▶ ジーイー・ヘルスケア・バイオプロセス・アールアンドディ・アクチボラグの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-01-26
(45)【発行日】2022-02-03
(54)【発明の名称】変異免疫グロブリン結合ペプチド
(51)【国際特許分類】
C12N 15/31 20060101AFI20220127BHJP
C07K 14/31 20060101ALI20220127BHJP
C07K 16/00 20060101ALI20220127BHJP
C07K 17/00 20060101ALI20220127BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20220127BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20220127BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220127BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220127BHJP
C07K 1/22 20060101ALI20220127BHJP
【ＦＩ】
C12N15/31 ZNA
C07K14/31
C07K16/00
C07K17/00
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C07K1/22
【請求項の数】
8
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2020107847
(22)【出願日】2020-06-23
(62)【分割の表示】P 2017525397の分割
【原出願日】2015-11-16
(65)【公開番号】P2020178696
(43)【公開日】2020-11-05
【審査請求日】2020-07-15
(31)【優先権主張番号】1451376-6
(32)【優先日】2014-11-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】SE
(31)【優先権主張番号】1510261.9
(32)【優先日】2015-06-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(31)【優先権主張番号】1510263.5
(32)【優先日】2015-06-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(73)【特許権者】
【識別番号】516105833
【氏名又は名称】サイティバ・バイオプロセス・アールアンドディ・アクチボラグ
(74)【代理人】
【識別番号】100188558
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100154922
【弁理士】
【氏名又は名称】崔 允辰
(74)【代理人】
【識別番号】100207158
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 研二
(72)【発明者】
【氏名】ロドリゴ，グスタフ
(72)【発明者】
【氏名】ビョルクマン，トーマス
(72)【発明者】
【氏名】アンデル，マッツ
【審査官】原 大樹
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１２／１６５５４４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０１０－０８１８６６（ＪＰ，Ａ）
【文献】HOBER SOPHIA，PROTEIN A CHROMATOGRAPHY FOR ANTIBODY PURIFICATION，JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY B: BIOMEDICAL SCIENCES & APPLICATION，NL，ELSEVIER，2007年03月12日，VOL:848, NR:1，PAGE(S):40 - 47，http://dx.doi.org/10.1016/j.jchromb.2006.09.030
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ
Ｃ０７Ｋ
Ａ６１Ｋ
ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＥＭＢＡＳＥ／ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
複数のＦｃ結合ポリペプチドを含む多量体であって、
各ポリペプチドが、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、及び、配列番号４８からなる群から選択される配列を含み、
前記多量体が少なくとも1つのリンカーを含み、ポリペプチドを接続する前記リンカーが、プロリン、アスパラギン、及び／又はグルタミンを含まない、
多量体。
【請求項2】
前記ポリペプチドが、配列番号７で定義されるポリペプチドと比較して改善されたアルカリ安定性を有する、請求項１に記載の多量体。
【請求項3】
請求項１又は２に記載の複数のポリペプチドを含む多量体であって、
ａ）ポリペプチドが、１５残基以下のアミノ酸を含むリンカーで連結されている、及び／又は
ｂ）多量体が、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体又は九量体である、
多量体。
【請求項4】
１以上のシステイン残基、複数のリジン残基及び複数のヒスチジン残基からなる群から選択される、Ｃ末端又はＮ末端の１以上の連結要素の１～５個のアミノ酸残基か又はその範囲内をさらに含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の多量体。
【請求項5】
請求項１から４のいずれか１項に記載の多量体をコードする核酸又はベクター。
【請求項6】
請求項５に記載の核酸又はベクターを含む、発現系。
【請求項7】
請求項１から４のいずれか１項に記載の複数の多量体が固相支持体に結合されている、分離マトリックス。
【請求項8】
免疫グロブリンを単離する方法であって、請求項７に記載の分離マトリックスを使用する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、アフィニティークロマトグラフィーの分野に関し、より具体的には、免疫グロブリンのアフィニティークロマトグラフィーにおいて有用なプロテインＡの変異した免疫グロブリン結合ドメインに関する。また、本発明は変異ドメインの多量体に、さらに、変異ドメイン又は多量体を含む分離マトリックスにも関する。
【背景技術】
【0002】
免疫グロブリンは、世界中で製造又は開発のいずれにおいても最も普及しているバイオ医薬品を代表する。この特別な治療市場に対する商業的需要が高いことと、そのために価値が高いことにより、製薬会社は、付随するコストを制御する一方で各社のそれぞれのｍＡｂ製造プロセスの生産性を最大化することに充填を置いてきた。
【0003】
アフィニティークロマトグラフィーは、これらの免疫グロブリン分子、例えばモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体などの精製の重要なステップの１つとして、大部分の例で使用される。特に興味深い種類のアフィニティー試薬は、免疫グロブリン分子の不変部分と特異的結合することの可能なタンパク質であり、そのような相互作用は、抗体の抗原結合特異性とは独立している。そのような試薬は、限定されるものではないが血清又は血漿調製物又は細胞培養由来の供給原料などの異なる試料から、免疫グロブリンをアフィニティークロマトグラフィーによって回収するために広く使用されることができる。そのようなタンパク質の一例は、異なる種由来のＩｇＧ免疫グロブリンのＦｃ部分及びＦａｂ部分と結合することのできるドメインを含む、ブドウ球菌のプロテインＡである。これら
のドメインは、一般にＥ－、Ｄ－、Ａ－、Ｂ－及びＣ－ドメインと表示される。
のドメインは、一般にＥ－、Ｄ－、Ａ－、Ｂ－及びＣ－ドメインと表示される。
【0004】
ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）に基づく試薬は、その高い親和性及び選択性に起因して、バイオテクノロジーの分野、特に抗体の捕捉及び精製のための、並びに検出又は定量化のためのアフィニティークロマトグラフィーにおいて広範な用途が見出されている。現在、ＳｐＡに基づくアフィニティー媒体は、おそらく、工業用の細胞培養上清を含む、異なる試料からモノクローナル抗体及びその断片を単離するための最も広く使用されるアフィニティー媒体である。したがって、プロテインＡ－リガンドを含む様々なマトリックスが、例えば、天然のプロテインＡ（例えば、プロテインＡ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（スウェーデン、ウプサラ））の形態で市販されており、組換えプロテインＡからなるものもある（例えばｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。より具体的には、市販の組換えプロテインＡ製品で実施した遺伝子操作は、その担体との付着を促進し、リガンドの生産性を増加することを目的とする。
【0005】
これらの用途は、その他のアフィニティークロマトグラフィー用途のように、夾雑物を確実に除去することに総合的な注意を必要とする。そのような夾雑物は、例えば、クロマトグラフィー法において固定相又はマトリックスに吸着される、溶出しなかった分子、例えばタンパク質、炭水化物、脂質、細菌及びウイルスをはじめとする望ましくない生体分子又は微生物などであり得る。後の使用の前にマトリックスを再生するために、そのような夾雑物をマトリックスから除去することは、通常、目的生成物の最初の溶出の後に実施される。そのような除去は通常、固定相から夾雑物を溶出することのできる薬剤を使用する、定置洗浄（ＣＩＰ）として公知の方法を伴う。多くの場合使用されるそのような薬剤の種類の１つは、固定相に通すアルカリ溶液である。現在最も広く使用される洗浄及び消毒剤はＮａＯＨであり、その濃度は、汚染の程度及び性質に応じて０．１から例えば１Ｍまでの範囲であり得る。この戦略は、１３を上回るｐＨ値をもつ溶液にマトリックスを曝露することに関連する。タンパク質性アフィニティーリガンドを含有する多くのアフィニティークロマトグラフィーマトリックスに関して、そのようなアルカリ環境は非常に厳しい条件であり、結果的に、関与する高いｐＨに対するリガンドの不安定性による能力の低下をもたらす。
【0006】
そのため、大規模な研究がアルカリ性ｐＨ値に耐える能力の改善を示す、操作されたタンパク質リガンドの開発に着目してきした。例えば、Ｇｕｌｉｃｈら（Ｓｕｓａｎｎｅ Ｇｕｌｉｃｈ，Ｍａｒｔｉｎ Ｌｉｎｈｕｌｔ，Ｐｅｒ－Ａｋｅ Ｎｙｇｒｅｎ，Ｍａｔｈｉａｓ Ｕｈｌｅｎ，Ｓｏｐｈｉａ Ｈｏｂｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８０（２０００），１６９－１７８）は、アルカリ性環境での連鎖球菌アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）の安定性を改善するためにタンパク質工学を提案した。Ｇｕｌｉｃｈらは、４つ全てのアスパラギン残基がロイシン（１つの残基）、アスパラギン酸（２つの残基）及びリジン（１つの残基）に置き換えられている、ＡＢＤの変異体を製造した。さらに、Ｇｕｌｉｃｈらは、製造した変異体が天然のタンパク質に似た標的タンパク質結合挙動を示すこと、及び操作されたリガンドを含有するアフィニティーカラムが、アルカリ条件に繰り返し曝露した後に、操作されていない親リガンドを用いて調製したカラムよりも高い結合能を示すことを報告している。よって、４つ全てのアスパラギン残基は、構造及び機能に重大な影響を及ぼすことなく置き換えられることができることがその中で結論付けられる。
【0007】
最近の研究は、その変更をプロテインＡ（ＳｐＡ）にもおこなって類似した性質をもたらすことができることを示す。参照によりその全文が本明細書に援用される、米国特許出願公開第２００５／０１４３５６６号は、１以上のアスパラギン残基をグルタミン酸又はアスパラギン酸以外のアミノ酸に変異させると、その変異が、約１３～１４までのｐＨ値
で親ＳｐＡ、例えばＳｐＡのＢドメイン、又は、ＳｐＡのＢドメインから誘導した合成構築物であるプロテインＺ（米国特許第５１４３８４４号、参照によりその全文が援用される）などと比較して、増加した化学安定性を付与することを開示する。著者らは、これらの変異タンパク質をアフィニティーリガンドとして使用する場合、予想通り分離媒体がアルカリ化剤を用いる洗浄方法により良く耐えることができることを示す。アルカリ安定性を向上させる目的をもつプロテインＡドメインのさらなる変異は、国際公開第２００８／０３９１４１号、特開２００６－３０４６３３号、欧州特許出願公開第１９９２６９２号、欧州特許出願公開第２２０２３１０号、国際公開第２０１０／１１０２８８号、国際公開第２０１２／０８６６６０号、国際公開第２０１２／０８３４２５号、国際公開第２０１２／０８７２３０号及び国際公開第２０１４／１４６３５０号にも公開されており、その全ては参照によりその全文が本明細書に援用される。しかし、現在利用可能な変異体はなおアルカリ性のｐＨに対して感受性があり洗浄中のＮａＯＨ濃度は通常０．１Ｍに制限され、これは完全な洗浄を実現することが困難であることを意味する。高いＮａＯＨ濃度は、洗浄を向上させるかもしれないが、容認できない能力の喪失を招く。
で親ＳｐＡ、例えばＳｐＡのＢドメイン、又は、ＳｐＡのＢドメインから誘導した合成構築物であるプロテインＺ（米国特許第５１４３８４４号、参照によりその全文が援用される）などと比較して、増加した化学安定性を付与することを開示する。著者らは、これらの変異タンパク質をアフィニティーリガンドとして使用する場合、予想通り分離媒体がアルカリ化剤を用いる洗浄方法により良く耐えることができることを示す。アルカリ安定性を向上させる目的をもつプロテインＡドメインのさらなる変異は、国際公開第２００８／０３９１４１号、特開２００６－３０４６３３号、欧州特許出願公開第１９９２６９２号、欧州特許出願公開第２２０２３１０号、国際公開第２０１０／１１０２８８号、国際公開第２０１２／０８６６６０号、国際公開第２０１２／０８３４２５号、国際公開第２０１２／０８７２３０号及び国際公開第２０１４／１４６３５０号にも公開されており、その全ては参照によりその全文が本明細書に援用される。しかし、現在利用可能な変異体はなおアルカリ性のｐＨに対して感受性があり洗浄中のＮａＯＨ濃度は通常０．１Ｍに制限され、これは完全な洗浄を実現することが困難であることを意味する。高いＮａＯＨ濃度は、洗浄を向上させるかもしれないが、容認できない能力の喪失を招く。
【0008】
よって、この分野では、アルカリ洗浄方法に対してさらに改善された安定性を有するタンパク質リガンドを含有する分離マトリックスを得る必要性がなおある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
【文献】欧州特許出願公開第２７２８０００号
【発明の概要】
【0010】
本発明の一態様は、アルカリ安定性の改善されたポリペプチドを提供することである。これは、実施態様１に記載のポリペプチドによって実現される。
【0011】
１つの利点は、アルカリ安定性が親ポリペプチドよりも改善され、免疫グロブリン及びその他のＦｃ含有タンパク質に対する選択性の高い結合が維持されていることである。
【0012】
本発明の第２の態様は、複数のポリペプチドを含む、アルカリ安定性の改善された多量体を提供することである。これは、特許請求の範囲に定義される多量体によって実現される。
【0013】
本発明の第３の態様は、アルカリ安定性の改善されたポリペプチド又は多量体をコードする核酸又はベクターを提供することである。これは、特許請求の範囲に定義される核酸又はベクターによって実現される。
【0014】
本発明の第４の態様は、アルカリ安定性の改善されたポリペプチド又は多量体を発現することのできる発現系を提供することである。これは、特許請求の範囲に定義される発現系によって実現される。
【0015】
本発明の第５の態様は、免疫グロブリン及びその他のＦｃ含有タンパク質に選択的に結合し、改善されたアルカリ安定性を示すことのできる分離マトリックスを提供することである。これは、特許請求の範囲に定義される分離マトリックスによって実現される。
【0016】
本発明の第６の態様は、免疫グロブリン又はその他のＦｃ含有タンパク質を単離する効率的かつ経済的な方法を提供することである。これは、特許請求の範囲に定義される方法によって実現される。
【0017】
本発明のさらに適した実施形態は、従属クレームに記載される。
【0018】
定義
用語「抗体」及び「免疫グロブリン」は本明細書において同義的に使用され、抗体のフラグメント、抗体又は抗体フラグメントを含む融合タンパク質及び抗体又は抗体フラグメントを含むコンジュゲートも含むと理解される。
用語「抗体」及び「免疫グロブリン」は本明細書において同義的に使用され、抗体のフラグメント、抗体又は抗体フラグメントを含む融合タンパク質及び抗体又は抗体フラグメントを含むコンジュゲートも含むと理解される。
【0019】
用語「Ｆｃ結合ポリペプチド」及び「Ｆｃ結合タンパク質」とは、抗体の結晶化可能部分（Ｆｃ）と結合することのできるポリペプチド又はタンパク質をそれぞれ意味し、それには、例えばプロテインＡ及びプロテインＧ、又は結合特性が維持されたその任意のフラグメント又は融合タンパク質が挙げられる。
【0020】
用語「リンカー」は、本明細書において、多量体の２つのポリペプチド単位、単量体又はドメインを互いに連結する要素を意味する。
【0021】
用語「スペーサー」は、本明細書において、ポリペプチド又はポリペプチド多量体を担体に結合する要素を意味する。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【図1】配列番号１～７及び５１～５２で定義されるＦｃ結合ドメインのアライメントを示す図である。
【図2】ＳＰＲバイオセンサーチップと結合した親及び変異四量体Ｚｖａｒ（配列番号７）ポリペプチドバリアントのアルカリ安定性について実施例２から得た結果を示す図である。
【図3】アガロースビーズと結合した親及び変異四量体Ｚｖａｒ（配列番号７）ポリペプチドバリアントのアルカリ安定性（０．５Ｍ ＮａＯＨ）について実施例４から得た結果を示す図である。
【図4】アガロースビーズと結合した親及び変異四量体Ｚｖａｒ（配列番号７）ポリペプチドバリアントのアルカリ安定性（１．０Ｍ ＮａＯＨ）について実施例４から得た結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0023】
一態様では、本発明は、図１に図示される配列番号１（Ｅドメイン）、配列番号２（Ｄドメイン）、配列番号３（Ａドメイン）、配列番号２２（バリアントＡドメイン）、配列番号４（Ｂドメイン）、配列番号５（Ｃドメイン）、配列番号６（プロテインＺ）、配列番号７（Ｚｖａｒ）、配列番号５１（リンカー領域アミノ酸１～６を含まないＺｖａｒ）又は配列番号５２（リンカー領域アミノ酸１～６を含まないＣドメイン）と９０％以上、９５％以上又は９８％以上同一であることで定義されるか、又はそれを有する、ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）のＦｃ結合ドメインの変異体を含むか又はそれから本質的になり、配列番号４～７の１１位に対応する位置＊の少なくともアスパラギン（又は配列番号２の例ではセリン）残基が、グルタミン酸、リジン、チロシン、トレオニン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン、バリン、アラニン、ヒスチジン及びアルギニンからなる群から選択されるアミノ酸に変異している、Ｆｃ結合ポリペプチドを開示する。プロテインＺ（配列番号６）は、米国特許第５１４３８４４号に開示されるように変異Ｂドメインであり、一方配列番号７は、変異Ｎ３Ａ，Ｎ６Ｄ，Ｎ２３Ｔを含む、本明細書においてＺｖａｒと呼ばれるプロテインＺのさらに変異したバリアントを示す。配列番号２２は、図１の位置用語を用いる、Ａ４６Ｓ変異を有する黄色ブドウ球菌Ｎ３１５株由来のプロテインＡのＡドメインの天然バリアントである。これらのドメインのＮ１１の変異は、免疫グロブリン結合性を損なうことなく親ドメイン／ポリペプチドと比較して改善されたアルカリ安定性を付与する。そのため、このポリペプチドは、Ｆｃ又は免疫グロブリン結合ポリペプチド、或いはＦｃ又は免疫グロブリン結合ポリペプ
チド単位としても記載され得る。
チド単位としても記載され得る。
【0024】
＊この説明を通じて、図１のアミノ酸残基位置番号付けの慣習が使用され、位置番号は、配列番号４～７の位置番号に対応するように指定される。
【0025】
換言すると、本発明は、配列番号５３で定義されるか或いは９０％以上、９５％以上又は９８％以上の同一性を有する配列を含む、Ｆｃ結合ポリペプチドを開示する。
【0026】
配列番号５３
ＫＥＸ1Ｑ Ｘ2ＡＦＹＥＩＬＸ3ＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＸ4Ｘ5Ｆ ＩＸ6Ｘ7ＬＫＤＸ8ＰＳＸ9 ＳＸ10Ｘ11Ｘ12ＬＡＥＡＫＸ13 Ｘ14ＮＤＡＱＡ ＰＫ
式中、互いに独立に、
Ｘ1＝Ａ又はＱ
Ｘ2＝Ｅ、Ｋ、Ｙ、Ｔ、Ｆ、Ｌ、Ｗ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ａ、Ｈ又はＲ
Ｘ3＝Ｈ又はＫ
Ｘ4＝Ａ又はＮ
Ｘ5＝Ａ又はＧ
Ｘ6＝Ｑ又はＥ
Ｘ7＝Ｓ又はＫ
Ｘ8＝Ｅ又はＤ
Ｘ9＝Ｑ又はＶ
Ｘ10＝Ｋ、Ｒ又はＡ
Ｘ11＝Ａ、Ｅ又はＮ
Ｘ12＝Ｉ又はＬ
Ｘ13＝Ｋ又はＲ
Ｘ14＝Ｌ又はＹ
である。
ＫＥＸ1Ｑ Ｘ2ＡＦＹＥＩＬＸ3ＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＸ4Ｘ5Ｆ ＩＸ6Ｘ7ＬＫＤＸ8ＰＳＸ9 ＳＸ10Ｘ11Ｘ12ＬＡＥＡＫＸ13 Ｘ14ＮＤＡＱＡ ＰＫ
式中、互いに独立に、
Ｘ1＝Ａ又はＱ
Ｘ2＝Ｅ、Ｋ、Ｙ、Ｔ、Ｆ、Ｌ、Ｗ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ａ、Ｈ又はＲ
Ｘ3＝Ｈ又はＫ
Ｘ4＝Ａ又はＮ
Ｘ5＝Ａ又はＧ
Ｘ6＝Ｑ又はＥ
Ｘ7＝Ｓ又はＫ
Ｘ8＝Ｅ又はＤ
Ｘ9＝Ｑ又はＶ
Ｘ10＝Ｋ、Ｒ又はＡ
Ｘ11＝Ａ、Ｅ又はＮ
Ｘ12＝Ｉ又はＬ
Ｘ13＝Ｋ又はＲ
Ｘ14＝Ｌ又はＹ
である。
【0027】
Ｎ１１（Ｘ2）変異（例えばＮ１１Ｅ又はＮ１１Ｋ変異）は、唯一の変異であってよく、或いは、ポリペプチドは、さらなる変異、例えば配列番号４～７の３、６、９、１０、１５、１８、２３、２８、２９、３２、３３、３６、３７、４０、４２、４３、４４、４７、５０、５１、５５及び５７位に対応する位置の少なくとも１つでの置換などを含んでもよい。これらの位置の１以上で、最初のアミノ酸残基は、例えばアスパラギン、プロリン又はシステインでないアミノ酸で置換されていてよい。最初のアミノ酸残基は、例えばアラニン、バリン、トレオニン、セリン、リジン、グルタミン酸又はアスパラギン酸で置換されていてよい。さらに、１以上のアミノ酸残基が、例えば１～６位及び／又は５６～５８位から欠失されていてよい。
【0028】
一部の実施形態では、配列番号４～７の９位に対応する位置のアミノ酸残基（Ｘ1）は、グルタミン、アスパラギン、プロリン又はシステイン以外のアミノ酸、例えばアラニンなどである。９位及び１１位の変異の組合せは、例によって示されるように、特に良好なアルカリ安定性をもたらす。具体的な実施形態では、配列番号７において９位のアミノ酸残基はアラニンであり、１１位のアミノ酸残基はリジン又はグルタミン酸、例えばリジンなどである。９位の変異は、参照によりその全文が本明細書に援用される同時係属出願ＰＣＴ／ＳＥ２０１４／０５０８７２号においても考察されている。
【0029】
一部の実施形態では、配列番号４～７の５０位に対応する位置のアミノ酸残基（Ｘ13）は、アルギニン又はグルタミン酸である。
【0030】
ある種の実施形態では、配列番号４～７の３位に対応する位置のアミノ酸残基は、アラ
ニンである、及び／又は配列番号４～７の６位に対応する位置のアミノ酸残基は、アスパラギン酸である。３位及び６位のアミノ酸残基の１つはアスパラギンであってよく、代替実施形態では、３位及び６位の両方のアミノ酸残基がアスパラギンであってよい。
ニンである、及び／又は配列番号４～７の６位に対応する位置のアミノ酸残基は、アスパラギン酸である。３位及び６位のアミノ酸残基の１つはアスパラギンであってよく、代替実施形態では、３位及び６位の両方のアミノ酸残基がアスパラギンであってよい。
【0031】
一部の実施形態では、配列番号４～７の４３位に対応する位置のアミノ酸残基（Ｘ11）は、アラニン又はグルタミン酸、例えばアラニンなどである。具体的な実施形態では、配列番号７の９位及び１１位のアミノ酸残基は、それぞれ、アラニン及びリジン／グルタミン酸であり、一方、４３位のアミノ酸残基は、アラニン又はグルタミン酸である。
【0032】
ある種の実施形態では、配列番号４～７の２８位に対応する位置のアミノ酸残基（Ｘ5）は、アラニン又はアスパラギン、例えばアラニンなどである。
【0033】
一部の実施形態では、配列番号４～７の４０位に対応する位置のアミノ酸残基（Ｘ9）は、アスパラギン、アラニン、グルタミン酸及びバリンからなる群から、或いはグルタミン酸及びバリンからなる群から選択される。具体的な実施形態では、配列番号７の９位及び１１位のアミノ酸残基は、それぞれ、アラニン及びグルタミン酸であり、一方、４０位のアミノ酸残基は、バリンである。随意に、４３位のアミノ酸残基は、アラニン又はグルタミン酸であってよい。
【0034】
ある種の実施形態では、配列番号４～７の４２位に対応する位置のアミノ酸残基（Ｘ10）は、アラニン、リジン又はアルギニンである。
【0035】
一部の実施形態では、配列番号４～７の１８位に対応する位置のアミノ酸残基（Ｘ3）は、リジン又はヒスチジン、例えばリジンなどである。
【0036】
ある種の実施形態では、配列番号４～７の３３位に対応する位置のアミノ酸残基（Ｘ7）は、リジン又はセリン、例えばリジンなどである。
【0037】
一部の実施形態では、配列番号４～７の３７位に対応する位置のアミノ酸残基（Ｘ8）は、グルタミン酸又はアスパラギン酸、例えばグルタミン酸などである。
【0038】
ある種の実施形態では、配列番号４～７の５１位に対応する位置のアミノ酸残基（Ｘ14）は、チロシン又はロイシン、例えばチロシンなどである。
【0039】
一部の実施形態では、配列番号４～７の４４位に対応する位置のアミノ酸残基（Ｘ12）は、ロイシン又はイソロイシンである。具体的な実施形態では、配列番号７の９位及び１１位のアミノ酸残基は、それぞれ、アラニン及びリジン／グルタミン酸であり、一方、４４位のアミノ酸残基はイソロイシンである。随意に、４３位のアミノ酸残基は、アラニン又はグルタミン酸であってよい。
【0040】
一部の実施形態では、配列番号４～７の１、２、３及び４位、又は３、４、５及び６位に対応する位置のアミノ酸残基は欠失している。これらの実施形態の特定のバリアントでは、親ポリペプチドは、プロテインＡのＣドメイン（配列番号５）である。これらの欠失の天然のＣドメインへの影響は、参照によりその全文が本明細書に援用される米国特許第９０１８３０５号及び米国特許第８３２９８６０号に記載されている。
【0041】
ある種の実施形態では、配列番号４～７中の、例えば配列番号７中の変異は、Ｎ１１Ｋ；Ｎ１１Ｅ；Ｎ１１Ｙ；Ｎ１１Ｔ；Ｎ１１Ｆ；Ｎ１１Ｌ；Ｎ１１Ｗ；Ｎ１１Ｉ；Ｎ１１Ｍ；Ｎ１１Ｖ；Ｎ１１Ａ；Ｎ１１Ｈ；Ｎ１１Ｒ；Ｎ１１Ｅ、Ｑ３２Ａ；Ｎ１１Ｅ、Ｑ３２Ｅ、Ｑ４０Ｅ；Ｎ１１Ｅ、Ｑ３２Ｅ、Ｋ５０Ｒ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ４３Ａ；Ｑ９Ａ、Ｎ
１１Ｅ、Ｎ２８Ａ、Ｎ４３Ａ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ｅ、Ｌ４４Ｉ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｓ３３Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５０Ｒ、Ｌ５１Ｙ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ２８Ａ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｓ３３Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５０Ｒ、Ｌ５１Ｙ；Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５０Ｒ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｄ３７Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ及びＱ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｄ３７Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉからなる群から選択される。これらの変異は、特に高いアルカリ安定性をもたらす。配列番号４～７中の、例えば配列番号７中の変異は、Ｎ１１Ｋ；Ｎ１１Ｙ；Ｎ１１Ｆ；Ｎ１１Ｌ；Ｎ１１Ｗ；Ｎ１１Ｉ；Ｎ１１Ｍ；Ｎ１１Ｖ；Ｎ１１Ａ；Ｎ１１Ｈ；Ｎ１１Ｒ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ４３Ａ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ２８Ａ、Ｎ４３Ａ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ｅ、Ｌ４４Ｉ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ２８Ａ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｓ３３Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５０Ｒ、Ｌ５１Ｙ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｓ３３Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５０Ｒ、Ｌ５１Ｙ；Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ及びＱ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５０Ｒからなる群からも選択されることができる。
１１Ｅ、Ｎ２８Ａ、Ｎ４３Ａ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ｅ、Ｌ４４Ｉ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｓ３３Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５０Ｒ、Ｌ５１Ｙ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ２８Ａ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｓ３３Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５０Ｒ、Ｌ５１Ｙ；Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５０Ｒ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｄ３７Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ及びＱ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｄ３７Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉからなる群から選択される。これらの変異は、特に高いアルカリ安定性をもたらす。配列番号４～７中の、例えば配列番号７中の変異は、Ｎ１１Ｋ；Ｎ１１Ｙ；Ｎ１１Ｆ；Ｎ１１Ｌ；Ｎ１１Ｗ；Ｎ１１Ｉ；Ｎ１１Ｍ；Ｎ１１Ｖ；Ｎ１１Ａ；Ｎ１１Ｈ；Ｎ１１Ｒ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ４３Ａ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ２８Ａ、Ｎ４３Ａ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ｅ、Ｌ４４Ｉ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ２８Ａ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｓ３３Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５０Ｒ、Ｌ５１Ｙ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｓ３３Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５０Ｒ、Ｌ５１Ｙ；Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ及びＱ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５０Ｒからなる群からも選択されることができる。
【0042】
一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９及び配列番号５０からなる群から選択される配列を含むか又はそれから本質的になる。それは、例えば、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１６、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８及び配列番号２９からなる群から選択される配列を含むか又はそれから本質的になってよい。また、それは、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１６、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３８、配列番号４０；配列番号４１；配列番号４２；配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７及び配列番号４８からなる群から選択される配列を含むか又はそれから本質的になることができる。ポリペプチドは、例えば上記の群から、又はこれらの群の部分集合から選択される配列で定義されてよいが、それはまた、Ｎ及び／又はＣ末端にさらなるアミノ酸残基、例えばＮ末端のリーダー配列及び／又はＣ末端のテール配列を含んでもよい。
【0043】
配列番号８ Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ４３Ａ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＡＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号９ Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ２８Ａ、Ｎ４３Ａ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＡＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号１０ Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ｅ、Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶＳＫＥＩＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号１１ Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号１２ Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｅ、Ｑ３２Ａ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＡＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号１３ Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｅ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号１４ Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｅ、Ｑ３２Ｅ、Ｑ４０Ｅ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＥＳＬＫＤＤＰＳＥ ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号１５ Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｅ、Ｑ３２Ｅ、Ｋ５０Ｒ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＥＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＲ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号１６ Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｋ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ ＫＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号２３ Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｓ３３Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５０Ｒ、Ｌ５１Ｙ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＫＬＫＤＥＰＳＱ ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＲ ＹＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号２４ Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ２８Ａ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号２５ Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｓ３３Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５０Ｒ、Ｌ５１Ｙ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦ ＩＱＫＬＫＤＥＰＳＱ ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＲ ＹＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号２６ Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＱ ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号２７ Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＱ ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号２８ Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５０Ｒ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＱ ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＲ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号２９ Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＱ ＳＲＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号３６ Ｂ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）
ＡＤＮＫＦＮＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＮＥＥＱＲＮＧＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号３７ Ｃ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｅ４３Ａ）
ＡＤＮＫＦＮＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＧＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号３８ Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｙ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ ＹＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号３９ Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｔ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ ＴＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号４０ Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｆ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ ＦＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号４１ Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｌ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ ＬＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号４２ Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｗ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ ＷＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号４３ Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ ＩＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号４４ Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｍ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ ＭＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号４５ Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｖ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ ＶＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号４６ Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ａ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ ＡＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号４７ Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｈ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ ＨＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号４８ Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｒ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ ＲＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号４９ Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｄ３７Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＶ ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号５０ Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｄ３７Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＶ ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
第２の態様では、本発明は、上に開示されるいずれかの実施形態で定義される複数のポリペプチド単位を含むか、又はそれから本質的になる多量体を開示する。多量体は、例えば二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体又は九量体であり得る。それは、多量体中の全ての単位が同一であるホモ多量体であってもよいし、１以上の単位が他の単位と異なるヘテロ多量体であってもよい。有利には、多量体中の全ての単位は、例
えば上に開示される変異を含むことによって、アルカリ安定性である。ポリペプチドは、ポリペプチドのＣ末端とＮ末端との間のペプチド結合によって直接に互いと結合することができる。或いは、多量体中の２以上の単位は、オリゴマー種又はポリマー種、例えば最大１５又は３０アミノ酸、例えば１～５、１～１０又は５～１０アミノ酸などを含む要素などを含むリンカーによって結合することができる。これは特に配列番号５１及び５２の変異並びに配列番号５３のポリペプチドの例であり、リンカーの具体例は、例えば、ＶＤＡＫＦＤ又はＡＤＮＫＦＮ、例えばＶＤＡＫＦＤなどであり得る。そのようなリンカーの性質は、好ましくはタンパク質単位の空間的立体構造を不安定化するべきではない。これは、例えばリンカー中にプロリンが存在しないようにすることによって達成することができる。さらに、リンカーはまた、好ましくは変異したタンパク質単位の性質を損なわないようにアルカリ環境で十分に安定しているべきでもある。この目的のため、リンカーがアスパラギンを含まない場合は有利である。リンカーがグルタミンを含まない場合はさらに有利であり得る。多量体はさらにＮ末端で複数のアミノ酸残基、例えばクローニングプロセスに由来するか、又は切断されるシグナル伝達配列由来の残基を構成するアミノ酸残基などを含むことがある。さらなるアミノ酸残基の数は、例えば１５以下、例えば１０以下又は５以下などであってよい。具体例として、多量体は、ＡＱ配列をＮ末端に含むことがある。
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＡＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号９ Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ２８Ａ、Ｎ４３Ａ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＡＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号１０ Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ｅ、Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶＳＫＥＩＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号１１ Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号１２ Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｅ、Ｑ３２Ａ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＡＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号１３ Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｅ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号１４ Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｅ、Ｑ３２Ｅ、Ｑ４０Ｅ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＥＳＬＫＤＤＰＳＥ ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号１５ Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｅ、Ｑ３２Ｅ、Ｋ５０Ｒ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＥＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＲ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号１６ Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｋ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ ＫＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号２３ Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｓ３３Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５０Ｒ、Ｌ５１Ｙ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＫＬＫＤＥＰＳＱ ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＲ ＹＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号２４ Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ２８Ａ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号２５ Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｓ３３Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５０Ｒ、Ｌ５１Ｙ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦ ＩＱＫＬＫＤＥＰＳＱ ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＲ ＹＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号２６ Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＱ ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号２７ Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＱ ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号２８ Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５０Ｒ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＱ ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＲ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号２９ Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＱ ＳＲＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号３６ Ｂ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）
ＡＤＮＫＦＮＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＮＥＥＱＲＮＧＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号３７ Ｃ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｅ４３Ａ）
ＡＤＮＫＦＮＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＧＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号３８ Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｙ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ ＹＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号３９ Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｔ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ ＴＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号４０ Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｆ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ ＦＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号４１ Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｌ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ ＬＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号４２ Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｗ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ ＷＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号４３ Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ ＩＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号４４ Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｍ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ ＭＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号４５ Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｖ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ ＶＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号４６ Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ａ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ ＡＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号４７ Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｈ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ ＨＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号４８ Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｒ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ ＲＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号４９ Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｄ３７Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＶ ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号５０ Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｄ３７Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＶ ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ
第２の態様では、本発明は、上に開示されるいずれかの実施形態で定義される複数のポリペプチド単位を含むか、又はそれから本質的になる多量体を開示する。多量体は、例えば二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体又は九量体であり得る。それは、多量体中の全ての単位が同一であるホモ多量体であってもよいし、１以上の単位が他の単位と異なるヘテロ多量体であってもよい。有利には、多量体中の全ての単位は、例
えば上に開示される変異を含むことによって、アルカリ安定性である。ポリペプチドは、ポリペプチドのＣ末端とＮ末端との間のペプチド結合によって直接に互いと結合することができる。或いは、多量体中の２以上の単位は、オリゴマー種又はポリマー種、例えば最大１５又は３０アミノ酸、例えば１～５、１～１０又は５～１０アミノ酸などを含む要素などを含むリンカーによって結合することができる。これは特に配列番号５１及び５２の変異並びに配列番号５３のポリペプチドの例であり、リンカーの具体例は、例えば、ＶＤＡＫＦＤ又はＡＤＮＫＦＮ、例えばＶＤＡＫＦＤなどであり得る。そのようなリンカーの性質は、好ましくはタンパク質単位の空間的立体構造を不安定化するべきではない。これは、例えばリンカー中にプロリンが存在しないようにすることによって達成することができる。さらに、リンカーはまた、好ましくは変異したタンパク質単位の性質を損なわないようにアルカリ環境で十分に安定しているべきでもある。この目的のため、リンカーがアスパラギンを含まない場合は有利である。リンカーがグルタミンを含まない場合はさらに有利であり得る。多量体はさらにＮ末端で複数のアミノ酸残基、例えばクローニングプロセスに由来するか、又は切断されるシグナル伝達配列由来の残基を構成するアミノ酸残基などを含むことがある。さらなるアミノ酸残基の数は、例えば１５以下、例えば１０以下又は５以下などであってよい。具体例として、多量体は、ＡＱ配列をＮ末端に含むことがある。
【0044】
ある種の実施形態では、多量体は、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４及び配列番号３５からなる群から選択される配列を含むか又はそれから本質的になってよい。これらの配列は下の表に記載され、親（変異）ｎと命名される。ここでｎは多量体中の単量体単位の数である。
【0045】
配列番号１７ Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ４３Ａ）４
ＡＱＧＴ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＡＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＡＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＡＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＡＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号１８ Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ２８Ａ、Ｎ４３Ａ）４
ＡＱＧＴ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＡＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＡＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＡＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＡＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号１９ Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ｅ、Ｌ４４Ｉ）４
ＡＱＧＴ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ ＳＫＥＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ ＳＫＥＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ ＳＫＥＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ ＳＫＥＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号２０ Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４
Ｉ）４
ＡＱＧＴ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号３０ Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｓ３３Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５０Ｒ、Ｌ５１Ｙ）４
ＡＱＧＴ ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＫＬＫＤＥＰＳＱ ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＲ ＹＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＫＬＫＤＥＰＳＱ ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＲ ＹＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＫＬＫＤＥＰＳＱ ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＲ ＹＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＫＬＫＤＥＰＳＱ ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＲ ＹＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号３１ Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ）４
ＡＱＧＴ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＱ ＳＲＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＱ ＳＲＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＱ ＳＲＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＱ ＳＲＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号３２ Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ２８Ａ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）４
ＡＱＧＴ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号３３ Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）６
ＡＱＧＴ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号３４ Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｄ３７Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）４
ＡＱＧＴ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＶＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＶ ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＶ ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＶ ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号３５ Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｄ３７Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）４
ＡＱＧＴ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＶ ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＶ ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＶ ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＶ ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
一部の実施形態では、上に開示されるポリペプチド及び／又は多量体は、Ｃ末端又はＮ末端に、１以上のシステイン残基、複数のリジン残基及び複数のヒスチジン残基からなる群から選択される、１以上の連結要素をさらに含む。１以上の連結要素はまた、Ｃ末端又はＮ末端から１～５アミノ酸残基の範囲内、例えば１～３又は１～２アミノ酸残基の範囲内に位置してもよい。連結要素は、例えばＣ末端の単一のシステインであることがある。１以上の連結要素は、Ｃ又はＮ末端に直接に結合してもよいし、或いは連結要素は、最大１５アミノ酸、例えば１～５、１～１０又は５～１０アミノ酸を含むストレッチを介して結合してもよい。このストレッチもまた、好ましくは変異したタンパク質の性質を損なわないようにアルカリ環境で十分に安定しているべきである。この目的のため、ストレッチがアスパラギンを含まない場合は有利である。ストレッチがグルタミンを含まない場合はさらに有利であり得る。Ｃ末端システインを有する利点は、タンパク質のエンドポイントカップリングがシステインチオールと担体上の求電子基との反応を通じて達成され得ることである。このことは、結合能に重要である、結合したタンパク質の優れた移動度をもたらす。
ＡＱＧＴ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＡＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＡＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＡＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＡＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号１８ Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ２８Ａ、Ｎ４３Ａ）４
ＡＱＧＴ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＡＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＡＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＡＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ ＳＡＡＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号１９ Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ｅ、Ｌ４４Ｉ）４
ＡＱＧＴ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ ＳＫＥＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ ＳＫＥＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ ＳＫＥＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ ＳＫＥＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号２０ Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４
Ｉ）４
ＡＱＧＴ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号３０ Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｓ３３Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５０Ｒ、Ｌ５１Ｙ）４
ＡＱＧＴ ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＫＬＫＤＥＰＳＱ ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＲ ＹＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＫＬＫＤＥＰＳＱ ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＲ ＹＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＫＬＫＤＥＰＳＱ ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＲ ＹＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＫＬＫＤＥＰＳＱ ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＲ ＹＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号３１ Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ）４
ＡＱＧＴ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＱ ＳＲＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＱ ＳＲＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＱ ＳＲＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＫＡＦＹＥＩＬＫＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＱ ＳＲＮＬＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号３２ Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ２８Ａ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）４
ＡＱＧＴ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号３３ Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）６
ＡＱＧＴ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号３４ Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｄ３７Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）４
ＡＱＧＴ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＶＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＶ ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＶ ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＶ ＳＫＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
配列番号３５ Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｄ３７Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）４
ＡＱＧＴ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＶ ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＶ ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＶ ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＡＫＦＤＫＥＡＱ ＥＡＦＹＥＩＬＨＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ ＩＱＳＬＫＤＥＰＳＶ ＳＲＡＩＬＡＥＡＫＫ ＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
一部の実施形態では、上に開示されるポリペプチド及び／又は多量体は、Ｃ末端又はＮ末端に、１以上のシステイン残基、複数のリジン残基及び複数のヒスチジン残基からなる群から選択される、１以上の連結要素をさらに含む。１以上の連結要素はまた、Ｃ末端又はＮ末端から１～５アミノ酸残基の範囲内、例えば１～３又は１～２アミノ酸残基の範囲内に位置してもよい。連結要素は、例えばＣ末端の単一のシステインであることがある。１以上の連結要素は、Ｃ又はＮ末端に直接に結合してもよいし、或いは連結要素は、最大１５アミノ酸、例えば１～５、１～１０又は５～１０アミノ酸を含むストレッチを介して結合してもよい。このストレッチもまた、好ましくは変異したタンパク質の性質を損なわないようにアルカリ環境で十分に安定しているべきである。この目的のため、ストレッチがアスパラギンを含まない場合は有利である。ストレッチがグルタミンを含まない場合はさらに有利であり得る。Ｃ末端システインを有する利点は、タンパク質のエンドポイントカップリングがシステインチオールと担体上の求電子基との反応を通じて達成され得ることである。このことは、結合能に重要である、結合したタンパク質の優れた移動度をもたらす。
【0046】
ポリペプチド又は多量体のアルカリ安定性は、例えばＮＨＳ－又はマレイミドカップリング化学を使用して、ＳＰＲチップ、例えば実施例に記載されるようなＢｉａｃｏｒｅ ＣＭ５センサーチップとそれをカップリングさせ、指定された温度、例えば２２±２℃のアルカリ溶液中でのインキュベーションの前後に一般にポリクローナルヒトＩｇＧを用いてチップの免疫グロブリン結合能を測定することによって評価することができる。インキュベーションは、例えば０．５Ｍ ＮａＯＨ中で何回かの１０分サイクル、例えば１００、２００又は３００サイクルなどで実施することができる。２２±２℃の０．５Ｍ ＮａＯＨ中で１００回の１０分インキュベーションサイクルの後のマトリックスのＩｇＧ結合能は、インキュベーション前のＩｇＧ結合能の少なくとも５５、例えば少なくとも６０、少なくとも８０又は９０％以上などであり得る。或いは、上記のように測定される特定の変異体の１００サイクル後の残存ＩｇＧ結合能は、親ポリペプチド／多量体の残存ＩｇＧ結合能と比較することができる。この例では、変異体の残存ＩｇＧ結合能は、親ポリペプチド／多量体の少なくとも１０５％、例えば少なくとも１１０％、少なくとも１２５％、少なくとも１５０％又は少なくとも２００％などであることがある。
【0047】
第３の態様では、本発明は、上に開示される任意の実施形態によるポリペプチド又は多量体をコードする核酸を開示する。よって、本発明は、ポリペプチド又は多量体をコードするＲＮＡ及びＤＮＡなどの本発明の核酸配列の全ての形態を包含する。本発明は、ベクター、例えばプラスミドなどを包含し、ベクターは、コード配列に加えて本発明によるポリペプチド又は多量体の発現に必要なシグナル配列を含む。一実施形態では、ベクターは、本発明による多量体をコードする核酸を含み、この際、各々の単位をコードする別々の
核酸は、相同又は異種のＤＮＡ配列を有することがある。
核酸は、相同又は異種のＤＮＡ配列を有することがある。
【0048】
第４の態様では、本発明は発現系を開示し、発現系は上に開示されるような核酸又はベクターを含む。発現系は、例えばグラム陽性又はグラム陰性の原核生物宿主細胞系、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はバチルス属の種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）であってよく、本発明のポリペプチド又は多量体を発現するよう改変されている。代替実施形態では、発現系は、真核生物宿主細胞系、例えば酵母、例えばピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）又はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、又は哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞である。
【0049】
第５の態様では、本発明は、上に開示される任意の実施形態による複数のポリペプチド又は多量体が固相支持体に結合されている、分離マトリックスを開示する。そのようなマトリックスは、免疫グロブリン又はその他のＦｃ含有タンパク質の分離に有用である。そして、ポリペプチド／多量体のアルカリ安定性が改善されたために、マトリックスは洗浄中の高アルカリ条件に耐え、それはバイオプロセス分離の状況において長期の反復使用に不可欠である。マトリックスのアルカリ安定性は、指定された温度、例えば２２±２℃のアルカリ溶液中でのインキュベーションの前後に一般にポリクローナルヒトＩｇＧを使用して、免疫グロブリン結合能を測定することによって評価することができる。インキュベーションは、例えば、０．５Ｍ又は１．０Ｍ ＮａＯＨ中で何回かの１５分サイクル、例えば２５、５０又は７５時間の総インキュベーション時間に相当する１００、２００又は３００サイクルなどで実施することができる。２２±２℃の０．５Ｍ ＮａＯＨ中で９６～１００回の１５分インキュベーションサイクル或いは２４又は２５時間の総インキュベーション時間の後のマトリックスのＩｇＧ結合能は、インキュベーション前のＩｇＧ結合能の８０％以上、例えば８５％以上、９０％以上又は９５％以上などであり得る。２２±２℃の１．０Ｍ ＮａＯＨ中で合計２４時間のインキュベーションの後のマトリックスの能力は、インキュベーション前のＩｇＧ結合能の７０％以上、例えば８０％以上又は９０％以上などであり得る。
【0050】
当業者の理解するように、発現したポリペプチド又は多量体は、担体に固定される前に適切な程度まで精製されるべきである。そのような精製方法は当分野で周知であり、タンパク質に基づくリガンドの担体への固定は標準法を用いて容易に実行される。適した方法及び担体は、下でより詳細に考察される。
【0051】
本発明によるマトリックスの固相支持体は、任意の適した周知の種類の支持体であり得る。従来のアフィニティー分離マトリックスは多くの場合有機性であり、親水性表面を使用する水性媒体に露出する、すなわち、その外表面、そして存在する場合には内表面のヒドロキ基シ（－ＯＨ）、カルボキシ基（－ＣＯＯＨ）、カルボキサミド基（－ＣＯＮＨ2、おそらくＮ－置換形態）、アミノ基（－ＮＨ2、おそらく置換形態）、オリゴ基又はポリエチレンオキシ基を露出するポリマーに基づく。固相支持体は、適切には多孔性であり得る。固相支持体は、適切に多孔性であり得る。多孔度は、例えばＧｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９１，ｐｐ ６－１３に記載される方法に従って、逆サイズ排除クロマトグラフィーによって測定されるＫａｖ又はＫｄ値（特定のサイズのプローブ分子に対する利用可能な細孔容積の割合）として表すことができる。定義により、Ｋｄ値及びＫａｖ値の両方は常に０～１の範囲内にある。Ｋａｖ値は、有利には、プローブ分子としてＭｗ１１０ｋＤａのデキストランを用いて測定して、０．６～０．９５、例えば０．７～０．９０又は０．６～０．８であり得る。この利点は、担体が、本発明のポリペプチド／多量体と、ポリペプチド／多量体との免疫グロブリンの結合の両方に対応し、結合部位への、及び結合部位からの免疫グロブリンの物質輸送をもたらすことの可能な、高い割合の細孔を有する点である。
【0052】
ポリペプチド又は多量体は、例えばリガンドに存在するチオール、アミノ及び／又はカルボキシ基を利用する従来のカップリング技法によって担体と結合させることができる。ビスエポキシド、エピクロロヒドリン、ＣＮＢｒ、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）等は周知のカップリング試薬である。担体とポリペプチド／多量体との間には、ポリペプチド／多量体の有効性を改善し、ポリペプチド／多量体と担体との化学カップリングを促進する、スペーサーとして公知の分子を導入することができる。ポリペプチド／多量体の性質及びカップリング条件に応じて、カップリングは、マルチポイントカップリング（例えば複数のリジンを介するもの）であってもよいし、シングルポイントカップリング（例えば単一のシステインを介するもの）であってもよい。或いは、ポリペプチド／多量体は、非共有結合、例えば物理的吸着又は生体分子特異的吸着などによって担体と結合させてよい。
【0053】
一部の実施形態では、マトリックスは、５～２５、例えば５～２０ｍｇ／ｍｌ、５～１５ｍｇ／ｍｌ、５～１１ｍｇ／ｍｌ又は６～１１ｍｇ／ｍｌの、担体と結合したポリペプチド又は多量体を含む。結合したポリペプチド／多量体の量は、カップリングプロセスで使用したポリペプチド／多量体の濃度、使用した活性化及びカップリング条件、及び／又は使用した担体の多孔構造によって制御することができる。概して、マトリックスの絶対結合能は、結合したポリペプチド／多量体の量とともに、少なくとも細孔が結合したポリペプチド／多量体によって著しく狭窄されるようになる時点まで増加する。結合したポリペプチド／多量体１ｍｇ当たりの相対結合能は、高いカップリングレベルで低下し、上に指定される範囲内で最適の費用便益をもたらす。
【0054】
ある種の実施形態ではポリペプチド又は多量体は、チオエーテル結合を介して担体と結合する。そのようなカップリングを実施するための方法は当技術分野で周知であり、標準的な技法及び設備を使用して当業者に容易に実施される。チオエーテル結合は、柔軟で安定しているので、通常アフィニティークロマトグラフィーでの使用に適している。特に、チオエーテル結合がポリペプチド又は多量体の末端又は末端に近いシステイン残基を介するものである場合、結合したポリペプチド／多量体の移動度が増強され、それは結合能及び結合速度を改善する。一部の実施形態では、ポリペプチド／多量体は、上記のようにタンパク質上にあるＣ末端システインを介して結合される。このことは、システインチオールと担体上の求電子基、例えばエポキシド基、ハロヒドリン基等との効率的なカップリングを可能にし、その結果チオエーテル架橋結合となる。
【0055】
ある種の実施形態では、担体はポリヒドロキシポリマー、例えば多糖などを含む。多糖の例としては、例えばデキストラン、デンプン、セルロース、プルラン、寒天、アガロース等が挙げられる。多糖は、非特異的相互作用の程度が低く本質的に親水性であり、反応性の（活性化可能な）ヒドロキシル基の含有量が高く、バイオプロセシングで使用されるアルカリ洗浄溶液に対して通常安定している。
【0056】
一部の実施形態では、担体は寒天又はアガロースを含む。一部の実施形態では、担体は寒天又はアガロースを含む。本発明で使用される担体は、標準法、例えば逆懸濁ゲル化（Ｓ Ｈｊｅｒｔｅｎ：Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ７９（２），３９３－３９８（１９６４）などに従って容易に調製することができる。或いは、ベースマトリックスは、市販の製品、例えばＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）ＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の商品名で販売されている架橋アガロースビーズなどである。大規模分離に特に有利な一実施形態では、参照によりその全文が本明細書に援用される米国特許第６６０２９９０号又は米国特許第７３９６４６７号に記載の方法を用いて、担体を剛性が増加するように適合させているので、マトリックスは高流量により適したものになっている。
【0057】
ある種の実施形態では、担体、例えば多糖又はアガロース担体などは、例えばヒドロキシアルキルエーテル架橋によって架橋されている。そのような架橋を生成するクロスリンカー試薬は、例えばエピクロロヒドリンのようなエピハロヒドリン、ブタンジオールジグリシジルエーテルのようなジエポキシド、アリルハライド又はアリルグリシジルエーテルのようなアリル化試薬であり得る。架橋は、担体の剛性に有益であり、化学安定性を改善する。ヒドロキシアルキルエーテル架橋はアルカリ安定性であり、著しい非特異的吸着を引き起こさない。
【0058】
或いは、固相支持体は、合成ポリマー、例えばポリビニルアルコール、ポリヒドロキシアルキルアクリレート、ポリヒドロキシアルキルメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド等に基づく。疎水性ポリマー、例えばジビニル及びモノビニル置換ベンゼンに基づくマトリックスの例では、マトリックスの表面は、多くの場合、親水化されて上記定義の親水基を周囲の水性液に露出する。そのようなポリマーは、標準法に従って容易に製造される、例えば「Ｓｔｙｒｅｎｅ ｂａｓｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒ ｓｕｐｐｏｒｔｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｂｙ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ」（Ｒ Ａｒｓｈａｄｙ：Ｃｈｉｍｉｃａ ｅ Ｌ’Ｉｎｄｕｓｔｒｉａ ７０（９），７０－７５（１９８８））を参照されたい。或いは、市販製品、例えばＳＯＵＲＣＥ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）が使用される。別の代替法では、本発明による固相支持体は、無機性、例えばシリカ、酸化ジルコニウム等の担体を含む。
【0059】
さらに別の実施形態では、固相支持体は、別の形態、例えば表面、チップ、毛細管、又はフィルタ（例えば膜又はデプスフィルタマトリックス）などである。
【0060】
本発明によるマトリックスの形状に関して、一実施形態では、マトリックスは多孔質モノリスの形態である。代替実施形態では、マトリックスは、多孔質であっても非孔質であってもよいビーズ状又は粒子形態である。ビーズ状又は粒子形態のマトリックスは、充填層として、又は懸濁形態で使用されることができる。懸濁形態としては、粒子又はビーズが自由に移動する、発泡層及び純粋な懸濁液として公知の形態が含まれる。モノリス、充填層及び発泡層の例では、分離手順は一般に、濃度勾配をもつ従来のクロマトグラフィー従う。純粋な懸濁液の例では、バッチ式モードが使用される。
【0061】
第６の態様では、本発明は、上に開示されるような分離マトリックスを使用する、免疫グロブリンを単離する方法を開示する。
【0062】
ある種の実施形態では、この方法は、
ａ）免疫グロブリンを含む液体試料と上に開示される分離マトリックスとを接触させる工程、
ｂ）分離マトリックスを洗浄液で洗浄する工程、
ｃ）溶出液を用いて分離マトリックスから免疫グロブリンを溶出する工程、及び
ｄ）分離マトリックスを清浄液（或いは定置洗浄（ＣＩＰ）液と呼ぶこともできる）
で、例えば少なくとも１０分の接触（インキュベーション）時間で清浄する工程
を含む。
ａ）免疫グロブリンを含む液体試料と上に開示される分離マトリックスとを接触させる工程、
ｂ）分離マトリックスを洗浄液で洗浄する工程、
ｃ）溶出液を用いて分離マトリックスから免疫グロブリンを溶出する工程、及び
ｄ）分離マトリックスを清浄液（或いは定置洗浄（ＣＩＰ）液と呼ぶこともできる）
で、例えば少なくとも１０分の接触（インキュベーション）時間で清浄する工程
を含む。
【0063】
この方法はまた、工程ａ）の前に、上記の実施形態によるアフィニティー分離マトリックスを準備する工程と、免疫グロブリン及び液体試料として１以上のその他の物質を含む溶液を準備する工程と、工程ｃ）の後に、溶出液を回収する工程と、適宜溶出液を、例えば陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、マルチモードクロマトグラフィー及び／又は疎水性相互作用クロマトグラフィーによる、さらなる分離工程に供する工程を含んでもよい。液体試料、洗浄液及び溶出液の適した組成、並びに分離を実施するための一般条件は、アフィニティークロマトグラフィーの技術分野、特にプロテインＡクロマトグラ
フィーの技術分野で周知である。Ｆｃ含有タンパク質及び１以上のその他の物質を含む液体試料は、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、例えばＣＨＯ細胞、大腸菌又は酵母タンパク質などを含んでよい。ＣＨＯ細胞及び大腸菌タンパク質の内容物は、これらのタンパク質に対するイムノアッセイ、例えばＣｙｇｎｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＣＨＯ ＨＣＰ又は大腸菌ＨＣＰ ＥＬＩＳＡキットによって簡便に求めることができる。宿主細胞タンパク質又はＣＨＯ細胞／大腸菌タンパク質は、工程ｂ）の間に離脱させることができる。
フィーの技術分野で周知である。Ｆｃ含有タンパク質及び１以上のその他の物質を含む液体試料は、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、例えばＣＨＯ細胞、大腸菌又は酵母タンパク質などを含んでよい。ＣＨＯ細胞及び大腸菌タンパク質の内容物は、これらのタンパク質に対するイムノアッセイ、例えばＣｙｇｎｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＣＨＯ ＨＣＰ又は大腸菌ＨＣＰ ＥＬＩＳＡキットによって簡便に求めることができる。宿主細胞タンパク質又はＣＨＯ細胞／大腸菌タンパク質は、工程ｂ）の間に離脱させることができる。
【0064】
溶出は、プロテインＡ媒体からの溶出に使用される任意の適した溶液を使用することによって実施することができる。これは、例えばｐＨ５以下、例えばｐＨ２．５～５又は３～５などの溶液又は緩衝液であり得る。また、一部の例では、それはｐＨ１１以上、例えばｐＨ１１～１４又はｐＨ１１～１３などの溶液又は緩衝液であり得る。一部の実施形態では、溶出緩衝液又は溶出緩衝液勾配は、１以上の単官能性、二官能性又は酸官能性カルボン酸又はそのようなカルボン酸の塩を含む。ある種の実施形態では、溶出緩衝液又は溶出緩衝液勾配は、酢酸塩、クエン酸塩、グリシン、コハク酸塩、リン酸塩、及びギ酸塩からなる群から選択される１以上の陰イオン種を含む。
【0065】
一部の実施形態では、清浄液は、アルカリ性、例えばｐＨが１３～１４である。そのような溶液は、特に間隔の上端で、マトリックスの効率的な洗浄をもたらす。
【0066】
ある種の実施形態では、清浄液は０．１～２．０Ｍ ＮａＯＨ又はＫＯＨ、例えば０．５～２．０又は０．５～１．０Ｍ ＮａＯＨ又はＫＯＨなどを含む。これらは効率的な洗浄溶液であり、特にＮａＯＨ又はＫＯＨ濃度が０．１Ｍ又は少なくとも０．５Ｍを上回る場合にそうである。本発明のポリペプチドの高い安定性は、そのような強アルカリ溶液の使用を可能にする。
【0067】
この方法はまた、消毒液でマトリックスを消毒する工程を含んでもよく、消毒液は例えば過酸化物、例えば過酸化水素及び／又は過酸、例えば過酢酸又は過ギ酸などを含んでよい。
【0068】
一部の実施形態では、工程ａ）～ｄ）は１０回以上、例えば５０回以上、５０～２００、５０～３００又は５０～５００回繰り返される。このことは、マトリックスを何度も再使用することができるという点でプロセスの経済に重要である。
【0069】
工程ａ）～ｃ）はまた、１０回以上、例えば５０回以上、５０～２００、５０～３００又は５０～５００回繰り返すことができ、工程ｄ）は、工程ｃ）を複数回行った後に実施され、その結果工程ｄ）は１０回以上、例えば５０回以上実施される。工程ｄ）は、例えば２～２０回目の工程ｃ）の例ごとに実施することができる。
【実施例】
【0070】
タンパク質の変異導入
部位特異的変異導入を、変異をコードするオリゴヌクレオチドを用いて２工程のＰＣＲによって実施した。鋳型として、Ｚ、Ｂ又はＣのいずれかの単一のドメインを含有するプラスミドを使用した。ＰＣＲ断片を大腸菌発現ベクターに連結した。ＤＮＡ塩基配列決定法を使用して、挿入した断片の正しい配列を検証した。
部位特異的変異導入を、変異をコードするオリゴヌクレオチドを用いて２工程のＰＣＲによって実施した。鋳型として、Ｚ、Ｂ又はＣのいずれかの単一のドメインを含有するプラスミドを使用した。ＰＣＲ断片を大腸菌発現ベクターに連結した。ＤＮＡ塩基配列決定法を使用して、挿入した断片の正しい配列を検証した。
【0071】
変異体の多量体を形成するために、アミノ酸ＶＤに対応する、Ｂ、Ｃ又はＺドメインの出発コドン（ＧＴＡ ＧＡＣ）に位置するＡｃｃ Ｉ部位を使用した。単量体ドメインのベクターをＡｃｃ Ｉで消化し、ホスファターゼ処理した。各々のバリアントに特異的なＡｃｃ Ｉ粘着末端プライマーを設計し、２つのオーバーラップＰＣＲ産物を各々の鋳型から製造した。ＰＣＲ産物を精製し、２％アガロースゲル上でＰＣＲ産物を比較することによって濃度を推定した。等量の対のＰＣＲ産物をライゲーション緩衝液中でハイブリダイズした（４５分で９０℃→２５℃）。結果として得られる産物は、Ａｃｃ Ｉ部位（正しいＰＣＲ断片及び／又は消化ベクター）に連結される可能性の高い断片の約１／４からなる。ライゲーション及び形質転換の後、コロニーをＰＣＲスクリーニングして所望の変異体を含む構築物を同定した。陽性クローンは、ＤＮＡ塩基配列決定法により確認した。
【0072】
構築物の発現及び精製
構築物を、標準培地中の大腸菌Ｋ１２の発酵によって細菌ペリプラズム内に発現させた。発酵後、細胞を熱処理してペリプラズムの内容物を培地に放出させた。培地に放出された構築物を、孔径０．２μｍの膜を用いる精密濾過法によって回収した。
構築物を、標準培地中の大腸菌Ｋ１２の発酵によって細菌ペリプラズム内に発現させた。発酵後、細胞を熱処理してペリプラズムの内容物を培地に放出させた。培地に放出された構築物を、孔径０．２μｍの膜を用いる精密濾過法によって回収した。
【0073】
各々の構築物（ここでは濾過工程からの透過液中にある）を、アフィニティーによって精製した。透過液を、固定化ＩｇＧ（ＩｇＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ＦＦ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を含有するクロマトグラフィー培地に添加した。添加した産物をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、ｐＨを低下させることによって溶出した。
【0074】
溶出プールを中性ｐＨ（ｐＨ８）に調節し、ジチオトレイトールの添加によって還元した。次に、試料を陰イオン交換体に添加した。洗浄工程の後、構築物をＮａＣｌ勾配に溶出し、それを夾雑物から分離した。溶出プールを限外濾過によって４０～５０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。固定ＩｇＧ培地での構築物のアフィニティー精製の成功は、問題の構築物がＩｇＧに対して高い親和性を有することを意味することに留意する必要がある。
【0075】
精製したリガンドをＲＰＣ ＬＣ－ＭＳで分析して、純度を求め、分子量が（アミノ酸配列に基づく）予測値と一致することを確かめた。
【0076】
実施例１
Ｎ末端のＡＱＧＴリーダー配列及びＣ末端のシステインをさらに含む、表１に記載の精製単量体リガンドを、ＢｉａｃｏｒｅＣＭ５センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、スウェーデン）上に固定化し、十分な量でＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅのアミンカップリングキット（チップ上のカルボキシメチル基のアミンのカルボジイミドカップリング用）を使用して、Ｂｉａｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）計測器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、スウェーデン）で約２００～１５００ＲＵのシグナル強度を得た。固定化表面のＩｇＧ結合能を追跡するため、１ｍｇ／ｍｌヒトポリクローナルＩｇＧ（Ｇａｍｍａｎｏｒｍ）をチップの上に流し、シグナル強度（結合量に比例）を記録した。次に、表面を定置洗浄した（ＣＩＰ）、すなわち、室温で（２２±２℃）１０分間、５００ｍＭ ＮａＯＨを流した。これを９６～１００サイクル繰り返し、固定化リガンドのアルカリ安定性を、各サイクルの後に残存ＩｇＧ結合能（シグナル強度）として追跡した。結果は表１に示され、少なくともリガンドＺｖａｒ（Ｎ１１Ｋ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｅ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｙ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｔ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｆ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｌ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｗ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｉ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｍ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｖ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ａ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｈ１）、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｒ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｅ、Ｑ３２Ａ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｅ、Ｑ３２Ｅ、Ｑ４０Ｅ）１及びＺｖａｒ（Ｎ１１Ｅ、Ｑ３２Ｅ、Ｋ５０Ｒ）１、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ４３Ａ）１、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ２８Ａ、Ｎ４３Ａ）１、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ｅ、Ｌ４４Ｉ）１、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）１、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ２８Ａ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｓ３３Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５０Ｒ、Ｌ５１Ｙ）１、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｓ３３Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ
４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５０Ｒ、Ｌ５１Ｙ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）１、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）１及びＺｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５０Ｒ）１が、基準として使用した親構造Ｚｖａｒ１と比較してアルカリ安定性が改善されたことを示す。さらに、リガンドＢ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）１及びＣ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｅ４３Ａ）１は、基準として使用した親Ｂドメイン及びＣドメインと比較して安定性が改善された。
Ｎ末端のＡＱＧＴリーダー配列及びＣ末端のシステインをさらに含む、表１に記載の精製単量体リガンドを、ＢｉａｃｏｒｅＣＭ５センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、スウェーデン）上に固定化し、十分な量でＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅのアミンカップリングキット（チップ上のカルボキシメチル基のアミンのカルボジイミドカップリング用）を使用して、Ｂｉａｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）計測器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、スウェーデン）で約２００～１５００ＲＵのシグナル強度を得た。固定化表面のＩｇＧ結合能を追跡するため、１ｍｇ／ｍｌヒトポリクローナルＩｇＧ（Ｇａｍｍａｎｏｒｍ）をチップの上に流し、シグナル強度（結合量に比例）を記録した。次に、表面を定置洗浄した（ＣＩＰ）、すなわち、室温で（２２±２℃）１０分間、５００ｍＭ ＮａＯＨを流した。これを９６～１００サイクル繰り返し、固定化リガンドのアルカリ安定性を、各サイクルの後に残存ＩｇＧ結合能（シグナル強度）として追跡した。結果は表１に示され、少なくともリガンドＺｖａｒ（Ｎ１１Ｋ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｅ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｙ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｔ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｆ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｌ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｗ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｉ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｍ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｖ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ａ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｈ１）、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｒ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｅ、Ｑ３２Ａ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｅ、Ｑ３２Ｅ、Ｑ４０Ｅ）１及びＺｖａｒ（Ｎ１１Ｅ、Ｑ３２Ｅ、Ｋ５０Ｒ）１、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ４３Ａ）１、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ２８Ａ、Ｎ４３Ａ）１、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ｅ、Ｌ４４Ｉ）１、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）１、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ２８Ａ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｓ３３Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５０Ｒ、Ｌ５１Ｙ）１、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｓ３３Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ
４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５０Ｒ、Ｌ５１Ｙ）１、Ｚｖａｒ（Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）１、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）１及びＺｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５０Ｒ）１が、基準として使用した親構造Ｚｖａｒ１と比較してアルカリ安定性が改善されたことを示す。さらに、リガンドＢ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）１及びＣ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｅ４３Ａ）１は、基準として使用した親Ｂドメイン及びＣドメインと比較して安定性が改善された。
【0077】
表１．Ｂｉａｃｏｒｅ（０．５Ｍ ＮａＯＨ）で評価した単量体リガンド
【0078】
【表1】
表２に記載の精製四量体及び六量体リガンドを、ＢｉａｃｏｒｅＣＭ５センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、スウェーデン）上に固定化し、十分な量でＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅのアミンカップリングキット（チップ上のカルボキシメチル基のアミンのカルボジイミドカップリング用）を使用して、Ｂｉａｃｏｒｅ計測器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、スウェーデン）で約２００～１５００ＲＵのシグナル強度を得た。固定化表面のＩｇＧ結合能を追跡するため、１ｍｇ／ｍｌヒトポリクローナルＩｇＧ（Ｇａｍｍａｎｏｒｍ）をチップの上に流し、シグナル強度（結合量に比例）を記録した。次に、表面を定置洗浄した（ＣＩＰ）、すなわち、室温で（２２±２℃）１０分間、５００ｍＭ ＮａＯＨを流した。これを３００サイクル繰り返し、固定化リガンドのアルカリ安定性を、各サイクルの後に残存ＩｇＧ結合能（シグナル強度）として追跡した。結果は表２及び図２に示され、少なくともリガンドＺｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ４３Ａ）４、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ２８Ａ、Ｎ４３Ａ）４、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ｅ、Ｌ４４Ｉ）４及びＺｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）４、Ｚｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｄ３７Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）４及びＺｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｄ３７Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）４が、基準として使用した親構造Ｚｖａｒ４と比較してアルカリ安定性が改善されたことを示す。六量体リガンドＺｖａｒ（Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ）６も、基準として使用した親構造Ｚｖａｒ６と比較してアルカリ安定性が改善されたことを示す。
【0079】
表２．Ｂｉａｃｏｒｅ（０．５Ｍ ＮａＯＨ）で評価した四量体及び六量体リガンド
【0080】
【表2】
実施例２のような５００ｍＭの代わりに１Ｍ ＮａＯＨを用いて、３つのリガンドの１００回のＣＩＰサイクルを用いて実施例２を繰り返した。結果は表３に示され、３つ全てのリガンドが、基準として使用した親構造Ｚｖａｒ４と比較して１Ｍ ＮａＯＨ中でも安定性を改善したことを示す。
【0081】
表３．Ｂｉａｃｏｒｅ（１Ｍ ＮａＯＨ）で評価した四量体リガンド
【0082】
【表3】
表２の精製四量体リガンド（全てＮ末端にさらなるシステインを含む）を、下に記載される方法を用いてアガロースビーズに上に固定化し、能力及び安定性について評価した。結果を表４及び図３に示す。
【0083】
表４．カラム（０．５Ｍ ＮａＯＨ）で評価した、四量体リガンドを含むマトリックス。
【0084】
【表4】
使用したベースマトリックスは、米国特許第６６０２９９０号に記載の方法に従って調製し、Ｇｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９１，ｐｐ ６－１３に記載の方法に従う、Ｍｗ１１０ｋＤａのデキストランの逆ゲル濾過クロマトグラフィーのＫａｖ値０．７０に相当する孔径をもつ、８５マイクロメートル（容積重量、ｄ５０Ｖ）の中位径の硬質架橋アガロースビーズであった。
【0085】
２５ｍＬ（ｇ）のドレインしたベースマトリックス、１０．０ｍＬの蒸留水及び２．０２ｇのＮａＯＨを、１００ｍＬフラスコ中２５℃で１０分間の機械撹拌によって混合した。４．０ｍＬのエピクロロヒドリンを添加し、反応を２時間進行させた。活性化したゲルを１０ゲル堆積量（ＧＶ）の水で洗浄した。
【0086】
カップリング
５０ｍｌ Ｆａｌｃｏｎチューブ中２０ｍＬのリガンド溶液（５０ｍｇ／ｍＬ）に、１６９ｍｇのＮａＨＣＯ3、２１ｍｇのＮａ2ＣＯ3、１７５ｍｇのＮａＣｌ及び７ｍｇのＥＤＴＡを添加した。Ｆａｌｃｏｎチューブをローラーテーブルの上に５～１０分間載せた後、７７ｍｇのＤＴＥを添加した。還元は４５分超進行した。次に、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５を充填したＰＤ１０カラムでリガンド溶液を脱塩した。脱塩した溶液中のリガンド含有量を、２７６ｎｍのＵＶ吸収を測定することによって求めた。
５０ｍｌ Ｆａｌｃｏｎチューブ中２０ｍＬのリガンド溶液（５０ｍｇ／ｍＬ）に、１６９ｍｇのＮａＨＣＯ3、２１ｍｇのＮａ2ＣＯ3、１７５ｍｇのＮａＣｌ及び７ｍｇのＥＤＴＡを添加した。Ｆａｌｃｏｎチューブをローラーテーブルの上に５～１０分間載せた後、７７ｍｇのＤＴＥを添加した。還元は４５分超進行した。次に、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５を充填したＰＤ１０カラムでリガンド溶液を脱塩した。脱塩した溶液中のリガンド含有量を、２７６ｎｍのＵＶ吸収を測定することによって求めた。
【0087】
活性化したゲルを３～５ＧＶ｛０．１Ｍリン酸塩／１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．６｝で洗浄し、次に米国特許第６３９９７５０号に記載の方法に従ってリガンドを結合させた。この実験で使用した全ての緩衝液を、窒素ガスによって少なくとも５～１０分間脱気した。ゲルのリガンド含有量は、リガンド溶液の量及び濃度を変化させることによって制御することができた。
【0088】
固定化の後、ゲルを３ｘＧＶの蒸留水で洗浄した。ゲル＋１ＧＶ｛０．１Ｍ リン酸塩／１ｍＭ ＥＤＴＡ／１０％チオグリセロールｐＨ８．６｝を混合し、チューブを室温で一晩振動台に置いた。次に、ゲルを３ｘＧＶ｛０．１Ｍ ＴＲＩＳ／０．１５Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ８．６｝及び０．５Ｍ ＨＡｃで、その後８～１０ｘＧＶの蒸留水で交互に洗浄した。ゲル試料をアミノ酸分析のために外部の試験所に送り、リガンド含有量（ｍｇ／ｍ
ｌゲル）を全アミノ酸含有量から計算した。
ｌゲル）を全アミノ酸含有量から計算した。
【0089】
タンパク質
Ｇａｍｍａｎｏｒｍ１６５ｍｇ／ｍｌ（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）、平衡化緩衝液中２ｍｇ／ｍｌに希釈。
Ｇａｍｍａｎｏｒｍ１６５ｍｇ／ｍｌ（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）、平衡化緩衝液中２ｍｇ／ｍｌに希釈。
【0090】
平衡化緩衝液
ＰＢＳリン酸緩衝液１０ｍＭ＋０．１４Ｍ ＮａＣｌ＋０．００２７Ｍ ＫＣｌ、ｐＨ７．４（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）
吸着緩衝液
ＰＢＳリン酸緩衝液１０ｍＭ＋０．１４Ｍ ＮａＣｌ＋０．００２７Ｍ ＫＣｌ、ｐＨ７．４（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）
溶出緩衝液
１００ｍＭ酢酸塩ｐＨ２．９
動的結合能
２ｍｌの樹脂を、ＴＲＩＣＯＲＮ（商標）５ １００カラムに充填した。貫流容量を、ＡＫＴＡＥｘｐｌｏｒｅｒ１０システムで滞留時間６分（流量０．３３ｍｌ／分）で求めた。安定したベースラインが得られるまで平衡化緩衝液をバイパスカラムに流した。これは、オートゼロイングの前に行った。１００％ＵＶシグナルが得られるまで試料をカラムに加えた。その後、平衡緩衝液を再び安定したベースラインが得られるまで加えた。
ＰＢＳリン酸緩衝液１０ｍＭ＋０．１４Ｍ ＮａＣｌ＋０．００２７Ｍ ＫＣｌ、ｐＨ７．４（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）
吸着緩衝液
ＰＢＳリン酸緩衝液１０ｍＭ＋０．１４Ｍ ＮａＣｌ＋０．００２７Ｍ ＫＣｌ、ｐＨ７．４（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）
溶出緩衝液
１００ｍＭ酢酸塩ｐＨ２．９
動的結合能
２ｍｌの樹脂を、ＴＲＩＣＯＲＮ（商標）５ １００カラムに充填した。貫流容量を、ＡＫＴＡＥｘｐｌｏｒｅｒ１０システムで滞留時間６分（流量０．３３ｍｌ／分）で求めた。安定したベースラインが得られるまで平衡化緩衝液をバイパスカラムに流した。これは、オートゼロイングの前に行った。１００％ＵＶシグナルが得られるまで試料をカラムに加えた。その後、平衡緩衝液を再び安定したベースラインが得られるまで加えた。
【0091】
ＵＶシグナルが最大吸光度の８５％に達するまで試料をカラムに添加した。その後、流量０．５ｍｌ／分の５カラム容量（ＣＶ）の平衡緩衝液でカラムを洗浄した。タンパク質を５ＣＶの溶出緩衝液で流量０．５ｍｌ／分で溶出した。次に、カラムを流量０．２ｍｌ／分の０．５Ｍ ＮａＯＨで洗浄し、平衡化緩衝液で再び平衡化させた。
【0092】
１０％の貫流容量の計算には、下の式を使用した。それは、カラム流出液中のＩｇＧの濃度が供給液中のＩｇＧ濃度の１０％になるまでカラムに添加されるＩｇＧの量である。
【0093】
【数1】
【0094】
ＣＩＰ－０．５Ｍ ＮａＯＨ
１０％貫流のＤＢＣ（Ｑｂ１０）は、アルカリ洗浄溶液に繰り返し曝露する前と後に求めた。各々のサイクルには、０．５Ｍ ＮａＯＨを０．５／分の速度で２０分間カラムに通してポンプ送達し、その後カラムを４時間静置するＣＩＰ工程が含まれた。曝露は室温（２２±２℃）で行った。このインキュベーションの後、カラムを平衡緩衝液で流量０．５ｍｌ／分で２０分間洗浄した。表４は、６回の４時間サイクル後の残存結合能（すなわち、０．５Ｍ ＮａＯＨへの累積曝露時間は２４時間）を、絶対数で、そして初期能力と比較して表す。
１０％貫流のＤＢＣ（Ｑｂ１０）は、アルカリ洗浄溶液に繰り返し曝露する前と後に求めた。各々のサイクルには、０．５Ｍ ＮａＯＨを０．５／分の速度で２０分間カラムに通してポンプ送達し、その後カラムを４時間静置するＣＩＰ工程が含まれた。曝露は室温（２２±２℃）で行った。このインキュベーションの後、カラムを平衡緩衝液で流量０．５ｍｌ／分で２０分間洗浄した。表４は、６回の４時間サイクル後の残存結合能（すなわち、０．５Ｍ ＮａＯＨへの累積曝露時間は２４時間）を、絶対数で、そして初期能力と比較して表す。
【0095】
実施例５
実施例４を、表５に示される四量体リガンドを用いて、但しＣＩＰ工程で０．５Ｍの代わりに１．０Ｍ ＮａＯＨを使用して繰り返した。結果を表５及び図４に示す。
実施例４を、表５に示される四量体リガンドを用いて、但しＣＩＰ工程で０．５Ｍの代わりに１．０Ｍ ＮａＯＨを使用して繰り返した。結果を表５及び図４に示す。
【0096】
表５．カラム－１．０Ｍ ＮａＯＨで評価した、四量体リガンドを含むマトリックス。
【0097】
【表5】
［実施態様１］
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号２２、配列番号５１又は配列番号５２で定義されるか或いは９０％以上、例えば９５％以上又は９８％以上の同一性を有するブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）のＦｃ結合ドメインの変異体を含むＦｃ結合ポリペプチドであって、配列番号４～７の１１位に対応する位置の少なくともアスパラギン又はセリン残基が、グルタミン酸、リジン、チロシン、トレオニン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン、バリン、アラニン、ヒスチジン及びアルギニンからなる群から選択されるアミノ酸に変異している、Ｆｃ結合ポリペプチド。
［実施態様２］
配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号５１又は配列番号５２で定義されるか或いは９０％以上、例えば９５％以上又は９８％以上の同一性を有するブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）の親Ｆｃ結合ドメインの変異体を含む、実施態様１に記載のポリペプチド。
［実施態様３］
配列番号４～７の１１位に対応する位置のアミノ酸残基がグルタミン酸である、実施態様１又は２に記載のポリペプチド。
［実施態様４］
配列番号４～７の１１位に対応する位置のアミノ酸残基がリジンである、実施態様１乃至３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様５］
配列番号４～７の９位に対応する位置のアミノ酸残基がアラニンである、実施態様１乃至４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様６］
配列番号４～７の５０位に対応する位置のアミノ酸残基がアルギニン又はグルタミン酸、例えばアルギニンなどである、実施態様１乃至５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様７］
配列番号４～７の３位に対応する位置のアミノ酸残基がアラニンである、及び／又は配列番号４～７の６位に対応する位置のアミノ酸残基がアスパラギン酸である、実施態様１乃至６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様８］
配列番号４～７の３位及び６位に対応する位置のアミノ酸残基の少なくとも１つ、例えば両方がアスパラギンである、実施態様１乃至６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様９］
配列番号４～７の４３位に対応する位置のアミノ酸残基がアラニン又はグルタミン酸、例えばアラニンなどである、実施態様１乃至８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様１０］
配列番号４～７の２８位に対応する位置のアミノ酸残基がアラニン又はアスパラギンである、実施態様１乃至９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様１１］ 配列番号４～７の４０位に対応する位置のアミノ酸残基が、アスパラギン、アラニン、グルタミン酸及びバリンからなる群から選択される、実施態様１乃至１０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様１２］
配列番号４～７の４２位に対応する位置のアミノ酸残基が、アラニン、リジン又はアルギニン、例えばアルギニンなどである、実施態様１乃至１１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様１３］
配列番号４～７の４４位に対応する位置のアミノ酸残基が、ロイシン又はイソロイシン、例えばイソロイシンなどである、実施態様１乃至１２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様１４］
配列番号４～７の１８位に対応する位置のアミノ酸残基が、リジン又はヒスチジン、例えばリジンなどである、実施態様１乃至１３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様１５］
配列番号４～７の３３位に対応する位置のアミノ酸残基が、リジン又はセリン、例えばリジンなどである、実施態様１乃至１４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様１６］
配列番号４～７の３７位に対応する位置のアミノ酸残基が、グルタミン酸又はアスパラギン酸、例えばグルタミン酸などである、実施態様１乃至１５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様１７］
配列番号４～７の５１位に対応する位置のアミノ酸残基が、チロシン又はロイシン、例えばチロシンなどである、実施態様１乃至１６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様１８］
配列番号４～７の１、２、３及び４位、又は３、４、５及び６位に対応する位置のアミ
ノ酸残基が欠失している、実施態様１乃至１７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様１９］
配列番号７で定義されるＺｖａｒの変異体であるポリペプチドであって、９位のアミノ酸残基がアラニンであり、１１位のアミノ酸残基がリジン又はグルタミン酸、例えばリジンなどである、実施態様１乃至１８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様２０］
４３位のアミノ酸残基がアラニン又はグルタミン酸である、実施態様１９に記載のポリペプチド。
［実施態様２１］
４０位のアミノ酸残基がバリンである、実施態様１９又は２０に記載のポリペプチド。
［実施態様２２］
４４位のアミノ酸残基がイソロイシンである、実施態様１９乃至２１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様２３］
変異が、Ｎ１１Ｋ；Ｎ１１Ｅ；Ｎ１１Ｙ；Ｎ１１Ｔ；Ｎ１１Ｆ；Ｎ１１Ｌ；Ｎ１１Ｗ；Ｎ１１Ｉ；Ｎ１１Ｍ；Ｎ１１Ｖ；Ｎ１１Ａ；Ｎ１１Ｈ；Ｎ１１Ｒ；Ｎ１１Ｅ、Ｑ３２Ａ；Ｎ１１Ｅ、Ｑ３２Ｅ、Ｑ４０Ｅ；Ｎ１１Ｅ、Ｑ３２Ｅ、Ｋ５０Ｒ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ４３Ａ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ２８Ａ、Ｎ４３Ａ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ｅ、Ｌ４４Ｉ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｓ３３Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５０Ｒ、Ｌ５１Ｙ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ２８Ａ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｓ３３Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５０Ｒ、Ｌ５１Ｙ；Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５０Ｒ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｄ３７Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ及びＱ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｄ３７Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉからなる群から選択される、実施態様１乃至２２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様２４］
変異が、Ｎ１１Ｋ；Ｎ１１Ｙ；Ｎ１１Ｆ；Ｎ１１Ｌ；Ｎ１１Ｗ；Ｎ１１Ｉ；Ｎ１１Ｍ；Ｎ１１Ｖ；Ｎ１１Ａ；Ｎ１１Ｈ；Ｎ１１Ｒ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ４３Ａ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ２８Ａ、Ｎ４３Ａ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ｅ、Ｌ４４Ｉ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｅ、Ｎ２８Ａ、Ｑ４０Ｖ、Ａ４２Ｋ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｓ３３Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５０Ｒ、Ｌ５１Ｙ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｓ３３Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５０Ｒ、Ｌ５１Ｙ；Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ；Ｑ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ及びＱ９Ａ、Ｎ１１Ｋ、Ｈ１８Ｋ、Ｄ３７Ｅ、Ａ４２Ｒ、Ｎ４３Ａ、Ｌ４４Ｉ、Ｋ５０Ｒからなる群から選択される、実施態様１乃至２２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様２５］
配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９及び配列番号５０からなる群から選択される配列を含むか又はそれから本質的になる、実施態様１乃至２４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様２６］
配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１６、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８及び配列番号２９からなる群から選択される配列を含むか又はそれから本質的になる、実施態様１乃至２５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様２７］
配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１６、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３８、配列番号４０；配列番号４１；配列番号４２；配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７及び配列番号４８からなる群から選択される配列を含むか又はそれから本質的になる、実施態様１乃至２６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様２８］
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６又は配列番号７によって、例えば配列番号７などで定義されるポリペプチドと比較して改善されたアルカリ安定性を有する、実施態様１乃至２７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様２９］
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６又は配列番号７によって、例えば配列番号７などで定義される親ポリペプチドと比較して改善されたアルカリ安定性を有する、実施態様１乃至２８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［実施態様３０］
アルカリ安定性が、２２±２℃の０．５Ｍ又は１．０Ｍ ＮａＯＨ水溶液中、２４又は２５時間のインキュベーションの後に残存ＩｇＧ結合能によって測定して改善されている、実施態様２８又は２９に記載のポリペプチド。
［実施態様３１］
配列番号５３で定義されるか或いは９０％以上又は９５％以上又は９８％以上の同一性を有する配列を含むＦｃ結合ポリペプチド。
【0098】
ＫＥＸ1Ｑ Ｘ2ＡＦＹＥＩＬＸ3ＬＰ ＮＬＴＥＥＱＲＸ4Ｘ5Ｆ ＩＸ6Ｘ7ＬＫＤＸ8ＰＳＸ9 ＳＸ10Ｘ11Ｘ12ＬＡＥＡＫＸ13 Ｘ14ＮＤＡＱＡＰＫ（配列番号５３）
式中、互いに独立に、
Ｘ1＝Ａ又はＱ
Ｘ2＝Ｅ、Ｋ、Ｙ、Ｔ、Ｆ、Ｌ、Ｗ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ａ、Ｈ又はＲ
Ｘ3＝Ｈ又はＫ
Ｘ4＝Ａ又はＮ
Ｘ5＝Ａ又はＧ
Ｘ6＝Ｑ又はＥ
Ｘ7＝Ｓ又はＫ
Ｘ8＝Ｅ又はＤ
Ｘ9＝Ｑ又はＶ
Ｘ10＝Ｋ、Ｒ又はＡ
Ｘ11＝Ａ、Ｅ又はＮ
Ｘ12＝Ｉ又はＬ
Ｘ13＝Ｋ又はＲ
Ｘ14＝Ｌ又はＹ。
［実施態様３２］
実施態様１乃至３１のいずれか１項に記載の複数のポリペプチドを含むか又はそれから本質的になる多量体。
［実施態様３３］
ポリペプチドが、１５残基以下のアミノ酸を含むリンカーで連結されている、実施態様３２に記載の多量体。
［実施態様３４］
二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体又は九量体である、実施態様３２又は３３に記載の多量体。
［実施態様３５］
配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４及び配列番号３５で定義される配列の群から選択される配列を含むか又はそれから本質的になる、実施態様３２乃至３４のいずれか１項に記載の多量体。
［実施態様３６］
１以上のシステイン残基、複数のリジン残基及び複数のヒスチジン残基からなる群から選択される、Ｃ末端又はＮ末端の１以上の連結要素の１～５個のアミノ酸残基か又はその範囲内をさらに含む、実施態様１乃至３５のいずれか１項に記載のポリペプチド又は多量体。
［実施態様３７］
実施態様１乃至３６のいずれか１項に記載のポリペプチド又は多量体をコードする核酸又はベクター。
［実施態様３８］
実施態様３７に記載の核酸又はベクターを含む、発現系。
［実施態様３９］
実施態様１乃至３６のいずれか１項に記載の複数のポリペプチド又は多量体が固相支持体に結合されている、分離マトリックス。
［実施態様４０］
ポリペプチド又は多量体が、チオエーテル結合によって固相支持体に結合されている、実施態様３９に記載の分離マトリックス。
［実施態様４１］
固相支持体が多糖である、実施態様３９又は４０に記載の分離マトリックス。
［実施態様４２］
２２±２℃の０．５Ｍ ＮａＯＨ中での２４時間のインキュベーションの後のマトリックスのＩｇＧ結合能が、インキュベーションの前のＩｇＧ結合能の８０％以上、例えば８５％以上、９０％以上又は９５％以上である、実施態様３８乃至４０のいずれか１項に記載の分離マトリックス。
［実施態様４３］
２２±２℃の１．０Ｍ ＮａＯＨ中での２４インキュベーションの後のマトリックスのＩｇＧ結合能が、インキュベーションの前のＩｇＧ結合能の７０％以上、例えば８０％以上又は９０％以上である、実施態様３９乃至４２のいずれか１項に記載の分離マトリックス。
［実施態様４４］
免疫グロブリンを単離する方法であって、実施態様３９乃至４３のいずれか１項に記載の分離マトリックスを使用する方法。
［実施態様４５］
ａ）免疫グロブリンを含む液体試料と、実施態様３９乃至４３のいずれか１項に記載の分離マトリックスとを接触させる工程と、
ｂ）分離マトリックスを洗浄液で洗浄する工程と、
ｃ）溶出液を用いて分離マトリックスから免疫グロブリンを溶出する工程と、
ｄ）分離マトリックスを清浄液で清浄する工程と
を含む、実施態様４４に記載の方法。
［実施態様４６］
清浄液がアルカリ性、例えばｐＨが１３～１４である、実施態様４５に記載の方法。
［実施態様４７］
清浄液が０．１～１．０Ｍ ＮａＯＨ又はＫＯＨ、例えば０．５～１．０Ｍ ＮａＯＨ又はＫＯＨを含む、実施態様４５又は４６に記載の方法。
［実施態様４８］
工程ａ）～ｄ）を１０回以上、例えば５０回以上又は５０～２００回繰り返す、実施態様４４乃至４６のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様４９］
工程ａ）～ｃ）を１０回以上、例えば５０回以上又は５０～２００回繰り返し、工程ｃ）を複数回、例えば１０回以上又は５０回以上行った後に工程ｄ）を実施する、実施態様４４乃至４８のいずれか１項に記載の方法。
式中、互いに独立に、
Ｘ1＝Ａ又はＱ
Ｘ2＝Ｅ、Ｋ、Ｙ、Ｔ、Ｆ、Ｌ、Ｗ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ａ、Ｈ又はＲ
Ｘ3＝Ｈ又はＫ
Ｘ4＝Ａ又はＮ
Ｘ5＝Ａ又はＧ
Ｘ6＝Ｑ又はＥ
Ｘ7＝Ｓ又はＫ
Ｘ8＝Ｅ又はＤ
Ｘ9＝Ｑ又はＶ
Ｘ10＝Ｋ、Ｒ又はＡ
Ｘ11＝Ａ、Ｅ又はＮ
Ｘ12＝Ｉ又はＬ
Ｘ13＝Ｋ又はＲ
Ｘ14＝Ｌ又はＹ。
［実施態様３２］
実施態様１乃至３１のいずれか１項に記載の複数のポリペプチドを含むか又はそれから本質的になる多量体。
［実施態様３３］
ポリペプチドが、１５残基以下のアミノ酸を含むリンカーで連結されている、実施態様３２に記載の多量体。
［実施態様３４］
二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体又は九量体である、実施態様３２又は３３に記載の多量体。
［実施態様３５］
配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４及び配列番号３５で定義される配列の群から選択される配列を含むか又はそれから本質的になる、実施態様３２乃至３４のいずれか１項に記載の多量体。
［実施態様３６］
１以上のシステイン残基、複数のリジン残基及び複数のヒスチジン残基からなる群から選択される、Ｃ末端又はＮ末端の１以上の連結要素の１～５個のアミノ酸残基か又はその範囲内をさらに含む、実施態様１乃至３５のいずれか１項に記載のポリペプチド又は多量体。
［実施態様３７］
実施態様１乃至３６のいずれか１項に記載のポリペプチド又は多量体をコードする核酸又はベクター。
［実施態様３８］
実施態様３７に記載の核酸又はベクターを含む、発現系。
［実施態様３９］
実施態様１乃至３６のいずれか１項に記載の複数のポリペプチド又は多量体が固相支持体に結合されている、分離マトリックス。
［実施態様４０］
ポリペプチド又は多量体が、チオエーテル結合によって固相支持体に結合されている、実施態様３９に記載の分離マトリックス。
［実施態様４１］
固相支持体が多糖である、実施態様３９又は４０に記載の分離マトリックス。
［実施態様４２］
２２±２℃の０．５Ｍ ＮａＯＨ中での２４時間のインキュベーションの後のマトリックスのＩｇＧ結合能が、インキュベーションの前のＩｇＧ結合能の８０％以上、例えば８５％以上、９０％以上又は９５％以上である、実施態様３８乃至４０のいずれか１項に記載の分離マトリックス。
［実施態様４３］
２２±２℃の１．０Ｍ ＮａＯＨ中での２４インキュベーションの後のマトリックスのＩｇＧ結合能が、インキュベーションの前のＩｇＧ結合能の７０％以上、例えば８０％以上又は９０％以上である、実施態様３９乃至４２のいずれか１項に記載の分離マトリックス。
［実施態様４４］
免疫グロブリンを単離する方法であって、実施態様３９乃至４３のいずれか１項に記載の分離マトリックスを使用する方法。
［実施態様４５］
ａ）免疫グロブリンを含む液体試料と、実施態様３９乃至４３のいずれか１項に記載の分離マトリックスとを接触させる工程と、
ｂ）分離マトリックスを洗浄液で洗浄する工程と、
ｃ）溶出液を用いて分離マトリックスから免疫グロブリンを溶出する工程と、
ｄ）分離マトリックスを清浄液で清浄する工程と
を含む、実施態様４４に記載の方法。
［実施態様４６］
清浄液がアルカリ性、例えばｐＨが１３～１４である、実施態様４５に記載の方法。
［実施態様４７］
清浄液が０．１～１．０Ｍ ＮａＯＨ又はＫＯＨ、例えば０．５～１．０Ｍ ＮａＯＨ又はＫＯＨを含む、実施態様４５又は４６に記載の方法。
［実施態様４８］
工程ａ）～ｄ）を１０回以上、例えば５０回以上又は５０～２００回繰り返す、実施態様４４乃至４６のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様４９］
工程ａ）～ｃ）を１０回以上、例えば５０回以上又は５０～２００回繰り返し、工程ｃ）を複数回、例えば１０回以上又は５０回以上行った後に工程ｄ）を実施する、実施態様４４乃至４８のいずれか１項に記載の方法。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】