(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-01-25
(45)【発行日】2022-02-02
(54)【発明の名称】光誘発性ウイルス療法の遠隔制御
(51)【国際特許分類】
A61K 35/76 20150101AFI20220126BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220126BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220126BHJP
A61K 35/761 20150101ALI20220126BHJP
A61K 47/02 20060101ALI20220126BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20220126BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20220126BHJP
C12N 7/00 20060101ALI20220126BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20220126BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20220126BHJP
C12N 15/864 20060101ALN20220126BHJP
C12N 15/867 20060101ALN20220126BHJP
C12N 15/861 20060101ALN20220126BHJP
A61K 9/14 20060101ALN20220126BHJP
【ＦＩ】
A61K35/76 ZNA
A61K48/00
A61P35/00
A61K35/761
A61K47/02
A61K45/00
A61K38/16
C12N7/00
C12N7/01
C12N15/12
C12N15/864 100Z
C12N15/867 Z
C12N15/861 Z
A61K9/14
【請求項の数】
13
(21)【出願番号】P 2019523822
(86)(22)【出願日】2017-11-03
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-02-06
(86)【国際出願番号】 US2017059882
(87)【国際公開番号】W WO2018085630
(87)【国際公開日】2018-05-11
【審査請求日】2019-07-08
(31)【優先権主張番号】62/417,946
(32)【優先日】2016-11-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】505008028
【氏名又は名称】中央研究院
【氏名又は名称原語表記】ＡＣＡＤＥＭＩＡ ＳＩＮＩＣＡ
【住所又は居所原語表記】１２８ Ａｃａｄｅｍｉａ Ｒｏａｄ，Ｓｅｃｔｉｏｎ ２，Ｎａｎｋａｎｇ Ｔａｉｐｅｉ，Ｔａｉｗａｎ
(73)【特許権者】
【識別番号】506292158
【氏名又は名称】国立台湾大学
【氏名又は名称原語表記】Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｔａｉｗａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ． １， Ｒｏｏｓｅｖｅｌｔ Ｒｄ． Ｓｅｃ．４， Ｄａ‘ａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｔａｉｐｅｉ，Ｔａｉｗａｎ
(74)【代理人】
【識別番号】100094569
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 伸一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100103610
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100123777
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 さつき
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(74)【代理人】
【識別番号】100111501
【弁理士】
【氏名又は名称】滝澤 敏雄
(72)【発明者】
【氏名】楊 ▲パン▼池
(72)【発明者】
【氏名】曾 士傑
(72)【発明者】
【氏名】廖 子嫻
【審査官】六笠 紀子
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１６－５１７４４８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１３－５２６６１６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００９－１１４０６６（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２００５／０９５６２１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Theranostics，2015年，Vol.5,No.7，p.667-685
【文献】医学のあゆみ，2016年09月，Vol.258,No.11，p.1063-1067
【文献】竹原清人，遺伝学的にコードされた光感受性物質を用いた標的化光線力学ウイルス療法，岡山大学医歯薬学総合研究科病態制御科学専攻 医学博士学位論文，2016年03月，URL:http://ousar.lib.okayama-u.ac.jp/files/public/5/54260/20160621152646110128/K0005277_abstract_review.pdf[検索日2020.06.22]
【文献】Nano Lett.，2006年，6(4)，p.587-591
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３５／００－３５／７６８
Ａ６１Ｋ ４８／００
Ａ６１Ｐ ３５／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
磁性酸化物ナノ粒子と化学的に共役して共有結合を形成したウイルス粒子を含む、磁性ウイルス粒子であって、光増感剤が前記ウイルス粒子内にカプセル化されており、
前記化学的な共役は、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を介した共役であり、
前記磁性酸化物ナノ粒子／前記１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）のモル比は、１／１～１／２０であり、
前記磁性酸化物ナノ粒子は、酸化鉄ナノ粒子である、前記磁性ウイルス粒子。
【請求項2】
前記磁性ウイルス粒子は、前記磁性酸化物ナノ粒子と化学的に共役して共有結合を形成したウイルス粒子を含む鉄化ウイルス粒子である、請求項１に記載の磁性ウイルス粒子。
【請求項3】
前記磁性酸化物ナノ粒子は、１～１００ｎｍの範囲の直径を有する、請求項１または２に記載の磁性ウイルス粒子。
【請求項4】
前記磁性酸化物ナノ粒子は、１～２０ｎｍの範囲の直径を有する、請求項３に記載の磁性ウイルス粒子。
【請求項5】
前記ウイルス粒子は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子、レンチウイルス粒子、またはアデノウイルス粒子である、請求項１～４のいずれか一項に記載の磁性ウイルス粒子。
【請求項6】
前記ウイルス粒子は、ＡＡＶ粒子であり、ＡＡＶ血清型１～９のいずれか１つである、請求項５に記載の磁性ウイルス粒子。
【請求項7】
前記光増感剤は、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄタンパク質を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の磁性ウイルス粒子。
【請求項8】
前記ＫｉｌｌｅｒＲｅｄタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の磁性ウイルス粒子。
【請求項9】
請求項１～８のいずれか一項に記載の磁性ウイルス粒子を含む、腫瘍治療用医薬組成物。
【請求項10】
前記腫瘍部位は、肺、腎臓、心臓、脳、膀胱、皮膚、乳房、または腸にある、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項11】
１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）およびＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミド（Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ）の存在下で磁性酸化物ナノ粒子とウイルス粒子とが化学的に共役して共有結合を形成する工程を含む、磁性ウイルス粒子の製造方法であって、光増感剤が前記ウイルス粒子内にカプセル化されており、
前記化学的な共役は、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を介した共役であり、
前記磁性酸化物ナノ粒子／前記１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）のモル比は、１／１～１／２０であり、
前記磁性酸化物ナノ粒子は、酸化鉄ナノ粒子であり、
前記共役が、
（ｉ）１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）の存在下で、磁性酸化物ナノ粒子をカルボン酸と混合して、混合物を形成する工程、
（ｉｉ）Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミド（Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ）を混合物に入れて、アミン反応性ＮＨＳエステルで修飾された磁性酸化物ナノ粒子を形成する工程、および
（ｉｉｉ）修飾された磁性酸化物ナノ粒子をウイルス粒子と共にインキュベートして、磁性ウイルス粒子を形成する工程、
を含む、前記磁性ウイルス粒子の製造方法。
【請求項12】
前記光増感剤は、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄタンパク質を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記ＫｉｌｌｅｒＲｅｄタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、２０１６年１１月４日に出願された米国仮特許出願第６２／４１７，９４６号の出願日の権益を主張し、その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【0002】
癌の革新的な治療法において、ウイルス療法は有望な癌治療薬の一種であり、現在、臨床試験ではいくつかの科からのウイルスが評価されている（Ｂｅｌｌら、Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ，２０１４；Ｒｕｓｓｅｌｌら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０１２；Ｍｉｅｓｔら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０１４）。ウイルス療法のほとんどの臨床試験では、患者は腫瘍内注射によってウイルス療法が行われる(Ｍｉｅｓｔら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０１４)。癌治療において、ウイルスの全身性送達の増強は、依然として効果的なウイルス療法の障害である（Ｌｅｄｆｏｒｄ，Ｎａｔｕｒｅ，２０１５；Ｂｅｌｌら、Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ，２０１４；Ｒｕｓｓｅｌｌら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１２；Ｍｉｅｓｔら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０１４；Ｋｏｔｔｅｒｍａｎら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ，２０１４）。効果的で正確な全身性送達を達成することは、ウイルス療法の機会を大幅に拡大する。
【0003】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を介した遺伝子送達に係る臨床試験は、多数の単遺伝子性疾患の治療（Ｋｏｔｔｅｒｍａｎら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ，２０１４；Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｎａｔｕｒｅ，２０１５）および組織工学の開発（Ｙｏｏら、Ａｄｖ．Ｈｅａｌｔｈｃ．Ｍａｔｅｒ．，２０１６）を成功させた。指向性局在化は、治療量を減少させるので、変異誘発をもたらすＡＡＶ指向性免疫応答、異所性発現および癌遺伝子活性化の危険性を低下させる。また、ＡＡＶキャプシドの工学（Ｌｉｓｏｗｓｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１４）およびＡＡＶゲノムからのＣｐＧモチーフの排除（Ｆａｕｓｔら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ、２０１３）に対する改良されたアプローチは、ヒトのＡＡＶへの自然曝露から生じる中和抗体との結合を回避することを可能にすることにより、ＡＡＶの免疫原性を低減する。興味のあることに、ＡＡＶキャプシドは、核局在化配列でタグ付けされた光スイッチ可能タンパク質に結合した光依存性因子モチーフを発現するように設計されており、光に曝されると、遺伝子送達効率が有意な向上を示す（Ｇｏｍｅｚら、ＡＣＳ Ｎａｎｏ．，２０１６）。しかしながら、適切な投与量で遺伝物質を正確かつ特異的に送達することは、大きな課題となっている。ウイルスが全身投与された際、肝臓は、しばしばデフォルトの目的地となり（Ｋｏｔｔｅｒｍａｎら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ，２０１４）、他の臓器／組織が意図された標的である場合では、障壁となる。
【発明の概要】
【0004】
本開示は、少なくとも部分的には、磁性ウイルス粒子、例えば、磁場が印加される部位にうまく局在化された、光増感剤タンパク質（例えば、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄタンパク質）を担持する鉄化ウイルス粒子の開発に基づいている。そのような鉄化されたＡＡＶ２粒子は、光誘発ウイルス療法に使用される場合、腫瘍増殖をうまく減少させる。
【0005】
ゆえに、本開示の一つの態様は、磁性酸化物ナノ粒子（例えば、酸化鉄ナノ粒子）に共役されたウイルス粒子を含む磁性ウイルス粒子（例えば、鉄化ウイルス粒子）を特徴とする。磁性酸化物粒子は、１～１００ｎｍの範囲の直径を有することができる。いくつかの例では、磁性酸化物粒子は、５ｎｍの平均直径を有することができる。いくつかの実施形態では、ウイルス粒子は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子、例えば、血清型１～９（例えば、ＡＡＶ２）粒子のいずれか１つ、レンチウイルス粒子、またはアデノウイルス粒子である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の磁性ウイルス粒子のいずれも、配列番号１のアミノ酸配列を含み得るＫｉｌｌｅｒＲｅｄタンパク質のような光増感剤タンパク質を担持することができる。
【0006】
別の態様では、本開示は、（ｉ）本明細書に記載のＫｉｌｌｅｒＲｅｄタンパク質のような光増感剤を担持する磁性ウイルス粒子（光増感剤を含む）を、有効量で、必要とする対象に投与する工程、（ｉｉ）対象の腫瘍部位に磁場を印加することにより、腫瘍部位への磁性ウイルス粒子の局在化を誘導する工程、および（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の後に、対象の腫瘍部位に光照射を行う工程を含む、腫瘍の治療方法を提供する。いくつかの実施形態において、工程（ｉｉｉ）は、５４０～５８０ｎｍ（例えば、５６１ｎｍ）の波長で行われる。あるいは、さらに、腫瘍部位は、肺、腎臓、心臓、膀胱、皮膚、乳房、または腸にある。
【0007】
さらに別の態様では、本開示は、１つ以上の架橋剤の存在下で磁性酸化物ナノ粒子（例えば、酸化鉄ナノ粒子）をウイルス粒子に化学的に共役させる工程を含む、本明細書に記載の鉄化ウイルス粒子のような磁性ウイルス粒子の製造方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記化学的共役は、エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を介した共役に関与する。
【0008】
いくつかの例では、本明細書に記載の製造方法は、（ｉ）カルボキシル活性化剤の存在下で、酸化鉄ナノ粒子のような磁性酸化物ナノ粒子をカルボン酸と混合して、混合物を形成する工程、（ｉｉ）カルボキシル基をアミン反応性ＮＨＳエステルに変換させることができる試薬を混合物に入れて、アミン反応性ＮＨＳエステルで修飾された磁性酸化物ナノ粒子を形成する工程、および（ｉｉｉ）修飾された磁性酸化物ナノ粒子をウイルス粒子と共にインキュベートして、磁性ウイルス粒子を形成する工程を含む。前記カルボキシル活性化剤は、カルボジイミド化合物、例えば、ＥＤＣであってもよい。あるいは、さらに、工程（ｉｉ）における試薬は、Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミド（Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ）である。
【0009】
また、（ｉ）本明細書に記載の磁性ウイルス粒子のいずれか１つと薬学的に許容可能な担体とを含む、腫瘍治療用の医薬組成物、（ｉｉ）腫瘍治療用の医薬を製造するための磁性ウイルス粒子の使用は、本開示の範囲内にある。
【0010】
本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細は、以下の説明に記載されている。本発明の他の特徴または利点は、以下の図面およびいくつかの実施形態の詳細な説明から、そして添付の特許請求の範囲からも明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1A-F】図１は遠隔制御の「鉄化」ウイルスを示す図である。図１Ａ：マイクロウイルス療法のための単一尾静脈注射による遠隔指向の鉄化ウイルスの概念である。鉄化ＡＡＶ２は、磁場強制送達で指向されると、標的腫瘍部位に急速に蓄積する。ここで、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄは、ＡＡＶ２－ＫｉｌｌｅｒＲｅｄで感染された腫瘍細胞によって発現される。光は、ウイルス療法を作動させる。ＫｉｌｌｅｒＲｅｄタンパク質の照射は、ＲＯＳとそれに続く細胞内損傷を引き起こして、細胞死を促進する。図１Ｂ：ＥＤＣ／Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳに関与する二段階共役プロセスを使用して、鉄化ＡＡＶ２を酸化鉄ナノ粒子と共役させるための例示的なプロセスの概略図である。写真は、鉄化ＡＡＶ２の透明黄色溶液を示す。図１Ｃ：カルボン酸を含む酸化鉄ナノ粒子のＴＥＭ画像である。スケール＝５０ｎｍ。図１Ｄ：ナノ粒子／ＥＤＣのモル比（１／２０）で調製された鉄化ＡＡＶ２のＴＥＭ画像は、ウイルスと結合した酸化鉄ナノ粒子を示す。スケール＝２００ｎｍ。図１Ｅ：フローサイトメトリーにより、ナノ粒子／ＥＤＣの様々なモル比についての鉄化ＡＡＶ２による形質導入６日間後のＧＦＰ発現細胞の割合を分析する（#，Ｐ＞０．２５；##，Ｐ＜０．００５；不等分散を仮定した両側ｔ検定に基づく）。データは、６回行った測定の平均値±標準偏差を示す。図１Ｆ：ナノ粒子／ＥＤＣの様々なモル比において、ＨＥＫ２９３細胞を鉄化ＡＡＶ２へ曝露した後の生存率である。細胞生存率は、非曝露細胞と比較して、処理２４時間後に残存する生存細胞の割合として得られる。細胞数は、標準ＭＴＳアッセイにより決定される（*，Ｐ＞０．２；**，Ｐ＞０．５；不等分散を仮定した両側ｔ検定に基づく）。データは、６回行った測定の平均値±標準偏差を示す。
【図2A-E】図２は、マイクロトランスダクションのための遠隔制御「鉄化」ウイルスを示す写真および図を含む。図２Ａ：抗ＡＡＶ２抗体およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）４８８に共役された二次抗体を用いて免疫染色し、磁場曝露期間（５、１０、または３０分間）にわたるＡＡＶ２分布の代表的な共焦点画像である。図２Ｂ：３０分間磁化した未修飾ＡＡＶ２を対照として使用した。スケール＝１０００μｍ。３０分間磁場曝露（直径：１，５００μｍ）でインキュベートし、その後６日間形質導入した、鉄化ＡＡＶ２（図２Ｃおよび図２Ｄ）またはＡＡＶ２（図２Ｅ）で感染したＧＦＰ発現細胞の蛍光強度のプロファイル曲線である。鉄化ＡＡＶ２またはＡＡＶ２で感染したＧＦＰ陽性細胞を示す画像を共焦点顕微鏡で観察した。画像からの全ての蛍光強度を共焦点顕微鏡で分析した。細胞をＤＡＰＩで染色して、細胞核を標識した（赤色蛍光を選択するように調整した）。データは、６回行った測定の平均値を示す。スケール＝１０００μｍ。
【図3A-D】図３は、インビトロでの光誘発ウイルス療法を示す写真および図を含む。図３Ａ：ｐＡＡＶ－ＫｉｌｌｅｒＲｅｄの配列図である。ＡＡＶ２－ＫｉｌｌｅｒＲｅｄは、ｐＡＡＶ－ＫｉｌｌｅｒＲｅｄの発現プラスミドおよびパッケージングプラスミド（ｐＨｅｌｐｅｒおよびｐＡＡＶ－ＲＣ２）によって産生された。図３Ｂ～図３Ｄ：ＫｉｌｌｅｒＲｅｄタンパク質を照射した後、鉄化ＡＡＶ２（図３Ｂおよび図３Ｃ）またはＡＡＶ２（図３Ｄ）で感染した細胞の死滅および核分布の蛍光強度のプロファイルである。細胞は、照射前に、鉄化ＡＡＶ２またはＡＡＶ２で６日間処理し、磁場（直径：１５００μｍ）で３０分間インキュベートした。２０分間照射した後、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ（商標）で固定可能な遠赤死亡細胞染色キット（Ｆｉｘａｂｌｅ Ｆａｒ Ｒｅｄ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ）を用いて、感染された細胞を観察した。図３Ｂ～図３Ｄの右：代表的な共焦点画像は、赤色蛍光（細胞死）を示す。さらに、処理された細胞をＤＡＰＩで染色して細胞核を示し、共焦点画像を赤色蛍光と併合した。画像からの全ての蛍光強度を共焦点顕微鏡により分析した。データは、６回行った測定の平均値を示す。スケール＝１０００μｍ。
【図4A-J】図４は、インビボでの全身遠隔制御ウイルス療法を示す図および写真を含む。図４Ａ：遠隔制御送達を評価する治療プロトコルであり、様々な条件での光誘発性ウイルス療法である。図４Ｂ：磁化（Ｍ）および／または光照射（Ｌ）下で、尾静脈注射による様々なウイルス処理されたＥＧＦＲ－ＴＫＩ耐性ＨＩ９７５（ＥＧＦＲL858R/T790M）異種移植片腫瘍の腫瘍増殖である。腫瘍サイズは、記載された日に、キャリパーによって測定された（*，Ｐ＜０．０１５；**，Ｐ＜０．００１；不等分散を仮定した両側ｔ検定に基づく）。データは、６回行った測定の平均値±標準誤差を示す。図４Ｃ～図４Ｆ：１５日目において、様々な処置後、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）（図４Ｃ）、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニックエンドラベリング（ＴＵＮＥＬ）アッセイ（図４Ｄ）、ＤＡＰＩ（図４Ｅ）、およびプルシアンブルー（図４Ｆ）で染色した、それぞれのグループのマウス（ｎ＝６）からの腫瘍切片の代表的な画像である。スケール＝５００μｍ。図４Ｇ：０日目、２日目、７日目、および１４日目において、鉄化ＡＡＶ２－ＫｉｌｌｅｒＲｅｄを胸腺欠損ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに投与した後、血液から得られた血清の中で、グルタミン酸－オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）、グルタミン酸－ピルビン酸（ＧＰＴ）、総ビリルビン（ＴＢＩＬ）、およびクレアチニン（ＣＲＥ）のレベルの生化学的分析を行った。データは、３回行った測定の平均値±標準偏差を示す。図４Ｈ：様々な処置をした後のマウスの体重である。ＭまたはＬへの曝露の有無での尾静脈注射による様々な製剤の処置に応答して、記載された日に、マウスの体重を測定した。データは、６回行った測定の平均値±標準偏差を示す。図４Ｉ：検出シグナルとしてＡＡＶ２コードルシフェラーゼを使用し、様々な製剤の尾静脈注射後、１４日目に、マウスの代表的なＩＶＩＳ画像を撮影した。図４Ｊ：静脈内注射で様々な治療を受けたマウスからの器官の代表的なＩＶＩＳ画像である。
【図5】図５は、磁場下での局所化ウイルス形質導入を示す写真を含む。図５Ａ～図５Ｂ：共焦点顕微鏡によって観察された、鉄化ＡＡＶ２（図５Ａ）またはＡＡＶ２（図５Ｂ）で感染したＫｉｌｌｅｒＲｅｄ陽性細胞を示す画像である。細胞はＤＡＰＩで染色して細胞核を標識した（青色蛍光）。スケール＝１０００μｍ。
【図7】図７は、生物発光活性化レベルのインビボモニタリングを示す写真である。様々な製剤を尾静脈注射した後、検出シグナルとしてＡＡＶ２－ルシフェラーゼを用いて、７日目に、マウスの代表的なＩＶＩＳ画像を撮影した。
【図8】図８は、ゲル電気泳動およびｐＡＡＶ－ＫｉｌｌｅｒＲｅｄの構築を示す写真を含む。プラスミドｐＡＡＶ－ＫｉｌｌｅｒＲｅｄは、ｐＫｉｌｌｅｒＲｅｄ－ｄＭｉｔｏおよびｐＡＡＶ－ＭＣＳから構築された。ＫｉｌｌｅｒＲｅｄフラグメント（０．７１ｋｂ）は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および方法の節に記載されているプライマーの配列を使用することによって、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ配列のＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ部位に付加した。
【図9】図９は、鉄化ＡＡＶ２混合溶液の例示的な精製および溶媒交換プロセスを示す概略図である。鉄化ＡＡＶ２の合成は、図１Ｂにおける化学的共役に従って調製した。共役反応の後、ＰＢＳ溶液に溶媒交換されたサイズ脱塩カラム（分子量カットオフ：１００Ｋ）により、鉄化ＡＡＶ２の黄色混合溶液を精製した。
【図10】図１０は、相対ウイルス力価の決定を示す図を含む。ＡＡＶ－ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ ＤＮＡの検出は、方法の節に記載されているプライマーの配列を用いて逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）により決定した。様々な数のゲノムコピー（ＧＣ）でのＡＡＶ２－ＫｉｌｌｅｒＲｅｄのＲＴ－ＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動によって分析した（図の上半部）。得られた断片は、予想サイズの５３９ｂｐと一致した。標準曲線は、ＡＡＶ－ＫｉｌｌｅｒＲｅｄのＧＣ番号のデータ点とＩｍａｇｅ Ｊソフトウェアによって得られたそれらのバンド強度を表示した（図の下半部）。未知の含有量を有する（図９より）鉄化ＡＡＶ２－ＫｉｌｌｅｒＲｅｄのＲＴ－ＰＣＲサンプルは、精製および溶媒交換の後に、線形回帰によって定量的に校正した。ラダー：分子サイズマーカー、ＮＴＣ：テンプレート制御なし。
【発明を実施するための形態】
【0012】
本明細書に係る磁性（例えば、鉄化）ウイルス粒子、例えば、ＡＡＶ２ウイルス粒子は、磁場が印加される部位にうまく戻ることが示される。このような磁性ウイルス粒子は、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄのような光増感剤タンパク質を担持し、磁場の誘導を介して腫瘍部位に帰着するとき、腫瘍に対して光誘発毒性を示す。
【0013】
磁性ウイルス粒子およびその製造方法
本明細書に記載の磁性ウイルス粒子は、酸化鉄ナノ粒子のような磁性粒子に付着した任意のウイルス粒子であってもよい。いくつかの場合において、ウイルス粒子は、ウイルス遺伝物質（例えば、ウイルスの種類に応じるＤＮＡまたはＲＮＡ）を封入したウイルスタンパク質を含有してもよく、これは、ウイルス粒子の集合を容易にすることができる。当該ウイルス遺伝物質としては、野生型対応物に比べて、本明細書に記載の方法に使用されるウイルス粒子が自己複製することができないような、欠陥があるものであることが好ましい。さらに、当該ウイルス粒子は、天然の宿主細胞に感染することができないように修飾されてもよく、例えば、細胞受容体との相互作用に関与するウイルスタンパク質に欠陥がある。あるいは、本明細書に記載のウイルス粒子は、ウイルス遺伝物質を含まない。このようなウイルス粒子は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）としても知られており、当技術分野において公知の方法によって調製することができる。当該ウイルス粒子は、適切なウイルス起源に由来することができる。いくつかの実施形態において、ウイルス粒子は、レンチウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルスに由来する。
本明細書に記載の磁性ウイルス粒子は、酸化鉄ナノ粒子のような磁性粒子に付着した任意のウイルス粒子であってもよい。いくつかの場合において、ウイルス粒子は、ウイルス遺伝物質（例えば、ウイルスの種類に応じるＤＮＡまたはＲＮＡ）を封入したウイルスタンパク質を含有してもよく、これは、ウイルス粒子の集合を容易にすることができる。当該ウイルス遺伝物質としては、野生型対応物に比べて、本明細書に記載の方法に使用されるウイルス粒子が自己複製することができないような、欠陥があるものであることが好ましい。さらに、当該ウイルス粒子は、天然の宿主細胞に感染することができないように修飾されてもよく、例えば、細胞受容体との相互作用に関与するウイルスタンパク質に欠陥がある。あるいは、本明細書に記載のウイルス粒子は、ウイルス遺伝物質を含まない。このようなウイルス粒子は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）としても知られており、当技術分野において公知の方法によって調製することができる。当該ウイルス粒子は、適切なウイルス起源に由来することができる。いくつかの実施形態において、ウイルス粒子は、レンチウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルスに由来する。
【0014】
酸化鉄ナノ粒子のような磁性酸化物ナノ粒子は、磁性酸化物粒子（例えば、酸化鉄粒子）である。本明細書で使用される「ナノ粒子」という用語は、例を挙げると、１００ｎｍ以下の粒径のものを指し、例えば、約０．５ｎｍ～約１００ｎｍ、約１ｎｍ～約５０ｎｍ、約１ｎｍ～約２５ｎｍ、または約１ｎｍ～約１０ｎｍである範囲が挙げられる。粒径は、金属粒子の平均直径を指し、ＴＥＭ（透過型電子顕微鏡）のような従来の方法によって決定することができる。一般的に、本明細書に記載の方法から得られた金属ナノ粒子には、複数の粒径が存在することができる。いくつかの実施形態において、異なるサイズの金属含有ナノ粒子の存在は許容可能である。
【0015】
本明細書に記載の酸化鉄ナノ粒子のような磁性酸化物ナノ粒子は、１～１００ｎｍの範囲の直径を有することができる。いくつかの場合において、当該酸化鉄ナノ粒子は、マグネタイト（Ｆｅ3Ｏ4）またはその酸化形態であり得る。酸化フェライト（マグネタイト）は、天然産の鉱物であり、ＭＲＩ、磁気分離、磁性薬物送達のような多様な生物学的用途に超常磁性ナノ粒子の形で広く使用されている（Ｍｏｄｙら、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｎａｎｏ ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１４，４（４）：ｐｐ３８５～３９２）。本開示で使用される酸化鉄ナノ粒子は、１～８０ｎｍの範囲の直径を有することができ、例えば、１～６０ｎｍ、１～５０ｎｍ、１～４０ｎｍ、１～３０ｎｍ、１～２０ｎｍ、１～１０ｎｍ、３～１０ｎｍまたは５～１０ｎｍである。特定の一例では、本開示で使用される酸化鉄ナノ粒子は、２０ｎｍ、１５ｎｍ、１０ｎｍ、５ｎｍ、または２ｎｍの平均直径を有する。いくつかの実施形態において、全体における酸化鉄ナノ粒子の直径は、平均直径の５０％以内（例えば、４０％、３０％、２０％、または１０％）の変動がある。
【0016】
本明細書に記載の磁性ウイルス粒子は、１つ以上の架橋剤を用いて、磁性酸化物ナノ粒子をウイルス粒子（例えば、ウイルスタンパク質またはウイルス核酸）に共役させる任意の従来の方法を使用することにより、製造することができる。タンパク質、核酸および薬物は、当技術分野で公知のいくつかの手順に従ってナノ粒子に共役することができ、例えば、１層ずつ、１－エチル－３－［３－ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドを使用するか、または、１－エチル－３－［３－ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドとポリエチレンイミンを使用する。図１Ｂは、鉄化ＡＡＶ２ウイルス粒子を製造するためのフローチャートの例示的説明図を提供する。この例示的なプロセスでは、酸化鉄ナノ粒子のような磁性酸化物ナノ粒子は、カルボキシル活性化剤（例えば、ＥＤＣ）の存在下で、適切な条件により、適切な期間にわたって、カルボン酸とインキュベートすることができる。カルボキシル基をアミン反応性ＮＨＳエステルに変換することができる試薬、例えば、Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミド（Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ）を反応混合物に添加し、適切な条件下で適切な時間でインキュベートし、アミノ反応性ＮＨＳエステルで修飾された磁性酸化物ナノ粒子を形成することができ、当該磁性酸化物ナノ粒子は、ウイルスタンパク質の所定のアミノ酸側鎖と反応して共有結合を形成する。次いで、修飾された磁性酸化物ナノ粒子は、適切な溶液（例えば、ＰＢＳ）の中で、組換えウイルス粒子と混合され、例えば、磁性酸化物ナノ粒子が化学的共役を介してウイルス粒子に共役される。
【0017】
本明細書に記載の磁性ウイルス粒子は、従来の方法によってウイルス粒子でカプセル化することが可能な治療薬を担持することができる。いくつかの例では、治療薬は光増感剤であり、当該光増感剤は、光化学的プロセス、例えば、光を照射することにより、細胞毒性剤に変換することができる分子である。光増感剤は、光線力学療法に使用されることにより、様々な疾患、例えば、癌を治療することができる。
【0018】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の磁性ウイルス粒子は、光毒性蛍光タンパク質のようなタンパク質系光増感剤（光増感剤タンパク質）を担持する。例としては、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄタンパク質（例えば、Ｆｒａｎｓｅｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５９５：１６５～１７９；２０１７を参照）、ＫｉｌｌｅｒＯｒａｎｇｅタンパク質（例えば、Ｓａｒｋｉｓｙａｎら、Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ，１０（１２）：ｅ０１４５２８７；２０１５を参照）、またはＳｕｐｅｒｎｏｖａタンパク質（例えば、Ｔａｋｅｍｏｔｏら、Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．３：２６２９；２０１３を参照）を含む。以下、例示的なＫｉｌｌｅｒＲｅｄタンパク質のアミノ酸配列を提供する。
ＭＧＳＥＧＧＰＡＬＦＱＳＤＭＴＦＫＩＦＩＤＧＥＶＮＧＱＫＦＴＩＶＡＤＧＳＳＫＦＰＨＧＤＦＮＶＨＡＶＣＥＴＧＫＬＰＭＳＷＫＰＩＣＨＬＩＱＹＧＥＰＦＦＡＲＹＰＤＧＩＳＨＦＡＱＥＣＦＰＥＧＬＳＩＤＲＴＶＲＦＥＮＤＧＴＭＴＳＨＨＴＹＥＬＤＤＴＣＶＶＳＲＩＴＶＮＣＤＧＦＱＰＤＧＰＩＭＲＤＱＬＶＤＩＬＰＮＥＴＨＭＦＰＨＧＰＮＡＶＲＱＬＡＦＩＧＦＴＴＡＤＧＧＬＭＭＧＨＦＤＳＫＭＴＦＮＧＳＲＡＩＥＩＰＧＰＨＦＶＴＩＩＴＫＱＭＲＤＴＳＤＫＲＤＨＶＣＱＲＥＶＡＹＡＨＳＶＰＲＩＴＳＡＩＧＳＤＥＤ
（配列番号１）
ＭＧＳＥＧＧＰＡＬＦＱＳＤＭＴＦＫＩＦＩＤＧＥＶＮＧＱＫＦＴＩＶＡＤＧＳＳＫＦＰＨＧＤＦＮＶＨＡＶＣＥＴＧＫＬＰＭＳＷＫＰＩＣＨＬＩＱＹＧＥＰＦＦＡＲＹＰＤＧＩＳＨＦＡＱＥＣＦＰＥＧＬＳＩＤＲＴＶＲＦＥＮＤＧＴＭＴＳＨＨＴＹＥＬＤＤＴＣＶＶＳＲＩＴＶＮＣＤＧＦＱＰＤＧＰＩＭＲＤＱＬＶＤＩＬＰＮＥＴＨＭＦＰＨＧＰＮＡＶＲＱＬＡＦＩＧＦＴＴＡＤＧＧＬＭＭＧＨＦＤＳＫＭＴＦＮＧＳＲＡＩＥＩＰＧＰＨＦＶＴＩＩＴＫＱＭＲＤＴＳＤＫＲＤＨＶＣＱＲＥＶＡＹＡＨＳＶＰＲＩＴＳＡＩＧＳＤＥＤ
（配列番号１）
【0019】
光を照射すると、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄタンパク質は活性酸素種（ＲＯＳ）を生成することができ、これは癌細胞のような疾患細胞を殺すために使用できる。ＫｉｌｌｅｒＲｅｄタンパク質の光毒性は、５４０～５８０ｎｍでの緑色光照射によって誘発され、通常の方法で決定可能な光強度照射時間とタンパク質濃度に依存する。
【0020】
本開示に使用されるＫｉｌｌｅｒＲｅｄタンパク質は、配列番号１に対して少なくとも７５％（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％）の配列同一性を有することができ、また、光毒性活性が保存する。２つのアミノ酸配列の「同一性百分率」は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４－６８，１９９０のアルゴリズムを用いて決定され、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－７７，１９９３のように修飾される。このようなアルゴリズムは、ＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０，１９９０）。本発明のタンパク質分子と一致するアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて、ＢＬＡＳＴタンパク質検索を実施することができる。２つの配列の間にギャップが存在する場合は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９－３４０２，１９９７に記載されているように、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを使用することができる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用するとき、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを使用することができる。
【0021】
他の例示的なＫｉｌｌｅｒＲｅｄタンパク質および光毒性蛍光タンパク質は、当該分野では公知であり、また、それらのアミノ酸配列は、公共の遺伝子データベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋから、配列番号１をクエリとして用いることにより得ることができる。例としては、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＹ４０１６８、３Ａ８Ｓ＿Ａ、２ＷＩＱ＿Ａ、ＢＡＮ８１９８４、３ＧＢ３＿Ａ、４Ｂ３０＿Ｂおよび４Ｂ３０＿Ａに記載されているものが挙げられるが、これらに限定されない。例示的なＫｉｌｌｅｒＯｒａｎｇｅタンパク質は、登録番号ＡＱＹ７９１４１、４ＺＦＳ＿Ａおよび４ＺＢＬ＿Ａで、ＧｅｎＢａｎｋに見出すことができる。例示的なＳｕｐｅｒｎｏｖａタンパク質は、登録番号３ＷＣＫ＿ＡでＧｅｎＢａｎｋに提供されている。
【0022】
本明細書に記載の磁性ウイルス粒子のいずれかは、薬学的に許容可能な担体（賦形剤）と混合して、本明細書に記載の治療方法に使用される医薬組成物を形成することができる。「許容可能な」とは、担体が、組成物の活性成分と相溶性があり（好ましくは、活性成分を安定化させることができる）、また治療されるべき対象には有害であってはならないことを意味する。薬学的に許容可能な賦形剤（担体）は、当技術分野において周知である緩衝剤を含む（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２０ｔｈ Ｅｄ．（２０００）Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｅｄ．Ｋ．Ｅ．Ｈｏｏｖｅｒを参照）。薬学的に許容可能な担体の非限定的な例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、食塩水、シロップ、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリアクリル酸、滑沢剤（例えば、タルク、ステアリン酸マグネシウム、および鉱油）、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、保存料（例えば、メチル－、エチル－、プロピル－ヒドロキシ－ ベンゾエート）、ｐＨ調整剤（例えば、無機および有機の酸、ならびに塩基）、甘味剤、ならびに香味剤が挙げられる。
【0023】
本方法に使用される医薬組成物は、凍結乾燥製剤または水溶液タイプの薬学的に許容可能な担体、賦形剤、または安定化剤を含むことができる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２０ｔｈ Ｅｄ．（２０００）Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｅｄ．Ｋ．Ｅ．Ｈｏｏｖｅｒ）。許容可能な担体、賦形剤、または安定化剤は、使用される投与量および濃度では受試者に無毒であり、例えば、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸のような緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンのようなアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンのようなアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストランを含む単糖類、二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールのような糖類；ナトリウムのような塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；及び／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような非イオン性界面活性剤を含むことができる。
【0024】
インビボ投与に使用される医薬組成物は、無菌でなければならない。これは、例えば、滅菌濾過膜を通して濾過することにより容易に達成される。治療用ウイルス粒子組成物は、通常、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルに入れる。
【0025】
本明細書に記載の医薬組成物は、例えば、カプセル剤、散剤、顆粒剤、液剤もしくは懸濁剤のような単位剤形、または非経口投与用の坐剤であり得る。
【0026】
錠剤のような固体組成物を調製するために、主な活性成分を、薬学的担体、例えば、コーンスターチ、ラクトース、スクロース、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウムまたはガムのような従来の錠剤化成分、および水のような他の医薬希釈剤と混合することにより、本発明の化合物またはその無毒性の薬学的に許容可能な塩の均一混合物を含有する固体予備製剤組成物を形成することができる。これらの予備製剤組成物を均質として言及するとき、活性成分が組成物中に均一に分散されているので、組成物は錠剤、丸剤およびカプセル剤のような同等に有効な単位剤形に容易に細分されることができる。次いで、この固体予備製剤組成物を、０．１～約５００ｍｇの本発明の活性成分を含有する上記の種類の単位剤形に細分する。新規組成物の錠剤または丸剤は、コーティングするか、または他の方法で配合することにより、長期作用の利点を提供する剤形を提供することができる。例えば、錠剤または丸剤は、内側剤形および外側剤形の組成成分を含むことができ、後者は前者を覆うエンベロープの形態である。この２つの組成成分は、腸溶層によって分離することができ、当該腸溶層は、胃での崩壊に抵抗し、内部成分が十二指腸に無傷で通過すること、または放出を遅らせることを可能にする。このような腸溶層またはコーティングは、様々な材料を使用することができ、その材料には、多くのポリマー酸、およびポリマー酸とシェラック、セチルアルコールや酢酸セルロースのような材料との混合物が含まれる。
【0027】
適切な界面活性剤としては、特に、ポリオキシエチレンソルビタン（例えば、Ｔｗｅｅｎ（商標）２０、４０、６０、８０または８５）および他のソルビタン（例えば、Ｓｐａｎ（商標）２０、４０、６０、８０または８５）のような非イオン性剤が挙げられる。界面活性剤を含む組成物は、便利上では、０．０５～５％の界面活性剤を含み、また、０．１～２．５％を含んでもよい。必要に応じて、他の成分、例えば、マンニトールまたは他の薬学的に許容可能なビヒクルを加えてもよいことが理解されよう。
【0028】
適切なエマルジョンは、市販の脂肪エマルジョン、例えば、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（商標）、Ｉｎｆｏｎｕｔｒｏｌ（商標）、Ｌｉｐｏｆｕｎｄｉｎ▲およびＬｉｐｉｐｈｙｓａｎ（商標）を使用して調製することができる。活性成分は、予め混合されたエマルジョン組成物に溶解されてもよく、あるいは油（例えば、大豆油、ベニバナ油、綿実油、ゴマ油、コーン油またはアーモンド油）に溶解されてリン脂質（例えば、卵リン脂質、大豆リン脂質または大豆レシチン）および水と混合してエマルジョンを形成してもよい。エマルジョンの張度を調整するために、他の成分、例えば、グリセロールまたはグルコースを添加してもよいことが理解されよう。適切なエマルジョンは、典型的には、２０％以下、例えば、５～２０％の油を含有する。
【0029】
エマルジョン組成物は、磁性ウイルス粒子を、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商用）またはその成分（大豆油、卵リン脂質、グリセロールおよび水）と混合することによって調製することができる。
【0030】
磁性ウイルス粒子を用いた腫瘍の光誘発ウイルス療法
磁性ウイルス粒子は、磁場によって標的化されることができ、または、磁気温熱療法に使用されることができる（Ｃｈａｎ（２００５）； Ｉｔｏ（２００５））。１つ以上の光増感剤を担持する任意の磁性ウイルス粒子は、磁場によって所望の部位（例えば、腫瘍部位）に標的化されることができる。光増感剤は、光を照射すると、細胞傷害剤を生成し、それは所望の部位で腫瘍細胞のような罹患細胞を殺すことができる。
磁性ウイルス粒子は、磁場によって標的化されることができ、または、磁気温熱療法に使用されることができる（Ｃｈａｎ（２００５）； Ｉｔｏ（２００５））。１つ以上の光増感剤を担持する任意の磁性ウイルス粒子は、磁場によって所望の部位（例えば、腫瘍部位）に標的化されることができる。光増感剤は、光を照射すると、細胞傷害剤を生成し、それは所望の部位で腫瘍細胞のような罹患細胞を殺すことができる。
【0031】
本明細書に開示の方法を実施するために、有効量の本明細書に記載の医薬組成物を、静脈内投与のような適切な経路、例えば、ボーラスまたは一定期間にわたる持続注入として、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液内、または髄腔内経路によって、治療を必要とする対象（例えば、ヒト）に投与することができる。液体製剤用の市販のネブライザーは、ジェットネブライザーおよび超音波ネブライザーを含み、投与に有用である。液体製剤は、直接噴霧することができ、凍結乾燥粉末は、再構成後に噴霧することができる。あるいは、本明細書に記載の磁性ウイルス粒子を含有する医薬組成物は、フルオロカーボン製剤および定量吸入器を用いてエアロゾル化するか、または凍結乾燥粉末として吸入することができる。
【0032】
本明細書に記載の方法によって治療される対象は、哺乳動物であってもよく、より好ましくはヒトであり得る。哺乳動物には、家畜、スポーツ動物、ペット、霊長類、ウマ、イヌ、ネコ、マウスおよびラットが含まれるが、これらに限定されない。治療を必要とするヒト対象は、癌のような標的となる疾患／障害を有するか、有する危険性があるか、または有することが疑われるヒト患者であり得る。標的となる疾患または障害を有する対象は、日常的な健康診断、例えば、実験室検査、臓器機能検査、ＣＴスキャン、または超音波検査によって特定することができる。このような標的となる疾患／障害のいずれかを有することが疑われる対象は、疾患／障害の１つ以上の症状を示すことが可能である。疾患／障害の危険性がある対象は、その疾患／障害の危険因子のうちの１つ以上を有する対象であり得る。
【0033】
本明細書で使用される「有効量」という用語とは、単独または１つ以上の他の活性剤と組み合わせることにより、対象に治療効果を付与するための必要な各活性剤の量をいう。当業者による認識されるように、有効量は、治療される特定の症状、症状の重症度、年齢、体調、体格、性別および体重を含む個々の患者のパラメータ、治療の期間、併用療法の性質（もしあれば）、特定の投与経路、および医療従事者の知識と専門知識に含まれる要因のようなものによって異なる。これらの要因は、当業者にはよく知られており、日常的な実験だけで対処することができる。一般には、個々の成分またはそれらの組み合わせの最大用量、すなわち、正しい医学的判断による最も高い安全用量を使用することが好ましい。
【0034】
半減期のような経験的な考慮事項は、通常、投与量の決定に寄与するであろう。投与頻度は、治療の過程において決定および調整することができ、一般には、標的となる疾患／障害の治療および／または抑制、および／または改善、および／または遅延に基づくが、必ずしもそうとは限らない。
【0035】
一般に、本明細書に記載の磁性ウイルス粒子のいずれかを投与する場合、最初の候補投与量は、磁性ウイルス粒子に含まれる光増感剤が約２ｍｇ／ｋｇであり得る。本開示の目的を達成するために、典型的な投与量は、上記の要因によって、約０．１μｇ／ｋｇ～３μｇ／ｋｇ～３０μｇ／ｋｇ～３００μｇ／ｋｇ～３ｍｇ／ｋｇ～３０ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ以上までの範囲とすることができる。必要に応じて、症状により、磁性ウイルス粒子を繰り返し投与して、所望の症状の抑制が起こるまで、または標的となる疾患もしくは障害もしくはその症状を軽減するのに十分な治療レベルが達成されるまで、治療を続けることができる。一つの例示的な投与計画は、約２ｍｇ／ｋｇの初期用量、その後の毎週の約１ｍｇ／ｋｇの光増感剤の維持用量、またはその後の隔週の約１ｍｇ／ｋｇの維持用量の投与を含む。しかしながら、施術者が達成したい薬物動態学的崩壊のパターンに応じて、他の投与計画も有用であり得る。例えば、毎週に１～４回の投与が考えられる。いくつかの実施形態において、約３μｇ／ｍｇ～約２ｍｇ／ｋｇの範囲の投与量（例えば、約３μｇ／ｍｇ、約１０μｇ／ｍｇ、約３０μｇ／ｍｇ、約１００μｇ／ｍｇ、約３００μｇ／ｍｇ、約１ｍｇ／ｋｇおよび約２ｍｇ／ｋｇ）を使用することができる。いくつかの実施形態では、投与頻度は、毎週１回、２週間ごとに１回、４週間ごとに１回、５週間ごとに１回、６週間ごとに１回、７週間ごとに１回、８週間ごとに１回、９週間ごとに１回、もしくは１０週間ごとに１回であり、または、毎月１回、２ヶ月ごとに１回、もしくは３ヶ月ごとに１回、または、それ以上の期間であり得る。この治療法の進行は、従来の技術および分析により、容易にモニターされる。投与計画（使用される光増感剤を含む）は、経時的に変わり得る。
【0036】
いくつかの実施形態において、正常体重の成人患者に対しては、約０．３～５．００ｍｇ／ｋｇの範囲の用量が投与されることができる。いくつかの例では、本明細書に記載の磁性ウイルス粒子における光増感剤（例えば、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ）の投与量は１０ｍｇ ／ ｋｇであってもよい。特定の投与計画、すなわち、用量、タイミングおよび繰り返し回数は、特定の個体およびその個体の病歴、ならびに個々の薬剤の特性（例えば、薬剤の半減期、および当分野でよく知られている他の考慮事項）に依存するであろう。
【0037】
本開示の目的のために、本明細書に記載の光増感剤の適切な投与量は、使用される具体的な光増感剤（またはその組成物）、疾患／障害の種類および重症度、以前の治療、患者の病歴および光増感剤に対する反応、ならびに担当医の裁量に依存する。典型的には、臨床医は、所望の結果を達成する投与量に達するまで、光増感剤を含む磁性ウイルス粒子を投与する。いくつかの実施形態において、所望の結果は、血栓症の減少である。投与量が所望の結果をもたらしたか否かを決定する方法は、当業者にとっては明らかである。同じまたは異なる光増感剤を担持する１つまたは複数の磁性ウイルス粒子の投与は、例えば、受験者の生理学的状態および当業者にとって公知の他の要因に応じて、連続的または断続的であることができる。磁性ウイルス粒子の投与は、予め選択された期間、例えば、標的となる疾患または障害の発症前、発症中、発症後のいずれかにおいて、本質的に連続的であってもよく、または一連の間隔をあけた投与量であってもよい。
【0038】
医薬組成物を対象に投与するために、治療の標的となる疾患の種類または疾患の部位に応じて、医学の当業者に知られている従来の方法を使用することができる。この組成物は、他の従来の経路、例えば、経口投与、非経口投与、吸入スプレー投与、局所投与、直腸投与、経鼻投与、口腔投与、経膣投与、または埋め込み型リザーバーを介して投与されることもできる。本明細書で使用される「非経口」という用語は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液内、胸骨内、髄腔内、病巣内および頭蓋内注射または注入技術を含む。さらに、１ヶ月、３ヶ月または６ヶ月でデポー注射可能または生分解可能な材料および方法を使用するような注射可能なデポー投与経路により、対象に投与することができる。いくつかの例では、医薬組成物は眼内または硝子体内に投与される。
【0039】
注射用組成物は、植物油、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、乳酸エチル、炭酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、エタノール、およびポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）のような様々な担体を含むことができる。静脈内注射の場合には、水溶性抗体は点滴法によって投与することができ、それにより、光増感剤および生理学的に許容可能な賦形剤を担持する磁性ウイルス粒子を含有する医薬製剤を注入する。生理学的に許容可能な賦形剤としては、例えば、５％デキストロース、０．９％食塩水、リンゲル液または他の適切な賦形剤を含むことができる。筋肉内製剤、例えば、適切な可溶性塩形態の光増感剤の無菌製剤は、注射用水、０．９％食塩水、または５％グルコース溶液のような医薬賦形剤に溶解して投与することができる。
【0040】
治療を必要とする受験者（例えば、癌患者）に磁性ウイルス粒子を投与した後、その受験者の所望の部位、例えば、腫瘍部位に磁場を印加することにより、磁性ウイルス粒子を所望の部位に引き寄せるができる。磁場を発生させるために使用する例示的な磁石としては、帯電磁石が電気パルスを所望の部位に送達して静止し（非帯電）、治療領域に一定期間固定することにより、連続治療を送達することを含むが、これに限定されない。磁性ウイルス粒子を所望の部位にホーミングすることを可能にするために、適切な期間において磁場を所望の部位に印加することができる。その後、適切な光照射を同じ部位に適用して、磁性ウイルス粒子に含まれる光増感剤を作動させ、細胞毒性分子を放出して罹患細胞（例えば、腫瘍細胞）を死滅させることができる。光照射の適切な波長、強度、および持続時間は、治療に使用される光増感剤（例えば、光毒性蛍光タンパク質）の種類および／または投与量に依存する。一つの例では、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄタンパク質を使用し、緑色光（例えば、５４０～５８０ｎｍの波長）を使用して、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄタンパク質の光毒性を誘発することができる。上記のＫｉｌｌｅｒＯｒａｎｇｅおよびＳｕｐｅｒｎｏｖａを含む他の光毒性蛍光タンパク質も使用することができる。
【0041】
本明細書に記載の光誘発ウイルス療法は、固形腫瘍のような癌を治療するために適用することができる。本明細書で使用される「治療する」という用語とは、標的となる疾患または障害、疾患／障害の症状、または疾患／障害に対する素因を有する受験者に、１つ以上の活性剤を含む組成物を適用または投与して、障害、疾患の症状、または疾患または障害に対する素因を治療、治癒、緩和、軽減、変更、善後、改善、改進または影響することを目的としたものを意味する。
【0042】
標的となる疾患／障害を緩和することは、疾患の発展もしくは進行を遅延させること、または、疾患の重症度を軽減することを含む。病気を緩和することは、必ずしも治療結果が必要とは限らない。本明細書で使用される「標的となる疾患または障害の発展を『遅延させる』」とは、疾患の進行を延期、妨害、徐行、後回、安定化、および／または遅らせることを意味する。この遅延は、疾患および／または治療されている個体の病歴に応じて、様々な長さの時間であり得る。疾患の発展を「遅延させる」もしくは緩和させるまたは疾患の発症を遅延させる方法は、この方法を使用しない場合と比較して、所定の期間内において疾患の１つ以上の症状を発展する確率および／または所定の期間内において症状の程度を低減させる方法である。このような比較は、通常、統計的に有意な結果を得るのに十分な数の対象を用いた臨床試験に基づいている。
【0043】
疾患の「発展」または「進行」とは、疾患の初期兆候および／またはその後の進行を意味する。疾患の発展は、当技術分野において周知の標準的な臨床技術を使用して、検出および評価することができる。しかし、発展とは、検出できないかもしれない進行をも意味する。本開示の目的のために、発展または進行とは、症状の生物学的過程を意味する。「発展」とは、発生、再発および発症を含む。本明細書で使用される「標的となる疾患または障害の『発症』または『発生』」とは、初期発症および／または再発を含む。
【0044】
光誘発ウイルス療法に使用されるキット
本開示は、癌のような疾患細胞が関与する疾患／障害の治療に使用されるキットをも提供する。このようなキットは、少なくとも１つの光増感剤を担持する本明細書に記載の磁性ウイルス粒子のいずれかを含む、１つ以上の容器を含むことができる。
本開示は、癌のような疾患細胞が関与する疾患／障害の治療に使用されるキットをも提供する。このようなキットは、少なくとも１つの光増感剤を担持する本明細書に記載の磁性ウイルス粒子のいずれかを含む、１つ以上の容器を含むことができる。
【0045】
いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載の任意の方法に従って使用される説明書を含むことができる。含まれる説明書は、癌のような標的疾患に対する光誘発ウイルス療法に使用される磁性ウイルス粒子の投与についての説明を含むことができる。キットは、個体が標的疾患を有するか否かを同定することにより、治療に適した個体を選択することについての説明をさらに含むことができる。さらに、他の実施形態では、説明書は、標的疾患の危険性がある個体に磁性ウイルス粒子を投与することについての説明を含む。
【0046】
磁性ウイルス粒子および／またはその中に含まれる光増感剤の使用に関する説明書は、一般に、意図される治療の投与量、投与スケジュール、および投与経路に関する情報を含む。容器は、単位用量、バルクパッケージ（例えば、複数回用量パッケージ）またはサブユニット用量であることができる。本発明のキットで提供される説明書は、典型的には、ラベルまたは添付文書（例えば、キットに含まれる紙のシート）上に書かれた説明書であるが、機械可読の説明書（例えば、磁気または光学記憶ディスク上で記録された指示）も許容可能である。
【0047】
ラベルまたは添付文書は、癌のような標的疾患の治療、発症の遅延および／または緩和のために組成物を使用することを示す。本明細書に記載の方法のいずれかを実施するための説明書を提供することができる。
【0048】
本開示のキットは、適切な包装中にある。適切な包装としては、バイアル、ボトル、ジャー、可撓性包装（例えば、密封マイラーまたはビニール袋）などが挙げられるが、これらに限定されない。また、吸入器、経鼻投与装置（例えば、アトマイザー）のような特定の装置またはミニポンプのような注入装置と組み合わせて使用するパッケージも考えられる。キットは、滅菌アクセスポートを有することができる（例えば、容器は、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであり得る）。容器は、滅菌アクセスポートを有することができる（例えば、容器は、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであり得る）。組成物の中の少なくとも１つの活性剤は、本明細書に記載のような光増感剤を担持する磁性ウイルス粒子である。
【0049】
キットは、緩衝液および解釈情報のような追加の構成要素を選択的に提供してもよい。通常、キットは、容器、および容器上にあるまたは付随するラベルもしくは添付文書を含む。いくつかの実施形態において、本発明は、上記のキットの内容物を含む製品を提供する。
【0050】
一般的な技術
本発明の実施は、他に示さない限り、当該分野の技術の範囲内にある分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の技術を使用する。このような技術は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ； Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ ａｎｄ Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９９３－８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．，１９８７）、ＰＣＲ： Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｍｕｌｌｉｓら、ｅｄｓ．，１９９４）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９９）、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ ａｎｄ Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８８－１９８９）； Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００）、 Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９）、Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．，Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）などの文献に十分に説明されている。
本発明の実施は、他に示さない限り、当該分野の技術の範囲内にある分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の技術を使用する。このような技術は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ； Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ ａｎｄ Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９９３－８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．，１９８７）、ＰＣＲ： Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｍｕｌｌｉｓら、ｅｄｓ．，１９９４）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９９）、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ ａｎｄ Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８８－１９８９）； Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００）、 Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９）、Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．，Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）などの文献に十分に説明されている。
【0051】
さらに詳述しなくても、当業者であれば、上記の説明に基づいて本発明を最大限に利用することができると考えられる。したがって、以下の特定の実施例は、単なる例示として解釈されるべきであり、いかなる意味においても本開示の残りの部分を限定するものではない。本明細書で引用された全ての刊行物は、本明細書で参照された目的または主題のために参照により組み込まれる。
【実施例】
【0052】
臨床ウイルス療法は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により、癌治療への使用が承認されているが、ウイルス療法をより広く開発するために、多くの改善が求められている。特別な挑戦としては、ウイルス療法を全身的に投与し、腫瘍内、特に、敏感な臓器内の複雑な腫瘍に対する注射の制限を克服することである。目的を達成するために、酸化鉄ナノ粒子（～５ｎｍ）と化学的に共役された組換えアデノ随伴ウイルス血清型２（ＡＡＶ２）を構築し、これは磁場下で顕著な遠隔誘導能力を示した。形質導入は、マイクロスケールの精度で行われた。さらに、感光性タンパク質ＫｉｌｌｅｒＲｅｄを産生するための遺伝子をＡＡＶ２ゲノムに導入するころにより、光線力学療法（ＰＤＴ）または光誘発性のウイルス療法を実現した。インビボ実験は、尾静脈注射された「鉄化」ＡＡＶ２－ＫｉｌｌｅｒＲｅｄの磁気誘導がＰＤＴと結合して、アポトーシスにより、腫瘍増殖を有意に減少させることを示した。この原理の証明は、誘導および高度に局所化されたマイクロスケールの光誘発ウイルス療法を実証している。
【0053】
材料および方法
材料と細胞培養
カルボン酸を有する酸化鉄ナノ粒子（ロット番号：０５１４１３Ａ、サイズ：５ｎｍ、ゼータ電位：－３０ｍＶ～－５０ｍＶ）は、Ｏｃｅａｎ ＮａｎｏＴｅｃｈ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）（ＥＤＣ）、Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミド（Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ）、および２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝食塩水は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）から購入した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）は、Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。分岐ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｍｗ＝２５，０００）は、Ａｌｄｒｉｃｈ（ミルウォーキー、ＭＩ）から購入した。ｐＫｉｌｌｅｒＲｅｄ－ｄＭｉｔｏのプラスミドＤＮＡは、Ｅｖｒｏｇｅｎ ＪＳＣ（Ｍｏｓｃｏｗ、Ｒｕｓｓｉａ）から購入した。ウイルス（ＡＡＶ２－ルシフェラーゼ）およびｐＨｅｌｐｅｒ、ｐＡＡＶ－ＲＣ２、ｐＡＡＶ－ＧＦＰ、およびｐＡＡＶ－ＭＣＳのプラスミドＤＮＡは、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。プラスミドｐＡＡＶ－ＫｉｌｌｅｒＲｅｄは、以下のようにして構築した。まず、以下のプライマー配列：５'－ＧＧＣＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＴＴＣＡＧＡＧＧＧＣＧＧＣＣＣＣＧＣＣＣ－３'（配列番号５）および５'－ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＡＴＣＣＴＣＧＴＣＧＣＴＡＣＣＧＡＴＧＧＣＧＣＴＧＧＴ－３'（配列番号２）を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用することにより、ｐＫｉｌｌｅｒＲｅｄ－ｄＭｉｔｏからのＫｉｌｌｅｒＲｅｄフラグメントにＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ部位を付加した。次いで、ＰＣＲで生成したＫｉｌｌｅｒＲｅｄ ｃＤＮＡ（０．７１ｋｂ）をｐＡＡＶ－ＭＣＳのＥｃｏＲＩ－Ｓａｌｌ部位にクローニングして、ｐＡＡＶ－ＫｉｌｌｅｒＲｅｄを得た（図３Ａおよび図８）。
材料と細胞培養
カルボン酸を有する酸化鉄ナノ粒子（ロット番号：０５１４１３Ａ、サイズ：５ｎｍ、ゼータ電位：－３０ｍＶ～－５０ｍＶ）は、Ｏｃｅａｎ ＮａｎｏＴｅｃｈ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）（ＥＤＣ）、Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミド（Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ）、および２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝食塩水は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）から購入した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）は、Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。分岐ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｍｗ＝２５，０００）は、Ａｌｄｒｉｃｈ（ミルウォーキー、ＭＩ）から購入した。ｐＫｉｌｌｅｒＲｅｄ－ｄＭｉｔｏのプラスミドＤＮＡは、Ｅｖｒｏｇｅｎ ＪＳＣ（Ｍｏｓｃｏｗ、Ｒｕｓｓｉａ）から購入した。ウイルス（ＡＡＶ２－ルシフェラーゼ）およびｐＨｅｌｐｅｒ、ｐＡＡＶ－ＲＣ２、ｐＡＡＶ－ＧＦＰ、およびｐＡＡＶ－ＭＣＳのプラスミドＤＮＡは、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。プラスミドｐＡＡＶ－ＫｉｌｌｅｒＲｅｄは、以下のようにして構築した。まず、以下のプライマー配列：５'－ＧＧＣＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＴＴＣＡＧＡＧＧＧＣＧＧＣＣＣＣＧＣＣＣ－３'（配列番号５）および５'－ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＡＴＣＣＴＣＧＴＣＧＣＴＡＣＣＧＡＴＧＧＣＧＣＴＧＧＴ－３'（配列番号２）を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用することにより、ｐＫｉｌｌｅｒＲｅｄ－ｄＭｉｔｏからのＫｉｌｌｅｒＲｅｄフラグメントにＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ部位を付加した。次いで、ＰＣＲで生成したＫｉｌｌｅｒＲｅｄ ｃＤＮＡ（０．７１ｋｂ）をｐＡＡＶ－ＭＣＳのＥｃｏＲＩ－Ｓａｌｌ部位にクローニングして、ｐＡＡＶ－ＫｉｌｌｅｒＲｅｄを得た（図３Ａおよび図８）。
【0054】
ヒト胚腎臓２９３（ＨＥＫ２９３、ＣＲＬ－１５７３、ＡＴＣＣ）および２９３Ｔ（ＣＲＬ－３２１６、ＡＴＣＣ）細胞株を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ ｍＬ-1のペニシリン、および１００μｇ ｍＬ-1のストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。細胞は、５％ＣＯ2を含む３７℃のインキュベーター中で培養した。
【0055】
ウイルスの生産、精製および滴定
ＡＡＶ－２ヘルパーフリー包装システム（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、ＡＡＶ２－ＧＦＰまたはＡＶ２－ＫｉｌｌｅｒＲｅｄの生産を行った。簡単に説明すると、ＡＡＶ２レポーターは、２９３Ｔ細胞において、プラスミドＤＮＡ（ｐＨｅｌｐｅｒ、ｐＡＡＶ－ＲＣ２、およびｐＡＡＶトランスジーン）のＰＥＩ媒介同時トランスフェクションにより、産生された。各１００ｍｍ皿について、２９３Ｔ細胞を２０μｇのｐＨｅｌｐｅｒ、１０μｇのｐＡＡＶ－ＲＣ２およびｐＡＡＶ－ＧＦＰ（またはｐＡＡＶ－ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ）でトランスフェクトした。３つのプラスミドＤＮＡを無血清培地に４０μｇのＰＥＩと混合し、次いで、ボルテックス混合により、３０～６０秒間徹底的に混合し、少なくとも２０～３０分間放置した。トランスフェクション時間は３０分間だけ行った。トランスフェクションの３日間後に、トランスフェクションした細胞を採取した。ウイルス形質導入のために、ＶｉｒａＢｉｎｄ（商標）ＡＡＶ精製キット（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ）およびＱｕｉｃｋＴｉｔｅｒ（商標）ＡＡＶ定量キット（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ）のプロトコールに従って、ＡＡＶ２－ＧＦＰまたはＡＡＶ２－ＫｉｌｌｅｒＲｅｄの精製および滴定を行った。ウイルス生産の各バッチ（８×１００ｍｍディッシュ）について、ＡＡＶ２－ＧＦＰまたはＡＡＶ２－ＫｉｌｌｅｒＲｅｄストックのミリリットル当たりのゲノムコピー数（ＧＣ）は、１０11～１０12の範囲であった。精製ウイルスを使用するまで－８０℃で保存した。
ＡＡＶ－２ヘルパーフリー包装システム（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、ＡＡＶ２－ＧＦＰまたはＡＶ２－ＫｉｌｌｅｒＲｅｄの生産を行った。簡単に説明すると、ＡＡＶ２レポーターは、２９３Ｔ細胞において、プラスミドＤＮＡ（ｐＨｅｌｐｅｒ、ｐＡＡＶ－ＲＣ２、およびｐＡＡＶトランスジーン）のＰＥＩ媒介同時トランスフェクションにより、産生された。各１００ｍｍ皿について、２９３Ｔ細胞を２０μｇのｐＨｅｌｐｅｒ、１０μｇのｐＡＡＶ－ＲＣ２およびｐＡＡＶ－ＧＦＰ（またはｐＡＡＶ－ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ）でトランスフェクトした。３つのプラスミドＤＮＡを無血清培地に４０μｇのＰＥＩと混合し、次いで、ボルテックス混合により、３０～６０秒間徹底的に混合し、少なくとも２０～３０分間放置した。トランスフェクション時間は３０分間だけ行った。トランスフェクションの３日間後に、トランスフェクションした細胞を採取した。ウイルス形質導入のために、ＶｉｒａＢｉｎｄ（商標）ＡＡＶ精製キット（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ）およびＱｕｉｃｋＴｉｔｅｒ（商標）ＡＡＶ定量キット（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ）のプロトコールに従って、ＡＡＶ２－ＧＦＰまたはＡＡＶ２－ＫｉｌｌｅｒＲｅｄの精製および滴定を行った。ウイルス生産の各バッチ（８×１００ｍｍディッシュ）について、ＡＡＶ２－ＧＦＰまたはＡＡＶ２－ＫｉｌｌｅｒＲｅｄストックのミリリットル当たりのゲノムコピー数（ＧＣ）は、１０11～１０12の範囲であった。精製ウイルスを使用するまで－８０℃で保存した。
【0056】
鉄化ウイルスの調製と特徴
鉄化ＡＡＶ２は、化学共役の手順に従って調製された（図１Ｂ）。ＭＥＳ緩衝食塩水中に、カルボン酸を有する酸化鉄ナノ粒子（２５μｇ、０．１７２５ｎｍｏｌ）、ＥＤＣ（０．１７２５、０．８６５、１．７３、３．４６、４．３２５、８．６５または１７．３ｎｍｏｌ）を含有する反応混合物を調製し、混合物にＳｕｌｆｏ－ＮＨＳを穏やかに添加しながら２５℃で１５分間撹拌し、アミン反応性Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳエステルを有する酸化鉄ナノ粒子の均一溶液を得た。ＰＢＳ中のＡＡＶ２ストック（０．５μＬ、１×１０12ＧＣ ｍＬ-1）を混合物に滴下して加えた後、２５℃の一定温度で１２０分間反応させた。化学的共役プロセスの後、黄色溶液を、ＰＢＳで平衡化されＰＢＳに溶媒交換されたサイズ脱塩カラム（分子量カットオフ：１００Ｋ）を用いて精製した（図９）。精製工程の後、ＡＡＶ２－ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ用のプライマー配列：５'－ＧＣＣＣＡＴＧＡＧＣＴＧＧＡＡＧＣＣ－３'（配列番号３）および５'－ＣＧＡＴＧＧＣＧＣＴＧＧＴＧＡＴＧＣ－３'（配列番号４）を用いたＰＣＲを使用することにより、～９０％の再リサイクル収率が得られた（図１０）。得られたＡＡＶ２－ＫｉｌｌｅｒＲｅｄのＰＣＲ断片は、予想サイズ５３９ｂｐと一致した。
鉄化ＡＡＶ２は、化学共役の手順に従って調製された（図１Ｂ）。ＭＥＳ緩衝食塩水中に、カルボン酸を有する酸化鉄ナノ粒子（２５μｇ、０．１７２５ｎｍｏｌ）、ＥＤＣ（０．１７２５、０．８６５、１．７３、３．４６、４．３２５、８．６５または１７．３ｎｍｏｌ）を含有する反応混合物を調製し、混合物にＳｕｌｆｏ－ＮＨＳを穏やかに添加しながら２５℃で１５分間撹拌し、アミン反応性Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳエステルを有する酸化鉄ナノ粒子の均一溶液を得た。ＰＢＳ中のＡＡＶ２ストック（０．５μＬ、１×１０12ＧＣ ｍＬ-1）を混合物に滴下して加えた後、２５℃の一定温度で１２０分間反応させた。化学的共役プロセスの後、黄色溶液を、ＰＢＳで平衡化されＰＢＳに溶媒交換されたサイズ脱塩カラム（分子量カットオフ：１００Ｋ）を用いて精製した（図９）。精製工程の後、ＡＡＶ２－ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ用のプライマー配列：５'－ＧＣＣＣＡＴＧＡＧＣＴＧＧＡＡＧＣＣ－３'（配列番号３）および５'－ＣＧＡＴＧＧＣＧＣＴＧＧＴＧＡＴＧＣ－３'（配列番号４）を用いたＰＣＲを使用することにより、～９０％の再リサイクル収率が得られた（図１０）。得られたＡＡＶ２－ＫｉｌｌｅｒＲｅｄのＰＣＲ断片は、予想サイズ５３９ｂｐと一致した。
【0057】
透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ、ＪＥＯＬ ＪＥＭ－１４００）の分析においては、１滴の鉄化ＡＡＶ２溶液をＦｏｒｍｖａｒ炭素被覆の２００メッシュ銅グリッドの上で風乾させた。次に、加速電圧１００ｋＶで動作するＪＥＯＬ－１４００顕微鏡により、ＴＥＭ画像を取得した。
【0058】
形質導入
ウイルス感染および形質導入のすべての実験は、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ ｍＬ-1ペニシリンおよび１００μｇ ｍＬ-1ストレプトマイシンを含む培地を使用した。磁場を用いずに、鉄イオン化ウイルスまたは非鉄イオン化ウイルスの形質導入能力を測定するために、ＡＡＶ２－ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）をシグナル指標として使用した。ＨＥＫ２９３細胞を２４ウェルプレートに１×１０5細胞 ウェル-1で播種し、翌日感染させた。様々なモル比のナノ粒子／ＥＤＣおよびＡＡＶ２－ＧＦＰのみの鉄化ＡＡＶ２の試験サンプルを、それぞれ、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中の細胞に添加し、６日間形質導入させた。
ウイルス感染および形質導入のすべての実験は、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ ｍＬ-1ペニシリンおよび１００μｇ ｍＬ-1ストレプトマイシンを含む培地を使用した。磁場を用いずに、鉄イオン化ウイルスまたは非鉄イオン化ウイルスの形質導入能力を測定するために、ＡＡＶ２－ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）をシグナル指標として使用した。ＨＥＫ２９３細胞を２４ウェルプレートに１×１０5細胞 ウェル-1で播種し、翌日感染させた。様々なモル比のナノ粒子／ＥＤＣおよびＡＡＶ２－ＧＦＰのみの鉄化ＡＡＶ２の試験サンプルを、それぞれ、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中の細胞に添加し、６日間形質導入させた。
【0059】
ウイルス形質導入によるＧＦＰ発現細胞を、フローサイトメトリー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって定量的に評価した。細胞を０．０２５％トリプシンで分離し、懸濁液をマイクロチューブに移し、４％パラホルムアルデヒドで固定した。細胞を前方散乱および側方散乱によって適切にゲート制御し、サンプルあたり１０，０００個のイベントを収集した。未処理細胞を陰性対照として使用した。
【0060】
鉄化ウイルスの毒性
７×１０4個のＨＥＫ２９３細胞を２４ウェルプレートの各ウェルに播種し、培地を１２時間供給した。次いで、細胞を、異なるモル比のナノ粒子／ＥＤＣで試験鉄化ＡＡＶ２に曝露し、ｐＨ７．４で２４時間インキュベートした。２４時間インキュベートした後、試験サンプルを含有するトランスフェクション培地を除去した。さらに、酸化鉄ナノ粒子またはＡＡＶ２は、ｐＨ７．４で２４時間インキュベートしただけであった。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６（商標）ＡＱｕｅｏｕｓ ｏｎｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ細胞増殖アッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を用いて、以前の研究に従って細胞増殖を決定した。４９０ｎｍにおけるホルマザンの13,16光学密度（Ｏ．Ｄ．）は、細胞生存率を定量化した。この試薬は、テトラゾリウム化合物３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－５－（３－カルボキシメトキシフェニル）－２－（４－スルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム、分子内塩（ＭＴＳ）を含有し、未処理細胞によって達成されたＭＴＳの減少は１００％に設定し、試験細胞のそれは未処理細胞の百分率として表した。
７×１０4個のＨＥＫ２９３細胞を２４ウェルプレートの各ウェルに播種し、培地を１２時間供給した。次いで、細胞を、異なるモル比のナノ粒子／ＥＤＣで試験鉄化ＡＡＶ２に曝露し、ｐＨ７．４で２４時間インキュベートした。２４時間インキュベートした後、試験サンプルを含有するトランスフェクション培地を除去した。さらに、酸化鉄ナノ粒子またはＡＡＶ２は、ｐＨ７．４で２４時間インキュベートしただけであった。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６（商標）ＡＱｕｅｏｕｓ ｏｎｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ細胞増殖アッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を用いて、以前の研究に従って細胞増殖を決定した。４９０ｎｍにおけるホルマザンの13,16光学密度（Ｏ．Ｄ．）は、細胞生存率を定量化した。この試薬は、テトラゾリウム化合物３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－５－（３－カルボキシメトキシフェニル）－２－（４－スルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム、分子内塩（ＭＴＳ）を含有し、未処理細胞によって達成されたＭＴＳの減少は１００％に設定し、試験細胞のそれは未処理細胞の百分率として表した。
【0061】
外部磁場によるマイクロトランスダクション
図１Ｅおよび図１Ｆの結果からわかるように、以下のインビトロおよびインビボ試験のために、鉄化ウイルスを最適化するためのナノ粒子／ＥＤＣのモル比が１／２０である鉄化ＡＡＶ２が選択された。ＨＥＫ２９３細胞を、２．５×１０5細胞 ウェル-1で３５ｍｍ皿に播種し、翌日感染させた。鉄化ＡＡＶ２またはＡＡＶ２のみの試験サンプルを、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中の細胞とインキュベートし、１，５００μｍ直径を有する外部磁場（２，０００～２，２００ガウス）の異なるタイムコース（０、５、１０、または３０分）で分析した。続いて、サンプルを４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定し、ＡＡＶ２の主要コートタンパク質ＶＰ３のアミノ酸７５～８６に特異的な抗ＡＡＶ抗体（ａｂｅａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を用いて、ウイルスの免疫染色を実施することにより、ＡＡＶ２の配布を観察した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）４８８（ａｂｅａｍ）に共役されたヤギ抗ウサギＩｇＧ Ｈ＆Ｌを用いて、シグナル増幅を展開し、共焦点顕微鏡で観察した。あるいは、６日間の形質導入後に、感染された細胞は、共焦点顕微鏡でＧＦＰ発現を観察して分析した。感染された細胞をＤＡＰＩで染色して細胞核を標識した。
図１Ｅおよび図１Ｆの結果からわかるように、以下のインビトロおよびインビボ試験のために、鉄化ウイルスを最適化するためのナノ粒子／ＥＤＣのモル比が１／２０である鉄化ＡＡＶ２が選択された。ＨＥＫ２９３細胞を、２．５×１０5細胞 ウェル-1で３５ｍｍ皿に播種し、翌日感染させた。鉄化ＡＡＶ２またはＡＡＶ２のみの試験サンプルを、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中の細胞とインキュベートし、１，５００μｍ直径を有する外部磁場（２，０００～２，２００ガウス）の異なるタイムコース（０、５、１０、または３０分）で分析した。続いて、サンプルを４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定し、ＡＡＶ２の主要コートタンパク質ＶＰ３のアミノ酸７５～８６に特異的な抗ＡＡＶ抗体（ａｂｅａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を用いて、ウイルスの免疫染色を実施することにより、ＡＡＶ２の配布を観察した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）４８８（ａｂｅａｍ）に共役されたヤギ抗ウサギＩｇＧ Ｈ＆Ｌを用いて、シグナル増幅を展開し、共焦点顕微鏡で観察した。あるいは、６日間の形質導入後に、感染された細胞は、共焦点顕微鏡でＧＦＰ発現を観察して分析した。感染された細胞をＤＡＰＩで染色して細胞核を標識した。
【0062】
ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ活性化に関する以前の研究（Ｔｓｅｎｇら、Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ、２０１５年）に従って、研究において最適化されたＲＯＳの生成およびＫｉｌｌｅｒＲｅｄの光毒性のために、５６１ｎｍのアルゴンレーザーを用いて、２０分の照射時間を選択した。ＫｉｌｌｅｒＲｅｄの照射後、製造元の記載に従って、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ（商標）で固定可能な遠赤死亡細胞染色キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）を使用して、感染された細胞を観察した。処理された細胞をＤＡＰＩで染色して細胞核を標識した。
【0063】
マウス研究
動物に関するすべての手順は、中央研究院の施設内動物管理および利用委員会（ＡＳ ＩＡＣＵＣ）によって許可された。胸腺欠損ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（６週齢のオス）は、国立実験動物センター（台湾）から提供された。マウスは、１２時間／１２時間の明／暗サイクルで制御された環境に養われ、最大５つのグループに収容され、食物と水を自由に摂取させた。
動物に関するすべての手順は、中央研究院の施設内動物管理および利用委員会（ＡＳ ＩＡＣＵＣ）によって許可された。胸腺欠損ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（６週齢のオス）は、国立実験動物センター（台湾）から提供された。マウスは、１２時間／１２時間の明／暗サイクルで制御された環境に養われ、最大５つのグループに収容され、食物と水を自由に摂取させた。
【0064】
インビボでの光誘発ウイルス療法の有効性
腫瘍部位に対する外部磁場の有無にかかわらず、鉄化ＡＡＶ２または未修飾ＡＡＶ２の光誘発性ウイルス療法効果を評価するために、図４Ａの試験調製に従って、Ｌ８５８ＲおよびＴ７９０Ｍを有するＥＧＦＲ－ＴＫＩ耐性Ｈ１９７５細胞を、皮下注射で２×１０6個の細胞を６週齢の雄の胸腺欠損ヌードマウスの腹部に注入することにより、異種移植腫瘍を確立した。腫瘍体積が～２００ｍｍ3に達したら、マウスを５つのグループにランダムで分け、鉄化ＡＡＶ２（５×１０9ＧＣ/マウス）またはＡＡＶ２（５×１０9ＧＣ/マウス）を有する１００μＬのＰＢＳを尾静脈注射した。ＰＢＳ注射処置を対照マウスとして用いた。標的腫瘍に磁場を印加する処置において、Ｈ１９７５（ＥＧＦＲL858R/T790M）異種移植腫瘍を１．５Ｔガウスで磁場に２時間曝露した。
腫瘍部位に対する外部磁場の有無にかかわらず、鉄化ＡＡＶ２または未修飾ＡＡＶ２の光誘発性ウイルス療法効果を評価するために、図４Ａの試験調製に従って、Ｌ８５８ＲおよびＴ７９０Ｍを有するＥＧＦＲ－ＴＫＩ耐性Ｈ１９７５細胞を、皮下注射で２×１０6個の細胞を６週齢の雄の胸腺欠損ヌードマウスの腹部に注入することにより、異種移植腫瘍を確立した。腫瘍体積が～２００ｍｍ3に達したら、マウスを５つのグループにランダムで分け、鉄化ＡＡＶ２（５×１０9ＧＣ/マウス）またはＡＡＶ２（５×１０9ＧＣ/マウス）を有する１００μＬのＰＢＳを尾静脈注射した。ＰＢＳ注射処置を対照マウスとして用いた。標的腫瘍に磁場を印加する処置において、Ｈ１９７５（ＥＧＦＲL858R/T790M）異種移植腫瘍を１．５Ｔガウスで磁場に２時間曝露した。
【0065】
３日目に、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ活性化のために、動物を１．５ｍＷ ｍｍ-2の総照射量で処置した。レーザーファイバーの先端を、動物に対して垂直に腫瘍の上に取り付けた。この計画は、最初の最適化実験に従って決定された（Ｔｓｅｎｇら、Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２０１５）。図４Ａに記載されているように、注射後３日目から、５日間毎日２０分間、レーザー治療を腫瘍に与えた。毎日の治療後、キャリパーを用いて腫瘍増殖を測定した。腫瘍の長さ（Ｌ）および幅（Ｗ）を測定し、以下の式に従って腫瘍体積を計算し：腫瘍体積＝（０．５Ｌ2）Ｗ。最後の治療の２４時間後に、腫瘍サイズの検査を行った。
【0066】
組織学的および免疫組織化学的分析
Ｈ１９７５（ＥＧＦＲL858R/T790M）異種移植腫瘍を、接種後１５日目に採取した。採取した異種移植腫瘍を１０％ホルマリン中で固定し、パラフィン包埋し、５ｍｍ切片をヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、顕微鏡で検査した。異種移植片腫瘍切片は、プルシアンブルーまたはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）５９４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎ）を有するＣｌｉｃｋ－ｉＴ（商標）Ｐｌｕｓ ＴＵＮＥＬアッセイをも用いて染色し、腫瘍内の鉄化ＡＡＶ２の酸化鉄ナノ粒子を検出するか、またはｉｎ ｓｉｔｕアポトーシス検出を観察した。
Ｈ１９７５（ＥＧＦＲL858R/T790M）異種移植腫瘍を、接種後１５日目に採取した。採取した異種移植腫瘍を１０％ホルマリン中で固定し、パラフィン包埋し、５ｍｍ切片をヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、顕微鏡で検査した。異種移植片腫瘍切片は、プルシアンブルーまたはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）５９４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎ）を有するＣｌｉｃｋ－ｉＴ（商標）Ｐｌｕｓ ＴＵＮＥＬアッセイをも用いて染色し、腫瘍内の鉄化ＡＡＶ２の酸化鉄ナノ粒子を検出するか、またはｉｎ ｓｉｔｕアポトーシス検出を観察した。
【0067】
血液分析
０日目、２日目、７日目、および１４日目に、鉄化ＡＡＶ２－ＫｉｌｌｅｒＲｅｄを投与した後、眼窩洞採血を用いて、胸腺欠損ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスからの血清を採取した。グルタミン酸－オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）、グルタミン酸－ピルビン酸（ＧＰＴ）、総ビリルビン（ＴＢＩＬ）、およびクレアチニン（ＣＲＥ）のレベルの生化学的分析を評価した。ＧＯＴおよびＧＰＴレベルの決定のために、相対するアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の活性を測定する酵素的方法を使用した。また、肝癌および肝炎を含む肝細胞損傷の指標であるＴＢＩＬのレベルは、製造元の指示に従って、Ｒａｎｄｏｘ診断テストキットを用いて決定した。腎機能の指標とするＣＲＥレベルは、Ｒａｎｄｏｘ診断テストキットを用いて試験した。
０日目、２日目、７日目、および１４日目に、鉄化ＡＡＶ２－ＫｉｌｌｅｒＲｅｄを投与した後、眼窩洞採血を用いて、胸腺欠損ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスからの血清を採取した。グルタミン酸－オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）、グルタミン酸－ピルビン酸（ＧＰＴ）、総ビリルビン（ＴＢＩＬ）、およびクレアチニン（ＣＲＥ）のレベルの生化学的分析を評価した。ＧＯＴおよびＧＰＴレベルの決定のために、相対するアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の活性を測定する酵素的方法を使用した。また、肝癌および肝炎を含む肝細胞損傷の指標であるＴＢＩＬのレベルは、製造元の指示に従って、Ｒａｎｄｏｘ診断テストキットを用いて決定した。腎機能の指標とするＣＲＥレベルは、Ｒａｎｄｏｘ診断テストキットを用いて試験した。
【0068】
インビボでの生物発光イメージング
無菌濾過したＰＢＳ溶液（全量１００μＬにおける５×１０9ＧＣ ＡＡＶ２を含有）中の鉄化ＡＡＶ２－ルシフェラーゼまたはＡＡＶ２－ルシフェラーゼを、異種移植腫瘍に外部磁場を用いるかまたは用いていないマウスに、尾静脈注射した。生物発光イメージングは、治療後７日目と１４日目に達成された。マウスを、酸素中に２％のイソフルランで満たしたチャンバー内で麻酔した。ルシフェリン（～２４０μＬ、Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）の腹腔内（ＩＰ）注射後、発光イメージは、インキュベーション後５～１０分間において、５分間の一定の画像取得時間（Ｂｉｎ：１６／４、ＦＯＶ：１２）で、ＩＶＩＳイメージングシステム（Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェアを有するＸｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ－５０）によって捕捉した。インビボでの生物発光シグナルは、全身の関心領域からのバックグラウンド減算（光子束 秒-1ｃｍ-2ｓｒ-1）の後、各マウスについての伏臥時取得および仰向け取得の両方の合計として計算した。
無菌濾過したＰＢＳ溶液（全量１００μＬにおける５×１０9ＧＣ ＡＡＶ２を含有）中の鉄化ＡＡＶ２－ルシフェラーゼまたはＡＡＶ２－ルシフェラーゼを、異種移植腫瘍に外部磁場を用いるかまたは用いていないマウスに、尾静脈注射した。生物発光イメージングは、治療後７日目と１４日目に達成された。マウスを、酸素中に２％のイソフルランで満たしたチャンバー内で麻酔した。ルシフェリン（～２４０μＬ、Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）の腹腔内（ＩＰ）注射後、発光イメージは、インキュベーション後５～１０分間において、５分間の一定の画像取得時間（Ｂｉｎ：１６／４、ＦＯＶ：１２）で、ＩＶＩＳイメージングシステム（Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェアを有するＸｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ－５０）によって捕捉した。インビボでの生物発光シグナルは、全身の関心領域からのバックグラウンド減算（光子束 秒-1ｃｍ-2ｓｒ-1）の後、各マウスについての伏臥時取得および仰向け取得の両方の合計として計算した。
【0069】
統計分析
データは、６回行った実験の平均値±標準偏差として示す。インビボでの腫瘍体積の測定において、データは、６回行った実験の平均値±平均値の標準誤差として示す。統計的有意差検定では、不等分散を仮定して両側ｔ検定を使用してＰ値を計算した。
データは、６回行った実験の平均値±標準偏差として示す。インビボでの腫瘍体積の測定において、データは、６回行った実験の平均値±平均値の標準誤差として示す。統計的有意差検定では、不等分散を仮定して両側ｔ検定を使用してＰ値を計算した。
【0070】
結果
（１）ウイルス用の鉄スーツの製造
この新しい概念を厳密に検証するために、ＡＡＶ表面タンパク質のアミノ基を介したＥＤＣ／Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミド（Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ）共役により、アデノ随伴ウイルス血清型２（ＡＡＶ２）を、様々なモル比のナノ粒子／１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）で、カルボン酸を有する酸化鉄ナノ粒子（サイズ：５ｎｍ）と化学的に共役した（図１Ｂ）。酸化鉄ナノ粒子または鉄化ＡＡＶ２の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像は、ｃａ．５ｎｍ（図１Ｃ）または３０～４０ｎｍ（図１Ｄ）の直径を有した。
（１）ウイルス用の鉄スーツの製造
この新しい概念を厳密に検証するために、ＡＡＶ表面タンパク質のアミノ基を介したＥＤＣ／Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミド（Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ）共役により、アデノ随伴ウイルス血清型２（ＡＡＶ２）を、様々なモル比のナノ粒子／１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）で、カルボン酸を有する酸化鉄ナノ粒子（サイズ：５ｎｍ）と化学的に共役した（図１Ｂ）。酸化鉄ナノ粒子または鉄化ＡＡＶ２の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像は、ｃａ．５ｎｍ（図１Ｃ）または３０～４０ｎｍ（図１Ｄ）の直径を有した。
【0071】
ウイルス感染のインビトロ特徴付けおよびアッセイは、完全培地（１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ ｍＬ-1のペニシリンおよび１００μｇ ｍＬ-1のストレプトマイシン）の中で行った。ＡＡＶ２－ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）アッセイおよびフローサイトメトリーを使用して、ＡＡＶ２形質導入効率に対する化学的共役の影響を評価した（図１Ｅ）。磁場なしの形質導入後６日目に、鉄化ＡＡＶ２で処理した細胞は、ＡＡＶ２の対照処理と比較して、１／１～１／２０のモル比（Ｐ＞０．２５）で一定のＧＦＰ発現を維持した。形質導入効率は、１／２５のモル比では５５．６％（Ｐ＜０．００５）に低下し、１／１００のモル比では３８．７％（Ｐ＜０．００５）に低下した。これらのデータから、酸化鉄ナノ粒子をカルボン酸とＡＡＶ２表面のタンパク質に共有結合させるために使用される化学結合の性質は、表面リガンドの競合により、ウイルス形質導入の効率に影響を与えることを示した（Ｌｏｃｈｒｉｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２００６）。いずれかのモル比の鉄化ＡＡＶ２をヒト胚腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞とインキュベートしても、細胞傷害性が観察されなかった（図１Ｆ）。全体として、最適化されたモル比１／２０の鉄化ＡＡＶ２は、磁気誘導の形質導入および光増感のために、低毒性のＡＡＶ２により、細胞を効率的に感染させるのに適していた。
【0072】
（２）鉄化ＡＡＶ２分布の遠隔磁性制御
鉄化ＡＡＶ２の遠隔磁気制御能力をさらに評価するために、抗ＡＡＶ２抗体と蛍光色素ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（商標）４８８に共役された二次抗体とを利用した免疫染色アッセイにより、細胞培養中のＡＡＶ２分布を観察した。５分間、１０分間または３０分間の磁場（２，０００～２，２００ガウス）への曝露で、相当な蛍光が蓄積して、ＡＡＶ２分布の局所的制御を生じさせた（図２Ａ）。これに対して、修飾されていないＡＡＶ２は、３０分間の磁場曝露で、均一にランダムな分布を示した（図２Ｂ）。同様に、鉄化ＡＡＶ２で感染した細胞のＧＦＰ発現は、処置した細胞を直径１５００μｍの円筒形磁石を有する同じ磁場に曝露して最大３０分間インキュベートした後、形質導入後６日目に調べた。ＧＦＰ発現細胞の分布は、図２Ｃおよび図２Ｄ中の蛍光強度によって表され、直径２，０００μｍの「マイクロトランスダクション」プロファイルを示す。これに対して、ＧＦＰを発現する未修飾ＡＡＶ２処理細胞は、ランダムに分布していた（図２Ｅ）。
鉄化ＡＡＶ２の遠隔磁気制御能力をさらに評価するために、抗ＡＡＶ２抗体と蛍光色素ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（商標）４８８に共役された二次抗体とを利用した免疫染色アッセイにより、細胞培養中のＡＡＶ２分布を観察した。５分間、１０分間または３０分間の磁場（２，０００～２，２００ガウス）への曝露で、相当な蛍光が蓄積して、ＡＡＶ２分布の局所的制御を生じさせた（図２Ａ）。これに対して、修飾されていないＡＡＶ２は、３０分間の磁場曝露で、均一にランダムな分布を示した（図２Ｂ）。同様に、鉄化ＡＡＶ２で感染した細胞のＧＦＰ発現は、処置した細胞を直径１５００μｍの円筒形磁石を有する同じ磁場に曝露して最大３０分間インキュベートした後、形質導入後６日目に調べた。ＧＦＰ発現細胞の分布は、図２Ｃおよび図２Ｄ中の蛍光強度によって表され、直径２，０００μｍの「マイクロトランスダクション」プロファイルを示す。これに対して、ＧＦＰを発現する未修飾ＡＡＶ２処理細胞は、ランダムに分布していた（図２Ｅ）。
【0073】
（３）鉄化ＡＡＶ２－ＫｉｌｌｅｒＲｅｄを用いた光誘発ウイルス療法
細胞のマイクロ形質導入が成功したことを確認するデータを用いて、５６１ｎｍの対応する波長およびＡＡＶ２－ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ（図３Ａ）を利用して、２０分間照射することにより、光誘発ウイルス療法を行った（Ｔｓｅｎｇら、Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２０１５）。観察された鉄化ＡＡＶ２に感染したＧＦＰ発現細胞と一致して、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ発現は、円形領域のみをもたらした（図５Ａ）。また、ＧＦＰ発現と一致して、ＡＡＶ２－ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ対照は、優先的な空間形質導入を示さなかった（図５Ｂ）。ＫｉｌｌｅｒＲｅｄは、光誘発毒性を有するので、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄタンパク質を発現する細胞において、黄色光の照射後には細胞死が観察された。ＡＡＶ２－ＫｉｌｌｅｒＲｅｄに感染していない場合には、細胞死の分布は、磁場の微小スポットに効果的に蓄積され、光毒性を示さなかったため（図３Ｂおよび図３Ｃ）、未修飾ＡＡＶ２と比較して、光誘発ウイルス療法のための遠隔制御鉄化ＡＡＶ２を実証した（図３Ｄ）。
細胞のマイクロ形質導入が成功したことを確認するデータを用いて、５６１ｎｍの対応する波長およびＡＡＶ２－ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ（図３Ａ）を利用して、２０分間照射することにより、光誘発ウイルス療法を行った（Ｔｓｅｎｇら、Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２０１５）。観察された鉄化ＡＡＶ２に感染したＧＦＰ発現細胞と一致して、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ発現は、円形領域のみをもたらした（図５Ａ）。また、ＧＦＰ発現と一致して、ＡＡＶ２－ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ対照は、優先的な空間形質導入を示さなかった（図５Ｂ）。ＫｉｌｌｅｒＲｅｄは、光誘発毒性を有するので、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄタンパク質を発現する細胞において、黄色光の照射後には細胞死が観察された。ＡＡＶ２－ＫｉｌｌｅｒＲｅｄに感染していない場合には、細胞死の分布は、磁場の微小スポットに効果的に蓄積され、光毒性を示さなかったため（図３Ｂおよび図３Ｃ）、未修飾ＡＡＶ２と比較して、光誘発ウイルス療法のための遠隔制御鉄化ＡＡＶ２を実証した（図３Ｄ）。
【0074】
（４）血流を通した前臨床試験における抗腫瘍活性と体内分布
ＥＧＦＲ－ＴＫＩ耐性ＨＩ ９７５（ＥＧＦＲL858R/T790M）異種移植腫瘍を有する胸腺欠損ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおいて、遠隔鉄化ＡＡＶ２－ＫｉｌｌｅｒＲｅｄを用いて、光誘発ウイルス療法治療を行った（図４Ａ）。注目すべきことに、Ｈ＆Ｅ（ヘマトキシリンおよびエオシン）染色により示される大面積の腫瘍壊死（図４Ｃ）、ＴＵＮＥＬ（末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニックエンドラベリング）アッセイによる広範囲の陽性染色（図４Ｄ）、およびＤＡＰＩ（４'，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）染色により標識された核酸（図４Ｅ）を対照することにより、他の治療法と比較して、鉄化ＡＡＶ２－ＫｉｌｌｅｒＲｅｄによる治療は、腫瘍増殖の強力な抑制と関連することを示した（図４Ｂおよび図６）。また、プルシアンブルーで染色された淡青色の領域は、磁場および鉄化ＡＡＶ２に露出されたサンプルにおいて、鉄の分布および存在量の増加を示した（図４Ｆ）。尾静脈注射により鉄化ＡＡＶ２－ＫｉｌｌｅｒＲｅｄの単回投与は、有意な腫瘍増殖の抑制をもたらしたが、長期抑制を欠いた。印象的なことに、８日目に鉄化ＡＡＶ２－ＫｉｌｌｅｒＲｅｄを再度注射した場合、さらなる５日間では腫瘍の体積増加を完全に停止したことが達成され、これを超えると、有意に抑制された（Ｐ＜０．０１５）。これに対して、磁化場または光照射しない場合には、ＡＡＶ２－ＫｉｌｌｅｒＲｅｄのみまたは鉄化ＡＡＶ２－ＫｉｌｌｅｒＲｅｄの送達は、統計的に関連のある抗腫瘍効果をもたらさなかった。全身送達を達成する際に本質的に困難な課題を克服するのを助けるために、同時送達は他の研究と一致している（Ｌｅｄｆｏｒｄ，Ｎａｔｕｒｅ，２０１５；Ｂｅｌｌら、Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ，２０１４；Ｒｕｓｓｅｌｌら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１２；Ｍｉｅｓｔら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０１４；Ｋｏｔｔｅｒｍａｎら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，２０１４）。
ＥＧＦＲ－ＴＫＩ耐性ＨＩ ９７５（ＥＧＦＲL858R/T790M）異種移植腫瘍を有する胸腺欠損ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおいて、遠隔鉄化ＡＡＶ２－ＫｉｌｌｅｒＲｅｄを用いて、光誘発ウイルス療法治療を行った（図４Ａ）。注目すべきことに、Ｈ＆Ｅ（ヘマトキシリンおよびエオシン）染色により示される大面積の腫瘍壊死（図４Ｃ）、ＴＵＮＥＬ（末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニックエンドラベリング）アッセイによる広範囲の陽性染色（図４Ｄ）、およびＤＡＰＩ（４'，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）染色により標識された核酸（図４Ｅ）を対照することにより、他の治療法と比較して、鉄化ＡＡＶ２－ＫｉｌｌｅｒＲｅｄによる治療は、腫瘍増殖の強力な抑制と関連することを示した（図４Ｂおよび図６）。また、プルシアンブルーで染色された淡青色の領域は、磁場および鉄化ＡＡＶ２に露出されたサンプルにおいて、鉄の分布および存在量の増加を示した（図４Ｆ）。尾静脈注射により鉄化ＡＡＶ２－ＫｉｌｌｅｒＲｅｄの単回投与は、有意な腫瘍増殖の抑制をもたらしたが、長期抑制を欠いた。印象的なことに、８日目に鉄化ＡＡＶ２－ＫｉｌｌｅｒＲｅｄを再度注射した場合、さらなる５日間では腫瘍の体積増加を完全に停止したことが達成され、これを超えると、有意に抑制された（Ｐ＜０．０１５）。これに対して、磁化場または光照射しない場合には、ＡＡＶ２－ＫｉｌｌｅｒＲｅｄのみまたは鉄化ＡＡＶ２－ＫｉｌｌｅｒＲｅｄの送達は、統計的に関連のある抗腫瘍効果をもたらさなかった。全身送達を達成する際に本質的に困難な課題を克服するのを助けるために、同時送達は他の研究と一致している（Ｌｅｄｆｏｒｄ，Ｎａｔｕｒｅ，２０１５；Ｂｅｌｌら、Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ，２０１４；Ｒｕｓｓｅｌｌら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１２；Ｍｉｅｓｔら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０１４；Ｋｏｔｔｅｒｍａｎら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，２０１４）。
【0075】
鉄化ＡＡＶ２－ＫｉｌｌｅｒＲｅｄで処置した動物は、肝臓および腎臓の機能をモニターするために、グルタミン酸オキサロトランスアミナーゼ（ＧＯＴ）、ピルビン酸オキサロトランスアミナーゼ（ＧＰＴ）、総ビリルビン（ＴＢＩＬ）、およびクレアチニン（ＣＲＥ）のレベルについても評価した。これらの生化学的分析は、有意な肝臓または腎臓の毒性を全く示さなかった（図４Ｇ）。すべての実験グループにおいて、体重の有意な減少は検出されず、厳重な鉄化ウイルス、磁場露出、または光照射に関連した毒性の欠如を表している（図４Ｈ）。鉄化ＡＡＶ２－ルシフェラーゼで処理された以外にインビボ試験と同様に処理された動物についての生物発光を用いて、７日目（図７）および１４日目（図４Ｉ）に生体内分布を検討した。これらの発見と一致して、磁気誘導が利用された７日目および１４日目に、腫瘍において有意な生物発光が観察され、図４Ｂに示される腫瘍抑制と一致した。これは、送達における遠隔制御の特定性への動的な依存性を強化する。予想通り、肝臓でも生物発光が観察され、ウイルスおよびナノ粒子のクリアランス経路は一致していた（図４Ｊ）（Ｔｓｅｎｇら、Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２０１５）。
【0076】
上記内容を要約すると、遠隔誘導「鉄化」ウイルス送達を用いて達成される光誘発ウイルス療法による、抗腫瘍効果の特異性が実証されている。このような技術的概念は、血流を介した全身送達に利用して、治療効果および正確性を改善することができる。本開示の鉄化ＡＡＶ２には、いくつかの際立った特徴、例えば、標的化送達、ウイルス療法の光誘発活性化、組換えの欠如およびゲノム統合（Ｋｏｔｔｅｒｍａｎら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ，２０１４）、ならびに強力な前臨床安全記録（Ｋｏｔｔｅｒｍａｎら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ，２０１４）があり、これらは、概念の潜在的な利点を定義する。さらに、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）機器は、所望の方向に、パルス状の磁場勾配を作り出すために適用することができ（Ｍｕｔｈａｎａら、Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２０１５）、それは内部３Ｄボリューム内の蓄積を形作る見込みを提供することができる。
【0077】
他の実施形態
本明細書に開示されている全ての特徴は、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書に開示されている各特徴は、同じ、同等、または類似の目的を果たす代替の特徴によって置き換えられてもよい。ゆえに、他に明示的に述べられていない限り、開示された各特徴は、包括的な一連の同等または類似の特徴の一例にすぎない。
本明細書に開示されている全ての特徴は、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書に開示されている各特徴は、同じ、同等、または類似の目的を果たす代替の特徴によって置き換えられてもよい。ゆえに、他に明示的に述べられていない限り、開示された各特徴は、包括的な一連の同等または類似の特徴の一例にすぎない。
【0078】
上記の説明から、当業者は本発明の本質的な特徴を容易に確認することができ、本発明の精神および範囲から逸脱しない限り、本発明を様々な用途および条件に適合させるように様々な変更および修正を加えることができる。ゆえに、他の実施形態も特許請求の範囲内にある。
【0079】
同価
本明細書ではいくつかの本発明の実施形態を説明して例示しましたが、当業者は、機能の実行かつ／または結果の獲得のために、様々な他の手段および／または構造および／または１つ以上の説明した利点を容易に想起し、そして、このような変形および／または修正の各々は、本明細書に記載の発明の実施形態の範囲内にあると見なされる。より一般的に言えば、当業者は、本明細書に記載のすべてのパラメータ、寸法、材料、および構成が例示的であることを意味し、実際のパラメータ、寸法、材料、および／または構成は、特定の用途に依存するまたは本発明の教示が使用されることを容易に理解する。当業者であれば、本明細書に記載の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識し、または日常的な実験のみを用いて確かめることができる。したがって、前記の本発明の実施形態は、例としてのみ提示され、添付の特許請求の範囲およびその均等物の範囲内で、具体的に説明および特許請求される以外の方法で本発明の実施形態を実施できることを理解されたい。本開示の実施形態は、本明細書に記載されている個々の特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法のそれぞれに関する。さらに、このような特徴、システム、物品、材料、キットおよび／または方法が互いに矛盾していない場合、このような特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法の２つ以上の任意の組み合わせも本開示の発明の範囲に含まれる。
本明細書ではいくつかの本発明の実施形態を説明して例示しましたが、当業者は、機能の実行かつ／または結果の獲得のために、様々な他の手段および／または構造および／または１つ以上の説明した利点を容易に想起し、そして、このような変形および／または修正の各々は、本明細書に記載の発明の実施形態の範囲内にあると見なされる。より一般的に言えば、当業者は、本明細書に記載のすべてのパラメータ、寸法、材料、および構成が例示的であることを意味し、実際のパラメータ、寸法、材料、および／または構成は、特定の用途に依存するまたは本発明の教示が使用されることを容易に理解する。当業者であれば、本明細書に記載の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識し、または日常的な実験のみを用いて確かめることができる。したがって、前記の本発明の実施形態は、例としてのみ提示され、添付の特許請求の範囲およびその均等物の範囲内で、具体的に説明および特許請求される以外の方法で本発明の実施形態を実施できることを理解されたい。本開示の実施形態は、本明細書に記載されている個々の特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法のそれぞれに関する。さらに、このような特徴、システム、物品、材料、キットおよび／または方法が互いに矛盾していない場合、このような特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法の２つ以上の任意の組み合わせも本開示の発明の範囲に含まれる。
【0080】
本明細書に限定および使用されるすべての定義は、辞書の定義、参照により組み込まれる文書中の定義、および／または定義された用語の通常の意味を示すと理解されるべきである。
【0081】
本明細書に開示されている全ての参考文献、特許および特許出願は、それぞれが引用されている主題に関して参照により組み込まれており、場合によっては、文書の全体を包含することがある。
【0082】
本明細書および特許請求の範囲に使用される不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、そうでないことが明確に示されていない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。
【0083】
本明細書および特許請求の範囲に使用される「および／または」という句は、要素の「いずれかまたは両方」の結合、すなわち、場合によっては結合的に存在し、他の場合には分離的に存在する要素を意味すると理解されたい。「および／または」で列挙された複数の要素は、同じように解釈されるべきであり、すなわち、「１つ以上」の要素の結合である。具体的に識別された要素に関連するかどうかにかかわらず、「および／または」という句によって具体的に識別された要素以外の他の要素が任意に存在してもよい。ゆえに、非限定的な例として、「含む」というオープンエンド言語と共に使用される場合の「Ａおよび／またはＢ」への参照は、一つの実施形態では、Ａのみ（場合によりＢ以外の要素を含む）；別の実施形態では、Ｂのみ（場合によりＡ以外の元素を含む）；さらに別の実施形態では、ＡとＢの両方（場合により他の要素を含む）；等を指すことができる。
【0084】
本明細書および特許請求の範囲に使用されるように、「または」は、上記で定義されたような「および／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リスト内の項目を分離するとき、「または」あるいは「および／または」は包括的、すなわち、少なくとも１つの要素を含むが、１つより多くの要素をも含み、また、要素のリストおよびオプションで追加のリストにない項目をも含む。反対のことを明確に示す用語のみ、例えば、「１つのみ」または「１つだけ」、または特許請求の範囲で使用されている「のみからなる」は、厳密に１つの要素または要素のリストの包含を指す。一般的に、本明細書で使用される「または」という用語は、「どちらか」、「その中の１つ」、「その中の１つだけ」または「１つだけ」のような独占の用語が先行する場合には、排他的な選択肢（すなわち、「両方の中の一方または他方であるが、両方ではない」）を示すものとしてのみ解釈されるものとする。「本質的に～からなる」は、特許請求の範囲で使用されるとき、特許法の分野で使用されるときのその通常の意味を有するものとする。
【0085】
本明細書および特許請求の範囲に使用される１つ以上の要素のリストにおける「少なくとも１つ」という句は、要素のリスト中の任意の１つの要素から選択される少なくとも１つの要素を意味すると理解されるべきであるが、要素のリスト内に具体的に列挙された各要素およびすべての要素の少なくとも１つを必ずしも含まず、また、要素リストの要素の組み合わせを除外しない。具体的に特定された要素に関連しているかどうかにかかわらず、当該「少なくとも１つ」の定義は、要素のリスト内で具体的に特定された要素以外の要素が任意に存在し得ることを可能にする。ゆえに、非限定的な例として、「ＡおよびＢの少なくとも一方」（または「ＡまたはＢの少なくとも一方」に相当、あるいは「Ａおよび／またはＢの少なくとも一方」に相当）は、一つの実施形態では、少なくとも１つの任意選択で１つより多いＡを含むが、Ｂを含まず（および任意選択でＢ以外の元素を含む）；別の実施形態では、少なくとも１つの任意選択で１つより多いＢを含むが、Ａを含まず（および任意選択でＡ以外の元素を含む）；さらに別の実施形態では、少なくとも１つの任意選択で１つより多いＡを含み、少なくとも１つの任意選択で１つより多いＢ（および任意選択で他の元素を含む）；等を指すことができる。
【0086】
反対に、明確に示されていない限り、１つより多い工程または動作を含む本明細書に請求される方法において、方法の工程または動作の順序は必ずしもその順序に限定されないことも理解されるべきである。
【図1A-F】
【図2A-E】
【図3A-D】
【図4A-G】
【図4H-J】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】