特許 7016556 脳由来神経栄養因子を発現する間葉系幹細胞およびその用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-01-28

(45)【発行日】2022-02-07

(54)【発明の名称】脳由来神経栄養因子を発現する間葉系幹細胞およびその用途

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/867 20060101AFI20220131BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220131BHJP

   C12N 5/0775 20100101ALI20220131BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20220131BHJP

   A61K 38/22 20060101ALI20220131BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20220131BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20220131BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20220131BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20220131BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20220131BHJP

   A61P 25/14 20060101ALI20220131BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20220131BHJP

   A61K 35/28 20150101ALI20220131BHJP

【ＦＩ】

C12N15/867 Z ZNA

C12N5/10

C12N5/0775

C12N7/01

A61K38/22

A61P9/00

A61P9/10

A61P25/00

A61P25/16

A61P25/28

A61P25/14

A61K35/76

A61K35/28

【請求項の数】 7

(21)【出願番号】P 2020562062

(86)(22)【出願日】2019-01-24

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2021-05-13

(86)【国際出願番号】 KR2019001007

(87)【国際公開番号】W WO2019147036

(87)【国際公開日】2019-08-01

【審査請求日】2020-09-24

(31)【優先権主張番号】10-2018-0008569

(32)【優先日】2018-01-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】520278413

【氏名又は名称】エスエルバイジェン インコ―ポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＳＬＢＩＧＥＮ ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100121728

【弁理士】

【氏名又は名称】井関 勝守

(74)【代理人】

【識別番号】100165803

【弁理士】

【氏名又は名称】金子 修平

(74)【代理人】

【識別番号】100170900

【弁理士】

【氏名又は名称】大西 渉

(72)【発明者】

【氏名】ソン ヨンチョル

(72)【発明者】

【氏名】イ スンミン

(72)【発明者】

【氏名】ギム ヘヨン

【審査官】福澤 洋光

(56)【参考文献】

【文献】中国特許出願公開第１０２１７４５７８（ＣＮ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１７／１３５８００（ＷＯ，Ａ１）

【文献】中国特許出願公開第１０５２５５８３６（ＣＮ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１０４５９３４２１（ＣＮ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１１／０２８８１６０（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １／００－１５／９０

ＣＡ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

テトラサイクリン応答因子（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓ；ＴＲＥ）プロモーター遺伝子及び脳由来神経栄養因子（ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ，ＢＤＮＦ）タンパク質をコードする遺伝子を含むレンチウイルスベクターを備えたレンチウイルスでトランスフェクションされた不死化した間葉系幹細胞（ＭＳＣ）。

【請求項2】

前記ＢＤＮＦタンパク質が配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の不死化した間葉系幹細胞。

【請求項3】

前記ＢＤＮＦタンパク質をコードする遺伝子が配列番号２の塩基配列を含む、請求項１に記載の組み換えレンチウイルスベクター。

【請求項4】

前記不死化した間葉系幹細胞は、ｈＴＥＲＴおよび／またはｃ－Ｍｙｃ遺伝子が導入されたものである、請求項１に記載の不死化した間葉系幹細胞。

【請求項5】

請求項１～４のいずれか１項に記載の不死化した間葉系幹細胞を含む神経疾患の予防または治療用薬学組成物。

【請求項6】

前記神経疾患が、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，ＰＤ）、ルー・ゲーリック病（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｌａｔｅｒａｌ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ＡＬＳ）、脳梗塞、慢性脳損傷（ｃｈｒｏｎｉｃ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ）、脊髄損傷、ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，ＨＤ）、レット症候群（Ｒｅｔｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，ＲＤ）、虚血性脳疾患、脳卒中および外傷性脳損傷（Ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ）、多発性硬化症よりなる群から選ばれるものである、請求項５に記載の神経疾患の予防または治療用薬学組成物。

【請求項7】

神経疾患の予防または治療のための薬剤を製造するための、請求項１～４のいずれか１項に記載の不死化した間葉系幹細胞の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、２０１８年１月２４日に出願された韓国特許出願第１０－２０１８－０００８５６９号を優先権として主張し、前記明細書の全体は、本出願の参考文献である。

【0002】

本発明は、ＢＤＮＦ（ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ）タンパク質をコードする遺伝子を含む組み換えレンチウイルスベクター、および前記ベクターを用いて製造されたレンチウイルスによりトランスフェクションされた細胞に関する。

【背景技術】

【0003】

ＢＤＮＦ（Ｂｒａｉｎ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒ）は、人体の脳、網膜、運動神経細胞、腎臓、唾液、前立腺などで発現し、脳の海馬（ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ）、大脳皮質（ｃｅｒｅｂｒａｌ ｃｏｒｔｅｘ）、視床下部（ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｕｓ）、基底前脳（ｂａｓａｌ ｆｏｒｅｂｒａｉｎ）などで発現する。ＢＤＮＦは、長期記憶（ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｍｅｍｏｒｙ）において重要な部分を占めるが、学習が生じた動物においてＢＤＮＦ ｍＲＮＡは、脳の海馬部位で高い水準で発現する。このような海馬部位で発現が増加することは、学習水準も関連があると報告された。

【0004】

また、ＢＤＮＦは、神経細胞の生成を促進するニューロトロフィンに対して最も優れた活性を示す物質である。実際にＢＤＮＦが遺伝的に完全に除去されたマウスの場合には、出生後に深刻な死亡率を示し、小脳、嗅球（ｏｌｆａｃｔｏｒｙ ｂｕｌｂ）、視覚皮質（ｖｉｓｕａｌ ｃｏｒｔｅｘ）と渦巻管（ｃｏｃｈｌｅａｒ）などで神経細胞の損失が観察される。反面、部分的にＢＤＮＦ遺伝子が除去された場合には、ニューロトロフィンの発現が減少して海馬部位の長期強化（ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ，ＬＴＰ）と感覚および痛覚システムの変化が観察され、行動学的な問題とともに精神学的な問題まで観察される。

【0005】

一方、ＢＤＮＦは、神経退行性疾患（ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）を治療するための薬の開発において標的物質として活用されている。ＢＤＮＦが、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，ＰＤ）、ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，ＨＤ）、ルー・ゲーリック病（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ＡＬＳ）のような神経退行性疾患に関与するという実験的な証拠は、１９９０年代初期から報告されてきた。多様な研究においてＢＤＮＦの遺伝子的異常が疾病と関連があると報告されたことがある。実際にこのような神経退行性疾患を有している患者では、ＢＤＮＦの量が正常ヒトより減少している。特に、ハンチントン病と関連して、多様な細胞および動物実験を通じて、疾患が進行されれば、ＢＤＮＦの輸送に問題が生ずるという点が報告された。減少したＢＤＮＦを外部に供給する方法を通じて疾患を治療しようとする試みがなされているが、現在まで効果的にＢＤＮＦを脳に伝達することが難しいという問題がある。

【0006】

なお、全世界的に細胞を用いた治療方法が開発されており、成体幹細胞を用いた細胞治療剤について多くの研究が進行中にある。成体幹細胞である間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ＭＳＣ）は、骨、軟骨、筋肉、脂肪、線維芽細胞などに分化しうる多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）細胞である。前記ＭＳＣは、骨髄、臍帯血、脂肪など多様な成体組織から比較的容易に得ることができる。ＭＳＣは、炎症または損傷部位に移動する特異性があるので、治療薬物を伝達するための伝達体としても大きい利点がある。また、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹枝状細胞および自然殺害細胞のような免疫細胞の機能を抑制したり活性化させて、人体の免疫機能を調節することができる。それだけでなく、ＭＳＣは、試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で比較的容易に培養することができるという利点がある。このような特性によって、ＭＳＣを細胞治療剤として用いるための研究が活発に進行されている。

【0007】

しかしながら、このようなＭＳＣの利点にもかかわらず、細胞治療剤として臨床に使用できる等級のＭＳＣを生産することは、に次のような問題がある。第一に、ＭＳＣの増殖には限界があるので、これを大量で生産し難い。第二に、収得したＭＳＣは、多様な種類の細胞が混合されていて、生産時に同じ効果を維持し難い。第三に、ＭＳＣのみを用いる場合、治療効果が高くない。最後に、人体に注入されたＭＳＣが体内で癌細胞になる可能性もある。

【0008】

なお、韓国登録特許第１５８５０３２号公報には、ハイドロゲルで培養した間葉系幹細胞を含有する細胞治療剤を開示している。前記文献には、細胞治療剤として使用するための間葉系幹細胞を分離する工程で前処理過程を短縮して、すぐに投与可能な組成物を提供しているが、前記のような間葉系幹細胞の問題点およびこれを解消するための方案については、全く言及していない。したがって、細胞治療剤として使用できる安全でかつ効果的な間葉系幹細胞に対する研究が必要である。

【0009】

特に、脳由来神経栄養因子（ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ，ＢＤＮＦ）を発現するように、アデノウイルスを用いて間葉系幹細胞を形質転換させた研究が行われたことがある（Ｋａｒｉ Ｐｏｌｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．２４ ｎｏ．５：９６５－９７７，２０１６）。しかしながら、前記研究で使用された間葉系幹細胞は、組織から収得した一般的な間葉系幹細胞であって、ＭＳＣの増殖には限界があるため、大量生産しにくい問題点がある。それだけでなく、ＢＤＮＦ遺伝子の発現程度が均一でないため、生産時に同じ効果を期待し難い。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

これより、本発明者らは、大量生産が可能であり、同じ効果を維持できる幹細胞治療剤を開発するために研究した結果、本発明のトランスフェクションされたＭＳＣは１６０日以上継代培養（増殖）が可能であることを確認した。また、本発明のトランスフェクションされたＭＳＣが１６０日以上ＢＤＮＦ遺伝子を安定的に発現し、このような間葉系幹細胞が神経細胞の保護および再生などの効果を示すことを確認することによって、本発明を完成した。

【課題を解決するための手段】

【0011】

前記目的を達成するために、本発明は、ＢＤＮＦタンパク質をコードする遺伝子を含む組み換えレンチウイルスベクターを提供する。

【0012】

また、本発明は、ＢＤＮＦタンパク質をコードする遺伝子を含む組み換えレンチウイルスを提供する。

【0013】

また、本発明は、前記組み換えレンチウイルスがトランスフェクションされた宿主細胞を提供する。

【0014】

また、本発明は、前記組み換えレンチウイルスを有効成分として含む神経疾患の予防または治療用薬学組成物を提供する。

【0015】

しかも、本発明は、前記トランスフェクションされた宿主細胞を有効成分として含む神経疾患の予防または治療用薬学組成物を提供する。

【0016】

また、本発明は、前記組み換えレンチウイルスまたは前記組み換えレンチウイルスでトランスフェクションされた宿主細胞を個体に投与する段階を含む神経疾患の予防または治療方法を提供する。

【0017】

また、本発明は、前記組み換えレンチウイルスまたは前記組み換えレンチウイルスでトランスフェクションされた宿主細胞の神経疾患の予防または治療用途を提供する。

【発明の効果】

【0018】

本発明のＢＤＮＦタンパク質を発現する間葉系幹細胞およびこれを有効成分として含む神経疾患の予防または治療用薬学組成物は、大量生産が可能であり、同じ効果を維持できる幹細胞治療剤としてＢＤＮＦを発現して神経細胞の保護および再生を誘導することによって、脳組織の形成を促進させ、神経系の機能を向上させる。また、本発明の間葉系幹細胞は、不死化した間葉系幹細胞であって、高い細胞増殖率を有し、異常分化および増殖の可能性が低いため、安全性が高い。したがって、本発明の薬学組成物は、神経疾患の予防または治療用薬学的組成物として有用に活用され得る。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】図１は、不死化されたＭＳＣ（ｉｍＭＳＣ）と不死化しないＭＳＣ（ＭＳＣ）の細胞増殖率を比較したグラフである：Ｘ軸：培養期間；およびＹ軸：累積細胞集団倍加数（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｌｅｖｅｌ，ＰＤＬ）。

【図2】図２は、本発明の一実施例で製造した＃１～＃５０のクローンのＢＤＮＦタンパク質発現量を示すグラフである。

【図3】図３は、ＢＤＮＦタンパク質発現量に優れたクローンのドキシサイクリン存在の有無によるＢＤＮＦタンパク質発現量を示すグラフである。

【図4】図４は、ＢＤＮＦタンパク質生産に優れた細胞クローンである＃１４、＃２２、＃２３および＃４１クローンの染色体分析結果を示す図である。

【図5】図５は、ＢＤＮＦタンパク質を生産する菌株で選別した＃１４、＃２２、＃２３および＃４１クローンの１４０日間累積細胞集団倍加数を示すグラフである。

【図6】図６は、ＢＭ－０１Ａ細胞株の遺伝子操作以後のＭＳＣが持つ固有な特性である表面抗原タンパク質ＣＤ９０、ＣＤ４４、ＣＤ１０５、ＣＤ７３などの発現と骨髄由来ＭＳＣの表面抗原タンパク質の発現を比較して示すものである。

【図7】図７は、ＢＤＮＦ遺伝子を含むレンチウイルスでトランスフェクションされた不死化したＭＳＣの細胞増殖率を確認したグラフである：Ｘ軸：培養期間；およびＹ軸：累積細胞集団倍加数（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｌｅｖｅｌ，ＰＤＬ）。

【図8】図８は、ＢＭ－０１Ａ細胞株の１４０日間継代培養時に形態学的に細胞の特性が維持されることを確認した図である。

【図9】図９は、ドキシサイクリン処理の有無によるＢＭ－０１Ａ細胞株のＢＤＮＦタンパク質発現量を示すグラフである。

【図10】図１０は、ＢＭ－０１Ａ細胞株の継代培養時に各継代別にＢＤＮＦタンパク質発現量が一定に維持されることを示す図である。

【図11】図１１は、ＢＭ－０１Ａ細胞株に遺伝子が導入されたことを確認した図である。

【図12】図１２は、キノリン酸（ＱＡ）の注入によるハンチントン病誘発ラット内側前脳束（ｌａｔｅｒａｌ ｖｅｎｔｒｉｃｌｅ ｚｏｎｅ，ＬＶＺ）の体積変化を示す図である。

【図13】図１３は、ＢＭ－０１Ａ細胞株をハンチントン病誘発ラットの脳に注入して一週間後に、脳内にＢＭ－０１Ａ細胞株が存在するかを確認した図である。

【図14】図１４は、ロータロッド実験（Ｒｏｔａ－ｒｏｄ ｔｅｓｔ）を通じてＢＭ－０１Ａ細胞株の注入によるハンチントン病誘発ラットの行動改善効果を確認したグラフである。

【図15】図１５は、歩行実験（Ｓｔｅｐｐｉｎｇ ｔｅｓｔ）を通じてＢＭ－０１Ａ細胞株の注入によるハンチントン病誘発ラットの行動改善効果を確認したグラフである。

【図16】図１６は、階段実験（Ｓｔａｉｒｃａｓｅ ｔｅｓｔ）を通じてＢＭ－０１Ａ細胞株の注入によるハンチントン病誘発ラットの行動改善効果を確認したグラフである。

【図17】図１７は、細胞の凍結剤形バッファーまたはＢＭ－０１Ａ細胞株を注入した後、ハンチントン病誘発ラットの脳組織内Ｉｂａ－１およびＥＤ１を免疫染色した写真である。

【図18】図１８は、細胞の凍結剤形バッファーまたはＢＭ－０１Ａ細胞株を注入した後、ハンチントン病誘発ラットの脳組織内ＥＤ１および炎症マーカーであるｉＮＯＳを免疫染色した写真である。

【図19】図１９は、細胞の凍結剤形バッファーまたはＢＭ－０１Ａ細胞株を注入した後、ハンチントン病誘発ラットの脳組織内神経膠細胞を染色した写真である。

【図20】図２０は、細胞の凍結剤形バッファーまたはＢＭ－０１Ａ細胞株を注入した後、ハンチントン病誘発ラットのＬＶＺの体積を撮影した写真である。

【図21】図２１は、細胞の凍結剤形バッファーまたはＢＭ－０１Ａ細胞株を注入した後、ハンチントン病誘発ラットのＬＶＺの体積を測定したグラフである。

【図22】図２２は、細胞の凍結剤形バッファーまたはＢＭ－０１Ａ細胞株を注入した後、ハンチントン病誘発ラットの線条体内の欠失部分を測定した写真である。

【図23】図２３は、細胞の凍結剤形バッファーまたはＢＭ－０１Ａ細胞株を注入した後、ハンチントン病誘発ラットの線条体内の欠失部分の体積を測定したグラフである。

【図24】図２４は、細胞の凍結剤形バッファーまたはＢＭ－０１Ａ細胞株を注入した後、ハンチントン病誘発ラットの線条体内の密度を測定した図である。

【図25】図２５は、細胞の凍結剤形バッファーまたはＢＭ－０１Ａ細胞株を注入した後、ハンチントン病誘発ラットの脳組織内ＤＣＸを免疫染色した写真である。

【図26】図２６は、ロータロッド実験（Ｒｏｔａ－ｒｏｄ ｔｅｓｔ）を通じてＢＭ－０１Ａ細胞株の注入による脳卒中誘発ラットの行動改善効果を確認したグラフである。

【図27】図２７は、歩行実験（Ｓｔｅｐｐｉｎｇ ｔｅｓｔ）を通じてＢＭ－０１Ａ細胞株注入による脳卒中誘発ラットの行動改善効果を確認したグラフである。

【図28】図２８は、修正された神経学的重症度スコア実験（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｅｖｅｒｉｔｙ ｓｃｏｒｅｓ ｔｅｓｔ）を通じてＢＭ－０１Ａ細胞株の注入による脳卒中誘発ラットの行動改善効果を確認したグラフである。

【図29】図２９は、細胞の凍結乾燥剤形（ｖｅｈｉｃｌｅ）またはＢＭ－０１Ａ細胞株を注入した後、脳卒中誘発ラットの神経膠瘢痕部位を染色した写真である。

【図30】図３０は、細胞の凍結乾燥剤形（ｖｅｈｉｃｌｅ）またはＢＭ－０１Ａ細胞株を注入した後、脳卒中誘発ラットの皮質と線条体部位での瘢痕面積の減少を測定したグラフである。

【図31】図３１は、細胞の凍結乾燥剤形（ｖｅｈｉｃｌｅ）またはＢＭ－０１Ａ細胞株を注入した後、脳卒中誘発ラットの皮質と線条体部位での瘢痕厚さの減少を測定したグラフである。

【図32】図３２は、ＢＭ－０１Ａ細胞株の遺伝子操作後にも腫瘍原性がないことを確認したグラフである。

【図33】図３３は、ＢＭ－０１Ａ細胞株を注入した１０週目のハンチントン病誘発ラットの脳組織内ＢＭ－０１Ａ細胞株の生存有無を確認した図である。

【発明を実施するための形態】

【0020】

以下、本発明を詳細に説明する。

【0021】

本発明は、ＢＤＮＦタンパク質をコードする遺伝子を含む組み換えレンチウイルスベクターを提供する。

【0022】

本明細書において使用される用語「脳由来神経栄養因子（ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ，ＢＤＮＦ）」タンパク質は、脳に最も豊富に分布しているニューロトロフィン（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ）である。これは、 ニューロン（ｎｅｕｒｏｎ）の成長を促進し、神経伝達物質の合成、代謝、遊離およびニューロンの活性を調節すると知られている。また、ＢＤＮＦタンパク質は、うつ病患者の前頭葉皮質または海馬で減少し、その濃度を増加させて、うつ病を治療できることが知られている。

【0023】

本発明によるＢＤＮＦタンパク質は、ヒト由来のタンパク質でありうる。前記タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドでありうる。前記ＢＤＮＦタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列と約８０％、９０％、９５％または９９％以上の相同性を有することができる。一方、前記ＢＤＮＦタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号２の塩基配列でありうる。また、前記ＢＤＮＦタンパク質をコードする塩基配列は、配列番号２の塩基配列と約８０％、９０％、９５％または９９％以上の相同性を有することができる。

【0024】

本明細書において使用される用語「レンチウイルスベクター」は、レトロウイルスの一種である。前記ベクターは、レンチウイルストランスファーベクターと混用して称されることがある。前記レンチウイルスベクターは、感染対象である細胞のゲノムＤＮＡに挿入されて安定的に遺伝子を発現させる。また、前記ベクターは、分裂細胞および非分裂細胞に遺伝子を伝達することができる。前記ベクターは、人体の免疫反応を誘導しないので、発現が持続的である。また、従来使用されるウイルスベクターであるアデノウイルスベクターに比べて大きいサイズの遺伝子も伝達可能であるという利点がある。

【0025】

本発明の組み換えレンチウイルスベクターは、プロモーターにより、これに積載された遺伝子の発現を調節することができる。前記プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ヒト伸長因子－１アルファ（ｈｕｍａｎ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ－１ ａｌｐｈａ，ＥＦ－１α）またはテトラサイクリン応答因子（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓ；ＴＲＥ）プロモーターでありうる。一実施例によれば、組み換えレンチウイルスベクターは、一つのプロモーターによりＢＤＮＦタンパク質の発現を調節することができる。前記プロモーターは、発現させようとするタンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結される。

【0026】

一実施例によれば、前記ＢＤＮＦタンパク質は、ＴＲＥプロモーターに連結され得る。前記ＴＲＥプロモーターは、ｔＴＡ（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ）タンパク質によりプロモーターと連結された遺伝子の転写を活性化させることができる。具体的に、ｔＴＡタンパク質は、テトラサイクリン（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）またはドキシサイクリン（ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ）が存在しないとき、ＴＲＥプロモーターに結合して転写を活性化させる。反面、これらが存在する場合には、ｔＴＡタンパク質がＴＲＥプロモーターに結合しないので、転写を活性化させない。したがって、テトラサイクリンまたはドキシサイクリンの存在有無によってＢＤＮＦタンパク質の発現を調節することができる。

【0027】

前記用語「作動可能に連結された」は、特定のポリヌクレオチドがその機能を発揮することができるように、他のポリヌクレオチドに連結されたことを意味する。すなわち、特定タンパク質をコードする遺伝子がプロモーターに作動可能に連結されたというのは、当該プロモーターにより遺伝子がｍＲＮＡに転写されてタンパク質に翻訳され得ることを意味する。

【0028】

本発明は、ＢＤＮＦタンパク質をコードする遺伝子を含む組み換えレンチウイルスを提供する。

【0029】

前記組み換えレンチウイルスは、本発明のレンチウイルスベクター、パッケージング（ｐａｃｋａｇｉｎｇ）プラスミドおよびエンベロープ（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）プラスミドで宿主細胞を形質転換させる段階；および形質転換された宿主細胞からレンチウイルスを分離する段階を通じて収得することができる。

【0030】

前記用語「パッケージングプラスミド（ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｐｌａｓｍｉｄ）」および「エンベローププラスミド（ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｐｌａｓｍｉｄ）」は、タンパク質をコードする遺伝子が積載されたプラスミドである。これらのプラスミドは、レンチウイルスベクターの他に、レンチウイルスを生産するために必要なヘルパー構造物（例えば、プラスミドまたは単離された核酸）を提供することができる。このような構造物は、宿主細胞でレンチウイルスベクターを製造し、これをパッケージングするのに有用な要素を含有する。前記要素としては、ＧＡＧ前駆体のような構造タンパク質；ｐｏｌ前駆体のようなプロセッシングタンパク質；プロテアーゼ、外皮タンパク質、および宿主細胞でタンパク質を製造し、レンチウイルス粒子を生産するのに必要な発現および調節信号などを含むことができる。

【0031】

組み換えレンチウイルスの生産には、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社のＬｅｎｔｉ－Ｘ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍや、Ａｄｄｇｅｎｅ社で提供するパッケージングプラスミド（例えば、ｐＲＳＶ－Ｒｅｖ、ｐｓＰＡＸ、ｐＣｌ－ＶＳＶＧ、ｐＮＨＰなど）またはエンベローププラスミド（例えば、ｐＭＤ２．Ｇ、ｐＬＴＲ－Ｇ、ｐＨＥＦ－ＶＳＶＧなど）を使用することができる。

【0032】

また、本発明は、前記組み換えレンチウイルスがトランスフェクションされた宿主細胞を提供する。

【0033】

前記用語「形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）」は、ウイルス感染を通じて組み換えレンチウイルスベクターにロードされた遺伝子を伝達することを意味する。

【0034】

本発明による宿主細胞は、ヒト胚性幹細胞（ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ，ｈＥＳ）、骨髄幹細胞（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ，ＢＭＳＣ）、間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ，ＭＳＣ）、ヒト神経幹細胞（ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ，ｈＮＳＣ）、輪部幹細胞（ｌｉｍｂａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）または経口粘膜上皮細胞（ｏｒａｌ ｍｕｃｏｓａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）でありうる。本発明の一実施例によれば、前記宿主細胞は、間葉系幹細胞でありうる。

【0035】

前記用語「間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ，ＭＳＣ）」は、骨細胞、軟骨細胞および脂肪細胞を含む多様な細胞に分化し得る多分化能の間質細胞をいう。間葉系幹細胞は、骨、軟骨、脂肪、筋、神経組織、線維芽細胞および筋肉細胞など具体的な臓器の細胞に分化し得る。これらの細胞は、脂肪組織、骨髄、末梢神経、血液、臍帯血、骨膜、真皮、中胚葉由来の組織などから分離または精製され得る。

【0036】

本発明によるトランスフェクションされた宿主細胞は、不死化したものでありうる。具体的に、前記宿主細胞は、ｈＴＥＲＴおよび／またはｃ－Ｍｙｃ遺伝子が導入されたものでありうる。

【0037】

また、本発明によるトランスフェクションされた宿主細胞は、チミジンキナーゼ（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ，ＴＫ）遺伝子をさらに含むことができる。

【0038】

本発明において使用する用語「チミジンキナーゼ」とは、ＡＴＰのγ位置のリン酸をチミジンに結合させて、チミジンは、三リン酸の形態に変形され、チミジル酸を生成する反応を触媒する酵素を意味する。変形されたチミジンは、ＤＮＡ複製に使用されることができず、したがって、これを含む細胞の死滅を誘導するものと知られている。前記ＴＫタンパク質は、公知の配列であれば、いずれも使用が可能である。一実施例によれば、前記ＴＫタンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドでありうる。一方、前記ＴＫタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号４の塩基配列を有するポリヌクレオチドでありうる。

【0039】

本発明において使用する用語「ｈＴＥＲＴ」とは、テロメラーゼ逆転写酵素を意味する。前記テロメラーゼ逆転写酵素は、テロメラーゼのＲＮＡ鋳型を相補的ＤＮＡを合成して、ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッド形態を成した後、二重鎖のＤＮＡになって、宿主細胞の染色体に挿入される。これにより、前記宿主細胞は、テロメアの代わりに、テロメラーゼが染色体の末端小粒に付着してテロメアを続いて生成することになって、不滅化した細胞を形成することができる。

【0040】

本発明において使用する用語「ｃ－Ｍｙｃ」とは、ヒトの８番染色体に位置する転写因子をコードする遺伝子を意味する。細胞内遺伝子約１５％の発現を調節するｃ－Ｍｙｃにコードされたタンパク質は、転写調節因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）であって、前記転写調節因子が過発現する場合、細胞活性および増殖が促進される。

【0041】

前記宿主細胞は、次のような方法で製造され得る：
１）宿主細胞にｈＴＥＲＴおよび／またはｃ－Ｍｙｃ遺伝子を含むレンチウイルスを１次感染させる段階；
２）１次感染した宿主細胞にｔＴＡ遺伝子を含むレンチウイルスを２次感染させる段階；
３）２次感染した宿主細胞にＢＤＮＦ遺伝子を含むレンチウイルスを３次感染させる段階。

【0042】

前記段階１）でｈＴＥＲＴおよび／またはｃ－Ｍｙｃは、宿主細胞を不死化させる遺伝子であって、前記ｈＴＥＲＴおよび／またはｃ－Ｍｙｃのほかに不死化遺伝子と知られた他の遺伝子も使用可能である。一実施例によれば、前記ｈＴＥＲＴおよびｃ－Ｍｙｃタンパク質は、それぞれ、配列番号７および配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチドでありうる。一方、前記ｈＴＥＲＴおよびｃ－Ｍｙｃタンパク質をコードする遺伝子は、それぞれ、配列番号８および配列番号６の塩基配列を有するポリヌクレオチドでありうる。

【0043】

前記段階２）でｔＴＡは、標的タンパク質の発現を調節できる遺伝子であって、テトラサイクリントランスアクチベーターを意味する。本発明において使用されたＴｅｔ－ｏｆｆシステムは、前述したような方法でテトラサイクリンまたはドキシサイクリンの存在有無によって標的タンパク質の発現を調節することができる。

【0044】

本発明のＢＤＮＦを発現する間葉系幹細胞は、ＴＲＥプロモーターによりｅｘ ｖｉｖｏでドキシサイクリン処理前に比べて１００倍以上、１１０倍以上、１２０倍以上、１５０倍以上でＢＤＮＦタンパク質を発現することを特徴とする。

【0045】

本発明は、前述したような組み換えレンチウイルスまたはトランスフェクションされた宿主細胞を有効成分として含む神経疾患の予防または治療用薬学組成物を提供する。

【0046】

また、本発明は、前記組み換えレンチウイルスまたは前記組み換えレンチウイルスでトランスフェクションされた宿主細胞を個体に投与する段階を含む神経疾患の予防または治療方法を提供する。

【0047】

また、本発明は、前記組み換えレンチウイルスまたは前記組み換えレンチウイルスでトランスフェクションされた宿主細胞の神経疾患の予防または治療用途を提供する。

【0048】

本発明の組み換えレンチウイルスまたは宿主細胞は、ＢＤＮＦの発現を通じて神経保護効果を示すことができるので、多様な中枢神経障害の治療に使用され得る。

【0049】

前記神経疾患は、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，ＰＤ）、ルー・ゲーリック病（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｌａｔｅｒａｌ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ＡＬＳ）、脳梗塞、慢性脳損傷（ｃｈｒｏｎｉｃ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ）、虚血性脳疾患、脊髄損傷、ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，ＨＤ）、レット症候群（Ｒｅｔｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，ＲＤ）、脳卒中、多発性硬化症、外傷性脳損傷（Ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ）、および勃起不全よりなる群から選ばれる。

【0050】

前記薬学組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含むことができる。前記担体は、薬品の製造時に通常用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシ安息香酸、プロピルヒドロキシ安息香酸、滑石、ステアリン酸マグネシウム、ミネラルオイルなどを含むことができる。

【0051】

また、本発明の薬学組成物は、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤およびこれらの組合せよりなる群から選ばれる薬学的に許容可能な添加剤をさらに含むことができる。

【0052】

前記担体は、本発明の薬学組成物の総重量を基準として約１重量％～約９９．９９重量％、好ましくは約９０重量％～約９９．９９重量％で含まれ得、前記薬学的に許容可能な添加剤は、約０．１重量％～約２０重量％で含まれ得る。

【0053】

前記薬学組成物は、通常の方法によって、薬学的に許容される担体および賦形剤を用いて製剤化することによって、単位用量の形態で製造されたり、または多用量容器内に内入させて製造され得る。この際、剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液、シロップ剤または乳化液の形態であるか、または、エキス剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤の形態であり得、分散剤または安定化剤をさらに含むことができる。

【0054】

また、本発明は、本発明の薬学組成物を個体に投与する段階を含む、前述したような神経疾患を予防または治療する方法を提供する。

【0055】

前記個体は、哺乳動物、具体的にヒトでありうる。前記薬学組成物の投与経路および投与量は、患者の状態および副作用の有無によって多様な方法および量で対象に投与され得、最適な投与方法および投与量は、通常の技術者が適切な範囲で選択することができる。また、前記薬学組成物は、治療しようとする疾患に対して治療効果が公知の他の薬物または生理学的活性物質と併用して投与されたり、他の薬物との組合せ製剤の形態で剤形化され得る。

【0056】

前記薬学組成物を非経口的に投与する場合、その例としては、皮下、目、腹腔内、筋肉内、口腔、直腸、眼窩内、脳内、頭蓋内（ｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌ）、脊椎内、脳室内、髄腔内、鼻内、静脈内投与がある。

【0057】

前記投与は、１回以上、１～４回投与され得、具体的に２回に分けて投与され得る。これを反復投与する場合には、１２～４８時間、２４～３６時間間隔、１週、２週～４週間隔で投与することができ、具体的には、２４時間または１週以上の間隔で投与することができる。前記投与は、レンチウイルスの場合、成人基準１日１．０×１０^６～１．０×１０^１２ＴＵ、具体的に１．０×１０^８～１．０×１０^１０ＴＵの量で投与され得る。一方、細胞の場合、成人基準１日１．０×１０^５～１．０×１０^１１ｃｅｌｌｓ、具体的に１．０×１０^７～１．０×１０^９ｃｅｌｌｓの量で投与され得る。投与量が多い場合には、一日に数回にかけて投与され得る。

【0058】

以下、本発明を下記実施例により詳細に説明する。ただし、下記の実施例は、本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明がこれらにより制限されるものではない。

【0059】

実施例１．不死化した間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の製造
実施例１．１．不死化遺伝子を含むレンチウイルスベクターの製造
ＭＳＣを不死化させるために、不死化遺伝子であるｃ－Ｍｙｃおよび／またはｈＴＥＲＴをそれぞれ含むレンチウイルスベクターを製造した。この際、Ｔｅｔ－ｏｆｆシステムを使用するために、ｔＴＡタンパク質を発現する遺伝子コンストラクトを共に挿入した。

【0060】

まず、ｐＷＰＴベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ、米国）の発現カセット内にＥＦプロモーターをＣＭＶプロモーターで置換し、その下位にＲＳＶプロモーターを追加連結して、ｐＢＤレンチウイルスベクターを製作した。

【0061】

前記ｐＢＤレンチウイルスベクターに、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子（配列番号６）およびチミジンリン酸化酵素（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ，ＴＫ）遺伝子（配列番号４）をＩＲＥＳで連結して、ＣＭＶプロモーターにより発現が調節され得るように挿入した。前記製作されたベクターは、ｐＢＤ－１と命名した。

【0062】

一方、ｐＢＤレンチウイルスベクターに、ｈＴＥＲＴ遺伝子（配列番号８）をＣＭＶプロモーターにより発現が調節され得るように挿入した。これに、ゼオシン（ｚｅｏｃｉｎ）に対する抵抗性を有する遺伝子（ＺｅｏＲ；配列番号１４）は、ＲＳＶプロモーターにより発現が調節され得るように挿入した。前記製作されたベクターは、ｐＢＤ－２と命名した。

【0063】

また、ｐＢＤレンチウイルスベクターに、ｔＴＡ（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｔｒａｎｓ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）遺伝子（配列番号１０）をＣＭＶプロモーターにより発現が調節され得るように挿入した。これにピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）に対する抵抗性を有する遺伝子（ＰｕｒｏＲ；配列番号１２）は、ＲＳＶプロモーターにより発現が調節され得るように挿入した。前記製作されたベクターは、ｐＢＤ－３と命名した。

【0064】

実施例１．２．不死化遺伝子を含むレンチウイルスの生産
前記実施例１．１．で製作されたレンチウイルスベクターを用いて、次のような方法で不死化遺伝子を含むレンチウイルスを生産した。

【0065】

まず、レンチ－Ｘ細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）は、１０％ウシ胎児血清が含まれたＤＭＥＭ培地を使用して１５０ｍｍディッシュ（ｄｉｓｈ）に培養した。一方、レンチウイルスベクターは、ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｎ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、米国）を使用してＤＨ５α大腸菌細胞から抽出および定量した。

【0066】

前記培養されたレンチ－Ｘ細胞をＰＢＳで洗浄した後、３ｍｌのＴｒｙｐＬＥ^ＴＭ Ｓｅｌｅｃｔ ＣＴＳ^ＴＭ（Ｇｉｂｃｏ、米国）を添加した。細胞を３７℃で約５分間放置した後、細胞が脱離されたことを確認した。脱離された細胞を７ｍｌの１０％ウシ胎児血清が含まれたＤＭＥＭ培地を添加して中和させた。中和した細胞は、５０ｍｌチューブに集めて１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上澄み液を除去し、１０ｍｌの１０％ウシ胎児血清が含まれたＤＭＥＭ培養培地を添加して細胞を再懸濁した。

【0067】

懸濁された細胞は、ヘモサイトメーターでその数を測定した後、１５０ｍｍディッシュに１．２×１０^７個の細胞になるように分注した。前記分注された細胞の細胞飽和度が約９０％程度に培養されたとき、１２μｇのレンチウイルスベクター、１２μｇのｐｓＰＡＸ（Ａｄｄｇｅｎｅ；ｇａｇ－ｐｏｌ発現、パッケージングプラスミド）および２．４μｇのｐＭＤ．Ｇプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ；ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＶＳＶ－Ｇ発現、エンベローププラスミド）混合物を前記細胞に形質導入した。形質導入を助けるために、リポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）とプラス試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）を使用した。形質導入６時間後、１０％ウシ胎児血清が含まれたＤＭＥＭに培地を交換した。これを４８時間追加培養した後、上澄み液を集めた。

【0068】

前記収得された上澄み液をレンチウイルス濃縮キット（Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）と混合した後、４℃で一晩中培養した。これを４℃、４，０００ｒｐｍの条件で２時間遠心分離してウイルスを収得し、これをＦＢＳが含まれていない０．５ｍｌのＤＭＥＭに再懸濁した。その結果、ｐＢＤ－１、ｐＢＤ－２およびｐＢＤ－３レンチウイルスベクターから生産されたレンチウイルスをそれぞれ４．０×１０^８ＴＵ／ｍｌ、２．０×１０^８ＴＵ／ｍｌおよび１．２×１０^９ＴＵ／ｍｌの濃度で準備した。

【0069】

実施例１．３．不死化した間葉系幹細胞の製造
前記実施例１．２．で生産された不死化遺伝子を含むレンチウイルスを使用して、不死化したＭＳＣを製造した。

【0070】

まず、骨髄由来ＭＳＣを次のような方法で準備した。具体的に、健康なドナー（ｄｏｎｏｒ）の腸骨稜（ｉｌｉａｃ ｃｒｅｓｔ）から骨髄穿刺液（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ａｓｐｉｒａｔｅ）を収得した。これを滅菌コンテナで２０ＩＵ／ｍｌのヘパリンと混合して凝固を抑制した。前記骨髄混合液を４℃、７３９Ｇの条件で７分間遠心分離した後、上澄み液を除去し、１０倍体積の滅菌された水と混合した。これを同じ条件でさらに遠心分離して、細胞のペレットを収得した。収得されたペレットを２０％のＦＢＳおよび５ｎｇ／ｍｌのｂ－ＦＧＦ（１００－１８Ｂ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、米国）が含まれたＤＭＥＭ－ｌｏｗ ｇｌｕｃｏｓｅ（１１８８５－０８４、Ｇｉｂｃｏ、米国）培地に懸濁して、培養フラスコに分注した。これを３７℃、５％ＣＯ_２条件で２４～４８時間培養した後、新しい培地に交替した。これを３～４日間隔で新しい培地に交替しつつ継代培養し、培養２週後に蛍光細胞分析器を使用してＭＳＣの有無を確認した。

【0071】

前記実施例１．２．で生産されたｐＢＤ－１レンチウイルスで前記準備されたＭＳＣをレトロネクチン（Ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）を使用して１００ＭＯＩで感染させた。感染した細胞に前述したことと同じ方法で、ｐＢＤ－２レンチウイルスベクターを１００ＭＯＩで感染させた。感染後、細胞を安定化させた後、培養液に５００μｇ／ｍｌのゼオマイシンを添加してｐＢＤ－２レンチウイルスが感染した細胞を選別した。

【0072】

前記選別された細胞にｐＢＤ－３レンチウイルスベクターを１００ＭＯＩで感染させた。感染後、安定化された細胞の培養液に１μｇ／ｍｌのピューロマイシンを添加してｐＢＤ－３レンチウイルスが感染した細胞を選別した。その結果、不死化遺伝子を含むＭＳＣおよびそうでないＭＳＣの細胞増殖率を図１に示した。

【0073】

図１に示されたように、不死化遺伝子であるｃ－ＭｙｃおよびｈＴＥＲＴを含むレンチウイルスにより感染したＭＳＣ細胞は、培養１２０日以後にも高い細胞増殖率を維持した。反面、正常ＭＳＣ細胞は、培養４０日以後には、細胞増殖率が急激に減少した。

【0074】

実施例２．ＢＤＮＦ遺伝子を含むレンチウイルスの製作
実施例２．１．ＢＤＮＦ遺伝子を含むレンチウイルスベクターの製作
前記実施例１．１．で製作したｐＢＤレンチウイルスベクターに、ＢＤＮＦ遺伝子（配列番号２）を挿入した。

【0075】

まず、ＢＤＮＦ発現に及ぼすプロモーターの影響を確認するために、ＣＭＶプロモーターとＴＲＥプロモーターを使用してＢＤＮＦ遺伝子が発現するようにレンチウイルスベクターを製造し、これを用いてＢＤＮＦ遺伝子を発現するＭＳＣを製造した。その結果、ＣＭＶプロモーターが適用された細胞株の場合、長期継代培養時にＢＤＮＦを発現するＭＳＣが形態学的に変化し、継代培養が進行されるほどＢＮＤＦの発現率が減少することを確認した。

【0076】

これにより、ＢＮＤＦ遺伝子をＴＲＥプロモーターにより発現が調節されるように挿入した。ＴＲＥプロモーターは、ドキシサイクリンの添加有無によって前記プロモーターと連結された遺伝子の発現を調節することができる。

【0077】

実施例２．２．ＢＤＮＦ遺伝子を含むレンチウイルスの生産
前記実施例２．１で製作されたＢＤＮＦ遺伝子を含むレンチウイルスベクターを用いて、前記実施例１．２．に記載されたことと同じ方法でレンチウイルスを生産した。生産されたレンチウイルスは、１．４×１０^１２ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌの濃度で準備した。

【0078】

実施例３．ＢＤＮＦ遺伝子を含むレンチウイルスがトランスフェクションされたＭＳＣの製造
前記実施例１．３．で製造した不死化したＭＳＣに、前記実施例２．２．で生産したＢＤＮＦ遺伝子を含むレンチウイルスを感染させて、ＢＤＮＦ遺伝子を発現する細胞を製造した。形質導入は、実施例１．３．に記載されたことと同じ方法で行った。感染後、細胞を安定化させた後、培養液に５００μｇ／ｍｌのＧ４１８を添加してｐＢＤ－４レンチウイルスが感染した細胞を選別した。選別された細胞は、１μｇ／ｍｌのドキシサイクリン（ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ、６３１３１１、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、米国）が添加された培地で培養することによって、培養中にＢＤＮＦタンパク質の発現を抑制させた。

【0079】

前記選別された細胞がコロニーを形成するように培養した。ヒトＢＤＮＦ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，ＤＹ２４８，米国）でＢＤＮＦタンパク質発現有無を確認して形成された＃１～＃５０のクローンのうちＢＤＮＦタンパク質を発現する＃１０、＃１２、＃１４、＃１８、＃２０、＃２２、＃２３、＃２６、＃２９および＃４１クローンを選別した（図２）。その後、ドキシサイクリン処理時にＢＤＮＦタンパク質を発現しない＃１４、＃２２、＃２３および＃４１クローンを選別した（図３）。前記４個のクローンをＥＯＮＥ医療財団に染色体分析を依頼して確認した。いずれも、正常な染色体形態を示し、１４０日間細胞増殖能を確認した（図４および図５）。その結果、安定した増殖パターンを示し、最も発現量に優れた＃４１クローンをＢＭ－０１Ａ細胞株と命名し、後続実験を進めた。ＢＭ－０１Ａ細胞株は、２０１８年１２月１４日付で韓国生命工学研究院の生物資源センターに寄託番号ＫＣＴＣ １３７７８ＢＰとして寄託した。

【0080】

実験例１．ＢＭ－０１Ａ細胞株で表面抗原タンパク質発現の確認
遺伝子を挿入する前の骨髄由来ＭＳＣとＢＤＮＦ遺伝子が挿入されたＢＭ－０１Ａ細胞株の表面抗原タンパク質発現をヒトＭＳＣ分析キット（Ｓｔｅｍｆｌｏｗ^ＴＭ，Ｃａｔ Ｎｏ ５６２２４５，ＢＤ）を用いて分析した。実験は、各キットに含まれているマニュアルによって行われ、実験結果を図６に示した。

【0081】

図６に示されたように、ＢＭ－０１Ａ細胞株は、ＢＤＮＦを発現させるための遺伝子操作を経た後にも、ＭＳＣが持っている固有な特性である表面抗原タンパク質であるＣＤ９０、ＣＤ４４、ＣＤ１０５、およびＣＤ７３の発現が骨髄由来ＭＳＣと類似していることを証明した。

【0082】

実験例２．ＢＭ－０１Ａ細胞株の増殖率の確認
前記実施例３．で確立したＢＭ－０１Ａ細胞株の増殖率を確認した。

【0083】

Ｔ１７５フラスコに１．２×１０^６～１３．０×１０^６個のＢＭ－０１Ａ細胞株を接種して３日または４日間培養を進め、ＰＤＬ（Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｄｏｕｂｌｉｎｇ Ｌｅｖｅｌ）と細胞生存率を測定した。ＰＤＬは、「ＰＤＬ＝Ｘ＋３．２２２（ｌｏｇＹ－ｌｏｇＩ）」公式により計算し、Ｘは、初期ＰＤＬ、Ｉは、血管に接種された初期細胞数、Ｙは、最終細胞数を示した。

【0084】

Ｔ１７５フラスコに１．２×１０^６～１３．０×１０^６個のＢＭ－０１Ａ細胞株を接種して３日または４日間培養を進め、ＰＤＬ（Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｄｏｕｂｌｉｎｇ Ｌｅｖｅｌ）と細胞生存率を測定した。ＰＤＬは、「ＰＤＬ＝Ｘ＋３．２２２（ｌｏｇＹ－ｌｏｇＩ）」公式により計算し、Ｘは、初期ＰＤＬ、Ｉは、フラスコに接種された初期細胞数、Ｙは、最終細胞数を示した。

【0085】

実験例３．継代培養によるＢＭ－０１Ａ細胞株の形態学的確認
前記実施例３．で確立したＢＭ－０１Ａ細胞株の継代培養による形態学的変形を確認するために、実験例１．でＢＭ－０１Ａ細胞株の増殖率を確認し、顕微鏡で細胞の写真を撮影した。

【0086】

その結果、ＢＭ－０１Ａ細胞は、１４０日以上長期継代培養をしても、形態学的に変化がないことを確認した（図８）。

【0087】

実験例４．ＢＭ－０１Ａ細胞株でＢＤＮＦタンパク質の発現確認
前記実施例３．で確立したＢＭ－０１Ａ細胞でＢＤＮＦタンパク質の発現をＥＬＩＳＡ分析方法で確認した。具体的に、ＢＤＮＦタンパク質の発現水準は、ヒトＢＤＮＦ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキットで確認した。実験は、各キットに含まれているマニュアルによって行われた。

【0088】

実験結果、ドキシサイクリンを除去した培地とドキシサイクリンを除去しない培地において約１×１０^５個の細胞から４８時間発現が誘導されたＢＤＮＦタンパク質の発現水準を図９に示した。ドキシサイクリンが存在する培地では、約１．６ｎｇのＢＤＮＦが検出された反面、ドキシサイクリンを除去した培地では、約３８０ｎｇのＢＤＮＦが検出された。

【0089】

【表1】

【0090】

前記表１のように、本発明のＢＭ－０１Ａ細胞株で約３８０ｎｇ／１０^５ｃｅｌｌｓのＢＤＮＦタンパク質が発現することを確認した（表１）。また、確立されたＢＭ－０１Ａ細胞株の継代別ＢＤＮＦタンパク質発現量をヒトＢＤＮＦ ＥＬＩＳＡキットで測定した。その結果、ＢＤＮＦタンパク質発現量が一定に維持されることを確認した（図１０）。

【0091】

実験例５．ＢＭ－０１Ａ細胞株でＢＤＮＦ導入遺伝子の確認
前記実施例３．で製造したＢＭ－０１Ａ細胞株に遺伝子が導入されたかを確認するためにＰＣＲを行った。具体的に、前記ＢＭ－０１Ａ細胞株を９ｍｌのＰＢＳが含まれた１５ｍｌチューブに移した後、１，５００ｒｐｍで５分間セルダウン（Ｃｅｌｌ Ｄｏｗｎ）させた。ＰＢＳを完全に除去した後、１．５ｍｌチューブに２００μｌのＰＢＳでペレットを懸濁させた後に移した。その後、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｔｉｓｓｕｅ（ＭＮ、７４０９５２．２５０）を用いてｇＤＮＡを準備し、下記表２のように混合物を作った後、下記表３の段階でＰＣＲを行った。この際、陽性対照群として１００ｎｇのＢＭ－０１ＡプラスミドＤＮＡを、陰性対照群として１μｌの精製水を入れた。前記ＢＭ－０１ＡプラスミドＤＮＡは、韓国特許公開第２０１７－００９３７４８号に記載された方法によって分離精製することができる。

【0092】

【表2】

【0093】

【表3】

【0094】

１％（ｖ／ｖ）アガロースゲルを電気泳動キットに入れた。一番目のウェルに１０μｌのＤＮＡ Ｓｉｚｅ Ｍａｒｋｅｒをローディングし、次のウェルから陰性対照群、陽性対照群、３個のＢＭ－０１Ａ検体の順にそれぞれ１０μｌずつローディングした。以後、１００Ｖで２０分間電気泳動を実施し、ゲル写真を撮って、その結果を図１１に示した。図１１に示されたように、３個のＢＭ－０１Ａ細胞株が全部陽性対照群と同じサイズ（１．０ｋｂ）のＰＣＲプロダクトを確認した。

【0095】

実験例６．ＢＭ－０１Ａ細胞株の神経細胞の保護および治療効果の確認
実験例６．１．ハンチントン病誘発ラットの製作
神経毒素であるキノリン酸（ｑｕｉｎｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ，ＱＡ）を右側の内側前脳束（ＡＰ＋１．０、ＭＬ －２．５、ＤＶ －５．０）に１２０ｎｍｏｌ／２μｌの濃度で０．２μｌ／分の速度で注入して、急性ハンチントン病誘発ラットを製作した。製作された急性ハンチントン病動物モデルの確認のために、ＱＡ注入２週後にＤＡＲＰＰ－３２抗体（１：１００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を使用して免疫染色を行った後、ＬＶＺ（ｌａｔｅｒａｌ ｖｅｎｔｒｉｃｌｅ ｚｏｎｅ）の体積を測定した。

【0096】

図１２に示されたように、ＱＡ注入後に脳の萎縮によってＬＶＺの体積が増加したことを確認した。

【0097】

実験例６．２．ＢＭ－０１Ａ細胞株の注入
実験例６．１．で製作したハンチントン病誘発ラットの内側前脳束２部位（ＡＰ １．５、ＭＬ －３．０、ＤＶ －５．５および－４．５）に１×１０^６ｃｅｌｌｓ／１μｌの濃度のＢＭ－０１Ａ細胞株を０．２μｌ／分の速度で注入した。対照群には、培養培地を同じ用量で注入した。注入１週後にｈＮｕ免疫染色を実施して、ＢＭ－０１Ａ細胞株の存在を確認した。

【0098】

実験例６．２．ＢＭ－０１Ａ細胞株の注入
実験例６．１．で製作したハンチントン病誘発ラットの内側前脳束２部位（ＡＰ １．５、ＭＬ －３．０、ＤＶ －５．５および－４．５）に１×１０^６ｃｅｌｌｓ／１μｌの濃度のＢＭ－０１Ａ細胞株を０．２μｌ／分の速度で注入した。対照群には、凍結剤形バッファーを同じ用量で注入した。注入１週後にｈＮｕ免疫染色を実施して、ＢＭ－０１Ａ細胞株の存在を確認した。

【0099】

実験例６．３．行動改善効果の確認
ＢＭ－０１Ａ細胞株の注入によるハンチントン病誘発ラットの行動改善効果を確認するために、ＢＭ－０１Ａ注入３週前から１週間ラットを訓練させた。ＢＭ－０１Ａ注入２週間前に正常ラットの行動実験値を測定し、ＢＭ－０１Ａ注入１週間前にＱＡを注入してハンチントン病を誘発した。行動実験は、ロータロッド実験（Ｒｏｔａ－ｒｏｄ ｔｅｓｔ）、歩行実験（Ｓｔｅｐｐｉｎｇ ｔｅｓｔ）および階段実験（Ｓｔａｉｒｃａｓｅ ｔｅｓｔ）を実施した。

【0100】

まず、基本的な感覚運動能力を確認するロータロッド実験を進めた。ロータロッド実験は、次第に増加する速度で回転する円筒からマウスが落ちるのにかかる時間を測定する方式で進めた。また、ロータロッド実験は、ＱＡ注入前、ＢＭ－０１Ａ注入直後、ＢＭ－０１Ａ注入後２週、４週、６週、８週、１０週目に実施した。その結果、ＢＭ－０１Ａ注入２週後から対照群よりＢＭ－０１Ａ細胞株を注入した実験群が円筒から落ちるのにさらに長時間がかかり、時間が経過するにつれて対照群と実験群の落ちるのにかかる時間の差異が増加した（図１４）。

【0101】

また、歩行実験は、ラットの片方の手を固定した後、他方の手でテーブルをタッチする回数を測定する方式で進めた。歩行実験は、ＱＡ注入２週間前、ＢＭ－０１Ａ注入直後、ＢＭ－０１Ａ注入後２週、４週、６週、８週、１０週目に実施した。その結果、ＢＭ－０１Ａ注入２週後から対照群よりＢＭ－０１Ａ細胞株を注入した実験群のテーブルタッチ回数が多く、時間が経過するにつれて対照群と実験群のテーブルタッチ回数の差異が増加した（図１５）。

【0102】

また、階段実験は、階段が設置された所定のボックス内に餌を５個ずつ階段にセットした後、手を使用して１５分間摂取するようにし、残った餌の個数を測定して、摂取した餌の個数を計算する方式で進めた。階段実験は、ＱＡ注入２週間前、ＢＭ－０１Ａ注入直後、ＢＭ－０１Ａ注入後２週、４週、６週、８週、１０週目に実施した。その結果、ＢＭ－０１Ａ注入２週後から対照群よりＢＭ－０１Ａ細胞株を注入した実験群の摂取した餌の個数が多く、時間が経過するにつれて対照群と実験群の摂取した餌の個数の差異が増加した（図１６）。

【0103】

実験例６．４．抗炎症効果の確認
実験例６．２．で製作した１０週目の対照群および実験群ラットを犠牲にさせた。ラットの脳に４％（ｖ／ｖ）パラホルムアルデヒドを灌流して固定させた。クリオスタット（ｃｒｙｏｓｔａｔ，Ｍｉｃｒｏｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して４０μｍの凍結冠状切片（ｆｒｏｚｅｎ ｃｏｒｏｎａｌ ｓｅｃｔｉｏｎ）を準備した。

【0104】

前記切片を休止期の小膠細胞（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）と活性化した小膠細胞を染色するために、ウサギ－抗－マウスＩｂａ－１抗体およびＡｌｅｘａ－６４７が標識されたヤギ－抗－ウサギＩｇＧ抗体を使用して染色した。その後、活性化した小膠細胞を確認するために、ウサギ－抗－マウスＥＤ１（ＣＤ６８）抗体およびＡｌｅｘａ－４８８が標識されたヤギ－抗－ウサギＩｇＧ抗体（ＥＤ１）を使用して染色した。その後、引き続いてＤＡＰＩ（４，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）で染色した後、共焦点レーザー－走査顕微鏡イメージングシステム（ＬＳＭ５１０，Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，Ｉｎｃ．）を使用して写真を撮影した。その結果、ＢＭ－０１Ａ細胞株を注入した実験群において対照群より少ない活性化した小膠細胞が観察された（図１７）。

【0105】

また、前記切片をウサギ－抗－マウスＥＤ１（ＣＤ６８）抗体およびＡｌｅｘａ－４８８が標識されたヤギ－抗－ウサギＩｇＧ抗体（ＥＤ１）を使用して染色した。その後、活性化した小膠細胞のうち炎症マーカーであるｉＮＯＳを発現する細胞を確認するために、ウサギ－抗－マウスｉＮＯＳ抗体およびＡｌｅｘａ－６４７が標識されたヤギ－抗－ウサギＩｇＧ抗体を使用して染色した。引き続いて、ＤＡＰＩで染色した後、共焦点レーザー－走査顕微鏡イメージングシステムを使用して写真を撮影した。その結果、ＢＭ－０１Ａ細胞株を注入した実験群において活性化した小膠細胞のｉＮＯＳ発現量が減少したことを確認した（図１８）。

【0106】

実験例６．５．神経膠症減少効果の確認
実験例６．２．で１０週目の対照群および実験群ラットを犠牲にさせた。マウスの脳に４％（ｖ／ｖ）パラホルムアルデヒドを灌流して固定させた。クリオスタットを使用して４０μｍの凍結冠状切片を準備した。

【0107】

前記切片を神経膠細胞が特徴的に発現するグリア線維酸性タンパク質（Ｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＡＰ）をウサギ－抗－マウスＧＦＡＰ抗体およびＡｌｅｘａ－４８８が標識されたヤギ－抗－ウサギＩｇＧ抗体を使用して染色した。引き続いて、ＤＡＰＩで染色した後、共焦点レーザー－走査顕微鏡イメージングシステムを使用して写真を撮影した。

【0108】

その結果、ＢＭ－０１Ａ細胞株を注入した実験群において対照群より少ない神経膠細胞が観察された（図１９）。

【0109】

実験例６．６．神経細胞保護効果の確認
実験例６．２．で１０週目の対照群および実験群ラットを犠牲にさせた。ラットの脳に４％（ｖ／ｖ）パラホルムアルデヒドを灌流して固定させた。クリオスタットを使用して４０μｍの凍結冠状切片を準備した。ＤＡＲＰＰ－３２抗体を使用して免疫染色した後、ＬＶＺの体積、線条体（ｓｔｒｉａｔｕｍ）内の欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）部分の体積および線条体内の密度を測定した。その結果、ＢＭ－０１Ａを注入した実験群においてＬＶＺの体積が減少した（図２０および図２１）。また、ＢＭ－０１Ａを注入した実験群においてＱＡ注入で線条体内欠失部分の体積が減少し、線条体内の密度が増加したことを確認した（図２２～図２４）。

【0110】

また、神経発生のマーカータンパク質であるＤＣＸ（Ｄｏｕｂｌｅｃｏｒｔｉｎ）の発現量の変化を確認するために、前記準備した切片にウサギ－抗－マウスＤＣＸ抗体およびＡｌｅｘａ－６４７が標識されたヤギ－抗－ウサギＩｇＧ抗体を使用して染色した。共焦点レーザー－走査顕微鏡イメージングシステムを使用して写真を撮影した。その結果、ＢＭ－０１Ａ細胞株を注入した実験群のＤＣＸ発現量が増加したことを確認した（図２５）。

【0111】

実験例７．慢性脳卒中誘発実験動物でＢＭ－０１Ａ細胞株の神経細胞保護および治療効果の確認
実験例７．１．慢性脳卒中誘発ラットの製作
ＢＭ－０１Ａ細胞株の投与による慢性脳卒中誘発ラットの行動改善効果を確認するために、ＢＭ－０１Ａ投与５週間前から１週間マウスを訓練させた。ＢＭ－０１Ａ投与４週間前に正常ラットを対象として中大脳動脈閉塞症（ｍｉｄｄｌｅ ｃａｒｏｔｉｄ ａｒｔｅｒｙ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ；ＭＡＣｏ）実験を通じて脳卒中を誘発した。

【0112】

実験例７．２．行動改善効果の確認
ＢＭ－０１Ａ細胞株の注入による脳卒中誘発ラットの行動改善効果を確認するために、ＢＭ－０１Ａ注入３週前から１週間マウスを訓練させた。ＢＭ－０１Ａ注入３週および１週間前に２回にかけた行動実験を通じて正常マウスの行動実験値を測定し、行動実験を通じて脳卒中が誘発されたラットを選別し、ＢＭ－０１Ａを用量（ｄｏｓｅ）別に脳内投与した後、さらに４回の行動実験を実施して、総６回の行動実験を通じて行動実験値を測定した。行動実験は、ロータロッド実験（Ｒｏｔａ－ｒｏｄ ｔｅｓｔ）、歩行実験（Ｓｔｅｐｐｉｎｇ ｔｅｓｔ）および修正された神経学的重症度スコア実験（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｅｖｅｒｉｔｙ ｓｃｏｒｅｓ ｔｅｓｔ；ｍＮＳＳ）を実施した。

【0113】

まず、基本的な感覚運動能力を確認するロータロッド実験を進めた。ロータロッド実験は、次第に増加する速度で回転する円筒からマウスが落ちるのにかかる時間を測定する方式で進めた。実験は、ＭＣＡｏモデリング１週前、ＭＣＡｏモデリング直後、３週後、ＢＭ－０１Ａ投与後２週、５週、８週、１２週目に実施した。その結果、ＢＭ－０１Ａ注入５週後から対照群より１×１０^６個のＢＭ－０１Ａ細胞株を投与した実験群が円筒から落ちるのにさらに長時間がかかり、時間が経過するにつれて対照群と実験群の落ちるのにかかる時間の差異が増加した（図２６）。

【0114】

また、歩行実験は、マウスの片方の手を固定した後、他方の手でテーブルをタッチする回数を測定する方式で進めた。歩行実験は、ＭＣＡｏモデリング１週前、ＭＣＡｏモデリング直後、３週後、ＢＭ－０１Ａ投与後２週、５週、８週、１２週目に実施した。その結果、ＢＭ－０１Ａ注入１２週後には、対照群より１×１０^６個のＢＭ－０１Ａ細胞株を注入した実験群のテーブルタッチ回数が多く、時間が経過するにつれて対照群と実験群のテーブルタッチ回数の差異が増加した（図２７）。

【0115】

また、修正された神経学的重症度スコア実験（ｍＮＳＳ）は、運動能力、感覚機能、平衡維持力、反射機能などを総合的に評価して点数化した。実験は、ＭＣＡｏモデリング１週前、ＭＣＡｏモデリング直後、３週後、ＢＭ－０１Ａ注入後２週、５週、８週、１２週目に実施した（図２８）。その結果、ＢＭ－０１Ａ注入５週後から対照群より１×１０^６個のＢＭ－０１Ａ細胞株を注入した実験群の行動指数が改善され、時間が経過するにつれて対照群と実験群の行動指数の差異が増加および維持した。

【0116】

実験例７．３．抗炎症効果の確認
１６週目の対照群および実験群ラットを犠牲にさせた。ラットの脳に４％（ｖ／ｖ）パラホルムアルデヒドを灌流して固定させた。クリオスタット（ｃｒｙｏｓｔａｔ，Ｍｉｃｒｏｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して４０μｍの凍結冠状切片（ｆｒｏｚｅｎ ｃｏｒｏｎａｌ ｓｅｃｔｉｏｎ）を準備した。

【0117】

前記切片で神経膠瘢痕（ｇｌｉａｌ ｓｃａｒ）の形成を確認するために、神経膠細胞が特徴的に発現するグリア線維酸性タンパク質（Ｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＡＰ）をウサギ－抗－マウスＧＦＡＰ抗体およびＡｌｅｘａ－４８８が標識されたヤギ－抗－ウサギＩｇＧ抗体を使用して染色した。引き続き共焦点レーザー－走査顕微鏡イメージングシステム（ＬＳＭ５１０，Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，Ｉｎｃ．）を使用して写真を撮影した。

【0118】

その結果、瘢痕面積を測定したとき、皮質部位で対照群より１×１０^６個のＢＭ－０１Ａ細胞株を投与した実験群が瘢痕面積が減少し（図２９）、線条体の部位では、瘢痕面積が減少したが、統計的有意性は観察されなかった（図３０）。次に、瘢痕の厚さを測定したとき、皮質と線条体の部位で対照群より１×１０^６個のＢＭ－０１Ａ細胞株を投与した実験群において瘢痕の厚さが減少したことが観察された（図３１）。

【0119】

実験例８．ＢＭ－０１Ａ細胞株の安全性の確認
実験例８．１．試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）ＢＭ－０１Ａ細胞株の腫瘍原性の確認
ＣｙｔｏＳｅｌｅｃｔ^ＴＭ ９６－ｗｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙを用いて軟寒天ゲル（Ｓｏｆｔ Ａｇａｒ Ｇｅｌｓ）で骨髄由来ＭＳＣ、ＢＭ－０１Ａ細胞株、陽性対照群（ＨｅＬａ）および陰性対照群（ＮＩＨ３Ｔ３）で非依存性増殖（Ａｎｃｈｏｒａｇｅ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｇｒｏｗｔｈ）によるコロニー形成の有無を確認し、ＭＴＳ溶液で染色して、吸光度を測定することによって、細胞形質転換による腫瘍形成の有無を定量化した。

【0120】

その結果、陽性対照群で細胞形質転換によるコロニーが形成され、陰性対照群、骨髄由来ＭＳＣおよびＢＭ－０１Ａ細胞株は、コロニーが形成されないことから、細胞培養時に形質転換能力がなく、試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）腫瘍原性がないことを確認することができた（図３２）。

【0121】

実験例８．２．生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）ＢＭ－０１Ａ細胞株の安全性の確認
ＢＭ－０１Ａの生体内安全性を確認するために、実験例６．２．で１０週目の実験群ラットを犠牲にさせてＢＭ－０１Ａ細胞株の生存有無を確認した。具体的に、実験例６．２．で１０週目の対照群および実験群ラットを犠牲にさせた。ラットの脳に４％（ｖ／ｖ）パラホルムアルデヒドを灌流して固定させた。クリオスタットを使用して４０μｍの凍結冠状切片を準備した。抗－Ｈｕｍａｎ Ｎｕｃｌｅｉ抗体および細胞死滅マーカーである抗－Ｃａｓｐａｓｅ３抗体を使用して免疫染色した。共焦点レーザー－走査顕微鏡イメージングシステムを使用して写真を撮影した。

【0122】

その結果、Ｈｕｍａｎ Ｎｕｃｌｅｉは、死滅した形態で存在し、Ｃａｓｐａｓｅ ３が染色された部位が同一であった。すなわち、ＢＭ－０１Ａ細胞株が全部死滅することを立証し、これを通じて、生体内でも非正常的に分化したり増殖しないため、安全性に優れていることを確認した（図３３）。

【0123】

［受託番号］
寄託機関名：韓国生命工学研究院
受託番号：ＫＣＴＣ１３７７８ＢＰ
受託日付：２０１８年１２月１４日

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【配列表】

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