(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-01-28
(45)【発行日】2022-02-07
(54)【発明の名称】血液癌の併用療法
(51)【国際特許分類】
A61K 31/7088 20060101AFI20220131BHJP
A61K 31/496 20060101ALI20220131BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20220131BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220131BHJP
【ＦＩ】
A61K31/7088 ZMD
A61K31/496
A61P35/02
A61P43/00 121
【請求項の数】
26
(21)【出願番号】P 2019504731
(86)(22)【出願日】2017-07-28
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2019-08-22
(86)【国際出願番号】 US2017044348
(87)【国際公開番号】W WO2018026646
(87)【国際公開日】2018-02-08
【審査請求日】2020-07-27
(31)【優先権主張番号】62/370,018
(32)【優先日】2016-08-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】16197293.0
(32)【優先日】2016-11-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】62/422,738
(32)【優先日】2016-11-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】595161223
【氏名又は名称】ジェロン・コーポレーション
【氏名又は名称原語表記】ＧＥＲＯＮ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(72)【発明者】
【氏名】ファン， フェイ
(72)【発明者】
【氏名】ラスバルト， ジョシュア ジェイ．
(72)【発明者】
【氏名】リゾ， アレクサンドラ
【審査官】山村 祥子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１５／０６９７５８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１６－５０４３０７（ＪＰ，Ａ）
【文献】CANCER DISCOVERY，2014年， 4(3)， 362-375
【文献】Cell Stem Cell，2014年，Volume 15, Issue 6，673-675
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ４５／００
Ａ６１Ｋ ３１／００
Ａ６１Ｐ ３５／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を治療するための組み合わせ物であって、イメテルスタットとＡＢＴ－１９９とを含む、組み合わせ物。
【請求項2】
イメテルスタットが、１、２、３、４、５、６、７、８、または８より多い投薬サイクルで投与され、各サイクルが、（ａ）約７～１０ｍｇ／ｋｇのイメテルスタットを４週間ごとに１回静脈内投与；
（ｂ）約７～１０ｍｇ／ｋｇのイメテルスタットを週に１回を４週間静脈内投与；
（ｃ）約２．５～１０ｍｇ／ｋｇのイメテルスタットを３週間ごとに１回静脈内投与；または
（ｄ）約０．５～９．４ｍｇ／ｋｇのイメテルスタットを４週間ごとに１回静脈内投与を含む、請求項１に記載の組み合わせ物。
【請求項3】
前記イメテルスタットがイメテルスタットナトリウムである、請求項２に記載の組み合わせ物。
【請求項4】
ＡＢＴ－１９９が、（ａ）毎日、約５０～４００ｍｇのＡＢＴ－１９９の用量で；
（ｂ）１日目に約２ｍｇのＡＢＴ－１９９の用量で、その後６日目に約８００ｍｇの最終用量になるまで毎日増量し、６日目以降は毎日その最終用量で；または
（ｃ）１日目に約２５ｍｇのＡＢＴ－１９９の用量で、その後５日目に約４００ｍｇの最終用量になるまで毎日増量し、５日目以降は毎日その最終
用量で投与される、請求項１～３のいずれか一項に記載の組み合わせ物。
【請求項5】
ＡＢＴ－１９９の投与が、前記イメテルスタットの投与の１日前、１日後、または同じ日である、請求項４に記載の組み合わせ物。
【請求項6】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞におけるアポトーシスを誘導するためのイメテルスタットとＡＢＴ－１９９とを含む組み合わせ物であって、該細胞が、治療に有効な量のイメテルスタットとＡＢＴ－１９９とに接触されることを特徴とする、組み合わせ物。
【請求項7】
イメテルスタットがイメテルスタットナトリウムである、請求項６に記載の組み合わせ物。
【請求項8】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞におけるアポトーシスを誘導するためのキットであって、（ａ）投与されると、ＡＭＬ細胞においてアポトーシスを誘導するのに有効な量の用量のイメテルスタットと、
（ｂ）投与されると、ＡＭＬ細胞においてアポトーシスを誘導するのに有効な量の用量のＡＢＴ－１９９とを含む、キット。
【請求項9】
前記イメテルスタットがイメテルスタットナトリウムである、請求項８に記載のキット。
【請求項10】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞においてアポトーシスを誘導するｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法であって、該細胞と治療に有効な量のイメテルスタットナトリウムとを接触させることと、該細胞と治療に有効な量のＡＢＴ－１９９を接触させることとを含む、方法。
【請求項11】
イメテルスタットとＡＢＴ－１９９とを含む急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を治療するための医薬組成物。
【請求項12】
前記イメテルスタットがイメテルスタットナトリウムである、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項13】
ＢＣＬ阻害治療を受けている患者において、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を治療するためのイメテルスタットまたはイメテルスタットナトリウムを含む組成物であって、前記ＢＣＬ阻害治療がＡＢＴ－１９９の投与を含む、組成物。
【請求項14】
テロメラーゼ阻害治療を受けている患者において、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を治療するためのＡＢＴ－１９９を含む組成物であって、前記テロメラーゼ阻害治療がイメテルスタットまたはイメテルスタットナトリウムの投与を含む、組成物。
【請求項15】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を治療するためのイメテルスタットを含む組成物であって、前記組成物は、ＡＢＴ－１９９と組み合わせて、治療を必要とする被験体に投与されることを特徴とする、組成物。
【請求項16】
前記イメテルスタットがイメテルスタットナトリウムである、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項17】
イメテルスタットが、１、２、３、４、５、６、７、８、または８より多い投薬サイクルで投与され、各サイクルが、（ａ）約７～１０ｍｇ／ｋｇのイメテルスタットを４週間ごとに１回静脈内投与；
（ｂ）約７～１０ｍｇ／ｋｇのイメテルスタットを週に１回を４週間静脈内投与；もしくは
（ｃ）約２．５～７ｍｇ／ｋｇのイメテルスタットを３週間ごとに１回静脈内投与；もしくは
（ｃ）約０．５～９．４ｍｇ／ｋｇのイメテルスタットを４週間ごとに１回静脈内投与を含む、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項18】
前記ＡＢＴ－１９９が、（ａ）毎日、５０～４００ｍｇのＡＢＴ－１９９の用量で；
（ｂ）１日目に２ｍｇのＡＢＴ－１９９の用量で、その後６日目に８００ｍｇの最終用量になるまで毎日増量し、６日目以降は毎日その最終用量で；
（ｃ）１日目に２５ｍｇのＡＢＴ－１９９の用量で、その後５日目に４００ｍｇの最終用量になるまで毎日増量し増加、５日目以降は毎日その最終
用量で投与されるためのものである、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項19】
ＡＢＴ－１９９の前記投与が、前記イメテルスタットの投与の１日前、１日後、または同じ日である、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項20】
イメテルスタットとＡＢＴ－１９９との組み合わせが、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞のアポトーシスを誘導する、請求項１５に記載の組成物。
【請求項21】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を治療するためのイメテルスタットナトリウムを含む組成物であって、前記組成物は、ＡＢＴ－１９９と組み合わせて、治療を必要とする被験体に投与されることを特徴とする、組成物。
【請求項22】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を治療するためのＡＢＴ－１９９を含む組成物であって、前記組成物は、イメテルスタットナトリウムと組み合わせて、治療を必要とする被験体に投与されることを特徴とする、組成物。
【請求項23】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を治療するためのイメテルスタットナトリウムとＡＢＴ－１９９とを含む組み合わせ物。
【請求項24】
イメテルスタットナトリウムが、１、２、３、４、５、６、７、８、または８より多い投薬サイクルの投与のためのものであり、各サイクルが、（ａ）約７～１０ｍｇ／ｋｇのイメテルスタットナトリウムを４週間ごとに１回静脈内投与；
（ｂ）約７～１０ｍｇ／ｋｇのイメテルスタットナトリウムを週に１回を４週間静脈内投与；
（ｃ）約２．５～７ｍｇ／ｋｇのイメテルスタットナトリウムを３週間ごとに１回静脈内投与；もしくは
（ｄ）約０．５～９．４ｍｇ／ｋｇのイメテルスタットナトリウムを４週間ごとに１回静脈内投与を含む、請求項２１または２２に記載の組成物、または請求項２３に記載の組み合わせ物。
【請求項25】
前記ＡＢＴ－１９９が、（ａ）毎日、約５０～４００ｍｇのＡＢＴ－１９９の用量で；
（ｂ）１日目に約２ｍｇのＡＢＴ－１９９の用量で、その後６日目に約８００ｍｇの最終用量になるまで毎日増量し、６日目以降は毎日その最終用量で；
（ｃ）１日目に約２５ｍｇのＡＢＴ－１９９の用量で、その後５日目に約４００ｍｇの最終用量になるまで毎日増量し、５日目以降は毎日その最終用量で投与されるためのものである、請求項２１または２２に記載の組成物、または請求項２３に記載の組み合わせ物。
【請求項26】
ＡＢＴ－１９９の前記投与が、イメテルスタットナトリウムの前記投与の１日前、１日後、または同じ日である、請求項２１または２２に記載の組成物、または請求項２３に記載の組み合わせ物。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国仮出願第６２／３７０，０１８号（２０１６年８月２日に出願）、欧州特許出願第１６１９７２９３．０号（２０１６年１１月４日に出願）、米国仮出願第６２／４２２，７３８号（２０１６年１１月１６日）に対する優先権を主張し、それぞれの内容全体が、本明細書に参考として組み込まれる。
本出願は、米国仮出願第６２／３７０，０１８号（２０１６年８月２日に出願）、欧州特許出願第１６１９７２９３．０号（２０１６年１１月４日に出願）、米国仮出願第６２／４２２，７３８号（２０１６年１１月１６日）に対する優先権を主張し、それぞれの内容全体が、本明細書に参考として組み込まれる。
【0002】
（配列表）
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その全体が本明細書に参考として組み込まれる。このＡＳＣＩＩコピーは、２０１７年７月１７日に作成され、ＰＲＤ３４２４ＷＯＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔの名称であり、大きさは２，３３５バイトである。
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その全体が本明細書に参考として組み込まれる。このＡＳＣＩＩコピーは、２０１７年７月１７日に作成され、ＰＲＤ３４２４ＷＯＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔの名称であり、大きさは２，３３５バイトである。
【0003】
（発明の分野）
本開示は、本明細書に提供され、テロメラーゼ阻害剤とＢｃｌ－２阻害剤の組み合わせを用いる血液癌の治療に関する。
本開示は、本明細書に提供され、テロメラーゼ阻害剤とＢｃｌ－２阻害剤の組み合わせを用いる血液癌の治療に関する。
【背景技術】
【0004】
（発明の背景）
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者は、診断時の治療の選択肢が制限されている。治療は、典型的には、白血病細胞の負荷を迅速に減らすために化学療法の形態をとっている。多数の白血球（正常および疾患のもの）を除去するための侵襲性の白血球除去輸血手順が、一時的に腫瘍細胞の負荷を下げるために、化学療法と並行して適用されてもよい。誘導期の化学療法は、成功する場合があるが、患者の骨髄に残存する大部分の健康な細胞も死滅し、疾患を引き起こし、感染を回避し、白血球数を上げるために、さらなる苦痛緩和治療を必要とする。患者を寛解状態に保つための試みで、化学療法をさらに使用してもよいが、再発は一般的である。
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者は、診断時の治療の選択肢が制限されている。治療は、典型的には、白血病細胞の負荷を迅速に減らすために化学療法の形態をとっている。多数の白血球（正常および疾患のもの）を除去するための侵襲性の白血球除去輸血手順が、一時的に腫瘍細胞の負荷を下げるために、化学療法と並行して適用されてもよい。誘導期の化学療法は、成功する場合があるが、患者の骨髄に残存する大部分の健康な細胞も死滅し、疾患を引き起こし、感染を回避し、白血球数を上げるために、さらなる苦痛緩和治療を必要とする。患者を寛解状態に保つための試みで、化学療法をさらに使用してもよいが、再発は一般的である。
【0005】
テロメラーゼは、全ての種類の癌にわたって、９０％を超える腫瘍に存在し、正常で健康な組織には存在しない。イメテルスタットナトリウムは、ヒトテロメラーゼＲＮＡ（ｈＴＲ）テンプレート領域に相補性の共有結合により脂質付加した１３マーオリゴヌクレオチド（以下に示す）である、新規なファーストインクラスのテロメラーゼ阻害剤である。イメテルスタットナトリウムは、アンチセンス機能によって機能するのではないため、このような治療で一般的にみられる副作用がない。イメテルスタットナトリウムは、イメテルスタットのナトリウム塩である（以下に示す）。
イメテルスタットナトリウム
他に示されているか、内容から明確ではない限り、以下のイメテルスタットへの言及は、その塩も含む。上述のように、イメテルスタットナトリウムは、特に、イメテルスタットのナトリウム塩である。
【化1】
イメテルスタットナトリウム
他に示されているか、内容から明確ではない限り、以下のイメテルスタットへの言及は、その塩も含む。上述のように、イメテルスタットナトリウムは、特に、イメテルスタットのナトリウム塩である。
【0006】
ＡＢＴ－１９９／ベネトクラックス（商品名Ｖｅｎｃｌｅｘｔａ）は、再発した／不応性のｄｅｌ１７ｐを伴う慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）患者に使用するためのＦＤＡに承認されたＢｃｌ－２阻害剤である。ＡＢＴ－１９９は、ＡＢＴ １９９、ＧＤＣ０１９９、ＧＤＣ－０１９９またはＲＧ７６０１としても知られている。ＡＢＴ－１９９の化学名は、４－［４－［［２－（４－クロロフェニル）－４，４－ジメチルシクロヘキセン－１－イル］メチル］ピペラジン－１－イル］－Ｎ－［３－ニトロ－４－（オキサン－４－イルメチルアミノ）フェニル］スルホニル－２－（１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－５－イルオキシ）ベンザミド（Ｃａｓ番号１２５７０４４－４０－８）である。他に示されているか、内容から明確ではない限り、以下のＡＢＴ－１９９への言及は、その医薬的に許容される塩も含む。しかし、特定的には、実施例において、ＡＢＴ－１９９は、遊離塩基形態で使用された。
【0007】
ＡＢＴ－１９９は、以下に遊離塩基形態で示されており、Ｂｃｌ－２に対して非常に特異的であり、関連するＢｃｌファミリーメンバーに対するアフィニティを示し、大きな副作用を誘発する他の第一世代の阻害剤とは異なる。Ｂｃｌ－２の阻害は、細胞ＤＮＡ内の損傷または異常により引き起こされるアポトーシス促進性のシグナルを遮断し、最終的には、処理された細胞において、カスパーゼカスケードによってプログラムされた細胞死を引き起こし、内在性経路によってアポトーシスを引き起こす。
ＡＢＴ－１９９（遊離塩基形態で示される）
【化2】
ＡＢＴ－１９９（遊離塩基形態で示される）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0008】
ＡＭＬ細胞において、イメテルスタットナトリウムとＡＢＴ－１９９の組み合わせた投薬は、血液癌、特にＡＭＬに対する新規な治療を与える。イメテルスタットナトリウムは、現時点で、骨髄線維症（ＭＦ）および骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）で臨床的に研究されている。
ＡＢＴ－１９９は、ＣＬＬにおいてＦＤＡに承認されており、ＡＭＬにおいても研究されている。
ＡＢＴ－１９９は、ＣＬＬにおいてＦＤＡに承認されており、ＡＭＬにおいても研究されている。
【0009】
組み合わせて投与される場合、これら２つの薬剤は、癌細胞においてアポトーシスを促進することができる。組み合わせて投与される場合、これら２つの薬剤は、治療を必要とする被験体において癌を治療することができる。
【0010】
したがって、本発明の一実施形態は、血液癌を治療する方法であって、治療を必要とする被験体に、テロメラーゼ阻害剤とＢｃｌ－２阻害剤とを組み合わせて投与することを含む、方法である。
【0011】
本方法の一実施形態では、テロメラーゼ阻害剤は、イメテルスタットである。別の実施形態では、イメテルスタットは、イメテルスタットナトリウムである。イメテルスタットまたはイメテルスタットナトリウムは、１、２、３、４、５、６、７、８、または８より多い投薬サイクルで投与されてもよく、各サイクルが、（ａ）約７～１０ｍｇ／ｋｇのイメテルスタットを４週間ごとに１回静脈内投与；（ｂ）約７～１０ｍｇ／ｋｇのイメテルスタットを週に１回を４週間静脈内投与；（ｃ）約２．５～１０ｍｇ／ｋｇのイメテルスタットを３週間ごとに１回静脈内投与；または（ｄ）約０．５～９．４ｍｇ／ｋｇのイメテルスタットを４週間ごとに１回静脈内投与を含む。
【0012】
この治療方法は、急性骨髄性白血病、本態性血小板血症、真性赤血球増加症、原発性骨髄線維症、全身性肥満細胞症、慢性骨髄性白血病、慢性好中球性白血病、慢性好酸球性白血病、環状鉄芽球を伴う不応性貧血、多血球系異形成を伴う不応性血球減少症、過剰なブラストを伴う不応性貧血（１型）、過剰なブラストを伴う不応性貧血（２型）、単独５番染色体長腕（５ｑ）の欠失を伴う骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）（myelodysplastic syndrome (MDS) with isolated del (5q)）、分類不能型ＭＤＳ、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＬ）、非定型慢性骨髄性白血病、若年性骨髄単球性白血病、分類不能型骨髄増殖性／骨髄異形成症候群、Ｂリンパ芽球性白血病／リンパ腫、Ｔリンパ芽球性白血病／リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫／白血病、濾胞性リンパ腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫／ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、移植後のリンパ増殖性障害、ＨＩＶに関連するリンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性皮膚Ｂ細胞リンパ腫（primary cutaneous primary cutaneous B-cell lymphoma）、有毛細胞白血病、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症、くすぶり型多発性骨髄腫および孤立性形質細胞腫（孤立性の骨および髄外）から選択される血液癌を治療するために使用されてもよい。一実施形態では、血液癌は、急性骨髄性白血病である。したがって、本発明の一実施形態は、急性骨髄性白血病を治療する方法であって、イメテルスタットとＡＢＴ－１９９とを急性骨髄性白血病を有する被験体に投与することを含む、方法である。
【0013】
本発明の別の実施形態は、血液癌細胞におけるアポトーシスを誘導する方法であって、前記細胞と治療に有効な量のテロメラーゼ阻害剤とを接触させることと、前記細胞と治療に有効な量のＢｃｌ－２阻害剤とを接触させることとを含む、方法である。特定の実施形態では、テロメラーゼ阻害剤は、イメテルスタットまたはイメテルスタットナトリウムである。特定の実施形態では、特にイメテルスタットが使用される場合には、Ｂｃｌ－２阻害剤は、ＡＢＴ－１９９である。特定の実施形態では、血液癌細胞は、以下の種類の血液癌：急性骨髄性白血病、本態性血小板血症、真性赤血球増加症、原発性骨髄線維症、全身性肥満細胞症、慢性骨髄性白血病、慢性好中球性白血病、慢性好酸球性白血病、環状鉄芽球を伴う不応性貧血、多血球系異形成を伴う不応性血球減少症、過剰なブラストを伴う不応性貧血（１型）、過剰なブラストを伴う不応性貧血（２型）、単独５番染色体長腕（５ｑ）の欠失を伴う骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、分類不能型ＭＤＳ、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＬ）、非定型慢性骨髄性白血病、若年性骨髄単球性白血病、分類不能型骨髄増殖性／骨髄異形成症候群、Ｂリンパ芽球性白血病／リンパ腫、Ｔリンパ芽球性白血病／リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫／白血病、濾胞性リンパ腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫／ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、移植後のリンパ増殖性障害、ＨＩＶに関連するリンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性皮膚Ｂ細胞リンパ腫、有毛細胞白血病、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症、くすぶり型多発性骨髄腫および孤立性形質細胞腫（孤立性の骨および髄外）から選択される。一実施形態では、血液癌細胞は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞である。
【0014】
アポトーシスを誘導する方法は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで行われてもよい。したがって、本発明の一実施形態は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞におけるアポトーシスを誘導するｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法であって、前記細胞と治療に有効な量のイメテルスタットナトリウムとを接触させることと、前記細胞と治療に有効な量のＡＢＴ－１９９を接触させることとを含む、方法である。別の実施形態では、本方法は、治療に有効な量のテロメラーゼ阻害剤とＢｃｌ－２阻害剤を、血液癌を有する被験体に投与することを含む。
【0015】
本発明の別の実施形態は、キットであって、投与されると、血液癌細胞においてアポトーシスを誘導するのに有効な量の用量のテロメラーゼ阻害剤（例えばイメテルスタット）と、投与されると、血液癌細胞においてアポトーシスを誘導するのに有効な量の用量のＢｃｌ－２阻害剤（例えばＡＢＴ－１９９）とを含む、キットである。さらに別の実施形態では、本発明は、イメテルスタットまたはイメテルスタットナトリウムとＡＢＴ－１９９とを含む医薬組成物に関する。本組成物は、急性骨髄性白血病の治療のために製剤化されてもよい。
【0016】
本発明は、ＢＣＬ阻害治療を受けている患者において血液癌を治療するためにイメテルスタットまたはイメテルスタットナトリウムを使用することも包含する。別の実施形態では、本発明は、テロメラーゼ阻害治療を受けている患者において血液癌を治療するためにＡＢＴ－１９９を使用することに関する。
【0017】
本発明の代替の実施形態は、以下に関する。（１）血液癌を治療する方法で使用するためのテロメラーゼ阻害剤（例えばイメテルスタットまたはイメテルスタットナトリウム）であって、この方法が、前記テロメラーゼ阻害剤とＢｃｌ－２阻害剤（例えばＡＢＴ－１９９）とを組み合わせて、治療を必要とする被験体に投与することを含む、テロメラーゼ阻害剤、または、（２）血液癌を治療する方法において使用するためのテロメラーゼ阻害剤（例えばイメテルスタットまたはイメテルスタットナトリウム）とＢｃｌ－２阻害剤（例えばＢｃｌ－２）とを含む組み合わせであって、この方法が、治療を必要とする被験体に、この組み合わせを投与することを含む、組み合わせ。これらの実施形態では、血液癌は、急性骨髄性白血病であってもよい。または、血液癌が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、本態性血小板血症、真性赤血球増加症、原発性骨髄線維症、全身性肥満細胞症、慢性骨髄性白血病、慢性好中球性白血病、慢性好酸球性白血病、環状鉄芽球を伴う不応性貧血、多血球系異形成を伴う不応性血球減少症、過剰なブラストを伴う不応性貧血（１型）、過剰なブラストを伴う不応性貧血（２型）、単独５番染色体長腕（５ｑ）の欠失を伴う骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、分類不能型ＭＤＳ、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＬ）、非定型慢性骨髄性白血病、若年性骨髄単球性白血病、分類不能型骨髄増殖性／骨髄異形成症候群、Ｂリンパ芽球性白血病／リンパ腫、Ｔリンパ芽球性白血病／リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫／白血病、濾胞性リンパ腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫／ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、移植後のリンパ増殖性障害、ＨＩＶに関連するリンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性皮膚Ｂ細胞リンパ腫、有毛細胞白血病、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症、くすぶり型多発性骨髄腫および孤立性形質細胞腫（孤立性の骨および髄外）から選択される。これらの実施形態では、テロメラーゼ阻害剤とＢｃｌ－２阻害剤の組み合わせは、血液癌細胞のアポトーシスを誘導する。
【0018】
本発明のさらなる実施形態は、以下に関する。（１）急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を治療する方法で使用するためのイメテルスタットナトリウムであって、この方法が、イメテルスタットナトリウムとＡＢＴ－１９９とを組み合わせて、治療を必要とする被験体に投与することを含む、イメテルスタットナトリウム、（２）急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を治療する方法で使用するためのＡＢＴ－１９９であって、この方法が、ＡＢＴ－１９９とイメテルスタットナトリウムとを組み合わせて、治療を必要とする被験体に投与することを含む、ＡＢＴ－１９９、または（３）急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を治療する方法で使用するためのイメテルスタットナトリウムとＡＢＴ－１９９とを含む組み合わせであって、この方法が、この組み合わせを、治療を必要とする被験体に投与することを含む、組み合わせ。これらの実施形態では、イメテルスタットナトリウムは、１、２、３、４、５、６、７、８、または８より多い投薬サイクルの投与のためのものであり、各サイクルが、（ａ）約７～１０ｍｇ／ｋｇのイメテルスタットナトリウムを４週間ごとに１回静脈内投与；（ｂ）約７～１０ｍｇ／ｋｇのイメテルスタットナトリウムを週に１回を４週間静脈内投与；（ｃ）約２．５～７ｍｇ／ｋｇのイメテルスタットナトリウムを３週間ごとに１回静脈内投与；または（ｄ）約０．５～９．４ｍｇ／ｋｇのイメテルスタットナトリウムを４週間ごとに１回静脈内投与を含む。さらに、これらの実施形態では、ＡＢＴ－１９９は、（ａ）毎日、約５０～４００ｍｇのＡＢＴ－１９９の用量で；（ｂ）１日目に約２ｍｇのＡＢＴ－１９９の用量で、その後６日目に約８００ｍｇの最終用量になるまで毎日増量し、６日目以降は毎日その最終用量で；または（ｃ）１日目に約２５ｍｇのＡＢＴ－１９９の用量で、その後５日目に約４００ｍｇの最終用量になるまで毎日増量し、５日目以降は毎日その最終用量で投与するためのものである。また、これらの実施形態では、ＡＢＴ－１９９の投与は、イメテルスタットナトリウムの投与の１日前、１日後、または同じ日であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1B】図１Ｂは、イメテルスタットナトリウムおよび／またはＡＢＴ－１９９を用いてＫＧ－１細胞を４８時間治療する効果を示す。図１Ａは、種々の濃度のＡＢＴ－１９９および／またはイメテルスタットナトリウムを用いて４８時間治療し、アネキシンＶおよびヨウ化プロピジウムを用いて染色した後のＫＧ－１細胞のドットプロットを示す。図１Ｂは、ＫＧ－１細胞を、様々な濃度のＡＢＴ－１９９および／またはイメテルスタットナトリウムで４８時間治療したときの、化合物の濃度としてのアポトーシス細胞％のグラフを示す。アポトーシス細胞は、アネキシンＶとヨウ化プロピジウムとで二重標識されている。
【図2B】図２Ｂは、イメテルスタットナトリウムおよび／またはＡＢＴ－１９９を用いてＫＧ－１細胞を９６時間治療する効果を示す。図２Ａは、種々の濃度のＡＢＴ－１９９および／またはイメテルスタットナトリウムを用いて９６時間治療し、アネキシンＶおよびヨウ化プロピジウムを用いて染色した後のＫＧ－１細胞のドットプロットを示す。図２Ｂは、ＫＧ－１細胞を、様々な濃度のＡＢＴ－１９９および／またはイメテルスタットナトリウムで９６時間治療したときの、化合物の濃度としてのアポトーシス細胞％のグラフを示す。アポトーシス細胞は、アネキシンＶとヨウ化プロピジウムとで二重標識されている。
【図3B】図３Ｂは、ＫＧ－１細胞を、ミスマッチまたは非相補性オリゴヌクレオチドとＡＢＴ－１９９とで４８時間治療する効果を示す。図３Ａは、様々な濃度のＡＢＴ－１９９および／またはコントロールオリゴヌクレオチドを用いて４８時間治療し、アネキシンＶおよびヨウ化プロピジウムで染色した後のＫＧ－１細胞のドットプロットを示す。図３Ｂは、ＫＧ－１細胞を、様々な濃度のＡＢＴ－１９９および／またはコントロールオリゴヌクレオチドで４８時間治療したときの、化合物の濃度としてのアポトーシス細胞％のグラフを示す。Ｎｏｎ－Ｃｏｍｐは、非相補性コントロールオリゴヌクレオチドを指す。アポトーシス細胞は、アネキシンＶとヨウ化プロピジウムとで二重標識されている。
【図4B】図４Ｂは、ＫＧ－１細胞を、ミスマッチまたは非相補性オリゴヌクレオチドとＡＢＴ－１９９とで９６時間治療する効果を示す。図４Ａは、種々の濃度のＡＢＴ－１９９および／またはコントロールオリゴヌクレオチドを用いて９６時間治療し、アネキシンＶおよびヨウ化プロピジウムを用いて染色した後のＫＧ－１細胞のドットプロットを示す。図４Ｂは、ＫＧ－１細胞を、様々な濃度のＡＢＴ－１９９および／またはコントロールオリゴヌクレオチドで４８時間治療したときの、化合物の濃度としてのアポトーシス細胞％のグラフを示す。Ｎｏｎ－Ｃｏｍｐは、非相補性コントロールオリゴヌクレオチドを指す。アポトーシス細胞は、アネキシンＶとヨウ化プロピジウムとで二重標識されている。
【図5B】図５Ｂは、イメテルスタットナトリウムおよび／またはＡＢＴ－１９９を用いてＭＯＬＭ－１３細胞を４８時間治療する効果を示す。図５Ａは、種々の濃度のＡＢＴ－１９９および／またはイメテルスタットナトリウムを用いて４８時間治療し、アネキシンＶおよびヨウ化プロピジウムを用いて染色した後のＭＯＬＭ－１３細胞のドットプロットを示す。図５Ｂは、ＭＯＬＭ－１３細胞を、様々な濃度のＡＢＴ－１９９および／またはイメテルスタットナトリウムで４８時間治療したときの、化合物の濃度としてのアポトーシス細胞％のグラフを示す。アポトーシス細胞は、アネキシンＶとヨウ化プロピジウムとで二重標識されている。
【図6B】図６Ｂは、イメテルスタットナトリウムおよび／またはＡＢＴ－１９９を用いてＭＯＬＭ－１３細胞を４８時間治療する効果を示す。図６Ａは、種々の濃度のＡＢＴ－１９９および／またはイメテルスタットナトリウムを用いて９６時間治療し、アネキシンＶおよびヨウ化プロピジウムを用いて染色した後のＭＯＬＭ－１３細胞のドットプロットを示す。図６Ｂは、ＭＯＬＭ－１３細胞を、様々な濃度のＡＢＴ－１９９および／またはイメテルスタットナトリウムで９６時間治療したときの、化合物の濃度としてのアポトーシス細胞％のグラフを示す。アポトーシス細胞は、アネキシンＶとヨウ化プロピジウムとで二重標識されている。
【図7B】図７Ｂは、ＭＯＬＭ－１３細胞を、様々な濃度のＡＢＴ－１９９および／またはコントロールオリゴヌクレオチドで４８時間治療する効果を示す。図７Ａは、種々の濃度のＡＢＴ－１９９および／またはコントロールオリゴヌクレオチドを用いて４８時間治療し、アネキシンＶおよびヨウ化プロピジウムを用いて染色した後のＭＯＬＭ－１３細胞のドットプロットを示す。図７Ｂは、ＭＯＬＭ－１３細胞を、様々な濃度のＡＢＴ－１９９および／またはコントロールオリゴヌクレオチドで４８時間治療したときの、化合物の濃度としてのアポトーシス細胞％のグラフを示す。Ｎｏｎ－Ｃｏｍｐは、非相補性コントロールオリゴヌクレオチドを指す。アポトーシス細胞は、アネキシンＶとヨウ化プロピジウムとで二重標識されている。
【図8B】図８Ｂは、ＭＯＬＭ－１３細胞を、様々な濃度のＡＢＴ－１９９および／またはコントロールオリゴヌクレオチドで９６時間治療する効果を示す。図８Ａは、種々の濃度のＡＢＴ－１９９および／またはコントロールオリゴヌクレオチドを用いて９６時間治療し、アネキシンＶおよびヨウ化プロピジウムを用いて染色した後のＭＯＬＭ－１３細胞のドットプロットを示す。図８Ｂは、ＭＯＬＭ－１３細胞を、様々な濃度のＡＢＴ－１９９および／またはコントロールオリゴヌクレオチドで９６時間治療したときの、化合物の濃度としてのアポトーシス細胞％のグラフを示す。Ｎｏｎ－Ｃｏｍｐは、非相補性コントロールオリゴヌクレオチドを指す。アポトーシス細胞は、アネキシンＶとヨウ化プロピジウムとで二重標識されている。
【図9】図９は、ＫＧ－１細胞またはＭＯＬＭ－１３細胞において、イメテルスタットナトリウム、ＡＢＴ－１９９、または組み合わせによって４８時間および９６時間治療した後にＲＴ－ｑＰＣＲによって測定されたｈＴＥＲＴ転写レベルを示す。
【図10】図１０は、ＫＧ－１細胞またはＭＯＬＭ－１３細胞において、イメテルスタットナトリウム、ＡＢＴ－１９９、または組み合わせによって４８時間および９６時間治療した後にｑＰＣＲ ＴＲＡＰによって測定されたテロメラーゼ酵素活性レベルを示す。
【図11】図１１は、ＭＯＬＭ－１３細胞を、様々な濃度のＡＢＴ－１９９および／またはイメテルスタットナトリウムで４８時間治療したときの、化合物の濃度としてのアポトーシス細胞％のグラフを示す。アポトーシス細胞は、アネキシンＶとヨウ化プロピジウムとで二重標識されている。
【図12A】図１２Ａは、ＭＯＬＭ－１３細胞を、様々な濃度のＡＢＴ－１９９、コントロールミスマッチオリゴヌクレオチド及び非相補性オリゴヌクレオチドで４８時間治療したときの、化合物の濃度としてのアポトーシス細胞％のグラフを示す。
【図12B】図１２Ｂは、ＭＯＬＭ－１３細胞を、様々な濃度のＡＢＴ－１９９、コントロールミスマッチオリゴヌクレオチド及び非相補性オリゴヌクレオチドで４８時間治療したときの、化合物の濃度としてのアポトーシス細胞％のグラフを示す。図１２Ａは、ＭＯＬＭ－１３細胞を、様々な濃度のＡＢＴ－１９９および／またはコントロールミスマッチオリゴヌクレオチド「ミスマッチ」で４８時間治療したときの、化合物の濃度としてのアポトーシス細胞％のグラフを示す。図１２Ｂは、ＭＯＬＭ－１３細胞を、様々な濃度のＡＢＴ－１９９および／またはコントロール非相補性オリゴヌクレオチド「Ｎｏｎ－ｃｏｍｐ」で４８時間治療したときの、化合物の濃度としてのアポトーシス細胞％のグラフを示す。アポトーシス細胞は、アネキシンＶとヨウ化プロピジウムとで二重標識されている。
【図13】図１３は、ＭＯＬＭ－１３細胞を、様々な濃度のＡＢＴ－１９９および／またはイメテルスタットナトリウムで９６時間治療したときの、化合物の濃度としてのアポトーシス細胞％のグラフを示す。アポトーシス細胞は、アネキシンＶとヨウ化プロピジウムとで二重標識されている。
【図14A】図１４Ａは、ＭＯＬＭ－１３細胞を、様々な濃度のＡＢＴ－１９９、コントロールミスマッチオリゴヌクレオチド及び非相補性オリゴヌクレオチドで４８時間治療したときの、化合物の濃度としてのアポトーシス細胞％のグラフを示す。
【図14B】図１４Ｂは、ＭＯＬＭ－１３細胞を、様々な濃度のＡＢＴ－１９９、コントロールミスマッチオリゴヌクレオチド及び非相補性オリゴヌクレオチドで４８時間治療したときの、化合物の濃度としてのアポトーシス細胞％のグラフを示す。図１４Ａは、ＭＯＬＭ－１３細胞を、様々な濃度のＡＢＴ－１９９および／またはコントロールミスマッチオリゴヌクレオチド「ミスマッチ」で９６時間治療したときの、化合物の濃度としてのアポトーシス細胞％のグラフを示す。図１４Ｂは、ＭＯＬＭ－１３細胞を、様々な濃度のＡＢＴ－１９９および／またはコントロール非相補性オリゴヌクレオチド「Ｎｏｎ－ｃｏｍｐ」で９６時間治療したときの、化合物の濃度としてのアポトーシス細胞％のグラフを示す。アポトーシス細胞は、アネキシンＶとヨウ化プロピジウムとで二重標識されている。
【図15A】図１５Ａ～１５Ｄは、ＡＭＬ患者の全血から精製し、様々な濃度でのＡＢＴ－１９９および／またはイメテルスタットナトリウムの治療にｅｘ ｖｉｖｏで１６時間および４０時間曝露し、アネキシンＶおよびヨウ化プロピジウムで染色してフローサイトメトリーアッセイによって細胞生存率を分析した、４つのＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）サンプルの平均応答を示す。図１５Ａおよび図１５Ｂは、ＡＭＬ患者の全血液のＦｉｃｏｌｌ精製したＰＢＭＣを様々な濃度のＡＢＴ－１９９および／またはイメテルスタットナトリウムで１６時間治療したときの化合物の濃度としての生細胞％のグラフを示す。図１５Ａは、ＣＤ４５＋白血球の結果を示す。図１５Ｂは、ＣＤ４５＋／ＣＤ３４＋白血病幹細胞の結果を示す。図１５Ｃおよび図１５Ｄは、ＡＭＬ患者の全血液のＦｉｃｏｌｌ精製したＰＢＭＣを様々な濃度のＡＢＴ－１９９および／またはイメテルスタットナトリウムで４０時間治療したときの化合物の濃度としての生細胞％のグラフを示す。図１５Ｃは、ＣＤ４５＋白血球の結果を示す。図１５Ｄは、ＣＤ４５＋／ＣＤ３４＋白血病幹細胞の結果を示す。図１５Ａ～１５Ｄにおいて、エラーバーは、標準偏差を表す。治療後に残っている生細胞は、アネキシンＶまたはヨウ化プロピジウムのいずれかで標識されない。
【図15B】図１５Ａ～１５Ｄは、ＡＭＬ患者の全血から精製し、様々な濃度でのＡＢＴ－１９９および／またはイメテルスタットナトリウムの治療にｅｘ ｖｉｖｏで１６時間および４０時間曝露し、アネキシンＶおよびヨウ化プロピジウムで染色してフローサイトメトリーアッセイによって細胞生存率を分析した、４つのＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）サンプルの平均応答を示す。図１５Ａおよび図１５Ｂは、ＡＭＬ患者の全血液のＦｉｃｏｌｌ精製したＰＢＭＣを様々な濃度のＡＢＴ－１９９および／またはイメテルスタットナトリウムで１６時間治療したときの化合物の濃度としての生細胞％のグラフを示す。図１５Ａは、ＣＤ４５＋白血球の結果を示す。図１５Ｂは、ＣＤ４５＋／ＣＤ３４＋白血病幹細胞の結果を示す。図１５Ｃおよび図１５Ｄは、ＡＭＬ患者の全血液のＦｉｃｏｌｌ精製したＰＢＭＣを様々な濃度のＡＢＴ－１９９および／またはイメテルスタットナトリウムで４０時間治療したときの化合物の濃度としての生細胞％のグラフを示す。図１５Ｃは、ＣＤ４５＋白血球の結果を示す。図１５Ｄは、ＣＤ４５＋／ＣＤ３４＋白血病幹細胞の結果を示す。図１５Ａ～１５Ｄにおいて、エラーバーは、標準偏差を表す。治療後に残っている生細胞は、アネキシンＶまたはヨウ化プロピジウムのいずれかで標識されない。
【図15C】図１５Ａ～１５Ｄは、ＡＭＬ患者の全血から精製し、様々な濃度でのＡＢＴ－１９９および／またはイメテルスタットナトリウムの治療にｅｘ ｖｉｖｏで１６時間および４０時間曝露し、アネキシンＶおよびヨウ化プロピジウムで染色してフローサイトメトリーアッセイによって細胞生存率を分析した、４つのＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）サンプルの平均応答を示す。図１５Ａおよび図１５Ｂは、ＡＭＬ患者の全血液のＦｉｃｏｌｌ精製したＰＢＭＣを様々な濃度のＡＢＴ－１９９および／またはイメテルスタットナトリウムで１６時間治療したときの化合物の濃度としての生細胞％のグラフを示す。図１５Ａは、ＣＤ４５＋白血球の結果を示す。図１５Ｂは、ＣＤ４５＋／ＣＤ３４＋白血病幹細胞の結果を示す。図１５Ｃおよび図１５Ｄは、ＡＭＬ患者の全血液のＦｉｃｏｌｌ精製したＰＢＭＣを様々な濃度のＡＢＴ－１９９および／またはイメテルスタットナトリウムで４０時間治療したときの化合物の濃度としての生細胞％のグラフを示す。図１５Ｃは、ＣＤ４５＋白血球の結果を示す。図１５Ｄは、ＣＤ４５＋／ＣＤ３４＋白血病幹細胞の結果を示す。図１５Ａ～１５Ｄにおいて、エラーバーは、標準偏差を表す。治療後に残っている生細胞は、アネキシンＶまたはヨウ化プロピジウムのいずれかで標識されない。
【図15D】図１５Ａ～１５Ｄは、ＡＭＬ患者の全血から精製し、様々な濃度でのＡＢＴ－１９９および／またはイメテルスタットナトリウムの治療にｅｘ ｖｉｖｏで１６時間および４０時間曝露し、アネキシンＶおよびヨウ化プロピジウムで染色してフローサイトメトリーアッセイによって細胞生存率を分析した、４つのＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）サンプルの平均応答を示す。図１５Ａおよび図１５Ｂは、ＡＭＬ患者の全血液のＦｉｃｏｌｌ精製したＰＢＭＣを様々な濃度のＡＢＴ－１９９および／またはイメテルスタットナトリウムで１６時間治療したときの化合物の濃度としての生細胞％のグラフを示す。図１５Ａは、ＣＤ４５＋白血球の結果を示す。図１５Ｂは、ＣＤ４５＋／ＣＤ３４＋白血病幹細胞の結果を示す。図１５Ｃおよび図１５Ｄは、ＡＭＬ患者の全血液のＦｉｃｏｌｌ精製したＰＢＭＣを様々な濃度のＡＢＴ－１９９および／またはイメテルスタットナトリウムで４０時間治療したときの化合物の濃度としての生細胞％のグラフを示す。図１５Ｃは、ＣＤ４５＋白血球の結果を示す。図１５Ｄは、ＣＤ４５＋／ＣＤ３４＋白血病幹細胞の結果を示す。図１５Ａ～１５Ｄにおいて、エラーバーは、標準偏差を表す。治療後に残っている生細胞は、アネキシンＶまたはヨウ化プロピジウムのいずれかで標識されない。
【図16】図１６は、マウスモデルにおける、単剤療法としてのイメテルスタットナトリウムまたはＡＢＴ－１、または組み合わせた両方の薬剤のｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍効能と、生存便益を示す。マウスにＭＯＬＭ－１３細胞（播種性モデル）を播種し、ビヒクル、イメテルスタットナトリウムおよび／またはＡＢＴ－１９９、またはミスマッチオリゴヌクレオチドコントロールとＡＢＴ－１９９で治療した。治療後の生存についてマウスをモニタリングした（開始時にｎ＝１０マウス／群）。特定的には、図１６は、腫瘍細胞移植後の日数の関数としてマウスの生存率を示す。以下を用い、マウスを３１日間治療した。（ｉ）ビヒクル（ＭＭ＋ＰＥＧ４００／Ｐｈｏｓａｌ５０／ＥＴＯＨ）；（ｉｉ）イメテルスタットナトリウム（３０ｍｇ／ｋｇ）、（ｉｉｉ）ＡＢＴ－１９９（１００ｍｇ／ｋｇ）、（ｉｖ）ＭＭ（ミスマッチオリゴ）（３０ｍｇ／ｋｇ）およびＡＢＴ－１９９（１００ｍｇ／ｋｇ）；および（ｖ）イメテルスタットナトリウム（３０ｍｇ／ｋｇ）およびＡＢＴ－１９９（１００ｍｇ／ｋｇ）。
【発明を実施するための形態】
【0020】
本発明の以下の詳細な記載は、添付の図面と組み合わせて読むと、より良く理解される。図面は、本発明の特定の実施形態を示すために与えられる。しかし、本発明は、示されている正確な配置、例および手段に限定されない。開示を明確にするためであり、限定としてではなく、本発明の詳細な記載は、本発明の特定の特徴、実施形態または用途を記載するか、または示す項に分けられる。
【0021】
本発明は、テロメラーゼ阻害剤とＢｃｌ－２阻害剤との組み合わせを用いて血液癌を治療する方法を提供する。薬物耐性細胞の集団によって、治療に対する不完全な奏効、または疾患の再発が起こる場合がある。本発明は、ＡＭＬ細胞において、いずれかの薬物が独立して誘導し得るレベルよりも大きなレベルのアポトーシスを誘導するように相乗的に機能するテロメラーゼ阻害剤とＢｃｌ－２阻害剤との組み合わせを提供する。本発明は、血液癌細胞におけるアポトーシスを誘導する方法であって、前記細胞と、治療に有効な量のテロメラーゼ阻害剤と治療に有効な量のＢｃｌ－２阻害剤とを接触させることとを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、テロメラーゼ阻害剤は、イメテルスタットである。いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ－２阻害剤は、ＡＢＴ－１９９である。いくつかの実施形態では、血液癌は、ＡＭＬである。
【0022】
特定の場合には、この組み合わせは、いずれかの構成要素単独と比較して、高められた阻害効果を与える。ある場合には、この組み合わせは、これらの構成要素の組み合わせた効果または相加効果と比較して、相加効果を超える（supraadditive）効果または相乗効果を与える。
【0023】
いくつかの実施形態では、本方法は、血液癌細胞においてアポトーシスを誘導する方法である。本主題の方法は、細胞と治療に有効な量のテロメラーゼ阻害剤とを接触させることと、前記細胞と治療に有効な量のＢｃｌ－２阻害剤とを接触させることとを含んでいてもよい。特定の実施形態では、テロメラーゼ阻害剤は、イメテルスタットである。いくつかの実施形態では、テロメラーゼ阻害剤は、イメテルスタットナトリウムである。いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ－２阻害剤は、ＡＢＴ－１９９である。細胞とテロメラーゼ阻害剤とを接触させることは、細胞とＢｃｌ－２阻害剤とを接触させる前、接触させている間、および／または接触させた後に行われてもよい。細胞と、テロメラーゼ阻害剤およびＢｃｌ－２阻害剤とを接触させることは、同時に行われてもよく、または逐次的に行われてもよい。
【0024】
ある実施形態では、テロメラーゼ阻害剤は、テロメラーゼ阻害活性を有するオリゴヌクレオチドであり、特に、ともに本明細書に参考として組み込まれるＷＯ ２００５／０２３９９４号および／またはＷＯ ２０１４／０８８７８５号に定義されるようなオリゴヌクレオチドである。
【0025】
一般に、テロメラーゼ阻害剤とＢｃｌ－２阻害剤の様々な組み合わせを、逐次的に、または同時に利用し、使用してもよい。例えば、複数回投薬のために、この２種類の薬剤を、直接的に交互に投薬してもよく、または１つの薬剤の２回以上の用量を、他の薬剤の１回用量で置き換えてもよい。両方の薬剤の同時投与は、個々の薬剤の投薬と交互にしてもよく、または他の方法で散在させてもよい。ある場合には、投薬の間の時間は、治療開始から約１～６時間から約６～１２時間まで、約１２～２４時間まで、約１～２日間まで、約１～２種間まで、またはもっと長い期間であってもよい。一連の治療の間に、計画した投薬を完結する必要性は、再評価されてもよい。
【0026】
「アポトーシス」との用語は、その付随する細胞形態の変化および細胞生存性の消失を伴う、プログラムされた細胞死のプロセスを指す。一実施形態では、アポトーシスを誘導する方法は、脊椎動物生物の新生物障害を治療する方法を提供する。
【0027】
この方法の関連で、「誘導する」との用語は、直接的または間接的な因果関係を意味する。したがって、特定の状態の存在および／または維持によって、誘導される結果を引き起こすか、または導く。
【0028】
本明細書で使用される場合、「約」との用語は、測定可能な値（例えば、量、一時的な継続期間など）に言及される場合、その明記された値から±２０％～±０．１％、好ましくは±２０％または±１０％、より好ましくは±５％、さらにより好ましくは±１％、さらになお好ましくは±０．１％の変動を包含することを意味する。このような変動は、開示されている方法を行うのに適切であるためである。
【0029】
全体で使用される場合、「ＡＭＬ」は、急性骨髄性白血病を指す。
Ａ．治療
Ａ．治療
【0030】
本明細書で使用される場合、当該技術分野で十分に理解されるように、「治療」は、臨床的結果を含め、有益な結果または所望の結果を得るための手法である。本発明の目的のために、有益な臨床結果または所望の臨床結果としては、限定されないが、検出可能であるか、または検出不可能であるかによらず、１つ以上の症状の軽減または緩和、疾患の程度の減少、疾患の安定化した（すなわち、悪化しない）状態、疾患の広がりの予防、疾患の進行を遅らせるか、またはゆっくりにすること、疾患状態の緩和または一時的に抑えること、および寛解（部分的または完全）が挙げられる。「治療」は、治療を受けていない場合に予想される生存と比較して、生存時間が延びることも意味し得る。
【0031】
本開示は、テロメラーゼ阻害剤イメテルスタットナトリウムの投与と、Ｂｃｌ－２阻害剤ＡＢＴ－１９９の投与とを組み合わせることを含む、治療（血液癌、例えば、急性骨髄性白血病のための）を提供する。本主題の治療方法は、さらに効果的であり得、いずれかの薬物を単独で用いて観察される場合よりも、ＡＭＬ患者における治療に対する応答を大きくし得る。一実施形態では、本治療方法は、テロメラーゼ阻害剤とＢｃｌ－２阻害剤とを組み合わせて、血液癌の治療が必要な被験体に投与することを含む。別の実施形態では、血液癌は、ＡＭＬである。別の実施形態では、テロメラーゼ阻害剤は、イメテルスタットである。特定の実施形態では、テロメラーゼ阻害剤は、イメテルスタットナトリウムである。別の実施形態では、Ｂｃｌ－２阻害剤は、ＡＢＴ－１９９である。
【0032】
いくつかの実施形態では、被験体に投与されるテロメラーゼ阻害剤の用量は、そのテロメラーゼ阻害剤が単独で使用されるときに疾患を治療するのに十分な量である。特定の実施形態では、被験体に投与されるテロメラーゼ阻害剤の用量は、テロメラーゼ阻害剤が単独で使用されるときに疾患を治療するのに十分な量より少ない。一実施形態では、テロメラーゼ阻害剤の用量は、ＡＭＬと既に診断されている被験体の治療において、ＡＢＴ－１９９と組み合わせて使用される場合、減らされる。いくつかの実施形態では、テロメラーゼ阻害剤は、イメテルスタットである。いくつかの実施形態では、テロメラーゼ阻害剤は、イメテルスタットナトリウムである。いくつかの実施形態では、被験体に投与されるＢｃｌ－２阻害剤の用量は、Ｂｃｌ－２阻害剤が単独で使用されるときに疾患を治療するのに十分な量である。特定の実施形態では、被験体に投与されるＢｃｌ－２阻害剤の用量は、Ｂｃｌ－２阻害剤が単独で使用されるときに疾患を治療するのに十分な量より少ない。いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ－２阻害剤は、ＡＢＴ－１９９である。別の実施形態では、Ｂｃｌ－２阻害剤の用量は、ＡＭＬと既に診断されている被験体の治療において、イメテルスタットと組み合わせて使用される場合、減らされる。さらに別の実施形態では、そのイメテルスタットとＡＢＴ－１９９の用量は、ＡＭＬと既に診断されている被験体の治療において組み合わせて使用する場合、両方とも減らされる。
【0033】
別の実施形態では、テロメラーゼ阻害剤を用いた治療の長さは、血液癌を有する被験体の治療において、Ｂｃｌ－２阻害剤と組み合わせて使用される場合、短くされる。別の実施形態では、イメテルスタットを用いた治療の長さは、血液癌を有する被験体の治療において、ＡＢＴ－１９９と組み合わせて使用される場合、短くされる。別の実施形態では、ＡＢＴ－１９９を用いた治療の長さは、血液癌を有すると診断されている被験体の治療において、イメテルスタットと組み合わせて使用される場合、短くされる。別の実施形態では、イメテルスタットとＡＢＴ－１９９を両方とも用いた治療の長さは、血液癌を有すると診断されている被験体の治療において、組み合わせて使用される場合、短くされる。いくつかの実施形態では、血液癌は、ＡＭＬである。
【0034】
本明細書に記載される薬物の組み合わせは、両方の薬物を含む組成物として被験体に投与されてもよく、または別個に投与されてもよい。本明細書に記載される薬物の組み合わせは、合わせられた薬物組成物で、例えば、静脈内投与によって投与されてもよく、または別個に投与されてもよい。
Ｂ．血液癌
Ｂ．血液癌
【0035】
本発明の方法は、任意の簡便な血液悪性腫瘍の治療に使用することができる。血液悪性腫瘍は、血液を作る組織（例えば、骨髄）の細胞内で、または免疫系の細胞内で始まる癌の形態である。血液癌の例は、急性および慢性の白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫および骨髄異形成症候群である。ある場合には、血液悪性腫瘍は、血液癌と呼ばれる。骨髄増殖性新生物、すなわちＭＰＮは、骨髄において、新生物性造血性骨髄前駆体細胞（progenitor cell）、例えば、赤血球、血小板および顆粒球の前駆細胞（precursor cell）から生じる血液新生物である。新生物性前駆体細胞の増殖は、疾患に応じて、白血球、赤血球および／または血小板の任意の組み合わせの過剰産生を引き起こす。これらの過剰産生した細胞は、異常なものもあり、さらなる臨床的な合併症を引き起こすことがある。様々な種類の慢性骨髄増殖性障害が存在する。骨髄増殖性新生物には、本態性血小板血症、真性赤血球増加症、慢性骨髄性白血病、骨髄線維症、慢性好中球性白血病、慢性好酸球性白血病および急性骨髄性白血病が含まれる。骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）は、血液および骨髄の癌を含む症状群である。ＭＤＳとしては、限定されないが、不応性貧血、過剰なブラストを伴う不応性貧血、多血球系異形成を伴う不応性血球減少症および慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＬ）が挙げられる。
【0036】
目的の血液癌としては、限定されないが、ＡＭＬ、本態性血小板血症、真性赤血球増加症、原発性骨髄線維症、全身性肥満細胞症、慢性骨髄性白血病、慢性好中球性白血病、慢性好酸球性白血病、環状鉄芽球を伴う不応性貧血、多血球系異形成を伴う不応性血球減少症、過剰なブラストを伴う不応性貧血（１型）、過剰なブラストを伴う不応性貧血（２型）、単独５番染色体長腕（５ｑ）の欠失を伴う骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、分類不能型ＭＤＳ、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＬ）、非定型慢性骨髄性白血病、若年性骨髄単球性白血病、分類不能型骨髄増殖性／骨髄異形成症候群、Ｂリンパ芽球性白血病／リンパ腫、Ｔリンパ芽球性白血病／リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫／白血病、濾胞性リンパ腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫／ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、移植後のリンパ増殖性障害、ＨＩＶに関連するリンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性皮膚Ｂ細胞リンパ腫、有毛細胞白血病、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症、くすぶり型多発性骨髄腫および孤立性形質細胞腫（孤立性の骨および髄外）が挙げられる。
【0037】
本発明の特定の治療レジメンは、ＡＭＬの治療に特に適している。本発明の特定の実施形態では、治療が投与される被験体は、ＡＭＬを有している。ＡＭＬの中で、化学療法不応性ＡＭＬ、例えば、ダウノルビシンまたはイダルビシンと組み合わせてシタラビンを用いた治療に不応性のＡＭＬを、本明細書に開示する方法を用いて、例えば、ＡＢＴ－１９９と組み合わせてイメテルスタットを投与することによって治療することができる。治療に対するＡＭＬの応答は、当該技術分野で知られている。ＡＭＬ応答評価の一例を表１に示す。
【表1】
【0038】
本明細書に記載される薬物の組み合わせは、血液癌（またはそのサブタイプを含む）を含め、ここに述べられている疾患または障害の任意の１つの治療に使用するのに適している。薬物は、同時に投与されてもよく、または逐次投与されてもよい。
【0039】
本明細書に記載される薬物の組み合わせは、血液癌細胞においてアポトーシスを誘導する際に使用するのに適している。薬物は、同時に投与されてもよく、または逐次投与されてもよい。
【0040】
本明細書に記載される組成物は、血液癌（またはそのサブタイプを含む）を含め、ここに述べられている疾患または障害の任意の１つの治療に使用するのに適していることも明らかである。
Ｃ．被験体
Ｃ．被験体
【0041】
被験体は、癌の治療が必要な哺乳動物である。一般的に、被験体は、ヒト患者である。本発明のいくつかの実施形態では、被験体は、非ヒト哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、動物モデル（例えば、医薬のスクリーニング、特性決定、評価に使用されるマウスおよびラットなどの動物）および他の哺乳動物であってもよい。本明細書で使用される場合、患者、被験体および個体との用語は、相互に置き換え可能に使用される。
Ｄ．抗癌薬剤
Ｄ．抗癌薬剤
【0042】
以下の章は、本発明の様々な実施形態で使用される薬物を記述する。これらの薬物はよく知られているため、簡単な論考のみを与える。この章に引用される刊行物は、医師の利益のために薬物の態様を説明することを意図している。しかし、この章または本開示の他の箇所での特定の刊行物の引用は、用量、組み合わせ、適応症を含め、いかなる観点でも本発明を限定することを意図していない。
１．テロメラーゼ阻害剤
１．テロメラーゼ阻害剤
【0043】
テロメラーゼ阻害剤の例としては、限定されないが、イメテルスタット、具体的にはイメテルスタットナトリウムが挙げられる。ある場合には、血液悪性腫瘍を治療するために、１種類または１種類より多いテロメラーゼ阻害剤（例えば、２種類または３種類のテロメラーゼ阻害剤）を哺乳動物に投与してもよい。
【0044】
イメテルスタットナトリウムは、イメテルスタットのナトリウム塩であり、合成的に脂質がコンジュゲートした１３マーのオリゴヌクレオチドＮ３’→Ｐ５’－チオ－ホスホロアミデートである。イメテルスタットナトリウムの化学名は、ＤＮＡ，ｄ（３’－アミノ－３’－デオキシ－Ｐ－チオ）（Ｔ－Ａ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｔ－Ｔ－Ａ－Ｇ－Ａ－Ｃ－Ａ－Ａ），５’－［Ｏ－［２－ヒドロキシ－３－（ヘキサデカノイルアミノ）プロピル］ホスホロチオエート］，ナトリウム塩（１：１３）（配列番号１）である。イメテルスタットおよびイメテルスタットナトリウムは、いずれかの箇所に記載されるように生成され、製剤化され、または得られてもよい（Ａｓａｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、６３（１４）：３９３１－３９３９（２００３）、Ｈｅｒｂｅｒｔら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２４：５２６２－５２６８（２００５）およびＧｒｙａｚｎｏｖ、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓ．、７：４７７－４９３（２０１０））。
【0045】
イメテルスタットおよびイメテルスタットナトリウムは、テロメラーゼのＲＮＡテンプレートを標的とし、様々な癌細胞株およびマウスの腫瘍異種移植片におけるテロメラーゼ活性と細胞増殖を阻害することが示されている。乳癌、非小細胞肺癌および他の固形腫瘍、多発性骨髄腫、または慢性リンパ性白血病の患者が関わる第１相試験は、薬物の薬物動態および薬力学についての情報を与え、体重１ｋｇあたり９．４ｍｇを確立するのに役立った（２時間の静注として与えられる）。本態性血小板血症患者が関わるその後の第２相試験は、ＪＡＫ２ Ｖ６１７ＦおよびＣＡＬＲ変異体対立遺伝子の負荷を有意に減らすことに付随して、血小板を少なくする活性を示した。イメテルスタットナトリウムは、通常、静脈内投与される。本発明の実施において、他の投与経路（例えば、くも膜下腔内投与、腫瘍内注射、経口投与およびその他）も使用可能であることが想定される。イメテルスタットナトリウムは、一般的に臨床で利用される用量に匹敵する用量で投与され得る。好ましい実施形態では、イメテルスタットナトリウムは、本明細書のいずれかの場所に記載されるように投与される。
【0046】
特定の実施形態は、イメテルスタットがイメテルスタットナトリウムに限定される、他の実施形態のいずれか１つに係るものである。
２．Ｂｃｌ－２阻害剤ＡＢＴ－１９９
２．Ｂｃｌ－２阻害剤ＡＢＴ－１９９
【0047】
ＡＢＴ－１９９（ベネトクラックス）は、血小板を温存するファーストインクラスの選択的な傾向ＢＣＬ－２阻害剤を表わす（図１Ｂ）。ＡＢＴ－１９９は、ＢＣＬ－２に対するナノモル濃度未満のアフィニティ（Ｋｉ＜０．０１０ｎＭ）を示し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）およびＣＬＬに対する抗腫瘍活性を有している。ｉｎ ｖｉｖｏマウス異種移植試験は、中悪性度（Ｍｙｃ＋）リンパ腫および急性白血病に対して活性を示した。Ｒ／Ｒ ＮＨＬにおけるＡＢＴ－１９９の第Ｉａ相治験は、２００～９００ｍｇの連続的な毎日の投薬を使用した。７日目に１回分の用量を投与し、その後、２～３週間かけて段階的に漸増させていく導入期間があった。単一薬剤ＡＢＴ－１９９も、高リスクＲ／Ｒ ＡＭＬ患者と、集中的な化学療法に不適合であった未治療患者において、第２相の非盲検多施設治験で試験された。この試験は、患者が１週目（Ｗｋ）の１日目に２０ｍｇのＡＢＴ－１９９を摂取したとき、患者内の用量漸増が可能であった。毎日の漸増は、６日目およびその後毎日の８００ｍｇの最終用量を目的として実施された。第１の計画された評価で（Ｗｋ４終了時）、完全奏効（ＣＲ）、または完全な血液学的回復を伴うＣＲ（ＣＲｉ）がないこれらの患者は、１２００ｍｇまで漸増することが可能であった。リツキシマブと組み合わせたＡＢＴ－１９９の推奨される第２相の用量は、毎日４００ｍｇである。
Ｅ．医薬組成物
Ｅ．医薬組成物
【0048】
また、本発明は、テロメラーゼ阻害剤（例えば、イメテルスタット、特に、イメテルスタットナトリウム）とＢｃｌ－２阻害剤（例えば、ＡＢＴ－１９９）とを含む医薬組成物に関する。一実施形態では、医薬組成物は、イメテルスタット、特にイメテルスタットナトリウム（ｉｍｅｔｅｌｓｔａｔ ｓｏｄｉｕｍ）と、ＡＢＴ－１９９とを含む。一実施形態では、医薬組成物は、イメテルスタット、特にイメテルスタットナトリウム（ｉｍｅｔｅｌｓｔａｔ－ｓｏｄｉｕｍ）と、ＡＢＴ－１９９とを含む。本明細書に記載される薬物の組み合わせは、両方の薬物を含む組成物として被験体に投与されてもよい。
【0049】
担体または希釈剤は、組成物の他の成分と適合性であり、そのレシピエントに有害ではないという観点で、「許容される」ものでなければならない。
【0050】
投与を容易にするために、本明細書に記載される薬物の組み合わせは、投与目的のための様々な医薬形態に製剤化されてもよい。本明細書に記載される薬物の組み合わせは、投与目的のための様々な医薬形態に製剤化されてもよい。適切な組成物として、通常は全身投与する薬物のために使用される、引用された全ての組成物が存在していてもよい。
【0051】
本発明の医薬組成物を調製するために、本明細書に記載する薬物の有効な量の組み合わせを、薬学的に許容される担体との密な混合物として合わせ、担体は、投与に望ましい製剤の形態に依存して、多種多様な形態をしていてもよい。これらの医薬組成物は、特に、経口、直腸、経皮、非経口注射または吸入に適した単位剤形であることが望ましい。ある場合には、投与は、静脈内注射によってでもよい。例えば、経口剤形の組成物を調製する際に、例えば、経口液体製剤（例えば、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤、エマルションおよび液剤）の場合には水、グリコール、油、アルコールなど；または散剤・粉剤（powder）、丸薬、カプセル剤および錠剤の場合には、固体担体、例えば、デンプン、糖類、カオリン、希釈剤、滑沢剤、バインダー、崩壊剤などの任意の通常の医薬媒体を使用してもよい。投与の容易さのため、錠剤およびカプセル剤は、固体医薬担体が明らかに使用される場合には、最も有利な経口単位剤形を表す。非経口組成物の場合、担体は、通常は、滅菌水を少なくとも大部分に含むが、他の成分（例えば、溶解度を補助するための成分）が含まれていてもよい。注射可能な液剤は、例えば、担体が食塩水溶液、グルコース溶液、または食塩水とグルコース溶液の混合物を含むように調製されてもよい。注射可能な液剤は、例えば、担体が食塩水溶液、グルコース溶液、または食塩水とグルコース溶液の混合物を含むように調製されてもよい。本明細書に記載する薬剤の組み合わせを含む注射可能な液剤は、長期間作用するために油中に製剤化されてもよい。この目的のための適切な油は、例えば、ピーナッツ油、ゴマ油、綿実油、トウモロコシ油、大豆油、長鎖脂肪酸の合成グリコールエステル、およびこれらの油と他の油の混合物である。注射可能な懸濁剤は、適切な液体担体、懸濁化剤などが使用され得る場合には調製されてもよい。使用のすぐ前に液体形態の製剤に変換されることを意図した固体形態の製剤も含まれる。皮下投与に適した組成物において、担体は、必要に応じて、浸透促進剤および／または適切な湿潤剤を含み、必要に応じて、少量の任意の性質を有する適切な添加剤と合わされ、添加剤は、皮膚に対して顕著に有害な影響を与えない。この添加剤は、皮膚への投与を促進してもよく、および／または所望の組成物を調製するのに役立ってもよい。これらの組成物は、様々な様式で、例えば、経皮パッチとして、スポットオン型として、軟膏として投与されてもよい。
【0052】
投与を容易にし、投薬の均一性を容易にするために、上述の医薬組成物を単位剤形で製剤化するのが特に有利である。本明細書で使用する単位剤形は、単一投薬に適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要な医薬担体と関連して所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性成分を含んでいる。このような単位剤形の例は、錠剤（割線入りのまたは被覆された錠剤を含む）、カプセル剤、丸薬、パウダーパケット、カシェ剤（wafer）、坐剤、注射用液剤または懸濁剤など、およびそれらを分離した複数個（segregated multiples thereof）である。
【0053】
医薬組成物において本明細書に記載される組み合わせ中の薬物の溶解度および／または安定性を高めるために、α－、β－またはγ－シクロデキストリンまたはその誘導体、特に、ヒドロキシアルキル置換されたシクロデキストリン、例えば２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンまたはスルホブチル－β－シクロデキストリンを使用することが有利な場合がある。また、アルコールなどの共溶媒が、医薬組成物中の本発明による化合物の溶解度および／または安定性を高める場合がある。
【0054】
投与態様に応じて、医薬組成物は、好ましくは０．０５～９９重量％、より好ましくは０．１～７０重量％、さらにより好ましくは０．１～５０重量％の薬物を、本明細書に記載した組み合わせで含み、１～９９．９５重量％、より好ましくは３０～９９．９重量％、さらにより好ましくは５０～９９．９重量％の薬学的に許容される担体を含み、全てのパーセントは、組成物の合計重量を基準としたものである。
【0055】
投与頻度は、哺乳動物に対して顕著な毒性を与えることなく、血液悪性腫瘍の症状の重篤度を減らす（例えば、骨髄線維症を減らすか、または逆行させる）任意の頻度であってもよい。例えば、投与頻度は、２ヶ月ごとに約１回から１週間に約１回、または１ヶ月に約１回から１ヶ月に約２回、または６週間ごとに約１回から１ヶ月に約２回であってもよい。投与頻度は、一定のままであってもよく、または治療持続期間中に変動してもよい。１種類以上のテロメラーゼ阻害剤を含む組成物を用いた一連の治療は、休薬期間を含んでいてもよい。例えば、テロメラーゼ阻害剤とＢｃｌ－２阻害剤とを含む組成物は、３週間の期間、毎週投与され、その後、２週間の休薬期間があってもよく、このようなレジメンが複数回繰り返されてもよい。有効な量を用いる場合、様々な因子が、特定の用途に使用される実際の投与頻度に影響を与えることがある。例えば、有効な量、治療の継続期間、複数の治療薬剤の使用、投与経路、血液悪性腫瘍の重篤度が、投与頻度を上げるか、または下げるのに必要な場合がある。
【0056】
テロメラーゼ阻害剤（例えば、イメテルスタットまたはイメテルスタットナトリウム）とＢｃｌ－２阻害剤（例えば、ＡＢＴ－１９９）とを含む組成物を投与するための有効継続期間は、哺乳動物に顕著な毒性を与えることなく、血液悪性腫瘍の症状の重篤度を減らす（例えば、骨髄線維症を減らすか、または逆行させる）任意の継続期間であってもよい。したがって、有効継続期間は、１ヶ月から数ヶ月または数年まで、さまざまであってよい（例えば、１ヶ月から２年まで、１ヶ月から１年まで、３ヶ月から２年まで、３ヶ月から１０ヶ月まで、または３ヶ月から１８ヶ月まで）。一般的に、血液悪性腫瘍を治療するための有効継続期間は、２ヶ月から２０ヶ月までの継続期間の範囲であってもよい。ある場合には、有効継続期間は、個々の哺乳動物が生きている限りずっとであってもよい。特定の治療に使用される実際の有効継続期間に、複数の因子が影響を与えることがある。例えば、有効継続期間は、投与頻度、有効な量、複数の治療薬剤の使用、投与経路、血液悪性腫瘍の重篤度によって変動してもよい。
【0057】
特定の場合には、血液悪性腫瘍に関連する１つ以上の症状の一連の治療と重篤度をモニタリングしてもよい。血液悪性腫瘍の症状の重篤度が下がっているか否かを決定するために、任意の方法を使用してもよい。例えば、血液悪性腫瘍（例えば、骨髄線維症）の症状の重篤度は、生検技術を用いて評価することができる。
【0058】
「医薬的に許容される塩」との用語は、患者、例えば、哺乳動物への投与のために許容される塩を意味する（所与の投薬レジメンのための許容される哺乳動物安全性を有する対イオンを含む塩）。このような塩は、薬学的に許容される無機または有機の塩基と、薬学的に許容される無機または有機の酸とから誘導されてもよい。「医薬的に許容される塩」は、ある化合物の医薬的に許容される塩を指し、塩は、当該技術分野でよく知られている種々の有機および無機の対イオンから誘導され、単なる例として、ナトリウムなどが挙げられ、この分子が塩基官能基を含む場合、有機または無機の酸の塩（例えば塩酸塩など）。目的の医薬的に許容される塩としては、限定されないが、アルミニウム、アンモニウム、アルギニン、バリウム、ベンザチン、カルシウム、コリン酸、エチレンジアミン、リシン、リチウム、マグネシウム、メグルミン、プロカイン、カリウム、ナトリウム、トロメタミン、Ｎ－メチルグルカミン、Ｎ，Ｎ'－ジベンジルエチレン－ジアミン、クロロプロカイン、ジエタノールアミン、エタノールアミン、ピペラジン、亜鉛、ジイソプロピルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミンおよびトリエタノールアミンの塩が挙げられる。
【0059】
「その塩（複数可）」との用語は、酸のプロトンがカチオン（例えば、金属カチオンまたは有機カチオンなど）で置き換えられたときに作られる化合物を意味する。好ましくは、塩は、医薬的に許容される塩である。例として、本発明の化合物の塩は、該化合物が無機酸または有機酸によってプロトン化され、該塩のアニオン性成分としての該無機酸または有機酸の共役塩基により、カチオンを生成する塩が挙げられる。目的の塩としては、限定されないが、アルミニウム、アンモニウム、アルギニン、バリウム、ベンザチン、カルシウム、セシウム、コリン酸、エチレンジアミン、リチウム、マグネシウム、メグルミン、プロカイン、Ｎ－メチルグルカミン、ピペラジン、カリウム、ナトリウム、トロメタミン、亜鉛、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレン－ジアミン、クロロプロカイン、ジエタノールアミン、エタノールアミン、ピペラジン、ジイソプロピルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミンおよびトリエタノールアミンの塩が挙げられる。ヌクレオチド間結合の骨格を含む本明細書に示される任意のオリゴヌクレオチド構造について、このようなオリゴヌクレオチドは、任意の従来の塩形態を含んでいてもよいことが理解される。いくつかの実施形態では、酸性形態のヌクレオチド間結合が、単純化のために示されている。ある場合には、本主題の化合物の塩は、一価カチオン塩である。特定の場合には、本主題の化合物の塩は、二価カチオン塩である。ある場合には、本主題の化合物の塩は、三価カチオン塩である。「溶媒和物」は、溶媒分子と、溶質の分子またはイオンとの組み合わせによって作られる複合体を指す。溶媒は、有機化合物、無機化合物、またはこれら両方の混合物であってもよい。溶媒のいくつかの例としては、限定されないが、メタノール、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシドおよび水が挙げられる。溶媒が水である場合、生成する溶媒和物は、水和物である。
【0060】
「立体異性体（stereoisomer）」および「立体異性体（stereoisomers）」は、同じ原子結合を有するが、空間内の原子配置が異なる化合物を指す。立体異性体は、例えば、ｃｉｓ－ｔｒａｎｓ異性体、ＥおよびＺ異性体、エナンチオマー、およびジアステレオマーを含む。１つ以上の置換基を含む本明細書に開示される基のいずれかのように、もちろん、このような基が、立体的に実施不可能おであり、および／または合成的に実施不可能な任意の置換または置換パターンを含まないことが理解される。全ての立体異性体が、本開示の範囲内に含まれることが意図されている。
【0061】
当業者は、本明細書に記載する基の他の互変異性の配置が可能であることを理解するだろう。主題化合物の全ての互変異性体形態は、具体的に示されていない場合であっても、その化合物の基の１つの可能な互変異性体配置が記載される構造によって包含されると理解される。
【0062】
主題となる化合物の立体異性体の互変異性体の医薬的に許容される塩の溶媒和物を含むことが意図されている。これらは、本開示の範囲内に含まれることが意図されている。
Ｆ．投与および投与レジメン
Ｆ．投与および投与レジメン
【0063】
血液癌の治療の場合、テロメラーゼ阻害剤（例えば、イメテルスタットまたはイメテルスタットナトリウム）とＢｃｌ－２阻害剤（例えば、ＡＢＴ－１９９、ＡＢＴ－２６３およびＡＢＴ－７３７）とを組み合わせて、治療を必要とする被験体に投与してもよい。この方法で治療可能な癌の例は、急性骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ、ＡＭＬ）（急性骨髄球性白血病（ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）とも呼ばれる）、急性骨髄性白血病、急性顆粒球性白血病または急性非リンパ性白血病である。急性白血病において、白血病細胞は、急速に成長と分裂を行う未成熟な血液細胞（ブラストと呼ばれる）である。治療を行わないと、急性白血病患者の大部分は、わずか数ヶ月しか生存できないだろう。
【0064】
本発明で使用されるテロメラーゼ阻害剤およびＢｃｌ－２阻害剤は、治療に有効な任意の用量（例えば、一般的に臨床的に使用される用量に匹敵する用量）で投与されてもよい。既知の承認されている抗癌剤の具体的な投薬レジメン（例えば、推奨されている有効な用量）は、医師には知られてり、例えば、ＰＨＹＳＩＣＩＡＮＳ’ ＤＥＳＫ ＲＥＦＥＲＥＮＣＥ、２００３、５７ｔｈ Ｅｄ．、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｉｎｃ．、Ｏｒａｄｅｌｌ、Ｎ．Ｊ．；Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ ＴＨＥ ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ ＢＡＳＩＳ ＯＦ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ" ２００１、１０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに見出される製品の記載から与えられるか、および／またはＦｅｄｅｒａｌ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎから入手可能であるか、および／または医薬文献に記載されている。
【0065】
ある態様では、被験体に投与されるテロメラーゼ阻害剤イメテルスタットナトリウムの用量は、約１．０ｍｇ／ｋｇ～約１３．０ｍｇ／ｋｇである。別の態様では、テロメラーゼ阻害剤の用量は、約６．５ｍｇ／ｋｇ～約１１．７ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、テロメラーゼ阻害剤の用量は、約６．５ｍｇ／ｋｇ、６．６ｍｇ／ｋｇ、６．７ｍｇ／ｋｇ、６．８ｍｇ／ｋｇ、６．９ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、７．１ｍｇ／ｋｇ、７．２ｍｇ／ｋｇ、７．３ｍｇ／ｋｇ、７．４ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、７．６ｍｇ／ｋｇ、７．７ｍｇ／ｋｇ、７．８ｍｇ／ｋｇ、７．９ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、８．１ｍｇ／ｋｇ、８．２ｍｇ／ｋｇ、８．３ｍｇ／ｋｇ、８．４ｍｇ／ｋｇ、８．５ｍｇ／ｋｇ、８．６ｍｇ／ｋｇ、８．７ｍｇ／ｋｇ、８．８ｍｇ／ｋｇ、８．９ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、９．１ｍｇ／ｋｇ、９．２ｍｇ／ｋｇ、９．３ｍｇ／ｋｇ、９．４ｍｇ／ｋｇ、９．５ｍｇ／ｋｇ、９．６ｍｇ／ｋｇ、９．７ｍｇ／ｋｇ、９．８ｍｇ／ｋｇ、９．９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１０．１ｍｇ／ｋｇ、１０．２ｍｇ／ｋｇ、１０．３ｍｇ／ｋｇ、１０．４ｍｇ／ｋｇ、１０．５ｍｇ／ｋｇ、１０．６ｍｇ／ｋｇ、１０．７ｍｇ／ｋｇ、１０．８ｍｇ／ｋｇ、１０．９ｍｇ／ｋｇ、１１ｍｇ／ｋｇ、１１．１ｍｇ／ｋｇ、１１．２ｍｇ／ｋｇ、１１．３ｍｇ／ｋｇ、１１．４ｍｇ／ｋｇ、１１．５ｍｇ／ｋｇ、１１．６ｍｇ／ｋｇ、１１．７ｍｇ／ｋｇ、１１．８ｍｇ／ｋｇ、１１．９ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１２．１ｍｇ／ｋｇ、１２．２ｍｇ／ｋｇ、１２．３ｍｇ／ｋｇ、１２．４ｍｇ／ｋｇ、１２．５ｍｇ／ｋｇ、１２．６ｍｇ／ｋｇ、１２．７ｍｇ／ｋｇ、１２．８ｍｇ／ｋｇ、１２．９ｍｇ／ｋｇまたは１３ｍｇ／ｋｇのうち少なくともいずれかを含む。
【0066】
いくつかの実施形態では、個体に投与されるテロメラーゼ阻害剤の有効な量は、約１ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、３．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６．５ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、９．４ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇのうち少なくともいずれかを含む。様々な実施形態では、個体に投与されるテロメラーゼ阻害剤の有効な量は、約３５０ｍｇ／ｋｇ、３００ｍｇ／ｋｇ、２５０ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、６．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、３．５ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、または０．５ｍｇ／ｋｇのいずれかより少ないテロメラーゼ阻害剤を含む。
【0067】
医薬組成物（例えば、テロメラーゼ阻害剤を含む医薬組成物、および／またはＢｃｌ－２阻害剤を含む医薬組成物）の例示的な投薬頻度としては、限定されないが、毎日；１日おき；週に２回；週に３回；中断なく毎週；４週間のうち３週間は毎週；３週間ごとに１回；２週間ごとに１回；３週間のうち２週間は毎週を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、おおよそ、１週間ごとに１回、２週間ごとに１回、３週間ごとに１回、４週間ごとに１回、６週間ごとに１回、または８週間ごとに１回投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、おおよそ、少なくとも、１週間に１回、２回、３回、４回、５回、６回または７回（すなわち、毎日）、または毎日３回、毎日２回投与される。いくつかの実施形態では、各投与間の間隔は、おおよそ、６ヶ月、３ヶ月、１ヶ月、２０日間、１５日間、１２日間、１０日間、９日間、８日間、７日間、６日間、５日間、４日間、３日間、２日間または１日のいずれかより短い。いくつかの実施形態では、各投与間の間隔は、約１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、８ヶ月または１２ヶ月のいずれかより長い。いくつかの実施形態では、投与計画の中に中断はない。いくつかの実施形態では、各投与間の間隔は、約１週間を超えない。
【0068】
テロメラーゼ阻害剤、例えば、イメテルスタットまたはイメテルスタットナトリウムは、任意の適切な方法を用いて投与されてもよい。例えば、テロメラーゼ阻害剤、例えば、イメテルスタットまたはイメテルスタットナトリウムは、ある期間にわたって（例えば、１時間、２時間、３時間、４時間または５時間）、４週間ごとに１回、静脈内投与されてもよい。一実施形態では、イメテルスタットは、週に１回、約２時間の期間に７～１０ｍｇ／ｋｇが静脈内投与される。別の実施形態では、イメテルスタットは、３週間ごとに１回、約２時間の期間に２．５～７ｍｇ／ｋｇが静脈内投与される。さらに別の実施形態では、イメテルスタットは、４週間ごとに１回、約２時間の期間に０．５～５ｍｇ／ｋｇが静脈内投与される。別の実施形態では、イメテルスタットは、３週間ごとに１回、約２時間の期間に２．５～１０ｍｇ／ｋｇが静脈内投与される。さらに別の実施形態では、イメテルスタットは、４週間ごとに１回、約２時間の期間に０．５～９．４ｍｇ／ｋｇが静脈内投与される。
【0069】
このような場合に、Ｂｃｌ－２阻害剤であるＡＢＴ－１９９を用いて治療するとき、ＡＢＴ－１９９の用量は、約４００ｍｇ ＰＯ ｑＤａｙまたはそれより少なくてもよい。例えば、血液悪性腫瘍を有すると特定されたヒトは、（ａ）２０ｍｇ ＰＯ ｑｄａｙ、（ｂ）５０ｍｇ ＰＯ ｑＤａｙ、（ｃ）１００ｍｇ ＰＯ ｑＤａｙ、（ｄ）２００ｍｇ ＰＯ ｑＤａｙ、または（ｅ）４００ ｍｇ ＰＯ ｑＤａｙの用量のＡＢＴ－１９９で治療されてもよい。別の実施形態では、ＡＢＴ－１９９は、５週間にわたって、推奨される１日用量４００ｍｇまで毎週漸増していく計画に従い、１週目は２０ｍｇ ＰＯ ｑＤａｙで開始し、２週目は５０ｍｇ ＰＯ ｑＤａｙ、３週目は１００ｍｇ ＰＯ ｑＤａｙ、４週目は２００ｍｇ ＰＯ ｑＤａｙ、および５週目とそれから先は４００ｍｇ ＰＯ ｑＤａｙを投与する。別の実施形態では、ＡＢＴ－１９９は、４００ｍｇ ＰＯ ｑＤａｙで投与する。別の実施形態では、投薬は、疾患が進行するか、または受け入れられない毒性が出るまで続けられる。
【0070】
癌治療は、時に、薬物投与の複数「回」または「サイクル」を含み、各サイクルが、特定の計画にしたがった１回以上の薬物投与を含むことが理解されるだろう（例えば、３週間ごとに連続した３日間、１週間に１回など）。例えば、抗癌薬物は、１～８サイクル、またはさらに長い期間投与されてもよい。１種類より多い薬物（例えば、２種類の薬物）が被験体に投与される場合、それぞれは、それ自体の計画に従って投与されてもよい（例えば、毎週、３週間ごとに１回など）。薬物投与は、異なる周期で投与された場合であっても、両方の薬物が、少なくともいくつかの時間で同じ日に投与されるように調整することができ、または、あるいは薬物が、少なくともいくつかの時間で連続した日に投与されるように調整することができることは明らかである。
【0071】
テロメラーゼ阻害剤（例えば、イメテルスタットまたはイメテルスタットナトリウム）とＢｃｌ－２阻害剤（例えば、ＡＢＴ－１９９またはＶｅｎｅｔｅｃｌａｘ）が組み合わせて投与される治療レジメンでは、これらは任意の順序で投与されてもよい。特定の実施形態では、テロメラーゼ阻害剤は、Ｂｃｌ－２阻害剤の投与の１日前、１日後、または同じ日に投与される。医師によって決定されるように、他の計画を使用してもよいことが理解される。
【0072】
当該技術分野で理解されるように、癌治療薬を用いた治療は、毒性が観察されたときに、患者の簡便さのために、本発明の範囲から逸脱することなく一時的に中断され、その後再開されてもよい。
Ｇ．組み合わせの投与
Ｇ．組み合わせの投与
【0073】
薬物が、同じ一連の治療の一部として投与される場合、２種類または３種類の薬物を被験体に「組み合わせて」投与する。一連の治療は、相加的に、相補的に、相乗的に、または他の様式で単一薬物の投与について予想されるよりも望ましい結果を与えるような、医学専門家が一緒に作用すると考える薬物の組み合わせの投与を指す。一連の治療は、１日または数日間であってもよいが、もっと多くは、数週間続く。
【0074】
したがって、組み合わせた投与の例は、１日目から開始し、イメテルスタットを２８日間ごとに１回、１～４サイクル投与し、ＡＢＴ－１９９を、１日目から開始し、７日間ごとに１回、４サイクル投与することである。ある実施形態では、ＡＢＴ－１９９の投与は、１日目、－１日目、または２日目、またはそのサイクル内の別の日に開始する。ある実施形態では、組み合わせた投与の例は、１日目から開始し、イメテルスタットを２８日間ごとに１回、１～４サイクル投与し、ＡＢＴ－１９９を、１日目から開始して２８日間毎日１回、１～４サイクル投与することである。
【0075】
２種類の薬物が組み合わせて投与される場合、種々の計画が使用可能である。ある場合には、例えば、限定されないが、まず、薬物１が、薬物２の投与前に投与され、薬物１を用いた治療が、薬物２投与の経過の間ずっと続けられる。または、薬物２の治療を開始した後、または終了した後に薬物１が投与される。または、まず、他の癌治療の開始と同時期に、薬物１が、投与される。この状況で使用される場合、「同時期に」は、この２種類の薬物が同じ日に投与されるか、または連続した日に投与されることを意味する。
【0076】
原則として、特定の薬物を一緒に製剤化してもよいが、一般的に、特定の薬物は、別個の組成物で投与する。同様に、特定の薬物は、同時に投与されてもよいが、さらに多くは（特に、注入によって投与される薬物の場合）、薬物は、同じ日の異なる時間、または連続した日に、または別の計画に従って投与される。
【0077】
本発明は、テロメラーゼ阻害剤とＢｃｌ－２阻害剤とを含む組み合わせにも関する。特に、テロメラーゼ阻害剤はイメテルスタットであり、Ｂｃｌ－２阻害剤はＡＢＴ－１９９である。特に、テロメラーゼ阻害剤はイメテルスタットナトリウムであり、Ｂｃｌ－２阻害剤はＡＢＴ－１９９である。
【0078】
本発明は、医薬として使用するためのテロメラーゼ阻害剤とＢｃｌ－２阻害剤とを含む組み合わせにも関する。特に、テロメラーゼ阻害剤はイメテルスタットであり、Ｂｃｌ－２阻害剤はＡＢＴ－１９９である。特に、テロメラーゼ阻害剤はイメテルスタットナトリウムであり、Ｂｃｌ－２阻害剤はＡＢＴ－１９９である。
Ｈ．診断
Ｈ．診断
【0079】
ＡＭＬの診断のために、Ｍａｙ－Ｇｒｕｅｎｗａｌｄ－ＧｉｅｍｓａまたはＷｒｉｇｈｔ－Ｇｉｅｍｓａ染色を用い、血液および骨髄の塗抹は、形態学的に試験される。血液塗抹標本に少なくとも２００個の白血球、骨髄の塗抹に５００個の有核細胞が計測されることが推奨され、後者は、スピクラを含むことが推奨される。ＡＭＬの診断のために、ｔ（１５；１７）、ｔ（８；２１）、ｉｎｖ（１６）またはｔ（１６；１６）を有するＡＭＬおよび赤白血病の一部の症例を除き、骨髄または血液ブラストの計測数が２０％以上であることが必要である。骨髄芽球、単芽球および巨核芽球がブラスト計測数に含まれる。単球性または骨髄単球性の分化を伴うＡＭＬでは、単芽球および前単球が、異常な単球というわけではないが、ブラスト等価物として計測される。赤芽球は、稀な純粋な赤白血病の場合を除き、ブラストとして計測されない。
Ｉ．キット
Ｉ．キット
【0080】
本発明は、テロメラーゼ阻害剤とＢｃｌ－２阻害剤とを含むキットにも関する。血液癌を治療する際に使用するためのテロメラーゼ阻害剤とＢｃｌ－２阻害剤とを含むキットも提供される。このような治療は、ある場合には、テロメラーゼ阻害剤を投与する前、投与した後、または投与と同時に、Ｂｃｌ－２阻害剤を被験体に投与することを含む。ある場合には、テロメラーゼ阻害剤は、イメテルスタットである。
【0081】
関連する態様では、本発明は、被験体において癌細胞の増殖を阻害するのに有効な量の用量のテロメラーゼ阻害剤を含むキットを提供する。キットは、ある場合には、テロメラーゼ阻害剤の投与のための指示を含む添付文書を含む。添付文書は、Ｂｃｌ－２阻害剤と組み合わせて上記阻害剤を使用するための１セットの指示をユーザに与えてもよい。ある場合には、Ｂｃｌ－２阻害剤は、ＡＢＴ－１９９である。
【0082】
ある場合には、併用療法のための指示のセットは、（ｉ）Ｂｃｌ－２阻害剤と組み合わせて使用される場合、少ない用量のテロメラーゼ阻害剤、（ｉｉ）テロメラーゼ阻害剤と組み合わせて使用される場合、少ない用量のＢｃｌ－２阻害剤、および／または（ｉｉｉ）片方または両方の阻害剤について通常推奨されるものとは異なる投薬レジメンが推奨されてもよい。
【0083】
この段落において、上のいくつかの場合には、テロメラーゼ阻害剤はイメテルスタットであり、ある場合には、テロメラーゼ阻害剤はイメテルスタットナトリウムであり、ある場合には、Ｂｃｌ－２阻害剤はＡＢＴ－１９９であることが明らかである。
Ｊ．例示的な実施形態
Ｊ．例示的な実施形態
【0084】
本発明の例示的な一実施形態は、テロメラーゼ阻害剤とＢｃｌ－２阻害剤とを組み合わせて、血液癌の治療が必要な被験体に投与することを含む治療方法である。特定の実施形態では、テロメラーゼ阻害剤は、イメテルスタットである。代替の実施形態では、Ｂｃｌ－２阻害剤は、ＡＢＴ－１９９、ＡＢＴ－２６３またはＡＢＴ－７３７である。さらに別の実施形態では、Ｂｃｌ－２阻害剤は、ＡＢＴ－１９９である。一実施形態では、テロメラーゼ阻害剤はイメテルスタットであり、Ｂｃｌ－２阻害剤はＡＢＴ－１９９である。
【0085】
血液癌は、ＡＭＬ、本態性血小板血症、真性赤血球増加症、原発性骨髄線維症、全身性肥満細胞症、慢性骨髄性白血病、慢性好中球性白血病、慢性好酸球性白血病、環状鉄芽球を伴う不応性貧血、多血球系異形成を伴う不応性血球減少症、過剰なブラストを伴う不応性貧血（１型）、過剰なブラストを伴う不応性貧血（２型）、単独５番染色体長腕（５ｑ）の欠失を伴う骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、分類不能型ＭＤＳ、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＬ）、非定型慢性骨髄性白血病、若年性骨髄単球性白血病、分類不能型骨髄増殖性／骨髄異形成症候群、Ｂリンパ芽球性白血病／リンパ腫、Ｔリンパ芽球性白血病／リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫／白血病、濾胞性リンパ腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫／ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、移植後のリンパ増殖性障害、ＨＩＶに関連するリンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性皮膚Ｂ細胞リンパ腫、有毛細胞白血病、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症、くすぶり型多発性骨髄腫および孤立性形質細胞腫（孤立性の骨および髄外）であってもよい。一実施形態では、血液癌は、ＡＭＬである。
【0086】
特定の実施形態では、テロメラーゼ阻害剤イメテルスタットは、１、２、３、４、５、６、７、８、または８より多い投薬サイクルで投与され、各サイクルが、（ａ）約７～１０ｍｇ／ｋｇのそのイメテルスタットを４週間ごとに１回静脈内投与；（ｂ）約７～１０ｍｇ／ｋｇのイメテルスタットを、毎週１回を４週間静脈内投与；（ｃ）約２．５～７ｍｇ／ｋｇのイメテルスタットを３週間ごとに１回静脈内投与；または（ｄ）約０．５～９．４ｍｇ／ｋｇのイメテルスタットを４週間ごとに１回静脈内投与を含む。イメテルスタットは、イメテルスタットナトリウムであってもよい。
【0087】
特定の実施形態では、ＡＢＴ－１９９は、（ａ）毎日、約５０～４００ｍｇのＡＢＴ－１９９の用量で；（ｂ）１日目に約２ｍｇのＡＢＴ－１９９の用量で、その後６日目に約８００ｍｇの最終用量になるまで毎日増量し、６日目以降は毎日その最終用量で；または（ｃ）１日目に２５ｍｇのＡＢＴ－１９９の用量で、その後５日目に約４００ｍｇの最終用量になるまで毎日増量し、５日目以降は毎日その最終用量で投与する。ＡＢＴ－１９９の投与は、テロメラーゼ阻害剤の投与の１日前、１日後、または同じ日であってもよい。
【0088】
本発明の別の実施形態は、血液癌細胞においてアポトーシスを誘導する方法であって、前記細胞と治療に有効な量のテロメラーゼ阻害剤とを接触させることと、前記細胞と治療に有効な量のＢｃｌ－２阻害剤とを接触させることとを含む、方法である。本方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで行われてもよい。一実施形態では、テロメラーゼ阻害剤は、イメテルスタットである。別の実施形態では、イメテルスタットは、イメテルスタットナトリウムである。この方法では、Ｂｃｌ－２阻害剤は、ＡＢＴ－１９９である。特定の実施形態では、血液癌細胞は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、本態性血小板血症、真性赤血球増加症、原発性骨髄線維症、全身性肥満細胞症、慢性骨髄性白血病、慢性好中球性白血病、慢性好酸球性白血病、環状鉄芽球を伴う不応性貧血、多血球系異形成を伴う不応性血球減少症、過剰なブラストを伴う不応性貧血（１型）、過剰なブラストを伴う不応性貧血（２型）、単独５番染色体長腕（５ｑ）の欠失を伴う骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、分類不能型ＭＤＳ、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＬ）、非定型慢性骨髄性白血病、若年性骨髄単球性白血病、分類不能型骨髄増殖性／骨髄異形成症候群、Ｂリンパ芽球性白血病／リンパ腫、Ｔリンパ芽球性白血病／リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫／白血病、濾胞性リンパ腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫／ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、移植後のリンパ増殖性障害、ＨＩＶに関連するリンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性皮膚Ｂ細胞リンパ腫、有毛細胞白血病、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症、くすぶり型多発性骨髄腫および孤立性形質細胞腫（孤立性の骨および髄外）の種類の癌に由来する細胞であってもよい。一実施形態では、血液癌細胞は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞である。
【0089】
本発明は、併用療法のためのキットも提供する。したがって、本発明の一実施形態は、キットであって、（ａ）投与されると、血液癌細胞においてアポトーシスを誘導するのに有効な量の用量のテロメラーゼ阻害剤と、（ｂ）投与されると、血液癌細胞においてアポトーシスを誘導するのに有効な量の用量のＢｃｌ－２阻害剤とを含む、キットである。このキットの一実施形態では、テロメラーゼ阻害剤はイメテルスタットであり、Ｂｃｌ－２阻害剤はＡＢＴ－１９９である。
【0090】
本発明の一実施形態は、血液癌の治療に使用するためのテロメラーゼ阻害剤（例えばイメテルスタット／イメテルスタットナトリウム）とＢＣＬ－２阻害剤（例えばＡＢＴ－１９９）とを含む医薬組成物である。一実施形態では、医薬組成物は、イメテルスタット／イメテルスタットナトリウムとＡＢＴ－１９９とを含む。
【0091】
本発明の別の実施形態は、血液癌を治療する方法において使用するためのテロメラーゼ阻害剤であって、この方法が、治療を必要とする被験体に、テロメラーゼ阻害剤とＢｃｌ－２阻害剤とを組み合わせて投与することを含む、テロメラーゼ阻害剤である。本発明のさらに別の実施形態は、血液癌を治療する方法において使用するためのＢｃｌ－２阻害剤であって、この方法が、治療を必要とする被験体に、Ｂｃｌ－２阻害剤とテロメラーゼ阻害剤とを組み合わせて投与することを含む、Ｂｃｌ－２阻害剤である。本発明の代替の実施形態は、血液癌を治療する方法において使用するためのテロメラーゼ阻害剤とＢｃｌ－２阻害剤との組み合わせであって、この方法が、治療を必要とする被験体に、この組み合わせを投与することを含む、組み合わせである。これらの実施形態では、テロメラーゼ阻害剤とＢｃｌ－２阻害剤の組み合わせは、血液癌細胞のアポトーシスを誘導する。これらの実施形態では、テロメラーゼ阻害剤は、イメテルスタットであってもよい。一実施形態では、イメテルスタットは、イメテルスタットナトリウムである。また、これらの実施形態では、Ｂｃｌ－２阻害剤は、ＡＢＴ－１９９であってもよい。イメテルスタットは、１、２、３、４、５、６、７、８、または８より多い投薬サイクルで投与するためのものであってもよく、各サイクルが、（ａ）約７～１０ｍｇ／ｋｇのイメテルスタットを４週間ごとに１回静脈内投与；（ｂ）約７～１０ｍｇ／ｋｇのイメテルスタットを、毎週１回を約４週間静脈内投与；または（ｃ）約２．５～７ｍｇ／ｋｇのイメテルスタットを３週間ごとに１回静脈内投与；または（ｄ）約０．５～９．４ｍｇ／ｋｇのイメテルスタットを４週間ごとに１回静脈内投与を含む。ＡＢＴ－１９９は、（ａ）毎日、約５０～４００ｍｇのＡＢＴ－１９９の用量で；（ｂ）１日目に約２ｍｇのＡＢＴ－１９９の用量で、その後６日目に約８００ｍｇの最終用量になるまで毎日増量し、６日目以降は毎日その最終用量で；または（ｃ）１日目に約２５ｍｇのＡＢＴ－１９９の用量で、その後５日目に４００ｍｇの最終用量になるまで毎日増量し、５日目以降は毎日その最終用量で投与するためのものであってもよい。特定の実施形態では、ＡＢＴ－１９９の投与は、テロメラーゼ阻害剤の投与の１日前、１日後、または同じ日である。
【0092】
テロメラーゼ阻害剤、Ｂｃｌ－２阻害剤、または組み合わせの複数の実施形態では、血液癌は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、本態性血小板血症、真性赤血球増加症、原発性骨髄線維症、全身性肥満細胞症、慢性骨髄性白血病、慢性好中球性白血病、慢性好酸球性白血病、環状鉄芽球を伴う不応性貧血、多血球系異形成を伴う不応性血球減少症、過剰なブラストを伴う不応性貧血（１型）、過剰なブラストを伴う不応性貧血（２型）、単独５番染色体長腕（５ｑ）の欠失を伴う骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、分類不能型ＭＤＳ、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＬ）、非定型慢性骨髄性白血病、若年性骨髄単球性白血病、分類不能型骨髄増殖性／骨髄異形成症候群、Ｂリンパ芽球性白血病／リンパ腫、Ｔリンパ芽球性白血病／リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫／白血病、濾胞性リンパ腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫／ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、移植後のリンパ増殖性障害、ＨＩＶに関連するリンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性皮膚Ｂ細胞リンパ腫、有毛細胞白血病、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症、くすぶり型多発性骨髄腫および孤立性形質細胞腫（孤立性の骨および髄外）であってもよい。一実施形態では、血液癌は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。
【0093】
本発明の代替の実施形態は、血液癌細胞におけるアポトーシスを誘導するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、前記細胞と治療に有効な量のテロメラーゼ阻害剤とを接触させることと、前記細胞と治療に有効な量のＢｃｌ－２阻害剤とを接触させることとを含む、方法である。一実施形態では、テロメラーゼ阻害剤は、イメテルスタットである。イメテルスタットは、イメテルスタットナトリウムであってもよい。Ｂｃｌ－２阻害剤は、ＡＢＴ－１９９であってもよい。
【0094】
このｉｎ ｖｉｔｒｏ方法の特定の実施形態では、血液癌細胞は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、本態性血小板血症、真性赤血球増加症、原発性骨髄線維症、全身性肥満細胞症、慢性骨髄性白血病、慢性好中球性白血病、慢性好酸球性白血病、環状鉄芽球を伴う不応性貧血、多血球系異形成を伴う不応性血球減少症、過剰なブラストを伴う不応性貧血（１型）、過剰なブラストを伴う不応性貧血（２型）、単独５番染色体長腕（５ｑ）の欠失を伴う骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、分類不能型ＭＤＳ、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＬ）、非定型慢性骨髄性白血病、若年性骨髄単球性白血病、分類不能型骨髄増殖性／骨髄異形成症候群、Ｂリンパ芽球性白血病／リンパ腫、Ｔリンパ芽球性白血病／リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫／白血病、濾胞性リンパ腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫／ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、移植後のリンパ増殖性障害、ＨＩＶに関連するリンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性皮膚Ｂ細胞リンパ腫、有毛細胞白血病、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症、くすぶり型多発性骨髄腫および孤立性形質細胞腫（孤立性の骨および髄外）の種類の癌に由来する細胞である。このｉｎ ｖｉｔｒｏ方法の一実施形態では、血液癌細胞は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞である。
【0095】
本発明のさらに別の実施形態は、テロメラーゼ阻害剤とＢｃｌ－２阻害剤とを含む組み合わせである。一実施形態では、テロメラーゼ阻害剤はイメテルスタットであり、Ｂｃｌ－２阻害剤はＡＢＴ－１９９である。別の実施形態では、テロメラーゼ阻害剤はイメテルスタットナトリウムであり、Ｂｃｌ－２阻害剤はＡＢＴ－１９９である。この組み合わせは、医薬として使用するためのものであってもよい。
【0096】
本発明の別の実施形態は、ＢＣＬ阻害治療を受けている患者において血液癌を治療するためのイメテルスタットまたはイメテルスタットナトリウムの使用である。代替の実施形態は、テロメラーゼ阻害治療を受けている患者において、血液癌を治療するためのＡＢＴ－１９９の使用である。本発明のさらに別の実施形態は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を治療する方法で使用するためのイメテルスタットナトリウムであって、この方法が、イメテルスタットナトリウムとＡＢＴ－１９９とを組み合わせて、治療を必要とする被験体に投与することを含む、イメテルスタットナトリウムである。さらなる実施形態は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を治療する方法で使用するためのＡＢＴ－１９９であって、この方法が、ＡＢＴ－１９９とイメテルスタットナトリウムとを組み合わせて、治療を必要とする被験体に投与することを含む、ＡＢＴ－１９９である。さらなる実施形態は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を治療する方法で使用するためのイメテルスタットナトリウムとＡＢＴ－１９９とを含む組み合わせであって、この方法が、この組み合わせを、治療を必要とする被験体に投与することを含む、組み合わせである。適用可能な場合、これらの実施形態では、イメテルスタットナトリウムは、１、２、３、４、５、６、７、８、または８より多い投薬サイクルの投与のためのものであり、各サイクルが、（ａ）約７～１０ｍｇ／ｋｇのイメテルスタットナトリウムを４週間ごとに１回静脈内投与；（ｂ）約７～１０ｍｇ／ｋｇのイメテルスタットナトリウムを、毎週１回を４週間静脈内投与；または（ｃ）約２．５～７ｍｇ／ｋｇのイメテルスタットナトリウムを３週間ごとに１回静脈内投与；または（ｄ）約０．５～９．４ｍｇ／ｋｇのイメテルスタットナトリウムを４週間ごとに１回静脈内投与を含む。
さらに、これらの実施形態では、ＡＢＴ－１９９は、（ａ）毎日、約５０～４００ｍｇのＡＢＴ－１９９；（ｂ）１日目に約２ｍｇのＡＢＴ－１９９の用量で、その後６日目に８００ｍｇの最終用量になるまで毎日増量し、６日目以降は毎日その最終用量で；または（ｃ）１日目に約２５ｍｇのＡＢＴ－１９９の用量で、その後５日目に４００ｍｇの最終用量になるまで毎日増量し、５日目以降は毎日その最終用量で投与するためのものであってもよい。これらの特定の実施形態では、ＡＢＴ－１９９の投与は、イメテルスタットナトリウムの投与の１日前、１日後、または同じ日である。
さらに、これらの実施形態では、ＡＢＴ－１９９は、（ａ）毎日、約５０～４００ｍｇのＡＢＴ－１９９；（ｂ）１日目に約２ｍｇのＡＢＴ－１９９の用量で、その後６日目に８００ｍｇの最終用量になるまで毎日増量し、６日目以降は毎日その最終用量で；または（ｃ）１日目に約２５ｍｇのＡＢＴ－１９９の用量で、その後５日目に４００ｍｇの最終用量になるまで毎日増量し、５日目以降は毎日その最終用量で投与するためのものであってもよい。これらの特定の実施形態では、ＡＢＴ－１９９の投与は、イメテルスタットナトリウムの投与の１日前、１日後、または同じ日である。
【0097】
本発明のさらに別の実施形態は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞におけるアポトーシスを誘導するｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法であって、前記細胞と治療に有効な量のイメテルスタットナトリウムとを接触させることと、前記細胞と治療に有効な量のＡＢＴ－１９９を接触させることとを含む、方法である。
【0098】
上述の実施形態の全てにおいて、テロメラーゼ阻害剤は、イメテルスタットであってもよく、Ｂｃｌ－２阻害剤は、ＡＢＴ－１９９であってもよい。さらに特定的には、上述の実施形態の全てにおいて、テロメラーゼ阻害剤は、イメテルスタットナトリウムであってもよく、Ｂｃｌ－２阻害剤は、ＡＢＴ－１９９であってもよい。
【0099】
本発明をさらに説明するが、以下の実施例によって限定されない。
【実施例】
【0100】
実施例１：テロメラーゼ阻害剤イメテルスタットナトリウムをＢＣＬ－２阻害剤ベネトクラックスと組み合わせると、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＡＭＬ細胞株においてアポトーシスが高まる。
ＡＭＬ腫瘍細胞ＫＧ－１（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ－２４６）およびＭＯＬＭ－１３（ＤＳＭＺ番号ＡＣＣ５５４）を、１０％ウシ胎児血清（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号１６１４０－０８９）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン抗生物質カクテル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ１５１４０－１２２）を補充したＲＰＭＩ－１６４０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号１１８７５－０８５）中、約２０，０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルポリスチレンＵ底組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ番号３５３７７７）に蒔き、加湿した５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃のインキュベータ内で成長させた。１０％ウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ－１６４０中で調製したイメテルスタットナトリウム（Ｊａｎｓｓｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．）および／またはＤＭＳＯ中１０００倍ストックとして調製し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ビヒクル；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号２００１２－０２７）で１：１００に希釈したＡＢＴ－１９９（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍカタログ番号Ｓ８０４８）を用い、細胞をすぐに処理した。９６時間の実験で、ＡＢＴ－１９９およびイメテルスタットナトリウムが、両方とも４８時間未満のｉｎ－ｖｉｔｒｏ半減期を有しているため、第２の用量の化合物を、新しい培地を加えることなく、４８時間に適用した（Ｓｈａｍｍａｓ ｅｔ ａｌ、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、２２（７）：１４１０－１４１８（２００８））。イメテルスタットナトリウムを０～５０μΜで試験し、ＡＢＴ－１９９を０～５００ｎＭで試験した。表２に示されるコントロール非相補性オリゴヌクレオチドおよびミスマッチオリゴヌクレオチド（ＵＳ ７，９９８，９３８号）は、効果がイメテルスタットナトリウムとＡＢＴ－１９９の組み合わせに特異的であることを示すために、イメテルスタットナトリウムと同一の濃度で使用した。
ＡＭＬ腫瘍細胞ＫＧ－１（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ－２４６）およびＭＯＬＭ－１３（ＤＳＭＺ番号ＡＣＣ５５４）を、１０％ウシ胎児血清（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号１６１４０－０８９）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン抗生物質カクテル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ１５１４０－１２２）を補充したＲＰＭＩ－１６４０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号１１８７５－０８５）中、約２０，０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルポリスチレンＵ底組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ番号３５３７７７）に蒔き、加湿した５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃のインキュベータ内で成長させた。１０％ウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ－１６４０中で調製したイメテルスタットナトリウム（Ｊａｎｓｓｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．）および／またはＤＭＳＯ中１０００倍ストックとして調製し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ビヒクル；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号２００１２－０２７）で１：１００に希釈したＡＢＴ－１９９（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍカタログ番号Ｓ８０４８）を用い、細胞をすぐに処理した。９６時間の実験で、ＡＢＴ－１９９およびイメテルスタットナトリウムが、両方とも４８時間未満のｉｎ－ｖｉｔｒｏ半減期を有しているため、第２の用量の化合物を、新しい培地を加えることなく、４８時間に適用した（Ｓｈａｍｍａｓ ｅｔ ａｌ、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、２２（７）：１４１０－１４１８（２００８））。イメテルスタットナトリウムを０～５０μΜで試験し、ＡＢＴ－１９９を０～５００ｎＭで試験した。表２に示されるコントロール非相補性オリゴヌクレオチドおよびミスマッチオリゴヌクレオチド（ＵＳ ７，９９８，９３８号）は、効果がイメテルスタットナトリウムとＡＢＴ－１９９の組み合わせに特異的であることを示すために、イメテルスタットナトリウムと同一の濃度で使用した。
【表2】
【0101】
４８時間および９６時間に、アネキシンＶ（内部細胞膜染色）とヨウ化プロピジウム（ＰＩ、ＤＮＡに結合する染料）フローサイトメトリーアッセイキット（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄカタログ６４０９１４）を用い、健康な集団、初期アポトーシス集団およびアポトーシス集団について、細胞を測定した。アネキシンＶは、緑色蛍光ＦＩＴＣ染料にコンジュゲートした組換えアネキシンＶを用いたアポトーシス細胞おけるホスファチジルセリンの外在化を検出しヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を用いて死細胞を検出する。ヨウ化プロピジウムは、壊死細胞を赤色蛍光で染色する。両プローブを用いた処理の後、初期アポトーシス細胞は、緑色蛍光を示し、アポトーシス（死）細胞は、赤色と緑色の蛍光を示し、生細胞は、蛍光をほとんど示さないか、または全く示さない。簡単に言うと、細胞をペレット化し、ＰＢＳで２回洗浄した後、製造業者の示唆したプロトコルに従って、抗アネキシンＶ－ＦＩＴＣおよびヨウ化プロピジウムを比率１：２で含むアネキシンＶ結合バッファーに懸濁させた。細胞を暗所中、４℃で３０分間染色し、その後、ＰＢＳで３回洗浄し、ＦＡＣｓ Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤカタログ５５４６５７）に懸濁した後、順方向の散乱、横方向の散乱、ＦＩＴＣおよびＰＥチャンネルについて、ＢＤ ＦＡＣｓ Ｃａｎｔｏフローサイトメーターで調べた。細胞集団を、Ｃｙｔｏｂａｎｋソフトウェアを用いて分析し、未治療の（イメテルスタットナトリウムまたはＡＢＴ－１９９なし）条件と比較し、生細胞（いずれかのチャンネルで染色されない、すなわち、二重陰性集団）のゲーティングの境界を確立した。全ての実験について、フローサイトメトリーデータのドットプロットは、左下象限に生細胞の割合、左上象限に初期アポトーシス細胞（アネキシンＶ＋／ＰＩ－）の割合、右上象限にアポトーシス（死）細胞（二重標識されたアネキシンＶ＋／ＰＩ＋）の割合を有する四象限（four quadrants）を示す。アポトーシス細胞（二重標識されたもの）の割合を使用し、Ｈｉｇｈｅｓｔ Ｓｉｎｇｌｅ Ａｇｅｎｔ（ＨＳＡ）とＢｌｉｓｓ相加モデルを両方とも使用する組み合わせ効果を計算した（Ｊ Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．２０１５；６（１８１））。
【0102】
ＨＳＡモデルを用い、組み合わせにおけるそれぞれの用量について、組み合わせた状態（「Ｃ」）の細胞毒性効果を、それぞれの単一薬剤コントロール（「Ａ」または「Ｂ」）によって生じる効果と比較した。
ＨＳＡを上回る過剰＝Ｃ－Ａ（Ａ＞Ｂの場合）またはＣ－Ｂ（Ａ＜Ｂの場合）。
ＨＳＡを上回る過剰＝Ｃ－Ａ（Ａ＞Ｂの場合）またはＣ－Ｂ（Ａ＜Ｂの場合）。
【0103】
Ｂｌｉｓｓモデルは、同様の比較を行うが、単一薬剤の最大効果の代わりに、Ｂｌｉｓｓモデルは、それぞれの単一薬剤の合計に等しい値の組み合わせから、その積を引き算する。
Ｂｌｉｓｓを上回る過剰＝Ｃ－［（Ａ＋Ｂ）－（Ａ＊Ｂ）］。
Ｂｌｉｓｓを上回る過剰＝Ｃ－［（Ａ＋Ｂ）－（Ａ＊Ｂ）］。
【0104】
これらのモデルは、ある組み合わせにおける相加性または弱い相乗性を示すことができる。
ＡＭＬ細胞株治療の結果
ＡＭＬ細胞株治療の結果
【0105】
イメテルスタットナトリウムおよび／またはＡＢＴ－１９９を用いて４８時間治療した後のＫＧ－１細胞のフローサイトメトリーデータのドットプロットを図１Ａに示し、様々なイメテルスタットナトリウム濃度でのＡＢＴ－１９９濃度に対するアポトーシス細胞（二重標識）％のグラフを図１Ｂに示す。ＫＧ－１は、４８時間後にＡＢＴ－１９９に対して低い感受性を示し（それぞれ１００ｎＭおよび５００ｎＭで約９％および約１４％）、イメテルスタットナトリウムに対して最小限の感受性を示す。しかし、５０μΜのイメテルスタットナトリウムの治療を、１００ｎＭまたは５００ｎＭのＡＢＴ－１９９と組み合わせると、細胞死に対するさらに大きな効果が、観察される（１００ｎＭで約２７％、５００ｎＭで約５０％）。表３および表４は、ＫＧ－１細胞を４８時間治療した場合のＨＳＡモデルまたはＢＬＩＳＳモデルを用いた組み合わせ効果の計算結果を示す。負の値は、これらのモデルでは拮抗作用を示しているのではなく、単に相互作用がないことを示している。
【表3】
【表4】
【0106】
イメテルスタットナトリウムおよび／またはＡＢＴ－１９９を用いて９６時間治療した後のＫＧ－１細胞のフローサイトメトリーデータのドットプロットを図２Ａに示し、様々なイメテルスタットナトリウム濃度でのＡＢＴ－１９９濃度に対するアポトーシス細胞（二重標識）％のグラフを図２Ｂに示す。ＫＧ－１は、９６時間後にＡＢＴ－１９９に対して低い感受性を示し（それぞれ１００ｎＭおよび５００ｎＭで約６％および約１０％）、イメテルスタットナトリウムへのある程度の感受性も観察される（それぞれ１０μΜ、２０μΜおよび５０μΜで５％、９％および１６％）。しかし、２５μΜまたは５０μΜのイメテルスタットナトリウムの治療を、２０～５００ｎＭのＡＢＴ－１９９と組み合わせると、細胞死に対するさらに大きな効果が、全ての濃度で観察される。表５および表６は、ＫＧ－１細胞を９６時間治療した場合のＨＳＡモデルまたはＢＬＩＳＳモデルを用いた組み合わせ効果の計算結果を示す。
【表5】
【表6】
【0107】
ミスマッチオリゴヌクレオチドまたは非相補性オリゴヌクレオチドとＡＢＴ－１９９とを用いて４８時間（図３Ａ）または９６時間（図４Ａ）治療した後の、ＫＧ－１細胞についてのフローサイトメトリーデータのドットプロットを示す。様々なオリゴヌクレオチド濃度でのＡＢＴ－１９９濃度に対するアポトーシス細胞（二重標識）％のグラフを４８時間（図３Ｂ）または９６時間（図４Ｂ）について示す。ｈｉｇｈｅｓｔ ｓｉｎｇｌｅ－ａｇｅｎｔモデルを上回る過剰（表７および表８）およびＢｌｉｓｓモデルを上回る過剰（表９および表１０）は、オリゴヌクレオチドコントロールを用いてもなんの効果もないことを確認する。負の値は、これらのモデルでは拮抗作用を示しているのではなく、単に相互作用がないことを示している。
【表7】
【表8】
【表9】
【表10】
【0108】
イメテルスタットナトリウムおよび／またはＡＢＴ－１９９を用いて４８時間治療した後のＭＯＬＭ－１３細胞のフローサイトメトリーデータのドットプロットを図５Ａに示し、様々なイメテルスタットナトリウム濃度でのＡＢＴ－１９９濃度に対するアポトーシス細胞（二重標識）％のグラフを図５Ｂに示す。ＭＯＬＭ－１３は、４８時間後にＡＢＴ－１９９に対してある程度の感受性を示し（それぞれ１００ｎＭおよび５００ｎＭで約１９％および約３０％）、イメテルスタットナトリウムに対してある程度の感受性を示す（５０μΜで２１．５％）。しかし、２５μΜのイメテルスタットナトリウムをＡＢＴ－１９９と組み合わせると、細胞死に対してさらに大きな効果が観察された（それぞれ１００ｎＭおよび５００ｎＭで約３２％および約７２％）。細胞死に対する最も大きな効果は、１００ｎＭ（６２％）および５００ｎＭ（８８％）のＡＢＴ－１９９と組み合わせた５０μΜのイメテルスタットナトリウムを用いて観察された。驚くべきことに、５０μΜのイメテルスタットナトリウムと組み合わせると、ＡＢＴ－１９９は、５ｎＭおよび２０ｎＭの低い濃度で細胞死滅化に対する効果が観察された。表１１および表１２は、ＭＯＬＭ－１３細胞を４８時間治療した場合のＨＳＡモデルまたはＢＬＩＳＳモデルを用いた組み合わせ効果の計算結果を示す。
【表11】
【表12】
【0109】
イメテルスタットナトリウムおよび／またはＡＢＴ－１９９を用いて９６時間治療した後のＭＯＬＭ－１３細胞のフローサイトメトリーデータのドットプロットを図６Ａに示し、様々なイメテルスタットナトリウム濃度でのＡＢＴ－１９９濃度に対するアポトーシス細胞（二重標識）％のグラフを図６Ｂに示す。ＭＯＬＭ－１３は、９６時間後にＡＢＴ－１９９に対する感受性を示し（５、２０、１００および５００ｎＭで３０％を超える細胞死）、イメテルスタットナトリウムに対する感受性を示す（１０、２５および５０μΜで３０％以上）。ＡＢＴ－１９９とイメテルスタットナトリウムを組み合わせた治療の全ての濃度で、細胞死滅化が高められている。最高濃度のＡＢＴ－１９９（５００ｎＭ）と組み合わせたとき、最小濃度のイメテルスタットナトリウム（１０μΜ）で、９０％より大きな細胞死が観察された。ＡＢＴ－１９９の１００ｎＭおよび５００ｎＭの濃度で、組み合わせたときにも、９０％より大きな細胞死が観察された。最高濃度のイメテルスタットナトリウム（５０μΜ）では、５、１０、２０、１００、５００ｎＭのＡＢＴ－１９９濃度で、ほぼ完全な細胞死が観察された。
表１３および表１４は、ＭＯＬＭ－１３細胞を９６時間治療した場合のＨＳＡモデルまたはＢＬＩＳＳモデルを用いた組み合わせ効果の計算結果を示す。
表１３および表１４は、ＭＯＬＭ－１３細胞を９６時間治療した場合のＨＳＡモデルまたはＢＬＩＳＳモデルを用いた組み合わせ効果の計算結果を示す。
【表13】
【表14】
【0110】
ミスマッチオリゴヌクレオチドまたは非相補性オリゴヌクレオチドとＡＢＴ－１９９とを用いて４８時間（図７Ａ）または９６時間（図８Ａ）治療した後の、ＭＯＬＭ－１３細胞についてのフローサイトメトリーデータのドットプロットを示す。様々なオリゴヌクレオチド濃度でのＡＢＴ－１９９濃度に対するアポトーシス細胞（二重標識）％のグラフを４８時間（図７Ｂ）または９６時間（図８Ｂ）について示す。ｈｉｇｈｅｓｔ ｓｉｎｇｌｅ－ａｇｅｎｔモデルを上回る過剰（表１５および表１７）およびＢｌｉｓｓモデルを上回る過剰（表１６および表１８）は、オリゴヌクレオチドコントロールを用いてもなんの効果もないことを確認する。負の値は、これらのモデルでは拮抗作用を示しているのではなく、単に相互作用がないことを示している。
実施例２：治療された細胞における、イメテルスタットナトリウムとＡＢＴ－１９９の相互作用の機構に関する試験。
【表15】
【表16】
【表17】
【表18】
【0111】
機構的に、イメテルスタットナトリウムは、主に、テロメラーゼ酵素複合体の活性部位を阻害することによって機能する。活性部位を阻害すると、酵素が作用するテロメア末端が、そのため、伸長されない。腫瘍細胞の迅速かつ繰り返しの細胞分裂により、時間経過とともに、それらは進行的なテロメアの短縮を起こしやすくなる。テロメア再生プロセスがブロックされると、細胞は、進行的に危機に近づき、最終的にアポトーシスを引き起こす（Ｂｒｕｅｄｉｇａｍ ｅｔ ａｌ、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、１５：７７５－７９０ （２０１４））。
【0112】
Ｂｃｌ－２およびその関連するファミリーメンバーは、腫瘍細胞への抗アポトーシスシグナルの送達に、役割を果たす。Ｂｃｌ－２は、Ｂａｘを阻害することによって働く。Ｂａｘは、正常なプログラムされた細胞死をもたらすアポトーシス因子の放出をシグナル伝達する際に鍵となるメディエータである。これらのシグナル下、Ｂａｘは、ミトコンドリアに移行し、チトクロムｃおよび他のアポトーシス因子を始動させ、カスパーゼカスケードを活性化し、固有の（すなわち、非受容体介在性－ＴＲＡＩＬ，ＴＮＦａなど）経路によって細胞死を完結させる。Ｂｃｌ－２は、Ｂａｘを直接的に阻害し得るため、Ｂｃｌ－２の存在によって、これらのシグナルの妨害が起こる。Ｂａｘがなければアポトーシス因子は放出されず、細胞は、アポトーシスシグナルから開放される。
【0113】
これらの２つの経路は、テロメラーゼの主なタンパク質構成要素ｈＴＥＲＴとして集まり、これも、Ｂｃｌ－２と交わる固有のアポトーシス経路において、補助的な役割を果たす。これに加え、Ｂｃｌ－２は、ｈＴＥＲＴ発現と、その後のテロメラーゼ活性も高めることが知られており、腫瘍細胞におけるアポトーシスをさらに減らす。ｈＴＥＲＴは、ミトコンドリアに到達し、アポトーシスシグナルのカスケードを始動させる前にＢａｘを妨害することができることが示されている。これに加えて、ミトコンドリア内で、ｈＴＥＲＴは、Ｂａｘに対するＢｃｌ－２の阻害効果を高めることができる。治療された細胞において、イメテルスタットナトリウムとＡＢＴ－１９９との間の相互作用の機構をさらに解明するために、ＲＴ－ｑＰＣＲを用いて転写レベルを評価することによってｈＴＥＲＴ発現を測定し、ＰＣＲ系ＴＲＡＰアッセイにおいて、溶解した細胞由来のタンパク質を用い、テロメラーゼ活性を評価した。
ｈＴＥＲＴ転写物レベル
ｈＴＥＲＴ転写物レベル
【0114】
細胞実験からのサンプル（および単一薬剤コントロール）を、分子分析のために集め、可能性のある作用機序に寄与する組み合わせの効果を評価した。ＡＭＬ細胞を、Ｆａｌｃｏｎ Ｔ２５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ３５３１３５）中、５０μΜのイメテルスタットナトリウム、２０ｎＭのＡＢＴ－１９９、５０μΜのイメテルスタットナトリウムと２０ｎＭのＡＢＴ－１９９または薬物なし、のいずれかを投薬した培地８ｍＬ中８００万個の細胞のバッチで、以前の実験と同様に４８時間および９６時間成長させ、次いで、溶解、および核酸またはタンパク質のいずれか抽出のために、細胞ペレットとして集めた。まず、２－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａカタログ番号６３６８９－１００ＭＬ－Ｆ）を補充した３５０μＬのＲＬＴバッファー（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号１０３０９６３）を用いて細胞を溶解することによって、核酸を精製した。ＡｌｌＰｒｅｐ ＲＮＡ／ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号８０２０４）を用いてＲＮＡを精製し、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号４３６８８１４）を用い、ｃＤＮＡに逆転写し、前増幅させた後、ＴａｑＭａｎ ＰｒｅＡｍｐ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号４３８４５５７Ｂ）で分析した。ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製ＶｉｉＡ７ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステムを用い、組織内で開発したＴａｑ－Ｍａｎ ＲＴ－ｑＰＣＲアッセイを用いて生成物を分析し、ｈＴＥＲＴ転写レベルを測定した（ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ－ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号４３０４４３７；以下のプライマーおよびプローブ配列）。
ｈＴＥＲＴ全長順方向：５’－ＴＧＴＡＣＴＴＴＧＴＣＡＡＧＧＴＧＧＡＴＧＴＧＡ－３’（配列番号４）
ｈＴＥＲＴ全長逆方向：５’－ＧＣＴＧＧＡＧＧＴＣＴＧＴＣＡＡＧＧＴＡＧＡＧ－３’（配列番号５）
ｈＴＥＲＴ ＦＡＭプローブ：ＦＡＭ ５’－ＣＧＣＧＴＡＣＧＡＣＡＣＣＡＴ－３’ＭＧＢＮＦＱ（配列番号６）
ここで、ＦＡＭは、蛍光レポーターであり、ＭＧＢＮＦＱは、クエンチャーである。
ｈＴＥＲＴ全長順方向：５’－ＴＧＴＡＣＴＴＴＧＴＣＡＡＧＧＴＧＧＡＴＧＴＧＡ－３’（配列番号４）
ｈＴＥＲＴ全長逆方向：５’－ＧＣＴＧＧＡＧＧＴＣＴＧＴＣＡＡＧＧＴＡＧＡＧ－３’（配列番号５）
ｈＴＥＲＴ ＦＡＭプローブ：ＦＡＭ ５’－ＣＧＣＧＴＡＣＧＡＣＡＣＣＡＴ－３’ＭＧＢＮＦＱ（配列番号６）
ここで、ＦＡＭは、蛍光レポーターであり、ＭＧＢＮＦＱは、クエンチャーである。
【0115】
イメテルスタットナトリウムおよび／またはＡＢＴ－１９９を用いた４８時間および９６時間の治療後のｈＴＥＲＴ発現を示す棒グラフを図９に示す。ＲＴ－ｑＰＣＲによって測定されるＲＮＡ発現レベルを、同じ曝露時間での未治療コントロールに対する割合として示す。結果は、ＫＧ－１細胞は、ＡＢＴ－１９９治療によってｈＴＥＲＴのＲＮＡレベルが最小限減少し（いずれかの時間点で、コントロールと比較して９０～９５％）、ＭＯＬＭ－１３細胞が、投薬９６時間後にｈＴＥＲＴ転写レベルのわずかな減少のみを示す（コントロールと比較して約６９％）ことを示す。イメテルスタットナトリウム治療は、両細胞株について、ＲＮＡレベルのより大きな減少を示し、さらに長い治療時間では、さらに低い発現を伴う（４８時間では、ＫＧ－１細胞はコントロールの７２％、９６時間ではコントロールの４７％；ＭＯＬＭ－１３細胞は、４８時間では３９％、９６時間ではアッセイによって検出不可能）。イメテルスタットナトリウムとＡＢＴ－１９９の組み合わせについて、ＫＧ－１におけるイメテルスタットナトリウム単一薬剤と比較して、ｈＴＥＲＴ発現は、変化しなかった。両方の時間点でのＭＯＬＭ－１３について、ｈＴＥＲＴは、検出不可能であった。
ｈＴＥＲＴ酵素レベル
ｈＴＥＲＴ酵素レベル
【0116】
タンパク質分析についての上の章からのサンプルを、溶解およびタンパク質抽出のために１５００Ｋで５分間の遠心分離処理によって、細胞ペレットとして集めた。改変された方法を利用するによって、２種類の主な供給源から合わせたタンパク質溶解物を分析した（Ｈｏｕ，ｅｔ ａｌ．（２００１）４３（３） ５１９－５２４ および Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（２００６） １ （３） １５８３－１５９０）。８０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ、１％のＮＰ－４０、１０％のグリセロール、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、２５０μΜのデオキシコール酸ナトリウム、１００μΜのＡＥＢＳＦ、５ｍＭの２－メルカプトエタノールバッファーを加え、氷上で３０分間インキュベートすることによって、溶解物を作成した。溶解物を１５分間、最大速度、４℃で遠心分離処理し、細胞片をペレット化した。澄明化した溶解物からのタンパク質の収量を、ＢＣＡアッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号２３２５２）を用いて定量し、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製ＶｉｉＡ７ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステムを用いてｑＰＣＲ ＴＲＡＰ系アッセイを行い、相対的なテロメラーゼ活性を決定した（Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ－ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ番号４３６７６５９）。このアッセイにおいて、タンパク質溶解物を、過剰なｄＮＴＰおよびＳＹＢＲ緑色染料存在下、テロメア配列を模倣する合成オリゴヌクレオチドに曝露する。テロメラーゼの活性が大きいほど、合成プライマーの伸長が大きくなり、したがって、核酸の染色と、ＳＹＢＲ染料によって発生するシグナルが大きくなる。このシグナルを、コントロールタンパク質溶解物の標準曲線と比較し、サンプル間の相対的なテロメラーゼ活性を決定した。
順方向プライマー：５’－ＡＡＴＣＣＧＴＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＴ－３’ （配列番号７）
逆方向プライマー：５’－ＧＣＧＣＧＧＣＴＴＡＣＣＣＴＴＡＣＣＣＴＴＡＣＣＣＴＡＡＣＣ－３’ （配列番号８）
分子相互作用の結果
順方向プライマー：５’－ＡＡＴＣＣＧＴＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＴ－３’ （配列番号７）
逆方向プライマー：５’－ＧＣＧＣＧＧＣＴＴＡＣＣＣＴＴＡＣＣＣＴＴＡＣＣＣＴＡＡＣＣ－３’ （配列番号８）
分子相互作用の結果
【0117】
イメテルスタットナトリウムおよび／またはＡＢＴ－１９９を用いた４８時間および９６時間の治療後のテロメラーゼ活性を示す棒グラフを図１０に示す。４８時間で、ＡＢＴ－１９９は、ＫＧ－１細胞およびＭＯＬＭ－１３細胞の両方において、単一薬剤として使用された場合、テロメラーゼ活性に対して何ら効果を示さない。９６時間のＡＢＴ－１９９治療で、テロメラーゼの活性は、ＫＧ－１において約８０％に、および約７０％に減少し、ＡＢＴ－１９９が、テロメラーゼ活性に対してほとんど効果がないことを示していた。イメテルスタットナトリウムは、ＫＧ－１細胞株およびＭＯＬＭ－１３細胞株両方において、テロメラーゼ活性の減少を示した。ＭＯＬＭ－１３細胞において、コントロールと比較した減少は、両時間点で匹敵するものであった（４８時間で３７％、９６時間で４４％）。しかし、ＫＧ－１は、９６時間のイメテルスタットナトリウムの治療で、テロメラーゼ活性のさらに大きな減少を示した（４８時間で６４％、９６時間で１６％）。併用療法を用いると、ＫＧ－１は、イメテルスタットナトリウム単一薬剤からの最小限の差を示し、一方、ＭＯＬＭ－１３では、テロメラーゼ活性の減少は、ＰＣＲアッセイによってほぼ検出不可能であった。
実施例３：組み合わせの相乗性を解明する
実施例３：組み合わせの相乗性を解明する
【0118】
ＡＭＬ腫瘍細胞株ＭＯＬＭ－１３モデルの治療を、以下のように変更しつつ、実施例１に記載した実験フォーマットで繰り返した。イメテルスタットナトリウム、コントロールミスマッチ化合物およびコントロール非相補性化合物を、０～７５μΜ（７種類の合計濃度）のさらに高い濃度で試験し、ＡＢＴ－１９９を２０ｐＭ～１μΜ（９種類の合計濃度）で試験した。治療された細胞を、既に記載したようなアネキシンＶおよびヨウ化プロピジウム染色について、フローサイトメトリーによって分析した。アポトーシス集団においてゲーティングされた事象（アネキシンＶ＋／ヨウ化プロピジウム＋）を使用し、この組み合わせマトリックスについての相乗性スコアを決定した。組み合わせデータの分析を、Ｈｏｒｉｚｏｎ ＣｈａｌｉｃｅＴＭ Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｇｒｏｕｐ、ケンブリッジ、ＵＫ）によって生成した。ＭＯＬＭ－１３および細胞株ＨＬ－６０を用いてさらなるｉｎ ｖｉｔｒｏ実験を行い、この組み合わせに対して単一曝露したときのイメテルスタットナトリウムとＡＢＴ－１９９の相乗性を評価した（すなわち、４８時間で再投薬なし）。ＡＢＴ－１９９用量範囲は、わずかに代えられ（５００ｐＭ～１００ｎＭ、５種類の最終濃度）、４８時間で、細胞に第２の時間投与された、上に記載した実験の等価なデータ点と比較した。ミスマッチコントロールおよび非相補性コントロールは、この実験では使用しなかった。
【0119】
治療されたＭＯＬＭ－１３細胞において観察される効果を統計的に定性するために、ＣｈｏｕおよびＴａｌａｌａｙの方法（Ｃｈｏｕ ＴＣ、Ｔａｌａｌａｙ Ｐ．、Ａｄｖ Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇｕｌ １９８４； ２２：２７－５５）に従って、アイソボログラム分析の固定された投薬比率からの生データをまとめるＨｏｒｉｚｏｎ’ｓ ＣｈａｌｉｃｅＴＭ Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅのウェブアプリケーションを用い、投薬の組み合わせを評価した。組み合わせ条件にアイソボログラム分析を行い、組み合わせ指数を作成し、このアイソボログラムより下に入る相乗的な対およびそれより上に入る拮抗的な対の組み合わせの挙動をグラフに表す（相加的な組み合わせは、このライン上にあると予想される）。Ｈｏｒｉｚｏｎ ＣｈａｌｉｃｅＴＭ Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅは、さらに、相乗性スコアを与え、１より大きな値は、相乗性を示している。
【0120】
４８時間治療について、様々なイメテルスタットナトリウム濃度でのＡＢＴ－１９９濃度に対するアポトーシス細胞％（二重標識）のグラフを図１１に示す。表１９は、４８時間治療後のＭＯＬＭ－１３細胞についてのそれぞれの組み合わせでの、相加性を超える（Ｌｏｅｗｅモデル）計算結果を示す。０より大きな値は、表１９の右上象限にみられ、一方、ＡＢＴ－１９９の濃度は、２０ｎＭ以上であり、イメテルスタットナトリウムの濃度は、２５μＭ以上である。Ｈｏｒｉｚｏｎ ＣｈａｌｉｃｅＴＭ Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅは、さらに、相乗性スコアを与え、１より大きな値は、相乗性を示している。イメテルスタットナトリウムで治療された細胞について、４８時間後に、相乗性スコアは、５．１２であると決定された。これを、ミスマッチコントロールおよび非相補性コントロールのスコア０．２２および０．４１のスコアとそれぞれ比較する（表２０および表２１）。４８時間治療について、様々なイメテルスタットナトリウム濃度でのＡＢＴ－１９９濃度に対するアポトーシス細胞％（二重標識）のグラフを、それぞれミスマッチコントロールおよび非相補性コントロールについて、図１２Ａおよび１２Ｂに示す。
【表19】
【表20】
【表21】
【0121】
９６時間治療について、様々なイメテルスタットナトリウム濃度でのＡＢＴ－１９９濃度に対するアポトーシス細胞％（二重標識）のグラフを図１３に示す。表２２は、９６時間治療後のＭＯＬＭ－１３細胞についてのそれぞれの組み合わせでの、相加性を超える（Ｌｏｅｗｅモデル）計算結果を示す。ゼロより大きな値は、表１９の右上の対角線上に見出される。驚くべきことに、最小濃度のＡＢＴ－１９９（０．０４ｎＭおよび０．２ｎＭ）でさえ５０μΜのイメテルスタットナトリウムおよび７５μΜのイメテルスタットナトリウムとそれぞれ、相乗性を示し、最小濃度のイメテルスタットナトリウム（１μΜおよび５μΜ）は、それぞれ５００ｎＭおよび１００ｎＭのＡＢＴ－１９９との相乗性を示す。Ｈｏｒｉｚｏｎ ＣｈａｌｉｃｅＴＭ Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅは、さらに、相乗性スコアを与え、１より大きな値は、相乗性を示している。イメテルスタットナトリウムで治療された細胞について、９６時間後に、相乗性スコアは、１１．３３であると決定された。これを、ミスマッチコントロールおよび非相補性コントロールのスコア０．０３および０．０６とそれぞれ比較する（表２３および表２４）。９６時間治療について、様々なイメテルスタットナトリウム濃度でのＡＢＴ－１９９濃度に対するアポトーシス細胞％（二重標識）のグラフを、それぞれミスマッチコントロールおよび非相補性コントロールについて、図１４Ａおよび１４Ｂに示す。
【表22】
【表23】
【表24】
【0122】
単一用量の治療から９６時間後のアポトーシス集団（二重標識）を、ＭＯＬＭ－１３について示し（図１７Ａ）、ＡＭＬ細胞株ＨＬ－６０について示す（図１７Ｂ）。より少ない用量範囲のＡＢＴ－１９９をこの実験に使用し、イメテルスタットナトリウム共治療の効能を評価した。表２５は、それぞれのＭＯＬＭ－１３の組み合わせについてＨｏｒｉｚｏｎ ＣｈａｌｉｃｅＴＭ Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅによって計算される相加性を超える（Ｌｏｅｗｅモデル）計算結果を示し、一方、表２６は、ＨＬ－６０についての計算結果を示す。両方の株で相乗性であるが、さらに低い（５μＭおよび１０μΜ）のイメテルスタットナトリウム濃度で、より大きなスコアと、アポトーシスに対する高められた効果によって実証されるように、ＭＯＬＭ－１３において、より大きな相乗性が観察される。イメテルスタットナトリウムとの組み合わせは、ＡＢＴ－１９９濃度を１～５ｎＭ用量まで下げる見込みがあることを示す。
【表25】
【表26】
【0123】
比較のために、図１３にプロットされ、表２２を作成するために使用されたデータを、図１７Ａおよび表２５に使用される用量でのみ、Ｈｏｒｉｚｏｎ ＣｈａｌｉｃｅＴＭ Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて再分析した。表２７に示されるように、相乗性スコアは、ＡＢＴ－１９９漸増曲線の上側レベルを除去すると、ほぼ半分である（１１．３３から６．０６）。このスコアは、９６時間の単一用量（表２５）の条件のほぼ倍であり（３．２４に対して６．０６）、このことは、連続的に曝露すると、ＡＢＴ－１９９とイメテルスタットナトリウムと合わせたとき、さらに大きな相乗性が誘導されることを示唆している。
実施例４：テロメラーゼ阻害剤イメテルスタットナトリウムをＢＣＬ－２阻害剤ベネトクラックスと組み合わせると、ｅｘ ｖｉｖｏで、ＡＭＬ患者サンプルにおいてアポトーシスが高まる。
【表27】
【0124】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、化学療法以外の治療選択肢が限定された侵襲性の強い癌であり、そのため、この満たされていない必要性を満たす治癒薬剤が必要である。ｈＴＥＲＴ（テロメラーゼの触媒サブユニット）およびＢＣＬ－２（アポトーシス制御因子）の両方は、ＡＭＬで過剰発現し、これは、疾患の重篤度と、予後不良にそれぞれ相関している。イメテルスタットナトリウムは、血液悪性腫瘍において臨床的活性を有するテロメラーゼのファーストインクラスの競争阻害剤である。ベネトクラックス（ＡＢＴ－１９９）は、１７ｐを欠き、以前に少なくとも１つの治療を受けたＣＬＬ患者について承認されたＢＣＬ－２阻害剤であり、ＡＭＬ患者において、有望な臨床的便益を示している。この実施例での試験は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの、ＡＭＬ細胞に対するイメテルスタットナトリウムまたはベネトクラックス単独、または組み合わせの効果を調査した。
【0125】
ＡＭＬ細胞株（実施例１を参照）およびＦｉｃｏｌｌ精製後にＡＭＬ患者の全血から得られたＡＭＬ患者末梢血単核細胞（「ＰＢＭＣ」）サンプルを、イメテルスタットナトリウムまたはベネトクラックス単独、または組み合わせで治療し、生存可能な細胞集団およびアポトーシス細胞集団をフローサイトメトリーによって評価した。テロメラーゼ活性、ｈＴＥＲＴ発現およびミトコンドリア機能不全が作用機序について調査された。ＡＭＬ患者のＰＢＭＣに、イメテルスタットナトリウム（０μΜ、２５μΜおよび５０μΜ）、ベネトクラックス（ＡＢＴ－１９９）（０ｎＭ、２０ｎＭおよび１００ｎＭ）または組み合わせを１６時間または４０時間投薬した。アポトーシスは、アネキシンＶおよびヨウ化プロピジウムのフローサイトメトリー染色によって測定した。染色していない（すなわち、二重陰性）細胞は、治療後に残る生細胞を構成する。
【0126】
具体的には、ＡＭＬ患者由来の全血（ｎ＝４）を、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅカタログ番号１７－１４４０－０３）を用いて精製し、ＰＢＭＣを精製した。Ｆｉｃｏｌｌを５０ｍＬのＳｅｐＭａｔｅ遠沈管（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号８５４５０）に入れ、患者の血液を、ＨｙＣｌｏｎｅ ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号ＳＨ３００７０．０２）の２％ＦＢＳを補充したリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ； ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号２００１２－０２７）で１：１希釈し、その後にＦｉｃｏｌｌの上部にロードした。血液を遠心分離処理し、赤血球細胞、顆粒球などからＰＢＭＣを分離し、残ったＰＢＭＣをＰＢＳ＋２％ＦＢＳで２回洗浄した。細胞を、上述の１０％ ＨｙＣｌｏｎｅ ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ－１６４０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号１１８７５－０８５）中、ウェルあたり約３００，０００個細胞の密度で９６ウェルポリスチレンＵ底組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ３５３７７７）に蒔き、加湿した５％ＣＯ２下、３７℃インキュベーターで成長させた。ｅｘ ｖｉｖｏ ＰＢＭＣでは抗生物質は使用しなかった。１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ－１６４０中で調製したイメテルスタットナトリウム（Ｊａｎｓｓｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．）および／またはＤＭＳＯ中１０００倍ストックとして調製し、ＰＢＳ（ビヒクル）で１：１００に希釈したＡＢＴ－１９９（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍカタログ番号Ｓ８０４８）を用い、細胞をすぐに処理した。イメテルスタットナトリウムを０～５０μΜで試験し、ベネトクラックス（ＡＢＴ－１９９）を０～１００ｎＭで試験した。
【0127】
１６時間および４０時間の治療の後に、実施例１に記載するように、アネキシンＶ（内部細胞膜染色）とヨウ化プロピジウム（ＰＩ、ＤＮＡに結合する染料）フローサイトメトリーアッセイキット（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄカタログ６４０９１４）を用い、健康な集団、初期アポトーシス集団およびアポトーシス集団について、細胞を測定した。さらに、ＰＢＭＣを、以下の分化マーカーについて染色した。ＣＤ４５（Ｖ５００コンジュゲートしたもの；ＢＤカタログ番号５６０７７７）およびＣＤ３４（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅコンジュゲートしたもの；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号３４３５１２）。まず、ＣＤ４５陽性について事象をゲーティングし、次いで、ＣＤ３４についてゲーティングした後、上の実施例１に記載するようにアネキシンＶ／ヨウ化プロピジウム評価した。ＣＤ４５＋（白血球）およびＣＤ４５＋／ＣＤ３４＋（白血病幹細胞）の集団について、４患者の平均および標準偏差を決定した。
ｅｘ ｖｉｖｏでの治療結果
ｅｘ ｖｉｖｏでの治療結果
【0128】
図１５Ａ～１５Ｄは、ｅｘ ｖｉｖｏでイメテルスタットナトリウムおよび／またはベネトクラックス（ＡＢＴ－１９９）に曝露した４人のＡＭＬ患者のＰＢＭＣサンプルの平均応答を示す。ＡＭＬ患者のＣＤ４５＋白血球およびＣＤ４５＋／ＣＤ３４＋白血病幹細胞を様々な濃度のベネトクラックス（ＡＢＴ－１９９）および／またはイメテルスタットナトリウムで１６時間治療した、治療後の生細胞％のグラフを図１５Ａ（ＣＤ４５＋白血球）および１５Ｂ（ＣＤ４５＋／ＣＤ３４＋白血病幹細胞）に示す。ＡＭＬ患者のＣＤ４５＋白血球およびＣＤ４５＋／ＣＤ３４＋白血病幹細胞を様々な濃度のベネトクラックス（ＡＢＴ－１９９）および／またはイメテルスタットナトリウムで４０時間治療した、治療後の生細胞％のグラフを図１５Ｃ（ＣＤ４５＋白血球）および１５Ｄ（ＣＤ４５＋／ＣＤ３４＋白血病幹細胞）に示す。一般的に、ＡＭＬ患者由来のＣＤ４５＋白血球の生存率は、１６時間および４０時間曝露した後、イメテルスタットナトリウム治療のみによっては影響を受けず、単一薬剤としてのベネトクラックスによっては中程度しか影響を受けない。しかし、イメテルスタットナトリウムをベネトクラックスと組み合わせて使用すると、細胞生存率の減少が観察された。ＣＤ４５＋／ＣＤ３４＋白血病幹細胞細胞集団について同様の結果が観察された。イメテルスタットナトリウムをベネトクラックスと組み合わせて使用する場合、両時間点で、細胞生存率の減少における用量依存性の活性が示され、４０時間で最も顕著であった。
【0129】
イメテルスタットナトリウムとベネトクラックスとを組み合わせたとき、複数のＡＭＬ細胞株において、アポトーシス誘導における用量依存性の相乗的な活性が観察された（実施例１を参照）。例えば、ＭＯＬＭ－１３細胞株において、単一薬剤イメテルスタットナトリウムおよびベネトクラックスは、４８時間後に中程度のアポトーシス活性を有していた（それぞれ２２％および３０％）が、組み合わせは、４８時間で８８％、９６時間でほぼ１００％を達成した。同様の高められたアポトーシス活性が、４人のＡＭＬ患者サンプルでも観察された。分子分析は、イメテルスタットナトリウムとベネトクラックスとを合わせると、ｈＴＥＲＴ発現が減少し、テロメラーゼ活性が、いずれかの薬剤単独よりも強くなることを示した。この例は、ＡＭＬにおいて、イメテルスタットナトリウムとベネトクラックスとを組み合わせると、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞株および患者サンプルにおけるアポトーシス誘導に対し、相乗効果を有することを示す。
実施例５：テロメラーゼ阻害剤イメテルスタットナトリウムをＢＣＬ－２阻害剤ベネトクラックスと組み合わせると、ｉｎ ｖｉｖｏで、急性骨髄性白血病において生存が高まる。
実施例５：テロメラーゼ阻害剤イメテルスタットナトリウムをＢＣＬ－２阻害剤ベネトクラックスと組み合わせると、ｉｎ ｖｉｖｏで、急性骨髄性白血病において生存が高まる。
【0130】
実施例４に記載したように、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、化学療法以外の治療選択肢が限定された侵襲性の強い癌であり、そのため、治癒薬剤が必要である。実施例４では、テロメラーゼ阻害剤イメテルスタットナトリウムをＢＣＬ－２阻害剤ベネトクラックスと組み合わせると、ｉｎ ｖｉｔｒｏでアポトーシスが高まることを示した。この実施例での試験は、イメテルスタットナトリウムまたはベネトクラックス単独、または急性骨髄性白血病のｉｎ ｖｉｖｏモデルでの組み合わせの効果を調査した。
方法
方法
【0131】
ＭＯＬＭ－１３ ＡＭＬを播種したマウスモデルでのｉｎ ｖｉｖｏ試験を行い、効能と生存を評価した。具体的には、試験０日目に、ＭＯＬＭ－１３ ＡＭＬ腫瘍細胞をマウスに移植した。以下を用い、マウスを３１日間治療した。（ｉ）ビヒクル（ＭＭ＋ＰＥＧ４００／Ｐｈｏｓａｌ５０／ＥＴＯＨ）；（ｉｉ）イメテルスタットナトリウム（３０ｍｇ／ｋｇ）、（ｉｉｉ）ベネトクラックス（ＡＢＴ－１９９）（１００ｍｇ／ｋｇ）、（ｉｖ）ＭＭ（ミスマッチオリゴヌクレオチドコントロール）（３０ｍｇ／ｋｇ）およびＡＢＴ－１９９（１００ｍｇ／ｋｇ）；および（ｖ）イメテルスタットナトリウム（３０ｍｇ／ｋｇ）およびＡＢＴ－１９９（１００ｍｇ／ｋｇ）。マウスの生存率を時間（腫瘍細胞移植後の日数）の関数として評価した。
この試験は、合計１０８日間続いた（治療を停止してから７７日間）。
この試験は、合計１０８日間続いた（治療を停止してから７７日間）。
【0132】
５０匹の雌ＳＣＩＤベージュマウス（６週齢、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に、１００万個のＭＯＬＭ－１３細胞を静脈内注射し、５つの群に無作為に分けた。注射後１日目に、マウスを表２８に列挙される５つの条件のいずれかで治療した。
【表28】
【0133】
マウスを毎日観察し、体重を週に２回測定した。各群のマウスの生存もフォローした。この試験は１０８日目に終了し、これは最後の治療から７７日後であった。寿命の増加（「ＩＬＳ」）を各群について評価し、ビヒクルコントロールに対するＩＬＳ％を
ＩＬＳ％＝１００×（Ｔ－Ｃ）／Ｃ
として計算し、ここで、Ｔは、治療群の生存中央値であり、Ｃは、コントロール群の生存中央値である。
ｉｎ ｖｉｖｏ試験の結果
ＩＬＳ％＝１００×（Ｔ－Ｃ）／Ｃ
として計算し、ここで、Ｔは、治療群の生存中央値であり、Ｃは、コントロール群の生存中央値である。
ｉｎ ｖｉｖｏ試験の結果
【0134】
ＡＭＬ播種性モデルＭＯＬＭ－１３の１０８日目のＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ Ｓｕｒｖｉｖａｌ Ｐｌｏｔを図１６に示す。特に、図１６は、腫瘍細胞移植後の日数の関数としてマウスの生存率を示す。様々な治療群について計算した生存中央値および寿命増加率％（「ＩＬＳ」）を表２９に示す。この結果は、イメテルスタットナトリウム単一薬剤で治療されたマウスについての生存期間中央値が、２６．５日間であったことを示しており、これはビヒクルと比較して、２０．４％ ＩＬＳ（ｐ＝０．０００９）に置き換えられる。ベネトクラックス（ＡＢＴ－１９９）単一薬剤を用いて治療すると、生存期間中央値３０日間、ＩＬＣ ３６．３％が得られた（ｐ≦０．０００１）。ミスマッチ（ＭＭ）オリゴコントロールと組み合わせると、ＡＢＴ－１９９は、ＡＢＴ－１９９単独と同様の効果を与えた。生存期間中央値３１日間、ＩＬＳ ４０．９％（ｐ≦０．０００１）。イメテルスタットナトリウムとＡＢＴ－１９９とを組み合わせると、最良の結果が得られ、生存期間中央値が３７日間であり、６８．１％ ＩＬＳ（ｐ≦０．０００１）の有意な効能が得られた。さらに、この併用療法群からの４匹のマウス（４０％）は、長く生存し、１０８日間を超えて生き残り、このことは、生存便益が高められたことを示していた。
【表29】
【0135】
全てのマウスが、イメテルスタットナトリウムとベネトクラックスの組み合わせに忍容性であり、イメテルスタットナトリウム（３９．６％、ｐ＝０．００１１）またはベネトクラックス（２３．３％、ｐ＝０．０００１）単独と比較すると、寿命の増加が観察された。この組み合わせ群では、治療したマウスの４０％が、治療を中断してから７７日後に生きており、このことは、治癒の可能性を伴い、有意な生存便益を示していた。この実施例での結果は、実施例４と同様に、ＡＭＬにおいて、イメテルスタットナトリウムとベネトクラックスの組み合わせが、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞株および患者サンプルにおけるアポトーシス誘導に対して相乗効果を有することを示し、このことは、長期間の生存および異種移植片モデルの治癒の可能性に置き換えられる。
等価物および参照による組み込み
等価物および参照による組み込み
【0136】
本発明を、その具体的な実施形態を参照しつつ記載してきたが、様々な変更がなされてもよく、本発明の範囲から逸脱することなく、等価物に置き換えることができることが当業者によって理解されるべきである。これに加え、特定の状況、材料、物質組成、プロセス、単数または複数のプロセスステップに適応するように、本発明の範囲から逸脱することなく、本発明によって与えられる利益を達成するために、多くの改変がなされてもよい。このような全ての改変が、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図されている。
【0137】
本明細書に引用されるあらゆる刊行物および特許文書は、このような各刊行物または文書が、具体的にかつ個々に本明細書に参照により組み込まれるように示されているかのように、本明細書に参照により組み込まれる。刊行物および特許文書の引用は、任意のこのような文書が、関連する従来技術であることを示すことを意図したものではなく、これらの内容または日付に関する承認を構成するものでもない。
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12A】
【図12B】
【図13】
【図14A】
【図14B】
【図15A】
【図15B】
【図15C】
【図15D】
【図16】
【図17A】
【図17B】
