巣上皮癌(EOC)は、米国における婦人科悪性腫瘍の主要死因である。卵巣癌の約60%が後期に診断され、現在の標準治療に対する初期反応は高いものの、ほとんどの患者は疾患再発を起こして5年全生存率(OS)は45%をわずかに超える。
【0003】
ワクチン接種による卵巣腫瘍免疫の導入は有望なアプローチであり、その潜在的な有効性は、卵巣腫瘍がT細胞に浸潤されている患者で認められるOSの増加によって裏付けられる。全腫瘍ホモジネートまたはヒト上皮成長因子受容体2(HER2)、癌精巣抗原1(CTAG1BまたはNY-ESO-1)および癌抗原25(CA-125)のような特定の腫瘍関連抗原を用いた治療的卵巣癌ワクチンの戦略が試みられているが、僅かな治療結果しか提供していない(Zhang et al., Journal of Medicine 348:203-213 (2003);Kandalaft et al., Journal of Clinical Oncology 29:925-933 (2011);Bookman et al., Journal of Clinical Oncology 21:283-290 (2003);Odunsi et al., Cancer Research 63:6076-6083 (2004);and Rosen et al., Gynecologic Oncology 99:267-277 (2005)、各々その全体が参照により本明細書に組み入れられる)。
【0004】
したがって、高い卵巣癌の再発率および低い5年生存率を考慮すると、卵巣癌の治療および予防のための新しい組成物および方法が非常に必要とされている。
【発明の概要】
【0005】
ある態様において、抗ミュラー管ホルモンII型受容体(AMHR2)に対する免疫応答の誘導を介した卵巣癌の治療および/または予防のための方法および組成物が提供される。
【0006】
特定の態様において、対象(例えば、ヒト女性対象)における卵巣癌腫瘍(例えば、原発性または転移性卵巣癌、例えば卵巣上皮癌腫瘍)の治療方法であって、該対象にAMHR2タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも一部(例えば、配列番号1の少なくとも一部)を含むアミノ酸配列を有するポリペプチド(すなわち「AMHR2ポリペプチド」)、AMHR2ポリペプチドをコードする核酸、AMHR2エピトープを提示している抗原提示細胞、および/またはAMHR2刺激リンパ球(例えば、Tリンパ球および/またはBリンパ球)を含む免疫原性組成物を投与することを含む、該治療方法を提供する。いくつかの実施形態において、卵巣癌腫瘍はAMHR2を発現する。いくつかの実施形態において、該免疫原性組成物の投与により、対象における卵巣癌腫瘍に対する免疫応答(例えば、T細胞免疫応答(例えば1型および/または17型免疫応答)および/またはB細胞免疫応答(例えばIgG応答))が誘導される。いくつかの実施形態において、対象は該免疫原性組成物を複数回投与される(例えば、少なくとも2、3、4、5または6回投与)。いくつかの実施形態において、対象は、卵巣癌腫瘍の少なくとも一部を除去するための外科手術を受けたことがある。いくつかの実施形態において、当該方法は、卵巣癌腫瘍の少なくとも一部を外科的に除去するステップをさらに含む。
【0007】
特定の態様において、対象(例えば、ヒト女性対象)における卵巣癌および/または卵巣癌の再発を予防する方法であって、AMHR2タンパク質(例えば、配列番号1)のアミノ酸配列の少なくとも一部を含むアミノ酸配列を有するポリペプチド(すなわち、「AMHR2ポリペプチド」)、AMHR2ポリペプチドをコードする核酸、AMHR2エピトープを提示している抗原提示細胞、および/またはAMHR2刺激リンパ球(例えば、Tリンパ球および/またはBリンパ球)を含む免疫原性組成物を該対象に投与することを含む、該方法が提供される。いくつかの実施形態において、該免疫原性組成物の投与は、対象においてAMHR2に対する免疫応答(例えば、T細胞免疫応答(例えば1型および/または17型免疫応答)および/またはB細胞免疫応答(例えばIgG応答))を誘導する。いくつかの実施形態において、対象は該免疫原性組成物を複数回投与される(例えば、少なくとも2、3、4、5または6回投与)。いくつかの実施形態において、対象は卵巣癌腫瘍(例えば、AMHR2を発現する卵巣癌腫瘍(例えば原発性または転移性卵巣癌腫瘍))の少なくとも一部を除去するための外科手術を受けたことがある。いくつかの実施形態において、該腫瘍は卵巣上皮癌腫瘍である。いくつかの実施形態において、当該方法は、卵巣癌腫瘍の少なくとも一部を外科的に除去するステップをさらに含む。
【0008】
本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態において、免疫原性組成物は、アジュバントを含む。いくつかの実施形態において、アジュバントはアジュバント65、α-GalCer、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、リン酸カルシウム、β-グルカンペプチド、CpG DNA、GM-CSF、GPI-0100、IFA、IFN-γ、IL-17、リピドA、リポ多糖、リポバント(Lipovant)、モンタナイド(Montanide)、N-アセチル-ムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミン、Pam3CSK4、ポリ-IC、クイルA(quil A)、トレハロースジミコレート、またはザイモサンである。いくつかの実施形態において、アジュバントは1型/17型混合型免疫応答の混合を誘導するものである。
【0009】
本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態において、該方法は対象中のおよび/または対象由来の卵巣癌腫瘍がAMHR2を発現するかどうかを決定する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、該方法はAMHR2の発現に関し対象から得られた腫瘍サンプルを試験する工程を含む。いくつかの実施形態において、AMHR2の発現は腫瘍サンプルにおけるAMHR2タンパク質の存在を(例えばFACS、蛍光顕微鏡法、ウエスタンブロットなどによって)検出することによって決定される。いくつかの実施形態において、AMHR2タンパク質は、該サンプルを、検出可能に標識された抗体(例えば、蛍光部分で直接または間接的に標識された抗体)と接触させることによって検出される。いくつかの実施形態において、AMHR2の発現は、AMHR2mRNAの存在を(例えば、RT-PCR、ノーザンブロットなどによって)検出することによって決定される。いくつかの実施形態では、AMHR2mRNAは、該サンプルを検出可能に標識された核酸プローブ(例えば、蛍光部分で直接または間接的に標識されたプローブ)と接触させることによって検出される。いくつかの実施形態において、該方法は、対象から(例えば、腫瘍バイオプシーにより)試料を得ることを含む。
【0010】
本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態において、該方法は、該免疫原性組成物の投与が対象における卵巣癌腫瘍および/またはAMHR2対する免疫応答を誘導するか否かを決定する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、該免疫応答はT細胞免疫応答(例えば、1型/17型混合型免疫応答)である。いくつかの実施形態において、該免疫応答は、患者試料(例えば、患者血清試料)中のサイトカイン(例えば、IFN-γおよび/またはIL-17)の存在を検出することによって決定される。いくつかの実施形態において、サイトカインは、検出されるサイトカインに特異的な検出可能に標識された抗体と、直接的または間接的に試料を接触させることによって検出される。いくつかの実施形態において、サイトカインは、ELISAアッセイを実施することによって検出される。いくつかの実施形態では、免疫応答はB細胞免疫応答である。いくつかの実施形態において、B細胞免疫応答は、患者試料(例えば、血清試料)中の抗AMHR2抗体(例えば、抗AMHR2IgG抗体)の存在を検出することによって検出される。
【0011】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、対象にさらなる薬剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、該さらなる薬剤は抗癌剤である。いくつかの実施形態において、抗癌剤はパクリタキセル、シスプラチン、トポテカン、ゲムシタビン、ブレオマイシン、エトポシド、カルボプラチン、ドセタキセル、ドキソルビシン、トポテカン、シクロホスファミド、トラベクテジン、オラパリブ、タモキシフェン、レトロゾール、またはベバシズマブである。いくつかの実施形態において、抗癌剤は免疫チェックポイント阻害剤である。いくつかの実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤はCTLA4の阻害剤、例えば抗CTLA4抗体(例えば、イピリムマブ(BMS)、トレメリムマブ(AstraZeneca)、および/またはKAHR-102(Kahr Medical))である。いくつかの実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤はPD-1の阻害剤、例えば抗PD-1抗体(例えば、ニボルマブ(BMS)、ペンブロリズマブ/ランブロリズマブ(Merck)、ピディリズマブ(Curetech)、AMP-224(GSK)、AMP-514(AstraZeneca)、STI-A1110(Sorrento)および/またはTSR-042(Tesaro)である。いくつかの実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤はPD-L1および/またはPD-L2の阻害剤、例えば抗PD-L1および/または抗PD-L2抗体(例えば、RG-7446(Roche)、BMS-936559(BMS)、MEDI-4736(AstraZeneca)、MSB-0020718C(Merck)、AUR-012(Pierre Fabre Med)、STI-A1010(Sorrento))である。
【0012】
本明細書で提供される方法の特定の実施形態において、該ヒト女性対象は卵巣癌になりやすい素因を持っている。いくつかの実施形態では、対象のゲノムは、対象を卵巣癌にかかりやすくするBRCA1またはBRCA2変異を含む。いくつかの実施形態において、対象は、卵巣癌の家族歴を有する。いくつかの実施形態において、対象は閉経後のヒト女性である。
【0013】
特定の態様において、対象(例えば、ヒト女性対象)における卵巣癌を予防および/または治療するためのキットおよび/または組成物(例えば、免疫原性組成物)であって、AMHR2タンパク質(例えば、配列番号1)のアミノ酸配列の少なくとも一部を含むアミノ酸配列を有するポリペプチド(すなわち、「AMHR2ポリペプチド」)、AMHR2ポリペプチドをコードする核酸、AMHR2エピトープを提示している抗原提示細胞、および/またはAMHR2刺激リンパ球(例えば、Tリンパ球および/またはBリンパ球)を含む、該キットまたは組成物が提供される。いくつかの実施形態において、該キットは該ポリペプチド、核酸、抗原提示細胞および/またはリンパ球の複数回用量を含む。いくつかの実施形態において、該キットは使用説明をさらに含む。
【0014】
本明細書で提供されるキットおよび組成物の特定の実施形態において、該キットまたは組成物は、アジュバントをさらに含む。いくつかの実施形態において、該アジュバントは、アジュバント65、α-GalCer、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、リン酸カルシウム、β-グルカンペプチド、CpG DNA、GM-CSF、GPI-0100、IFA、IFN-γ、IL-17、リピドA、リポ多糖、リポバント(Lipovant)、モンタナイド(Montanide)、N-アセチル-ムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミン、Pam3CSK4、クイルA(quil A)、トレハロースジミコレートまたはザイモサンである。いくつかの実施形態において、アジュバントは1型/17型混合型免疫応答を誘導するものである。
【0015】
本明細書で提供される該キットまたは組成物のいくつかの実施形態において、該キットまたは組成物はさらなる薬剤(例えば、抗癌剤)を更に含む。いくつかの実施形態において、該さらなる薬剤はパクリタキセル、シスプラチン、トポテカン、ゲムシタビン、ブレオマイシン、エトポシド、カルボプラチン、ドセタキセル、ドキソルビシン、トポテカン、シクロホスファミド、トラベクテジン、オラパリブ、タモキシフェン、レトロゾールおよびベバシズマブからなる群から選択される抗癌剤である。
【0016】
いくつかの実施形態において、該抗癌剤は免疫チェックポイント阻害剤である。いくつかの実施形態において、該免疫チェックポイント阻害剤はCTLA4の阻害剤、例えば抗CTLA4抗体(例えば、イピリムマブ(BMS)、トレメリムマブ(AstraZeneca)および/または KAHR-102(Kahr Medical))である。いくつかの実施形態において、該免疫チェックポイント阻害剤はPD-1の阻害剤、例えば抗PD-1抗体(例えば、ニボルマブ(BMS)、ペンブロリズマブ/ランブロリズマブ(Merck)、ピディリズマブ(Curetech)、AMP-224(GSK)、AMP-514(AstraZeneca)、STI-A1110(Sorrento)、および/またはTSR-042(Tesaro))である。いくつかの実施形態において、該免疫チェックポイント阻害剤はPD-L1および/またはPD-L2の阻害剤、例えば抗PD-L1および/または抗PD-L2抗体(例えば、RG-7446(Roche)、BMS-936559(BMS)、MEDI-4736(AstraZeneca)、MSB-0020718C(Merck)、AUR-012(Pierre Fabre Med)、STI-A1010(Sorrento))である。
【図面の簡単な説明】
【0017】
図1図1には3つのパネルがある。パネル(A)は細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインを示す全長AMHR2、およびC-末端6xHisタグのついたAMHR2-CD変異体を示す模式図である。パネル(B)は、非誘導、IPTG誘導におけるAMHR2-CDの発現、およびNi-NTAアフィニティー精製AMHR2-CDを示す、クーマシーブルーで染色されたSDS-PAGEゲルを示す。パネル(C)は、非誘導、IPTG誘導におけるAMHR2-CDの発現、およびNi-NTAアフィニティー精製(2つの用量)のAMHR2-CDを示す、SDS-PAGEゲルの抗Hisウエスタンブロットを示す。
図2図2は6つのパネルを有し、AMHR2-CD/CFAによるメスC57BL/6マウスの免疫化がもたらしたデータ、およびLNCまたは脾細胞が増殖およびサイトカイン生成の評価のためにインビトロで培養されたことを示す。パネル(A)は、10日刺激LNCが抗原濃度のいくつかのログにわたってAMHR2-CDに対する顕著な抗原特異的リコール増殖応答を示したことを実証する。パネル(B)は、AMHR2-CDに対する応答が磁気ビーズ分離によって精製されたCD4T細胞によって誘発されるが、CD8T細胞によっては誘発されなかったことを示す。パネル(C)は、AMHR2-CDに対する増殖応答がCD4抗体の存在下で著しく阻害されるが、CD8またはアイソタイプ対照抗体の存在下では阻害されないことを示す。パネル(D)は免疫4週間後に脾細胞は免疫原で再活性化されたこと、および72時間の培養上清のELISA分析により、AMHR2-CDに対するリコール応答がIFNγ生成の上昇およびIL-2、IL-4、およびIL-5の極小の生成を伴う炎症性の表現型を伴ったことを示されたことを示す。パネル(E)は、IFNγの脾細胞生成が精製CD4T細胞から誘発され、精製CD8T細胞では誘発されなかったことを示す。パネル(F)は、免疫化の2ヶ月後、AMHR2-CD特異的IgGの血清レベルが1:50,000希釈を超えての力価でも検出可能であったことを示す。PBSコントロールには希釈血清の代わりにPBSを使用した。エラーバーは±SDを示す。
図3図3は3つのパネルを有し、AMHR2-CD免疫化後の良性一過性卵巣炎症に関連するデータを示す。パネル(A)は、相対的卵巣IFNγ遺伝子発現が、AMHR2-CDで免疫した4週間後に上昇したが、CFA単独で免疫した後では上昇しなかったことを示す。免疫後8週間で、相対的卵巣IFNγ遺伝子発現は、免疫した両方のマウス群において同様であった。パネル(B)はAMHR2-CD免疫化マウスの卵巣におけるIFNγの低レベル一過性発現は、AMHR2-CDで免疫化したメスC57BL/6マウスおよびCFA単独で免疫化したコントロールマウスにおける4連続の交配サイクルにわたる仔産生により定義される妊孕性を評価することにより決定されたとおり、卵巣機能に対する検出可能な影響と関連していないことを示す。パネル(C)は、AMHR2遺伝子発現が卵巣およびID8卵巣腫瘍細胞に限定され、正常子宮、胃、脾臓、心臓、肺、腎臓および肝臓において検出されなかったことを示す。エラーバーは±SDを示す。
図4図4は7つのパネルを有し、AMHR2-CD免疫化マウスにおける腫瘍増殖の阻害に関連するデータを示す。図(A)、(B)および(C)にそれぞれ示されるように、ID8腫瘍増殖は、腫瘍細胞の接種の5日前、7日前、または1日前に予防的にワクチン接種されたマウスにおいて阻害された。パネル(D)は、ID8接種の7日前および1日前にワクチン接種されたマウスにおける実験終了時の最終腫瘍重量によって測定されたとおり、AMHR2-CDワクチン接種が全体的な腫瘍量の有意な減少をもたらしたことを示す。パネル(E)は、ID8腫瘍の接種の60日後のAMHR2-CDによる治療的ワクチン接種が、確立された触知できる増殖ID8腫瘍の増殖を有意に阻害することを示す。パネル(F)は、AMHR2-CDによる6-7週齢のメスTgM1SIIR-TAgトランスジェニックマウスの予防的ワクチン接種が、自然発症EOCの増殖において高度に有意な阻害をもたらしたことを示す。パネル(G)は、6-7週齢の雌TgM1SIIR-TAgトランスジェニックマウスの予防的AMHR2-CDワクチン接種が、CFA単独でワクチン接種したコントロールマウスと比較して、高度に有意な41.7%の平均OS増加をもたらしたことを示す。アスタリスクは統計的有意性を示す。エラーバーは±SDを示す。
図5図5は、3つのパネルを有し、腫瘍分析に関連するデータを示す。パネル(A)において、矢印は低解像度(上)および高解像度(下)画像中のAMHR2-CDワクチン接種マウスからのID8腫瘍におけるCD3T細胞の浸潤を示す。CFA単独でワクチン接種したコントロールマウスでは、CD3T細胞の炎症性浸潤は観察されなかった。パネル(B)は、CD3T細胞集団にゲートされたTILのフローサイトメトリー分析は、CFA単独で免疫化されたコントロールマウスと比較して、AMHR2-CDでワクチン接種されたマウスからの腫瘍浸潤におけるCD4T細胞の割合の明らかな増加を示したが、CD8T細胞では示されなかったことを示す。示されたデータは、同様の結果をもたらす3つの実験の代表例である。パネル(C)は、AMHR2-CD免疫化マウス由来の腫瘍が、CD4、IFNγ、TNFα、およびIL-2について相対的な遺伝子発現の増加を一貫して示したが、CD8については示さなかったことを示している。アスタリスクは統計的有意性を示す。エラーバーは±SDを示す。
図6図6は、5つのパネルを有し、CD4T細胞による腫瘍増殖に対する免疫防御の受動移入に関連するデータを示す。細胞移入の翌日に、レシピエントマウスに、ID8腫瘍細胞を接種した。AMHR2-CD特異的LNC(パネル(A))および脾細胞(パネル(B))を移入したマウスでは、ID8腫瘍の増殖が阻害された。パネル(C)は、脾細胞移入および接種の190日後に、AMHR2-CD特異的脾細胞のレシピエントでは、OVA特異的脾細胞のレシピエントと比較して、平均腫瘍重量が低かったことを示す。パネル(D)および(E)はそれぞれ、精製AMHR2-CD特異的CD4T細胞の移植がID8腫瘍増殖を阻害したことを示す(B220B細胞では示されなかった)。アスタリスクは統計的有意性を示す。エラーバーは±SDを示す。
図7図7は、正常ヒト組織におけるAMHR2遺伝子発現を示す。25個の他の正常なヒト組織もまた試験され、バックグラウンドレベルを上回るAMHR2の発現は示されなかった。
図8図8は、5つのパネルを有し、ヒト組織におけるAMHR2遺伝子発現を示す。パネル(A)は、AMHR2の細胞外ドメインが卵巣で発現するが、他のAMHR2発現組織では発現しないことを示す。パネル(B)は、AMHR2-CDおよびAMHR2-EDに特異的なプライマー対を使用するヒト組織のqRT-PCR分析は、AMHR2-EDが専らヒト卵巣で発現され、ヒトの副腎または膵臓では発現されないことを示すことによって、ヒトタンパク質アトラスからの治験を確認する。パネル(C)は、ヒトAMHR2の卵巣発現が年齢と共に低下すること、およびこの低下は、閉経前卵巣(平均年齢、31歳)と比較して、閉経後卵巣(平均年齢、64歳)では有意に低いレベルで発現するAMHR2-EDに関して特に明白であることを示す。より年老いたマウス卵巣(9ヶ月齢)では、AMHR2-ED遺伝子発現の同様の有意な低下が起こる。パネル(D)は、AMHR2の卵巣発現の年齢に伴う減少は、ヒトEOCにおけるAMHR2-CDおよびAMHR2-EDドメインの両方の高レベルの遺伝子発現とは対照的であることを示す。パネル(E)は、ヒトEOCにおけるこの高いAMHR2遺伝子発現が、16の全てのヒトEOC腫瘍において、ウエスタンブロット分析によって検出された対応する高レベルの検出可能なAMHR2タンパク質を伴うことを示す(これはAMHR2-EDに特異的なポリクローナル抗体を用い、内在性コントロールとしてβ-アクチン免疫染色を用いて試験された)。すべての場合において、エラーバーは±SDを示し、アスタリスクは有意性を示す。
図9図9は2つのパネルを有し、ヒトEOCにおけるAMHR2細胞外ドメインの発現を示す。パネル(A)は、AMHR2-EDに特異的なプライマー対を使用する定量的リアルタイムRT-PCR分析が正常ヒト卵巣(n=7)におけるAMHR2-EDの発現を示し、正常なヒト副腎(n=3)では示さないことを示す。パネル(B)は、AMHR2の細胞外ドメインに特異的なポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロット分析は、試験した5個のヒトEOCすべてにおいてAMHR2-EDタンパク質の検出を示すことを示す。該全長タンパク質は当該5つの試験腫瘍のうちの1つのみで検出され、細胞質キナーゼドメインの領域の可能な欠失のために、多くのEOCにおいてAMHR2シグナル伝達が変化し得ることを示唆された。β-アクチンに特異的な抗体をコントロールとして使用した。
図10図10には8つのパネルがある。パネル(A)は、完全長マウスAMHR2(上段)ならびに組み換え免疫原としての産生のために選択された140アミノ酸AMHR2-ED HISタグ切断変異体の略図である。パネル(B)は、2つの充填量でのNi-NTAアフィニティー精製AMHR2-EDの発現を示すSDS-PAGEゲルの抗Hisウエスタンブロット(左)およびCoomasie Blue染色(右)を示す。パネル(C)は、8週齢の雌C57BL/6マウスのAMHR2-EDワクチン接種の1ヶ月後を示す;ELISPOT分析は、IFNγおよびIL-17を産生するが、IL-5は産生しない、抗原特異的T細胞の脾細胞頻度の上昇を示した。パネル(D)(IFNγ)およびパネル(E)(IL-17)は、AMHR2-EDに対する炎症誘発性応答が、応答するCD4T細胞に主によるものであったが、CD8T細胞からの顕著な応答も組み込まれたことを示す。パネル(F)は、AMHR2-EDワクチン接種がAMHR2-EDに対する実質的な血清IgG抗体応答を誘導し、1/50,000までの希釈で検出可能であったことを示し、パネル(G)は、主に関与するIgG1およびIgG2bアイソタイプを示す。パネル(H)は、3つの他の異なるH-2ハプロタイプを表す雌マウスがIFNγ産生T細胞の高い抗原特異的頻度を示したことから、AMHR2-EDの免疫原性はC57BL/6マウスに限定されないことを示す。すべての場合において、エラーバーは±SDを示す。
図11図11は5つのパネルを有し、AMHR2-EDが高度に免疫原性であることを示す。パネル(A)は、AMHR2-ED免疫化マウス由来の脾細胞が、AMHR2-EDに対する抗原特異的リコール増殖応答を示したが、AMHR2-EDと同様の方法で生成および精製された無関係なコントロール抗原である組換えマウスβ-カゼインに対してでは応答はないことを示す。パネル(B)は、CFA免疫化マウスからの脾細胞がAMHR2-EDおよびβ-カゼインの両方に応答しないことを示す。パネル(C)は培養上清のELISA分析を示し、これは高レベルの炎症誘発性サイトカイン、IFNγおよびIL-17の産生をAMHR2-EDが活性化したことおよび2型制御性サイトカインIL-5の極小産生であったことを示す。パネル(D)は、AMHR2-ED免疫化マウス由来の脾細胞は1型(~1/4,000リンパ球;p<0.0001)および17型(~1/20,000リンパ球;p<0.02)の炎症誘発性T細胞の有意に高い頻度と、IL-5を発現する2型制御性T細胞の最小頻度を実証することを示す。パネル(E)は、AMHR2-ECによる免疫化の4ヶ月後、AMHR2-ED特異的IgGの血清力価が、1/50,000希釈を超える力価で有意に検出可能であったことを示す(p<0.001)。
図12図12は5つのパネルを有し、AMHR2-EDが主にCD4T細胞応答を活性化することを示す。TgM1SIIR-TAgトランスジェニック雌マウスのAMHR2-EDによる免疫化から1ヶ月後に単離した脾細胞および精製CD4(CD8ではない)T細胞は、1型(パネル(A))および17型(パネル(B)))炎症誘発性T細胞の顕著な抗原特異的誘導を示した。6週齢でAMHR2-EDで免疫化した7ヶ月齢のメスのTgMISIIR-Tagマウスから採取した自然発症EOCの免疫組織化学分析は、CD3T細胞(パネル(C))およびCD4T細胞(パネル(D))の主な浸潤を示し、CD8T細胞では示さなかった(パネル(E))。
図13図13は3つのパネルを有し、AMHR2-EDによる免疫後の一過性卵巣炎症を示す。リアルタイムRT-PCR分析により、AMHR2-EDによる免疫4週間後(パネル(A))に摂取した卵巣では炎症性サイトカインIL-1βの発現を示したが、8週間後(パネル(B))では示さなかった。IFNγ発現は、免疫後の時点で上昇しなかった。9ヶ月齢のC57BL/6雌マウスのAMHR2-EDワクチン接種後4週間での(パネル(C))qRT-PCR分析は、IL-1βについてもIFNγについても卵巣遺伝子発現の上昇を示さなかった。
図14図14は2つのパネルを有し、AMHR2-ED免疫化によってマウス妊孕性が影響を受けないことを示している。CFA中のAMHR2-EDで免疫化したマウスまたはCFA単独で免疫化した対照マウス間に、1腹あたり平均仔数(パネル(A))および平均仔出生体重(パネル(B))に有意差は認められなかった。
図15図15は8つのパネルを有しており、AMHR2-EDワクチン接種は、自発性および移植可能な卵巣腫瘍の増殖を阻害することを示している。パネル(A)は、6-7週齢の雌TgM1SIIR-TAgトランスジェニックマウスの予防的AMHR2-EDワクチン接種が、自然発症EOCの増殖における高度に有意な阻害をもたらしたことを示す(p<0.0001)。パネル(B)は、6-7週齢の雌TgM1SIIR-TAgトランスジェニックマウスの予防的AMHR2-EDワクチン接種が、CFA単独でワクチン接種したコントロールマウスと比較して全生存の42%の増大をもたらした(平均193.7±34.5日対平均135±13.89日)ことを示す。移植可能なTgMISIIR EOC腫瘍の増殖における同様の有意な阻害が、3x10マウス卵巣癌(MOVCAR)細胞を接種する7日間前パネル(C)または15日間前パネル(D)のいずれかにワクチン接種したマウスに見られた(p<0.001)。パネル(E)は、6~7週齢のTgMISIIR-TAg(DR26)トランスジェニックマウスの予防的AMHR2-EDワクチン接種が自然発症EOC腫瘍の出現および増殖を有意に遅延させたことを示す。パネル(F)は、自発性腫の増殖の阻害が、高度に有意な全生存の42%の増大をもたらしたことを示す。パネル(G)は、AMHR2-EDワクチン接種が、確立された自発性腫瘍を有するTgMISIIR-TAg(DR26)トランスジェニックマウスにおいてEOCに対する有意な免疫療法を提供するのにも有効であることを示す。パネル(H)は、AMHR2-EDでワクチン接種したTgMISIIR-TAg(DR26)マウスの自然発症EOC腫瘍の免疫組織化学的分析が、矢印で示されるとおり、一貫して、CD3T細胞(左上パネル)およびCD4T細胞(中央上パネル)の顕著な浸潤(時折CD8T細胞(右上パネル)も)を示した。CFA単独でワクチン接種したコントロールマウス由来の対応する免疫染色されたEOC腫瘍は、一貫して検出可能なT細胞浸潤を示さなかった(下パネル)。すべての場合において、エラーバーは±SDを示し、アスタリスクは有意性を示す。
図16図16は2つのパネルを有し、AMHR2-ED刺激CD4T細胞およびB220B細胞の移入後のEOC腫瘍増殖の阻害を示す。AMHR2-EDで免疫したマウスからのCD4T細胞(パネル(A))またはB220B細胞(パネル(B))の移入後に、MOVCAR EOCの増殖の阻害が生じた。アスタリスクは有意性を示す。
図17図17は、2つのパネルを有し、AMHR2-ED刺激CD4T細胞およびB220B細胞の移入後の全生存の増大を示す。AMHR2-EDで免疫化したマウスからのCD4T細胞パネル(A)またはB220B細胞パネル(B)を受けたMOVCAR腫瘍保有マウスにおける全生存の増大。
図18図18は、AMHR2-ED刺激ドCD4T細胞および血清の移入後の腫瘍増殖の阻害および全生存の増大を示す。ID8-VEGF EOC腫瘍の成長阻害が、AMHR2-EDで免疫化したマウスのCD4T細胞(左上パネル)または血清(左下パネル)を受けたマウスで生じた。全生存の増大が、AMHR2-EDで免疫化されたマウスからのCD4T細胞(右上のパネル)または血清(右下のパネル)を受けたマウスで生じた。
図19図19は、ヒトAMHR2-CDタンパク質バリアントの最も長いアミノ酸配列(配列番号1)である。細胞外ドメイン(AMHR2-ED)は太字で示し、細胞質ドメイン(AMHR2-CD)はイタリック体で示す。
図20図20は6つのパネルを有し、CD4T細胞、B220B細胞、および精製IgGによる腫瘍免疫の受動移入を示す。パネル(A)は、MOVCAR接種の1日前のTgMISIIR-TAg(低)雌マウスへのAMHR2-ED刺激CD4T細胞の移入が、腫瘍増殖の有意な阻害をもたらしたことを示し、パネル(B)は、オボアルブミン刺激CD4T細胞を受けたマウスと比較して全生存が向上したことを示す。パネル(C)は、MOVCAR接種の1日前のTgMISIIR-TAg(低)雌マウスへのAMHR2-ED刺激B220B細胞の移入が腫瘍増殖の有意な阻害をもたらしたことを示し、パネル(D)は、オボアルブミン免疫化マウスからのB220B細胞を受けたマウスと比較して、全生存が向上したことを示す。パネル(E)はMOVCAR接種の1日前の、AMHR2-ED免疫化マウス由来アフィニティー精製IgGの、TgMISIIR-TAg(低)雌マウスへの移入が、腫瘍増殖の有意な阻害をもたらしたことを示し、パネル(F)はオボアルブミン免疫マウス由来のアフィニティー精製IgGを受けたマウスと比較して、全生存が向上したことを示す。すべてのケースにおいて、エラーバーは±SDを示し、アスタリスクは有意性を示す。
【0018】
詳細な説明
一般
本願では、抗ミュラー管ホルモンII型受容体(AMHR2)に対する免疫応答の誘導を介した卵巣癌の治療および/または予防のための方法、キットおよび組成物が提供される。
【0019】
AMHR2はトランスフォーミング増殖因子ベータ(TGFβ)ファミリーのII型受容体に相同な(homologous to)セリン/スレオニンキナーゼ容体である。ヒトAMHR2遺伝子は11個のエクソンを含有し、3つの既知のコードタンパク質を産生する7つの既知の選択的スプライスによるバリアント、タンパク質コード特性を持つ1つの更なるバリアント、およびオープンリーディングフレームの無い3つの非コード転写物がある(The human AMHR2 gene contains 11 exons with seven known alternatively spliced variants producing three known coded proteins, one additional variant with protein coding features, and three non-coding transcripts with no open reading frames.)。成人女性において、573アミノ酸長のタンパク質(配列番号1;図19)の最も長いヒトタンパク質コード転写物は、通常、卵巣のみで発現され、127アミノ酸細胞外ドメイン(AMHR2-ED)、26アミノ酸膜貫通ドメイン、および403アミノ酸細胞質ドメイン(AMHR2-CD)を含む。AMHR2シグナル伝達は、雄性発生の間にミュラー管の退行を引き起こし、および成人女性において卵母細胞発生および卵胞生成を調整し、それにより、卵巣予備能力および受精能の実質的な制御を提供する。AMHR2はヒトEOCの大部分で発現し、原発性EOCでは90%、境界悪性腫瘍では78%、非EOC卵巣腫瘍では77~86%、およびグレードIII-IVの卵巣癌の悪性腹水では56%である。正常組織では、AMHR2-CD発現は主に卵巣に限定される。AMHR2-CD発現が少数の他のヒト組織でも起こることもあるが、AMHR2-EDは専ら卵巣で発現する。さらに、AMHR2-CDおよびAMHR2-EDの両方の卵巣発現は、閉経後の卵巣で減少する。
【0020】
本明細書に記載されるように、AMHR2ポリペプチドによるワクチン接種および/またはAMHR2で刺激されたリンパ球の養子移入は、広範な自己免疫合併症を生じることなく、卵巣癌に対する有効な免疫療法を提供する。399アミノ酸配列の該細胞質ドメイン(AMHR2-CD)または140アミノ酸配列の該細胞外ドメイン(AMHR2-ED)のいずれかを含有する組換えマウスAMHR2ポリペプチドのいずれかによる卵巣癌のマウスモデルの免疫化は、顕著な炎症誘発性T細胞応答をもたらし、非常に高いIgG抗体価を伴った。AMHR2-CDおよびAMHR2-EDポリペプチドによるワクチン接種は、卵巣癌に対する有意なT細胞介在性の予防および治療を提供し、マウス卵巣癌モデルにおける自然発症卵巣癌腫瘍の発症に対する有意な予防を媒介した。さらに、当該腫瘍増殖に対する保護は、自己免疫症状が最小限であり、その後の交配サイクルにわたって受精能に検出できるほどの影響はなかった。これらのデータは、AMHR2-CDおよび/またはAMHR2-EDに対する標的化ワクチン接種が、卵巣癌に対する安全かつ有効な治療法を提供することを示している。
【0021】
定義
便宜上、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲で使用される特定の用語をここに集める。
【0022】
冠詞「a」および「an」は、本明細書では、その冠詞の文法的目的の1つまたは複数(すなわち、少なくとも1つ)を意味するために使用される。例として、「an element」は、1つのelementまたは2つ以上のelementを意味する。
【0023】
本明細書で使用される場合、用語「投与する」は、対象に医薬品または組成物を提供することを意味し、これに限定されないが、例えば、医療従事者による投与および自己投与を含む。
【0024】
本明細書において、「免疫応答」という用語は、免疫系による抗原または抗原決定基に対する任意の応答を意味する。例示的な免疫応答として、体液性免疫応答(例えば抗原特異的抗体(中和またはその他)の生成)および細胞性免疫応答(例えばリンパ球増殖)が挙げられる。1型炎症性免疫応答は1型サイトカイン(例えばIFNγ)の産生を特徴とする。2型炎症性免疫応答は2型サイトカイン(例えばIL-4またはIL-5)の発現を特徴とする。17型炎症性免疫応答は17型サイトカイン、特にIL-17の発現を特徴とする。いくつかの例では、混合型免疫応答が生成され得る。例えば、ある場合には、IFNγおよびIL-17の両方の発現を特徴とする1型/17型混合型炎症性免疫応答が産生される。
【0025】
本明細書で使用される場合、アミノ酸配列間の「%同一性」は「%相同性」と同義であり、これはKarlinおよびAltschul(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 2264-2268, 1990)およびKarlinおよびAltschul(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5873-5877, 1993)で修正されたアルゴリズムを用いて決定することができる。上記のアルゴリズムはAltschulら(J. Mol. Biol. 215, 403-410, 1990)のNBLASTおよびXBLASTプログラムに組み込まれている。本明細書に記載のポリヌクレオチドに相同なヌクレオチド配列をえるためにBLASTヌクレオチド検索を、NBLASTプログラム、スコア=100、語長(wordlength)=12で行う。基準ポリペプチドと相同なアミノ酸配列を得るために、BLASTタンパク質検索をXBLASTプログラム、スコア=50、語長(wordlength)=3で行う。比較目的のためのギャップのあるアライメントを得るために、Gapped BLASTをAltschulら((Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402, 1997)に記載のとおりに使用する。BLASTおよびGapped BLASTプログラムを使用する場合、それぞれのプログラム(例えば、XBLASTおよびNBLAST)のデフォルトパラメーターが使用される。
【0026】
本明細書で使用される「医薬的に許容される担体」という用語は医薬的に許容される物質、組成物またはビヒクル、例えば液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、または物質を封入する溶媒であって、対象化合物をある臓器または体の部分から、別の臓器または体の部分へ運搬または輸送することに関与するものを意味する
【0027】
本明細書で使用される場合、用語「対象」は、治療または療法のために選択されたヒトまたは非ヒト動物を意味する。
【0028】
本明細書で使用する「治療上有効な量」および「有効量」という語句は、医薬療法に適用可能な合理的な利益/リスク比で対象の少なくとも一部の細胞集団において所望の治療効果を生じるのに有効な薬剤の量を意味する
【0029】
対象における疾患を「治療する」または疾患を有する対象を「治療する」とは、疾患の少なくとも1つの症状が減少するように、または悪化しないように、対象に医薬的処置、例えば薬物の投与を施すことをいう。
【0030】
抗ミュラー管ホルモン受容体II(AMHR2)
特定の態様において、AMHR2ポリペプチド(例えば、AMHR2-EDまたはその免疫原性フラグメント、またはAMHR2-CDまたはその免疫原性フラグメントを含有するポリペプチド)またはAMHR2ポリペプチドをコードする核酸の投与による、抗ミュラー管ホルモンII型受容体(AMHR2)に対する免疫応答の誘導を介した卵巣癌の治療および/または予防のための方法、キットおよび組成物が提供される。
【0031】
ヒトAMHR2遺伝子は11個のエクソンを含有し、3つの既知のコードタンパク質を産生する7つの既知の選択的スプライスによるバリアント、タンパク質コード特性を持つ1つの更なるバリアント、およびオープンリーディングフレームの無い3つの非コード転写物がある(The human AMHR2 gene contains 11 exons with seven known alternatively spliced variants producing three known coded proteins, one additional variant with protein coding features, and three non-coding transcripts with no open reading frames.)。成人女性において、573アミノ酸長のタンパク質の最も長いヒトタンパク質コード転写物は、通常、卵巣のみで発現され、127アミノ酸細胞外ドメイン、26アミノ酸膜貫通ドメイン、および403アミノ酸細胞質ドメインを含む(図19)。AMHR2シグナル伝達は、雄性発生の間にミュラー管の退行を引き起こし、および成人女性において卵母細胞発生および卵胞生成を調整し、それにより、卵巣予備能力および受精能の実質的な制御を提供する。AMHR2の3つのタンパク質コードアイソフォームのmRNA配列は、NCBI参照番号NM_020547.2、NM_001164690.1およびNM_001164690.1で提供され、これらはそれぞれ、NCBI参照番号、NP_065434.1、NP_001158162.1およびNP_001158163.1で提供されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。上記mRNAおよびタンパク質配列の各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0032】
いくつかの実施形態において、AMHR2ポリペプチドおよび/またはAMHR2ポリペプチドをコードする核酸が本明細書において提供される。AMHR2ポリペプチドはAMHR2タンパク質、AMHR2-ED、AMHR2-CD、および/またはAMHR2特異的免疫応答を誘発するのに充分な長さの該AMHR2アミノ酸配列の一部のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。特定の実施形態において、AMHR2ポリペプチドはまた、当該アミノ酸配列に相当しないアミノ酸を含む(例えば、AMHR2アミノ酸配列と非AMHR2タンパク質またはポリペプチドに相当するアミノ酸配列を含む融合タンパク質)。いくつかの実施形態において、AMHR2ポリペプチドは、AMHR2タンパク質またはそのフラグメントに相当するアミノ酸配列のみを含む。
【0033】
本明細書で提供される方法、組成物およびキットの特定の実施形態において、AMHR2ポリペプチドは、AMHR2タンパク質アミノ酸配列の少なくとも8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、140、150、160、170、180、190または200個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、該連続するアミノ酸は、AMHR2の細胞質ドメインのアミノ酸配列と同一である。いくつかの実施形態において、該連続するアミノ酸は、AMHR2の細胞外ドメインのアミノ酸配列と同一である。
【0034】
本明細書で提供される方法の特定の実施形態において、AMHR2ポリペプチドはAMHR2タンパク質アミノ酸配列の少なくとも8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、140、150、160、170、180、190または200個の連続するアミノ酸から本質的になるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、該連続するアミノ酸は、AMHR2の細胞質ドメイン中のアミノ酸配列と同一である。いくつかの実施形態において、該連続するアミノ酸はAMHR2の細胞外ドメイン中のアミノ酸配列と同一である。
【0035】
本明細書で提供される方法の特定の実施形態では、AMHR2ポリペプチドはAMHR2タンパク質アミノ酸配列の少なくとも8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、140、150、160、170、180、190または200個の連続するアミノ酸からなるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、該連続するアミノ酸はAMHR2の細胞質ドメイン中のアミノ酸配列と同一である。いくつかの実施形態において、該連続するアミノ酸はAMHR2の細胞外ドメイン中のアミノ酸配列と同一である。
【0036】
本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態において、AMHR2ポリペプチドはAMHR2タンパク質中のアミノ酸配列と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、77%、98%または99%の同一性である、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、140、150、160、170、180、190または200個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、該アミノ酸配列は、AMHR2タンパク質の細胞質ドメイン中にある。いくつかの実施形態では、該アミノ酸配列は、AMHR2タンパク質の細胞外ドメイン中にある。
【0037】
本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態において、AMHR2ポリペプチドはAMHR2タンパク質中のアミノ酸配列と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、77%、98%または99%同一性の8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、140、150、160、170、180、190または200個の連続するアミノ酸から本質的になるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、該アミノ酸配列はAMHR2タンパク質の細胞質ドメイン中にある。いくつかの実施形態において、該アミノ酸配列はAMHR2タンパク質の細胞外ドメイン中にある。
【0038】
本明細書で提供される方法、組成物およびキットのいくつかの実施形態において、AMHR2ポリペプチドはAMHR2タンパク質中のアミノ酸配列と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、77%、98%または99%同一性である8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、140、150、160、170、180、190または200個の連続するアミノ酸からなるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、該アミノ酸配列は、AMHR2タンパク質の細胞質ドメイン中にある。いくつかの実施形態では、該アミノ酸配列は、AMHR2タンパク質の細胞外ドメイン中にある。
【0039】
本明細書で提供される方法、組成物およびキットのいくつかの実施形態において、AMHR2ポリペプチドは、AMHR2の細胞外ドメインと同一のアミノ酸配列を含まない。いくつかの実施形態において、AMHR2ポリペプチドは、AMHR2の膜貫通ドメインと同一のアミノ酸配列を含まない。いくつかの実施形態において、AMHR2ポリペプチドは、AMHR2の細胞質ドメインと同一のアミノ酸配列を含まない。
【0040】
当業者に周知のように、実質的な配列類似性を有するポリペプチドは、宿主動物において同一または非常に類似の免疫反応を引き起こすことができる。従って、いくつかの実施形態において、AMHR2タンパク質の誘導体、同等物(equivalent)、バリアント、フラグメント、または突然変異体またはそれらのフラグメントもまた本明細書で提供される該方法、組成物およびキットに適し得る。
【0041】
いくつかの実施形態において、該AMHR2ポリペプチドのバリエーションまたは誘導体が本明細書で提供される。改変されたポリペプチドは改変された(例えば保存的置換によって)アミノ酸配列を有し得るが、未改変のタンパク質抗原と反応する免疫応答を依然誘発し、機能的同等物(equivalent)と考えられる。本明細書で使用される場合、用語「保存的置換」はを別の生物学的に類似の残基によるアミノ酸残基の置換を示す。同じ保存的グループ内のアミノ酸は、典型的には、タンパク質の機能に実質的に影響を及ぼすことなく互いに代用することができることは、当技術分野において周知である。特定の実施形態によれば、AMHR2ポリペプチドのリガンド結合ドメインの誘導体、同等物(equivalent)、バリアント、または突然変異体は、該AMHR2タンパク質またはそのフラグメントの少なくとも85%相同性の配列のポリペプチドである。いくつかの実施形態では、相同性は少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%である。
【0042】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のAMHR2ポリペプチドをコードする核酸(例えばAMHR2ポリペプチドをコードするDNA分子)が提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、AMHR2ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む発現ベクターを含む。いくつかの実施形態において、AMHR2核酸は、オープンリーディングフレームの発現に必要な調節エレメントを含む。そのような要素は、例えば、プロモーター、開始コドン、停止コドン、およびポリアデニル化シグナルを含むことができる。さらに、エンハンサーを含めることができる。これらのエレメントは、AMHR2ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結することができる。
【0043】
プロモーターの例には、これらに限定されないが、サルウイルス40(SV40)のプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス(MMTV)プロモーター、ヒトヒト免疫不全ウイルス(HIV)(例えばHIV末端反復配列(LTR)プロモーター)、モロニーウイルス、サイトメガロウイルス(CMV)(例えばCMV最初期プロモーター)、エプスタイン・バーウイルス(EBV)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)、ならびにヒト遺伝子(例えばヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、およびヒトメタロチオネイン)のプロモーターが挙げられる。適切なポリアデニル化シグナルの例としては、SV40ポリアデニル化シグナルおよびLTRポリアデニル化シグナルが挙げられるが、これらに限定されない。
【0044】
発現に必要とされる調節エレメントに加えて、他のエレメントもまた核酸分子に含まれ得る。そのような追加要素にはエンハンサーが含まれる。エンハンサーには、上記のプロモーターが含まれる。好ましいエンハンサー/プロモーターには、例えば、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンおよびウイルスエンハンサー(例えばCMV、RSVおよびEBV由来のもの)が含まれる。
【0045】
いくつかの実施形態では、核酸は、キャリアまたは送達ベクターに作動可能に組み込まれることができる。有用な送達ベクターには、これらに限定されないが例えば、生分解性マイクロカプセル、免疫刺激複合体(ISCOM)またはリポソーム、および遺伝子改変された弱毒化生キャリア(例えばウイルスまたは細菌)が挙げられる。
【0046】
いくつかの実施形態において、ベクターはウイルスベクター(例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、鶏痘、AVポックス、改変ワクシニアアンカラ(MVA)および他の組換えウイルス)である。例えば、ワクシニアウイルスベクターを、樹状細胞を感染させるために使用することできる。
【0047】
医薬組成物
特定の態様において、本明細書に記載のAMHR2ポリペプチドおよび/または本明細書に記載のAMHR2ポリペプチドをコードする核酸を含む医薬組成物(例えば、ワクチン組成物)が提供される。いくつかの実施形態において、該組成物は医薬的に許容される担体を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に記載の複数(例えば2つ以上の)のAMHR2ポリペプチドまたは核酸の組み合わせを含む。
【0048】
本明細書中に記載される医薬組成物は、以下の投与に適するものを含む、固体または液体形態での投与のために特別に製剤化され得る:(1)経口投与、例えばドレンチ(水性または非水性の溶液または懸濁液)、錠剤(例えば、頬側、舌下、および全身性吸収の標的とされるもの)、ボーラス投与、粉末、顆粒、舌への投与のためのペースト;または(2)非経口投与(例えば皮下、筋肉内、静脈内、硬膜外注射による。例えば滅菌溶液もしくは懸濁液、または徐放性製剤として)。
【0049】
これらの製剤または組成物を調製する方法には、本明細書に記載のAMHR2ポリペプチドおよび/または核酸を、担体、および適宜1つまたは複数の補助成分と会合させる工程が含まれる。一般に、製剤は、本明細書に記載の薬剤を液体担体または細かく分割した固体担体、またはその両方と均一かつ密接に接触させ、次いで必要に応じて製品を成形することによって調製される。
【0050】
非経口投与に適した医薬組成物は、本明細書に記載のAMHR2ポリペプチドおよび/または核酸を、1つまたは複数の医薬的に許容される滅菌等張水溶液または非水溶液、分散液、懸濁液またはエマルションと組み合わせて含むか、または糖、アルコール、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、製剤を対象とするレシピエントの血液と等張にする溶質、懸濁化剤、または増粘剤を含有していてもよい、使用直前に滅菌注射用溶液または分散液に再構成され得る滅菌粉末剤と組み合わせて含む。
【0051】
医薬組成物に使用することができうる適切な水性および非水性担体の例には、水、エタノール、ポリオール(例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど)およびそれらの適切な混合物、植物油、例えばオリーブ油、およびオレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材の使用、分散液の場合には必要とされる粒子サイズの維持、および界面活性剤の使用によって維持することができる。
【0052】
選択された投与経路にかかわらず、本明細書に提供される薬剤(これは適切な水和形態で使用され得る)および/または本明細書に開示される医薬組成物は、医薬的に許容される剤形に、当該技術分野で知られる従来の方法によって製剤化される。
【0053】
いくつかの実施形態において、記載される医薬組成物は、対象に投与される場合、AMHR2を発現する細胞に対する免疫応答を誘発することができる。そのような医薬組成物は、卵巣癌の予防的および/または治療的処置のためのワクチン組成物として有用である。
【0054】
いくつかの実施形態において、該医薬組成物は生理学的に許容されるアジュバントをさらに含む。いくつかの実施形態において、使用されるアジュバントは、医薬組成物の免疫原性の増加をもたらす。アジュバントは、抗原の徐放を提供するものであり得るか(例えば、アジュバントはリポソームであり得る)、またはそれ自体が免疫原性であり、それによって抗原(すなわち、AMHR2ポリペプチド中に存在する抗原)と相乗的に機能するアジュバントであり得る。例えば、アジュバントは、既知のアジュバント、または抗原摂取を促進する、免疫系細胞を投与部位に動員する、または応答するリンパ細胞の免疫活性化を促進する、他の物質であり得る。アジュバントには、これらに限定されないが例えば、免疫調節分子(例えば、サイトカイン)、油および水エマルション、水酸化アルミニウム、グルカン、硫酸デキストラン、酸化鉄、アルギン酸ナトリウム、Bacto-アジュバント、合成ポリマー(例えばポリアミノ酸およびアミノ酸の共重合体)、サポニン、パラフィン油、およびムラミルジペプチドが挙げられる。いくつかの実施形態において、該アジュバントはアジュバント65、α-GalCer、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、リン酸カルシウム、β-グルカンペプチド、CpG DNA、GM-CSF、GPI-0100、IFA、IFN-γ、IL-17、リピドA、リポ多糖、リポバント(Lipovant)、モンタナイド(Montanide)、N-アセチル-ムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミン、Pam3CSK4、クイルA(quil A)、トレハロースジミコレートまたはザイモサンである。いくつかの実施形態において、アジュバントは1型/17型混合型免疫応答を誘導するものである。
【0055】
いくつかの実施形態において、アジュバントは免疫調節分子である。例えば、免疫調節分子は、組換えタンパク質サイトカイン、ケモカイン、または免疫刺激剤、またはサイトカイン、ケモカイン、または免疫応答を増強するように設計された免疫刺激剤をコードする核酸であり得る。
【0056】
免疫調節性サイトカインの例として、インターフェロン(例えば、IFNα、IFNβおよびIFNγ)、インターロイキン(例えば、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-17およびIL-20)、腫瘍壊死因子(例えば、TNFαおよびTNFβ)、エリスロポエチン(EPO)、FLT-3リガンド、gIp10、TCA-3、MCP-1、MIF、MIP-1α、MIP-1β、ランテス、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、ならびに上記いずれかの機能性フラグメントが挙げられる。
【0057】
いくつかの実施形態において、ケモカイン受容体、すなわち、CXC、CC、C、またはCX3Cケモカイン受容体に結合する免疫調節性ケモカインもまた、本明細書で提供される組成物に含めることができる。ケモカインの例には、これらに限定されないが例えば、Mip1α、Mip-1β、Mip-3α(Larc)、Mip-3β、ランテス、Hcc-1、Mpif-1、Mpif-2、Mcp-1、Mcp-2、Mcp-3、Mcp-4、Mcp-5、Eotaxin、Tarc、Elc、I309、IL-8、Gcp-2 Gro-α、Gro-β、Gro-γ、Nap-2、Ena-78、Gcp-2、Ip-10、Mig、I-Tac、Sdf-1、およびBca-1(Blc)、ならびに上記いずれかの機能性フラグメントが挙げられる。
【0058】
特定の実施形態において、本明細書で提供される組成物はまた、または1つ以上の他の薬剤(例えばこれらに限定されないが化学療法剤、免疫療法剤、免疫調節性および/または抗血管新生薬)を含む。
【0059】
いくつかの実施形態において、該1つ以上の薬剤は化学療法剤であることができ、例えば”Cancer Chemotherapeutic Agents”, American Chemical Society, 1995, W. O. Foye Edに記載のような、天然または合成のものであることができる。
【0060】
1つの実施形態において、該化学療法剤は小分子受容体アンタゴニスト(例えばバタラニブ、SU 11248またはAZD-6474)、EGFRまたはHER2アンタゴニスト(例えばゲフィチニブ、エルロチニブ、CI-1033またはハーセプチン)、抗体(例えばベバシズマブ、セツキシマブ、リツキシマブ)、DNAアルキル化剤(例えばシスプラチン、オキサリプラチンまたはカルボプラチン)、アントラサイクリン(例えばドキソルビシンまたはエピルビシン)、代謝拮抗剤(例えば5-FU、ペメトレキセド、ゲムシタビンまたはカペシタビン)、カンプトテシン(例えばイリノテカンまたはトポテカン、抗癌剤(例えばパクリタキセルまたはドセタキセル)、エピポドフィロトキシン(例えばエトポシドまたはテニポシド)、プロテアソーム阻害剤(例えばボルテゾミブまたは抗炎症薬(例えばセレコキシブまたはロフェコキシブ)からなる群から選択され、これらは適宜該医薬的に許容される塩の形態、該水和物および/または溶媒和物の形態であってもよく、適宜、その個々の光学異性体の形態であっても、個々のエナンチオマーまたはラセミ体の混合物であっても良い。
【0061】
別の実施形態において、該化学療法剤は、小分子VEGF受容体アンタゴニスト(例えばバタラニブ(PTK-787/ZK222584)、SU-5416、SU-6668、SU-11248、SU-14813、AZD-6474、AZD-2171、CP-547632、CEP-7055、AG-013736、IM-842またはGW-786034)、二重EGFR/HER2アンタゴニスト(例えばゲフィチニブ、エルロチニブ、CI-1033またはGW-2016)、EGFRアンタゴニスト(例えばイレッサ(ZD-1839)、タルセバ(OSI-774)、PKI-166、EKB-569、HKI-272またはハーセプチン)、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼのアンタゴニスト(例えばBAY-43-9006またはBAY-57-9006)、キナゾリン誘導体(例えば4-[(3-クロロ-4-フルオロフェニルアミノ]-6-{[4-(N,N-ジメチルアミノ)-1-オキソ-2-ブテン-1-イル]アミノ}-7-((S)-テトラヒドロフラン-3-イルオキシ)キナゾリン(4-[(3-chloro-4-fluorophenypamino]-6-{[4-(N,N-dimethylamino)-1-oxo-2-bute-- n-1-yl]amino}-7-((S)-tetrahydrofuran-3-yloxy)quinazoline)または4-[(3-クロロ-4-フルオロ-フェニル)アミノ]-6-{[4-(ホモモルホリン-4-イル)-1-オキソ-2-ブテン-1-イル]アミノ}-7-[(S)-(テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ]-キナゾリン(4-[(3-chloro-4-fluoro-phenyl)amino]-6-{[4-(homomorpholin-4-yl)-1-oxo-2-bu- -ten-1-yl]amino}-7-[(S)-(tetrahydrofuran-3-yl)oxy]-quinazoline)、または医薬的に許容されるそれらの塩)、合成的小分子下に分類されないタンパク質キナーゼ受容体アンタゴニスト(例えばアトラセンタン、リツキシマブ、セツキシマブ、アバスチン.TM.(ベバシズマブ)、IMC-1C11、アービタックス(C-225)、DC-101、EMD-72000、ビタキシン(vitaxin)、イマチニブ)、融合タンパク質であるタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤(例えばVEGFtrap)、アルキル化剤または白金化合物 例えばメルファラン、シクロホスファミド、オキサザホスホリン、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、テトラプラチン、イプロプラチン、マイトマイシン、ストレプトゾシン、カルムスチン(BCNU)、ロムスチン(CCNU)、ブスルファン、イホスファミド、ストレプトゾシン、チオテパ、クロラムブシル、ナイトロジェンマスタード(例えばメクロレタミン)、エチレンイミン化合物、アルキルスルホネート、ダウノルビシン、ドキソルビシン(adriamycin)、リポソームのドキソルビシン(doxil)、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、アムサクリン、ダクチノマイシン、ディスタマイシンまたはその誘導体、ネトロプシン、ピベンジモル、マイトマイシン、CC-1065、デュオカルマイシン、ミスラマイシン、クロモマイシン、オリボマイシン、フタラニリド(phtalanilide)(例えばプロパミジンまたはスチルバミジン)、アントラマイシン、アジリジン、ニトロソウレアまたはその誘導体、ピリミジンまたはプリンアナログまたはヌクレオシドジホスフェートレダクターゼのアンタゴニストまたは阻害剤(例えばシタラビン、5-フルオロウラシル(5-FU)、ペメトレキセド、テガフール/ウラシル、ウラシルマスタード、フルダラビン、ゲムシタビン、カペシタビン、メルカプトプリン、クラドリビン、チオグアニン、メトトレキサート、ペントスタチン、ヒドロキシ尿素、または葉酸)、フレオマイシン、ブレオマイシンまたはその誘導体または塩、CHPP、BZPP、MTPP、BAPP、リブロマイシン(liblomycin)、アクリジンまたはその誘導体、リファマイシン、アクチノマイシン、アドラマイシン(adramycin)、カンプトテシン(例えばイリノテカン(camptosar)またはトポテカン)、アムサクリンまたはそのアナログ、三環系カルボキサミド、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤(例えばSAHA、MD-275、トリコスタチンA、CBHA、LAQ824、またはバルプロ酸)、植物由来の抗癌剤(例えばパクリタキセル(taxol)、ドセタキセルまたはタキソテール)、ビンカアルカロイド(例えばナベルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンまたはビノレルビン)、トロポロンアルカロイド(例えばコルヒチンまたはその誘導体)、マクロライド(例えばマイタンシン、アンサミトシン(ansamitocin)またはリゾキシン(rhizoxin))、抗有糸分裂性ペプチド(例えばフォモプシン(phomopsin)またはドラスタチン)、エピポドフィロトキシンまたはポドフィロトキシンの誘導体(例えばエトポシドまたはテニポシド)、ステガナシン(steganacin)、抗有糸分裂性カルバメート誘導体(例えばコンブレタスタチンまたはアンフェチニル(amphetinile))、プロカルバジン、プロテアソーム阻害剤(例えばボルテゾミブ)、酵素(例えばアスパラギナーゼ、ペグ化アスパラギナーゼ(pegaspargase))またはチミジン-ホスホリラーゼ阻害剤、ゲスターゲンまたはエストロゲン(例えばエストラムスチン(T-66)またはメゲストロール)、抗アンドロゲン(例えばフルタミド、カソデックス、アナンドロン(anandron)またはシプロテロン酢酸エステル)、アロマターゼ阻害剤(例えばアミノグルテチミド(gluthetimide)、アナストロゾール、ホルメスタンまたはレトロゾール)、GNrHアナログ(例えばリュープロレリン、ブセレリン、ゴセレリンまたはトリプトレリン)、抗エストロゲン(例えばタモキシフェンまたはそのクエン酸塩、ドロキシフェン(droloxifene)、トリオキシフェン(trioxifene)、ラロキシフェンまたはジンドロキシフェン(zindoxifene))、17β-エストラジオールの誘導体(例えばICI 164,384またはICI 182,780)、アミノグルテチミド、ホルメスタン、ファドロゾール、フィナステリド、ケトコナゾール、LH-RHアンタゴニスト(例えばリュープロリド)、ステロイド(例えばプレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ブデノシド(budenoside)、フルオコルトロンまたはトリアムシノロン)、インターフェロン(例えばインターフェロンβ)、インターロイキン(例えばIL-10またはIL-12)、抗TNFα抗体(例えばエタネルセプト)、免疫調節薬(例えばサリドマイド、そのR-およびS-エナンチオマーおよびその誘導体、またはレビニド(revimid)(CC-5013))、ロイコトリエンアンタゴニスト、マイトマイシンC、アジリドキノン(aziridoquinone)(例えばBMY-42355、AZQまたはEO-9)、2-ニトロイミダゾール(例えばミソニダゾール、NLP-1またはNLA-1)、ニトロアクリジン、ニトロキノリン、ニトロピラゾロアクリジン、「二重機能」ニトロ芳香族化合物(例えばRSU-1069またはRB-6145)、CB-1954、ナイトロジェンマスタードのN-オキシド(例えばナイトロミン)、ナイトロジェンマスタードの金属錯体、抗CD3または抗CD25抗体、耐性誘導剤、ビホスホネートまたはその誘導体(例えばミノドロン酸またはその誘導体(YM-529、Ono-5920、YH-529)、ゾレドロン酸一水和物、イバンドロン酸ナトリウム水和物 またはクロドロン酸二ナトリウム)、ニトロイミダゾール(例えばメトロニダゾール、ミソニダゾール、ベンズニダゾールまたはニモラゾール)、ニトロアリール化合物(例えばRSU-1069)、ニトロキシルまたはN-オキシド(例えばSR-4233)、ハロゲン化ピリミジンアナログ(例えばブロモデオキシウリジン、ヨードデオキシウリジン)、チオホスフェート(例えばWR-272 1)、光化学的活性化薬剤(例えばポルフィマー、フォトフリン、ベンゾポルフィリン誘導体、フェオホルビド(pheophorbide)誘導体、メロシアニン540(MC-540)またはスズエチオポルプリン(tin etioporpurin))、ant-テンプレートまたはアンチセンスRNAまたはDNA(例えばオブリメルセン)、非ステロイド性炎症性薬(例えばアセチルサリチル酸(acetylsalicyclic acid)、メサラジン、イブプロフェン、ナプロキセン、フルルビプロフェン、フェノプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、インドプロフェン、ピルプロフェン、カプロフェン、オキサプロジン、プラノプロフェン、ミロプロフェン、チオキサプロフェン、スプロフェン、アルミノプロフェン、チアプロフェン酸、フルプロフェン、インドメタシン、スリンダク、トルメチン、ゾメピラック、ナブメトン、ジクロフェナク、フェンクロフェナク、アルクロフェナク、ブロムフェナク、イブフェナク、アセクロフェナク、アセメタシン、フェンチアザク、クリダナク、エトドラク、オキシピナク(oxpinac)、メフェナム酸、メクロフェナム酸、フルフェナム酸、ニフルミニク酸(nifluminic acid)、トルフェナム酸、ジフルニサル、フルフェニサール、ピロキシカム、テノキシカム、ロモキシカム(lomoxicam)、ニメスリド、メロキシカム、セレコキシブ、ロフェコキシブ、または非ステロイド性炎症性薬の医薬的に許容される塩)、細胞障害性抗菌薬、ガン細胞の表面分子を標的にする抗体(例えばアポリズマブまたは1D09C3)、メタロプロテイナーゼの阻害剤(例えばTIMP-1またはTIMP-2)、亜鉛、癌遺伝子の阻害剤(例えばP53およびRb)、希土類元素の複合物(例えばランタニドの複素環複合物)、光化学療法剤(例えばPUVA)、転写因子複合体ESX/DRIP130/Sur-2の阻害剤、HER-2発現の阻害剤、(例えば該ヒートショックタンパク質HSP90修飾薬ゲルダナマイシンおよびその誘導体17-アリルアミノゲルダナマイシンまたは17-AAG)、またはIM-842、テトラチオモリブデート、スクアラミン、コンブレスタチン(combrestatin)A4、TNP-470、マリマスタット、ネオバスタット(neovastat)、ビカルタミド、アバレリックス、オレゴボマブ、ミツモマブ(mitumomab)、TLK-286、アレムツズマブ、イブリツモマブ、テモゾロミド、デニロイキンジフチトクス、アルデスロイキン、ダカルバジン、フロクスウリジン、プリカマイシン、ミトタン、ピポブロマン、プリカマイシン、タモキシフェンおよびテストラクトンから選択される治療薬からなる群から選択される。好ましい化合物として、小分子VEGF受容体アンタゴニスト(例えばバタラニブ(PTK-787/ZK222584)、SU-5416、SU-6668、SU-11248、SU-14813、AZD-6474)、EGFR/HER2アンタゴニスト(例えばCI-1033またはGW-2016)、EGFRアンタゴニスト(例えばイレッサ(ゲフィチニブ、ZD-1839)、タルセバ(エルロチニブ、OSI-774)、PKI-166、EKB-569、HKI-272またはハーセプチン)、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼのアンタゴニスト(例えばBAY-43-9006またはBAY-57-9006)、アトラセンタン、リツキシマブ、セツキシマブ、Avastin.TM.(ベバシズマブ)、IMC-1C11、アービタックス(C-225)、DC-101、EMD-72000、ビタキシン(vitaxin)、イマチニブ、アルキル化剤または白金化合物 例えばメルファラン、シクロホスファミド、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン(adriamycin)、リポソームのドキソルビシン(doxil)、エピルビシン、イダルビシン、ピリミジンまたはプリン
アナログまたはヌクレオシドジホスフェートレダクターゼのアンタゴニストまたは阻害剤(例えばシタラビン、5-フルオロウラシル(5-FU)、ペメトレキセド、テガフール/ウラシル、ゲムシタビン、カペシタビン、メルカプトプリン、メトトレキサート)、抗癌剤(例えばパクリタキセル(taxol)またはドセタキセル)、ビンカアルカロイド(例えばナベルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンまたはビノレルビン)、抗有糸分裂性ペプチド(例えばドラスタチン)、エピポドフィロトキシンまたはポドフィロトキシンの誘導体(例えばエトポシドまたはテニポシド)、非ステロイド性炎症性薬(例えばメロキシカム、セレコキシブ、ロフェコキシブ)、ガン細胞の表面分子を標的にする抗体(例えばアポリズマブまたはID09C3)、またはヒートショックタンパク質HSP90修飾薬ゲルダナマイシンおよびその誘導体17-アリルアミノゲルダナマイシンまたは17-AAGが挙げられる。
【0062】
別の実施形態において、化学療法剤はチューブリンと相互作用または結合する化合物、合成的小分子VEGF受容体アンタゴニスト、小分子増殖因子受容体アンタゴニスト、EGF受容体および/またはVEGF受容体および/またはインテグリン受容体または他のタンパク質チロシンキナーゼ受容体の合成的小分子の下に分類されない阻害剤、EGF受容体および/またはVEGF受容体および/またはインテグリン受容体または他のタンパク質チロシンキナーゼ受容体を対象とする阻害剤である融合タンパク質、核酸と相互作用し、アルキル化剤または白金化合物として分類される化合物、核酸と相互作用し、アントラサイクリン、DNA干渉物質、またはDNA架橋剤(DNA副溝結合化合物を含む)として分類される化合物、代謝拮抗薬、天然、半合成的または合成的ブレオマイシン型抗生物質、DNA転写酵素の阻害剤、および特にトポイソメラーゼIまたはトポイソメラーゼII阻害剤、クロマチン変性剤、有糸分裂阻害剤、有糸分裂阻害薬、細胞周期阻害剤、プロテアソーム阻害剤、酵素、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、ホルモン阻害剤、ステロイド生合性の阻害剤、ステロイド、サイトカイン、低酸素-選択的細胞毒、サイトカインの阻害剤、リンホカイン、サイトカインに対する抗体、経口および非経口耐性誘導剤、支持的薬物(supportive agent)、化学的放射線増感剤およびプロテクター、光化学的活性化薬剤、合成的ポリ-またはオリゴヌクレオチド(適宜改変またはコンジュゲートしている)、非ステロイド性抗炎症、細胞障害性抗菌薬、ガン細胞の表面分子を標的にする抗体、増殖因子またはそれらの受容体を標的にする抗体、メタロプロテイナーゼの阻害剤、金属、癌遺伝子の阻害剤、遺伝子転写またはRNA翻訳またはタンパク質発現の阻害剤、希土類元素の複合物、および光化学療法剤からなる群から選択される。
【0063】
他の実施形態において、化学療法剤は、パクリタキセル(taxol)、ドセタキセル、ビンカアルカロイド(例えばナベルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンまたはビノレルビン)、アルキル化剤または白金化合物 例えばメルファラン、シクロホスファミド、オキサザホスホリン、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、テトラプラチン、イプロプラチン、マイトマイシン、ストレプトゾシン、カルムスチン(BCNU)、ロムスチン(CCNU)、ブスルファン、イホスファミド、ストレプトゾシン、チオテパ、クロラムブシル、ナイトロジェンマスタード(例えばメクロレタミン)、免疫調節薬(例えばサリドマイド、そのR-およびS-エナンチオマーおよびその誘導体)、またはレビニド(revimid)(CC-5013))、エチレンイミン化合物、アルキルスルホネート、ダウノルビシン、ドキソルビシン(adriamycin)、リポソームのドキソルビシン(doxil)、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、アムサクリン、ダクチノマイシン、ディスタマイシンまたはその誘導体、ネトロプシン、ピベンジモル、マイトマイシン、CC-1065、デュオカルマイシン、ミスラマイシン、クロモマイシン、オリボマイシン、フタラニリド(phtalanilide)(例えば プロパミジンまたはスチルバミジン)、アントラマイシン、アジリジン、ニトロソウレアまたはその誘導体、ピリミジンまたはプリンアナログまたはヌクレオシドジホスフェートレダクターゼのアンタゴニストまたは阻害剤(例えばシタラビン、5-フルオロウラシル(5-FU)、ウラシルマスタード、フルダラビン、ゲムシタビン、カペシタビン、メルカプトプリン、クラドリビン、チオグアニン、メトトレキサート、ペントスタチン、ヒドロキシ尿素、または葉酸)、アクリジンまたはその誘導体、リファマイシン、アクチノマイシン、アドラマイシン(adramycin)、カンプトテシン(例えばイリノテカン(camptosar)またはトポテカン)、アムサクリンまたはそのアナログ、三環系カルボキサミド、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤(例えばSAHA、MD-275、トリコスタチンA、CBHA、LAQ824、またはバルプロ酸)、プロテアソーム阻害剤(例えばボルテゾミブ)、小分子VEGF受容体アンタゴニスト(例えばバタラニブ(PTK-787/ZK222584)、SU-5416、SU-6668、SU-11248、SU-14813、AZD-6474、AZD-2171、CP-547632、CEP-7055、AG-013736、IM-842またはGW-786034)、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼのアンタゴニスト(例えばBAY-43-9006またはBAY-57-9006)、二重EGFR/HER2アンタゴニスト(例えばゲフィチニブ、エルロチニブ、CI-1033またはGW-2016)、EGFRアンタゴニスト(例えばイレッサ(ZD-1839)、タルセバ(OSI-774)、PKI-166、EKB-569、HKI-272またはハーセプチン)、キナゾリン誘導体(例えば4-[(3-クロロ-4-フルオロフェニル)アミノ]-6-{[-4-(N,N-ジメチルアミノ)-1-オキソ-2-ブテン-1-イル]アミノ}-7-((S)-テトラヒドロフラン-3-イルオキシ)-キナゾリン(4-[(3-chloro-4-fluorophenyl)amino]-6-{[-4-(N,N-dimethylamino)-1-oxo-2-but- -en-1-yl]amino}-7-((S)-tetrahydrofuran-3-yloxy)-quinazoline)または4-[(3-クロロ-4-フルオロ-フェニル)アミノ]-6-{[4-(ホモモルホリン-4-イル)-1-オキソ-2-ブテン-1-イル]アミノ}-7-[(S)-(テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ]-キナゾリン(4-[(3-chloro-4-fluoro-phenyl)amino]-6-{[4-(homomorpholin-4-yl)-1-oxo-2-bu- -ten-1-yl]amino}-7-[(S)-(tetrahydrofuran-3-yl)oxy]-quinazoline)、またはそれらの医薬的に許容される塩、転写因子複合体ESX/DRIP130/Sur-2の阻害剤、HER-2発現の阻害剤、例えばヒートショックタンパク質HSP90修飾薬ゲルダナマイシンおよびその誘導体17-アリルアミノゲルダナマイシンまたは17-AAG、合成的小分子の下に分類されないタンパク質キナーゼ受容体アンタゴニスト 例えばアトラセンタン、リツキシマブ、セツキシマブ、Avastin.TM.(ベバシズマブ)、IMC-1C11、アービタックス(C-225)、DC-101、EMD-72000、ビタキシン(vitaxin)、イマチニブ、およびガン細胞の表面分子を標的にする抗体(例えばアポリズマブまたは1D09C3)からなる群から選択される。
【0064】
いくつかの実施形態において、抗癌剤は免疫チェックポイント阻害剤である。いくつかの実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤はCTLA4の阻害剤(例えば抗CTLA4抗体(例えば、イピリムマブ(BMS)、トレメリムマブ(AstraZeneca)および/またはKAHR-102(Kahr Medical))))である。いくつかの実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤はPD-1の阻害剤(例えば抗PD-1抗体(例えば、ニボルマブ(BMS)、ペンブロリズマブ/ランブロリズマブ(Merck)、ピディリズマブ(Curetech)、AMP-224(GSK)、AMP-514(AstraZeneca)、STI-A1110(Sorrento)および/またはTSR-042(Tesaro))である。いくつかの実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤はPD-L1および/またはPD-L2の阻害剤(例えば抗PD-L1および/または抗PD-L2抗体(例えば、RG-7446(Roche)、BMS-936559(BMS)、MEDI-4736(AstraZeneca)、MSB-0020718C(Merck)、AUR-012(Pierre Fabre Med)、STI-A1010(Sorrento)))である。
【0065】
いくつかの実施形態において、該組成物は本明細書に記載のAMHR2ポリペプチドをコードする核酸(例えばAMHR2ポリペプチドをコードするDNA分子)を含む。いくつかの実施形態において該組成物は、AMHR2ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む発現ベクターを含む。
【0066】
細胞(例えば、筋肉細胞、抗原提示細胞(APC)(例えば樹状細胞、マクロファージ、etc.))によってって取り込まれると、DNA分子は染色体外分子として細胞内に存在することができ、かつ/または、染色体に組み込むことができる。DNAは、別の遺伝物質として残ることができるプラスミドの形態で細胞に導入することができる。あるいは、染色体に組み込むことができる直鎖状DNAを細胞に導入することができる。DNAを細胞に導入する場合、適宜、DNAと染色体との統合を促進する試薬を添加することができる。
【0067】
治療法
特定の態様において、卵巣癌を治療または予防する方法、および/または卵巣癌腫瘍またはAMHR2に対する免疫応答を誘導する方法が本明細書で提供される。特定の実施形態では、本方法は、本明細書に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、卵巣癌腫瘍は原発性腫瘍である。いくつかの実施形態では、該卵巣癌腫瘍は転移性腫瘍である。いくつかの実施形態では、該卵巣癌腫瘍は、卵巣上皮癌(EOC)腫瘍である。いくつかの実施形態では、該卵巣癌腫瘍はAMHR2を発現する。
【0068】
本明細書に記載の方法を使用して、その必要がある対象を治療することができる。本明細書中で使用される場合、「その必要がある対象」は、卵巣癌を有している、卵巣癌を有していた、および/または卵巣癌の素因を有する対象を含む。例えば、いくつかの実施形態において、対象は、卵巣癌腫瘍(例えば、AMHR2を発現する卵巣癌腫瘍)を有する。いくつかの実施形態では、対象は、卵巣癌腫瘍の少なくとも一部を除去するための手術を受けたことがある。いくつかの実施形態において、対象は、ゲノム中に対象を卵巣癌になりやすくするBRCA1またはBRCA2変異を有しているため、卵巣癌になりやすい素因を持っている。いくつかの実施形態において、対象は、卵巣癌の家族歴を有する。
【0069】
本明細書に開示される医薬組成物は、経口および非経口を含む、任意の適切な投与経路によって送達され得る。特定の実施形態では、医薬組成物は、一般的な方法で(例えば、経口または非経口投与によって)送達される。
【0070】
対象薬剤の用量は、薬剤の血漿濃度を参照して決定され得る。例えば、最大血漿濃度(Cmax)および時間0から無限大までの血漿濃度-時間曲線下面積(AUC(0-4))を用いることができる。用量には、CmaxおよびAUC(0-4)の上記の値を生じるもの、およびこれらのパラメーターのより大きいまたはより小さい値をもたらす他の用量が含まれる。
【0071】
該医薬組成物における有効成分の実際の投与量レベルは、患者への毒性無く、特定の患者、組成および投与様式に対して所望の治療応答を達成するのに有効な量の有効成分を与えるように変化させうる。
【0072】
選択された投与量レベルは、使用される特定の薬剤の活性、投与経路、投与時間、使用される特定の化合物の排泄または代謝速度、治療期間、使用される特定の化合物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物、および/または物質、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全般的な健康状態および以前の病歴、ならびに医学分野において周知の同様の要因のような、さまざまな要因に依存する。
【0073】
当該技術分野の通常のスキルを有する医師または獣医師は、必要とされる医薬組成物の有効量を容易に決定および処方することができる。例えば、医師または獣医師は、所望の治療効果を達成するために必要なレベルより低いレベルで医薬組成物に用いられる薬剤の用量を処方および/または投与し、所望の効果が達成されるまで徐々に用量を増加させることができるであろう。
【0074】
一般に、本明細書に記載の薬剤の適切な1日用量は、治療効果を生じるのに有効な最低用量である薬剤の量であろう。そのような有効用量は、一般に上記の因子に依存する。
【0075】
一態様では、AMHR2を発現する細胞(例えば、卵巣癌腫瘍細胞)に対する免疫応答を対象において誘発する方法が本明細書で提供される。本方法は、本明細書に記載の医薬組成物を対象に投与することを含み、該医薬的に許容される組成物は、対象に投与されるとき、AMHR2を発現する細胞に対する免疫応答を誘発する。
【0076】
一般に、該免疫応答は、体液性免疫応答、細胞性免疫応答、またはその両方を含み得る。
【0077】
体液性応答は、該医薬組成物を投与された対象由来の血清試料中の抗体レベルについての標準的なイムノアッセイによって測定することができる。細胞性免疫応答は、T細胞を伴う応答であり、インビトロまたはインビボで測定することができる。例えば、一般的な細胞性免疫応答は、医薬的に許容される組成物の投与後適切な時間に対象から採取された細胞(例えば、末梢血白血球(PBL))におけるT細胞増殖活性として測定されることができる。例えばPBMCを適切な期間、刺激因子と共にインキュベートした後、[H]チミジン取り込みを測定することができる。増殖しているT細胞のサブセットは、フローサイトメトリーを用いて測定することができる。
【0078】
特定の態様では、本明細書で提供される方法は、ヒトおよび非ヒト哺乳類の両方に投与することを含む。獣医学的用途も考えられる。いくつかの実施形態では、対象は、免疫応答が誘発され得る任意の生きたメス生物であり得る。対象の例としては、ヒト、家畜、イヌ、ネコ、マウス、ラット、およびそれらのトランスジェニック種が挙げられるが、これらに限定されない。
【0079】
特定の実施形態において、対象は、卵巣癌の病歴を有し、別の治療様式を投与されたことがある。該別の治療は、例えば、外科的切除、放射線療法、化学療法、および免疫療法の他の様式であって、当該他の療法の結果として対象が臨床的に測定可能な腫瘍を示さないものを含み得る。しかしながら、対象は、元の腫瘍部位の近くに、または転移によって、癌の再発または進行のリスクがあると決定されたものであることができる。そのような対象は、高リスクおよび低リスクの対象としてさらに分類することができる。細分化は、最初の治療の前後に観察される特徴に基づいて行うことができる。これらの特徴は、臨床分野において知られており、異なる癌ごとに適宜定義される。高リスクサブグループの典型的な特徴は、腫瘍が隣接組織に浸潤したか、またはリンパ節の関与を示すものである。従って、例えば、本明細書に記載の医薬組成物は、主に再発に対する予防措置として抗癌応答を誘発するために対象に投与することができる。
【0080】
いくつかの実施形態では、該医薬組成物は、適切な任意の時間に投与することができる。例えば、投与は、卵巣癌腫瘍を有する対象の従来の治療の前またはその間に実施することができ、腫瘍が臨床的に検出不能になった後も継続されることができる。投与はまた、再発の徴候を示す対象においても継続することができる。
【0081】
いくつかの実施形態では、該医薬組成物は、治療上または予防上有効な量で投与されることができる。対象への該医薬組成物の投与は、既知の手順を用いて、所望の効果を達成するのに十分な用量および期間で行うことができる。
【0082】
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、任意の適切な部位、例えば、原発性腫瘍に対して遠位または近位である部位で、対象に投与されることができる。投与経路は、治療されている腫瘍性疾患およびを患者の状態を考慮して、非経口、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内、鼻腔内、静脈内(留置カテーテルを含む)、求心性リンパ管を介して、または適切な他の経路によるものであることができる。好ましくは、用量は、所望の応答(腫瘍性疾患および/またはそれに関連する症状の免疫応答または予防的もしくは治療的処置を誘発する)をもたらすのに有効な量および時間で投与される。
【0083】
医薬的に許容される組成物は、対象において免疫応答を誘発する療法を含む他の療法に続いて、前に、または同時に投与することができる。例えば、対象は、化学療法、放射線療法、および他の免疫療法の製剤、好ましくは、本明細書に記載の組成物の免疫原性を妨げないような方法で提供される他の療法によって、その前にまたは同時に治療されてもよい。
【0084】
投与は、ケア提供者(例えば、医師、獣医師)によって適切にタイミングをとられることができ、対象の臨床状態、投与の目的、および/または考慮または投与されている他の療法に依存しうる。いくつかの実施形態では、初期量を投与し、対象は免疫学的および/または臨床的応答についてモニタリングされることができる。免疫学的モニタリングの適切な手段には、応答者としての患者の末梢血リンパ球(PBL)および刺激因子としての腫瘍性細胞を用いることが含まれる。免疫学的反応はまた、投与部位での炎症応答の遅延によっても測定され得る。所望の効果が達成されるまで、典型的には、月に1回、2回、または好ましくは1週間に1回、初期投与量に続く1回または複数回の投与量を適宜与えることができる。その後、必要に応じて、特に免疫学的または臨床的利益が低下しているように見える場合に、さらなるブースターまたは維持用量を与えることができる。
【0085】
細胞療法
特定の態様では、本明細書に記載のAMHR2ポリペプチドまたは当該AMHR2ポリペプチドをコードする核酸は、AMHR2で刺激された抗原提示細胞および/またはこれらの抗原提示細胞で産生されたAMHR2特異的リンパ球を提供するための組成物および方法において使用されることができる。いくつかの実施形態において、このような抗原提示細胞および/またはリンパ球は、卵巣癌の治療または予防に使用される。
【0086】
いくつかの態様では、抗原提示細胞を本明細書に記載のAMHR2ポリペプチドまたは少なくとも1つのAMHR2ポリペプチドをコードする核酸と、少なくとも1つのAMHR2ポリペプチドが抗原提示細胞によって提示されるのに十分な条件下、インビトロで接触させることによる、AMHR2で刺激された抗原提示細胞を作製するための方法が提供される。
【0087】
いくつかの実施形態において、AMHR2ポリペプチド、またはAMHR2ポリペプチドをコードする核酸は、抗原提示細胞を含む同種な、実質的に同種な、または異種の組成物と接触させることができる。例えば、該組成物には、これらに限定されないが、全血、新鮮血、またはその画分、例えばこれらに限定されないが、末梢血単核細胞、全血のバフィーコート画分、濃厚赤血球、放射線照射血液、樹状細胞、単球、マクロファージ、好中球、リンパ球、ナチュラルキラー細胞、およびナチュラルキラーT細胞が含まれる。任意に抗原提示細胞の前駆体が使用される場合、該前駆体を抗原提示細胞に分化させるのに十分な適切な培養条件下で前駆体を培養されることができる。いくつかの実施形態では、抗原提示細胞(またはその前駆体)は、単球、マクロファージ、骨髄系細胞系の細胞、B細胞、樹状細胞、またはランゲルハンス細胞から選択される。
【0088】
抗原提示細胞と接触して配置されるAMHR2ポリペプチドまたはAMHR2ポリペプチドをコードする核酸の量は、通常の実験によって当業者によって決定されることができる。一般に、抗原提示細胞は、細胞がT細胞の調節のための抗原のプロセシングされた形態を提示するのに十分な時間、AMHR2ポリペプチドまたはAMHR2ポリペプチドをコードする核酸と接触される。一実施形態では、抗原提示細胞を、AMHR2ポリペプチドまたはAMHR2ポリペプチドをコードする核酸の存在下、約1週間未満、例示的には1分~約48時間、約2分~約36時間、約3分~約24時間、約4分~約12時間、約6分~約8時間、約8分~約6時間、約10分~約5時間、約15分~約4時間、約20分~約3時間、約30分~約2時間、および約40分~約1時間インキュベートする。抗原提示細胞が抗原を処理して提示するのに必要な時間およびAMHR2ポリペプチドまたはAMHR2ポリペプチドをコードする核酸の量は、例えば、パルスチェイス法を用いて決定することができる。ここでは接触後にウォッシュアウト時間と読み取りシステム、例えば、抗原反応性T細胞への曝露が続く。
【0089】
特定の実施形態では、抗原提示細胞の内在性プロセシング経路に抗原を送達するための任意の適切な方法を使用することができる。そのような方法には、これらに限定されないが、pH感受性リポソーム、アジュバントへの抗原のカップリング、アポトーシス性細胞送達、樹状細胞上への細胞のパルスシング、抗原を含む組換えキメラウイルス様粒子(VLP)の樹状細胞株のMHCクラスIプロセッシングの経路への送達を伴う方法が挙げられる。
【0090】
一実施形態では、可溶化AMHR2ポリペプチドが、抗原提示細胞とインキュベートされる。いくつかの実施形態において、AMHR2ポリペプチドは、MHCクラスI経路への送達のための抗原提示細胞のサイトゾルへの抗原の移動を増強するために細胞溶解素に結合され得る。細胞溶解素の例には、サポニン化合物(例えばサポニン含有免疫刺激複合体(ISCOM5))、孔形成毒素(例えばα-毒素)、およびグラム陽性菌の天然細胞溶解素(例えばリステリオリジンO(LLO)、ストレプトリジンO(SLO)、およびパーフリンゴリジンO(PFO)が挙げられる。
【0091】
いくつかの実施形態において、AMHR2ポリペプチドをコードする核酸を抗原提示細胞に導入するために、抗原提示細胞(例えば樹状細胞およびマクロファージ)は当技術分野で公知の方法に従って単離されて、当技術分野で公知の方法によってポリヌクレオチドによりトランスフェクトされることができる。トランスフェクション試薬および方法は、当該分野で公知であり、市販されている。例えば、AMHR2ポリペプチドをコードするRNAを、適切な培地中に提供し、抗原提示細胞と接触させる前に脂質(例えば、カチオン性脂質)と組み合わせられることができる。そのような脂質の非限定的な例としては、LIPOFECTINTMおよびLIPOFECTAMINETMが挙げられる。次いで、得られたポリヌクレオチド-脂質複合体を抗原提示細胞と接触させることができる。あるいは、エレクトロポレーションまたはリン酸カルシウムトランスフェクションのような技術を用いて、ポリヌクレオチドを抗原提示細胞に導入することができる。次いで、ポリヌクレオチド積載抗原提示細胞を使用して、インビボまたはエクスビボでのTリンパ球(例えば、細胞傷害性Tリンパ球)増殖を刺激することができる。1つの実施形態において、エクスビボで増大されたTリンパ球は、養子免疫療法の方法で対象に投与される。
【0092】
特定の態様において、AMHR2エピトープが抗原提示細胞によって提示されるのに十分な条件下で、インビトロでAMHR2ポリペプチドまたはAMHR2ポリペプチドをコードする核酸と接触された抗原提示細胞を含む組成物が本明細書に提供される。
【0093】
いくつかの態様では、AMHR2に特異的なリンパ球を調製するための方法が提供される。この方法は、AMHR2を発現する細胞に対して免疫応答を誘発することができるAMHR2特異的リンパ球を産生するのに十分な条件下で、リンパ球を上述の抗原提示細胞と接触させることを含む。したがって、抗原提示細胞はまた、AMHR2を発現する細胞に対する免疫応答を誘発するためのリンパ球(Tリンパ球およびBリンパ球を含む)を提供するために使用され得る。
【0094】
いくつかの実施形態では、抗原提示細胞によって提示されるAMHR2エピトープにTリンパ球をプライミングするために、Tリンパ球の調製物を上記の抗原提示細胞と一定時間(例えば、少なくとも約24時間)接触させる。
【0095】
いくつかの実施形態では、抗原提示細胞の集団を、AMHR2ポリペプチドまたはAMHR2ポリペプチドをコードする核酸とともに末梢血Tリンパ球の異種集団と共培養することができる。該細胞はAMHR2ポリペプチドに含まれるAMHR2エピトープが抗原提示細胞によって提示されかつ抗原提示細胞がAMHR2を発現する細胞に応答するためのTリンパ球の集団を刺激するのに十分な時間および条件下で共培養されることができる。特定の実施形態では、AMHR2を発現する細胞に応答するために刺激されたTリンパ球およびBリンパ球が提供される。
【0096】
Tリンパ球は、任意の適切な供給源(例えば末梢血、脾臓、およびリンパ節)から得ることができる。Tリンパ球は、粗製調製物として、または部分的に精製されたまたは実質的に精製された調製物として使用することができ、標準的な方法、これらに限定されないが例えば、抗体を用いる免疫磁気またはフローサイトメトリー法を伴う方法によって得ることができる。
【0097】
特定の態様において、上記の抗原提示細胞またはリンパ球ならびに医薬的に許容される担体および/または希釈剤を含む組成物(例えば、医薬組成物)が提供される。いくつかの実施形態では、該組成物は、上記のようなアジュバントをさらに含む。
【0098】
特定の態様において、AMHR2を発現する細胞に対する免疫応答を誘発するための方法であって、免疫応答を誘発するのに十分な有効量で上記の抗原提示細胞またはリンパ球を対象に投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、有効量の上記抗原提示細胞またはリンパ球を対象に投与することを含む、卵巣癌の治療または予防のための方法が提供される。一実施形態において、該抗原提示細胞またはリンパ球は、全身的に、好ましくは注射によって投与される。あるいは、例えば、組織(例えば、卵巣癌腫瘍の近位の組織、例えば卵巣組織)に、好ましくはデポー製剤または徐放性製剤中で、直接注射することにより、全身というよりむしろ局所的に投与されることができる。
【0099】
特定の実施形態では、本明細書に記載の抗原刺激抗原提示細胞およびこれらの抗原提示細胞により作製された抗原特異的Tリンパ球は、卵巣癌の予防的または治療的処置のための免疫調節組成物中の活性化合物として使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のAMHR2刺激抗原提示細胞は、対象への養子移入のためのCD8Tリンパ球、CD4Tリンパ球、および/またはBリンパ球を生成するために使用され得る。したがって、例えば、AMHR2特異的リンパ球は、卵巣癌に罹患した対象において治療目的のために養子移入されることができる。
【0100】
特定の実施形態では、本明細書中に記載される抗原提示細胞および/またはリンパ球は、免疫応答を誘発するために、特に、AMHR2を発現する細胞に対する免疫応答を誘発するために、単独でまたは組み合わせて対象に投与されることができる。いくつかの実施形態では、該抗原提示細胞および/またはリンパ球は、対象由来(すなわち、自己細胞)または対象とMHC適合または不適合である(例えば、アロジェネイック)異なる対象由来であり得る。
【0101】
該抗原提示細胞およびリンパ球の単回または複数回の投与は、ケア提供者(例えば、医師)によって選択される細胞数および処置で実施されることができる。いくつかの実施形態において、該抗原提示細胞および/またはリンパ球は医薬的に許容される担体中で投与される。適切な担体は、細胞を増殖させた増殖培地、またはリン酸緩衝食塩水のような任意の適切な緩衝化培地であり得る。該細胞は、単独で、または他の治療剤と併用して補助治療として投与されることができる。
【実施例
【0102】
実験操作
【0103】
組換えマウスAMHR2ポリペプチドの生成
8週齢の雌C57BL/6マウスの卵巣からトータルmRNAを抽出した。AMHR2配列1-140または170-568を増幅するように設計されたプライマー対を使用して、RT-PCRによってマウスAMHR2の140アミノ酸細胞外ドメイン全体または399アミノ酸細胞質ドメイン全体のいずれかをコードするcDNAを生成した。タンパク質フォールディングを最適化し、全収率を高めるために、天然のコドン配列の置換(Dapcel、Cleveland、OH)を行い、当該最適化したcDNAをpET-3a(Novagen、Darmstadt、Germany)のNdeI-BamHI部位に挿入し、C末端6×His標識組換えタンパク質を得た(図1Aおよび10A)。大腸菌を、これらの挿入断片を含むプラスミドで形質転換した。高レベルの発現コロニーを、イソプロピルチオガラクトピロニダーゼ(IPTG;Amresco、Solon OH)による誘導後に選択し、適切な配向および整列を確認するために配列決定した。6xHis標識AMHR2ポリペプチドを、ニッケル-ニトリロ三酢酸(Ni-NTA)アフィニティークロマトグラフィー(Qiagen Sciences、Germantown、MD)を用いて変性条件下で精製した。精製したAMHR2ポリペプチドを変性SDS-PAGEゲル(Bio-Rad、Hercules、CA)で電気泳動し、免疫ブロットPVDF膜(Bio-Rad)上にブロットした。AMHR2ポリペプチドの免疫検出は、HRP結合His抗体(Qiagen)を用いた増強化学発光システム(Amersham Biosciences、Piscataway、NJ)を用いて行った。使用前に、6xHis標識AMHR2ポリペプチドを逆相HPLCによって精製し、エンドトキシンフリータンパク質を得た。エンドトキシンのレベルは、組換えタンパク質1mgあたり<0.05エンドトキシン単位(<5pg)であった。
【0104】
マウスと免疫
雌のC57BL/6マウスを、ID8腫瘍のレシピエントとして使用した。マウスを6週齢で商業的に入手し(Jackson Laboratory、Bar Harbor、ME)、7-10週齢で、等量の水と400μgのマイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacteria tuberculosis)を含有する完全フロイントアジュバント(CFA;Difco、Detroit、MI)のエマルション200μL中に含まれる組換えマウスAMHR2-CDまたはAMHR2-ED100μgを、側腹部に皮下注射することにより免疫した。TgMlSIIR-TAg(DR26 line)トランスジェニックマウスは雄のTgMISIIR-TAg(H-2)マウスを雌の野生型同系C57BL/6(Jackson Laboratory)と交配させることによって維持された。TgMlSIIR-TAgマウスを、6~7週齢で、上記のようにCFA中の組換えマウスAMHR2-CDまたはAMHR2-ED100μgで免疫化した。妊孕性表現型(phenotype)を決定するために、年齢適合試験および対照ワクチン接種C57BL/6雌マウスを同じC57BL/6雄と交配させた。
【0105】
腫瘍接種および測定
ID8細胞を75または225cm組織培養フラスコ(BD Biosciences、Franklin Lakes、NJ)中、4%ウシ胎仔血清(Thermo Scientific Hyclone、Logan、UT)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(Invitrogen、Carlsbad、CA)、およびインスリン-トランスフェリン-亜セレン酸ナトリウム培地補充物(Sigma-Aldrich、St. Louis、MO)を含有するDMEM(Mediatech Cellgro, Manassas, VA)中で、該細胞が70-80%コンフルエントになるまで培養した。トリプシン処理により細胞を回収し、PBSで2回洗浄した。メスC57BL/6マウスに、5x10個のID8細胞を左背側腹部に皮下接種した。ID8腫瘍の増殖は、長さx幅を測定するためにバーニアキャリパーを用いて定期的に評価した。腫瘍増殖のエンドポイントは、17mmの任意の方向の測定によって決定した。
【0106】
自然発症卵巣腫瘍のインビボイメージングおよび測定。
雌トランスジェニックマウスにおける両側卵巣腫瘍増殖を、小動物用のVevo770高分解能in vivoマイクロイメージングシステム(VisualSonics、Toronto、Canada)を用いて超音波により毎月測定した。腹部から毛を除去した後、RMV704低周波プローブ/スキャンヘッドおよび水性導電性ゲルを用いて、腹部のリアルタイムイメージングを行った。30分間未満の画像取得時間中、1~2%vol/volイソフルランの連続流を有するノーズコーンを用いて固定のための麻酔を施し、酸素供給を連続的に維持した。プローブ/スキャンヘッドを、水性導電性ゲルを塗布した後、腹部を非常に穏やかに移動させた。腫瘍領域の測定および計算を、関心設定の多角形領域(VisualSonics)を用いて、インビボでの卵巣腫瘍サイズの2-D評価を可能にするVevoソフトウェアBモード測定ツールを用いて行った。Bモード超音波検査による固形腫瘍の測定は組織病理学的測定と良好に相関することが示されている。
【0107】
RT-PCR
組織を切除し、RNA-Later(Life Technologies, Grand Island, NY)で凍結保存した。RNAは、TRIZOL試薬(Invitrogen)中でのホモジナイゼーションによって各組織から抽出するか、または市販品を購入した(OriGene Technologies, Rockville, MD;ILS Biotech, Chestertown, MD)。Superscript III(Invitrogen)を用いてバルクRNAからcDNAを生成した。遺伝子特異的プライマー(テーブル1)を用いてSYBR Green PCR mix(Applied Biosystems、Carlsbad、CA)を用いてqRT-PCRにより遺伝子発現を定量した。相対的遺伝子発現は、個々の組織におけるβ-アクチン発現レベルに対する各試験遺伝子発現レベルの標準化によって評価した。遺伝子発現は、AMHR2特異的プライマーおよびβアクチン特異的プライマー(テーブル1)を用いたConventional RT-PCRによって決定した。30サイクルの増幅後、PCR産物をアガロースゲル(1TBE緩衝液中2%)で分離し、臭化エチジウムで染色した後に紫外線下で可視化した。TgMlSIIR-TAgマウスの子孫における導入遺伝子発現は、先に記載したようなプライマー対(テーブル1)を用いたSV40-TAgの773bpフラグメントのPCR増幅によって決定した。マウスAMHR2の細胞外ドメインの全140アミノ酸配列のDNAを、AMHR2特異的プライマー対(テーブル1)を用いてマウス卵巣組織からRT-PCRにより増幅した。
【0108】
テーブル1. クローニング、qRT-PCR、トランスジーンの検出、およびConventional RT-PCRに使用されるプライマー対
【表1】
【0109】
腫瘍浸潤リンパ球(TIL)のフローサイトメトリー分析
50KUのDNase I(Sigma-Aldrich)および0.2mg/mlコラゲナーゼII(Life Technologies)を含むHBSS中37℃で30分間、刻んだ腫瘍を消化し、続いて不連続勾配遠心分離によってTILをID8腫瘍から単離した。当該部分的に精製されたTILを、0.5%BSAおよび0.05%アジ化ナトリウムを含むPBS中、FcγIII/II受容体抗体(BD Biosciences)で処理し、FITC結合抗マウスCD3とPE結合抗マウスCD4またはPE結合抗マウスCD8(BD Biosciences)の一方でニ重染色した。CD3T細胞集団をゲーティングし、CD4およびCD8T細胞のパーセンテージについて分析した。30,000の総イベントで収集されたデータをFlowJoソフトウェア(BD Biosciences)を用いて分析した。
【0110】
腫瘍免疫の受動移入
AMHR2ポリペプチドまたはコントロール免疫原(オボアルブミン;Sigma-Aldrich)を用いたメスC57BL/6マウスの免疫の10日後、5x10細胞/mlのLNCを、IL-12(10ng/ml)およびIL-18(10ng/ml;Peprotech、Rocky Hill、NJ)の存在下、24ウェル平底Falconプレート(BD Biosciences)中、上記のように補充したDMEM中、総量2.0 ml/ウェルで、20μg/mlの免疫原でin vitroで活性化した。再刺激の3日後、2×10個の活性化全LNCを、亜致死的にγ照射された(5Gy)ナイーブメスレシピエントに腹腔内注射した。あるいは、C57BL/6雌マウスをAMHR2ポリペプチドまたはOVAのいずれかで免疫化し、4週間後、上記のように免疫原、IL-12、およびIL-18で再活性化された7.5x10全脾細胞、磁気ビーズ分離で全脾細胞から精製され同様に再活性化された2x10のCD4T細胞、および
磁気ビーズ分離で全脾細胞から精製された2x10の非再活性化B220B細胞を含む、3グループの細胞を亜致死的にγ照射された(5Gy)ナイーブメスレシピエントに腹腔内注射した。すべての場合において、細胞移入の翌日に5x10個のID8細胞を宿主に皮下接種し、腫瘍増殖を上記のように定期的に評価した。濃縮された細胞の純度は、CellQuestソフトウェア(BD Biosciences)を用いたフローサイトメトリー分析によって決定され、一貫して>90%であった。
【0111】
生物統計分析
スチューデントのt検定を用いて、mRNA発現レベルと平均腫瘍重量の差違を比較した。腫瘍増殖曲線間の差異を、unweighted one-way ANOVAによって比較し、logrank検定を用いてマウス生存曲線の差を比較した。
【0112】
実施例1:組換えマウスAMHR2-CDの作製
全細胞質ドメインの399個のアミノ酸を含む170-568配列からなるマウスAMHR2の最も長い親水性ドメインが発現された(図1A)。Ni-NTAアフィニティー精製C末端6xHisタグタンパク質は、SDS-PAGEゲルのクマシーブルー染色(図1B)およびHRPコンジュゲートHis特異的抗体を用いたウエスタンブロットブロット免疫染色によって決定される(図1C)~44kDタンパク質として移動した。
【0113】
実施例2:AMHR2-CDの免疫原性
雌C57BL/6マウスのAMHR2-CD免疫化の10日後、LNCは、AMHR2-CDに用量反応的に増殖したが、AMHR2-CDと同様の方法で生成および精製された組換えヒトコクリン(cochlin)、コントロールタンパク質では増殖しなかった(図2A)。LNCによるこの抗原特異的増殖は、精製CD4T細胞から誘導されたが、精製CD8T細胞からは誘導されず(図2B)、CD4特異的抗体(CD8特異的抗体でない)との培養の処理によって阻害された(図2C)。免疫化から4週間後、免疫原刺激された脾細胞からの上清のELISA分析は、IFNγの高産生およびIL-2、IL-4、およびIL-5の産生が比較的低いといった、AMHR2-CDに対する主要な炎症促進性応答を示した(図2D)。全脾細胞集団からのT細胞サブセットの精製は、CD4T細胞(CD8T細胞でなく)がAMHR2-CDに応答してIFNγを産生することを示した(図2E)。免疫化の2ヶ月後、AMHR2-CD特異的IgGの血清レベルは、1:50,000希釈を超える力価でも検出可能であった(図2F)。
【0114】
実施例3:AMHR2-CD免疫後の良性一過性卵巣炎症
次に、卵巣の自己免疫を誘導するAMHR2-CD免疫の可能性を調べた。C57BL/6雌マウスのAMHR2-CD免疫化の4週間後および8週間後、卵巣IFNγ遺伝子発現をqRT-PCRによって測定した。相対的な卵巣IFNγ遺伝子発現は、AMHR2-CD免疫化の4週間後には中程度に上昇したが、CFA単独の免疫化後ではそうではなかった(図3A)。免疫化の8週間後、相対的な卵巣IFNγ遺伝子発現は、免疫した両マウス群において同様であった。中でも注目すべきは、4週間でAMHR2-CD免疫化マウスで観察されたIFNγ遺伝子発現の一時的な上昇は、CFAコントロールマウスより3倍高いだけであった。AMHR2-CD免疫化の4、8および12週間後の免疫組織化学分析により、卵巣でCD3T細胞浸潤は観察されなかった。4連続交配サイクル(この間、AMHR2-CDおよびCFA免疫化マウス間に同腹仔あたりの子の数に有意差は生じなかった(P>0.60)(図3C))にわたるマウス妊孕性により示されるとおり、AMHR2-CD免疫マウスの卵巣におけるIFNγの低い一過性発現は、卵巣機能への検出可能な影響と関連していなかった。AMHR2遺伝子の発現は、卵巣およびID8卵巣腫瘍細胞で直ちに検出され、正常なマウス子宮、胃、脾臓、心臓、肺、腎臓および肝臓ではいずれも感知可能なレベルで検出されなかった(図3C)。
【0115】
実施例4:AMHR2-CDで免疫化したマウスにおける腫瘍増殖の阻害
AMHR2-CDによるワクチン接種が、C57BL/6雌マウスにおける移植可能なID8腫瘍の増殖を阻害するかどうかを次に試験した。ID8卵巣腫瘍細胞の接種の15日前(図4A;P<0.001)、7日前(図4V;P<0.001)または1日後(図4C;P<0.05)に予防ワクチン接種したマウスにおいて、ID8腫瘍増殖は阻害された。さらに、ID8接種の7日前(P<0.01)および1日前(P<0.05)にワクチン接種されたマウスにおける実験の終了時の最終ID8腫瘍重量によって測定されたとおり、AMHR2-CDワクチン接種は、全腫瘍量の有意な減少をもたらした(図4D)。AMHR2-CDワクチン接種は、EOCに対する治療としても有効であった。ID8腫瘍の接種60日後のAMHR2-CDによるワクチン接種は、確立された触診可能なID8腫瘍の増殖を有意に阻害した(P<0.05;図4E)。AMHR2-CDを用いたワクチン接種は、TgM1SIIR-TAgトランスジェニックマウスにおいて自然発症的に発生する自然発症EOCの増殖を有意に阻害した(P<0.0001;図4F)。さらに、CFAワクチン接種コントロールマウスと比較した場合、腫瘍増殖におけるこの阻害は、極めて有意に全生存期間(OS)の増加を伴った(P<0.0005;図4G)。CFAワクチン接種対照マウス(平均135日±13.89)と比較したAMHR2-CDワクチン接種マウスのこの拡大された寿命(平均191.25日±22.95)は、OSにおける41.7%の増大を表す。
【0116】
実験の終了時に、腫瘍を炎症性浸潤について分析した。免疫組織化学分析は、一貫して、AMHR2-CDワクチン接種マウスからの腫瘍におけるCD3T細胞の広範な浸潤を示した(図5A)。CFA単独で免疫化したマウスの腫瘍では浸潤は観察されなかった。TILのフローサイトメトリー分析は、CFA単独で免疫化したコントロールマウスと比較して、AMHR2-CDでワクチン接種したマウスからの腫瘍におけるCD4T細胞の顕著な増加を示した(40.7%対11.7%;図5b)。腫瘍におけるCD8T細胞の実質的な増加は、CFA免疫化コントロールマウスと比較してAMHR2-CD免疫化マウスでは生じなかった(それぞれ10.5%対7.4%)。次に、qRT-PCRによって腫瘍RNAを炎症誘発因子の遺伝子発現について分析した。CFA免疫化コントロールマウスの腫瘍と比較して、AMHR2-CD免疫化マウスの腫瘍はCD4、IFNγ、TNFα、およびIL-2の相対的遺伝子発現では一貫して有意な増加を示した(全てのケースでP<0.05)が、CD8ではなかった(図5C)。これらのデータは、AMHR2-CDによる免疫化後のID8腫瘍内の炎症誘発性免疫環境の誘導を示す。
【0117】
実施例5:CD4細胞による腫瘍免疫の受動移入
全てのレシピエントマウスに、細胞移入の翌日にID8腫瘍細胞を接種した。OVA特異的LNCを投与されたマウスと比較した場合、AMHR2-CD特異的LNC(P=0.04;図6A)および脾細胞(P<0.01;図6B)を移入したマウスにおいて腫瘍増殖は有意に阻害された。初回刺激された脾細胞の移入および腫瘍接種の190日後、平均腫瘍重量は、OVA特異的脾細胞のレシピエントと比較して、AMHR2-CD特異的脾細胞のレシピエントにおいて有意に低かった(P<0.05;図6C)。4週間の初回刺激脾細胞から精製したAMHR2-CD特異的CD4T細胞の移入は、精製OVA特異的CD4T細胞の移入と比較してID8腫瘍増殖の有意な阻害をもたらした(P<0.0004;図6D)、一方、4週間初回刺激された脾臓細胞から精製されたAMHR2-CD-刺激B220B細胞の移入は、OVA刺激B220B細胞の移入と比較して、ID8腫瘍増殖を有意に阻害しなかった(P=0.07;図6D)。したがって、AMHR2-CD特異的炎症誘発性CD4T細胞は、EOCの増殖に対する免疫防御を伝達するのに十分である。
【0118】
実施例6:ヒトAMHR2組織発現
ヒトタンパク質アトラスデータベースを調べて、30のヒト組織における相対的なAMHR2遺伝子発現を決定した。図7に見られるように、AMHR2遺伝子発現は、30個の組織のうちのわずか5個でバックグラウンドを上回ることが観察され、最高発現は卵巣で観察された。
【0119】
AMHR2のいくつかの公知のスプライスバリアントがあり、AMHR2の異なる部分をコードする様々なスプライスバリアントがある。次いで、ヒトタンパク質アトラスを調べて、AMHR2遺伝子発現が観察された5つの組織における異なるAMHR2エキソンの発現レベルを決定した。図8に示すように、AMHR2の細胞外ドメインをコードするエキソンの発現は、専ら卵巣に限定されていた。
【0120】
定量的リアルタイムRT-PCR(qRT-PCR)を用いて、AMHR2-EDの発現が正常なヒト卵巣に限定され、該ヒトの副腎または膵臓で発現されないことを示した(図8B)。さらに、図8Dに示されるように、ヒト閉経後卵巣(平均64歳、52~95歳)および老いたマウス卵巣(9ヶ月齢)は、ヒト閉経前卵巣と(平均31歳、範囲27~45歳)および若いマウス卵巣(6週齢)とそれぞれ比較して、低レベルのAMHR2-ED発現を有する。さらに、試験された全てのヒトEOC腫瘍は、AMRR2-ED転写物(qRT-PCRによって評価;図8E)およびタンパク質(ウエスタンブロット分析によって評価;図8F)の両方の高レベル発現を示した。したがって、正常な卵巣では、両方のドメインの発現レベルが年齢とともに低下し、AMHR2ポリペプチドを有する閉経後の女性にワクチン接種する際の一過性の卵巣炎の可能性も低下する。
【0121】
リアルタイムRT-PCRを用いて、AMHR2細胞外ドメインが正常なヒト卵巣で発現されるが、細胞外ドメインでは発現しないことを確認した(図9A)。
【0122】
AMHR2細胞外ドメインがEOCで発現されるかどうかを次に試験した。5つのEOCをAMHR2細胞外ドメインに特異的な抗体を用いたウエスタンブロットで試験したところ、すべてのサンプルで細胞外ドメインの発現が観察された(図9B)。
【0123】
実施例7:組換えマウスAMHR2-EDの作製
AMHR2タンパク質のN末端140アミノ酸で構成されるマウスAMHR2細胞外ドメインを発現させた(図10A)。Ni-NTAアフィニティー精製C末端6xHisタグタンパク質は、SDS-PAGEゲルのクマシーブルー染色およびHRP結合His特異的抗体を用いたウエスタンブロット免疫染色によって決定される~17kDタンパク質として移動した(図10B)。6週齢の若いC57BL/6雌マウスのAMHR2-EDワクチン接種の1ヶ月後、ELISPOT分析は、IFNγ産生抗原特異的T細胞の脾細胞頻度(平均で3,831脾臓細胞あたり1)、IL-17の脾細胞頻度(平均で21,739脾細胞あたり1個)の上昇を示したがIL-5ではなかった(図10C)。
【0124】
AMHR2-EDに応答する炎症誘発性T細胞は、主にCD4T細胞であったが、IFNγ(図10D)およびIL-17(図10E)を産生するCD8T細胞も含んでいた。AMHR2-EDワクチン接種の4ヶ月後、AMHR2-EDに対する血清IgG抗体応答は、1/50,000までの希釈で検出可能であり(図10F)、主にIgG1およびIgG2bアイソタイプからなっていた(図10G)。AMHR2-EDは、完全に異なる主要組織適合複合体ハプロタイプ(C57BL/6(H-2)、BALB/c(H-2)、A/J(H-2)、およびFVBN/J(H-2)を含む)を示すいくつかのマウス株において高度に免疫原性であり、IFNγ分泌脾細胞がワクチン接種の1ヶ月後の頻度が平均でそれぞれ1/4,310、1/4,425、1/8,772、および1/10,000であった(図10H)。
【0125】
実施例8:AMHR2-EDの免疫原性
AMHR2-EDの免疫原性は、TgM1SIIR-TAg(DR26系)トランスジェニック雌マウスのCFA中AMHR2-EDによる免疫化によって決定した。免疫化の4週間後、AMHR2-ED由来の脾細胞は、AMHR2-EDに対する抗原特異的リコール増殖応答を示したが、組換えマウスβ-カゼイン(AMHR2-EDと同様の様式で生成および精製された無関係なコントロール抗原)では見られなかった(図11A)。対照的に、CFA免疫化マウス由来の脾細胞は、AMHR2-EDおよびβ-カゼインの両方に対して応答しなかった(図11B)。培養上清のELISA分析により、高レベルの炎症誘発性サイトカインサイトカイン、IFNγおよびIL-17のAMHR2-ED活性化産生が示され、および第2型制御性サイトカインIL-5の産生は最小であることが示された(図11C)。AMHR2-EDで免疫したマウスの脾細胞は、1型(~1/4,000リンパ球;p<0.0001)および17型(~1/20,000リンパ球;p<0.02)炎症誘発性T細胞の有意に高い頻度を示したが、IL-5を発現する2型制御性T細胞は最小の頻度であった(図11D)。AMHR2-EDによる免疫化の4ヶ月後、AMHR2-ED特異的IgGの血清力価は、1/50,000希釈を超える力価で依然として検出可能であった(p<0.001、図11E)。これらの結果は、AMHR2-EDが高度に免疫原性であることを示している。
【0126】
AMHR2-EDによるワクチン接種によって生成された免疫応答の性質をさらに評価するために、TgM1SIIR-TAgトランスジェニック雌マウスをAMHR2-ED25μg/mlまたは50μg/mlのいずれかで免疫化した。免疫化の1ヶ月後、脾臓を採取し、IFNγおよびIL-17の発現を検出した。図12A-Bに見られるように、AMHR2-EDの免疫化の1ヶ月後に単離された脾細胞および精製CD4(CD8ではない)T細胞は、1型および17型炎症誘発性T細胞の顕著な抗原特異的誘導を示した。AMHR2-EDで6週齢で免疫化された7ヶ月齢のメスTgMISIIR-Tagマウスから採取した自然発症EOCの免疫組織化学分析は、CD3T細胞およびCD4T細胞の優勢な浸潤を示したが、CD8T細胞ではなかった(図12C~D)。
【0127】
実施例9:AMHR2-EDによる免疫は妊孕性に影響しない
AMHR2-EDによる免疫後の卵巣炎症のレベルを調べた。マウスの卵巣を、AMHR2-EDによる免疫化の4週間後および8週間後に採取し、RT-PCRによって分析した。図13に見られるように、採取された卵巣は、免疫後4週間で炎症性サイトカインIL-1βの発現を示したが、8週間では示さなかった。IFNγ発現は、免疫後のいずれの時点でも上昇しなかった。対照的に、AMHR2-EDワクチン接種の4週間後、9ヶ月齢のC57BL/6雌マウスの卵巣中のIL-1βについてもIFNγについては遺伝子発現の上昇は起こらなかった(図13C)。
【0128】
次に、AMHR2-EDで免疫したマウスの妊孕性を調べた。図14に見られるように、4回の交配サイクルにわたる妊孕性によって測定された卵巣機能は、AMHR2-ED免疫化による影響を受けなかった。具体的には、CFA中のAMHR2-EDで免疫化したマウス間またはCFA単独で免疫化したコントロールマウスの間で、同腹仔あたりの平均仔数または平均出生時重量の有意差は検出されなかった。
【0129】
実施例10:AMHR2-EDによる免疫化は、卵巣癌腫瘍の増殖を阻害する
自発性かつ移植可能な卵巣腫瘍の増殖を阻害するAMHR2-EDワクチン接種の能力を試験した。図15A~Bに見られるように、6~7週齢の雌TgM1SIIR-TAgトランスジェニックマウスの予防的AMHR2-ECワクチン接種は、自然発症EOCの増殖において高度に有意な阻害をもたらし(p<0.0001)、CFA単独でワクチン接種したコントロールマウスと比較して、全生存が42%増加した(平均193.7±34.5日対平均135±13.89日)。移植可能なTgMISIIR EOC腫瘍の増殖における同様の有意な阻害は、3x10マウス卵巣癌(MOVCAR)細胞を接種する7日前または15日前のいずれかにワクチン接種されたマウスで生じた(p<0.001;図15C~D)。
【0130】
同様に、6-7週齢のTgMISIIR-TAg(DR26)トランスジェニックマウスの予防的AMHR2-EDワクチン接種は、CFA単独でワクチン接種したコントロールマウスと比較して、自然発症EOCの出現および増殖を有意に遅延させた(P<0.001;図15E)。この自然発症EOCの出現および増殖の阻害は、CFA単独でワクチン接種したコントロールマウスと比較して、有意な42%全生存の増加をもたらした(P<0.0001)、(平均194±35日対平均135±14日それぞれ;図15F)。AMHR2-EDワクチン接種はまた、確立された増殖性自然発症EOCを有するTgMISIIR-TAg(DR26)トランスジェニックマウスにおいて、EOCに対する高度に有意な免疫療法を提供するのに有効であった(P<0.0001;図15G)。AMHR2をワクチン接種したTgMISIIR-TAg(DR26)マウスからの自然発症EOCの免疫組織化学的分析は、CD3T細胞(図15H、左上パネル)およびCD4T細胞(図15H、上段中央パネル)では一貫して、CD8T細胞(図15H、右上パネル)では時折、顕著な浸潤を示した。CFA単独でワクチン接種したコントロールマウス由来の対応する免疫染色EOCは、一貫して検出可能なT細胞浸潤を示さなかった(図3f、下のパネル)。
【0131】
実施例11:AMHR2-ED刺激T細胞およびB細胞の移入は、卵巣癌腫瘍の増殖を阻害する
EOC腫瘍増殖に対するAMHR2-ED刺激CD4T細胞およびB220B細胞の移入の効果を試験した。図16に見られるように、AMHR2-EDで免疫化したマウスからのCD4T細胞またはB220B細胞の移入後に、MOVCAR EOCの増殖の阻害が生じた。さらに、図17に見られるように、AMHR2-ED免疫化マウスからのCD4T細胞またはB220B細胞の移入もまた、細胞を受けたMOVCAR腫瘍を有するマウスにおいて全生存を増加させた。ナイーブレシピエントへの細胞の移入およびMOVCAR EOCの接種は、互いに1日以内に行われた。さらに、図18に見られるように、ID8-VEGF EOC腫瘍の増殖阻害は、AMHR2-EDで免疫化したマウスからのCD4T細胞(左上パネル)または血清(左下パネル)を受けたマウスで生じた。全生存の増大は、AMHR2-EDで免疫化したマウスのCD4T細胞(右上のパネル)または血清(右下のパネル)を受けたマウスで生じた。ナイーブレシピエントへの細胞の移入およびID8-VEGF EOCの接種は、互いに1日以内に行われた。アスタリスクは有意性を示す。
【0132】
実施例12:CD4T細胞、B220B細胞、およびIgGによる腫瘍免疫の受動移入
EOC腫瘍増殖の阻害を説明する免疫集団の同一性を試験した。MOVCAR接種の1日前にAMHR2-ED刺激CD4T細胞をTgMISIIR-TAg(低)雌マウスに移入すると、オボアルブミン刺激CD4T細胞を受けたマウスと比較して、腫瘍増殖の極めて有意な阻害がもたらされ(P<0.0001;図20A)、全生存が増大することが見出された(P<0.006;図20B)。さらに、MOVCAR接種の1日前にTgMISIIR-TAg(低)雌マウスにAMHR2-ED刺激B220B細胞を移入することにより、オボアルブミン免疫化マウスからのB220B細胞を受けたマウスと比較して、有意な腫瘍増殖の阻害(P<0.0001;図20C)および全生存の増大(P<0.009;図20D)が媒介された。MOVCAR接種の1日前にTgMISIIR-TAg(低)雌マウスへのAMHR2-ED免疫化マウス由来のアフィニティー精製IgGの移入は、オボアルブミン免疫化マウス由来のアフィニティー精製IgGを受けたマウスと比較して、腫瘍増殖の有意な阻害をもたらし(P<0.0001;図20E)、全生存を増大した(P<0.002;図20F)。
【0133】
参照による組み込み
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許および特許出願は、各々の刊行物、特許または特許出願が具体的に参照され、個々に示されているかのように、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。コンフリクトの場合には、本明細書中の定義を含む本出願は、コントロールする。
【0134】
同等物(均等物)
当業者であれば、本明細書に記載された特定の実施形態に対する多くの同等物(均等物)を認識するであろうし、あるいは通常の実験を用いて確認することができるであろう。
そのような同等物(均等物)は、下記の請求の範囲に記載されたものに包含されることが意図される。
図1
図2
図3
図4
図5
図6
図7
図8-1】
図8-2】
図8-3】
図9
図10-1】
図10-2】
図11
図12
図13-1】
図13-2】
図14
図15-1】
図15-2】
図16
図17
図18
図19
図20
【配列表】
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