特許 7015171 新規融合体及びその検出法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-01-25

(45)【発行日】2022-02-02

(54)【発明の名称】新規融合体及びその検出法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20220126BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20220126BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220126BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20220126BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20220126BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20220126BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20220126BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220126BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20220126BHJP

   C12Q 1/6813 20180101ALI20220126BHJP

   C12Q 1/6844 20180101ALI20220126BHJP

   C12Q 1/6876 20180101ALI20220126BHJP

   C07K 14/47 20060101ALN20220126BHJP

   C12N 9/12 20060101ALN20220126BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z ZNA

A61K39/395 Y

A61P35/00

C07K19/00

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N15/63 Z

C12Q1/6813 Z

C12Q1/6844 Z

C12Q1/6876 Z

C07K14/47

C12N9/12

【請求項の数】 25

(21)【出願番号】P 2017561206

(86)(22)【出願日】2017-01-13

(86)【国際出願番号】 JP2017001118

(87)【国際公開番号】W WO2017122816

(87)【国際公開日】2017-07-20

【審査請求日】2020-01-10

(31)【優先権主張番号】P 2016006471

(32)【優先日】2016-01-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２７年度 文部科学省、科学技術試験研究委託事業、「チロシンキナーゼ阻害剤によるがん治療の実用化に関する研究」（治療標的となる新規融合型キナーゼの同定）、次世代癌研究戦略推進プロジェクト事業、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願

(73)【特許権者】

【識別番号】000173588

【氏名又は名称】公益財団法人がん研究会

(74)【代理人】

【識別番号】100179431

【弁理士】

【氏名又は名称】白形 由美子

(72)【発明者】

【氏名】竹内 賢吾

(72)【発明者】

【氏名】坂田 征士

(72)【発明者】

【氏名】冨樫 由紀

(72)【発明者】

【氏名】藤田 直也

(72)【発明者】

【氏名】片山 量平

【審査官】長谷川 強

(56)【参考文献】

【文献】PLoS ONE, 2012, Vol.7, Issue 6, e39653, p.1-12

【文献】Database GenBank [online], Accession No. AFN01665, 2012-07-03 uploaded, [retrieved on 2021-01-23], <https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/AFN01665.1?report=genbank&log$=protalign&blast_rank=1&RID=0RFK8BT4013>, SND1-BRAF fusion [Homo sapiens].

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／６２

Ａ６１Ｋ ３９／３９５

Ａ６１Ｐ ３５／００

Ｃ０７Ｋ １９／００

Ｃ１２Ｎ １／１５

Ｃ１２Ｎ １／１９

Ｃ１２Ｎ １／２１

Ｃ１２Ｎ ５／１０

Ｃ１２Ｎ １５／６３

Ｃ１２Ｑ １／６８１３

Ｃ１２Ｑ １／６８４４

Ｃ１２Ｑ １／６８７６

Ｃ０７Ｋ １４／４７

Ｃ１２Ｎ ９／１２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＰＸＮ又はＧＭＤＳとＢＲＡＦとの融合タンパク質。

【請求項2】

以下の（ａ）～（ｄ）からなる群から選択されるポリペプチドである、請求項１に記載の融合タンパク質：
（ａ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列との同一性が９５％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、及び
（ｄ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。

【請求項3】

請求項１又は２に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。

【請求項4】

請求項３に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。

【請求項5】

請求項４に記載のベクターで形質転換された細胞。

【請求項6】

請求項１、又は２の（ａ）～（ｄ）に記載のいずれかのＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質とＢＲＡＦタンパク質との融合タンパク質の検出方法であって、
被験者から得た試料中の、切断されたＢＲＡＦタンパク質を検出する工程を含む検出方法。

【請求項7】

ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質とＢＲＡＦタンパク質との融合タンパク質をコードする融合遺伝子の検出方法であって、
前記融合遺伝子が請求項３に記載のポリヌクレオチドであり、
被験者から得た試料中の、切断されたＢＲＡＦタンパク質をコードする遺伝子を検出する工程を含む検出方法。

【請求項8】

前記融合遺伝子のＤＮＡ又は転写産物であるｍＲＮＡを検出する、請求項７記載の検出方法。

【請求項9】

請求項１又は２に記載のいずれかのＰＸＮ又はＧＭＤＳとＢＲＡＦとの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、ＰＸＮ－ＢＲＡＦ又はＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合遺伝子の検出用キット。

【請求項10】

請求項１又は２に記載のいずれかのＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質とＢＲＡＦタンパク質との融合タンパク質の検出用キットであって、
融合点よりＮ末端側領域のＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質のポリペプチドに特異的に結合する抗体と、融合点よりＣ末端側領域のＢＲＡＦタンパク質のポリペプチドに特異的に結合する抗体を含む、ＰＸＮ又はＧＭＤＳとＢＲＡＦとの融合タンパク質の検出用キット。

【請求項11】

ＢＲＡＦタンパク質をコードするポリヌクレオチド部分から設計されるアンチセンスプライマー及びＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質をコードするポリヌクレオチド部分から設計されるセンスプライマーを含む、ＢＲＡＦ遺伝子とＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、アンチセンスプライマーは請求項３に記載のポリヌクレオチドにアニールする核酸分子からなり、センスプライマーは請求項３に記載のポリヌクレオチドの相補鎖にアニールする核酸分子からなるプライマーセット。

【請求項12】

請求項１又は２に記載のいずれかの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを検出するためのプライマーセットであって、
該ポリヌクレオチドが配列番号１又は配列番号３に示される塩基からなるポリヌクレオチドであり、該プライマーセットが配列番号１又は配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにアニールする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にアニールする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット。

【請求項13】

請求項１２に記載のプライマーセットであって、
以下の（ａ）～（ｂ）からなる群から選択される、センスプライマー及びアンチセンスプライマー、を含む、プライマーセット：
（ａ）配列番号１の塩基番号１から９６２の間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー、及び配列番号１の塩基番号９６３から２０６７の間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマー、又は、
（ｂ）配列番号３の塩基番号１から３７２の間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー、及び配列番号３の塩基番号３７３から１６５１の間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマー。

【請求項14】

（１）請求項２に記載の（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリペプチド、又は前記ポリペプチドを発現している細胞に試験物質を接触させる工程、
（２）前記ポリペプチドの活性及び／又は発現が阻害されるか否かを分析する工程、及び
（３）前記ポリペプチドの活性及び／又は発現を阻害する物質を選択する工程
を含む、前記ポリペプチドの活性及び／又は発現を阻害する物質をスクリーニングする方法。

【請求項15】

前記ポリペプチドの活性及び／又は発現を阻害する物質が、ＰＸＮ又はＧＭＤＳとＢＲＡＦとの融合体陽性のがんの治療剤である、請求項１４に記載のスクリーニング方法。

【請求項16】

請求項１、又は２に記載のＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質とＢＲＡＦタンパク質との融合タンパク質の検出方法であって、
被験者から得た試料中の、切断されたＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質を検出する工程を含む検出方法。

【請求項17】

ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質とＢＲＡＦタンパク質との融合タンパク質をコードする融合遺伝子の検出方法であって、
前記融合遺伝子が請求項３に記載のポリヌクレオチドであり、
被験者から得た試料中の、切断されたＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質をコードする遺伝子を検出する工程を含む検出方法。

【請求項18】

請求項１、又は２に記載のいずれかのＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質とＢＲＡＦタンパク質との融合タンパク質の検出方法であって、
前記検出方法が、ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質とＢＲＡＦタンパク質とから構築される融合タンパク質の存在、を検出する工程を含む検出方法。

【請求項19】

請求項１又は２に記載のいずれかのＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質とＢＲＡＦタンパク質との融合タンパク質をコードする融合遺伝子の検出方法であって、
前記検出方法が、ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質とＢＲＡＦタンパク質とから構築される融合タンパク質をコードする融合遺伝子の存在、を検出する工程を含む検出方法。

【請求項20】

前記融合遺伝子のＤＮＡ又は転写産物であるｍＲＮＡを検出する、請求項１７又は１９に記載の検出方法。

【請求項21】

請求項１９に記載の検出方法に用いる検出用キットであって、
ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子と融合遺伝子を構成するＢＲＡＦ遺伝子の３’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第１のプローブと、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子５’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第２のプローブとを含む、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子の検出用キット。

【請求項22】

請求項１６記載の検出方法に用いる検出用キットであって、
ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質のＮ末端側領域を特異的に認識できる抗ＰＸＮ又はＧＭＤＳ抗体、及び、ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質のＣ末端側領域を特異的に認識できる抗ＰＸＮ又はＧＭＤＳ抗体を含む、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質の検出用キット。

【請求項23】

前記ポリペプチドの活性及び／又は発現を阻害する物質が、ＰＸＮ又はＧＭＤＳとＢＲＡＦとの融合体陽性のがんの治療剤である、請求項１４に記載のスクリーニング方法。

【請求項24】

請求項２に記載のいずれかのＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質とＢＲＡＦタンパク質との融合タンパク質の活性及び／又は発現を阻害する物質を含有する、ＰＸＮ－ＢＲＡＦ又はＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合体陽性のがんの治療用医薬組成物であって、
前記医薬組成物がｔｒａｍｅｔｉｎｉｂ、Ｓｏｒａｆｅｎｉｂ、Ｄａｂｒａｆｅｎｉｂ、Ｖｅｍｕｒａｆｅｎｉｂ、Ｒｅｇｏｒａｆｅｎｉｂ、Ｎ－｛２，４－ｄｉｆｌｕｏｒｏ－３－［（５－ｐｙｒｉｄｉｎ－３－ｙｌ－１Ｈ－ｐｙｒｒｏｌｏ［２，３－ｂ］ｐｙｒｉｄｉｎ－３－ｙｌ）ｃａｒｂｏｎｙｌ］ｐｈｅｎｙｌ｝ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ、Ｎ－｛３－［（５－ｃｈｌｏｒｏ－１Ｈ－ｐｙｒｒｏｌｏ［２，３－ｂ］ｐｙｒｉｄｉｎ－３－ｙｌ）ｃａｒｂｏｎｙｌ］－２，４－ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ｝ｐｒｏｐａｎｅ－１－ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ、（１Ｅ）－５－（１－ｐｉｐｅｒｉｄｉｎ－４－ｙｌ－３－ｐｙｒｉｄｉｎ－４－ｙｌ－１Ｈ－ｐｙｒａｚｏｌ－４－ｙｌ）－２，３－ｄｉｈｙｄｒｏ－１Ｈ－ｉｎｄｅｎ－１－ｏｎｅ ｏｘｉｍｅ、ＧＤＣ－０８７９、ＲＡＦ－２６５、ＡＺ６２８、又はこれらの薬学的に許容される塩を有効成分とする医薬組成物。

【請求項25】

請求項１又は２に記載のいずれかのＰＸＮ又はＧＭＤＳとＢＲＡＦとの融合タンパク質をコードする融合遺伝子の融合点をはさんでその上流のＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子由来の１６塩基及び、下流のＢＲＡＦ遺伝子由来の１６塩基からなる、連続した３２塩基の核酸分子。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＢＲＡＦキナーゼ領域を含む新規の融合タンパク質又は該融合タンパク質をコードする融合遺伝子、及びそれらの検出方法に関する。
本発明は、ＰＸＮ又はＧＭＤＳの少なくとも一部を含む新規の融合タンパク質又は該融合タンパク質をコードする融合遺伝子、及びそれらの検出方法に関する。

【背景技術】

【0002】

染色体転座の結果、本来は別々の遺伝子が融合して融合遺伝子が作られる。これまで慢性骨髄性白血病におけるＢＣＲ－ＡＢＬ１融合体や、肺がんにおけるＥＭＬ４－ＡＬＫ融合体、肺がんを含む種々のがんにおけるＲＯＳ１融合体のように、キナーゼ遺伝子の一部を構成要素に含む融合遺伝子はしばしば発がんに本質的な役割を担い、その機能を抑制する薬剤は極めて有効な抗がん剤となることが知られている（非特許文献１、特許文献１、及び特許文献２）。
例えば、チロシンキナーゼ阻害剤のクリゾチニブやエルロチニブの登場により、分子診断とがん治療効果の関係について、臨床で示されつつあり、分子診断による適応患者の選別により、患者を層別化した上での治療薬投与というコンセプトが広がりつつある。

【0003】

ＢＲＡＦ（V-Raf Murine Sarcoma Viral Oncogene Homolog B1）は、Ｒａｆキナーゼファミリーに属するセリン／スレオニンキナーゼであり、Ｒａｓ－ＧＴＰと結合することにより活性化される（非特許文献２）。
これまでに、ＢＲＡＦ融合遺伝子が原因であるがんが複数知られている。例えば、脳腫瘍におけるＫＩＡＡ１５４９－ＢＲＡＦ、前立腺がんにおけるＳＬＣ４５Ａ３－ＢＲＡＦ、胃がんにおけるＡＧＴＲＡＰ－ＢＲＡＦ等が知られている（非特許文献３～５）。ＢＲＡＦ遺伝子と他の遺伝子の再構成により生じた融合体は、恒常的にキナーゼドメインがリン酸化状態にあり、ＭＡＰキナーゼ／ＥＲＫ経路等にシグナルを送り続けることにより、細胞のがん化に繋がる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【文献】特許第４３０３３０３号公報

【文献】ＷＯ２０１１／１６２２９５号パンフレット

【非特許文献】

【0005】

【文献】Lugo, TG et al., Science. 247, 1079-1082 (1990).

【文献】Stephens RM., Mol. Cell. Biol. 12, 3733-3742 (1992).

【文献】MarK, W, ASCO Educational Book. e436-e440 (2014).

【文献】Palanisamy, N., Nat. Med., 793-799 (2010).

【文献】Mcmahon, M., Nat. Med., 749-750 (2010).

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明の課題は、がんの新たな原因因子である融合体（融合タンパク質及び融合遺伝子）を解明したことに基づき、融合タンパク質又は当該融合タンパク質をコードする融合遺伝子の検出方法、当該検出方法を用いたがんの診断方法、がん治療用医薬組成物の適用対象者の判定方法、前記検出方法のためのキット及びプライマーセット、前記融合タンパク質であるポリペプチドの活性及び／又は発現の阻害物質のスクリーニング方法、ならびに前記阻害物質を含有するがん治療用医薬組成物及び前記がん治療用医薬組成物を投与するがん治療方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明者は、大腸がん患者から得た検体から、ＰＸＮ遺伝子の一部と、キナーゼであるＢＲＡＦ遺伝子の一部とが融合した新規の融合遺伝子、及び、ＧＭＤＳ遺伝子の一部と、キナーゼであるＢＲＡＦ遺伝子の一部とが融合した新規の融合遺伝子を単離同定し（実施例１～３）、当該融合遺伝子が大腸がん患者検体に存在することを見出した（実施例４～５）。
本発明者は、これらの知見から、ＢＲＡＦ融合タンパク質又は該融合タンパク質をコードする融合遺伝子の検出方法を提供し、そのためのキット及びプライマーセットを提供し、この融合タンパク質又は当該融合タンパク質をコードする融合遺伝子を検出することにより、ＢＲＡＦ阻害物質を用いた治療の対象となるがん患者を判別することを可能とし、当該がん患者にＢＲＡＦ阻害物質を投与する工程を含む、がんの治療方法を提供する。
本発明者は、これらの知見から、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質又は該融合タンパク質をコードする融合遺伝子の検出方法を提供し、そのためのキット及びプライマーセットを提供し、この融合タンパク質又は当該融合タンパク質をコードする融合遺伝子を検出することにより、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ阻害物質を用いた治療の対象となるがん患者を判別することを可能とし、当該がん患者にＰＸＮ又はＧＭＤＳ阻害物質を投与する工程を含む、がんの治療方法を提供する。

【0008】

本発明は、以下の発明に関する：
［１］被験者から得た試料中の、ＢＲＡＦ融合タンパク質又は該融合タンパク質をコードする融合遺伝子の検出方法。
［２］前記検出方法が、ＢＲＡＦタンパク質の切断、又は、ＢＲＡＦタンパク質をコードする遺伝子の切断、を検出する工程を含む、［１］に記載の検出方法。
［３］前記検出方法が、ＢＲＡＦタンパク質とそれ以外の他のタンパク質とから構築される融合タンパク質の存在、又は、前記融合タンパク質をコードする融合遺伝子の存在、を検出する工程を含む、［１］に記載の検出方法。
［４］前記融合タンパク質が、ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質とＢＲＡＦタンパク質との融合タンパク質である、［１］～［３］のいずれかに記載の検出方法。
［５］前記融合タンパク質が、以下の（ａ）～（ｄ）からなる群から選択されるポリペプチドである、［１］～［４］のいずれかに記載の検出方法：
（ａ）配列番号２（ＰＸＮ－ＢＲＡＦ）又は配列番号４（ＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ）で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、及び
（ｄ）配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
［６］前記ＢＲＡＦ融合遺伝子が、［５］に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである、［１］～［５］のいずれかに記載の検出方法。
［７］前記融合遺伝子が、ＤＮＡ又はｍＲＮＡである、［１］～［６］のいずれかに記載の検出方法。
［８］前記試料が、消化器由来試料である、［１］～［７］のいずれかに記載の検出方法。
［９］前記消化器由来試料が、消化管由来試料である、［８］に記載の検出方法。
［１０］前記消化器由来試料が、下部消化管由来試料である、［８］に記載の検出方法。
［１１］前記消化器由来試料が、大腸由来試料である、［８］に記載の検出方法。
［１２］ＢＲＡＦ遺伝子５’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第１のプローブと、ＢＲＡＦ遺伝子３’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第２のプローブとを含む、ＢＲＡＦ融合遺伝子の検出用キット。
［１３］ＢＲＡＦ遺伝子と共にＢＲＡＦ融合遺伝子を構成する他の遺伝子の５’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第１のプローブと、ＢＲＡＦ遺伝子３’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第２のプローブとを含む、ＢＲＡＦ融合遺伝子の検出用キット。
［１４］ＢＲＡＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドの、５’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマー、ならびに、前記ポリヌクレオチドの３’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、ＢＲＡＦ融合遺伝子の検出用キット。
［１５］ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質とＢＲＡＦタンパク質との融合タンパク質であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、ＰＸＮ－ＢＲＡＦ又はＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合遺伝子の検出用キット。
［１６］以下の（ａ）～（ｄ）からなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、ＰＸＮ－ＢＲＡＦ又はＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合遺伝子の検出用キット：
（ａ）配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、及び
（ｄ）配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
［１７］ＢＲＡＦタンパク質のＮ末端側領域を特異的に認識できる抗ＢＲＡＦ抗体、及び、ＢＲＡＦタンパク質のＣ末端側領域を特異的に認識できる抗ＢＲＡＦ抗体を含む、ＢＲＡＦ融合タンパク質の検出用キット。
［１８］ＢＲＡＦタンパク質と共にＢＲＡＦ融合タンパク質を構成する他のタンパク質のＮ末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体と、ＢＲＡＦタンパク質のＣ末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体を含む、ＢＲＡＦ融合タンパク質の検出用キット。
［１９］前記他のタンパク質が、ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質である、［１８］に記載のキット。
［２０］ＢＲＡＦタンパク質をコードするポリヌクレオチド部分から設計されるアンチセンスプライマー及びＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質をコードするポリヌクレオチド部分から設計されるセンスプライマーを含む、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子とＢＲＡＦ遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、アンチセンスプライマーは［１６］に記載のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でアニールする核酸分子からなり、センスプライマーは［１６］に記載のポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件でアニールする核酸分子からなるプライマーセット。
［２１］ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子とＢＲＡＦ遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、配列番号１又は配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でアニールする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でアニールする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット。
［２２］以下の（ａ）～（ｂ）からなる群から選択される、センスプライマー及びアンチセンスプライマー、を含む、プライマーセット：
（ａ）配列番号１の塩基番号１から９６２の間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー、及び配列番号１の塩基番号９６３から２０６７の間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマー、及び、
（ｂ）配列番号３の塩基番号１から３７２の間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー、及び配列番号３の塩基番号３７３から１６５１の間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマー。
［２３］（１）［５］に記載のポリペプチド、又は前記ポリペプチドを発現している細胞に試験物質を接触させる工程、
（２）前記ポリペプチドの活性及び／又は発現が阻害されるか否かを分析する工程、及び
（３）前記ポリペプチドの活性及び／又は発現を阻害する物質を選択する工程
を含む、前記ポリペプチドの活性及び／又は発現を阻害する物質をスクリーニングする方法。
［２４］前記ポリペプチドの活性及び／又は発現を阻害する物質が、ＢＲＡＦ融合体陽性のがんの治療剤である、［２３］に記載のスクリーニング方法。
［２５］前記がんが、消化器がんである、［２４］に記載のスクリーニング方法。
［２６］前記がんが、消化管がんである、［２５］に記載のスクリーニング方法。
［２７］前記がんが、下部消化管がんである、［２５］に記載のスクリーニング方法。
［２８］前記がんが、大腸がんである、［２５］に記載のスクリーニング方法。
［２９］ＢＲＡＦ融合タンパク質の活性及び／又は発現を阻害する物質を含有する、ＢＲＡＦ融合体陽性のがんの治療用医薬組成物。
［３０］前記ＢＲＡＦ融合タンパク質の活性及び／又は発現を阻害する物質が、キナーゼ阻害剤である、［２９］に記載の医薬組成物。
［３１］前記ＢＲＡＦ融合タンパク質が、［５］に記載のポリペプチドである、［２９］又は［３０］に記載の医薬組成物。
［３２］前記がんが、消化器がんである、［２９］～［３１］のいずれかに記載の医薬組成物。
［３３］前記がんが、消化管がんである、［３２］に記載の医薬組成物。
［３４］前記がんが、下部消化管がんである、［３２］に記載の医薬組成物。
［３５］前記がんが、大腸がんである、［３２］に記載の医薬組成物。
［３６］ＢＲＡＦ融合タンパク質。
［３７］ＰＸＮ又はＧＭＤＳとＢＲＡＦとの融合タンパク質。
［３８］以下の（ａ）～（ｄ）からなる群から選択されるポリペプチドである、［３６］に記載の融合タンパク質：
（ａ）配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、及び
（ｄ）配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
［３９］［３６］～［３８］のいずれかに記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［４０］［３９］に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
［４１］［４０］に記載のベクターで形質転換された細胞。
［４２］被験者から得た試料中の、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質又は該融合タンパク質をコードする融合遺伝子の検出方法。
［４３］前記検出方法が、ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質の切断、又は、ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質をコードする遺伝子の切断、を検出する工程を含む、［４２］に記載の検出方法。
［４４］前記検出方法が、ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質とそれ以外の他のタンパク質とから構築される融合タンパク質の存在、又は、前記融合タンパク質をコードする融合遺伝子の存在、を検出する工程を含む、［４２］に記載の検出方法。
［４５］前記融合タンパク質が、ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質とＢＲＡＦタンパク質との融合タンパク質である、［４２］～［４４］のいずれかに記載の検出方法。
［４６］前記融合タンパク質が、以下の（ａ）～（ｄ）からなる群から選択されるポリペプチドである、［４２］～［４５］のいずれかに記載の検出方法：
（ａ）配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、及び
（ｄ）配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
［４７］前記ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子が、［４６］に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである、［４２］～［４６］のいずれかに記載の検出方法。
［４８］前記融合遺伝子が、ＤＮＡ又はｍＲＮＡである、［４２］～［４７］のいずれかに記載の検出方法。
［４９］前記試料が消化器由来試料である、［４２］～［４８］のいずれかに記載の検出方法。
［５０］前記消化器由来試料が、消化管由来試料である、［４９］に記載の検出方法。
［５１］前記消化器由来試料が、下部消化管由来試料である、［４９］に記載の検出方法。
［５２］前記消化器由来試料が、大腸由来試料である、［４９］に記載の検出方法。
［５３］ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子５’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第１のプローブと、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子３’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第２のプローブとを含む、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子の検出用キット。
［５４］ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子と共にＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子を構成する他の遺伝子の３’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第１のプローブと、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子５’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第２のプローブとを含む、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子の検出用キット。
［５５］ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質をコードするポリヌクレオチドの、５’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマー、ならびに、前記ポリヌクレオチドの３’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子の検出用キット。
［５６］ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質とＢＲＡＦタンパク質との融合タンパク質であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、ＰＸＮ－ＢＲＡＦ又はＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合遺伝子の検出用キット。
［５７］以下の（ａ）～（ｄ）からなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、ＰＸＮ－ＢＲＡＦ又はＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合遺伝子の検出用キット：
（ａ）配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、及び
（ｄ）配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
［５８］ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質のＮ末端側領域を特異的に認識できる抗ＰＸＮ又はＧＭＤＳ抗体、及び、ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質のＣ末端側領域を特異的に認識できる抗ＰＸＮ又はＧＭＤＳ抗体を含む、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質の検出用キット。
［５９］ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質と共にＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質を構成する他のタンパク質のＣ末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体と、ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質のＮ末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体を含む、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質の検出用キット。
［６０］前記他のタンパク質が、ＢＲＡＦタンパク質である、［５９］に記載のキット。
［６１］ＢＲＡＦタンパク質をコードするポリヌクレオチド部分から設計されるアンチセンスプライマー及びＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質をコードするポリヌクレオチド部分から設計されるセンスプライマーを含む、ＢＲＡＦ遺伝子とＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、アンチセンスプライマーは［５７］に記載のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でアニールする核酸分子からなり、センスプライマーは［５７］に記載のポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件でアニールする核酸分子からなるプライマーセット。
［６２］ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子とＢＲＡＦ遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、配列番号１又は配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でアニールする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でアニールする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット。
［６３］以下の（ａ）～（ｂ）からなる群から選択される、センスプライマー及びアンチセンスプライマー、を含む、プライマーセット：
（ａ）配列番号１の塩基番号１から９６２の間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー、及び配列番号１の塩基番号９６３から２０６７の間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマー、及び、
（ｂ）配列番号３の塩基番号１から３７２の間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー、及び配列番号３の塩基番号３７３から１６５１の間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマー。
［６４］（１）［４６］に記載のポリペプチド、又は前記ポリペプチドを発現している細胞に試験物質を接触させる工程、
（２）前記ポリペプチドの活性及び／又は発現が阻害されるか否かを分析する工程、及び
（３）前記ポリペプチドの活性及び／又は発現を阻害する物質を選択する工程
を含む、前記ポリペプチドの活性及び／又は発現を阻害する物質をスクリーニングする方法。
［６５］前記ポリペプチドの活性及び／又は発現を阻害する物質が、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合体陽性のがんの治療剤である、［６４］に記載のスクリーニング方法。
［６６］前記がんが、消化器がんである、［６５］に記載のスクリーニング方法。
［６７］前記がんが、消化管がんである、［６６］に記載のスクリーニング方法。
［６８］前記がんが、下部消化管がんである、［６６］に記載のスクリーニング方法。
［６９］前記がんが、大腸がんである、［６６］に記載のスクリーニング方法。
［７０］ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質の活性及び／又は発現を阻害する物質を含有する、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合体陽性のがんの治療用医薬組成物。
［７１］前記ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質の活性及び／又は発現を阻害する物質が、キナーゼ阻害剤である、［７０］に記載の医薬組成物。
［７２］前記ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質が、［４６］に記載のポリペプチドである、［７０］又は［７１］に記載の医薬組成物。
［７３］前記がんが、消化器がんである、［７０］～［７２］のいずれかに記載の医薬組成物。
［７４］前記がんが、消化管がんである、［７３］に記載の医薬組成物。
［７５］前記がんが、下部消化管がんである、［７３］に記載の医薬組成物。
［７６］前記がんが、大腸がんである、［７３］に記載の医薬組成物。
［７７］ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質。
［７８］ＰＸＮ又はＧＭＤＳとＢＲＡＦとの融合タンパク質。
［７９］以下の（ａ）～（ｄ）からなる群から選択されるポリペプチドである、［７７］に記載の融合タンパク質：
（ａ）配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、及び
（ｄ）配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
［８０］［７７］～［７９］のいずれかに記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［８１］［８０］に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
［８２］［８１］に記載のベクターで形質転換された細胞。
［８３］ＢＲＡＦ融合タンパク質の活性及び／又は発現を阻害する物質が、キナーゼ阻害剤である、ＢＲＡＦ融合体陽性のがんの治療方法。
［８４］ＢＲＡＦ融合タンパク質の活性及び／又は発現を阻害する物質の、ＢＲＡＦ融合体陽性のがんの治療用医薬組成物の製造への使用。
［８５］ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質の活性及び／又は発現を阻害する物質が、キナーゼ阻害剤である、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合体陽性のがんの治療方法。
［８６］ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質の活性及び／又は発現を阻害する物質の、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合体陽性のがんの治療用医薬組成物の製造への使用。

【発明の効果】

【0009】

本発明の検出方法は、ＢＲＡＦ融合体陽性のがん（特に消化器がん）を検出する方法として利用できる。また、本発明の検出方法によれば、被験者におけるＢＲＡＦ融合体陽性のがんを診断することができ、更に、ＢＲＡＦ阻害物質の適用対象者であるか否かを判定することができる。本発明の検出用キット及びプライマーセットは、本発明の検出方法に用いることができる。更に、本発明の阻害物質スクリーニング方法によれば、当該融合体陽性のがん患者の治療に有効な物質をスクリーニングすることができる。前記スクリーニング方法により得られた物質は、ＢＲＡＦ融合体陽性のがんの治療用医薬組成物の有効成分として使用することができ、また、ＢＲＡＦ融合体陽性のがんの治療に用いることができる。
本発明の検出方法は、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合体陽性のがん（特に消化器がん）を検出する方法として利用できる。また、本発明の検出方法によれば、被験者におけるＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合体陽性のがんを診断することができ、更に、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ阻害物質の適用対象者であるか否かを判定することができる。本発明の検出用キット及びプライマーセットは、本発明の検出方法に用いることができる。更に、本発明の阻害物質スクリーニング方法によれば、当該融合体陽性のがん患者の治療に有効な物質をスクリーニングすることができる。前記スクリーニング方法により得られた物質は、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合体陽性のがんの治療用医薬組成物の有効成分として使用することができ、また、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合体陽性のがんの治療に用いることができる。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】ＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞に融合遺伝子ＰＸＮ－ＢＲＡＦを導入し、７日間培養後の状態を示す、図面に代わる顕微鏡写真である。

【図2】ＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞に融合遺伝子ＧＭＤＳ－ＢＲＡＦを導入し、７日間培養後の状態を示す、図面に代わる顕微鏡写真である。

【図3】融合遺伝子ＰＸＮ－ＢＲＡＦ又はＧＭＤＳ－ＢＲＡＦを導入した３Ｔ３繊維芽細胞を皮下に接種したヌードマウスにおける、接種後１乃至８日後の腫瘍サイズの経時的変化を示すグラフである。

【図4】ＰＸＮ－ＢＲＡＦ又はＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合ポリペプチドを発現するＢａ／Ｆ３細胞におけるＢＲＡＦ阻害剤（trametinib）に対する感受性を示すグラフである。

【図5】ＰＸＮ－ＢＲＡＦ又はＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合ポリペプチドを発現するＢａ／Ｆ３細胞をＢＲＡＦ阻害剤で処理した後、各培養細胞由来の抽出物のウェスタンブロッティングを実施した結果を示す、図面に代わる写真である。

【発明を実施するための形態】

【0011】

≪定義等≫
＜融合点＞
本明細書における「ＢＲＡＦ融合遺伝子における融合点」とは、ＢＲＡＦ融合遺伝子における、ＢＲＡＦ遺伝子由来のポリヌクレオチドと、ＢＲＡＦ遺伝子と共に融合遺伝子を構築する他の遺伝子由来のポリヌクレオチドとが結合した箇所を意味する。
本明細書における「ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子における融合点」とは、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子における、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子由来のポリヌクレオチドと、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子と共に融合遺伝子を構築する他の遺伝子由来のポリヌクレオチドとが結合した箇所を意味する。

【0012】

例えば、ＢＲＡＦ融合遺伝子、あるいは、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子が、配列番号１で表されるＰＸＮ－ＢＲＡＦ融合遺伝子（ＰＸＮｅｘ６－ＢＲＡＦｅｘ１１）の場合、前記融合点とは、ＰＸＮ遺伝子由来のポリヌクレオチドの３’末端の塩基（第９６２番）と、ＢＲＡＦ遺伝子由来のポリヌクレオチドの５’末端の塩基（第９６３番）との結合した箇所（第９６２／９６３番）である。
また、ＢＲＡＦ融合遺伝子、あるいは、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子が、配列番号３で表されるＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合遺伝子（ＧＭＤＳｅｘ１－ＢＲＡＦｅｘ９）の場合、前記融合点とは、ＧＭＤＳ遺伝子由来のポリヌクレオチドの３’末端の塩基（第３７２番）と、ＢＲＡＦ遺伝子由来のポリヌクレオチドの５’末端の塩基（第３７３番）との結合した箇所（第３７２／３７３番）である。

【0013】

本明細書における「ＢＲＡＦ融合タンパク質における融合点」とは、ＢＲＡＦ融合タンパク質における、ＢＲＡＦ遺伝子由来のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドと、ＢＲＡＦ遺伝子と共に融合遺伝子を構築する他の遺伝子由来のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドとが結合した箇所を意味する。
本明細書における「ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質における融合点」とは、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質における、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子由来のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドと、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子と共に融合遺伝子を構築する他の遺伝子由来のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドとが結合した箇所を意味する。

【0014】

例えば、ＢＲＡＦ融合タンパク質、あるいは、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質が、配列番号２で表されるＰＸＮ－ＢＲＡＦ融合タンパク質の場合、前記融合点とは、ＰＸＮタンパク質由来のポリペプチドのＣ末端のアミノ酸（第２７７番）と、ＢＲＡＦタンパク質由来のポリペプチドのＮ末端のアミノ酸（第２７８番）との結合した箇所（第２７７／２７８番）である。
また、ＢＲＡＦ融合タンパク質、あるいは、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質が、配列番号４で表されるＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合タンパク質の場合、前記融合点とは、ＧＭＤＳタンパク質由来のポリペプチドのＣ末端のアミノ酸（第３４番）と、ＢＲＡＦタンパク質由来のポリペプチドのＮ末端のアミノ酸（第３５番）との結合した箇所（第３４／３５番）である。

【0015】

＜ＢＲＡＦ遺伝子又はＢＲＡＦタンパク質の切断＞
更に、本明細書において、「ＢＲＡＦ遺伝子の切断」又は「ＢＲＡＦ遺伝子が切断されている」とは、遺伝子の転座又は逆位等によりＢＲＡＦ遺伝子の連続性が失われている状態、すなわち、ＢＲＡＦ遺伝子がＢＲＡＦキナーゼ領域を含むポリヌクレオチドと、それ以外のポリヌクレオチドと、の少なくとも２つのポリヌクレオチドとに分かれている状態を指す。なお、ＢＲＡＦ遺伝子の切断点（break point）は、ＢＲＡＦ遺伝子が切断されてできたポリヌクレオチドの少なくとも一つがコードするタンパク質がＢＲＡＦキナーゼ活性を保持する範囲で限定されない。
また、「ＢＲＡＦ遺伝子以外の他の遺伝子の切断」又は「ＢＲＡＦ遺伝子以外の他の遺伝子が切断されている」とは、遺伝子の転座又は逆位等により他の遺伝子の連続性が失われている状態、すなわち、他の遺伝子が少なくとも２つのポリヌクレオチドに分かれている状態を指す。

【0016】

また、本明細書において、「ＢＲＡＦタンパク質の切断」又は「ＢＲＡＦタンパク質が切断されている」とは、ＢＲＡＦ遺伝子が、前述のように切断されている状態であることに基づき、ＢＲＡＦタンパク質の連続性が失われている状態、すなわち、ＢＲＡＦタンパク質がＢＲＡＦキナーゼ領域を含むポリペプチドと、それ以外のポリペプチドと、の少なくとも２つのポリペプチドに分かれている状態を指す。なお、ＢＲＡＦタンパク質の切断点は、ＢＲＡＦタンパク質が切断されてできたポリペプチドの少なくとも一つがＢＲＡＦキナーゼ活性を保持する範囲で限定されない。
また、「ＢＲＡＦタンパク質以外の他のタンパク質の切断」又は「ＢＲＡＦタンパク質以外の他のタンパク質が切断されている」とは、他の遺伝子が、前述のように切断されている状態であることに基づき、他のタンパク質の連続性が失われている状態、すなわち、他のタンパク質が少なくとも２つのポリペプチドに分かれている状態を指す。

【0017】

＜ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子又はＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質の切断＞
更に、本明細書において、「ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子の切断」又は「ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子が切断されている」とは、遺伝子の転座又は逆位等によりＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子の連続性が失われている状態を指す。なお、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子の切断点（break point）は、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子と共にＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子を構築する他の遺伝子がコードするタンパク質の機能（例えば、当該タンパク質がキナーゼドメインを有する場合、キナーゼ活性）を保持する範囲で限定されない。
また、「ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子以外の他の遺伝子の切断」又は「ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子以外の他の遺伝子が切断されている」とは、遺伝子の転座又は逆位等により他の遺伝子の連続性が失われている状態、すなわち、他の遺伝子が少なくとも２つのポリヌクレオチドに分かれている状態を指す。

【0018】

また、本明細書において、「ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質の切断」又は「ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質が切断されている」とは、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子が、前述のように切断されている状態であることに基づき、ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質の連続性が失われている状態、すなわち、ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質が少なくとも２つのポリペプチドに分かれている状態を指す。なお、ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質の切断点は、ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質と共にＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質を構築する他のタンパク質の機能（例えば、当該他のタンパク質がキナーゼドメインを有する場合、キナーゼ活性）を保持する範囲で限定されない。
また、「ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質以外の他のタンパク質の切断」又は「ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質以外の他のタンパク質が切断されている」とは、他の遺伝子が、前述のように切断されている状態であることに基づき、他のタンパク質の連続性が失われている状態、すなわち、他のタンパク質が少なくとも２つのポリペプチドに分かれている状態を指す。

【0019】

＜５’末端側領域／３’末端側領域、Ｎ末端側領域／Ｃ末端側領域＞
５’末端側領域とは、融合遺伝子の場合は、融合点より５’末端側のポリヌクレオチド、野生型遺伝子（融合遺伝子でない遺伝子）の場合は、当該野生型遺伝子が融合遺伝子を構築した場合の、切断点より５’末端側のポリヌクレオチドを示す。なお、５’末端側領域は、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、及びｃＤＮＡのいずれにおける領域であってもよく、例えば、ゲノムＤＮＡの場合は、５’末端側ゲノム領域ともいう。
３’末端側領域とは、融合遺伝子の場合は、融合点より３’末端側のポリヌクレオチド、野生型遺伝子（融合遺伝子でない遺伝子）の場合は、当該野生型遺伝子が融合遺伝子を構築した場合の、切断点より３’末端側のポリヌクレオチドを示す。なお、３’末端側領域は、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、及びｃＤＮＡのいずれにおける領域であってもよく、例えば、ゲノムＤＮＡの場合は、３’末端側ゲノム領域ともいう。

【0020】

Ｎ末端側領域とは、融合タンパク質の場合は、融合点よりＮ末端側のポリペプチド、野生型タンパク質（融合タンパク質でないタンパク質）の場合は、当該野生型タンパク質が融合遺伝子を構築した場合の、切断点よりＮ末端側のポリヌクレオチドを示す。
Ｃ末端側領域とは、融合タンパク質の場合は、融合点よりＣ末端側のポリペプチド、野生型タンパク質（融合タンパク質でないタンパク質）の場合は、当該野生型タンパク質が融合遺伝子を構築した場合の、切断点よりＣ末端側のポリヌクレオチドを示す。

【0021】

例えば、配列番号１で表されるＰＸＮ－ＢＲＡＦ融合遺伝子（ＰＸＮｅｘ６－ＢＲＡＦｅｘ１１）の場合、５’末端側領域は、第１～第９６２番、３’末端側領域は、第９６３～２０６７番の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。配列番号２で表されるＰＸＮ－ＢＲＡＦ融合タンパク質の場合、Ｎ末端側領域は、前記ＰＸＮｅｘ６－ＢＲＡＦｅｘ１１の５’末端側領域のＣＤＳ（配列番号１の第１３２～９６２番塩基）にコードされるポリペプチド（配列番号２の第１～２７７番アミノ酸）であり、Ｃ末端側領域は、前記ＰＸＮｅｘ６－ＢＲＡＦｅｘ１１の３’末端側領域のＣＤＳ（配列番号１の第９６３～１９４９番塩基）にコードされるポリペプチド（配列番号２の第２７８～６０５番アミノ酸）である。

【0022】

配列番号３で表されるＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合遺伝子（ＧＭＤＳｅｘ１－ＢＲＡＦｅｘ９）の場合、５’末端側領域は、第１～第３７２番、３’末端側領域は、第３７３～１６５１番の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。配列番号４で表されるＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合タンパク質の場合、Ｎ末端側領域は、前記ＧＭＤＳｅｘ１－ＢＲＡＦｅｘ９の５’末端側領域のＣＤＳ（配列番号３の第２７１～３７２番塩基）にコードされるポリペプチド（配列番号４の第１～３４番アミノ酸）であり、Ｃ末端側領域は、前記ＧＭＤＳｅｘ１－ＢＲＡＦｅｘ９の３’末端側領域のＣＤＳ（配列番号３の第３７３～１５３３番塩基）にコードされるポリペプチド（配列番号４の第３５～４２０番アミノ酸）である。

【0023】

＜ｃＤＮＡリファレンス配列＞
また、本明細書において、各由来遺伝子のｃＤＮＡリファレンス配列として、ＢＲＡＦはENST00000288602、ＰＸＮはENST00000267257、ＧＭＤＳはENST00000380815を、タンパク質のアミノ酸リファレンス配列としては、ＢＲＡＦはENSP00000288602、ＰＸＮはENSP00000267257、ＧＭＤＳはENSP00000370194を用いた。

【0024】

＜ストリンジェントな条件＞
本明細書における「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションのための条件として、「５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍＬ鮭精子ＤＮＡ、４２℃オーバーナイト」、洗浄のための条件として、「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」の条件である。「よりストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションのための条件として、「５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍＬ鮭精子ＤＮＡ、４２℃オーバーナイト」、洗浄のための条件として、「０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」の条件である。

【0025】

＜腫瘍形成能＞
あるポリペプチドが「腫瘍形成能を有する」ことは、公知の方法、例えば、ＷＯ２０１１／１６２２９５の実施例４の方法、あるいは、後述の実施例６の方法で確認することができる。具体的には、当該ポリペプチドを発現するプラスミドを導入した宿主（３Ｔ３繊維芽細胞）をヌードマウスの皮下に接種し、腫瘍形成の有無で判断する方法で確認する。

【0026】

≪本発明の検出方法に係る試料≫
＜対象臓器＞
本発明に係る検出方法は、対象臓器に生じるがんの検出に好適に用いることができる。被験者の被験部位（対象臓器）としては、本発明に係る融合体が存在している範囲で限定されないが、消化器が好ましく、消化管がより好ましく、胃腸が更に好ましく、下部消化管が更に好ましく、大腸が特に好ましい。
被験部位の組織型は、本発明に係る検出方法が適用可能な範囲で制限されず、扁平上皮組織でも、腺組織でもよいが、扁平上皮組織が好ましい。

【0027】

＜被験者からの採取物＞
本発明に係る検出方法における、被験者から得た試料としては、被験者からの採取物（生体から分離した試料）、具体的には、任意の採取された体液（好ましくは血液）、被験者患部からの摘出検体、生検試料又は擦過検体、糞便、尿、消化管洗浄液等を用いることができる。前記消化管洗浄液は、消化管全体の洗浄液であっても、あるいは、少なくとも被験部位を含む消化管の洗浄液、例えば、下部消化管の洗浄液、大腸の洗浄液であってもよい。検出感度を考慮すると、前記対象臓器における被験部位の細胞が含まれる試料が好ましく、被験者の被験部位からの摘出検体又は生検試料が更に好ましい。

【0028】

＜採取物の調製＞
本発明に係るＢＲＡＦ融合遺伝子、又は、ＢＲＡＦ融合タンパク質の検出方法は、被験者から得た試料の組織切片、又は、細胞懸濁液等を作成し、組織切片又は細胞懸濁液に含まれる細胞に対し、当業者に周知の技法により、ＢＲＡＦ融合遺伝子、又は、ＢＲＡＦ融合タンパク質を検出することにより実施できる。あるいは、前述の被験者から得た試料から、可溶化液を調製し、ここに含まれる遺伝子、又は、タンパク質を抽出し、この抽出試料において、当業者に周知の技法により、ＢＲＡＦ融合遺伝子、又は、ＢＲＡＦ融合タンパク質を検出してもよい。なお、ＢＲＡＦ融合遺伝子の検出とは、ＢＲＡＦ融合遺伝子のゲノムＤＮＡの検出、当該ゲノムＤＮＡの転写産物であるｍＲＮＡ、又は、ｍＲＮＡを鋳型として得られるｃＤＮＡの検出のいずれであってもよい。

【0029】

本発明に係るＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子、又は、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質の検出方法は、被験者から得た試料の組織切片、又は、細胞懸濁液等を作成し、組織切片又は細胞懸濁液に含まれる細胞に対し、当業者に周知の技法により、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子、又は、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質を検出することにより実施できる。あるいは、前述の被験者から得た試料から、可溶化液を調製し、ここに含まれる遺伝子、又は、タンパク質を抽出し、この抽出試料において、当業者に周知の技法により、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子、又は、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質を検出してもよい。なお、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子の検出とは、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子のゲノムＤＮＡの検出、当該ゲノムＤＮＡの転写産物であるｍＲＮＡ、又は、ｍＲＮＡを鋳型として得られるｃＤＮＡの検出のいずれであってもよい。

【0030】

≪本発明の検出方法に係る検出対象≫
本発明の検出方法には、被験者から得た試料中の、ＢＲＡＦ融合体の検出方法、すなわち、ＢＲＡＦキナーゼ領域を含む融合タンパク質（「ＢＲＡＦ融合タンパク質」ともいう）の検出方法、又は、前記融合タンパク質をコードする融合遺伝子（「ＢＲＡＦ融合遺伝子」ともいう）の検出方法が含まれる。
本発明の検出方法には、被験者から得た試料中の、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合体の検出方法、すなわち、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質の検出方法、又は、前記融合タンパク質をコードする融合遺伝子（「ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子」ともいう）の検出方法が含まれる。

【0031】

＜ＢＲＡＦ融合体：ＢＲＡＦ融合タンパク質とＢＲＡＦ融合遺伝子＞
本発明に係るＢＲＡＦ融合体は、ＢＲＡＦ融合タンパク質とＢＲＡＦ融合遺伝子を含む。
本発明に係るＢＲＡＦ融合タンパク質は、ＢＲＡＦタンパク質由来のポリペプチドと、ＢＲＡＦタンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドと、から構築される融合ポリペプチドであって、前記ＢＲＡＦタンパク質由来のポリペプチドは、ＢＲＡＦタンパク質における少なくともＢＲＡＦキナーゼ領域のポリペプチドを含み、ＢＲＡＦタンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドは、他のタンパク質における少なくとも一部のポリペプチドを含む範囲で特に制限されない。

【0032】

前記他のタンパク質としては、ＢＲＡＦキナーゼドメインを含むＢＲＡＦタンパク質の一部と融合することにより、構築されたＢＲＡＦ融合タンパク質が腫瘍形成能を有するものであれば特に制限されない。構築されたＢＲＡＦ融合タンパク質において、ＢＲＡＦキナーゼ活性化が恒常的に維持されることにより、ＢＲＡＦ融合タンパク質が腫瘍形成能を有することが好ましい。

【0033】

また、ＢＲＡＦ融合タンパク質は、ＢＲＡＦキナーゼ活性化が恒常的に維持され、構築されたＢＲＡＦ融合タンパク質が腫瘍形成能を有する範囲で、ＢＲＡＦタンパク質由来のポリペプチド、及び、ＢＲＡＦタンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドのいずれでもない、第３のポリペプチドを含んでいてもよい。第３のポリペプチドは、ＢＲＡＦ融合タンパク質のＮ末端に位置していても、Ｃ末端に位置していても、或いは、ＢＲＡＦタンパク質由来のポリペプチドとＢＲＡＦタンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドとの間に位置していてもよい。

【0034】

ＢＲＡＦ融合タンパク質としては、前記他のタンパク質が、ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質である融合タンパク質が特に好ましい。すなわち、少なくともＢＲＡＦキナーゼ領域のポリペプチドを含む、ＢＲＡＦタンパク質由来のポリペプチドと、ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質の少なくとも一部のポリペプチドを含む、ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質由来のポリペプチドと、から構築された、ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質とＢＲＡＦタンパク質との融合タンパク質（以下、ＰＸＮ－ＢＲＡＦ融合タンパク質又はＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合タンパク質、あるいは、ＰＸＮ－ＢＲＡＦ又はＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合タンパク質、あるいは、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合タンパク質ともいう）であることが好ましい。

【0035】

＜ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合体：ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質とＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子＞
本発明に係るＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合体は、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質とＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子を含む。
本発明に係るＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質は、ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質由来のポリペプチドと、ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドと、から構築される融合ポリペプチドであって、前記ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質由来のポリペプチドは、ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質における少なくとも一部のポリペプチドを含み、ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドは、他のタンパク質における少なくとも一部のポリペプチドを含む範囲で特に制限されない。

【0036】

前記他のタンパク質としては、ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質の一部と融合することにより、構築されたＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質が腫瘍形成能を有するものであれば特に制限されない。当該他のタンパク質の有する機能性ドメイン（好ましくは、キナーゼドメイン）の活性化が恒常的に維持されることにより、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質が腫瘍形成能を有することが好ましい。

【0037】

また、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質は、ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質の一部と融合することによりＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質以外の他のタンパク質の機能性ドメインの活性化が恒常的に維持され、構築されたＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質が腫瘍形成能を有する範囲で、ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質由来のポリペプチド、及び、ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドのいずれでもない、第３のポリペプチドを含んでいてもよい。第３のポリペプチドは、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質のＮ末端に位置していても、Ｃ末端に位置していても、或いは、ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質由来のポリペプチドとＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドとの間に位置していてもよい。

【0038】

ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質としては、前記他のタンパク質が、ＢＲＡＦタンパク質である融合タンパク質が特に好ましい。すなわち、ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質の少なくとも一部のポリペプチドを含む、ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質由来のポリペプチドと、少なくともＢＲＡＦキナーゼ領域のポリペプチドを含む、ＢＲＡＦタンパク質の少なくとも一部のポリペプチドと、から構築された、ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質とＢＲＡＦタンパク質との融合タンパク質（以下、ＰＸＮ－ＢＲＡＦ融合タンパク質又はＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合タンパク質、あるいは、ＰＸＮ－ＢＲＡＦ又はＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合タンパク質、あるいは、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合タンパク質ともいう）であることが好ましい。

【0039】

「ＰＸＮ又はＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合タンパク質」としては、下記（ａ）～（ｄ）に記載のポリペプチドが特に好ましい：
（ａ）配列番号２（ＰＸＮ－ＢＲＡＦ）又は配列番号４（ＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ）で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド（以下、相同ポリペプチドと称する）、及び
（ｄ）配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド（以下、機能的等価改変体と称する）。

【0040】

配列番号２で表されるアミノ酸配列は、配列番号１で表される塩基配列、特には配列番号１の塩基番号１３２～１９４９で表される塩基配列（ＣＤＳ）によりコードされる配列である。配列番号１で表される塩基配列は、ＰＸＮ遺伝子の５’－ＵＴＲ配列、ＰＸＮ遺伝子の開始コドンＡＴＧからエクソン６まで、ＢＲＡＦ遺伝子のエクソン１１からエクソン１８の停止コドンまで、及びＢＲＡＦ遺伝子の３’－ＵＴＲ配列の塩基配列からなる。配列番号１で表される塩基配列の内、塩基番号１～９６２の配列はＰＸＮ遺伝子に由来し、塩基番号９６３～２０６７の配列はＢＲＡＦ遺伝子に由来する。本明細書において、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び、これをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド（配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む）を、ＰＸＮｅｘ６－ＢＲＡＦｅｘ１１融合体（または、ＰＸＮｅｘ６－ＢＲＡＦｅｘ１１という場合もある）と称する。

【0041】

配列番号４で表されるアミノ酸配列は、配列番号３で表される塩基配列、特には配列番号３の塩基番号２７１～１５３３で表される塩基配列（ＣＤＳ）によりコードされる配列である。配列番号３で表される塩基配列は、ＧＭＤＳ遺伝子の５’－ＵＴＲ配列、ＧＭＤＳ遺伝子の開始コドンＡＴＧからエクソン１まで、ＢＲＡＦ遺伝子のエクソン９からエクソン１８の停止コドンまで、及びＢＲＡＦ遺伝子の３’－ＵＴＲ配列の塩基配列からなる。配列番号３で表される塩基配列の内、塩基番号１～３７２の配列はＧＭＤＳ遺伝子に由来し、塩基番号３７３～１６５１の配列はＢＲＡＦ遺伝子に由来する。本明細書において、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び、これをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド（配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む）を、ＧＭＤＳｅｘ１－ＢＲＡＦｅｘ９融合体（または、ＧＭＤＳｅｘ１－ＢＲＡＦｅｘ９という場合もある）と称する。

【0042】

「機能的等価改変体」において置換、欠失、及び／又は挿入可能なアミノ酸数は、１～数個であるが、好ましくは１～１０個、更に好ましくは１～７個、最も好ましくは１～５個である。

【0043】

「相同ポリペプチド」は、「配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、腫瘍形成能を有するポリペプチド」であるが、該同一性が、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上であるアミノ酸配列を含むポリペプチドが好ましい。なお、「配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、腫瘍形成能を有するポリペプチド」には、前記同一性を示し、且つ、少なくとも１つの置換、欠失、及び／又は挿入（好ましくは置換）を有するポリペプチド（狭義の相同ポリペプチド）と、同一性が１００％であるポリペプチドとが含まれる。

【0044】

なお、本明細書における前記「同一性」とは、ＮＥＥＤＬＥ ｐｒｏｇｒａｍ（J Mol Biol 1970; 48: 443-453）検索によりデフォルトで用意されているパラメータを用いて得られた値Ｉｄｅｎｔｉｔｙを意味する。前記のパラメータは以下のとおりである。
Ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ ＝ １０
Ｅｘｔｅｎｄ ｐｅｎａｌｔｙ ＝ ０．５
Ｍａｔｒｉｘ ＝ ＥＢＬＯＳＵＭ６２

【0045】

本発明に係るＢＲＡＦ融合遺伝子は、ＢＲＡＦ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドである。本明細書において、ＢＲＡＦ融合タンパク質およびＢＲＡＦ融合遺伝子をあわせて「ＢＲＡＦ融合体」と称することがある。

【0046】

本発明に係るＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子は、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドである。すなわち、ＰＸＮ融合遺伝子は、ＰＸＮ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、ＧＭＤＳ融合遺伝子は、ＧＭＤＳ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドである。本明細書において、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質およびＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子をあわせて「ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合体」と称することがある。

【0047】

本発明に係るＢＲＡＦ融合体においては、ＰＸＮｅｘ６－ＢＲＡＦｅｘ１１融合体バリアント、又はＧＭＤＳｅｘ１－ＢＲＡＦｅｘ９融合体バリアントが好ましい。特に、本発明に係るＢＲＡＦ融合タンパク質においては、ＰＸＮｅｘ６－ＢＲＡＦｅｘ１１融合タンパク質バリアント、又はＧＭＤＳｅｘ１－ＢＲＡＦｅｘ９融合タンパク質バリアントが好ましい。また、本発明に係るＢＲＡＦ融合遺伝子においては、ＰＸＮｅｘ６－ＢＲＡＦｅｘ１１融合遺伝子バリアント、又はＧＭＤＳｅｘ１－ＢＲＡＦｅｘ９融合遺伝子バリアントが好ましい。

【0048】

本発明に係るＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合体においては、ＰＸＮｅｘ６－ＢＲＡＦｅｘ１１融合体バリアント、又はＧＭＤＳｅｘ１－ＢＲＡＦｅｘ９融合体バリアントが好ましい。特に、本発明に係るＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質においては、ＰＸＮｅｘ６－ＢＲＡＦｅｘ１１融合タンパク質バリアント、又はＧＭＤＳｅｘ１－ＢＲＡＦｅｘ９融合タンパク質バリアントが好ましい。また、本発明に係るＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子においては、ＰＸＮｅｘ６－ＢＲＡＦｅｘ１１融合遺伝子バリアント、又はＧＭＤＳｅｘ１－ＢＲＡＦｅｘ９融合遺伝子バリアントが好ましい。

【0049】

≪本発明の検出方法の態様（融合タンパク質及び融合遺伝子の検出方法）≫
本発明の検出方法には、被験者から得た試料中の、ＢＲＡＦタンパク質の切断、又は、ＢＲＡＦタンパク質をコードするＢＲＡＦ遺伝子の切断、を検出する工程を含む検出方法と、被験者から得た試料中の、ＢＲＡＦタンパク質とＢＲＡＦタンパク質以外の他のタンパク質とから構築される融合タンパク質の存在、又は、前記融合タンパク質をコードする融合遺伝子の存在、を検出する工程を含む検出方法が含まれる。
本発明の検出方法には、被験者から得た試料中の、ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質の切断、又は、ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質をコードするＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子の切断、を検出する工程を含む検出方法と、被験者から得た試料中の、ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質とＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質以外の他のタンパク質とから構築される融合タンパク質の存在、又は、前記融合タンパク質をコードする融合遺伝子の存在、を検出する工程を含む検出方法が含まれる。

【0050】

＜ＢＲＡＦ融合遺伝子を検出する態様＞
以下、ＢＲＡＦ融合遺伝子を検出する態様について述べるが、これらに限定されるものではない。
なお、以下の各態様における遺伝子の特定の領域の検出は、その例示に関わらず、あらかじめ解析した塩基配列に基づいて設計されたプローブ又はプライマーを用いて行っても、あるいは、シーケンシングによって行ってもよい。

【0051】

〔ＢＲＡＦ融合遺伝子を検出する態様（１）〕
〈ＢＲＡＦ融合遺伝子を検出する態様（１－ａ）〉
ＢＲＡＦ融合遺伝子を検出する一態様として、ＢＲＡＦ融合遺伝子が構築されているとき、ＢＲＡＦ遺伝子が２つ以上のポリヌクレオチドに切断されていることに基づき、ＢＲＡＦ遺伝子が切断されている状態、すなわち、ＢＲＡＦ遺伝子の５’末端側領域とＢＲＡＦ遺伝子の３’末端側領域との連続性が失われていることを検出することにより、ＢＲＡＦ融合遺伝子を検出することができる。
具体的には、例えば、ＢＲＡＦ遺伝子の５’末端側領域に特異的にハイブリダイズする第１のプローブと、ＢＲＡＦ遺伝子の３’末端側領域に特異的にハイブリダイズする第２のプローブを用い、当該２つの遺伝子領域が染色体上で離れていることを検出することにより、ＢＲＡＦ融合遺伝子を検出することができる。
なお、ＢＲＡＦ遺伝子由来のポリヌクレオチドと融合して融合遺伝子を構築している他の遺伝子が切断されている状態を前記方法で確認することにより、ＢＲＡＦ融合遺伝子を検出してもよい。

【0052】

〈ＢＲＡＦ融合遺伝子を検出する態様（１－ｂ）〉
他の一態様として、ＢＲＡＦ遺伝子の、５’末端側領域と、３’末端側領域の発現量をそれぞれ特異的に検出し、その発現量の比を求めることにより、ＢＲＡＦ融合遺伝子を検出することができる。具体的には、例えば、ＢＲＡＦ遺伝子の５’末端側領域の発現量と、ＢＲＡＦ遺伝子３’末端側領域の発現量とが異なる場合、ＢＲＡＦ融合遺伝子を検出することができる。
あるいは、ＢＲＡＦ遺伝子と共にＢＲＡＦ融合遺伝子を構築しているＢＲＡＦ遺伝子以外の他の遺伝子について、前記方法で確認することにより、ＢＲＡＦ融合遺伝子を検出してもよい。

【0053】

〈ＢＲＡＦ融合遺伝子を検出する態様（１－ｃ）〉
他の一態様として、ＢＲＡＦ融合遺伝子の形成過程において、ＢＲＡＦ遺伝子又はＢＲＡＦ遺伝子以外の他の遺伝子の少なくとも一部の複製（duplication）を伴う場合、すなわち、ＢＲＡＦ遺伝子由来の重複したポリヌクレオチドと、ＢＲＡＦと共にＢＲＡＦ融合遺伝子を構築しているＢＲＡＦ遺伝子以外の他の遺伝子由来の重複したポリヌクレオチドとからＢＲＡＦ融合遺伝子が構築されている場合、ＢＲＡＦ遺伝子由来のポリヌクレオチド又は前記他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの重複を検出することにより、ＢＲＡＦ融合遺伝子を検出することができる。

【0054】

〔ＢＲＡＦ融合遺伝子を検出する態様（２）〕
ＢＲＡＦ融合遺伝子を検出する一態様として、ＢＲＡＦ融合遺伝子が、ＢＲＡＦ遺伝子由来ポリヌクレオチドと、ＢＲＡＦ遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドと融合して構築されていることに基づき、ＢＲＡＦ融合遺伝子における、ＢＲＡＦ遺伝子由来のポリヌクレオチドの少なくとも一部と、ＢＲＡＦ遺伝子以外の遺伝子由来のポリヌクレオチドの少なくとも一部とが連続して含まれる融合ポリヌクレオチドを検出することにより、ＢＲＡＦ融合遺伝子を検出することができる。
具体的には、例えば、ＢＲＡＦ遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの５’末端側領域に特異的にハイブリダイズする第１のプローブと、ＢＲＡＦ遺伝子由来のポリヌクレオチドの３’末端側領域に特異的にハイブリダイズする第２のプローブを用い、当該２つの遺伝子領域が染色体上で近接していることを検出することにより、ＢＲＡＦ融合遺伝子を検出することができる。ＢＲＡＦ遺伝子以外の他の遺伝子が、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子の場合、すなわちＢＲＡＦ融合遺伝子がＰＸＮ又はＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合遺伝子である場合、第１のプローブはＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子由来のポリヌクレオチドの５’末端側領域に特異的にハイブリダイズするプローブを用いればよい。

【0055】

〔ＢＲＡＦ融合遺伝子を検出する態様（３）〕
ＢＲＡＦ融合遺伝子を検出する一態様として、ＢＲＡＦ融合遺伝子が、ＢＲＡＦ遺伝子由来ポリヌクレオチドと、ＢＲＡＦ遺伝子以外の他の遺伝子由来ポリヌクレオチドとが、融合点において融合して構築されていることに基づき、ＢＲＡＦ融合遺伝子における、ＢＲＡＦ遺伝子由来のポリヌクレオチドの少なくとも一部と、ＢＲＡＦ遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの少なくとも一部とが、融合点を含んで連続して含まれる融合ポリヌクレオチドを検出することにより、ＢＲＡＦ融合遺伝子を検出することができる。
具体的には、例えば、ＢＲＡＦ遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの５’末端側領域に特異的にアニールする第１のプライマーと、ＢＲＡＦ遺伝子由来のポリヌクレオチドの３’末端側領域に特異的にアニールする第２のプライマーとを用いてＰＣＲ反応を行い、融合点の存在を示す所定のＰＣＲ産物が得られることを確認することにより、ＢＲＡＦ融合遺伝子を検出することができる。

【0056】

＜ＢＲＡＦ融合タンパク質を検出する態様＞
以下、ＢＲＡＦ融合タンパク質を検出する態様について述べるが、これらに限定されるものではない。

【0057】

〔ＢＲＡＦ融合タンパク質を検出する態様（１）〕
〈ＢＲＡＦ融合タンパク質を検出する態様（１－ａ）〉
ＢＲＡＦ融合タンパク質を検出する態様として、ＢＲＡＦ融合遺伝子が構築されているとき、ＢＲＡＦ遺伝子にコードされるＢＲＡＦタンパク質も切断されていることに基づき、ＢＲＡＦタンパク質が切断されている状態、すなわち、ＢＲＡＦタンパク質のＮ末端側領域とＣ末端側領域との連続性が失われていることを検出することにより、ＢＲＡＦ融合タンパク質を検出することができる。
具体的には、例えば、ＢＲＡＦタンパク質のＮ末端側領域に特異的に結合する第１の抗体と、ＢＲＡＦタンパク質のＣ末端側領域に特異的に結合する第２の抗体を用い、当該２つの領域が、同一のタンパク質に存在しないことを確認することにより、ＢＲＡＦ融合タンパク質を検出することができる。
あるいは、ＢＲＡＦタンパク質と共に融合タンパク質を構築しているＢＲＡＦタンパク質以外の他のタンパク質が切断されている状態を前記方法により確認することで、ＢＲＡＦ融合タンパク質を検出してもよい。

【0058】

〈ＢＲＡＦ融合タンパク質を検出する態様（１－ｂ）〉
他の一態様として、ＢＲＡＦタンパク質の、Ｎ末端側領域と、Ｃ末端側領域の発現量をそれぞれ特異的に検出し、その発現量の比を求めることにより、ＢＲＡＦ融合タンパク質を検出することができる。具体的には、例えば、ＢＲＡＦタンパク質のＮ末端側領域の発現量と、ＢＲＡＦタンパク質Ｃ末端側領域の発現量とが異なることを指標として、ＢＲＡＦ融合タンパク質を検出することができる。
あるいは、ＢＲＡＦタンパク質と共にＢＲＡＦ融合タンパク質を構築しているＢＲＡＦタンパク質以外の他のタンパク質について、前記方法で確認することにより、ＢＲＡＦ融合タンパク質を検出してもよい。

【0059】

〔ＢＲＡＦ融合タンパク質を検出する態様（２）〕
ＢＲＡＦ融合タンパク質を検出する一態様では、ＢＲＡＦ融合タンパク質が、ＢＲＡＦタンパク質由来ポリペプチドと、ＢＲＡＦタンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドとが融合して構築されていることに基づき、ＢＲＡＦ融合タンパク質における、ＢＲＡＦタンパク質由来のポリペプチドの少なくとも一部と、前記他のタンパク質由来のポリペプチドの少なくとも一部が連続して含まれる融合ポリペプチドを検出することにより、ＢＲＡＦ融合タンパク質を検出することができる。
具体的には、例えば、ＢＲＡＦタンパク質以外の他のタンパク質のＮ末端側領域に特異的に結合する第１の抗体と、ＢＲＡＦタンパク質のＣ末端側領域に特異的に結合する第２の抗体を用い、当該２つの領域が、同一のタンパク質に存在することを確認することにより、ＢＲＡＦ融合タンパク質を検出することができる。

【0060】

〔ＢＲＡＦ融合タンパク質を検出する態様（３）〕
ＢＲＡＦ融合タンパク質を検出する一態様では、ＢＲＡＦ融合タンパク質が、ＢＲＡＦタンパク質由来ポリペプチドと、ＢＲＡＦタンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドとが融合点で融合して構築されていることに基づき、ＢＲＡＦ融合タンパク質における、前記融合点を含むＢＲＡＦタンパク質由来のポリペプチドの少なくとも一部と、前記他のタンパク質由来のポリペプチドの少なくとも一部が連続して含まれる融合ポリペプチドを検出することにより、ＢＲＡＦ融合タンパク質を検出することができる。
具体的には、例えば、ＢＲＡＦ融合タンパク質の融合点を含むポリペプチドを特異的に認識する抗体を用いた免疫学的測定法により、ＢＲＡＦ融合タンパク質を検出することができる。

【0061】

〔ＢＲＡＦ融合タンパク質を検出する態様（４）〕
ＢＲＡＦ融合タンパク質を検出する一態様では、ＢＲＡＦ融合タンパク質の活性を指標にＢＲＡＦ融合タンパク質を検出することができる。
具体的には、例えば、野生型ＢＲＡＦタンパク質に対して阻害活性のある物質を用いて野生型ＢＲＡＦタンパク質の活性を阻害した上で、ＢＲＡＦタンパク質のキナーゼ活性を測定し、ＢＲＡＦ融合タンパク質を含まない（野生型ＢＲＡＦタンパク質のみを含む）場合に比較して、活性が高いことを指標にＢＲＡＦ融合タンパク質を検出することができる。なお、ＢＲＡＦタンパク質のキナーゼ活性の測定には当業者に周知の方法を適宜選択することができ、例えば、ＢＲＡＦによりリン酸化を受ける分子のリン酸化状態を検出してもよい。

【0062】

なお、ＢＲＡＦ融合タンパク質の検出は、ＢＲＡＦ融合タンパク質を構成する全長ポリペプチドの存在、あるいは、ＢＲＡＦ融合タンパク質の一部を構成するポリペプチドの存在を指標として行ってもよく、ＢＲＡＦ融合タンパク質の存在が確認できる範囲で制限されない。

【0063】

＜ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子を検出する態様＞
以下、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子を検出する態様について述べるが、これらに限定されるものではない。
なお、以下の各態様における遺伝子の特定の領域の検出は、その例示に関わらず、あらかじめ解析した塩基配列に基づいて設計されたプローブ又はプライマーを用いて行っても、あるいは、シーケンシングによって行ってもよい。

【0064】

〔ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子を検出する態様（１）〕
〈ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子を検出する態様（１－ａ）〉
ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子を検出する一態様として、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子が構築されているとき、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子が２つ以上のポリヌクレオチドに切断されていることに基づき、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子が切断されている状態、すなわち、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子の５’末端側領域とＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子の３’末端側領域との連続性が失われていることを検出することにより、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子を検出することができる。
具体的には、例えば、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子の５’末端側領域に特異的にハイブリダイズする第１のプローブと、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子の３’末端側領域に特異的にハイブリダイズする第２のプローブを用い、当該２つの遺伝子領域が染色体上で離れていることを検出することにより、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子を検出することができる。
なお、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子由来のポリヌクレオチドと融合して融合遺伝子を構築している他の遺伝子が切断されている状態を前記方法で確認することにより、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子を検出してもよい。

【0065】

〈ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子を検出する態様（１－ｂ）〉
他の一態様として、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子の、５’末端側領域と、３’末端側領域の発現量をそれぞれ特異的に検出し、その発現量の比を求めることにより、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子を検出することができる。具体的には、例えば、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子の５’末端側領域の発現量と、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子３’末端側領域の発現量とが異なる場合、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子を検出することができる。
あるいは、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子と共にＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子を構築しているＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子以外の他の遺伝子について、前記方法で確認することにより、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子を検出してもよい。

【0066】

〈ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子を検出する態様（１－ｃ）〉
他の一態様として、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子の形成過程において、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子、あるいは、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子以外の他の遺伝子の少なくとも一部の複製（duplication）を伴う場合、すなわち、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子由来の重複したポリヌクレオチドと、ＰＸＮ又はＧＭＤＳと共にＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子を構築しているＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子以外の他の遺伝子由来の重複したポリヌクレオチドとからＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子が構築されている場合、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子由来のポリヌクレオチド又は前記他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの重複を検出することにより、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子を検出することができる。

【0067】

〔ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子を検出する態様（２）〕
ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子を検出する一態様として、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子が、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子由来ポリヌクレオチドと、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドと融合して構築されていることに基づき、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子における、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子由来のポリヌクレオチドの少なくとも一部と、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子以外の遺伝子由来のポリヌクレオチドの少なくとも一部とが連続して含まれる融合ポリヌクレオチドを検出することにより、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子を検出することができる。
具体的には、例えば、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子由来のポリヌクレオチドの５’末端側領域に特異的にハイブリダイズする第１のプローブと、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの３’末端側領域に特異的にハイブリダイズする第２のプローブを用い、当該２つの遺伝子領域が染色体上で近接していることを検出することにより、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子を検出することができる。ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子以外の他の遺伝子が、ＢＲＡＦ遺伝子の場合、すなわちＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子がＰＸＮ又はＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合遺伝子である場合、第２のプローブはＢＲＡＦ遺伝子由来のポリヌクレオチドの３’末端側領域に特異的にハイブリダイズするプローブを用いればよい。

【0068】

〔ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子を検出する態様（３）〕
ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子を検出する一態様として、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子が、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子由来ポリヌクレオチドと、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子以外の他の遺伝子由来ポリヌクレオチドとが、融合点において融合して構築されていることに基づき、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子における、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子由来のポリヌクレオチドの少なくとも一部と、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの少なくとも一部とが、融合点を含んで連続して含まれる融合ポリヌクレオチドを検出することにより、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子を検出することができる。
具体的には、例えば、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子由来のポリヌクレオチドの５’末端側領域に特異的にアニールする第１のプライマーと、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの３’末端側領域に特異的にアニールする第２のプライマーとを用いてＰＣＲ反応を行い、融合点の存在を示す所定のＰＣＲ産物が得られることを確認することにより、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子を検出することができる。

【0069】

＜ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質を検出する態様＞
以下、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質を検出する態様について述べるが、これらに限定されるものではない。

【0070】

〔ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質を検出する態様（１）〕
〈ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質を検出する態様（１－ａ）〉
ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質を検出する態様として、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子が構築されているとき、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子にコードされるＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質も切断されていることに基づき、ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質が切断されている状態、すなわち、ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質のＮ末端側領域とＣ末端側領域との連続性が失われていることを検出することにより、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質を検出することができる。
具体的には、例えば、ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質のＮ末端側領域に特異的に結合する第１の抗体と、ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質のＣ末端側領域に特異的に結合する第２の抗体を用い、当該２つの領域が、同一のタンパク質に存在しないことを確認することにより、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質を検出することができる。
あるいは、ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質と共に融合タンパク質を構築しているＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質以外の他のタンパク質が切断されている状態を前記方法により確認することで、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質を検出してもよい。

【0071】

〈ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質を検出する態様（１－ｂ）〉
他の一態様として、ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質の、Ｎ末端側領域と、Ｃ末端側領域の発現量をそれぞれ特異的に検出し、その発現量の比を求めることにより、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質を検出することができる。具体的には、例えば、ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質のＮ末端側領域の発現量と、ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質Ｃ末端側領域の発現量とが異なることを指標として、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質を検出することができる。
あるいは、ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質と共にＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質を構築しているＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質以外の他のタンパク質について、前記方法で確認することにより、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質を検出してもよい。

【0072】

〔ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質を検出する態様（２）〕
ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質を検出する一態様では、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質が、ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質由来ポリペプチドと、ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドとが融合して構築されていることに基づき、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質における、ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質由来のポリペプチドの少なくとも一部と、前記他のタンパク質由来のポリペプチドの少なくとも一部が連続して含まれる融合ポリペプチドを検出することにより、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質を検出することができる。
具体的には、例えば、ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質のＮ末端側領域に特異的に結合する第１の抗体と、ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質以外の他のタンパク質のＣ末端側領域に特異的に結合する第２の抗体を用い、当該２つの領域が、同一のタンパク質に存在することを確認することにより、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質を検出することができる。

【0073】

〔ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質を検出する態様（３）〕
ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質を検出する一態様では、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質が、ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質由来ポリペプチドと、ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドとが融合点で融合して構築されていることに基づき、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質における、前記融合点を含むＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質由来のポリペプチドの少なくとも一部と、前記他のタンパク質由来のポリペプチドの少なくとも一部が連続して含まれる融合ポリペプチドを検出することにより、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質を検出することができる。
具体的には、例えば、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質の融合点を含むポリペプチドを特異的に認識する抗体を用いた免疫学的測定法により、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質を検出することができる。

【0074】

〔ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質を検出する態様（４）〕
ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質を検出する一態様では、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質の活性を指標にＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質を検出することができる。
具体的には、例えば、ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質と共に融合タンパク質を構築するＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質以外の他のタンパク質が酵素活性を有するタンパク質である場合、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質を含まない（野生型ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質のみを含む）場合に比較して、当該酵素活性が高いことを指標に、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質を検出することができる。なお、酵素活性の測定には当業者に周知の方法を適宜選択することができ、例えば、前記他のタンパク質がキナーゼ活性を有するタンパク質（好ましくはＢＲＡＦタンパク質）である場合、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質によりリン酸化を受ける分子のリン酸化状態を検出してもよい。

【0075】

なお、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質の検出は、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質を構成する全長ポリペプチドの存在、あるいは、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質の一部を構成するポリペプチドの存在を指標として行ってもよく、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質の存在が確認できる範囲で制限されない。

【0076】

≪検出方法に用いる技法≫
以下、ＢＲＡＦ融合遺伝子（ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又はｃＤＮＡ）の検出、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子（ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又はｃＤＮＡ）の検出、ＢＲＡＦ融合タンパク質の検出、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質の検出の各工程及び各検出技法について、より詳細に説明するが、これらに制限されるものではない。
なお、被験者から得た試料から、遺伝子（ゲノムＤＮＡ、又は、ｍＲＮＡ）又は、タンパク質を抽出した場合、あるいは、組織切片、又は、細胞懸濁液等を作成した場合において、調製された試料においてＢＲＡＦ融合遺伝子又はＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子、あるいは、ＢＲＡＦ融合タンパク質又はＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質を検出するために好適な技法は、当業者が適宜選択することができる。

【0077】

＜融合遺伝子の検出＞
ＢＲＡＦ融合遺伝子、又は、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子の検出は、ＢＲＡＦ融合遺伝子、又は、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子のゲノムＤＮＡの検出、当該ゲノムＤＮＡの転写産物であるｍＲＮＡの検出、又は、ｍＲＮＡを鋳型として得られるｃＤＮＡの検出のいずれであってもよい。
被験者から得た試料中の、ＢＲＡＦ融合遺伝子（ゲノムＤＮＡ、又は、ｍＲＮＡ）又はＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子（ゲノムＤＮＡ、又は、ｍＲＮＡ）を検出する技法としては、ＢＲＡＦ融合遺伝子又はＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子の少なくとも一部にハイブリダイズするプローブ（核酸プローブ等）を使用したハイブリダイゼーション技術、あるいは、ＢＲＡＦ融合遺伝子又はＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子の少なくとも一部にアニールするプライマーを用いた遺伝子増幅技術等、遺伝子の検出に用いられる当業者に周知のいかなる技法、及び、これらの技法を応用した技法を用いることができる。
すなわち、ＰＣＲ、ＬＣＲ（Ligase chain reaction）、ＳＤＡ（Strand displacement amplification）、ＮＡＳＢＡ（Nucleic acid sequence-based amplification）、ＩＣＡＮ（Isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids）、ＬＡＭＰ（Loop-mediated isothermal amplification）法、ＴＭＡ法（Gen-Probe’s TMA system）、インサイチュハイブリダイゼーション法、マイクロアレイ法、ノーザンハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーション、ドットブロット法、ＲＮＡプロテクション法、ＤＮＡシーケンス、ＲＮＡシーケンス等のいかなる技法を用いてもよい。

【0078】

〔ゲノムＤＮＡの検出〕
ゲノムＤＮＡの検出には、インサイチュハイブリダイゼーション技術を好適に用いることができる。インサイチュハイブリダイゼーション技術を利用した検出は、例えば、公知のＦＩＳＨ法に従って実施することができる。又は、クロモジェニックインサイチュハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）法とシルバーインサイチュハイブリダイゼーション（ＳＩＳＨ）法を組み合わせたフュージョンアッセイ（fusion assay）で実施することができる。好適には、以下に詳述のＦＩＳＨ法スプリットアッセイ、又は、ＦＩＳＨ法フュージョンアッセイで検出することができる。

【0079】

あるいは、ゲノムＤＮＡの検出には、ＤＮＡシーケンス技術を好適に用いることができる。シーケンシングには、従来のサンガー法に基づくシーケンサーを使用してもよいが、解析の効率を考慮すると、次世代シーケンサーを使用することが好ましい（例えば、Metzker ML、Nat Rev Genet. 2010 Jan;11(1):31-46参照）。次世代シーケンサーとしては、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＭｉＳｅｑ/ＨｉＳｅｑ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｇｉｅｓ社のＳＯＬｉＤシステム、Ｒｏｃｈｅ社の４５４シーケンスシステム（ＧＳ ＦＬＸ＋／ＧＳ Ｊｕｎｉｏｒ）等が例示できる。シーケンシングにおいては、シーケンスキャプチャ技術等を用いて、融合遺伝子が存在している可能性がある領域を濃縮（enrich）することで、解析の効率を向上させることができる。シーケンスキャプチャ技術としては、Ｒｏｃｈｅ社のＲｏｃｈｅ ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＳｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ等が例示できる。
以下に、ゲノムＤＮＡの検出のための代表的な方法を例示するが、これらに限定されるものではない。

【0080】

〈ＦＩＳＨ法スプリットアッセイ〉
ＢＲＡＦ融合遺伝子のＦＩＳＨ法スプリットアッセイでは、検出用プローブとして、ＢＲＡＦ遺伝子の５’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって蛍光標識したものと、同遺伝子の３’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって別の蛍光色素で標識したものとの組み合わせを使用する。正常な場合（野生型ＢＲＡＦ遺伝子の場合）には、２つの遺伝子領域（各遺伝子ごとの５’末端側領域と３’末端側領域）が近接しているため、２つのシグナルが重なった色（例えば、赤色蛍光色素と緑色蛍光色素を使用する場合には、黄色）として検出されるのに対して、転座又は逆位により２つの遺伝子領域が切断されている場合は、２種類の蛍光色素に由来するシグナル（例えば、赤色と緑色）が別々に離れて検出される。従って、ＦＩＳＨ法スプリットアッセイでは、ＢＲＡＦ遺伝子の５’末端側ゲノム領域とＢＲＡＦ遺伝子３’末端側ゲノム領域とが染色体上で離れていることを検出することにより、ＢＲＡＦ融合遺伝子の存在を検出している。

【0081】

また、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子のＦＩＳＨ法スプリットアッセイでは、検出用プローブとして、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子の５’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって蛍光標識したものと、同遺伝子の３’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって別の蛍光色素で標識したものとの組み合わせを使用する。正常な場合（野生型ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子の場合）には、２つの遺伝子領域（各遺伝子ごとの５’末端側領域と３’末端側領域）が近接しているため、２つのシグナルが重なった色（例えば、赤色蛍光色素と緑色蛍光色素を使用する場合には、黄色）として検出されるのに対して、転座又は逆位により２つの遺伝子領域が切断されている場合は、２種類の蛍光色素に由来するシグナル（例えば、赤色と緑色）が別々に離れて検出される。従って、ＦＩＳＨ法スプリットアッセイでは、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子の５’末端側ゲノム領域と同遺伝子の３’末端側ゲノム領域とが染色体上で離れていることを検出することにより、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子の存在を検出している。

【0082】

ＢＲＡＦ融合遺伝子又はＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子がＰＸＮ又はＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合遺伝子の場合、検出用プローブとして、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子の５’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって蛍光標識したものと、同遺伝子の３’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって別の蛍光色素で標識したものとの組み合わせ、あるいは、ＢＲＡＦ遺伝子の５’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって蛍光標識したものと、同遺伝子の３’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって別の蛍光色素で標識したものとの組み合わせを使用することにより、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合遺伝子を検出することができる。

【0083】

〈ＦＩＳＨ法フュージョンアッセイ〉
ＢＲＡＦ融合遺伝子のＦＩＳＨ法フュージョンアッセイでは、例えば、ＢＲＡＦ融合遺伝子がＰＸＮ又はＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合遺伝子の場合、検出用プローブとして、ＢＲＡＦ遺伝子の３’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって蛍光標識したものと、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子の５’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって別の蛍光色素で標識したものとの組み合わせを使用することができる。正常な場合（野生型ＢＲＡＦ遺伝子の場合）には、２種類の蛍光色素に由来するシグナル（例えば、赤色と緑色）が別々に離れて検出されるのに対して、転座又は逆位により２つの遺伝子領域が近接している場合は、２つのシグナルが重なった色（例えば、黄色）として検出される。

【0084】

また、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子のＦＩＳＨ法フュージョンアッセイでは、例えば、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子がＰＸＮ又はＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合遺伝子の場合、検出用プローブとして、ＢＲＡＦ遺伝子の３’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって蛍光標識したものと、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子の５’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって別の蛍光色素で標識したものとの組み合わせを使用することができる。正常な場合（野生型ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子の場合）には、２種類の蛍光色素に由来するシグナル（例えば、赤色と緑色）が別々に離れて検出されるのに対して、転座又は逆位により２つの遺伝子領域が近接している場合は、２つのシグナルが重なった色（例えば、黄色）として検出される。

【0085】

〈ＦＩＳＨ法を用いた遺伝子重複の検出〉
ＢＲＡＦ融合遺伝子構築に伴う遺伝子重複は、例えば、ＢＲＡＦ融合遺伝子が、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合遺伝子の場合、検出用プローブとして、ＢＲＡＦ遺伝子の３’末端側ゲノム領域の少なくとも一部をカバーするポリヌクレオチドであって蛍光標識したものを使用することができる。そして、野生型ＢＲＡＦ遺伝子のみを含む場合に比較して強いシグナル、例えば、２倍以上のシグナルが得られることを検出することで、ＢＲＡＦ融合遺伝子を検出することができる。
なお、ＢＲＡＦ遺伝子由来のポリヌクレオチドと融合して融合遺伝子を構築している他の遺伝子（例えば、ＢＲＡＦ融合遺伝子がＰＸＮ又はＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合遺伝子の場合、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子）の５’側ゲノム領域の検出用プローブを使用し、前記方法で、ＢＲＡＦ融合遺伝子を検出してもよい。

【0086】

ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子構築に伴う遺伝子重複は、例えば、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子が、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合遺伝子の場合、検出用プローブとして、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子の５’末端側ゲノム領域の少なくとも一部をカバーするポリヌクレオチドであって蛍光標識したものを使用することができる。そして、野生型ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子のみを含む場合に比較して強いシグナル、例えば、２倍以上のシグナルが得られることを検出することで、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子を検出することができる。
なお、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子由来のポリヌクレオチドと融合して融合遺伝子を構築している他の遺伝子（例えば、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子がＢＲＡＦ－ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子の場合、ＢＲＡＦ遺伝子）の３’側ゲノム領域の検出用プローブを使用し、前記方法で、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子を検出してもよい。

【0087】

〈ＣＧＨアレイ解析を用いた遺伝子重複の検出〉
ＢＲＡＦ融合遺伝子構築又はＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子構築に伴う遺伝子重複は、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）アレイ解析（例えば、Agilent CGH/CNV Array解析；アジレントテクノロジー社）により、検出することができる。

【0088】

〈次世代シーケンサーを用いた遺伝子重複の検出〉
ＢＲＡＦ融合遺伝子構築又はＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子構築に伴う遺伝子重複は、次世代シーケンサーにより、検出することができる。具体的には、次世代シーケンサーを用いた解析において、遺伝子重複部分のカバレッジが高い（解析対象としたＤＮＡ断片のシーケンスをリファレンス配列にアノテーションした際の該当部分の冗長度が高い）ことを検出することで、ＢＲＡＦ融合遺伝子又はＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子を検出することができる。

【0089】

〈検出に用いるプローブ（ゲノム用）〉
ＢＲＡＦ融合遺伝子を検出するための、ハイブリダイゼーションに用いるプローブとしては、ＢＲＡＦ融合遺伝子の少なくとも一部のヌクレオチド又はそれらの相補鎖にストリンジェントな条件下で（好ましくはよりストリンジェントな条件下で）ハイブリダイズするプローブが好ましい。

【0090】

例えば、融合点を含むＢＲＡＦ融合遺伝子のゲノムＤＮＡを検出する場合、ＢＲＡＦ融合遺伝子の融合点をはさんでその上流及び下流のそれぞれ１６塩基からなる、連続した少なくとも３２塩基の核酸分子、又はそれらの相補鎖を含むプローブを用いてもよい。

【0091】

ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子を検出するための、ハイブリダイゼーションに用いるプローブとしては、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子の少なくとも一部のヌクレオチド又はそれらの相補鎖にストリンジェントな条件下で（好ましくはよりストリンジェントな条件下で）ハイブリダイズするプローブが好ましい。

【0092】

例えば、融合点を含むＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子のゲノムＤＮＡを検出する場合、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子の融合点をはさんでその上流及び下流のそれぞれ１６塩基からなる、連続した少なくとも３２塩基の核酸分子、又はそれらの相補鎖を含むプローブを用いてもよい。

【0093】

例えば、ＢＲＡＦ融合遺伝子又はＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子が、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合遺伝子の場合、ＦＩＳＨ法フュージョンアッセイに用いることのできるプローブとしては、ＢＲＡＦ遺伝子又はＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子のいずれか一方の遺伝子の５’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第１のプローブと、残る一方の遺伝子の３’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第２のプローブとの組み合わせ（好ましくは、ＢＲＡＦ遺伝子の３’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第１のプローブと、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子の５’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第２のプローブとの組み合わせ）を用いることができる。
一方、例えば、ＢＲＡＦ融合遺伝子又はＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子が、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合遺伝子の場合、ＦＩＳＨ法スプリットアッセイに用いることのできるプローブとしては、ＢＲＡＦ遺伝子５’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第１のプローブと、ＢＲＡＦ遺伝子の３’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第２のプローブとの組み合わせ、あるいは、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子５’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第１のプローブと、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子３’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第２のプローブとの組み合わせ（好ましくは、ＢＲＡＦ遺伝子の５’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第１のプローブと、ＢＲＡＦ遺伝子の３’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第２のプローブとの組み合わせ）を用いることができる。

【0094】

〔ｍＲＮＡの検出〕
ｍＲＮＡの検出は、ノーザンハイブリダイゼーション法等によりｍＲＮＡ自体を解析することにより行っても、又は、当業者に周知の方法によりｍＲＮＡを鋳型として合成した、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を解析することにより行ってもよい。
上記ＲＮＡの検出には、シーケンス技術を好適に用いることができる。シーケンシングには、解析の効率を考慮すると、次世代シーケンサーを使用することが好ましい（例えば、Metzker ML、Nat Rev Genet. 2010 Jan;11(1):31-46参照）。次世代シーケンサーとしては、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＭｉＳｅｑ/ＨｉＳｅｑ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｇｉｅｓ社のＳＯＬｉＤシステム、Ｒｏｃｈｅ社の４５４シーケンスシステム（ＧＳ ＦＬＸ＋／ＧＳ Ｊｕｎｉｏｒ）等が例示できる。シーケンシングにおいては、後述の遺伝子増幅反応方法、シーケンスキャプチャ技術等を用いて、融合遺伝子が存在している可能性がある領域を濃縮（enrich）することで、解析の効率を向上させることができる。シーケンスキャプチャ技術としては、Ｒｏｃｈｅ社のＲｏｃｈｅ ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＳｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ等が例示できる。

【0095】

〈遺伝子増幅反応方法による検出〉
ｍＲＮＡは、検出対象であるＢＲＡＦ融合遺伝子又はＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子の少なくとも一部のポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したプライマーを用いた、遺伝子増幅反応方法にて検出することができる。以下に、ｍＲＮＡの検出のための代表的な方法を例示するが、これらに限定されるものではない。

【0096】

==ＰＣＲ法==
例えば、ＰＣＲ法では、ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって分析し、エチジウムブロマイド染色等によって目的とするサイズの増幅断片が得られたか否かを確認できる。目的とするサイズの増幅断片が得られた場合は、被験者から得た試料において、ＢＲＡＦ融合遺伝子又はＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子が存在していたことになる。このように、ＢＲＡＦ融合遺伝子又はＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子を検出することができる。
本発明のＢＲＡＦ融合遺伝子又はＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子の検出方法としては、被験者から得た試料中の、特定のポリヌクレオチドを遺伝子増幅反応により増幅する工程に加え、更に目的とするサイズの増幅断片が得られたか否かを検出する工程を含むことが好ましい。

【0097】

ＰＣＲ法は、ＢＲＡＦ融合遺伝子又はＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子を定量的に検出することに適している。
従って、前述の<ＢＲＡＦ融合遺伝子を検出する態様（１－ｂ）>に記載のように、ＢＲＡＦ遺伝子の５’末端側領域と３’末端側領域の発現量をそれぞれ特異的に検出し、その発現量の比を求めることによってＢＲＡＦ融合遺伝子を検出することができる。或いは、ＢＲＡＦ遺伝子と共にＢＲＡＦ融合遺伝子を構築しているＢＲＡＦ遺伝子以外の他の遺伝子の５’末端側領域と３’末端側領域の発現量をそれぞれ特異的に検出し、その発現量の比を求めることによって、ＢＲＡＦ融合遺伝子を検出することができる。
また、前述の<ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子を検出する態様（１－ｂ）>に記載のように、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子の５’末端側領域と３’末端側領域の発現量をそれぞれ特異的に検出し、その発現量の比を求めることによってＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子を検出する方法に好適に用いることができる。あるいは、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子と共にＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子を構築しているＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子以外の他の遺伝子の５’末端側領域と３’末端側領域の発現量をそれぞれ特異的に検出し、その発現量の比を求めることによって、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子を検出することができる。

【0098】

なお、ＰＣＲ法、及び、これに用いるプライマー設計法は、公知の方法に従って当業者が行うことができる。
例えば、ＢＲＡＦ遺伝子の５’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマー、ならびに、ＢＲＡＦ遺伝子の３’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いることができる。
例えば、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子の５’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマー、ならびに、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子の３’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いることができる。

【0099】

==リアルタイムＰＣＲ法==
更には、ＰＣＲ法においては、遺伝子の増幅過程においてＰＣＲ増幅モニター（リアルタイムＰＣＲ）法（Genome Res., 6(10), 986, 1996）を用いることにより、ＢＲＡＦ融合遺伝子又はＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子の検出において、より定量的な解析を行うことが可能である。ＰＣＲ増幅モニター法としては、例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７９００（ＰＥバイオシステムズ社）を用いることができる。リアルタイムＰＣＲは公知の方法であり、そのための装置及びキットは市販されており、これらを利用して簡便に行える。

【0100】

より具体的には、例えばＢＲＡＦ融合遺伝子がＰＸＮ又はＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合遺伝子であって、ｍＲＮＡを指標にしてＢＲＡＦ融合遺伝子を検出する場合、センスプライマー（５’－プライマー、フォワードプライマー）を、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子由来の任意の部分から、アンチセンスプライマー（３’－プライマー、リバースプライマー）を、ＢＲＡＦ遺伝子由来の任意の部分から設計する。
また、例えばＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子がＰＸＮ又はＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合遺伝子であって、ｍＲＮＡを指標にしてＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子を検出する場合、センスプライマー（５’－プライマー、フォワードプライマー）を、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子由来の任意の部分から、アンチセンスプライマー（３’－プライマー、リバースプライマー）を、ＢＲＡＦ遺伝子由来の任意の部分から設計する。

【0101】

==マルチプレックスＰＣＲ==
ＢＲＡＦ融合遺伝子を検出するためのＰＣＲ法では、ＢＲＡＦ遺伝子と融合してＢＲＡＦ融合遺伝子を構成する他の各遺伝子、及び、複数の融合点に対応した上記センスプライマーを混ぜることにより、１反応液により全ての融合ポリヌクレオチドを検出するマルチプレックスＰＣＲ（Multiplex PCR）を設計することもできる。
ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子を検出するためのＰＣＲ法では、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子と融合してＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子を構成する他の各遺伝子、及び、複数の融合点に対応した上記センスプライマーを混ぜることにより、１反応液により全ての融合ポリヌクレオチドを検出するマルチプレックスＰＣＲ（Multiplex PCR）を設計することもできる。

【0102】

==質量分析による検出==
上記遺伝子増幅反応方法を用いた検出方法において、増幅断片の解析のために、特開2012-100628号公報に記載の質量分析法を用いることができる。

【0103】

==検出に用いるプライマーセット==
本発明のＢＲＡＦ融合遺伝子を検出するための検出方法に用いられるプライマーセットは、検出対象であるＢＲＡＦ融合遺伝子の少なくとも一部を特異的に増幅でき、ＢＲＡＦ融合遺伝子を検出できるものであれば、特には限定されず、当業者が、検出対象ポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて設計することができる。
本発明のＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子を検出するための検出方法に用いられるプライマーセットは、検出対象であるＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子の少なくとも一部を特異的に増幅でき、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子を検出できるものであれば、特には限定されず、当業者が、検出対象ポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて設計することができる。
ＰＣＲ増幅モニター法におけるプライマー設計は、プライマー設計ソフトウェア（例えば、Primer Express; PE Biosystems）などを利用してできる。また、ＰＣＲ産物のサイズが大きくなると増幅効率が悪くなるため、センスプライマーとアンチセンスプライマーは、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを対象に増幅したときの増幅産物の大きさが１ｋｂ以下になるように設定するのが適切である。

【0104】

〈ハイブリダイゼーション法による検出〉
ｍＲＮＡは、検出対象であるＢＲＡＦ融合遺伝子又はＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子の少なくとも一部のポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブを用いた、ハイブリダイゼーション法にて検出することができる。
ハイブリダイゼーション技術を利用した検出は、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、ドットブロット法、ＤＮＡマイクロアレイ法、ＲＮＡプロテクション法などが挙げられる。

【0105】

==プローブ（ｍＲＮＡ用）==
ハイブリダイゼーションに用いるプローブとしては、ＢＲＡＦ融合遺伝子又はＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子の少なくとも一部又はそれらの相補鎖にストリンジェントな条件下で（好ましくはよりストリンジェントな条件下で）ハイブリダイズするプローブが好ましい。

【0106】

＜融合タンパク質の検出＞
被験者から得た試料中の、ＢＲＡＦ融合タンパク質又はＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質を検出する技法としては、タンパク質を解析するために用いられる当業者に周知いかなる技法、又は、これらの技法を応用したいかなる技法を用いてもよい。

【0107】

例えば、ＢＲＡＦ融合タンパク質の検出に用いる方法としては、ＢＲＡＦタンパク質、又は、ＢＲＡＦタンパク質と共にＢＲＡＦ融合タンパク質を構築するＢＲＡＦタンパク質以外の他のタンパク質を特異的に認識する抗体、あるいは、ＢＲＡＦ融合タンパクを特異的に認識する抗体を用いた免疫学的測定法（イムノアッセイ法）、酵素活性測定法（ＥＬＩＳＡ法）、２抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法、ウェスタンブロッティング法、免疫組織化学法、免疫沈降法、ｉＡＥＰ（intercalated antibody-enhanced polymer）法、ＦＲＥＴ法を例示することができる。あるいは、これらと組み合わせて、または単独で、質量分析法、アミノ酸シーケンス法を用いることができる。

【0108】

例えば、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質の検出に用いる方法としては、ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質、又は、ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質と共にＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質を構築するＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質以外の他のタンパク質を特異的に認識する抗体、あるいは、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパクを特異的に認識する抗体を用いた免疫学的測定法（イムノアッセイ法）、酵素活性測定法（ＥＬＩＳＡ法）、２抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法、ウェスタンブロッティング法、免疫組織化学法、免疫沈降法、ｉＡＥＰ（intercalated antibody-enhanced polymer）法、ＦＲＥＴ法を例示することができる。あるいは、これらと組み合わせて、または単独で、質量分析法、アミノ酸シーケンス法を用いることができる。
以下に、タンパク質の検出のための代表的な方法を例示するが、これらに限定されるものではない。

【0109】

〔検出に用いる代表的な手法〕
抗体を用いる検出方法としては、上記公知の方法によればよいが、例えば以下の方法を用いることができる。

【0110】

〈免疫組織化学法〉
例えば、検出対象のＢＲＡＦ融合タンパク質又はＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質が、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合タンパク質の場合、検出対象の融合タンパク質が存在している可能性のある組織切片に対し、ＢＲＡＦタンパク質のＣ末端側領域のポリペプチドに結合する抗ＢＲＡＦ抗体及びＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質のＮ末端側領域のポリペプチドに結合する抗ＰＸＮ又はＧＭＤＳ抗体を用いた免疫染色を行い、それらの抗体が近接していることを指標に、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。また、ＢＲＡＦタンパク質のＮ末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体と、ＢＲＡＦタンパク質のＣ末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体を用いた免疫染色を行い、それらの抗体が離れて局在していることを指標に、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。また、ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質のＮ末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体と、ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質のＣ末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体を用いた免疫染色を行い、それらの抗体が離れて局在していることを指標に、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。また、融合点を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体を用いた免疫染色を行い、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。

【0111】

〈ウェスタンブロッティング法〉
例えば、検出対象のＢＲＡＦ融合タンパク質又はＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質がＰＸＮ又はＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合タンパク質の場合、検出対象の融合タンパク質が存在している可能性のある細胞抽出液を、当業者に周知の方法により電気泳動して細胞抽出液中のタンパク質を分離した後、メンブレンにブロッティングする。
そして、タンパク質がブロッティングされたメンブレンに対し、ＢＲＡＦタンパク質のＮ末端側領域のポリペプチドに結合する抗ＢＲＡＦ抗体及びＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質のＣ末端側領域に結合する抗ＰＸＮ又はＧＭＤＳ抗体を用いた免疫染色を行い、メンブレン上の所望の位置に、抗ＢＲＡＦ抗体と抗ＰＸＮ又はＧＭＤＳ抗体が結合していることを指標に、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。
また、融合点を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体を用い、当該抗体がメンブレン上の所望の位置に結合していることを指標に、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。
あるいは、抗ＢＲＡＦ抗体を用い、当該抗体が、メンブレン上のＰＸＮ又はＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合タンパク質に結合していることを指標に、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。この際、メンブレン上で野生型ＢＲＡＦタンパク質が予測される位置とは異なる位置に抗ＢＲＡＦ抗体が結合することを指標に、検出対象の融合タンパク質の存在を検出してもよい。
抗ＰＸＮ又はＧＭＤＳ抗体を用い、抗ＢＲＡＦ抗体を用いた場合と同じ原理で、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合タンパク質を検出してもよい。

【0112】

〈免疫沈降法〉
例えば、検出対象のＢＲＡＦ融合タンパク質又はＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質が、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合タンパク質の場合、検出対象の融合タンパク質が存在している可能性のある細胞抽出液に対し、ＢＲＡＦタンパク質のＣ末端側領域のポリペプチドに結合する抗ＢＲＡＦ抗体又はＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質のＮ末端側領域のポリペプチドに結合する抗ＰＸＮ又はＧＭＤＳ抗体のいずれか一方の抗体で免疫沈降を行い、その沈降物に対して残るもう一方の抗体で検出することで、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。上記の通り、免疫沈降と検出をした後、更には、検出抗体により、検出したポリペプチドが目的の検出対象ポリペプチドの大きさであることを確認することが好ましい。

【0113】

あるいは、検出対象のＢＲＡＦ融合タンパク質が存在している可能性のある細胞抽出液に対し、ＢＲＡＦタンパク質のＣ末端側領域のポリペプチドに結合する抗ＢＲＡＦ抗体で免疫沈降を行い、更にその沈降物の質量分析を行うことにより、野生型ＢＲＡＦと異なる質量の抗ＢＲＡＦ抗体と結合するタンパク質の存在を確認することで、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。
検出対象のＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質が存在している可能性のある細胞抽出液に対し、ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質のＮ末端側領域のポリペプチドに結合する抗ＰＸＮ又はＧＭＤＳ抗体で免疫沈降を行い、さらにその沈降物の質量分析を行うことにより、野生型ＰＸＮ又はＧＭＤＳと異なる質量の抗ＰＸＮ又はＧＭＤＳ抗体と結合するタンパク質の存在を確認することで、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。

【0114】

〔検出に用いる抗体〕
なお、本発明に係る検出方法に用いる抗体は、ＢＲＡＦ融合タンパク質又はＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質の所望の部位に特異的に結合する範囲で特に制限されず、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を組みあわせて用いることもできる。前記抗体としては、免疫グロブリンそれ自体であっても、抗原結合能を保持した抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂、又はＦｖでもよい。また、抗体の結合を検出するため、当業者に周知のいかなる標識やシグナル増幅法が用いられてもよい。

【0115】

＜標識手法＞
上記遺伝子（ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ等）及びタンパク質の検出方法において、プローブ、プライマー、増幅産物、抗体等の標識は公知の技術を用いればよい。例えば、蛍光標識、化学発光標識、放射性標識、酵素標識、ビオチン標識、アビジン標識等を挙げることができる。
プローブを用いた検出方法において、プローブを標識する場合、その標識方法は上記のとおり、公知の方法によればよく、例えば、ＢＡＣクローンから、標識された核酸プローブを作製する場合、ニックトランスレーション、ランダムプライム法等の公知手法を用いることができる。またその際、ビオチン－ｄＵＴＰ（例えば、Roche Applied Science社製）を用いてプローブをビオチン標識し、アビジンと結合させた、蛍光体、放射性同位体、酵素等、を更に処理することでプローブを標識することができる。
抗体を用いた検出方法において、抗体を標識する場合、その標識方法は上記のとおり、公知の方法によればよいが、例えば、下記の標識方法が挙げられる。

【0116】

〔ｉＡＥＰ（intercalated antibody-enhanced polymer）法〕
検出対象となるタンパク質に結合する第一抗体と、ポリマー試薬の間に介在抗体を入れることにより、染色感度を上げることが可能である（Takeuchiら、Clin Cancer Res, 2009 May 1; 15(9):3143-3149）。

【0117】

〔蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）〕
２つの抗体の近接を検出する手法として、例えば、ＦＲＥＴ現象を利用したプローブ（ＦＲＥＴプローブ）を用いることができる。抗体の一つをドナー蛍光物質（ＣＦＰ等）で標識し、他の抗体をアクセプター蛍光物質（ＹＦＰ等）で標識した場合、両者が十分に近い距離にあると、ＦＲＥＴ現象により、ＹＦＰが励起状態となり、基底状態に戻る際に蛍光を発する。この蛍光を検出することで、２つの抗体が近接していることを検出することができる。

【0118】

≪ＢＲＡＦ阻害物質による治療の適用対象の判定≫
本発明の検出方法における検出対象のＢＲＡＦ融合遺伝子又は検出対象のＢＲＡＦ融合タンパク質が、被験者から得た試料から検出された場合は、当該被験者は、ＢＲＡＦ融合体陽性のがんを有する対象（患者）であり、ＢＲＡＦ阻害物質による治療の適用対象となる。

【0119】

≪ＰＸＮ又はＧＭＤＳ阻害物質による治療の適用対象の判定≫
本発明の検出方法における検出対象のＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子又は検出対象のＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質が、被験者から得た試料から検出された場合は、当該被験者は、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合体陽性のがんを有する対象（患者）であり、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ阻害物質による治療の適用対象となる。

【0120】

≪検出用キット≫
本発明の検出用キットには、検出対象のＢＲＡＦ融合遺伝子の検出用キット、又は、検出対象のＢＲＡＦ融合タンパク質の検出用キットが含まれる。
本発明の検出用キットには、検出対象のＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子の検出用キット、又は、検出対象のＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質の検出用キットが含まれる。

【0121】

本発明の検出対象のＢＲＡＦ融合遺伝子の検出用キット、又は、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子の検出用キットには、本発明の検出方法においてＦＩＳＨ法フュージョンアッセイ又はＦＩＳＨ法スプリットアッセイに用いることのできるプローブ、あるいは、本発明の検出方法における検出対象のＢＲＡＦ融合遺伝子又はＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子の少なくとも一部を特異的に増幅できるように設計したセンス及びアンチセンスプライマーが含まれる。センス及びアンチセンスプライマーセットは、ＢＲＡＦ融合遺伝子又はＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子の少なくとも一部のポリヌクレオチドであり、かつ、増幅対象であるポリヌクレオチドの増幅用のプライマーとして機能するポリヌクレオチドのセットである。

【0122】

また、本発明の検出対象のＢＲＡＦ融合タンパク質又はＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質の検出用キットには、本発明の検出方法に用いることができる抗体が含まれる。

【0123】

＜プローブ＞
本発明のＢＲＡＦ融合遺伝子の検出用キットは、ＢＲＡＦ融合遺伝子の少なくとも一部のポリヌクレオチド、又は、その相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、前記ＢＲＡＦ融合遺伝子を検出できるプローブを１種類、あるいは、２種類以上の組み合わせで含むことができる。
本発明のＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子の検出用キットは、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子の少なくとも一部のポリヌクレオチド、又は、その相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、前記ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子を検出できるプローブを１種類、あるいは、２種類以上の組み合わせで含むことができる。

【0124】

プローブとして、前述の≪検出方法に用いる技法≫に記載したいずれか１種類以上のプローブが例示できる。
例えば、ＢＲＡＦ融合遺伝子又はＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子がＰＸＮ又はＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合遺伝子の場合、ＢＲＡＦ遺伝子由来ポリヌクレオチドにハイブリダイズする１種類以上の（好ましくは２種類以上の）プローブ、又は、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子由来ポリヌクレオチドにハイブリダイズする１種類以上の（好ましくは２種類以上の）プローブ、のいずれかのみを含んでも、ＢＲＡＦ遺伝子由来ポリヌクレオチドにハイブリダイズする１種類以上のプローブ、及び、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子由来ポリヌクレオチドにハイブリダイズする１種類以上のプローブ、の両方を含んでも、あるいは、ＢＲＡＦ融合遺伝子の融合点を含むポリヌクレオチドにハイブリダイズする１種類以上のプローブ、又は、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子の融合点を含むポリヌクレオチドにハイブリダイズする１種類以上のプローブを含んでもよい。

【0125】

＜プライマーセット＞
本発明のＢＲＡＦ融合遺伝子の検出用キットは、ＢＲＡＦ融合遺伝子の少なくとも一部を特異的に増幅でき、ＢＲＡＦ融合遺伝子を検出できるプライマーセットを１セット、あるいは、２セット以上の組み合わせで含むことができる。
本発明のＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子の検出用キットは、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子の少なくとも一部を特異的に増幅でき、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子を検出できるプライマーセットを１セット、あるいは、２セット以上の組み合わせで含むことができる。
プライマーセットとして、前述の≪本発明の検出方法の態様≫又は≪検出方法に用いる技法≫に記載したいずれか１種類以上のプライマーセットが例示できる。

【0126】

本発明のプライマーセットには、好ましくは、
（１）ＢＲＡＦタンパク質をコードするポリヌクレオチド部分から設計されるアンチセンスプライマー及びＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質をコードするポリヌクレオチド部分から設計されるセンスプライマーを含む、ＢＲＡＦ遺伝子とＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、アンチセンスプライマーは「検出対象ポリヌクレオチド」にストリンジェントな条件下（好ましくは、よりストリンジェントな条件下）でアニールする核酸分子（好ましくは、少なくとも１６塩基の核酸分子）からなり、センスプライマーは「検出対象ポリヌクレオチド」の相補鎖にストリンジェントな条件（好ましくは、よりストリンジェントな条件下）でアニールする核酸分子（好ましくは、少なくとも１６塩基の核酸分子）からなるプライマーセット、が含まれる。

【0127】

また、前記プライマーセット（１）のより具体的な態様として、本発明のプライマーセットには、以下の（２）～（５）のプライマーセットが含まれる。

【0128】

（２）配列番号１（ＰＸＮｅｘ６－ＢＲＡＦｅｘ１１）の塩基番号１から９６２の間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー、及び配列番号１の塩基番号９６３から２０６７の間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
（３）配列番号３（ＧＭＤＳｅｘ１－ＢＲＡＦｅｘ９）の塩基番号１から３７２の間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー、及び配列番号３の塩基番号３７３から１６５１の間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
（４）配列番号１で表されるＢＲＡＦ融合遺伝子を検出するための、以下のプライマーセット。
ＰＸＮ－４４１Ｆ：ＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＣＴＧＡＡＣ（配列番号８）
ＢＲＡＦ－１４４４Ｒ：ＣＴＧＣＣＡＣＡＴＣＡＣＣＡＴＧＣＣＡＣＴ（配列番号９）
（５）配列番号３で表されるＢＲＡＦ融合遺伝子を検出するための、以下のプライマーセット。
ＧＭＤＳ－１Ｆ：ＧＡＣＡＴＧＧＣＡＣＡＣＧＣＡＣＣＧ（配列番号１０）
ＢＲＡＦ－１４４４Ｒ：ＣＴＧＣＣＡＣＡＴＣＡＣＣＡＴＧＣＣＡＣＴ（配列番号９）

【0129】

また、本発明のプライマーセットは、前述の〈遺伝子増幅反応方法による検出〉==ＰＣＲ法==に記載のように、ＢＲＡＦ遺伝子の５’末端側領域と３’末端側領域の発現量を検出するためのプライマーセット、又は、ＢＲＡＦ遺伝子と共に融合遺伝子を構築する他の遺伝子の５’末端側領域と３’末端側領域の発現量を検出するためのプライマーセットであってもよい。

【0130】

これらのプライマーセット（１）～（５）においては、センスプライマーとアンチセンスセンスプライマーの選択位置の間隔が１ｋｂ以下であるか、あるいは、センスプライマーとアンチセンスセンスプライマーにより増幅される増幅産物の大きさが１ｋｂ以下であることが好ましい。
また、本発明のプライマーは、通常、１５～４０塩基、好ましくは１６～２４塩基、更に好ましくは１８～２４塩基、特に好ましくは２０～２４塩基の鎖長を有する。

【0131】

本発明のプライマーセットは、本発明の検出方法において、検出対象ポリヌクレオチドを増幅及び検出するために用いることができる。また、本発明のプライマーセットに含まれる各プライマーは、特に限定されるものではないが、例えば、化学合成法によって製造することができる。

【0132】

＜抗体＞
本発明のＢＲＡＦ融合タンパク質の検出用キットには、ＢＲＡＦ融合タンパク質の任意の部位に特異的に結合する抗体を１種類、あるいは、２種類以上の組み合わせで含むことができる。具体的には、前述の＜融合タンパク質の検出＞に記載した抗体が例示できる。
本発明のＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質の検出用キットには、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質の任意の部位に特異的に結合する抗体を１種類、あるいは、２種類以上の組み合わせで含むことができる。具体的には、前述の＜融合タンパク質の検出＞に記載した抗体が例示できる。
例えば、ＢＲＡＦ融合タンパク質又はＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質が、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合タンパク質の場合、ＢＲＡＦタンパク質由来ポリペプチドに結合する１種類以上の（好ましくは２種類以上の）抗体、又は、ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質由来ポリペプチドに結合する１種類以上の（好ましくは２種類以上の）抗体、のいずれかのみを含んでも、ＢＲＡＦタンパク質由来ポリペプチドに結合する１種類以上の抗体、及び、ＰＸＮ又はＧＭＤＳタンパク質由来ポリペプチドに結合する１種類以上の抗体、の両方を含んでも、あるいは、ＢＲＡＦ融合タンパク質の融合点を含むポリペプチドに結合する１種類以上の抗体、又は、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子の融合点を含むポリヌクレオチドに結合する１種類以上の抗体を含んでもよい。

【0133】

≪阻害物質のスクリーニング方法≫
＜ポリペプチドを阻害する物質をスクリーニングする工程＞
本発明の、阻害物質のスクリーニング方法は、前記検出対象ポリペプチドを阻害する物質をスクリーニングすることができ、
（１）検出対象ポリペプチド、又は前記ポリペプチドを発現している細胞に試験物質を接触させる工程、
（２）前記ポリペプチドが阻害されるか否かを分析する工程、及び
（３）前記ポリペプチドを阻害する物質を選択する工程
を含む。

【0134】

本明細書において、「ポリペプチドの阻害」には、ポリペプチドの活性の阻害と、ポリペプチドの発現の阻害とが含まれる。また、「阻害」は、少なくとも一部の阻害を意味する。

【0135】

＜阻害物質スクリーニング工程とその指標＞
本発明のスクリーニング方法には、
（Ａ）精製又は粗製のポリペプチドを用いて、インビトロでポリペプチドの活性阻害を指標とする方法、
（Ｂ）ポリペプチドを発現している細胞を用いて、ポリペプチドの活性阻害を指標とする方法、
（Ｃ）ポリペプチドを発現している細胞を用いて、ポリペプチドの発現阻害を指標とする方法
が含まれる。

【0136】

〔（Ａ）精製又は粗製ポリペプチドを用い、活性阻害を指標とする方法〕
前記方法（Ａ）には、インビトロでポリペプチドに試験物質を添加して接触させる工程、前記試験物質により前記ポリペプチドの活性が阻害されたか否かを、対照（試験物質を接触させなかったポリペプチド）と比較して分析する工程、ポリペプチドの活性を阻害した物質を選択する工程を含む方法が含まれる。
インビトロにおけるポリペプチド活性の測定は、公知のキナーゼ活性測定法を用いることができ、例えば、キナーゼ反応により生成するＡＤＰ量を指標としても、あるいは、ポリペプチドのチロシンリン酸化レベルを指標としてもよく、市販のキナーゼ活性測定キットを用いることもできる。

【0137】

〔（Ｂ）ポリペプチド発現細胞を用い、活性阻害を指標とする方法〕
前記方法（Ｂ）には、ポリペプチドを発現している細胞に試験物質を添加して接触させる工程、前記試験物質により前記ポリペプチドの活性が阻害されたか否かを、対照（試験物質を接触させなかった細胞）と比較して分析する工程、ポリペプチドの活性を阻害した物質を選択する工程を含む方法が含まれる。
前記細胞におけるポリペプチド活性の測定は、公知のキナーゼ活性測定法を用いることができ、例えば、キナーゼ反応により生成するＡＤＰ量を指標としても、あるいは、ポリペプチドのチロシンリン酸化レベルを指標としてもよく、市販のキナーゼ活性測定キットを用いることもできる。

【0138】

〔（Ｃ）ポリペプチド発現細胞を用い、発現阻害を指標とする方法〕
前記方法（Ｃ）には、ポリペプチドを発現している細胞に試験物質を添加して接触させる工程、前記試験物質により前記ポリペプチドの発現が阻害されたか否かを、対照（試験物質を接触させなかった細胞）と比較して分析する工程、ポリペプチドの発現を阻害した物質を選択する工程を含む方法が含まれる。
前記細胞におけるポリペプチドの発現は、タンパク質又はｍＲＮＡの量を測定することにより分析することができる。タンパク質量の測定には、例えば、ＥＬＩＳＡ法、イムノブロット法を用いることができ、ｍＲＮＡ量の測定には、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ法、ノーザンブロット法を用いることができる。

【0139】

ここで、ＢＲＡＦ融合遺伝子は、腫瘍形成能を有する遺伝子である。従って、本発明の阻害物質スクリーニング方法で選択したポリペプチド阻害物質は、ＢＲＡＦ融合体陽性のがんの治療用医薬組成物の有効物質又はその候補物質として有用であり、本発明方法は、所望により、前記阻害物質がＢＲＡＦ融合体陽性のがんに対する治療活性を有することを確認する工程を更に含むことができる。
また、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子は、腫瘍形成能を有する遺伝子である。従って、本発明の阻害物質スクリーニング方法で選択したポリペプチド阻害物質は、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合体陽性のがんの治療薬又はその候補物質として有用であり、本発明方法は、所望により、前記阻害物質がＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合体陽性のがんに対する治療活性を有することを確認する工程を更に含むことができる。
前記確認工程は、公知の評価系を用いて実施することができ、例えば、培養細胞を用いるインビトロ評価系、腫瘍細胞を移植した担がんモデル動物を用いる評価系などを挙げることができる。前記担がんモデル動物としては、手術により患者から摘出した腫瘍組織を、一度培養により細胞株として樹立してから移植することもできるし、あるいは、前記腫瘍組織を直接、移植することもできる。後者の担がんモデル動物は、ＰＤＸ（patient-derived xenograft）モデル動物として知られており、細胞株を移植したモデル動物と比較して、継代を繰り返した皮下腫瘍組織における遺伝子発現プロファイルが原発巣とより類似しているため、評価系として好ましい。

【0140】

前記ポリペプチド発現細胞は、本発明のポリヌクレオチドを、常法に従って、所望の細胞に導入することで得ることもできる（例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4th Edition（2012）、Cold Spring Harbor Laboratory Press参照）。具体的には、例えば、本発明のＢＲＡＦ融合遺伝子又はＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子であるｃＤＮＡを、組換えベクターに導入し、これを更に細胞に導入することで、前記ポリペプチド発現細胞（形質転換細胞）を得ることができる。

【0141】

≪阻害物質を含有するがん治療用医薬組成物≫
本発明の、ＢＲＡＦ融合体陽性のがんの治療用医薬組成物は、ＢＲＡＦ融合遺伝子又はその転写産物に対する阻害物質を含む。例えば、本発明の阻害物質スクリーニング方法で得られる阻害物質（例えば、低分子化合物、二重鎖核酸（ｓｉＲＮＡを含む）、タンパク質（抗体又は抗体断片を含む）、ペプチド、又はそれ以外の化合物）を有効成分として含有し、所望により、製剤学的に許容される担体を含有することができる。
本発明のＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合体陽性のがんの治療用医薬組成物は、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子又はその転写産物に対する阻害物質を含む。例えば、本発明の阻害物質スクリーニング方法で得られる阻害物質（例えば、低分子化合物、二重鎖核酸（ｓｉＲＮＡを含む）、タンパク質（抗体又は抗体断片を含む）、ペプチド、又はそれ以外の化合物）を有効成分として含有し、所望により、製剤学的に許容される担体を含有することができる。

【0142】

＜ＢＲＡＦ融合遺伝子又は転写産物、あるいは、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子又は転写物に対する阻害物質＞
ＢＲＡＦ融合遺伝子又はその転写産物に対する阻害物質としては、キナーゼ阻害剤、例えば、ＢＲＡＦ阻害物質、又は、ＢＲＡＦ遺伝子と共に融合遺伝子を構築するもう一方の遺伝子又はその転写物質に対する阻害物質を挙げることができる。
ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子又はその転写産物に対する阻害物質としては、キナーゼ阻害剤、例えば、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ阻害物質、又は、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子と共に融合遺伝子を構築するもう一方の遺伝子又はその転写物質に対する阻害物質を挙げることができる。

【0143】

〔低分子化合物〕
前記阻害物質のうち、低分子化合物の具体例としては、trametinib (Japan Tobacco Inc.)、Sorafenib（Bayer Healthcare Pharmaceuticals Inc.）、Dabrafenib（GlaxoSmithKline LLC.）、Vemurafenib（PLX-4032, Hoffmann-La Roche Inc.）、Regorafenib（Bayer Healthcare Pharmaceuticals）、N-{2,4-difluoro-3-[(5-pyridin-3-yl-1H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-3-yl)carbonyl]phenyl}ethanesulfonamide、N-{3-[(5-chloro-1H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-3-yl)carbonyl]-2,4-difluorophenyl}propane-1-sulfonamide、(1E)-5-(1-piperidin-4-yl-3-pyridin-4-yl-1H-pyrazol-4-yl)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one oxime、GDC-0879（(E)-2,3-Dihydro-5-[1-(2-hydroxyethyl)-3-(4-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]-1H-inden-1-one oxime）、RAF-265（1-methyl-5-(2-(5-(trifluoromethyl)-1H-imidazol-2-yl)pyridin-4-yloxy)-N-(4-(trifluoromethyl)phenyl)-1H-benzo[d]imidazol-2-amine）、AZ628（3-(2-cyanopropan-2-yl)-N-(4-methyl-3-(3-methyl-4-oxo-3,4-dihydroquinazolin-6-ylamino)phenyl)benzamide）、および、これらの薬学的に許容される塩等を挙げることができる。

【0144】

〔二重鎖核酸〕
二重鎖核酸は、二重鎖の核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡ）部分と、好ましくはセンス鎖及びアンチセンス鎖の３’末端のオーバーハングとからなり、ＲＮＡｉを誘導する。ＲＮＡｉは進化的に保存された現象で、ＲＮａｓｅIIIエンドヌクレアーゼによって生じる２１～２３塩基の二重鎖核酸を介して起こる（Genes Dev. 15, 485-490, 2001）。３’側のオーバーハングはそれぞれ１又は２塩基の任意の核酸であるが、２塩基が好ましい。なお、前記塩基数（２１～２３塩基）は、オーバーハングを含むセンス鎖又はアンチセンス鎖の各々の塩基数である。また、センス鎖及びアンチセンス鎖は、同じ塩基数であることもできるし、異なる塩基数であることもできるが、同じ塩基数であることが好ましい。

【0145】

二重鎖核酸の３’側オーバーハングを構成するリボ核酸としては、例えば、Ｕ（ウリジン）、Ａ（アデノシン）、Ｇ（グアノシン）、又はＣ（シチジン）を用いることができ、３’側のオーバーハングを構成するデオキシリボ核酸としては、例えば、ｄＴ（デオキシチミジン）、ｄＡ（デオキシアデノシン）、ｄＧ（デオキシグアノシン）、又はｄＣ（デオキシシチジン）を用いることができる。

【0146】

本発明の医薬組成物の有効成分として用いることのできる二重鎖核酸は、ＢＲＡＦ融合遺伝子に対する阻害作用又はＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子に対する阻害作用を有するものであれば、特に限定されない。例えば、二重鎖部分が融合点を含むポリヌクレオチドの塩基配列、例えば、配列番号１の第９６２番～第９６３番を含む塩基配列、あるいは、配列番号３の第３７２番～第３７３番を含む塩基配列に基づいて設計することができる。あるいは、二重鎖部分が、キナーゼ部分をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて設計することができる。本発明の二重鎖核酸は、常法（例えば、J. Am. Chem. Soc., 120, 11820-11821, 1998; 及びMethods, 23, 206-217, 2001）により製造することができる。また、二重鎖核酸を委託製造する会社（例えば、ＲＮＡｉ社）は、当業者によく知られており、二重鎖核酸の製造に利用できる。また、ｓｉＲＮＡ配列設計システム（商用ｓｉＤｉｒｅｃｔ（登録商標）；ＲＮＡｉ社）により、二重鎖核酸を設計することができる。

【0147】

〔タンパク質・抗体〕
本発明の医薬組成物の有効成分として用いることのできる抗体は、ＢＲＡＦ融合遺伝子の転写産物又はＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子の転写物、好ましくは、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ遺伝子の転写産物を阻害するものであれば、限定されない。例えば、ＢＲＡＦ融合タンパク質又はＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質の活性、好ましくはキナーゼ活性を阻害するものが挙げられる。

【0148】

《本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、形質転換細胞》
＜本発明のポリペプチド＞
本発明の検出方法に係る検出対象であるＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質、好ましくはＰＸＮ－ＢＲＡＦ融合タンパク質又はＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合タンパク質は、それ自体、新規タンパク質である。

【0149】

本発明のポリペプチドであるＰＸＮ－ＢＲＡＦ融合タンパク質としては、下記（ａ）～（ｄ）に記載のポリペプチドが好ましい：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、及び
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。

【0150】

本発明のポリペプチドであるＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合タンパク質としては、下記（ａ）～（ｄ）に記載のポリペプチドが好ましい：
（ａ）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号４で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号４で表されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、及び
（ｄ）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。

【0151】

＜本発明のポリヌクレオチド＞
本発明の検出方法に係る検出対象であるＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子、好ましくはＰＸＮ－ＢＲＡＦ融合遺伝子又はＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合遺伝子は、それ自体、新規遺伝子である。
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチド（すなわち、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合タンパク質、好ましくはＰＸＮ－ＢＲＡＦ融合タンパク質又はＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合タンパク質）をコードするポリヌクレオチド（すなわち、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合遺伝子、好ましくはＰＸＮ－ＢＲＡＦ融合遺伝子又はＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合遺伝子）である限り、特に限定されるものではない。なお、「ＰＸＮ－ＢＲＡＦ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド」は、ＰＸＮ－ＢＲＡＦ融合遺伝子において翻訳領域のみからなるポリヌクレオチドであっても、ＰＸＮ－ＢＲＡＦ融合遺伝子のゲノムＤＮＡ全長であっても、ＰＸＮ－ＢＲＡＦ融合遺伝子のｍＲＮＡやｃＤＮＡであってもよい。また、「ＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド」は、ＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合遺伝子において翻訳領域のみからなるポリヌクレオチドであっても、ＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合遺伝子のゲノムＤＮＡ全長であっても、ＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合遺伝子のｍＲＮＡやｃＤＮＡであってもよい。

【0152】

＜本発明のベクター＞
本発明のベクターは、前記本発明のポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、真核生物又は原核生物の宿主細胞を形質転換できる適当なベクターに当該ポリヌクレオチドを組み込むことにより調製することができる。前記ベクターは、当該ポリヌクレオチドの発現に必要な配列、例えば、プロモーター、エンハンサーを含むことができ、更に、宿主への導入確認に必要な配列、例えば、薬剤耐性遺伝子を含むことができる。

【0153】

＜本発明の形質転換細胞＞
本発明の形質転換細胞は、本発明のベクターにより、適当な宿主細胞、例えば、真核生物又は原核生物の宿主細胞を形質転換することにより調製することができる。本発明の形質転換細胞は、本発明のポリペプチドを製造するのに用いることができる。

【実施例】

【0154】

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
なお、実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。

【0155】

［実施例１］臨床検体でのＢＲＡＦ遺伝子異常のＦＩＳＨ法による検出
目的遺伝子の５’末端側領域及び３’末端側領域を異なる色素で染め、遺伝子の転座又は逆位等を観察する方法が知られている。ＦＩＳＨ法の一種であるこの方法はスプリットアッセイ（split assay）と呼ばれている。スプリットアッセイでは、染色体転座又は逆位等を調べたい目的遺伝子の５’末端側領域及び３’末端側領域のそれぞれを異なる蛍光色素で標識したプローブで染める。例えば、テキサスレッド（TexasRed）（赤）標識及びＦＩＴＣ（緑）標識した２種類のプローブにて蛍光標識することにより、正常な場合（融合遺伝子が構築されていない場合）は１つの黄色のシグナル（緑色と赤色のシグナルが近傍に存在している状態）として検出され、転座又は逆位等が起きている場合は、離れた緑色と赤色のシグナルとして検出される。

【0156】

臨床検体でのＢＲＡＦ遺伝子異常をＦＩＳＨ法スプリットアッセイで検出した。手術により摘出され、２０％ホルマリンで固定化されパラフィンに包埋された大腸がん組織を４μｍの厚さで切り、スライドガラス上に乗せ病理切片を作製した。ＦＩＳＨ法は文献（Takeuchi K, Choi YL, Soda M, Inamura K, Togashi Y, Hatano S, Enomoto M, Takada S, Yamashita Y, Satoh Y, Okumura S, Nakagawa K, Ishikawa Y, Mano H. Multiplex reverse transcription-PCR screening for EML4-ALK fusion transcripts. Clin Cancer Res. 2008;14:6618-6624.）の方法に従い行った。作製した未染色の切片は、Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ＦＩＳＨアクセサリーキット（Dako社）で処理し、続いて、赤（TexasRed）の蛍光標識したＢＲＡＦ遺伝子５’末端側領域をカバーするＢＡＣ（bacterial artificial chromosome）クローン（クローン番号 RP11-159M20）と、緑（ＦＩＴＣ）の蛍光標識したＢＲＡＦ遺伝子３’末端側領域をカバーするＢＡＣクローン（クローン番号 RP11-759K14, CTD-2337E12）とを用いてハイブリダイゼーションした。更に続いて４，６－ジアミノ－２－フェニルインドール（4,6-diamino-2-phenylindole）で染色を行った。蛍光観察は蛍光顕微鏡ＢＸ５１（Olympus社）を使用した。緑と赤のシグナルが離れて観察されるゲノム構造異常が示唆される切片を見出した。約１５００例の病理検体での検討から２例のＢＲＡＦ遺伝子領域のゲノム構造異常を示唆する検体（結腸がん患者由来）を見出した。

【0157】

［実施例２］臨床検体でのＢＲＡＦ融合ポリヌクレオチド遺伝子の同定
ＦＩＳＨ法解析によりＢＲＡＦゲノム構造異常が示唆された組織由来のＲＮＡをテンプレートに、Ｓｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ Ｈｕｍａｎ Ｋｉｎｏｍｅ ＲＮＡ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ社）およびＭｉｓｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を用いて、キャプチャーシークエンスを行いＢＲＡＦ遺伝子キナーゼ領域の５’側に存在する遺伝子を調べた。その結果、ＰＸＮ遺伝子又はＧＭＤＳ遺伝子の一部がＢＲＡＦ遺伝子キナーゼ領域の５’側に融合していることが明らかとなった。

【0158】

［実施例３］臨床検体でのＰＸＮ－ＢＲＡＦ、ＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合ポリヌクレオチド遺伝子の単離
ＦＩＳＨ法解析によりＢＲＡＦゲノム構造異常が示唆され、融合する遺伝子が同定された大腸がん臨床検体由来のｃＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ（PrimeStar HS DNAポリメラーゼ）を用いてＰＣＲを行い、増幅産物をｐＴ７Ｂｌｕｅ－２にクローニングした。ＰＸＮ－ＢＲＡＦ融合ポリヌクレオチド遺伝子の単離用プライマーセットとしては、フォワードプライマーＧＭＤＳ－５’ＵＴＲ（配列番号５）とリバースプライマーＢＲＡＦ－３’ＵＴＲ（配列番号６）との組合せを用いた。また、ＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合ポリヌクレオチド遺伝子の単離用プライマーセットとしては、フォワードプライマーＧＭＤＳ－５’ＵＴＲ（配列番号７）とリバースプライマーＢＲＡＦ－３’ＵＴＲ（配列番号６）との組合せを用いた。

【0159】

得られた増幅産物（１９１４ｂｐおよび１４４０ｂｐ）の配列を確認した結果、ＰＸＮ遺伝子の開始コドンＡＴＧからエクソン６までと、ＢＲＡＦ遺伝子のエクソン１１からエクソン１８の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド（ＰＸＮｅｘ６－ＢＲＡＦｅｘ１１；配列番号１）が取得できた。また、ＧＭＤＳ遺伝子の開始コドンＡＴＧからエクソン１までと、ＢＲＡＦ遺伝子のエクソン９からエクソン１８の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド（ＧＭＤＳｅｘ１－ＢＲＡＦｅｘ９；配列番号３）が取得できた。

【0160】

なお、ＰＸＮｅｘ６－ＢＲＡＦｅｘ１１がコードするアミノ酸配列（配列番号２）に関して、ＰＸＮの登録アミノ酸配列（Ensemble database, Protein ID: ENSP00000288602）との比較により、Ｓ７３Ｇの１箇所のアミノ酸置換が認められた。なお、前記アミノ酸置換において、最初のアミノ酸（例：Ｓ７３Ｇにおける「Ｓ」）は登録アミノ酸配列におけるアミノ酸を、その後のアミノ酸番号（例：Ｓ７３Ｇにおける「７３」）は配列番号２におけるアミノ酸番号を、最後のアミノ酸（例：Ｓ７３Ｇにおける「Ｇ」）は配列番号２で表されるアミノ酸配列におけるアミノ酸を、それぞれ、意味する。また、前記アミノ酸置換を生じさせる、配列番号１で表される塩基配列における第３４８番のＣは、一塩基多型（rs4767884）として報告されている。

【0161】

【表1】

【0162】

［実施例４］ＰＸＮ－ＢＲＡＦ融合遺伝子、ＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合遺伝子の検出
表１に示すプライマーを用いて、融合部を含む領域を直接増幅するＲＴ－ＰＣＲで融合遺伝子の検出を行い、融合遺伝子ｃＤＮＡががん組織に存在していることを示した。具体的には、ＰＸＮ－ＢＲＡＦ融合遺伝子に関しては、検体由来ＲＮＡテンプレートに対して、ＰＸＮ遺伝子上に設計したフォワードプライマーＰＸＮ－４４１Ｆ（配列番号８）とＢＲＡＦ遺伝子上に設計したリバースプライマーＢＲＡＦ－１４４４Ｒ（配列番号９）とを使用してＰＣＲを行った。増幅産物を電気泳動したところ、プライマー設定位置から予想されるサイズのバンド（５２１ｂｐ）が観察された。ＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合遺伝子に関しては、検体由来ＲＮＡテンプレートに対して、ＧＭＤＳ遺伝子上に設計したフォワードプライマーＧＭＤＳ－１Ｆ（配列番号１０）とＢＲＡＦ遺伝子上に設計したリバースプライマーＢＲＡＦ－１４４４Ｒ（配列番号９）とを使用してＰＣＲを行った。増幅産物を電気泳動したところ、プライマー設定位置から予想されるサイズのバンド（３９６ｂｐ）が観察された。臨床検体を用いた融合遺伝子の検出が、これらの遺伝子上にプライマーを設計することによって可能であることが示された。

【0163】

［実施例５］臨床検体でのＰＸＮ－ＢＲＡＦ融合遺伝子、ＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合遺伝子のＦＩＳＨ法フュージョンアッセイによる検出
融合遺伝子がゲノム上で融合していることを確認するため、ＦＩＳＨ法フュージョンアッセイにて検出を行った。
ＦＩＳＨ法フュージョンアッセイでは染色体転座又は逆位等によって近接する二つの目的遺伝子領域を異なる蛍光色素で標識したプローブで染める。例えば、ＴｅｘａｓＲｅｄ（赤）標識及びＦＩＴＣ（緑）標識した２種類のプローブにて蛍光標識することにより、正常な場合（融合遺伝子が構築されていない場合）は赤と緑はそれぞれのシグナル（赤色と緑色のシグナルが離れて存在している状態）として検出され、転座又は逆位等が起きることにより２つの遺伝子領域が近接している場合は、赤色と緑色のシグナルが重なり黄色として検出される。

【0164】

具体的には、ＰＸＮ－ＢＲＡＦ融合遺伝子に関しては、赤（TexasRed）の蛍光標識をした、ＰＸＮ遺伝子５’末端側領域をカバーするＢＡＣクローン（クローン番号 CTD-2308L15, CTD-3139J18）と、緑（FITC）の蛍光標識をした、ＢＲＡＦ遺伝子３’末端側領域をカバーするＢＡＣクローン（クローン番号 RP11-759K14, CTD-2337E12）との組み合わせを使用した。
ＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合遺伝子に関しては、赤（TexasRed）の蛍光標識をした、ＧＭＤＳ遺伝子５’末端側領域をカバーするＢＡＣクローン（クローン番号 RP1-33B19, RP1-80B9, RP1-136B1）と、緑（FITC）の蛍光標識をした、ＢＲＡＦ遺伝子３’末端側領域をカバーするＢＡＣクローン（クローン番号 RP11-759K14, CTD-2337E12）との組み合わせを使用した。
蛍光観察は蛍光顕微鏡ＢＸ５１（Olympus社）を使用した。実施例４において融合遺伝子が陽性であった病理切片上でのフュージョンアッセイの結果、ＰＸＮ遺伝子５’末端側領域とＢＲＡＦ遺伝子３’末端側領域との近接したシグナル（黄）、あるいは、ＧＭＤＳ遺伝子５’末端側領域とＢＲＡＦ遺伝子３’末端側領域との近接したシグナル（黄）が観察され、融合遺伝子が染色体転座又は逆位等により生成されたことが確かめられた。
この方法が当該融合遺伝子の存在を検出する方法として使えることがわかった。

【0165】

［実施例６］ＰＸＮ－ＢＲＡＦ、ＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合ポリペプチドの腫瘍形成能の検討
本実施例では、ＰＸＮ－ＢＲＡＦ融合ポリペプチドをコードするｃＤＮＡとして、実施例３において大腸がん臨床検体から取得した配列番号１のＰＸＮ－ＢＲＡＦ融合遺伝子を使用して、また、ＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合ポリペプチドをコードするｃＤＮＡとして、実施例３において大腸がん臨床検体から取得した配列番号３のＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合遺伝子を使用して、各融合ポリペプチドの腫瘍形成能を検討した。前記の各ｃＤＮＡを発現ベクターｐＬｅｎｔｉ６（Invitrogen（登録商標）（Life Technologies社））に挿入して得られたｐＬｅｎｔｉ６－ＰＸＮ－ＢＲＡＦ又はｐＬｅｎｔｉ６－ＧＭＤＳ－ＢＲＡＦをマウス繊維芽細胞株ＮＩＨ３Ｔ３細胞に導入し７日間培養したところ、図１（ＰＸＮ－ＢＲＡＦ）及び図２（ＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ）に示すように形質転換フォーカスが観察された。遺伝子導入試薬のみの処理をしたＮＩＨ３Ｔ３細胞（ｃｏｎｔｒｏｌ）、ＬａｃＺを導入したＮＩＨ３Ｔ３細胞においては、形質転換フォーカスは認められなかった（図示せず）。すなわち、ＰＸＮ－ＢＲＡＦ又はＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合ポリペプチドを発現するベクターを導入した場合に限り、形質転換フォーカスが観察された。

【0166】

ＰＸＮ－ＢＲＡＦ又はＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合ポリペプチドを発現するベクターを導入したＮＩＨ３Ｔ３細胞、遺伝子導入試薬処理のみをおこなったＮＩＨ３Ｔ３細胞（ｃｏｎｔｒｏｌ）、ＬａｃＺを導入したＮＩＨ３Ｔ３細胞を、それぞれ、ヌードマウスの皮下に１×１０^６個ずつ接種したところ、融合ポリペプチドを発現するベクターを導入したＮＩＨ３Ｔ３細胞を接種したマウスにおいて腫瘍形成が確認された。遺伝子導入試薬処理のみをおこなったＮＩＨ３Ｔ３細胞（ｃｏｎｔｒｏｌ）を接種したマウスにおいては、腫瘍形成は確認されなかった。接種１日目以降の両マウスにおける腫瘍サイズを図３に示す。
この結果より、ＰＸＮ－ＢＲＡＦ又はＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合ポリペプチドが腫瘍形成能を持っていたことから、ＰＸＮ－ＢＲＡＦ又はＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合ポリヌクレオチドは、がんの原因遺伝子であることが示された。
なお、全長のＢＲＡＦポリペプチドをコードするｃＤＮＡをＮＩＨ３Ｔ３細胞に導入したところ、形質転換フォーカスは観察されず、全長のＢＲＡＦポリペプチドは腫瘍形成能を有しないことが確認された。

【0167】

［実施例７］ＰＸＮ－ＢＲＡＦ、ＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合ポリペプチド発現細胞のＢＲＡＦ阻害剤に対する感受性の検討
マウスリンパ系細胞株Ｂａ／Ｆ３細胞は、増殖因子であるＩＬ－３依存性細胞株であり、その増殖にＩＬ－３を必要とするが、がん化遺伝子（例えば、チロシンキナーゼ融合遺伝子）を導入することにより、ＩＬ－３を添加しなくても増殖できるようになることが知られている（Daley GQ and Baltimore D. Proc Natl Acad Sci USA. 1988 Dec;85(23):9312-9316.）。
本実施例では、親株Ｂａ/Ｆ３細胞及び実施例６で作製したｐＬｅｎｔｉ６－ＰＸＮ－ＢＲＡＦ又はｐＬｅｎｔｉ６－ＧＭＤＳ－ＢＲＡＦを導入したＢａ／Ｆ３細胞について、細胞数２０００の状態から、所定濃度のＢＲＡＦ阻害剤（trametinib）を添加し、７２時間培養した後の細胞数をカウントすることにより、ＢＲＡＦ阻害剤に対する感受性を検討した。より具体的な試験方法については、例えば、Ｋａｔａｙａｍａらの文献（Katayama R et al., Sci Transl Med, 2012(4):120ra17）を参照することができる。

【0168】

結果を図４に示す。コントロールである親株Ｂａ／Ｆ３細胞（ＩＬ－３濃度＝０．５ｎｇ／ｍＬ）では、ＢＲＡＦ阻害剤の濃度が細胞毒性を示す過剰量を超えない場合には、細胞増殖能に影響は認められなかった。一方、ｐＬｅｎｔｉ６－ＰＸＮ－ＢＲＡＦ又はｐＬｅｎｔｉ６－ＧＭＤＳ－ＢＲＡＦを導入したＢａ／Ｆ３細胞（ＩＬ－３非添加）では、いずれの融合遺伝子においても、ＢＲＡＦ阻害剤により、濃度依存的に細胞増殖が顕著に抑制された。
この結果は、ＢＲＡＦ阻害剤が、ＰＸＮ－ＢＲＡＦ又はＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合遺伝子陽性のがん患者の治療に有効であることを示すと同時に、ｐＬｅｎｔｉ６－ＰＸＮ－ＢＲＡＦ又はｐＬｅｎｔｉ６－ＧＭＤＳ－ＢＲＡＦを導入したＢａ／Ｆ３細胞を用いる本評価系が、当該融合遺伝子陽性のがん患者の治療に有効な薬剤をスクリーニングするために用いることができることを示すものである。

【0169】

［実施例８］ＰＸＮ－ＢＲＡＦ又はＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合ポリペプチド発現細胞におけるＢＲＡＦ阻害剤によるＰＸＮ－ＢＲＡＦ又はＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合ポリペプチドのリン酸化抑制の検討
実施例７で確認した、ＢＲＡＦ阻害剤によるＰＸＮ－ＢＲＡＦ又はＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合ポリペプチド発現細胞の増殖抑制が、ＰＸＮ－ＢＲＡＦ又はＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合ポリペプチドのＭＥＫ（MAPK/ERK kinase）に対するキナーゼ活性が阻害されたことによるものであることを確認するために、ＢＲＡＦ阻害剤で処理した各培養細胞由来抽出物のウェスタンブロッティングを行った。
結果を図５に示す。リン酸化ＭＥＫの検出には抗リン酸化ＭＥＫ抗体を使用し（図５におけるｐＭＥＫ）、ＭＥＫの検出には抗ＭＥＫ抗体を使用した。ＭＥＫのポリペプチド量については、ＢＲＡＦ阻害剤の処理の有無（及び処理濃度）に関してほとんど差異は認められなかった。一方、ＰＸＮ－ＢＲＡＦ又はＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合ポリペプチドのＭＥＫに対するリン酸化は、ＢＲＡＦ阻害剤による処理により、濃度依存的に顕著に減少しており、ＰＸＮ－ＢＲＡＦ又はＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合ポリペプチドのキナーゼ活性が阻害されることにより、ＰＸＮ－ＢＲＡＦ又はＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合ポリペプチドのＭＥＫに対するリン酸化が抑制されることが確認された。

【0170】

以上より、本発明において、一部の消化器がん患者においてＰＸＮ又はＧＭＤＳ遺伝子とＢＲＡＦ遺伝子との融合遺伝子が存在し、その遺伝子ががんの原因となっていることが明らかとなった。即ち、ＢＲＡＦ阻害薬物治療の対象となるがん患者を、ＰＸＮ－ＢＲＡＦ又はＧＭＤＳ－ＢＲＡＦ融合遺伝子を検出することで、好ましくは、ＰＸＮｅｘ６－ＢＲＡＦｅｘ１１又はＧＭＤＳｅｘ１－ＢＲＡＦｅｘ９を検出することで選別できることが明らかとなった。

【産業上の利用可能性】

【0171】

本発明の検出方法は、ＢＲＡＦ融合体陽性のがん患者の判定に有用である。本発明の検出用キット及びプライマーセットは、前記検出方法に用いることができる。本発明の阻害物質スクリーニング方法は、当該融合体陽性のがん患者の治療に有効な物質をスクリーニングするのに用いることができる。前記スクリーニングにより得られる物質は、当該融合体陽性のがんの治療用医薬組成物の有効成分として使用することができる。前記検出方法により、当該融合体陽性のがん患者と判定された患者に、前記物質を投与することにより、がんを治療することができる。
本発明の検出方法は、ＰＸＮ又はＧＭＤＳ融合体陽性のがん患者の判定に有用である。本発明の検出用キット及びプライマーセットは、前記検出方法に用いることができる。本発明の阻害物質スクリーニング方法は、当該融合体陽性のがん患者の治療に有効な物質をスクリーニングするのに用いることができる。前記スクリーニングにより得られる物質は、当該融合体陽性のがんの治療用医薬組成物の有効成分として使用することができる。前記検出方法により、当該融合体陽性のがん患者と判定された患者に、前記物質を投与することにより、がんを治療することができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。

【配列表フリーテキスト】

【0172】

配列表の配列番号５～１０の配列で表される塩基配列は、合成プライマー配列である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

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